DE10000978A1

DE10000978A1 - Verfahren zur Erhöhung des Gehalts an Fettsäuren in Pflanzen und Mikroorganismen

Info

Publication number: DE10000978A1
Application number: DE10000978A
Authority: DE
Inventors: Friedrich Spener; Amine Abbadi; Monika Brummel
Original assignee: GVS Gesellschaft fuer Verwertungssysteme GmbH
Current assignee: GVS Gesellschaft fuer Verwertungssysteme GmbH
Priority date: 2000-01-12
Filing date: 2000-01-12
Publication date: 2001-07-26
Also published as: EP1246928A2; WO2001051647A2; US20030145350A1; AU3728801A; CA2399626A1; AU784223B2; WO2001051647A3

Abstract

Die Erfindung betrifft transgene Pflanzen und Mikroorganismen, die Nukleinsäuresequenzen enthalten, welche für Proteine mit der Aktivität einer beta-Ketoacyl-ACP(aryl carrier protein)-Synthase (KAS) aus dem Enzymkomplex der Fettsäuresynthase (FAS) kodieren. Weiter betrifft die Erfindung Verfahren zur Erhöhung des Fettsäuregehalts, insbesondere des Gehalts an kurz- und mittelkettigen Fettsäuren, in Pflanzen, insbesondere in Samengeweben, sowie in Mikroorganismen, umfassend die Expression von Proteinen mit der Aktivität einer KAS aus dem Enzymkomplex der Fettsäuresynthase in transgenen Pflanzensamen und Mikroorganismen.

Description

Die Erfindung betrifft transgene Pflanzen und Mikroorganismen, die Nukleinsäuresequenzen enthalten, welche für Proteine mit der Aktivität einer β-Ketoacyl-ACP(acyl carrier protein)- Synthase (KAS) aus dem Enzymkomplex der Fettsäuresynthase (FAS) kodieren. Weiter betrifft die Erfindung Verfahren zur Beeinflussung des Fettsäuremusters und/oder Erhöhung des Fettsäuregehalts, insbesondere des Gehalts an kurz- und mittelkettigen Fettsäuren, in Pflanzen, insbesondere in Samengeweben und anderen Triacylglycerine synthetisierenden und/oder speichernden Geweben, sowie in Mikroorganismen, insbesondere in Bakterien und Algen, umfassend die Expression von Proteinen mit der Aktivität einer KAS aus dem Enzym komplex der Fettsäuresynthase in transgenen Pflanzen bzw. Mikroorganismen.

Die Fettsäure- und Triacylglycerinbiosynthese lassen sich aufgrund der Kompartimentierung als getrennte Biosynthesewege, jedoch im Hinblick auf das Endprodukt als ein Biosynthese weg ansehen. Die de novo Biosynthese von Fettsäuren erfolgt in den Plastiden und wird im wesentlichen von drei Enzymen bzw. Enzymsystemen katalysiert, nämlich der Acetyl-CoA- Carboxylase, der Fettsäuresynthase und der Acyl-ACP-Thioesterasen. Die Endprodukte dieser Reaktionsfolge sind in den meisten Organismen Palmitat, Stearat und, nach einer Desaturie rung, Oleat.

Die Fettsäuresynthase besteht aus einem Enzymkomplex dissoziierbarer Einzelenzyme mit den einzelnen Enzymen Malonyl-CoA:ACP-Transferase, β-Ketoacyl-ACP-Synthasen, die aus kettenlängenspezifischen β-Acyl-ACP:Malonyl-ACP-kondensierenden Enzymen (KAS I, II, IV) und dem Acetyl-CoA:Malonyl-ACP kondensierenden Enzym (KAS III) bestehen, β- Ketoacyl-ACP Reduktase, β-Hydroxyacyl-ACP-Dehydratase und Enoyl-ACP-Reduktase.

Der Start der Fettsäuresynthese in Samen von Ölsaaten beginnt mit der KAS III katalysierten Reaktion von Acetyl-CoA und Malonyl-ACP, wobei die Bildung des letzteren durch die Malonyl-CoA:ACP-Transferase katalysiert wird. In den nächsten Schritten der Fettsäure synthese wird die Ketogruppe des gebildeten β-Ketobutyryl-ACP zu einer Methylengruppe reduziert, wobei zuerst zu D-β-Hydroxybutyryl-ACP reduziert und anschließend aus dem D- β-Hydroxybutyryl-ACP durch Wasserabspaltung Crotonyl-ACP ensteht. Im letzteren Schritt des Zyklus wird Crotonyl-ACP zu Butyryl-ACP reduziert, wodurch der erste Verlängerungs zyklus abgeschlossen ist. In der zweiten Runde der Fettsäuresynthese kondensiert Butyryl- ACP mit Malonyl-ACP zu C6-β-Ketoacyl-ACP. Anschließende Reduktion, Wassersabpaltung und eine zweite Reduktion überführen das Zwischenprodukt C6-β-Ketoacyl-ACP zu C6- Acyl-ACP, das für eine dritte Verlängerungsrunde bereitgestellt wird. Diese Verlängerungs zyklen laufen weiter bis zu Palmitoyl- und Stearoyl-ACP. Diese Produkte werden zu Palmitat, Stearat und ACP hydrolysiert, Stearoyl-ACP jedoch überwiegend zu Oleoyl-ACP desaturiert und dann ebenfalls hydrolysiert.

Bei der Synthese kurz- und mittelkettiger Fettsäuren erfolgt die Hydrolyse durch Acyl-ACP Thioesterasen, die spezifisch für kurz- und mittelkettige Acylderivate sind.

Nach Export der Fettsäuren in das Cytoplasma erfolgt im sogenannten Kennedy-Pathway am endoplasmatischen Retikulum die Triacylglycerinbiosynthese aus Glycerin-3-Phosphat und Fettsäuren, die zuvor zu den Acyl-CoA Substraten aktiviert werden.

Unter den Begriff Fettsäuren fallen gesättigte oder ungesättigte, kurz-, mittel- oder lang kettige, geradkettige oder verzweigte, geradzahlige oder ungeradzahlige Fettsäuren. Als kurz kettige Fettsäuren werden allgemein Fettsäuren mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen bezeichnet. Hierzu zählen somit Buttersäure, Valeriansäure und Caprylsäure. Unter die Bezeichnung mittelkettige Fettsäuren fallen C₈- bis C₁₄-Fettsäuren, also in erster Linie Capronsäure, Laurinsäure und Myristinsäure. Schließlich zählt man zu den langkettigen Fettsäuren solche mit mindestens 16 Kohlenstoffatomen, also vor allem Palmitinsäure, Stearinsäure, Ölsäure, Linolsäure und Linolensäure. Allerdings werden häufig auch C₄-C₈-Fettsäuren als kurzkettig und C₆-C₁₀-Fettsäuren als mittelkettig bezeichnet. Es handelt sich somit nicht um starre Definitionen, sondern eher um eine Klassifizierung mit fließenden Übergängen.

Fettsäuren, die in sämtlichen pflanzlichen und tierischen Fetten und vor allem in pflanzlichen Ölen und Fischölen sowie in Mikroorganismen vorkommen, sind vielseitig einsetzbar. Beispielsweise kann ein Mangel an essentiellen Fettsäuren, also Fettsäuren, die im Organis mus nicht synthetisiert werden können und daher mit der Nahrung zugeführt werden müssen, zu Hautveränderungen und Wachstumsstörungen führen, weshalb Fettsäuren u. a. bei Ekzemen, Psoriasis, Verbrennungen und dergleichen, sowie auch in der Kosmetik eingesetzt werden. Weiter finden Fettsäuren und Öle in Wasch- und Reinigungsmitteln, als Deter gentien, als Farbzusätze, Schmier- und Gleitstoffe, Verarbeitungshilfen, Emulgationshilfen, Hydrauliköle und als Trägeröle in pharmazeutischen und kosmetischen Erzeugnissen Anwendung. Als nachwachsende Rohstoffe im chemisch-technischen Sektor werden natürliche Fette und Öle tierischen (beispielsweise Talg) und pflanzlichen (beispielsweise Kokosnuß-, Palmkern- oder Rapsöl) Ursprungs eingesetzt. Die Einsatzbereiche pflanzlicher Öle wurden in den letzten zwanzig Jahren deutlich erweitert. Mit steigendem Umwelt bewußtsein entwickelte man beispielsweise umweltverträgliche Schmierstoffe und Hydraulik öle. Weitere Anwendungen finden Fettsäuren und Fette als Nahrungsmittel bzw. Nahrungs mittelzusatz, beispielsweise in der parenteralen Ernährung, bei Backhilfen, in der Baby-, Senioren- und Sportlerkost, in Schokoladenmassen, Kakaopulver und als Backfette, zur Herstellung von Seifen, Salben, Kerzen, Malerfarben und Textilfarben, Firnissen, Heiz- und Beleuchtungsmitteln.

