DE69133283T2

DE69133283T2 - Dna, die für pflanzliche thioesterasen kodiert

Info

Publication number: DE69133283T2
Application number: DE69133283T
Authority: DE
Inventors: Maelor Huw DAVIES; Roman Michael POLLARD; Alois Toni VOELKER; A. Gregory THOMPSON
Original assignee: Calgene LLC
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1990-04-26
Filing date: 1991-04-25
Publication date: 2004-05-06
Anticipated expiration: 2011-04-26
Also published as: EP0480024A1; EP0480024B1; WO1991016421A1; JPH05507199A; CA2081122A1; US5344771A; EP0480024A4; ATE243743T1; DE69133283D1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft Proteinpräparate, Aminosäure- und Nucleinsäuresequenzen und Konstrukte, und diesbezügliche Verfahren.
Einführung
Hintergrund
„Verbesserte" Mittel, um Fettsäurezusammensetzungen aus biosynthetischen oder natürlichen Pflanzenquellen zu erhalten oder zu manipulieren, werden benötigt. Beispielsweise sind neue Ölprodukte, verbesserte Quellen synthetischer Triacylglycerine (Triglyceride), alternative Quellen handelsüblicher Öle, insbesondere tropischer Öle (d. h. Palmkern- und Kokosnussöle) und Pflanzenöle, die in natürlichen Quellen in Spuren vorkommen, für eine Vielzahl von Verwendungen in Industrie und Lebensmitteln erwünscht.
Zu diesem Zweck ist das Fettsäuresynthese- (FAS-) System in Pflanzen und Bakterien, FAS-11, untersucht worden. Der Mechanismus der Produktion „langkettiger Fettsäuren", d. h., Fettsäuren mit einer Kohlenstoffkettenlänge von 16 oder mehr als 16 Kohlenstoffatomen (C16), über das Acyl-Trägerprotein- (ACP-) abhängige, Plastid-lokalisierte FAS-System der Pflanzen ist relativ gut charakterisiert. Jedoch sind die Aminosäure- und entsprechenden Nucleinsäuresequenzen vieler Proteine, die für dieses Aktivität verantwortlich sind, nicht bestimmt worden. Insbesondere ist das Enzym, durch das freie langkettige Fettsäuren produziert werden, ist in mehreren verschiedenen Früchten untersucht worden. Trotzdem sind die Mechanismen, durch die Pflanzen Fettsäuren mit kürzeren Kohlenstoffketten, d. h. mit weniger als 16 Kohlenstoffatomen, einschließlich kurzkettige freie Fettsäuren (C4-C8) und mittelkettige freie Fettsäuren (C8-C14) produzieren, schwer fassbar geblieben.
Die Charakterisierung von Thioesterasen (auch als Hydrolasen bekannt) wäre für die weitere Untersuchung von Pflanzen-FAS-Systemen und zur Entwicklung neuer und/oder alternativer Ölquellen nützlich. Die Erzeugung einer Spanne von kurzkettigen C4-, C6- und C8-3-Ketofettsäuren könnte der Schlüssel zum Erfolg bei der Verbesserung von Polyhydroxybutyrat- (PHB-) basierten, bioabbaubaren Kunststoffen werden, die in Bakterien und Pflanzen produziert werden. Mittelkettige Fettsäuren haben eine spezielle Bedeutung in der Detergens- und Schmiermittelindustrie oder bei der Formulierung von Speiseölen mit vermindertem Kaloriengehalt und anderen gesundheitlichen Vorteilen. Siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 4.863.753 und A. C. Barch und V. K. Babayan, Am. J. Clin. Nat. 36, 950–962 (1982). Längere Fettsäuren könnten bestimmte andere Verwendungen haben, d. h. C16 und C18 werden in Margarine und anderen festen Produkten auf Ölbasis verwendet und sehr langkettige Fettsäuren weisen auch spezialisierte Verwendungen auf, d. h. C22 wird verwendet, um Erdnussbutter weicher zu machen. Als solche ist eine verfügbare Quelle einer Vielzahl von Fettsäurelängen, einschließlich Speicherfetten, die Fettsäuren unterschiedlicher Kettenlängen in gewünschten Verhältnissen eingebaut haben, für eine Reihe von Verwendungsfeldern in Industrie und Lebensmitteln erwünscht. So wie der biosynthetische Stoffwechselweg für die Kettentermination von Fettsäuren in Pflanzen ermittelt wird, kann das System für die Anwendung in vivo und in vitro adaptiert werden.
Folglich könnten Untersuchungen der Kettenterminationsmechanismen der Pflanze ein Mittel bereitstellen, um die Länge von Fettsäureprodukten oder resultierenden Triglyceriden und Ölen weiter zu verbessern. Weiters ist die Aufklärung des/der für die natürliche Produktion freier Fettsäuren in Pflanzen kritischen Faktors/en wünschenswert, einschließlich die Reinigung solcher Faktoren und die Charakterisierung des/der Elemente) und/oder Cofaktoren, welche die Effizienz des Systems erhöhen. Von speziellem Interesse sind die Nucleinsäuresequenzen von Genen, die für Faktoren kodieren, die mit der Produktion solcher freien Fettsäuren in Beziehung stehen, für Anwendungen in der Gentechnologie.
Relevante Literatur
T. A. McKeon und P. K. Stumpf, J. Biol. Chem. 257, 12141–12147 (1982), berichten von einer 700fachen Reinigung der Saflor-Acyl-ACP-Thioesterase. Andere Literaturstellen, die die Reinigung und Charakterisierung von Langketten-Acyl-ACP-Thioesterasen berichten, umfassen Shire et al., Arch. Biochem. Biophys. 172, 110–116 (1976); Ohlrooge et al., Arch. Biochem. Biophys. 189, 382–391 (1978); Imai et al., Plant Lipid Biochemistry, The Ninth International Symposium on Plant Lipids, Wye College, Univ. of London, July 8–13 (1990); A. Hellyer und A. R. Salbas, Plant Lipid Biochemistry, The Ninth International Symposium on Plant Lipids, Wye College, Univ. of London, July 8–13 (1990).
P. K. Stumpf, The Biochemistry of Plants (P. K. Stumpf und E. Conn (Hrsg.)) 9, 121–136 (1987), fassen die Mechanismen der Termination des Fettsäurekettenverlängerungs-Stoffwechselwegs für eine Reihe von Kettenlängen in Pflanzen zusammen. Spezifische Thioesterasen zur Herstellung mittelkettiger Fettsäuren werden postuliert, sowie andere mögliche Erklärungen. J. L. Harwood, Ann. Rev. Plant Physiol. Mol. Bio. 39, 101–138 (1988), zitiert verschiedene Möglichkeiten in der Literatur in Bezug auf die Produktion großer Mengen von mittelkettigen Fettsäuren in einigen Pflanzengeweben und berichtet, dass sich alle Ansätze, eine „geeignete Thioesterase" zu finden, die für die Produktion mittelkettiger Fettsäuren verantwortlich ist, als negativ erwiesen haben. J. L. Harwood, Crit. Rev. Plant Sci. 8, 1–43 (1989), gibt einen Überblick der derzeitigen Informationen bezüglich der Produktion mittelkettiger Fettsäuren in Pflanzen mit der Schlussfolgerung, dass sehr wenig bekannt ist. Siehe auch M. R. Pollard und S. S. Singh, The Metabolism, Structure and Function of Plant Lipids, P. K. Stumpf, J. B. Mudd und W. D. Nes (Hrsg,), Plenum Press, NY, S. 455–463 (1987).
Kurzbeschreibung der Figuren
1. Zwei Peptidsequenzen und die degenerierten Oligonucleotide, die in der PCR verwendet wurden, um die Lorbeer-Thioesterase zu erhalten, sind gezeigt. „I" in der Oligonucleotidsequenz stellt das Nucleotid Inosin dar. Die DNA-Sequenz in Kleinbuchstaben stellt künstliche 5'-Enden, die dazu entworfen sind, die nachfolgende Klonierung mit den zwei gewählten Restriktionsenzymen (Restriktionsstellen unterstrichen) zu ermöglichen. Das Oligonucleotid für Peptid 701 (Seq.-ID Nr. 14) ist Seq.-ID Nr. 32 und für Peptid 689 (Seq.-ID Nr. 12) ist es Seq.-ID Nr. 33.
2. Eine Fusion der PCR-erzeugten cDNA, sowie des längsten Bibliothek-Klon der Lorbeer-Thioesterase ist gezeigt. Die ersten 210 Basen (Seq.-ID Nr. 34) stammen vom 800 bp-PCR-Produkt. Der Spalt repräsentiert nicht sequenzierte DNA, ungefähr 240 bp, wie mittels Restriktionsenzymkartierung ermittelt wurde. Die übrige Sequenz (Seq.-ID Nr. 35) stammt vom PCR-Fragment und dem Bibliothek-Klon. Die Translation in das richtige Raster ist unter der Sequenz gezeigt. Ausgewählte Peptidsequenzen sind durch horizontale Linien unter der betreffenden Proteinsequenz dargestellt. Die gezeigten Zahlen entsprechen jenen, die in Tabelle 8 angegeben sind. Durch Proteinsequenzierung bereitgestellte Fehlpaarungen mit der Sequenz sind gezeigt.
3. Ein Sequenzvergleich zwischen zwei verwandten Lorbeer-Thioesterase-cDNA-Klonen ist gezeigt, die unter Verwendung des in Beispiel 14.C.2 beschriebenen, mittels PCR erzeugten 800 bp-Fragments isoliert wurden. Sequenzidentität ist durch horizontale Linien bezeichnet.
4. Eine Volllängensequenz einer Lorbeer-Thioesterase ist gezeigt. In 4A ist die Aminosäuresequenz des Strukturgens angegeben. In 4b ist die Nucleinsäuresequenz angegeben. Die Aminosäuresequenz in 4A beginnt mit dem ATG-Codon bei 181 bis 183. Wie andernorts in der Patentbeschreibung angemerkt, sind drei mögliche ATG- Startcodons in den ersten 219 Basenpaaren der Nucleinsäuresequenz von 4B lokalisiert.
5. Eine Darstellung der Orientierung der in Tabelle 9 gezeigten Fragmente ist bereitgestellt.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Pflanzen-Thioesterasen und stellt ein rekombinantes DNA-Konstrukt bereit, das eine für eine Pflanzen-Acyl-ACP-Thioesterase oder einen Abschnitt davon kodierende Nucleinsäure umfasst, die Hydrolaseaktivität gegenüber ein oder mehrere Fettacyl-ACP-Substrate aufweist, worin die besagte Nucleinsäure eine Sequenz umfasst, die zumindest 50% Sequenzidentität mit der Sequenz von Seq.-ID Nr. 34 und Seq.-ID Nr. 35 aufweist.
Die für Pflanzen-Thioesterase kodierende Sequenz kann in Abhängigkeit von der beabsichtigten Verwendung für eine vollständige oder für eine Teilsequenz kodieren. Die gesamte oder ein Abschnitt der Genomsequenz, cDNA-Sequenz, Vorläufer-Pflanzen-Thioesterase- oder reifen Pflanzen-Thioesterase-Sequenz ist vorgesehen.
Von speziellem Interesse sind rekombinante DNA-Konstrukte, die für die Transkription oder Transkription und Translation (Expression) der Pflanzen-Thioesterase-Sequenz sorgen. Folglich stellt die Erfindung ein Konstrukt bereit, das in der 5'->3'-Transkriptionsrichtung eine in einer Wirtszelle funktionstüchtige Transkriptionsregulationsregion und die besagte Sequenz der Erfindung umfasst. Ein solches Konstrukt kann weiters eine in einer Wirtszelle funktionstüchtige Translationsregulationsregion unmittelbar 5' der besagten Sequenz und eine Transkriptionstranslationsterminations-Regulationsregion 3' der besagten Sequenz der Erfindung umfassen. Dieses und andere Konstrukte und ihre Verwendungen werden von den beigefügten Ansprüchen bereitgestellt.
In einem zweiten Aspekt betrifft diese Erfindung das Vorliegen solcher Konstrukte in Wirtszellen, insbesondere Pflanzenwirtszellen.
In einem andern Aspekt betrifft diese Erfindung transgene Wirtszellen, die eine exprimierte Pflanzen-Thioesterase beherbergen.
In noch einem weiteren Aspekt betrifft diese Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanzen-Thioesterase in einer Wirtszelle oder ihre Nachkommen über die Expression eines Solchen Konstrukts in der Zelle. Zellen, die eine Pflanzen-Thioesterase als Ergebnis der Produktion der für die Pflanzen-Thioesterase kodierenden Sequenz enthalten, sind hierin ebenfalls vorgesehen.
In einer anderen Ausführungsform betrifft diese Erfindung Verfahren der Verwendung einer für Pflanzen-Thioesterase kodierenden DNA-Sequenz zur Modifizierung des Anteils von freien, innerhalb einer Zelle, insbesondere Pflanzenzellen produzierten Fettsäuren. Pflanzenzellen, die eine solche modifizierte Zusammensetzung freier Fettsäuren aufweisen, sind hierin ebenfalls vorgesehen.
Es werden hierin mittlere Ketten bevorzugende Pflanzen-Thioesterase-Proteine und Sequenzen beschrieben, die mit ihnen in Beziehung stehen, einschließlich Aminosäure- und Nucleinsäuresequenzen. Mittlere Ketten bevorzugende Acyl-Träger-Thioesterasen, die im Wesentlichen frei von anderen Pflanzenproteinen sind, werden beschrieben. Mittlere Ketten bevorzugende Acyl-Träger-Thioesterasen, die bevorzugte hydrolytische Aktivität gegenüber Acyl-Acyl-Trägerprotein- (ACP-) Substraten zeigen, sind von besonderem Interesse. Nucleinsäuresequenzen und Aminosäuresequenzen solcher Proteine werden beschrieben.
Zusätzlich werden Verfahren zur Herstellung einer mittelkettigen freien Fettsäure unter Anwendung einer mittlere Ketten bevorzugenden Acyl-Träger-Thioesterase bereitgestellt.
Hierin als Beispiele dienende Pflanzen-Thioesterasen umfassen Umbellularia california-(Lorbeer-), Cuphea hookeriana- (Cuphea-) und Cathamus tinctiorius- (Saflor-) Thioesterasen. Diese beispielhaften Thioesterasen können verwendet werden, um andere Pflanzen-Thioesterasen zu erhalten.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Eine Pflanzen-Thioesterase dieser Erfindung, die von einem rekombinanten Konstrukt kodiert wird, umfasst jede Sequenz von Aminosäuren, wie z. B. ein Protein, Polypeptid oder Peptidfragment, das aus einer Pflanzenquelle erhalten werden kann, welches die Fähigkeit zeigt, die Produktion freier Fettsäure(n) aus Fettacyl-Trägersubstraten unter für Pflanzenenzym reaktiven Bedingungen zu katalysieren. Mit „für Pflanzenenzym reaktive Bedingungen" ist gemeint, dass alle notwendigen Bedingungen in einer Umgebung vorliegen (d. h., Faktoren wie Temperatur, pH Fehlen hemmender Substanzen), die es dem Enzym ermöglichen, seine Funktion auszuüben.
Die bevorzugte Aktivität einer Pflanzen-Thioesterase für ein Fettacyl-Trägersubstrat mit bestimmter Kettenlänge wird durch Vergleich der erhaltenen Menge des freien Fettsäureprodukts mit Substraten verschiedener Kettenlänge erhalten. Beispielsweise ist mit „C12 bevorzugend" gemeint, dass die hydrolytische Aktivität des Enzympräparats eine Bevorzugung für Lauryl und vielleicht Decanoyl gegenüber anderen Substraten mit anderen Acylkohlenstofflängen zeigt. In ähnlicher Weise wird eine Pflanzen-Thioesterase mit „C10 bevorzugender" Aktivität höhere Aktivität für Decanoyl- und vielleicht Octanoyl-Substrate gegenüber anderen Substraten mit anderen Acylkohlenstofflängen zeigen. Es sei angemerkt, dass eine gewisse Aktivität signifikant geringeren Ausmaßes für Fettacyl-Substrate anderer Kettenlängen beobachtet werden kann, d. h., die Spezifität wird beträchtlich, jedoch nicht absolut sein.
Wie oben erwähnt, wird eine von einem DNA-Konstrukt dieser Erfindung kodierte Thioesterase Aktivität gegen Fettacyl-Trägersubstrate zeigen. Während der Biosynthese von Lipiden in einer Pflanzenzelle werden Fettsäuren typischerweise kovalent an ACP- oder Coenzym A- (CoA-) Träger gebunden. Pflanzen-Thioesterasen, die bevorzugte Aktivität gegenüber Acyl-ACP-Substraten zeigen, sind insbesondere bevorzugt, da sie wahrscheinlich mit dem FAS-Stoffwechselweg in unreifen Embryo-Plastiden eng assoziiert sind. Jedoch ist Aktivität gegenüber Acyl-CoA-Substraten oder beispielsweise anderen synthetischen Substraten hierin ebenfalls vorgesehen.
Andere Pflanzen-Thioesterasen sind aus den hierin beschriebenen, speziellen beispielhaften Profeinpräparaten und Sequenzen erlangbar. Darüber hinaus wird offenkundig werden, dass man natürliche und synthetische Pflanzen-Thioesterasen erhalten kann, einschließlich modifizierte Aminosäuresequenzen und Ausgangsmaterialien zur synthetischen Proteinmodellierung, und zwar aus den beispielhaft erläuterten Pflanzen-Thioesterasen und aus Pflanzen-Thioesterasen, die durch die Verwendung solcher beispielhafter Sequenzen erhalten werden. Modifizierte Aminosäuresequenzen umfassen Sequenzen, die mutiert, trunkiert, vergrößert worden sind und dergleichen, ob solche Sequenzen nun teilweise oder völlig synthetisiert worden sind. Sequenzen, die tatsächlich aus Pflanzenpräparaten gereinigt werden oder mit ihnen identisch sind oder für identische Proteine kodieren, werden ungeachtet des Verfahrens, das zur Erlangung des Proteins oder der Sequenz angewendet worden ist, gleichermaßen als natürlich hergeleitet betrachtet.
Folglich wird ein Fachkundiger leicht erkennen, dass Antikörperpräparate, Nucleinsäuresonden (DNA und RNA) und dergleichen hergestellt und verwendet werden können, um „homologe" oder „verwandte" Thioesterasen aus einer Vielzahl von Pflanzenquellen zu screenen und zu gewinnen. Typischerweise sind Nucleinsäuresonden markiert, um die Detektion vorzugsweise mit Radioaktivität zu ermöglichen, obgleich Enzyme oder andere Verfahren ebenso verwendet werden können. Für immunologische Screeningverfahren werden entweder polyklonale oder monoklonale Antikörper eingesetzt. Polyklonale Antiköper sind trotz ihrer geringeren Spezifität bei der Genisolierung typischerweise zweckdienlicher. Zur Detektion ist der Antikörper unter Verwendung von Radioaktivität oder eines beliebigen einer Vielzahl von Sekundärantikörper/Enzymkonjugat-Systemen markiert, die im Handel erhältlich sind. Beispiele von einigen der verfügbaren Antikörper-Detektionssysteme werden von Oberfilder (Focus, BRL Life Technologies Inc. 11, 1–5 (1989)) beschrieben.
Homologe Sequenzen werden gefunden, wenn eine Identität der Sequenz vorliegt, und kann durch Vergleich der Nucleinsäure- oder Aminosäure-Sequenzinformation oder durch Hybridisierungsreaktionen zwischen einer bekannten Thioesterase und einer Kandidatquelle ermittelt werden. Konservative Abänderungen, wie z. B. Glu/Asp, Val/Ile, Ser/Thr, Arg/Lys und Gln/Asn können bei der Ermittlung der Sequenzhomologie ebenfalls berücksichtigt werden. Typischerweise kann eine längere Nucleinsäuresequenz nur 50–60% Sequenzidentität aufweisen und wird bevorzugter zumindest ungefähr 70% Sequenzidentität zwischen der Target-Sequenz und einer gegebenen Pflanzen-Thioesterase von Interesse mit Ausnahme irgendwelcher eventuell vorhandener Deletionen aufweisen und noch immer als verwandt betrachtet werden. Aminosäuresequenzen werden bereits als homolog betrachtet, wenn nur 25% Sequenzidentität zwischen den beiden vollständigen reifen Proteinen vorliegt. (Siehe allgemein: R. F. Doolittle, OF URFS and ORFS (University Science Books, CA (1986)).
Eine genomische oder andere geeignete, aus der Kandidat-Pflanzenquelle von Interesse hergestellte Bibliothek kann mit konservierten Sequenzen aus der Pflanzen-Thioesterase sondiert werden, um homolog verwandte Sequenzen zu identifizieren. Eine gesamte cDNA oder eine andere Sequenz kann eingesetzt werden, wenn kürzere Sondensequenzen nicht identifiziert werden. Positive Klone werden dann mittels Restriktionsenzymverdau und/oder Sequenzierung analysiert. Wenn eine genomische Bibliothek verwendet wird, kann eine oder mehrere Sequenzen identifiziert werden, die sowohl die kodierende Region, als auch die Transkriptionsregulationselemente des Thioesterase-Gens aus einer solchen Pflanzenquelle bereitstellen. Sonden können auch beträchtlich kürzer als die gesamte Sequenz sein. Es können beispielsweise Oligonucleotide verwendet werden, die jedoch zumindest ungefähr 15, bevorzugter zumindest ungefähr 20 Nucleotide lang sind. Wenn kürzere Regionen zum Vergleich verwendet werden, ist ein höherer Grad an Sequenzidentität erforderlich als für längere Sequenzen. Kürzere Sonden sind häufig besonders für Polymerasekettenreaktionen (PCR) zweckdienlich, insbesondere wenn höchst konservierte Sequenzen identifiziert werden können. (Siehe Gould et al., PNAS USA 86, 1934–1938 (1989)).
Wenn längere Nucleinsäurefragmente (> 100 bp) als Sonden eingesetzt werden, insbesondere bei Verwendung vollständiger oder großer cDNA-Sequenzen würde man mit niedrigen Stringenzen screenen (zum Beispiel 40–50°C unter der Schmelztemperatur der Sonde), um ein Signal von der Target-Probe mit 20–50% Abweichung, d. h. homologe Sequenzen zu erhalten. (Siehe Beltz et al., Methods in Enzymology 100, 266–285 (1983)).