Pflanzenzüchterische Ziele sind insbesondere die Erhöhung des Gehalts von Fettsäuren in Samenölen. So besteht in Bezug auf Industrieraps und alternative Produktionsbereiche für die Landwirtschaft ein Zuchtziel in der Gewinnung von Rapsöl mit Fettsäuren mittlerer Ketten länge, da diese besonders in der Tensidherstellung begehrt sind. Neben dem Gedanken, pflanzliche Öle als Industrierohstoffe zu verwenden, besteht die Möglichkeit, sie als Biotreib stoff einzusetzen.

Es besteht daher allgemein ein Bedarf an der Bereitstellung von Fettsäuren, die beispielsweise als Grundstoffe für Weichmacher, Schmierstoffe, Pestizide, Tenside, Kosmetika usw. indus triell einsetzbar und/oder nahrungsmitteltechnologisch wertvoll sind. Eine Möglichkeit zur Bereitstellung von Fettsäuren besteht in der Extraktion der Fettsäuren aus Pflanzen oder Mikroorganismen, die besonders hohe Gehalte an den erwünschten Fettsäuren aufweisen. Die Erhöhung des Gehalts an beispielsweise mittelkettigen Fettsäuren in Pflanzen auf klassischem Wege, also durch Züchtung von Pflanzen, die in erhöhtem Maße diese Fettsäuren produzie ren, konnte bisher nur bedingt erreicht werden. Man ist daher besonders an modernen, bio technologischen Ansätzen in der Pflanzenzüchtung interessiert. So sind beispielsweise aus der Deutschen Patentanmeldung Nr. 199 26 456.2 Nukleinsäuren bekannt, die für Proteine mit der Aktivität der β-Ketoacyl-ACP-Synthasen I, II und IV kodieren. Pflanzen, die diese Nuklein säuren enthalten, weisen einen insgesamt erhöhten Gehalt an Fettsäuren auf.

Es ist daher eine Aufgabe der Erfindung, transgene Pflanzen und Mikroorganismen bereitzu stellen, die Fettsäuren produzieren, die sie in ihren Wildtypen in eher geringem Maße oder gar nicht produzieren können. Insbesondere ist es auch Aufgabe der Erfindung, Pflanzen und Mikroorganismen bereitzustellen, die einen gegenüber Wildtyppflanzen erhöhten Gehalt an kurz- und mittelkettigen Fettsäuren aufweisen.

Eine weitere Aufgabe besteht darin, Verfahren zur Erhöhung des Gehalts an Fettsäuren, ins besondere von kurz- und mittelkettigen Fettsäuren, in Pflanzen, hier insbesondere in Samen geweben und anderen Triacylglycerine synthetisierenden und/oder speichernden Geweben, sowie in Mikroorganismen, insbesondere in Bakterien und Algen, bereitzustellen.

Zur Lösung dieser Aufgaben dienen die Merkmale der unabhängigen Schutzansprüche.

Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den jeweiligen Unteransprüchen definiert.

Es ist jetzt gelungen, dem an der Fettsäuresynthese beteiligten Enzym β-Ketoacyl-ACP- Synthase III (KAS III) eine genaue Substratspezifität zuzuordnen. KAS III katalysiert die Kondensation von Acetyl-CoA mit Malonyl-ACP zu β-Ketobutyryl-ACP, welches durch die folgende Wirkung einer Enzymkaskade zu Butyryl-ACP reduziert wird. Das Produkt dieses ersten Verlängerungszyklus ist das Substrat für die Kondensation mit Malonyl-ACP in den nächsten Zyklen, die durch mehrere Acyl-ACP-spezifische Kondensationsenzyme katalysiert wird. In herkömmlichen Pflanzen führt dies zu einer Anreicherung von hauptsächlich C₁₆- und C₁₈-Acyl-ACPs, die im folgenden durch eine Acyl-ACP-Thioesterase hydrolysiert werden.

Pflanzliche Enzyme mit der Aktivität einer β-Ketoacyl-ACP-Synthase III (KAS III) besitzen eine hochwirksame regulatorische Funktion für die Steuerung der Fettsäurebiosynthese. Basierend auf diesem Wissen wurde jetzt überraschenderweise gefunden, dass durch Mutationen im Bereich der für die regulatorische Funktion verantwortlichen Region der KAS III eine Erhöhung des Gehalts an kurz- und/oder mittelkettigen Fettsäuren in Pflanzen oder Mikroorganismen mittels Übertragung von Sequenzen für derartige KAS III-Mutanten möglich ist. Diese Beobachtung wird gemäß der vorliegenden Erfindung zur Erhöhung des Gehalts an kurz- und/oder mittelkettigen Fettsäuren in Pflanzen und Mikroorganismen genutzt.

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Erhöhung des Gehalts an kurzkettigen und/oder mittelkettigen Fettsäuren in Pflanzen, umfassend die Schritte:

a) Herstellung einer Nukleinsäuresequenz, welche für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer β-Ketoacyl-ACP-Synthase III kodiert, wobei die β-Ketoacyl-ACP-Synthase III nicht durch Acyl-ACPs regulierbar, insbesondere nicht inhibierbar ist, und welche mindestens die folgenden Bestandteile umfaßt, die in der 5'-3'-Orientierung aneinandergereiht sind:
ein in Pflanzen, insbesondere in Triacyglycerine synthetisierendem und/oder speicherndem Gewebe aktiver Promotor,
mindestens eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer β-Ketoacyl-ACP-Synthase III kodiert, wobei die β-Ketoacyl-ACP-Synthase III nicht durch Acyl-ACPs regulierbar, insbesondere nicht inhibierbar ist, oder ein aktives Fragment davon kodiert und
gegebenenfalls ein Terminationssignal für die Termination der Transkription und die Addition eines Poly-A-Schwanzes an das entsprechende Transkript sowie gegebenenfalls davon abgeleitete DNA-Sequenzen;
b) Übertragung der Nukleinsäuresequenzen aus a) auf pflanzliche Zellen und
c) gegebenenfalls Regeneration vollständig transformierter Pflanzen und, falls erwünscht, Vermehrung der Pflanzen.

Bei dem Triacyglycerine synthetisierendem und/oder speicherndem Gewebe handelt es sich in erster Linie um Samengewebe. Aber auch andere pflanzliche Gewebe, wie z. B. das Frucht fleisch in Ölpflanzen kommen hier in Frage.

Weiter betrifft die Erfindung Verfahren zur Erhöhung des Gehalts an kurzkettigen und/oder mittelkettigen Fettsäuren in Mikroorganismen, insbesondere Bakterien und Algen, umfassend die Schritte:

a) Herstellung einer Nukleinsäuresequenz, welche für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer β-Ketoacyl-ACP-Synthase III kodiert, wobei die β-Ketoacyl-ACP-Synthase III nicht durch Acyl-ACPs regulierbar, insbesondere nicht inhibierbar ist, und welche mindestens die folgenden Bestandteile umfaßt, die in der 5'-3'-Orientierung aneinandergereiht sind:
ein in dem jeweiligen Mikroorganismus aktiver Promotor,
mindestens eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer β-Ketoacyl-ACP-Synthase III kodiert, wobei die β-Ketoacyl-ACP-Synthase III nicht durch Acyl-ACPs regulierbar, insbesondere nicht inhibierbar ist, oder ein aktives Fragment davon kodiert und
gegebenenfalls ein Terminationssignal für die Termination der Transkription und die Addition eines Poly-A-Schwanzes an das entsprechende Transkript sowie gegebenenfalls davon abgeleitete DNA-Sequenzen; und
b) Übertragung der Nukleinsäuresequenzen aus a) auf den jeweiligen Mikroorganismus.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren zur Erhöhung des Gehalts an kurzkettigen und/oder mittelkettigen Fettsäuren in Pflanzen bzw. Mikroorganismen nach dem oben angegebenen Schritt a) folgende Schritte b)-c) für Mikro organismen bzw. b)-d) für Pflanzen:

a) Zerstörung der Acyl-ACP-Bindungsstelle der β-Ketoacyl-ACP-Synthase III durch in vivo- Mutation,
b) Übertragung der Nukleinsäuresequenzen aus a) oder b), und
c) soweit die Nukleinsäuresequenzen in Schritt c) auf pflanzliche Zellen übertragen wurden, ggf. Regeneration vollständig transformierter Pflanzen und, falls erwünscht, Vermehrung der Pflanzen.