Vorzugsweise wird eine wie hierin beschriebene Pflanzen-Thioesterase zumindest ungefähr 30% Sequenzidentität und bevorzugter zumindest ungefähr 50% Sequenzidentität mit zumindest einer Sequenz von 8 Aminosäuren einer exemplifizierten Pflanzen-Thioesterase oder einer Pflanzen-Thioesterase aufweisen, die ihrerseits aus einer Pflanzen-Thioesterase erhalten worden ist. Alternativ dazu wird eine wie hierin beschriebene Pflanzen-Thioesterase zumindest ungefähr 65% Sequenzidentität und bevorzugter zumindest ungefähr 75% Sequenzhomologie mit einer exemplifizierten Pflanzen-Thioesterase oder einer Pflanzen-Thioesterase aufweisen, die ihrerseits aus einer gegebenen Pflanzen-Thioesterase-Sequenz erhalten worden ist. Insbesondere Thioesterasen, die aus einer Aminosäure- oder Nucleinsäuresequenz einer Lorbeer-Thioesterase (siehe 4A oder B) oder einem Sailor-Aminosäurefragment aus Tabelle 9 (Beispiel 14, infra) erlangbar sind, werden insbesondere bevorzugt. Die Pflanzen-Thioesterase kann bevorzugte Aktivität gegenüber länger- oder kürzerkettigen Fettacyl-Substraten aufweisen. Pflanzen-Thioesterasen, die eine lange Ketten bevorzugende Fettacyl-Hydrolyseaktivität oder eine mittlere Ketten bevorzugende Fettacyl-Hydrolyseaktivität aufweisen, werden beide nachstehend als homolog verwandte Proteine aus Gründen angesehen, die weiter unten ausführlicher beschrieben sind.
Wiederum können nicht nur Sequenzen, wie z. B. die in 4 und Tabelle 9 gezeigten, verwendet werden, um homologe Pflanzen-Thioesterasen zu identifizieren, sondern es können die daraus erhaltenen, resultierenden Sequenzen ein weiteres Verfahren bereitstellen, um Pflanzen-Thioesterasen aus anderen Pflanzenquellen zu erhalten. Insbesondere PCR kann eine zweckdienliche Technik sein, um verwandte Pflanzen-Thioesterasen aus hierin bereitgestellten Sequenzdaten zu erhalten. Ein Fachkundiger wird in der Lage sein, Oligonucleotidsonden auf Basis von Sequenzvergleichen von Regionen von typischerweise höchst konservierter Sequenz zu entwerfen. Von speziellem Interesse sind Sonden auf Basis des S828- oder 5829-Fragments aus Tabelle 9. Einzelheiten in Bezug auf Entwurf und Verfahren für eine PCR-Reaktion unter Verwendung dieser Sonden sind in den Beispielen ausführlicher beschrieben.
Es sollte ferner angemerkt werden, dass Pflanzen-Thioesterasen einer Reihe von Quellen verwendet werden können, um Kettenterminationsereignisse der Pflanzenfettsäurebiosynthese in einer Vielzahl von Pflanzen- und In-vivo-Anwendungen zu untersuchen. Da alle Pflanzen anscheinend Fettsäuren über einen gemeinsamen metabolischen Stoffwechselweg synthetisieren, kann die Untersuchung und/oder Anwendung einer Pflanzen-Thioesterase auf einen heterologen Pflanzenwirten leicht in einer Reihe von Spezies erreicht werden. In anderen Anwendungen kann eine Pflanzen-Thioesterase in Verbindung mit Plastid-Lysaten außerhalb der natürlichen Pflanzenquelle der Thioesterase verwendet werden, um die Produktion zu erhöhen und/oder die Zusammensetzung der in vitro hergestellten Fettsäuren zu modifizieren.
Sobald die Nucleinsäuresequenz erlangt ist, ist die Transkription, oder Transkription und Translation (Expression) der Pflanzen-Thioesterase in einer Wirtszelle erwünscht, um eine verfügbare Quelle des Enzyms herzustellen und/oder die Zusammensetzung von darin vorgefundenen Fettsäuren und/oder Triglyceriden zu modifizieren. Andere nützliche Anwendungen in vivo oder in vitro können gefunden werden, wenn die Wirtszelle eine Pflanzenwirtszelle ist.
Beispielsweise kann durch Erhöhen der Menge einer jeweiligen, dem Pflanzen-FAS-Komplex verfügbaren, kürzere Ketten bevorzugenden Thioesterase ein erhöhter prozentueller Anteil von kürzerkettigen Fettsäuren bereitgestellt werden. Auf ähnliche Weise kann es für manche Anwendungen wünschenswert sein, die Menge der in einer Pflanzenzelle endogen exprimierten, kürzere Ketten bevorzugenden Acyl-ACP-Thioesterase beispielsweise durch Antisensetechnologie zu verringern, um den prozentuellen Anteil von längerkettigen Fettsäuren zu erhöhen und umgekehrt. Siehe die anhängige US-Patentanmeldung Nr. 240.408, eingereicht am 30.8.88 ( US 5.107.065 ). je höher die Spezifität der Pflanzen-Thioesterase gegenüber einem gegebenen Fettacyl-Substrat ist, desto mehr Kontrolle kann möglicherweise im FAS-System ausgeübt werden.
Mittlere Ketten bevorzugende Pflanzen-Thioesterasen
Mit dieser Erfindung wird ein Mechanismus für die Biosynthese von Fettsäuren mittlerer Kettenlänge in Pflanzen nachgewiesen. Nämlich, dass spezifische Pflanzen-Thioesterasen mit bevorzugter Aktivität gegenüber mittelkettigen Acylsubstraten an der Akkumulierung mittelkettiger Fettsäuren in zumindest einigen Pflanzenspezies beteiligt sind.
Die Feststellung, dass kettenlängenspezifische Pflanzen-Thioesterasen bei der In-vivo-Produktion mittelkettiger Fettsäuren aktiv sind, weist auf mehrere Möglichkeiten für Pflanzenenzymquellen hin. Und in der Tat finden sich mittelkettige Fettsäuren in einigen Pflanzenspezies in großer Menge. Beispielsweise akkumulieren mehrere Spezies der Gattung Cuphea mittelkettige Fettsäuren enthaltende Triglyceride in ihren Samen, z. B. procumbens, lutea, hookeriana, hyssopifolia, wrightii und inflata. Eine weitere natürliche Pflanzenquelle mittelkettiger Fettsäuren sind Samen der Lauraceae-Familie: z. B. California-Lorbeer (Umbellularia california), Pisa (Actinodophne hookeri), Süß-Lorbeer (Laurus nobilis) und Cinnamomum camphora (Kampfer). Andere Pflanzenquellen umfassen Ulmaceae (Ulme), Myristicaceae, Simarubaceae, Vochysiaceae und Salvadoraceae.
Pflanzen, die signifikante Mengen mittelkettiger Fettsäuren enthalten, sind bevorzugte Kandidaten, um natürlich hergeleitete, mittellange Ketten bevorzugende Pflanzen-Thioesterasen zu erhalten. Es wird auch erkannt werden, dass andere Pflanzenquellen, die keine signifikanten Mengen mittelkettiger Fettsäuren aufweisen, leicht als Quellen anderer Enzyme gescreent werden können. Zusätzlich könnte ein Vergleich zwischen endogenen, mittellange Ketten bevorzugenden Pflanzen-Thioesterasen und zwischen längere und/oder kürzere Ketten bevorzugenden Pflanzen-Thioesterasen Einsichten für die Proteinmodellierung oder andere Modifizierungen liefern, um synthetische, mittellange Ketten bevorzugende Pflanzen-Thioesterasen wie oben diskutiert zu erzeugen.
Von speziellem Interesse sind mittellange Ketten bevorzugende Pflanzen-Thioesterasen, die eine bevorzugte Hydrolyseaktivität gegenüber Fettacyl-ACP-Substraten zeigen. Insbesondere bevorzugt sind mittellange Ketten bevorzugende Pflanzen-Thioesterasen, die eine ausgeprägte Bevorzugung gegenüber C12-Acyl-ACP-, C10-Acyl-ACP- oder C8-Acyl-ACP-Substraten zeigen. Wie oben beschrieben können andere Pflanzenquellen beispielsweise über die Anwendung von Proteinreinigung, Nucleinsäuresonden, Antikörperpräparaten, Proteinmodellierung oder Sequenzvergleichen ebenfalls Quellen für diese Enzyme bereitstellen und von besonderem Interesse sind die jeweiligen Aminosäure- und Nucleinsäuresequenzen, die solchen Pflanzen-Thioesterasen entsprechen. Ebenso wie früher beschrieben können weitere Pflanzensequenzen, wenn einmal die Nucleinsäuresequenz für eine gegebene Pflanzen-Thioesterase erhalten worden ist, verglichen und/oder sondiert werden, um dazu homolog verwandte DNA-Sequenzen und so weiter zu erhalten.
Mittlere Ketten bevorzugende Acyl-ACP-Pflanzen-Thioesterasen sind aus unreifen Embryos des California-Lorbeer- (Umbellularia california-) Baums, hiernach manchmal als „Lorbeer" bezeichnet, und Cuphea hookeriana, hierin manchmal als „Cuphea" bezeichnet, teilweise gereinigt worden. Die Lorbeer-Thioesterase-Enzymaktivität wandert in chromatographischen und elektrophoretischen Trennungen durchwegs gemeinsam mit einem Protein oder Paar von Proteinen, die ein scheinbares Molekulargewicht von un gefähr 34 kD aufweisen. Ein natives Molekulargewicht von ungefähr 42 kD ist mittels Gelfiltration geschätzt worden, was darauf hinweist, dass das Enzym ein Monomer der 34 kD-Untereinheit ist. Die Affinitätschromatographie an immobilisiertem ACP bildet einen entscheidenden Schritt im Reinigungsverfahren und löst die 12 : 0-ACP- und 18 : 1-CP-Thioesterasen ausreichend auf, um zu bestätigen, dass das mittelkettige Enzym eine vernachlässigbare Wirkung auf 18 : 1-ACP aufweist. Der Zeitverlauf der Induktion von 12 : 1-ACP-Thioesterase während der Samenentwicklung zeigt, dass die Fettacyl-Zusammensetzung des Keimblatts sich zum frühesten Zeitpunkt der Enzymaktivität abrupt von langkettigen Acylgruppen zu vorwiegend C10 und C12 ändert.
Wie in den Beispielen ausführlicher dargelegt wird, kann ein Pflanzen-Thioesterase-Präparat, die eine bevorzugte Hydrolaseaktivität gegenüber mittelkettigen Fettacyl-ACP-Substraten des California-Lorbeers aufweist und frei von anderen Pflanzenproteinen ist, wie folgt erhalten werden: Kurz gesagt wird eine Überstandsfraktion von gemahlenen unreifen California-Lorbeer-Embryos einer Ammonsulfatpräzipitation unterzogen, gefolgt von Hydoxylapatit-Säulenchromatographie des wieder aufgelösten Pellets, Anwenden von Carboxymethyl-Sepharose-Chromatographie auf eluierte Fraktionen und weitere Chromatographie an einer Säule von immobilisiertem E. coli-ACP. Ein oder zwei Proteine mit einem ungefähren Molekulargewicht von 34 kD eluieren oder migrieren gemeinsam mit der Enzymaktivität durch eine Vielzahl chromatographischer oder elektrophoretischer Techniken. Diese Proteine entsprechen der mittelkettigen Thioesterase. (Siehe auch Pollard et al., Archiv. Biochem. Biophys. 284, 306–312 (1991), die hiermit durch Verweis aufgenommen ist).
Ebenfalls in den Beispielen beschrieben sind Verfahren, um eine teilweise gereinigte C10 bevorzugende Cuphea-Acyl-ACP-Thioesterase zu erhalten. Die Cuphea-Thioesterase wird aus anderen Pflanzenproteinen teilweise gereinigt und die Aktivität wird auf dieselbe allgemeine Weise wie bei der Lorbeer-Thioesterase bestätigt. Wie in den Beispielen ausführlicher beschrieben wird, können die verschiedenen Puffer und Techniken von denen verschieden sein, die bei der Lorbeer-Extraktion verwendet werden. Die En zymaktivität wird gegen verschieden Acyl-ACP-Substrate verglichen und zeigt signifikant höhere Aktivität gegenüber C10-Acyl-ACP-Substraten im Vergleich zu anderen mittelkettigen Acyl-ACP-Substraten.
Obwohl das resultierende Cuphea-Präparat auch Aktivität gegen längerkettiges Substrat zusätzlich zum mittelkettigen Fettacyl-ACP-Substrat zeigt, werden beide oben beschriebenen Lorbeer- und Cuphea-Präparate dahingehend als „im Wesentlichen frei von anderen Pflanzenproteinen" betrachtet, als dass sie eine erkennbar unterschiedliche bevorzugte Aktivität gegenüber mittelkettigen Fettacyl-ACP-Substraten zeigen. Das/die resultierende(n) teilweise gereinigte(n) Präparate) kann/können durch verschiedene Parameter, einschließlich aber nicht beschränkt auf vergleichende Hemmuntersuchungen und Substratspezifität charakterisiert werden.
Bezüglich den beiden Cuphea- und Lobeer-Präparaten können zusätzliche und/oder alternative Reinigungsschritte erwünscht sein, um den Proteinextrakt zur Homogenität zu reinigen, um die Ausbeute zu erhöhen und dergleichen. Darüber hinaus liegen alternative Reinigungsprotokolle und/oder zusätzliche Reinigungsschritte, nun da die Existenz dieser Proteine bestätigt ist und verschiede Eigenschaften beschrieben sind, im Rahmen der Möglichkeiten eines Fachkundigen.
Andere Pflanzen-Thioesterasen
Sequenzinformationen bezüglich einer aus Saflor (Carthamus tinctorius) erhaltenen, langkettigen Thioesterase werden ebenfalls beschrieben. Interessanterweise ist entdeckt worden, dass zumindest zwei der aus der Saflor-Thioesterase sequenzierten Peptidfragmente hohe Sequenzidentität mit Abschnitten der mittlere Ketten bevorzugenden Lorbeer-Thioesterase aufweisen.
Obgleich sie in den Beispielen ausführlicher beschrieben werden, wurden die Saflor-Thioesterase-Peptidfragmente nach Säurepräzipitation von in Aceton gemahlenen Saflor- Embryos, gefolgt von Chromatographie an einer ACP-Säule und einer Chromatofokussierungssäule erhalten. Über die Analyse von Enzymaktivitätspeaks im Vergleich mit den aus der ACP-Säule erhaltenen Peaks wurden zwei Proteine, eines bei ungefähr 34 kD und eines bei ungefähr 40 kD, zur weiteren Analyse ausgewählt. Nach Bromcyan-Blotting sequenzierte Fragmente sind in Tabelle 9 des Beispiels 14 gezeigt.
Insbesondere ist gefunden worden, dass jedes entsprechend der 34 kD-Bande sequenzierte Fragment in der 40 kD-Bande detektiert wurde. Zusätzlich scheint es so zu sein, dass das 34 kD-Produkt denselben N-Terminus wie das 40 kD-Produkt aufweist. Eine schematische Darstellung, welche die Positionierung verschiedener Fragmente aus Tabelle 9 postuliert, findet sich in 5. Zusätzlich ist gefunden worden, dass Segmente der Lorbeer-Thioesterase-Aminosäuresequenz eine hohe Sequenzidentität mit zumindest zwei der sequenzierten Fragmente, S828 und 5829 aufwiesen.
Gentechnologische Anwendungen
Wie im Fach wohlbekannt ist, kann die Pflanzen-Thioesterase, wenn sie einmal erlangt ist, dazu verwendet werden, ihre dazu entsprechenden Aminosäure- und/oder Nucleinsäuresequenzen zu erhalten. Als kennzeichnendes Beispiel kann die Aminosäuresequenz durch die Sequenzierung von Peptidfragmenten erhalten werden, die aus dem partiellen Proteaseverdau von aus einem Gel gewonnenen Proteinblots resultieren. Zur Sequenzierung kann die Verwendung eines zweidimensionalen Gels gegenüber eines eindimensionalen SDS-PAGE-Gel bevorzugt sein. Die Peptidfragmente können verwendet werden, um Aminosäuresequenzen abzuleiten und letztendlich kann die Aminosäuresequenz erhalten werden. Aus der Aminosäuresequenz kann die Information revers translatiert werden und es können Nucleinsäuresonden zur Verwendung im PCR-Verfahren oder zur Verwendung als Sonden bei der Gewinnung des Gens synthetisiert werden. Als ein weiteres, anderes Beispiel kann das gereinigte Protein verwendet werden, um Antikörper dagegen herzustellen. Die Antikörper, polyklonal oder monoklonal, können auch dazu verwendet werden, um andere immunologisch verwandte Pflanzen- Thioesterase-Gene zu isolieren. Alternative Verfahren werden im Einklang mit Verfahren, die dem Fachkundigen vertraut sind, ebenfalls offenkundig sein.
Die Nucleinsäuresequenzen, die für Pflanzen-Thioesterasen kodieren, können in verschiedenen Konstrukten verwendet werden, beispielsweise als Sonden, um weitere Sequenzen zu erhalten. Alternativ dazu können diese Sequenzen in Verbindung mit geeigneten Regulationssequenzen verwendet werden, um die Anteile der jeweiligen Thioesterase von Interesse in einer Wirtszelle für die Gewinnung oder Untersuchung des Enzyms in vitro oder in vivo zu erhöhen, oder um die Anteile der der jeweiligen Thioesterase von Interesse für einige Anwendungen zu verringern, und zwar wenn die Wirtszelle pflanzlicher Natur ist, einschließlich Pflanzenzellen, Pflanzenteile (einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf Samen, Ableger oder Gewebe) und Pflanzen.
Eine Nucleinsäuresequenz, die für eine Pflanzen-Thioesterase dieser Erfindung kodiert, kann eine genomische, cDNA- oder mRNA-Sequenz umfassen. Mit „kodieren" ist gemeint, dass die Sequenz einer bestimmten Aminosäuresequenz entweder in Sense- oder Antisense-Orientierung entspricht. Mit „extrachromosomal" ist gemeint, dass sich die Sequenz außerhalb des Pflanzengenoms befindet, mit dem sie von Natur aus assoziiert ist. Mit „rekombinant" ist gemeint, dass die Sequenz eine gentechnische Modifikation durch Manipulation über Mutagenese, Restriktionsenzyme und dergleichen enthält. Eine cDNA-Sequenz kann Präprozessierungssequenz, wie z. B. Transitpeptidsequenzen enthalten. Transitpeptidsequenzen erleichtern die Zufuhr des Proteins zu einer bestimmten Organelle und werden vom Aminosäureanteil beim Eintritt in die Organelle abgespalten, wobei die „reife" Sequenz freigesetzt wird. Die Verwendung der Vorläufer-DNA-Sequenz ist in Pflanzenzellen-Expressionskassetten bevorzugt. Andere Plastid-Transitpeptidsequenzen, wie z. B. ein Transitpeptid der Samen-ACP, können eingesetzt werden, um die Pflanzen-Thioesterase dieser Erfindung in verschiedene Organellen von Interesse zu verlagern. Siehe US-Seriennummer 07/437.764, eingereicht am 15.11.89 und Europäische Patentanmeldung Nr. 189.707. Auf ähnliche Weise kann ein gegebenes Pflan zen-Thioesterase-Transitpeptid, wenn es einmal erlangt ist, dazu verwendet werden, um Sequenzen, die nicht dessen native kodierende Region sind, zu verlagern.
Darüber hinaus kann wie oben erörtert die vollständige Genomsequenz der Pflanzen-Thioesterase erhalten werden, indem eine genomische Bibliothek mit einer Sonde, wie z. B. einer cDNA-Sonde gescreent wird und jene Sequenzen isoliert werden, die die Expression in Samengewebe regulieren. Auf diese Weise können die Transkriptions- und Translationsinitiationsregionen, Introns und/oder Transkriptterminationsregionen der Pflanzen-Thioesterase zur Verwendung in einer Vielzahl von DNA-Konstukten mit dem oder ohne das Pflanzen-Thioesterase-Strukturgen erhalten werden. Folglich könnten die Nucleinsäuresequenzen dieser Erfindung, die der Pflanzen-Thioesterase entsprechen, auch Signalsequenzen, die zur Lenkung des Transports in ein Plastid nützlich sein könnten, nicht kodierende 5'-Stromauf-Regulationsregionen (Promotoren) mit nützlichen Gewebe- und Zeitkontrollprofilen, nicht kodierende 3'-stromab-Regulationsregionen, die als Transkriptions- und Translationsregulationsregionen nützlich sind, bereitstellen und könnten Einsichten in andere Eigenschaften des Gens gewähren.
Wenn einmal die gewünschte Pflanzen-Thioesterase-Nucleinsäuresequenz erlangt ist, kann sie auf vielfältige Weise manipuliert werden. Wo die Sequenz nicht kodierende flankierende Regionen umfasst, können die flankierenden Regionen der Resektion, Mutagenese usw. unterzogen werden. Folglich können Transitionen, Transversionen, Deletionen und Insertionen an der natürlich auftretenden Sequenz vorgenommen werden. Zusätzlich kann die gesamte Sequenz oder ein Teil davon synthetisiert werden. Im Strukturgen können ein oder mehrere Codons modifiziert werden, um eine modifizierte Aminosäuresequenz bereitzustellen, oder es können eine oder mehrere Codonmutationen eingeführt werden, um eine zweckdienliche Restriktionsstelle bereitzustellen oder für einen anderen Zweck, der an der Konstruktion und Expression beteiligt ist. Das Strukturgen kann durch Einsatz synthetischer Adaptoren, Linker weiter modifiziert werden, um eine oder mehrere zweckdienliche Restriktionsstellen oder dergleichen einzuführen.
Die für eine Pflanzen-Thioesterase kodierenden Nucleinsäure- oder Aminosäuresequenzen dieser Erfindung können mit anderen, nicht nativen oder „heterologen" Sequenzen auf vielfältige Weise kombiniert werden. Mit „heterologe" Sequenzen ist jede Sequenz gemeint, die sich nicht von Natur aus an die Pflanzen-Thioesterase gebunden findet, beispielsweise einschließlich Kombinationen von Nucleinsäuresequenzen aus derselben Pflanze, die sich nicht von Natur aus miteinander verbunden finden.
Die für eine Pflanzen-Thioesterase kodierende DNA-Sequenz dieser Erfindung kann in Verbindung mit allen oder einem Teil der Gensequenzen eingesetzt werden, die mit Thioesterase assoziiert sind. In ihren Bestandteilen wird eine für Thioesterase kodierende DNA-Sequenz in einem DNA-Konstrukt kombiniert, das in 5'->3'-Transkriptionsrichtung eine Transkriptionsinitiationskontrollregion, die zur Förderung der Transkription und Translation in einer Wirtszelle fähig ist, die für Pflanzen-Thioesterase kodierende DNA-Sequenz und eine Transkriptions- und Translationsterminationsregion aufweist.
Potentielle Wirtszellen umfassen prokaryotische sowie eukaryotische Zellen. Eine Wirtszelle kann einzellig sein oder sich in einem vielzelligen differenzierten oder undifferenzierten Organismus finden, was von der beabsichtigten Verwendung abhängt. Zellen dieser Erfindung sind dahingehend unterscheidbar, dass sie eine darin vorhandene, der Zelle der Wildform fremde Thioesterase aufweisen, zum Beispiel ein darin vorhandenes Nucleinsäurekonstrukt aufweisen, das für eine Pflanzen-Thioesterase kodiert.