Die Erfindung betrifft des weiteren transgene Pflanzen, pflanzliche Zellen und Mikroorganis men, die eine Nukleinsäuresequenz enthalten, welche für ein Protein mit der Aktivität einer β- Ketoacyl-ACP-Synthase III kodiert, wobei die β-Ketoacyl-ACP-Synthase III nicht durch Acyl-ACPs regulierbar, insbesondere nicht inhibierbar ist.

Untersuchungen des Einflusses von Acyl-ACPs unterschiedlicher Kettenlängen auf die Akti vität von KAS III am Beispiel von Cuphea zeigten, daß die KAS III-Enzyme von Cuphea in die Regulierung der Biosynthese mittelkettiger Fettsäuren über eine starke Rückkopplungs inhibierung involviert sind, die durch die mittelkettigen Acyl-ACP-Endprodukte ausgeübt wird, die in den Plastiden der entsprechenden Samen hergestellt werden. Unsere kinetischen Studien mit rekombinanter KAS III aus Cuphea wrightii zeigten weiter, daß unterschiedliche Bindungsstellen für das inhibitorische C₁₂-ACP und die Substrate Acetyl-CoA und Malonyl- ACP vorliegen.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die erfindungsgemäßen Pflanzen und Mikro organismen somit eine Nukleinsäuresequenz, die für eine KAS III-Mutante kodiert, bei der durch eine oder mehrere Mutationen an der Bindungsstelle der Acyl-ACPs die regulatorische Funktion ausgeschaltet ist, gleichzeitig aber die katalytische Aktivität bei der Kondensations reaktion von Acetyl-CoA und Malonyl-ACP aufrecht erhalten ist. Im Fall von KAS III- Mutanten aus Cuphea kommt es somit zu einer ungehemmten Synthese von Acyl-ACPs, die wiederum das Enzym KAS IV, das für die Synthese mittelkettiger Fettsäuren verantwortlich ist, und das Enzym KAS II, das für die Synthese langkettiger Fettsäuren verantwortlich ist, hemmen. Auf diese Weise wird die Synthese in Cuphea zu kurzkettigen Fettsäuren, insbeson dere zu C₄-C₈-Fettsäuren, verschoben, während in Raps die Synthese zu mittelkettigen Fett säuren, insbesondere zu C₆-C₁₀-Fettsäuren, verschoben wird.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthalten die erfindungsgemäßen Pflanzen und Mikroorganismen Nukleinsäuresequenzen, die gegenüber der Wildtypsequenz von KAS III aus C. wrightii (Slabaugh et al. 1995, Plant Physiol. 108, 343-444) durch mindestens eine Mutation in dem für das Aminosäuresequenzmotiv G³⁵⁷NTSAAS³⁶³ kodierenden Bereich verändert sind.

Wie weiter unten noch näher erklärt werden wird, handelt es sich bei dem Aminosäure sequenzmotiv G³⁵⁷NTSAAS³⁶³ aus C. wrightii um ein in KAS III-Enzymen konserviertes Motiv. Dieses Motiv GNTSAAS liegt in der KAS III aus C. wrightii zwischen den Aminosäuren 357 und 363, gerechnet vom Beginn der Präsequenz, die für eine Prä-KAS III ein schließlich eines für den Transport in die Plastiden verantwortlichen Signalpeptids kodiert. Bei Betrachtung des reifen KAS III-Proteins aus C. wrightii ist das Aminosäuremotiv zwi schen Aminosäure 290 und Aminosäure 296 lokalisiert. Die genaue Position des erfindungs gemäßen Aminosäuremotivs GNTSAAS in KAS III-Enzymen aus diversen Organismen ist aus Abb. 1 entnehmbar.

Da die Lage des Motivs GNTSAAS in den diversen KAS III verschieden ist, wird - sofern nicht konkret das KAS-Enzym aus C. wrightii gemeint ist - im folgenden auch allgemein von dem Motiv GNTSAAS gesprochen, ohne Angabe bestimmter Aminosäurepositionen (die Abb. 1 und ergänzenden, vom Fachmann auf einfache Weise erstellbaren Sequenz- Alignments entnommen werden können).

Insbesondere mit Hilfe der Mutanten Asn³⁵⁸Asp (im reifen Protein N291D) und Ala³⁶¹Ser (im reifen Protein A294S) der rekombinanten C. wrightii KAS III haben wir durch kinetische Untersuchungen nachgewiesen, daß durch diese Mutationen an der regulatorischen Bindungs stelle diese Enzyme durch Acyl-ACPs nicht mehr inhibiert werden, katalytisch jedoch voll aktiv sind. Bei erfindungsgemäß mit der KAS III-Mutante Asn³⁵⁸Asp transformierten Pflan zen konnte gezeigt werden, daß die Mutante nicht nur die Synthese von C₄-ACP erheblich stimulierte, sondern auch beispielsweise in Cuphea lanceolata die Synthese von C₄-C₆ Acyl ACPs um 50% auf Kosten mittelkettiger Acyl-ACPs steigerte. In transgenem Raps, der die vorstehend genannten KAS III-Mutanten exprimierte, wurde die Synthese mittelkettiger Acyl- ACPs (C₆-C₁₀) ebenfalls um über 50% auf Kosten langkettiger Acyl-ACPs gesteigert.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden die KAS III-Sequenzen für die Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Erhöhung des Gehalts an kurz- und/oder mittel kettigen Fettsäuren unter Kontrolle samenspezifischer Regulationselemente, insbesondere Promotoren, in Pflanzenzellen exprimiert. So liegen die vorstehend genannten DNA- Sequenzen in einer bevorzugten Ausführungsform in Kombination mit Promotoren vor, die besonders in Triacyglycerine synthetisierendem bzw. speicherndem Gewebe wie z. B. embryonalem Gewebe oder Fruchtfleisch in Ölpflanzen aktiv sind. Beispiele für solche Promotoren sind der USP-Promotor (Bäumlein et al. 1991, Mol. Gen. Genet. 225: 459-467), der Hordein-Promotor (Brandt et al. 1985, Carlsberg Res. Commun. 50: 333-345), sowie der Napin-Promotor, der ACP-Promotor und die FatB3- und FatB4-Promotoren, die dem auf dem Gebiet der pflanzlichen Molekularbiologie tätigen Fachmann wohl bekannt sind.

Gegebenenfalls können die Nukleinsäuresequenzen für die Verwendung in dem erfindungs gemäßen Verfahren durch Enhancer-Sequenzen oder andere regulatorische Sequenzen ergänzt sein. Die regulatorischen Sequenzen beinhalten beispielsweise auch Signalsequenzen, die für den Transport des Genprodukts zu einem bestimmten Kompartiment sorgen. Hier sind beson ders solche Signalsequenzen zu nennen, die das Genprodukt zum Ort der pflanzlichen Fett säuresynthese, nämlich den Plastiden, lenken. Sofern von der Chloroplastentransformation Gebrauch gemacht wird, erfolgt der Einbau der für KAS III kodierenden Nukleinsäuresequenz unmittelbar in das Plastidengenom, so dass hier in der Regel auf entsprechende Signal sequenzen bzw. -peptide verzichtet werden kann.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nukleinsäuremoleküle, die die vorstehend genannten Nukleinsäuresequenzen oder Teile davon enthalten, d. h. auch Vektoren, insbesondere Plasmide, Cosmide, Viren, Bakteriophagen und andere in der Gentechnik gängige Vektoren, die gegebenenfalls für den Transfer der vorstehend genannten Nukleinsäuremoleküle auf Pflanzen bzw. Pflanzenzellen eingesetzt werden können.