Abhängig vom Wirt werden die Regulationsregionen variieren und umfassen Regionen aus viralen, Plasmid- oder chromosomalen Genen und dergleichen. Zur Expression in prokaryotischen oder eukaryotischen Mikroorganismen, insbesondere einzelligen Wirten, kann eine breite Vielfalt von konstitutiven oder regulierbaren Promotoren eingesetzt werden. Die Expression in einem Mikroorganismus kann eine bequeme Quelle des Pflanzenenzyms bereitstellen. Unter Transkriptionsinitiationsregionen, die beschrieben worden sind, befinden sich Regionen aus bakteriellen und Hefe-Wirten, wie z. B. E. coli, B. subtilis, Saccharomyces cerevisiae, einschließlich Gene, wie z. B. Beta-Galactosidase, T7-Polymerase, Tryptophan E und dergleichen.
Vorwiegend werden die Konstrukte in Pflanzen funktionsfähige regulatorische Regionen umfassen, die für eine modifizierte Produktion von Pflanzen-Thioesterase und möglicherweise der Fettsäurezusammensetzung sorgen. Das offene Leseraster, das für die Pflanzen-Thioesterase oder ein Fragment davon kodiert, wird an seinem 5'-Ende an eine Transkriptionsinitiationsregulationsregion, wie z. B. der sich von Natur aus 5'-stromauf des Thioesterase-Strukturgens findenden Sequenz der Wildform, gebunden. Zahlreiche andere Transkriptionsinitiationsregionen sind verfügbar, die eine breite Vielfalt konstitutiver oder regulierbarer, z. B. induzierbarer Transkription der Strukturgenfunktionen bereitstellen. Unter den für Pflanzen verwendeten Transkriptionsinitiationsregionen befinden sich solche Regionen, die mit den Strukturgenen, wie z. B. für Nopalin- und Mannopin-Synthasen, oder mit Napin, ACP-Promotoren und dergleichen assoziiert sind. Die solchen Strukturgenen entsprechenden Transkriptions/Translationsinitiationsregionen finden sich unmittelbar 5'-stromauf des jeweiligen Startcodons. In Ausführungsformen, worin die Expression des Thioesterase-Proteins in einer Pflanzenzelle erwünscht ist, ist die Verwendung des gesamten Pflanzen Thioesterase-Gens oder eines Teils davon erwünscht; es können nämlich die gesamten oder ein Teil der nicht kodierenden 5'-Stromauf-Regionen (Promotoren) gemeinsam mit der Strukturgensequenz und den nicht kodierenden 3'-Stromab-Regionen eingesetzt werden. Wenn ein anderer Promotor erwünscht ist, wie z. B. ein Promotor, der im Pflanzenwirt von Interesse natürlich vorkommt oder ein modifizierter Promotor, d. h. mit Transkriptionsinitiationsregionen, die von einer Gen-Quelle hergeleitet sind, und Transkriptionsinitiationsregionen, die von einer davon verschiedenen Gen-Quelle hergeleitet sind, einschließlich der für die Pflanzen-Thioesterase von Interesse kodierenden Sequenz, oder verstärkte Promotoren, wie z. B. doppelte 35S-CaMV-Promotoren, können die Sequenzen mittels Standardverfahren miteinender verbunden werden.
Für solche Anwendungen, wenn nicht kodierende 5'-Stromauf-Regionen aus anderen, während der Samenreifung regulierten Genen erhalten werden, sind jene erwünscht, die vorzugsweise in Pflanzenembryogewebe exprimiert werden, wie z. B. ACP- und Napinhergeleitete Transkriptionsinitiationsregionen. Solche „samenspezifische Promotoren" können erlangt und gemäß den Lehren der US-Anmeldung mit der Seriennummer 07/147.781, eingereicht am 25.01.88 (nunmehr US-Seriennummer 07/550.804, eingereicht am 09.07.90 ( US 5.420.034 )) und US-Seriennummer 07/494.722, eingereicht am oder ungefähr am 15. März 1990 mit dem Titel „Novel Sequences Preferentially Expressed In Early Seed Development and Methods Related Thereto" ( US 5.530.194 )) verwendet werden.
Transkriptionsinitiationsregionen, die bevorzugt in Samengewebe exprimiert werden, d. h., die in anderen Pflanzenteilen nicht nachweisbar sind, werden als für Fettsäuremodifizierungen wünschenswert betrachtet, um irgendwelche zerstörerischen oder nachteiligen Wirkungen des Genprodukts zu minimieren.
Regulatorische Transkriptterminationsregionen können in DNA-Konstrukten dieser Erfindung ebenfalls bereitgestellt werden. Transkriptterminationsregionen können von der für Pflanzen-Thioesterase kodierenden DNA-Sequenz oder von einer zweckdienlichen Transkriptterminationsregion bereitgestellt werden, die von einer anderen Gen-Quelle, hergeleitet ist, beispielsweise der Transkriptterminationsregion, die von Natur aus mit der Transkriptinitiationsregion assoziiert ist. Wo die Transkriptterminationsregion von einer anderen Ge-Quelle stammt, wird sie zumindest ungefähr 0,5 kb, vorzugsweise 1–3 kb Sequenz 3' des Strukturgens enthalten, aus dem die Terminationsregion hergeleitet ist.
Pflanzen-Expressions- oder Transkriptionskonstrukte, die eine Pflanzen-Thioesterase als die DNA-Sequenz von Interesse für deren erhöhte oder verminderte Expression aufweisen, können mit einer breiten Vielfalt von Pflanzen eingesetzt werden, insbesondere Pflanzen, die an der Produktion von Pflanzenölen zur Verwendung in Speisen und In dustrie beteiligt sind. Insbesondere bevorzugt sind gewisse Ölsamenkulturpflanzen. Pflanzen von Interesse umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf Raps (Canola und Sorten mit hohem Erucasäure-Anteil), Sonnenblume, Saflor, Baumwolle, Cuphea, Sojabohne, Erdnuss, Kokosnuss und Ölpalmen und Mais. Abhängig vom Verfahren zur Einführung der rekombinanten Konstrukte in die Wirtszelle können andere DNA-Sequenzen erforderlich sein.
Bedeutenderweise ist diese Erfindung gleichermaßen auf einkeimblättrige und zweikeimblättrige Spezies anwendbar und ist leicht auf neue und/oder verbesserte Transformations- und Regulationstechniken anwendbar.
Das Verfahren der Transformation ist für die vorliegende Erfindung nicht entscheidend; verschiedene Verfahren der Pflanzentransformation sind zurzeit verfügbar. So wie neuere Verfahren verfügbar sind, um Kulturpflanzen zu transformieren, können sie hierunter direkt angewendet werden. Beispielsweise können viele Pflanzenspezies, die von Natur aus für Agrobacterium-Infektion anfällig sind, erfolgreich über dreiteilige oder binäre Vektorverfahren der Agrobacterium-vermittelten Transformation transformiert werden. Zusätzlich sind Techniken der Mikroinjektion, DNA-Partikelbeschuss, Elektroporation entwickelt worden, welche die Transformation verschiedener einkeimblättriger und zweikeimblättriger Spezies ermöglichen.
Bei der Entwicklung des DNA-Konstrukts werden die verschiedenen Komponenten des Konstrukts oder Fragmente davon normalerweise in einen zweckdienlichen Klonierungsvektor insertiert, der zur Replikation in einem bakteriellen Wirten wie E. coli fähig ist. Es existieren zahlreiche Vektoren, die in der Literatur beschrieben worden sind. Nach jeder Klonierung kann das Plasmid isoliert und weiterer Manipulation, wie z. B. Restriktion, Insertion neuer Fragmente, Ligation, Resektion usw. unterzogen werden, um die Komponenten der gewünschten Sequenz maßzuschneidern. Sobald das Konstrukt fertig gestellt ist, kann es auf einen geeigneten Vektor zur weiteren Manipulation gemäß der Transformationsweise der Wirtszelle übertragen werden.
Normalerweise ist im DNA-Konstrukt ein Strukturgen umfasst, das die erforderlichen Regulationsregionen für die Expression in einem Wirten aufweist und für die Selektion transformierter Zellen sorgt. Das Gen kann Resistenz gegen ein zytotoxisches Mittel, z. B. ein Antibiotikum, Schwermetall, Toxin usw., sowie Komplementierung bereitstellen, die einem auxotrophen Wirten Prototrophie, Virusimmunität und dergleichen verleiht. In Abhängigkeit von der Anzahl verschiedener Wirtsspezies werden Expressionskonstrukt oder Komponenten davon eingeführt, es können ein oder mehrere Marker eingesetzt werden, wo verschiedene Bedingungen zur Selektion für die verschiedenen Wirte verwendet werden.
Es wird angemerkt, dass die Degeneration des DNA-Codes dafür sorgt, dass einige Codonsubstitutionen der DNA-Sequenz ohne irgendwelche entsprechenden Modifizierungen der Aminosäuresequenz erlaubt sind. Wenn eine beliebige, nicht von einer Pflanze hergeleitete DNA-Sequenz in einer Pflanzenwirtszelle zu exprimieren ist, ist die Verwendung von „Pflanzen-bevorzugten Codons" wünschenswert.
Wie oben erwähnt, ist die Art und Weise, wie das DNA-Konstrukt in den Pflanzenwirt eingeführt wird, für diese Erfindung nicht entscheidend. Jedes Verfahren, das für die effiziente Transformation sorgt, kann eingesetzt werden. Verschiedene Verfahren zur Pflanzenzellentransformation umfassen die Verwendung von Ti- oder Ri-Plasmiden, Mikroinjektion, Elektroporation, DNA-Partikelbeschuss, Liposomfusion, DNA-Beschuss und dergleichen. In vielen Fällen wird es wünschenswert sein, das Konstrukt an einer oder beiden Seiten durch T-DNA zu begrenzen, besonders die linken und rechten Begrenzungen, insbesondere die rechte Begrenzung. Dies ist insbesondere zweckdienlich, wenn das Konstrukt A. tumefaciens oder A. rhizogenes als Transformationsart verwendet wird, obgleich die T-DNA-Begrenzungen mit anderen Transformationsarten Verwendung finden können.
Wo Agrobacterium für die Pflanzenzellentransformation verwendet wird, kann ein Vektor verwendet werden, der in den Agrobacterium-Wirten für die homologe Rekombina tion mit T-DNA oder dem im Agrobacterium-Wirten vorhandenen Ti- oder Ri-Plasmid eingeführt werden kann. Das Ti- oder Ri-Plasmid, das die T-DNA zur Rekombination enthält, kann "gerüstet" (zur Bildung von Galle fähig) oder "abgerüstet" (zur Bildung von Galle unfähig) sein, wobei letzteres zulässig ist, solange die vir-Gene im transformierten Agrobacterium-Wirten vorhanden sind. Das gerüstete Plasmid kann ein Gemisch von normalen Pflanzenzellen und Galle bilden.
In einigen Fällen, wo Agrobacterium als Vehikel zur Transformierung von Pflanzenzellen verwendet wird, wird das von (der) T-DNA-Begrenzungen) begrenzte Expressionskonstrukt in einen Breitbandwirtsvektor insertiert, wobei Breitbandwirtsvektoren in der Literatur beschrieben werden. Allgemein verwendet wird pRK2 oder ein Derivat davon. Siehe beispielsweise Ditta et al., PNAS USA 77, 7347–7351 (1980) und EP-A 120.515, die hierin durch Verweis aufgenommen sind. Umfasst in Expressionskonstrukt und T-DNA sind ein oder mehrere Marken, die die Selektion von transformiertem Agrobacterium und transformierten Pflanzenzellen ermöglichen. Eine Reihe von Markern sind zur Verwendung mit Pflanzenzellen entwickelt worden, wie z. B. Resistenz gegen Chloramphenicol, das Aminoglykosid G418, Hygromycin oder dergleichen. Der jeweils verwendete Marker ist für diese Erfindung nicht essentiell, wobei ein oder mehrere Marker abhängig vom jeweiligen Wirt und der Konstruktionsweise bevorzugt werden.
Zur Transformation von Pflanzenzellen unter Verwendung von Agrobacterium können Explantate kombiniert und mit dem transformierten Agrobacterium für ausreichend lange Zeit zur Transformation inkubiert, die Bakterien abgetötet und die Pflanzenzellen in einem geeigneten Selektionsmedium kultiviert werden. Sobald sich der Kallus bildet, kann die Sprösslingsbildung durch Verwendung geeigneter Pflanzenhormone nach bekannten Verfahren gefördert und die Sprösslinge in Wurzelbildungsmedium zur Neubildung von Pflanzen übertragen werden. Die Pflanzen können dann zur Samenbildung gezüchtet und der Samen dazu verwendet werden, repetitive Generationen zu etablieren und Pflanzenöle zu isolieren.
Die nunmehr allgemein beschriebene Erfindung wird durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele leichter verständlich, wobei die Beispiele ausschließlich zum Zwecke der Veranschaulichung aufgenommen sind und die vorliegende Erfindung nicht einschränken sollen.
Beispiele
In der nun folgenden experimentellen Offenbarung sind, wenn nicht anders verzeichnet, alle Temperaturen in Grad Celsius (°C), Gewichte in Gramm (g), Milligramm (mg) oder Mikrogramm (μg) angegeben, Konzentrationen sind als Molar (M), Millimolar (mM) oder Mikromolar (μM) angegeben und alle Volumina sind in Litern (I), Mikrolitern (μl) oder Millilitern (ml) angegeben.
Beispiel 1 – Test auf C12-bevorzugender Acyl-ACP-Thioesterase
Um auf C12-Thioesterase-Aktivität zu testen, wird das folgende Gemisch bei 30°C für 30 Minuten inkubiert: „Puffer", 7 mM KHP₂O₄-KOH, pH 8, 20% (v/v) Glycerin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 0,1% (v/v) Triton X100 umfassend; die auf Aktivität zu testende Probe im selben oder in einem ähnlichen Puffer wie der in Beispiel 2 beschriebene „Extraktionspuffer"; und 5 μl ¹⁴C-radiomarkiertes Lauroyl-ACP-Substrat für ein Gesamtvolumen von 100 μl und eine Lauroyl-ACP-Endkonzentration von 0,5 μM. Lauroyl-ACP-Substrat wird gemäß dem Verfahren von Rock et al. (Methods in Enzymology 72, 397–403 (1981)) hergestellt, wobei aus Escherichia coli mittels dem Verfahren von Rock und Cronan (Methods in Enzymology 71, 341–351 (1981)) hergestelltes ACP verwendet wird. Das Lauroyl ist in der Carboxylgruppe in einer spezifischen Radioaktivität von 50–60 μCi/μmol radiomarkiert.
Die Reaktion wird durch Zugabe von 0,5 ml kalter (0°) 10%iger (v/v) Essigsäure gestoppt. Das Fettsäureprodukt der hydrolytischen Enzymwirkung wird durch Zugabe von 1 ml Diethylether und kräftiges Mischen vom nicht hydrolysierten Substrat extrahiert. Nach dem Absetzen für einige Minuten wird die obere Etherschicht auf 5 ml Szintillationsflüssigkeit zur Bestimmung der Radioaktivität durch Flüssigszintillationsspektrometrie überführt. Wenn erwünscht, können zusätzliche Etherextraktionen durchgeführt werden, um verbleibende Spuren des Reaktionsprodukts für die genauere Quantifizierung der Enzymaktivität zu gewinnen. Die Menge der mit Ether extrahierten Radioaktivität ist ein direktes Maß der C12-bevorzugenden Acyl-ACP-Thioesterase-Aktivität vorausgesetzt, dass die Enzymmenge nicht ausreicht, mehr als ungefähr 25% des Substrats zu hydrolysieren. Bei einer höheren Aktivität als dieser wird die Beziehung zwischen Radioaktivität in der Etherschicht und der Enzymmenge deutlich unlinear. Das Enzympräparat muss geeignet verdünnt werden, um die Aktivität in den linearen Bereich des Tests zu bringen.
Die Aktivität wird als Thioesterase bestätigt, indem das etherlösliche Produkt mittels Dünnschichtchromatographie (DC) analysiert wird. Da Produkt wandert auf eine Silika-DC-Platte (Lösungsmittel: 80% Hexan, 20% Diethylether, 1% Essigsäure (v/v)) gemeinsam mit authentischem Laurat. Wenn unter Verwendung der das Produkt enthaltenden Etherschicht aus dem Testverfahren Phenacetylester hergestellt werden (R. F. Borch, Analytical Chemistry 47, 2437–2439 (1975)), wandert der resultierende Fleck gemeinsam mit authentischem Lauroylphenacetylester an einer C18-DC-Platte (Lösungsmittel: 100% Methanol), wie es auch das Produkt der basischen Hydrolyse des Lauroly-ACP-Substrats tut. Diese Beobachtungen verifizieren, dass das mit Ether extrahierte Produkt der Enzymreaktion freies Laureat ist. Es wird ferner abgeleitet, dass das Enzym von Interesse die Thioesterbindung hydrolysiert, es kann z. B. keine Protease sein, die den ACP-Anteil des Substrats angreift, da sonst das Produkt Lauroyl-Phosphopantethein wäre, das am DC unterschiedlich gewandert wäre.
Beispiel 2 – Lorbeer-Thioesterase-Reinigung und Identifizierung
Unreife Samen vom Umbellularia californica („Lorbeer") werden in einem Stadium geerntet, in dem Decanat und Laurat in der Fettsäurezusammensetzung vorwiegen, wie durch Gesamtfettsäureanalyse der Keimblätter ermittelt wurde. Die Keimblätter aus solchen Samen werden von anderen Samenteilen seziert und bei –70°C eingefroren. Dies stellt die Gewebequelle für die Enzymextraktion dar.
Die gefrorenen Keimblätter werden in einem Edelstahlmörser und Pistill bei ungefähr – 70°C pulverisiert und das Pulver unter flüssigem Stickstoff oder bei –70°C bis zum Gebrauch gelagert. Die Extraktion wird durch Zugabe von 4 ml/g „Extraktionspuffer", der 50 mM KHP₂O₄-KOH, pH 6,9. 5 mM Ethylendiamintetraacetat (EDTA), 2 mM DTT, 1 mM Natriumascorbat, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 1 μM Leupeptin und 1 μM Pepstatin zum Pulver bei 0–4°C erzielt. Das gerührte Gemisch von Pulver und Puffer wird in einem motorgetriebenen Mazerator (Brinkmann (Westbury, NY) „Polytron", drei Schübe von je 45 Sekunden) gemixt und dann durch vier Schichten Gaze filtriert. Dieser und alle nachfolgenden Schritte werden bei 4°C durchgeführt. Das erhaltene Filtrat wird bei ungefähr 14.000 × g (max.) für 30 Minuten zentrifugiert. Die Überstandsfraktionen werden durch „Miracloth" (Calbiochem Corp., LaJolla, CA) filtriert und die erhaltene Flüssigkeit wird als „Rohextrakt" bezeichnet.
Das Rohextrakt wird wie folgt der Ammonsulfatfraktionierung unterzogen. Eine ausreichende Menge Ammonsulfat wird schrittweise unter Rühren über 30 Minuten zugegeben, bis eine Sättigung von 70% erreicht ist. Das Präparat wird dann für weitere 30 Minuten gerührt. Nach dem Zentrifugieren wie oben wird das Pelletmaterial in Extraktionspuffer (2 ml/g Gewebeanfangsgewicht) resuspendiert und für 10 Minuten bis zur Auflösung gerührt. Danach wird Ammonsulfat wie oben zugegeben, diesmal jedoch nur eine zur Erzielung von 50% Sättigung ausreichende Menge. Nach Zentrifugation wie oben wird die Überstandsfraktion verworfen. Das pelletierte Material, das die C12 bevorzugende Acyl-ACP-Thioesterase enthält, kann durch Eintauchen in Flüssigstickstoff einge froren und dann, wenn erwünscht, in diesem Stadium bei –70°C gelagert werden. Das resultierende Material wird als „Ammonsulfatfraktion" bezeichnet. Es geht sehr wenig der C12 bevorzugenden Acyl-ACP-Thioesterase-Aktivität verloren, wenn das Pellet sehr schnell eingefroren wird.
Nach dem eventuell notwendigen Auftauen auf 4°C wird das Pellet in „HA1-Puffer" gelöst (1 ml/g Gewebeanfangsgewicht), der 50 mM KHP₂O₄-KOH, pH 6,9, 25% (w/v) Glycerin und 1 mM DTT umfasste. Das resuspendierte Präparat wird in einen Dialyseschlauch (12.000–14.000 Molekulargewichts-Cutoff) gegeben und gegen HA1-Puffer dialysiert. (Typischerweise erfordert ein Präparat von 600 g Keimblattgewebe zwei aufeinander folgende Dialyseschritte gegen je 4 Liter Puffer für zumindest je drei Stunden). Vor der Aufgaben auf die erste Säule wird das dialysierte Material wie oben zentrifugiert und das pelletierte Material verworfen.
Das Überstandsmaterial aus der Zentrifugation nach der Dialyse wird auf eine in HA1-Puffer äquilibrierte Hydoxylapatitsäule (HA-Ultrogel von IBF Biotechnics, Katalog-Nr. 247741, Savage, MD; für ein Präparat von 500–1200 g Gewebe typischerweise 10 cm Durchmesser × 12,5 cm Betthöhe) aufgegeben. Die Säule wird dann mit HA1-Puffer gewaschen, bis sich die Absorption des Eluats bei 280 nm nicht mehr ändert. Eine beträchtliche Proteinmenge und gelegentlich eine kleine Menge C12 bevorzugende Acyl-ACP-Thioesterase binden nicht an die Säule und werden ausgewaschen. Der Hauptteil der C12 bevorzugenden Acyl-ACP-Thioesterase-Aktivität bindet und wird durch Aufgeben von 400 mM KHP₂O₄-KOH, pH 6,9, 25% (w/v) Glycerin, 1 mM DTT eluiert. Das Eluat wird in Fraktionen (5–10 ml Volumen) gesammelt, die dann auf C12 bevorzugende Acyl-ACP-Thioesterase-Aktivität getestet werden. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und wie oben beschrieben dialysiert, und zwar gegen „CM1-Puffer", der 5 mM KHP₂O₄-KOH, pH 6,5, 25% (w/v) Glycerin, 1 mM EDTA, 1 mM DTT enthält (typischerweise drei Dialyseschritte von zumindest je 3 Stunden Dauer gegen je 4 Liter). Nach der Dialyse wird das Material mittels Zentrifugation wie früher beschrieben geklärt, wobei die Pellets verworfen wurden.