Bei den Pflanzen, die erfindungsgemäß transformiert sind und in denen aufgrund dessen eine veränderte Menge an Fettsäuren synthetisiert wird, kann es sich im Prinzip um jede beliebige Pflanze handeln. Vorzugsweise ist es eine monokotyle oder dikotyle Nutzpflanze und besonders bevorzugt eine Ölpflanze. Als Beispiele sind hier insbesondere Raps, Sonnen blume, Sojabohne, Erdnuß, Kokos, Rüpsen, Baumwolle und Ölpalmen zu nennen. Weitere Pflanzen, die der Fettsäure- und Fettgewinnung dienen können oder als Nahrungsmittel mit erhöhtem Fettsäuregehalt nützlich sind, sind Lein, Mohn, Olive, Kakao, Mais, Mandel, Sesam, Senf und Ricinus.

Gegenstand der Erfindung sind ferner Vermehrungsmaterial von erfindungsgemäßen Pflanzen, beispielsweise Samen, Früchte, Stecklinge, Knollen, Wurzelstöcke etc., sowie Teile dieser Pflanzen wie Protoplasten, Pflanzenzellen und Kalli.

Bei den Mikroorganismen, die erfindungsgemäß transformiert sind und in denen aufgrund dessen eine veränderte Menge an Fettsäuren synthetisiert wird, kann es sich im Prinzip um jeden beliebigen Mikroorganismus handeln. Vorzugsweise sind es Bakterien oder Algen.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die transgenen Pflanzen und Mikroorganis men eine Nukleinsäuresequenz, welche für ein Protein mit der Aktivität einer β-Ketoacyl- ACP-Synthase III aus Cuphea wrightii kodiert, wobei die β-Ketoacyl-ACP-Synthase III nicht durch Acyl-ACPs regulierbar, insbesondere nicht inhibierbar ist.

Abgesehen von den bereits im Stand der Technik erhältlich KAS III-Sequenzen (Referenzen siehe Abb. 1), kann der Fachmann KAS III-Sequenzen, die im Rahmen der Erfindung eingesetzt werden können, allgemein mittels Routineverfahren erhalten (siehe z. B. das weit verbreitete Laborjournal von Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York). In der Regel wird der Fachmann anhand der bekannten Sequenzen geeignete Oligo nukleotid-Primer für PCR-Reaktionen entwerfen oder bekannte KAS III-DNA-Sequenzen bzw. Fragmente davon als Gensonden in Hybridisierungsexperimenten unter Verwendung von cDNA- oder genomischen Libraries einsetzen. Als Hybridisierungssonde können z. B. Nukleinsäuremoleküle verwendet werden, die exakt oder im wesentlichen mit den genannten KAS III-Nukleotidsequenzen des Standes der Technik übereinstimmen oder Teile dieser Sequenzen aufweisen. Bei den als Hybridisierungssonde verwendeten Fragmenten kann es sich auch um synthetische Fragmente handeln, die mit Hilfe der gängigen Synthesetechniken hergestellt werden und deren Sequenz im wesentlichen mit der einer bekannten KAS III- Nukleinsäuresequenz übereinstimmt. Hat man Gene bzw. Klone identifiziert und isoliert, die mit bekannten KAS III-Nukleinsäuresequenzen hybridisieren, ist eine Bestimmung der Sequenz und eine Analyse der Eigenschaften der von dieser Sequenz kodierten KAS III-Proteine erforderlich. Hierzu stehen dem Fachmann eine Reihe von molekularbiolo gischen, biochemischen und biotechnologischen Standardverfahren zur Verfügung. Die mit den im Rahmen der Erfindung einsetzbaren KAS III-Nukleinsäuremolekülen hybridisierenden Moleküle umfassen auch Fragmente, Derivate und allelische Varianten der oben beschriebe nen DNA-Sequenzen, die für eine KAS III kodieren oder ein biologisch, d. h. enzymatisch aktives Fragment davon. Unter Fragmenten werden dabei Teile der Nukleinsäuremoleküle verstanden, die lang genug sind, um ein Polypeptid oder Protein mit der enzymatischen Aktivität einer KAS III oder einer vergleichbaren enzymatischen Aktivität zu kodieren. Der Ausdruck Derivat bedeutet in diesem Zusammenhang, daß die Sequenzen dieser Moleküle sich von den Sequenzen der oben genannten Nukleinsäuremoleküle an einer oder mehreren Positionen unterscheiden und einen hohen Grad an Homologie zu diesen Sequenzen aufwei sen. Homologie bedeutet dabei eine Sequenzidentität von mindestens 40%, insbesondere eine Identität von mindestens 60%, vorzugsweise über 80% und besonders bevorzugt über 90%, oder daß die homologe Sequenz unter stringenten Bedingungen, die dem Fachmann geläufig sind, mit bekannten KAS III-Sequenzen hybridisiert. Die Abweichung zu den oben beschriebenen Nukleinsäuremolekülen können dabei durch Deletion, Addition, Substitution, Insertion oder Rekombination entstanden sein. Homologie bedeutet ferner, daß funktionelle und/oder strukturelle Äquivalenz zwischen den betreffenden Nukleinsäuremolekülen oder den durch sie kodierten Proteinen besteht. Bei den Nukleinsäuremolekülen, die homolog zu den oben genannten Molekülen sind und Derivate dieser Moleküle darstellen, handelt es sich in der Regel um Variationen dieser Moleküle, die Modifikationen darstellen, die dieselbe biolo gische Funktion ausüben. Es kann sich dabei sowohl um natürlicherweise auftretende Variationen handeln, beispielsweise um Sequenzen aus anderen Organismen, oder um Mutationen, wobei diese Modifikationen auf natürliche Weise aufgetreten sein können oder durch gezielte Mutagenese eingeführt werden. Ferner kann es sich bei den Variationen um synthetisch hergestellte Sequenzen handeln. Bei den allelischen Varianten kann es sich sowohl um natürlich auftretende als auch um synthetisch hergestellte oder durch rekombi nante DNA-Techniken erzeugte Varianten handeln. Üblicherweise weisen die von den verschiedenen Varianten der im Rahmen der Erfindung einsetzbaren Nukleinsäuresequenzen kodierten KAS III-Proteine bestimmte gemeinsame Charakteristika auf. Dazu können z. B. Enzymaktivität, Molekulargewicht, immunologische Reaktivität, Konformation etc. gehören. Weitere gemeinsame Charakteristika können physikalische Eigenschaften wie z. B. das Laufverhalten in der Gelelektrophorese, chromatographisches Verhalten, Sedimentationsko effizienten, Löslichkeit, spektroskopische Eigenschaften, Stabilität, pH-Optimum, Tempera tur-Optimum etc. darstellen. Des weiteren können natürlich die Produkte der von den KAS III-Enzymen katalysierten Reaktionen gemeinsame oder ähnliche Merkmale aufweisen.

Zur Erzeugung der erfindungsgemäßen Pflanzen bieten sich verschiedene Methoden an. Zum einen können Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit Hilfe herkömmlicher gentechnologischer Transformationsmethoden derart verändert werden, dass die neuen Nukleinsäuremoleküle in das pflanzliche Genom integriert werden, d. h., dass stabile Transformanten erzeugt werden. Zum anderen kann ein vorstehend genanntes Nukleinsäuremolekül, dessen Anwesenheit und gegebenenfalls Expression in der Pflanzenzelle einen veränderten Fettsäuregehalt bewirkt, in der Pflanzenzelle bzw. der Pflanze als selbstreplizierendes System enthalten sein.

Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, deren Replikationssignale für E. coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC184, pBlueSfi usw. Die gewünschte Sequenz kann in einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor einge führt werden. Das erhaltene Plasmid wird dann für die Transformation von E. coli-Zellen verwendet. Transformierte E. coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet und anschließend geerntet und lysiert, und das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysen methode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid-DNA gespalten und gewonnene DNA-Fragmente mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden.

Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl bekannter Techniken zur Verfügung, wobei der Fachmann die jeweils geeignete Methode ohne Schwierigkeiten ermitteln kann. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, den direkten Gentransfer isolierter DNA in Protoplasten, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten.

Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden per se keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Ähnliches gilt für den direkten Gentransfer. Es können einfache Plasmide, wie z. B. pUC- und pBlueScript-Derivate, verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig. Dem Fachmann sind die Genselektionsmarker bekannt, und es stellt für ihn kein Problem dar, einen geeigneten Marker auszuwählen.

Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA- Sequenzen erforderlich sein. Werden beispielsweise für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der im Ti- bzw. Ri-Plasmid enthaltenen T-DNA als Flanken bereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden.

Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muß die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T- DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien repli zieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tume faciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA-Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden. Das als Wirtszelle dienende Agro bakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet.

Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv unter sucht und ausreichend in allseits bekannten Übersichtsartikeln und Handbüchern zur Pflanzentransformation beschrieben worden.

Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate zweckmäßiger weise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biocide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die Regeneration der Pflanzen erfolgt nach üblichen Regenerationsmethoden unter Verwendung bekannter Nährmedien. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden. Andere Möglichkeiten der Einführung fremder DNA unter Verwendung des biolistischen Verfahrens oder durch Protoplasten-Transformation sind ebenfalls bekannt und vielfach beschrieben.

Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzen zellen Resistenz gegenüber einem Biocid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G418, Bleomycin, Hygromycin, Methotrexat, Glyphosat, Streptomycin, Sulfonyl-Harnstoff, Genta mycin oder Phosphinotricin und u. a. vermittelt. Der individuell gewählte Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten. Hierzu sind auch alternative Marker geeignet, wie nutritive Marker, Screeningmarker (wie GFP, green fluorescent protein). Selbstverständlich kann auch vollkommen auf Selektionsmarker verzichtet werden, was allerdings mit einem ziemlich hohen Screening aufwand einhergeht.

Die transfomierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der üblichen Weise. Die resul tierenden Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus ent stehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotyischen Eigenschaften. Von den Pflanzenzellen können Samen gewonnen werden.

Es sollten zwei oder mehrere Generationen herangezogen werden, um sicherzustellen, daß das phänotypische Merkmal stabil beibehalten und vererbt wird. Auch sollten Samen geerntet werden, um sicherzustellen, daß der entsprechende Phänotyp oder andere Eigenarten erhalten geblieben sind.

Ebenso können nach üblichen Methoden transgene Linien bestimmt werden, die für die neuen Nukleinsäuremoleküle homozygot sind, und ihr phänotypisches Verhalten hinsichtlich eines veränderten Fettsäuregehalts untersucht und mit dem von hemizygoten Linien verglichen werden.

Der Nachweis der Expression der nicht regulierbaren Proteine mit KAS III-Aktivität kann mit Hilfe herkömmlicher molekularbiologischer und biochemischer Methoden erfolgen. Dem Fachmann sind diese Techniken bekannt und er ist problemlos in der Lage, eine geeignete Nachweismethode zu wählen, beispielsweise eine Northern Blot-Analyse zum Nachweis KAS-spezifischer RNA bzw. zur Bestimmung der Höhe der Akkumulation von KAS-spezi fischer RNA, eine Southern Blot-Analyse zur Identifizierung von für KAS III-kodierenden DNA-Sequenzen oder eine Western Blot-Analyse zum Nachweis des durch die erfindungs gemäßen DNA-Sequenzen kodierten KAS III-Proteins. Der Nachweis der enzymatischen Aktivität der KAS III kann anhand des Fettsäuremusters oder eines Enzymassays, wie beispielsweise in den nachfolgenden Beispielen beschrieben, bestimmt werden.

Die Erfindung basiert auf der erfolgreichen Herstellung und Charakterisierung neuer KAS III- Mutanten und der hier erstmals gelungenen Zuordnung konkreter Substratspezifitäten sowie der Aufklärung der KAS III-Regulationsmechanismen, die in den nachfolgenden Beispielen beschrieben werden.

Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung.

Beispiele Beispiel 1 Zielgerichtete Mutagenese der Cuphea wrightii KAS IIIa-cDNA

Standard-DNA-Manipulationsverfahren wurden nach Sambrook et al. (J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor, NY) durchgeführt. Als Ausgangsplasmid für die Herstellung der KAS III Mutanten diente cwKAS IIIa-cDNA (cwKAS = Cuphea wrightii KAS), die über NdeI- und XhoI-Restriktionsschnittstellen in den Expressionsvektor pET 15b (Novagen, MA, USA) kloniert worden war. Die mutierte DNA wurde unter Verwendung des PCR-basierten overlap extension-Verfahrens erzeugt (R. Higuchi, B. Krummel, R. K. Seiki (1988), Nucl. Acids Res. 16, S. 7351 bis 7367). Die Sequenzen der als Primer für die PCR-Reaktion verwendeten Oligonukleotide sind in Tabelle 1 angegeben.

Tabelle 1

Der für die Einführung von Mutationen vorgesehene Zielbereich (Basenpaare 734-1014) der cDNA der vermutlich reifen cwKAS IIIa (angefangen bei dem für die Aminosäure G⁶⁸ kodierenden Codon bis zum Stopcodon) wurde zunächst in Form einer Mutationskassette in den pGEM-T Easy Vektor (Promega, Heidelberg) kloniert. Dieses Konstrukt wird im folgenden als K3MK-pGEMT bezeichnet. Die Mutationskassette wurde mittels PCR- Reaktion unter Verwendung der Primer Fse5 und Xho3 konstruiert, wobei ein 280 Basenpaar langes Fragment amplifiziert wurde. Die Bedingungen für die PCR waren wie folgt: Anfängliche Denaturierung bei 95°C für 30 Sekunden, gefolgt von 25 Zyklen Annealing bei 55°C für 30 Sekunden, Strangverlängerung bei 72°C für 1 Minute und Denaturierung bei 95°C für 30 Sekunden. Der letzte DNA-Syntheseschritt wurde bei 72°C für eine Dauer von 5 Minuten durchgeführt. Die Amplifizierung des DNA Fragments wurde mit jeweils 50 pmol Primer, 1,3 U proof-reading Pfu-Polymerase, 2 ng pET15b-cwKAS IIIa-Plasmid als Template und 200 µM dNTPs in einem Gesamtvolumen von 50 µl durchgeführt. Das resultierende DNA-Fragment wurde durch Ligation in den pGEM-T Easy Sequencing-Vektor (Promega, Heidelberg, Deutschland) entsprechend dem Protokoll des Herstellers eingefügt. Die gesamte Sequenz der Muationskassette wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt.

Anschließend wurden drei punktmutierte KAS IIIs durch Austausch von Asparagin³⁵⁸ zu Aspartat, Alanin³⁶¹ zu Serin und Alanin³⁶² zu Prolin erzeugt. Die Amplifizierung der überlappenden DNA Fragmente der KAS III-Mutanten wurde in zwei getrennten Reaktionen durchgeführt, die jeweils 2 ng K3MK-pGEMT-Plasmid als Template, 2,5 U proof-reading Pfu-Polymerase, 200 µM dNTPs und 50 pmol eines jeden Primers in einem Gesamtvolumen von 50 µl enthielten. Jeder Reaktionsansatz enthielt einen flankierenden Primer (Fse5 oder Xho3) und den entsprechenden Mutations-Primer. Die Bedingungen für die PCR waren wie folgt: Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten, gefolgt von 30 Zyklen bei 94°C für 30 Sekunden, 55°C für eine Minute und 72°C für eine Minute und einen letzten Verlängerungs schritt bei 72°C für 10 Minuten. Zur Erzeugung der Gesamtlänge der mutagenisierten DNAs wurden 2,0 ng der gelgereinigten überlappenden DNA-Fragmente in einer zweiten Reaktion mit jeweils 50 pmol der flankierenden Primer Fse5 und Xho3, 200 µM dNTPs und 2,5 U Pfu- Polymerase in einem Gesamtreaktionsvolumen von 50 µl verwendet. Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten, gefolgt von 30 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 50°C für eine Minute und 72°C für eine Minute und ein letzter Verlängerungs schritt bei 72°C für 10 Minuten. Die Sequenz der Mutanten-Konstrukte wurde durch DNA- Sequenzierung nach der Ligation in den pGEM-T Easy Sequencing-Vektor bestätigt. Für die Proteinexpression wurden die cDNAs der KAS IIIa-Mutanten in die FseI- und XhoI- Restriktionsschnittstellen des pET15b-cwKAS IIIa-Plasmids subkloniert.