Die Überstandsfraktion wird dann auf eine mit CM1-Puffer äquilibrierte Kationentauschersäule (Pharmacia CM-Sepharose Fast Flow, Piscataway, NJ, Katalog-Nr. 17-0719-01, 10 cm Durchmesser × 14 cm Betthöhe) aufgegeben. Nach der Beladung wird die Säule mit CM1-Puffer gewaschen, bis sich die Absorption des Eluatstroms bei 280 nm nicht mehr ändert. Eine beträchtliche Proteinmenge und eine signifikante Menge (z. B. 50%) der C12 bevorzugenden Acyl-ACP-Thioesterase binden nicht an die Säule und werden ausgewaschen. Diese teilweise Bindung der C12 bevorzugenden Acyl-ACP-Thioesterase ist untersucht worden und erwies sich als Aggregation dieses Enzyms mit anderen, nicht identifizierten Proteinen zum Zeitpunkt der Extraktion. Tatsächlich liegen bis zu diesem Punkt des Reinigungsschemas zwei Populationen der C12 bevorzugenden Acyl-ACP-Thioesterase vor, freies Enzym und Aggregate. Die Kationentauschersäule trennt diese beiden Formen und das Aggregat wird verworfen. Die nicht aggregierte Form der C12-Acyl-ACP-Thioesterase wird durch Aufgabe von „CM2-Puffer", der 50 mM KHP₂O₄-KOH, pH 6,9, 150 mM NaCl, 25% (w/v) Glycerin, 1 mM EDTA und 1 mM DTT umfasst, aus der Säule eluiert. Das Eluat wird wie vorher fraktioniert und getestet und die aktiven Fraktionen werden vereinigt und gegen „ACP1-Puffer" dialysiert, der 10 mM KHP₂O₄-KOH, pH 6,5, 150 mM NaCl, 25% (w/v) Glycerin, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,1% (w/v) 3-[3-Chloramidopropyl)dimethylammonium]-1-propansulfonat (CHAPS) umfasst. Typischerweise sind zwei aufeinander folgende Dialyseschritte von zumindest je 3 Stunden gegen je 4 Liter für ein Präparat von 600 g Gewebe ausreichend.
Das dialysierte Material wird dann auf eine Säule von immobilisiertem ACP (2,5 cm Durchmesser × 10,5 cm Betthöhe) aufgegeben. Diese Säule wird durch Kopplung von Escherichia coli-ACP an Bromcyan-aktivierte Sepharose 4B gemäß den vom Hersteller dieser Säulenpackung (Pharmacia Inc., Piscataway, NJ) bereitgestellten Anleitungen hergestellt. Das E. coli-ACP wird wie in Beispiel 1 verwiesen hergestellt. Vor der Verwendung wird die Säule mit ACP1-Puffer äquilibriert. Das dialysierte Material aus der Kationentauschersäule wird mit 1–1,3 ml/min aufgegeben und es werden während des gesamten Prozesses Fraktionen von 8 ml gesammelt. Die Fraktionen werden auf C12-bevorzugende Acyl-ACP-Thioesterase-Aktivität und auf Gesamtproteingehalt unter Anwen dung eines Coomassieblau-Testverfahrens (BioRad Inc., Richmond, CA, Katalog-Nr. 500-0001) getestet. Eine beträchtliche Proteinmenge wird ohne Bindung aus der Säule ausgewaschen. Fast die gesamte C12-bevorzugende Acyl-ACP-Thioesterase-Aktivität bindet. Die Säule wurde mit ACP1-Puffer gewaschen, bis der Proteintest kein Protein mehr in Eluat detektiert. Sie wird dann mit 50 mM KHP₂O₄-KOH, pH 8,5, 50 mM Glycin, 25% (w/v) Glycerin, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,1% (w/v) CHAPS enthaltendem „ACP2-Puffer" gewaschen. Dieser Waschvorgang mit hohem pH-Wert dient der Entfernung unspezifisch gebundenen Proteins. Eine kleine Menge C12-Acyl-ACP-Thioesterase-Aktivität wird gelegentlich damit gemeinsam eluiert. Nachdem der Proteintest wiederum angezeigt hat, dass kein Protein mehr eluiert, wird ein linearer „Elutionsgradient" angewendet. Dieser umfasst insgesamt 560 ml „ACP3-Puffer" (100 mM KHP₂O₄-KOH, pH 6,9, 25% (w/v) Glycerin, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,1% (w/v) CHAPS) und „ACP4-Puffer" (500 mM KHP₂O₄-KOH, pH 6,9, 25% (w/v) Glycerin, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,1 (w/v) CHAPS). Wenn C12-bevorzugende Acyl-ACP-Thioesterase-Aktivität am Ende des Gradienten nach wie vor eluiert, kann dessen Elution durch Aufgeben von mehr ACP4-Puffer vervollständigt werden. Die gesammelten Fraktionen werden wie vorher getestet und es wird auch ein zweiter C12-bevorzugender Acyl-ACP-Thioesterase-Test mit fünfzigfach verdünnten Fraktionen durchgeführt. Durch Ausgleich der Nichtlinearität des Tests liefert dies eine genauere Bestimmung des maximalen Enzymaktivität. Die C12-bevorzugende Acyl-ACP-Thioesterase-Aktivität ist in den im Gradienten eluierten Fraktionen als zwei Peaks vorhanden, wobei ein kleinerer unmittelbar vor einem viel größeren eluiert.
Die jeden Peak umfassenden Fraktionen werden getrennt vereinigt. Der größere, später eluierende Peak ist das reinste Material, das für anschließende Experimente, Proteinsequenzierung usw. verwendet wird. Die Analyse dieses Materials mittels typischer SDS-PAGE-Verfahren zeigt nur 5–6 stark färbende Banden, einschließlich einer Bande mit einem ungefähren Molekulargewicht bei 34 kD und einige wenige schwächer färbende.
Aliquote von Fraktionen aus der ACP-Säule werden mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Silberfärbung analysiert. Das Bandenmuster am Peak der eluierten Aktivität ist deutlich einfacher als Durchflussmaterial und bei pH 8,5 eluiertes Material. Bandenmuster werden von Fraktion zu Fraktion verglichen, um Banden zu identifizieren, deren Intensitäten in Übereinstimmung mit 12 : 0-ACP-Thioesterase-Aktivität ansteigen und abfallen. Ein Bandenmuster, das einem ungefähren Molekulargewicht von 34 kD entspricht, erfüllte dieses Kriterium. In einigen Präparaten wird an dieser Position am SDS-Gel eine Doppelbande in engem Abstand beobachtet.
Alternativ dazu kann eine Vielfalt von chromatographischen und elektrophoretischen Techniken auf den im Wesentlichen gereinigten 12 : 0-ACP-Thioesterase-Pool aus der ACP-Säule angewendet werden, einschließlich lonenaustauschchromatographie, Chromatographie mit immobilisiertem Farbstoff und native Gelelektrophorese. Keine davon reinigt das Enzym zur elektrophoretischen Homogenität. Jedoch eluiert oder wandert in allen Fällen eine Bande oder ein Bandenpaar mit einem Molekulargewicht von ungefähr 34 kD gemeinsam mit der Enzymaktivität. Die beste Auflösung wird durch Chromatographie an S-Sepharose, gefolgt von Blue-4-Agarose erhalten, wobei die informativste Trennung an der abschließenden Blue-4-Agarosesäule auftritt. Die am reichlichsten eluierten Proteine sind jene mit einem ungefähren Molekulargewicht von 65 kD, 39 kD und 34 kD (Doppelbande). Nur das 34 kD-Paar eluiert gleichzeitig mit der 12 : 0-ACP-Thioesterase-Aktivität.
Beispiel 3 – Inhibitoruntersuchungen der C12-bevorzugenden Acyl-ACP-Thioesterase
Die untenstehende Tabelle 1 zeigt die Inhibierung der C12-bevorzugenden Lorbeer-Keimblatt-Acyl-ACP-Thioesterase durch Thiolreagenzien, die beobachtet wurde, wenn eine Ammonsulfatfraktion (Siehe Beispiel 2) getestet wurde (siehe Beispiel 1).
Tabelle 1
Nach Entfernung von Dithioerythrit aus einem Ammonsulfatfraktionspräparat durch Passieren einer kleinen Säule von Gelfiltrationsmedium G25-50 (Pharmacia, Piscataway, NJ) wurden die folgenden Ergebnisse beobachtet.
Tabelle 2
Diese vorläufigen Inhibitoruntersuchungen weisen darauf hin, dass die C12-bevorzugende Acyl-ACP-Thioesterase gegen 5 mM Iodacetamid unempfindlich ist und von 5 mM N-Ethylmaleimid nahezu vollständig inhibiert wird. Diese Ergebnisse weisen zeigen an, dass die C12-bevorzugende Acyl-ACP-Thioesterase eher eine Esterase des „aktiven Thiol"-Typs als eine des „aktiven Serin"-Typs ist.
Beispiel 4 – Substratspezifität der Acyl-ACP-Thioesterase aus Funktion der Kettenlänge
In Tests zum Vergleich der Aktivität der Ammonsulfatfraktionspräparate der C12-bevorzugenden Lorbeer-Acyl-ACP-Thioesterase von Beispiel 2 gegenüber mittelkettigen Fettsäuren verschiedener Länge im Test von Beispiel 1 äußerte sich die höchste Aktivität gegenüber C12-ACP- im Vergleich zu C8-, C10-, C11-, C14- und C16-ACP-Substraten, wie in Tabelle 3 gezeigt ist.
Tabelle 3
Beispiel 5 – Substratspezifität der C12-bevorzugenden Thioesterase als Funktion von ACP gegenüber CoA
Rohextrakte von Lorbeer-Keimblättern hydrolysieren Lauroyl-Coenzym A (CoA) sowie Lauroyl-ACP. Dies liegt an der Anwesenheit gesonderter Enzyme, die an den jeweiligen Substraten wirken, d. h., weil die C12-bevorzugende Acyl-ACP-Thioesterase auf Lauroyl-ACP wirkt und ein anderes Enzym auf Lauroyl-CoA wirkt. Der unterschiedliche Charakter dieser Enzyme zeigt sich durch ihre Trennung im ACP-Säulen-Stadium des Reinigungsschemas. Lauroyl-CoA-Hydrolyseaktivität findet sich hauptsächlich im Material, das nicht an die ACP-Säule bindet und die C12-bevorzugende Acyl-ACP-Thioesterase- Aktivität findet sich in dem Material, das bindet und anschließend mit einem Phosphatkonzentrationsgradienten eluiert wird. Die Aktivitäten der Peakfraktion des ungebundenen und gebundenen Materials dienen zur Veranschaulichung dieser Trennung, wie in der folgenden Tabelle gezeigt ist.
Tabelle 4
Daher zeigt die C12-bevorzugende Lorbeer-Acyl-ACP-Thioesterase viel mehr Aktivität gegenüber Lauroyl-ACP als gegenüber Lauroyl-CoA.
Beispiel 6 – Rolle des Enzyms bei der Laurat-Produktion
Weitere Belege dafür, dass die C12-bevorzugende Acyl-ACP-Thioesterase an der Biosynthese von Lauratgruppen beteiligt ist, die in Lorbeersamen vorwiegen, stammen von einem Vergleich der extrahierbaren Aktivität des Enzyms in zwei verschiedenen Stadien der Samenentwicklung. Wie in der folgenden Tabelle, Tabelle 5 gezeigt, liefern sehr junge Samen, die nur langkettige Fettsäuren und unwesentliche Mengen Laurat enthalten, viel weniger C12-bevorzugende ACP-Thioesterase als ältere Samen, die signifikante Mengen von Laurat akkumuliert haben. Es scheint daher so zu sein, dass signifikante Aktivität dieses Enzyms nur dann vorhanden ist, wenn die Samen Laurat akkumulieren. Zusätzlich scheint ein viel geringerer Unterschied der Lauroyl-CoA-Hydrolyseaktivität vorzuliegen, was damit im Einklang steht, dass es sich um unterschiedliche Enzyme handelt, wie oben in Beispiel 5 diskutiert wurde.