Die Deletionsmutante von KAS III wurde durch vollständige Deletion des Aminosäuremotivs Gly³⁵⁷ASn³⁵⁸Thr³⁵⁹Ser³⁶⁰ der Wildtyp-KAS IIIa erhalten. Die Amplifizierung der überlappen den DNA-Fragmente wurde in zwei getrennten Reaktionen mit 2 ng K3MK-pGEMT-Plasmid als Template, 2,5 U proof-reading Pfu-Polymerase, 200 µM dNTPs und 50 pmol eines jeden Primers in einem Gesamtvolumen von 50 µl durchgeführt. Um die mutagenisierten überlap penden DNA-Fragmente zu amplifizieren, wurden die Primerpaare Fse5/Del3 und Xho3/Del5 verwendet. Die Bedingungen für die PCR waren wie folgt: Denaturierung bei 94°C für 2 Minuten, gefolgt von 30 Zyklen bei 94°C für 30 Sekunden, 55°C für eine Minute und 72°C für eine Minute und einen letzten Verlängerungsschritt bei 72°C für 10 Minuten. Das vollständige Mutanten-DNA-Fragment wurde in einer zweiten Reaktion mit 2,0 ng der gelgereinigten überlappenden DNA-Fragmente mit jeweils 50 µmol der Primer Fse5 und Xho3, 200 µM dNTPs und 2,5 U Pfu-Polymerase in einem Gesamtreaktionsvolumen von 50 µl erzeugt. Das resultierende DNA-Fragment wurde auf die gleiche Weise sequenziert und subkloniert wie vorstehend für die anderen Mutantenkonstrukte beschrieben.

Beispiel 2 Expression und Reinigung von rekombinanten Wildtyp-KAS IIIa und KAS IIIa- Mutanten

Die mit einem N-terminalen His₆-tag versehenen Wildtyp-KAS IIIa und KAS IIIa-Mutanten wurden im E. coli-Stamm BL21(DE3)pLysS (Novagen, Madison, USA) exprimiert und durch Nickelaffinitäts-Chromatographie gereinigt. Die Reinheit der erzeugten KAS IIIs wurde durch SDS-PAGE beurteilt. Die KAS III-Konzentration wurde durch das Verfahren von Bradford (M. M. Bradford (1976), Anal. Biochem. 72, S. 248-254) bestimmt.

Beispiel 3 Enzymassays und Inhibierungsstudien

Die Aktivität von KAS IIIa wurde durch Inkorporation von radioaktivem Acetat aus [1-¹⁴C]Acetyl-CoA in Acetoacetyl-ACP untersucht (Brück et al. (1996), Planta 198, S. 271- 278). Der Reaktionsansatz (50 µl) enthielt 100 mM Natriumphosphat, pH 7,6, 10 µM [1-¹⁴C]Acetyl-CoA, 20 µM Malonyl-ACP und 2 ng der rekombinanten KAS IIIa bzw. der jeweiligen KAS IIIa-Mutante. Die Reaktion wurde durch die Zugabe des Enzyms gestartet und für eine Dauer von 5 Minuten bei 30°C durchgeführt.

Für die Inhibierungsstudien der Wildtyp-KAS IIIa wurde bezüglich der Substrate Acetyl-CoA und Malonyl-ACP unter Sättigungsbedingungen gearbeitet, bezüglich der Inhibtoren wurden nicht radioaktive Acyl-ACPs (C2-C16) oder Acyl-CoAs (C3-C12) mit variierenden Konzentrationen zugegeben. Die erhaltenen Daten wurden durch das Verfahren von Lineweaver-Burk analysiert. Für die Inhibierungsstudien der KAS IIIa-Mutanten mit Acyl- ACP wurden 10 µM nicht-radioaktives Dodecanoyl-ACP eingesetzt (siehe Abb. 3).

Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse der Inhibierung von Wildtyp-KAS IIIa durch Acyl-ACPs und Acyl-CoAs. Die KAS III-Aktivität wurde wie vorstehend beschrieben in Anwesenheit variierender Acyl-ACP-Konzentrationen (5-25 µM) oder Acyl-CoA-Konzentrationen (10-50 µM) gemessen.

Tabelle 2

Beispiel 4 Synthese der Acyl-ACPs in Pflanzenextrakten, die mit nicht regulierbarer KAS IIIa-Mutante Asn³⁵⁸Asp supplementiert wurden

Für Supplementierungsexperimente wurde eine FAS-Präparation aus C. lanceolata-Samen aus zellfreien Extrakten durch Ammoniumsulfatausfällung (0 bis 65% Sättigung) gewonnen (Brück et al., supra). Die FAS-Präparation aus Rapssamen wurde nach MacKintosh et al. (1989, BBA 1002, 114-124) erhalten. Alle Präparationen wurden bei -70°C gelagert. Vor der Verwendung wurde ein Aliquot des aufgetauten Ansatzes in 1 ml 100 mM Natriumphosphat (pH 7,6) gelöst und zentrifugiert (10000 × g, 5 Minuten, 4°C), um jegliches unlösliches Material zu eliminieren.

Anschließend wurde in Präparationen von C. lanceolata-Samen und Rapssamen der Einfluß supplementierter KAS IIIa-Mutanten auf das Acyl-ACP-Muster durch die Inkorporation von [1-¹⁴C]Acetat aus [1-¹⁴C]Acetyl-CoA in Acyl-ACPs untersucht. Die Assays wurden wie von Schütt et al. (Planta 205 (1998), S. 263-268) beschrieben durchgeführt. Die Reaktion (200 µl) enthielt 100 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 10 µM [1-¹⁴C]Acetyl-CoA, 20 µM Malonyl- CoA, 10 µM ACP aus E. coli, 1 mM NADH, 2 mM NADPH, 2 mM DTT, FAS-Präparation (0,205 µg Protein pro µl Reaktionsansatz) und die affinitätsgereinigte KAS IIIa-Mutante Asn³⁵⁸Asp in einer Endkonzentration von 7,11 ng Protein pro µl Reaktionsansatz. Die Kontrollreaktionen wurden durch Zugabe von Wildtyp-KAS IIIa anstelle der Asn³⁵⁸Asp- Mutante und ohne Enzymsupplementierung durchgeführt. Zusätzliche Kontrollreaktionen wurden durch Zugabe von 10 µM Decanoyl-ACP zu den Reaktionsansätzen durchgeführt. Innerhalb von 30 Minuten wurden bei unterschiedlichen Zeitintervallen Proben (50 µl) entnommen, und die Reaktion wurde durch Ausfällung der Acyl-ACPs mit Trichloressigsäure bei einer Endkonzentration von 10 Vol.-% beendet. Die ausgefällten Acyl-ACPs wurden, wie bei Brück et al., supra, beschrieben, gewaschen, in 18,7 µl MES (pH 6,8) gelöst und durch 2,5 M und 5,0 M Harnstoff-PAGE nach Post-Beittenmiller et al. (1991, J. Biol. Chem. 266, 1858- 1865) getrennt, auf Immobilon P (Millipore, Eschborn, Deutschland) übertragen und durch Autoradiographie wie bei Brück et al. (1996, supra) beschrieben sichtbar gemacht (siehe Abb. 4). Die Verlängerungsprodukte wurden densitometrisch unter Verwendung eines Ultroscan XL-Geräts (Pharmacia, Freiburg, Deutschland) quantifiziert.

In Tabelle 3 ist die Gesamtanreicherung von FAS-Produkten durch die Präparationen aus C. lanceolata und Raps als Funktion des zugegebenen Enzyms gezeigt. Die Synthese von FAS-Produkten wurde wie vorstehend beschrieben durch den Einbau von [1-¹⁴C]Acetat und mittels eines Szintillationszählers gemessen.

Tabelle 3

Das erhaltene ACP-Muster ist in Tabelle 4 dargestellt. In Tabelle 4 sowie in Abb. 4 sind die Acylgruppen durch die Zahl an Kohlenstoffatomen: Zahl der Doppelbindungen definiert.

Unsere kinetischen Untersuchungen mit rekombinanter KAS IIIa aus C. wrightii ergaben, daß die Inhibierung dieses kondensierenden Enzyms durch Dodecanoyl-ACP nicht kompetitiv bezüglich Acetyl-CoA bzw. Malonyl-ACP ist (siehe Abb. 2). Dies weist darauf hin, daß für das inhibitorische C₁₂-ACP andere Bindungsstellen als für Acetyl-CoA und Malonyl-ACP vorliegen. Um die an der regulatorischen Region von KAS III beteiligten Aminosäuren zu identifizieren, führten wir ein Aminosäuresequenz-Alignment von allen erhältlichen KAS III- Sequenzen aus Pflanzen, Rotalge (Porphyra umbilicalis) und E. coli durch (Referenzen siehe unten im Zusammenhang mit Abb. 1). Die Analyse der in Abb. 1 dargestellten Primärstrukturen im Vergleich zeigt die Existenz einer hochkonservierten C-terminalen Region G³⁵⁷NTSAAS³⁶³ an.

Die Deletion des gesamten Peptids Gly³⁵⁷ASn³⁵⁸Thr³⁵⁹Ser³⁶⁰ führte zu einem vollständigen Verlust der enzymatischen Aktivität. Untersuchungen der Sekundärstruktur dieser Mutante zeigten, daß dieser Aktivitätsverlust eher auf eine Veränderung der Gesamtstruktur im Vergleich zu der der aktiven Konformation der Wildtyp-KAS III als auf katalytische Eigen schaften dieses Motivs zurückzuführen ist.

Um den Beitrag bestimmter Aminosäuren an der regulatorischen Funktion zu untersuchen, haben wir drei Mutanten Asn³⁵⁸Asp, Ala³⁶¹Ser und Ala³⁶²Pro erzeugt. Die Sekundärstruktur analyse dieser Mutanten unter Verwendung von CD-Spektroskopie zeigte, daß die Spektren der Asn³⁵⁸Asp- und Ala³⁶¹Ser-Mutanten im wesentlichen dieselben Spektren ergaben wie das der Wildtyp-KAS IIIa, während die Sekundärstruktur der Ala³⁶²Pro-Mutante verändert war, was sich in einer verminderten kondensierenden Aktivität äußerte (siehe Abb. 5).

Die Inhibierung der Asn³⁵⁸Asp- und Ala³⁶¹Ser-Mutanten mit Dodecanoyl-ACP zeigten, daß die Mutanten nahezu überhaupt nicht durch dieses Acyl-ACP inhibiert wurden (siehe Abb. 2). Die Mutanten behielten etwa 85% der ursprünglichen Aktivität in Gegenwart einer Sättigungskonzentration (10 µM) von Dodecanoyl-ACP bei.

Die kinetischen Daten zeigen, daß die rekombinante Wildtyp-KAS IIIa eine individuelle Bindungsstelle für das regulatorische Acyl-ACP aufweist, wobei die Bindung nicht kovalent erfolgt. Die Tatsache, daß die Asn³⁵⁸Asp- und Ala³⁶¹Ser-Mutanten nicht durch Acyl-ACPs inhibiert werden, ist wahrscheinlich eine Folge der Änderung der Ladung und/oder Polarität der Seitenketten der entsprechenden Aminosäuren, wodurch das Andocken des Acyl-ACP behindert wird.

Die mit den FAS-Präparationen aus C. lanceolata- und Rapssamenextrakten erhaltenen Ergebnisse ergaben Unterschiede in der Gesamtanreicherung der FAS-Produkte als Funktion des supplementierten Enzyms (Tabelle 3). Die Supplementierung mit der Asn³⁵⁸Asp-Mutante führte zu einer 1,2-fachen Anreicherung an FAS-Produkten in C. lanceolata- und Rapssamen extrakten. Um nachzuweisen, ob dieser Effekt durch die KAS III-Aktivität, d. h. die Pro duktion von Butyryl-ACP, oder durch den Knockout einer regulatorischen Stelle des FAS- Enzymkomplexes begründet ist, wurden die Rapssamenextrakte mit derselben Menge an Wildtyp-KAS III wie im Fall der Mutante supplementiert. Dabei konnten keine bedeutsamen Unterschiede in der Gesamtmenge an FAS-Produkten verglichen mit der ohne Supplemen tierung beobachtet werden, was darauf hinweist, daß die Asn³⁵⁸Asp-Mutante einen Einfluß auf die Gesamt-Acyl-ACP-Synthese besitzt.

Der Zusatz der KAS IIIa-Mutante Asn³⁵⁸Asp im Überschuß zu Extrakten aus C. lanceolata- Samen und aus Rapssamen zeigte, daß die Mutante wie erwartet nicht nur die Synthese von C₄-ACP in beiden Extrakten erheblich stimulierte, sondern auch

- im C. lanceolata-Extrakt die Synthese von C₄-C₆ Acyl-ACPs um 50% steigerte (auf Kosten mittelkettiger Acyl-ACPs, insbesondere C₁₀ und C₁₂),
- im Rapssamenextrakt die Synthese mittelkettiger Acyl-ACPs (C₆-C₁₀) ebenfalls um über 50% steigerte, hier auf Kosten der langkettigen Acyl-ACPs, insbesondere der C₁₄- bis C₁₈- Acyl-ACPs (siehe Tabelle 4).

Derartige Veränderungen in der Acyl-ACP-Zusammensetzung spiegeln die Veränderungen in der Regulation und Steuerung der Fettsäurebiosynthese wider. Diese Veränderungen werden wahrscheinlich durch eine Änderung in dem stöchiometrischen Verhältnis einiger Acyl-ACPs hervorgerufen, was wiederum andere kondensierende Enzyme des FAS-Enzymkomplexes beeinflussen könnte.

Beschreibung der Abbildungen Abb. 1 Sequenzvergleich der KAS III-Primärstrukturen, einschließlich der der Präpetide

Die Referenzen und Accession Nos. für die jeweiligen Sequenzen sind, soweit bereits zum Stand der Technik gehörend, wie folgt:
Cuphea wrightii; GenBank Accession No.: U15935 (cwKAS IIIa); U15934 (cwKAS IIIb)
Slabaugh, M. B., Tai, H., Jaworski, J. G. and Knapp, S. J. (1995) cDNA clones encoding β- ketoacyl-acyl carrier protein synthase III from Cuphea wrghtii. Plant Physiol. 108, 343-444.
Spinacia oleracea; EMBL Accession No.: Z22771
Tai, H. and Jaworski, J. G. (1993) 3-Ketoacyl-Acyl Carrier Protein Synthase III from Spinach (Spinacia oleracea) is not similar to other Condensing Enzymes of Fatty Acid Synthase. Plant Physiol. 103, 1361-1367.
Arabidopsis; GenBank Accession No.: L31891
Tai, H., Post-Beittenmiller, D. and Jaworski, J. G. (1994) Cloning of a cDNA encoding 3- ketoacyl-acyl carrier protein synthase III from Arabidopsis. Plant Physiol. 108, 343-444.
Allium sativum; GenBank Accession No.: U306000
Chen, J. and Post-Beittenmiller, D. (1996) Molecular cloning of a cDNA encoding 3- ketoacyl-acyl carrier protein synthase III from leek. Gene 182, 45-52.
Porphyra umbilicalis; GenBank Accession No.: 438804
Reith, M. (1993) A β-ketoacyl-acyl carrier protein synthase III gene (fabH) is encoded on the chloroplast of the red alga Porphyra umbilicalis. Plant Mol. Biol. 21, 185-189
Escherichia coli, GenBank Accession No.: M77744
Tsay, J. T., Oh, W., Larson, T. J., Jackowski, S. and Rock, C. O. (1992) Isolation and characterization of the β-ketoacyl-acyl carrier protein synthase-III gene (fabH) from Escherichia coli K-12. J. Biol. Chem. 267, 6807-6814

Abb. 2

Kinetik der Inhibierung von Wildtyp-KAS III durch Dodecanoyl-ACP. Doppelt reziproke Auftragung der Konzentration von Acetyl-CoA (A) und Malonyl-ACP (B) gegen die Aktivität von KAS III in Abwesenheit (⚫) und Gegenwart von 1 µM (▲), 2,5 µM (∎) und 5 µM () Dodecanoyl-ACP. Der jeweilige Substratpartner wurde bei 10 µM [1-¹⁴C] Acetyl-CoA und 20 µM Malonyl-ACP konstant gehalten. Die Enzymaktivität wurde durch Verfolgung der Inkorporation von [1-¹⁴C]acetat aus [1-¹⁴C]Acetyl-CoA in β-Ketobutyryl- ACP (n = 8).

Abb. 3

Inhibierung von KAS III-Mutanten durch Dodecanoyl-ACP. Die Enzymakti vität wurde durch Verfolgung der Inkorporation von [1-¹⁴C]Acetat aus [1-¹⁴C]Acetyl-CoA in β-Ketobutyryl-ACP in Anwesenheit von 10 µM nicht-radioaktivem Dodecanoyl-ACP bestimmt (n = 4).

Abb. 4

Supplementierungsassays von FAS-Extrakten aus C. lanceolata (A) und Rapssamen (B). Die FAS-Reaktionen von den FAS-Präparationen wurden mit der KAS IIIa- Mutante Asn³⁵⁸Asp und 10 µM Decanoyl-ACP wie gezeigt supplementiert. Die Kontroll reaktionen wurden ohne Zugabe von exogenen KAS IIIs durchgeführt. Die Reaktions produkte wurden durch die Inkorporation [1-¹⁴C]acetat aus [1-¹⁴C]Acetyl-CoA in Acyl-ACPs bestimmt. Proben wurden nach 20 min entnommen und durch Auftrennung der Acyl-ACPs in der 5,0 M-Harnstoff-PAGE analysiert, gefolgt von Elektroblotting auf Immobilon P und Visualisierung durch Autoradiographie. Die Acylreste sind durch die Zahl an Kohlenstoff atomen: Zahl der Doppelbindungen defeniert (n = 3).

Abb. 5

CD-Spektren der Wildtyp-KAS IIIa (⚫), Asn³⁵⁸Asp (∎), Ala³⁶¹Ser (▲), Ala³⁶²Pro (○) und der Deletionsmutante (). Auftragung der Elliptizität (θ) gegen die Wellenlänge (λ).

Claims

1. Transgene Pflanzen und Mikroorganismen, die eine Nukleinsäuresequenz enthalten, welche für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer β-Ketoacyl-ACP- Synthase III (KAS III) kodiert, wobei das Protein nicht durch Acyl-ACPs regulierbar, insbesondere nicht inhibierbar ist.

2. Pflanzen und Mikroorganismen nach Anspruch 1, die eine Nukleinsäuresequenz enthalten, welche für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer β-Ketoacyl-ACP-Synthase III aus Cuphea wrightii kodiert, wobei das Protein nicht durch Acyl-ACPs regulierbar, insbesondere nicht inhibierbar ist.

3. Pflanzen und Mikroorganismen nach Anspruch 1 oder 2, die eine Nukleinsäuresequenz enthalten, welche gegenüber der Wildtypsequenz von KAS III durch mindestens eine Mutation in dem für das Aminosäuresequenzmotiv GNTSAAS kodierenden Bereich verändert ist.

4. Pflanzen und Mikroorganismen nach Anspruch 3, worin die Mutation innerhalb des Aminosäuremotivs GNTSAAS zu einem Austausch der Aminosäure N zu D und/oder der Aminosäure A (erstes Alanin des Motivs) zu S führt.

5. Pflanzen nach einem der vorangehenden Ansprüche, in denen die Nukleinsäuresequenz in Kombination mit einem in Pflanzen aktiven Promotor vorliegt.

6. Pflanzen nach einem der vorangehenden Ansprüche, in denen die Nukleinsäuresequenz in Kombination mit einem in Triacyglycerine synthetisierendem bzw. speicherndem Gewebe aktiven Promotor vorliegt.

7. Pflanzen nach einem der Ansprüche 5 und 6, in denen die Nukleinsäure sequenz zusätzlich in Kombination mit Enhancer-Sequenzen, für Signalpeptide kodierenden Sequenzen und/oder anderen regulatorischen Sequenzen vorliegt.

8. Pflanzen und Mikroorganismen nach einem der vorangehenden Ansprüche, die einen gegenüber Wildtyppflanzen bzw. Wildtypmikroorganismen veränderten Fettsäure gehalt und/oder eine gegenüber Wildtyppflanzen bzw. Wildtypmikroorganismen veränderte Fettsäurezusammensetzung aufweisen.

9. Pflanzen und Mikroorganismen nach einem der vorangehenden Ansprüche, die einen gegenüber Wildtyppflanzen bzw. Wildtypmikroorganismen erhöhten Gehalt an mittelkettigen Fettsäuren aufweisen.

10. Pflanzen und Mikroorganismen nach einem der vorangehenden Ansprüche, die einen gegenüber Wildtyppflanzen bzw. Wildtypmikroorganismen erhöhten Gehalt an kurzkettigen Fettsäuren aufweisen.

11. Pflanzen nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei denen es sich um Ölsaaten, insbesondere Raps, Sonnenblume, Sojabohne, Erdnuß, Kokos, Baumwolle, Lein, handelt.

12. Mikroorganismen nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 8 bis 10, bei denen es sich um Bakterien und Algen handelt.

13. Verfahren zur Erhöhung des Gehalts an kurz- und/oder mittelkettigen Fettsäuren in Pflanzen, insbesondere in Triacylglycerine synthetisierenden und/oder speichernden Geweben, umfassend die Schritte:

a) der Herstellung einer Nukleinsäuresequenz, welche für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer KAS III kodiert, wobei das Protein nicht durch Acyl-ACPs regulierbar, insbesondere nicht inhibierbar ist, mindestens umfassend die folgenden Bestandteile, die in der 5'-3'-Orientierung aneinandergereiht sind:
- - ein in Pflanzen aktiver Promotor,
- - mindestens eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein mit der Aktivität einer KAS III kodiert, wobei das Protein nicht durch Acyl-ACPs regulierbar, insbesondere nicht inhibierbar ist, und.
- - gegebenenfalls ein Terminationssignal für die Termination der Transkription und die Addition eines Poly-A-Schwanzes an das entsprechende Transkript, sowie gegebenenfalls davon abgeleitete DNA Sequenzen;

a) der Übertragung der Nukleinsäuresequenz aus a) auf pflanzliche Zellen und
b) gegebenenfalls der Regeneration vollständig transformierter Pflanzen und, falls erwünscht, der Vermehrung der Pflanzen.

14. Verfahren zur Erhöhung des Gehalts an kurz- und/oder mittelkettigen Fettsäuren in Mikroorganismen, umfassend die Schritte:

a) der Herstellung einer Nukleinsäuresequenz, welche für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer KAS III kodiert, wobei das Protein nicht durch Acyl-ACPs regulierbar, insbesondere nicht inhibierbar ist, mindestens umfassend die folgenden Bestandteile, die in der 5'-3'-Orientierung aneinandergereiht sind:
- - ein in dem jeweiligen Mikroorganismus aktiver Promotor,
- - mindestens eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein mit der Aktivität einer KAS III kodiert, wobei das Protein nicht durch Acyl-ACPs regulierbar, insbesondere nicht inhibierbar ist, und
- - gegebenenfalls ein Terminationssignal für die Termination der Transkription und die Addition eines Poly-A-Schwanzes an das entsprechende Transkript, sowie gegebenenfalls davon abgeleitete DNA Sequenzen; und

a) der Übertragung der Nukleinsäuresequenz aus a) auf den jeweiligen Mikroorganismus.

15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Protein mit der Aktvität einer KAS III aus Cuphea wrightii kodiert, wobei das Protein nicht durch Acyl-ACPs regulierbar, insbesondere nicht inhibierbar ist.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei die Nukleinsäure sequenz, welche für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer KAS III kodiert, gegenüber der Wildtypsequenz von KAS III durch mindestens eine Mutation in dem für das Aminosäuresequenzmotiv GNTSAAS kodierenden Bereich verändert ist.

17. Verfahren nach Anspruch 16, worin die Mutation innerhalb des Amino säuremotivs GNTSAAS zu einem Austausch der Aminosäure N zu D und/oder der Amino säure A (erstes Alanin des Motivs) zu S führt.

18. Verwendung von gemäß einem der Ansprüche 13 bis 17 hergestellten Pflanzen bzw. Mikroorganismen zur Gewinnung von Fettsäuren und Ölen mit erhöhtem Gehalt an kurz- und/oder mittelkettigen Fettsäuren.