Tabelle 5
Beispiel 7 – In-vitro-Lorbeer-Fettsäuresynthesetest
Eine Ammonsulfatfraktion eines Lorbeeer-Embryo-Extrakts wird dieselben spezifischen Fettsäuren wie jene synthetisieren, die sich im reifenden Samen finden, wenn sie mit E. coli-ACP, Malonyl-CoA und anderen typischen Cofaktor- und Substraterfordernissen von dokumentierten Fettsäure synthetisierenden In-vitro-Systemen ergänzt wird (Jaworski et al., Arch. Biochem. Biophys. 163, 769–776 (1974)). Die Produkte dieser In-vitro-Aktivität umfassen wasserlösliche Octanoyl- und Decanoylester, jedoch nahezu undetektierbare Mengen von wasserlöslichem Lauroylester, obwohl Laurat das hauptsächliche freie Fettsäureprodukt ist. Diese Ergebnisse werden am einfachsten unter dem Gesichtpunkt des Fettsäure synthetisierenden Systems erklärt, das Acyl-ACPs von sukzessiv erhöhter Kettenlänge produziert, und der spezifischen Lauroyl-ACP-Thioesterase, die das Acyl-ACP abfängt, wenn der Acylanteil sich auf bis zu zwölf Kohlenstoffatome verlängert hat, indem die Acyl- und ACP-Teile in diesem Stadium durch Hydrolyse abgespalten werden.
Beispiel 8 – Test auf C-10-bevorzugende Acyl-ACP-Thioesterase
Nach denselben allgemeinen Verfahren, wie sie in Beispiel 1 dargestellt sind, wird zum Testen auf C10-Thioesterase-Aktivität das folgende Reaktionsgemisch bei 30°C für 10-60 Minuten inkubiert: 50 μl zu testende Probe im selben oder einem ähnlichen „Extraktionspuffer", wie er in Beispiel 9A beschrieben wird, und ungefähr 250 pmol [¹⁴C]-radiomarkiertes Acyl-ACP-Substrat (für gewöhnlich wird Decanoyl-ACP in der Carboxylgruppe auf 50–60 μCi/μmol markiert) in einem Gesamtvolumen von 50 μl für eine Decanoyl-Endkonzentration von 0,5–5,0 μM, typischerweise 5,0 μM. Die Reaktion wird durch Zugabe von 0,5 ml 10%iger (v/v), kalter (4°) Essigsäure und indem das Reaktionsgemisch für einige Minuten auf Eis gegeben wird gestoppt. Das Fettsäureprodukt der hydrolytischen Enzymwirkung wird vom nicht hydrolysierten Substrat durch Zugabe von 2 ml Diethylether und heftiges Mischen extrahiert. Der Ether wird auf 5 ml Szintillationsflüssigkeit zur Szintillationszählung übertragen. Zusätzliche Etherextraktionen können, wenn erwünscht, durchgeführt werden, um verbleibende Spuren des Produkts zur genaueren Quantifizierung der Aktivität zu gewinnen.
Beispiel 8A
Als Alternative zu Beispiel 8 wird die Enzymaktivität durch Zugabe von 25 μl Probe zu einem Fläschchen mit Schraubverschluss getestet. Als nächstes wird konzentriertes radioaktives Substrat [¹⁴C]-C10 : 0-ACP, 54,7 μCi/μmol dem Fläschchen zugesetzt, so dass die Substratkonzentration im Testendvolumen von 100 μl 0,5 μM beträgt. Schließlich wird ausreichend Testpuffer (100 mM Glycin-HCl, pH 9, 0,2% CHAPS, 10 mM β-Mercaptoethanol) dem Fläschchen zugegeben, so dass das Gesamtvolumen 100 μl beträgt. Das Gemisch wird durch Inkubieren bei 30°C für 30 Minuten zur Reaktion gebracht. Die Reaktion wird durch Zugabe von 0,5 ml 10%ige (v/v) Essigsäure und dann 1 ml Diethylether (wasserfrei) gestoppt. Das radiomarkierte freie Fettsäureprodukt wird durch kräftiges Mischen der gestoppten Reaktion extrahiert. Die Etherphase wird dann auf 5 ml Szintillationsflüssigkeit übertragen und die Radioaktivität mittels Flüssigszintillationszählung bestimmt.
Beispiel 9 – Reinigung und Identifizierung von C10-bevorzugender Cuphea-Acyl-ACP-Thioesterase
Unreife Samen von Cuphea hookeriana werden geerntet. Die Gesamtfettsäurezusammensetzung von einigen wenigen der geernteten Samen wird mittels Standardverfahren analysiert, um sicherzustellen, dass sie sich im richtigen Entwicklungsstadium befinden. Dies ist definiert als das Stadium, in dem Octanat und Decanat in der Fettacylzusammensetzung überwiegen. Die geernteten Samen werden bei –70°C gefroren gelagert. Dies stellt die Gewebequelle für die Enzymextraktion dar.
Beispiel 9A
Ein erstes Verfahren zur Reinigung und Identifizierung einer C10-bevorzugenden Cuphea-Acyl-ACP-Thioesterase wird bereitgestellt.
Ein Acetonpulver wird durch Zerreiben der Samen zu einem Pulver in einem Mörser mit Pistill unter Flüssigstickstoff und anschließendes Zerreiben des Pulvers in einem Mörser mit Pistill mit kaltem Aceton (bei ungefähr –20°C) hergestellt. Das Pulver wird durch Filtration gesammelt und mit kaltem Ether gewaschen, um verbleibende Acetonspuren zu entfernen. Es wird dann mit 10 ml 50 mM KHP₂O₄-KOH, pH 7,5, 10 mM 2-Mercaptoethanol enthaltendem „Extraktionspuffer" je Gramm Acetonpulver extrahiert (dieser und alle anschließenden Schritte werden bei 0–4 °C durchgeführt). Das Homogenisat wird bei 11.000 × g für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert und die Überstandsfraktion für die anschließenden Reinigungsschritte nach Filtration durch zwei Schichten Miracloth (Calbiochem Inc., LaJolla, CA) verwendet.
Die Überstandsfraktion wird dann der Ammonsulfatfraktionierung unterzogen. Das Ammonsulfatpellet bei 40–60% Sättigung (wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt) wird wieder in „Puffer" aufgelöst, der 50 mM KHP₂O₄-KOH, pH 5,9, 10% (v/v) Glycerin und 10 mM 2-Mercaptoethanol umfasst, und gegen dieses Puffer dialysiert, um verbleibendes Ammonsulfat zu entfernen.
Das erhaltende Präparat wird dann der Hydroxylapatit-Chromatographie unterzogen. Das folgende Verfahren gilt für eine Ammonsulfatfraktion aus 100 g Anfangsfrischgewicht Samengewebe. Die dialysierte Ammonsulfatfraktion (35–40 ml) wird auf eine mit 50 mM KHP₂O₄-KOH, pH 6,9, 10% (v/v) Glycerin und 4 mM 2-Mercaptoethanol äquilibrierte Hydroxylapatit-Säule (2,5 cm × 14 cm Betthöhe Bio-Gel http von Bio-Rad Inc., Richmond, CA, Katalog-Nr. 130–0420) aufgegeben. Die Säule wird dann mit 280 ml desselben Puffers gewaschen (durchgehend 1,5 ml/min Flussrate). Die Elution wird mit 580 ml eines linearen Gradienten von diesen Bedingungen ausgehend auf 350 mM KHP₂O₄-KOH, pH 6,9, 10% (v/v) Glycerin und 4 mM 2-Mercaptoethanol erzielt, wobei Fraktionen von 12 ml Volumen gesammelt werden. Die eluierten Fraktionen werden mit Decanoyl-ACP als Substrat auf Hydrolaseaktivität getestet.
Zwei Peaks mit Aktivität werden erhalten, wobei einer die Säule ohne Bindung passiert und der andere bindet und anschließend mit dem Phosphatgradienten eluiert wird. Beide Peaks aus der Hydroxylapatit-Säule enthalten hydrolytische Aktivität gegenüber langkettigen Substraten (Acylgruppe von mehr als 14 Kohlenstoffatomen). Was die mittelkettigen Substrate betrifft, zeigen die durchströmenden Peaks geringe Bevorzugung, wogegen der Gradientenpeak eine beträchtliche Bevorzugung für Decanoyl-ACP zeigt (siehe Beispiel 11A).
In einem frühen Stadium der Teilreinigung zeigt die Decanoyl-ACP-, C10-bevorzugende Acyl-ACP-Thioesterase bei Pufferung mit 100 mM HEPES eine beträchtliche Test-pH-Toleranz, wobei die Aktivität sich zwischen pH 6,5 und 8,5 kaum ändert und ein Maximum bei pH 7,5 aufweist. Im Gegensatz dazu besteht eine Empfindlichkeit gegen die Ionenstärke im Test; z. B. nimmt die Aktivität bei Verwendung von Kaliumphosphat als Testpuffer ab, wenn die Phosphatkonzentration erhöht wird, obschon in 350 mM Phosphat nach wie vor Aktivität detektierbar ist.
Die C10-bevorzugende Acyl-ACP-Thioesterase-Aktivität und andere Proteine in den teilweise gereinigten Präparaten werden durch intensiven Kontakt mit Glas- und Kunststoffoberflächen in ihrer Konzentration vermindert. Dieser Effekt wird durch Aufnahme von Detergenzien, wie z. B. Triton X100 oder CHAPS in die Säulen- und Testpuffer abgeschwächt. Einige Detergenzien wirken im Test stimulierend.
Die C10-bevorzugende Acyl-ACP-Thioesterase-Aktivität geht während dem Ammonsulfatpräzipitationsschritt der Reinigung rasch verloren, wenn kein 2-Mercaptoethanol wie oben beschrieben in den Puffern zugegen ist. In den beschriebenen Puffern ist die Aktivität bei 0°C sowie bei wiederholtem Einfrieren auf –20° oder –70° sehr stabil.
Beispiel 9B
Als bevorzugtere Alternative zu Beispiel 9A werden Samen wie folgt extrahiert.
Eine Extraktionspaste wird mit 1375 ml Extraktionspuffer (200 mM Bis-Tris-HCl, pH 6,5, 10 mM β-Mercaptoethanol), 100 g Polyvinylpyrrolidon und 13,75 g löslichem Polyvinylpyrrolidon (mittleres Molekulargewicht von 10.000) hergestellt. 100 g Cuphea-Samen werden der Paste zugegeben. Alle nachfolgenden Schritte werden bei 4°C durchgeführt. Samen und Paste werden mit einem Polytron homogenisiert, bis das Gemisch glatt ist und keine intakten ganzen Samen mehr vorhanden sind. Das Homogenisat wird bei 10.000 × g für 20 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird dekantiert und durch Miracloth filtriert.
Der filtrierte Überstand wird in eine Aufschlämmung mit 100 ml des abgesetzten, vorher mit Extraktionspuffer äquilibrierten Blue-4-Agaroseharzes gemischt. Die Aufschlämmung wird an einem Büchnertrichter mit 500 ml Extraktionspuffer gewaschen, dann in eine Glassäule gegossen und mit weiterem Extraktionspuffer gespült, bis das Harz gepackt ist. Die Säule wird zuerst mit 100 mM NaCl, 200 mM Bis-Tris-HCl, pH 6,5, 10 mM 2-Mercaptoethanol gewaschen. 400 mM NaCl, 200 mM Bis-Tris-HCl, pH 6,5, 10 mM 2-Mercaptoethanol wird auf die Säule aufgegeben und das Eluat in Fraktionen aufgefangen. Jene Fraktionen mit Enzymaktivität werden vereinigt und gegen „S-Puffer" (50 mM Bis-Tris-HCl, pH 6,0, 0,2% (w/v) CHAPS, 10 mM 2-Mercaptoethanol) dialysiert.
Als nächstes wird die Probe an einer S-Sepharose-Säule wie folgt chromatographiert. Die dialysierte Probe aus der Blue-4-Säule wird auf eine 50 ml-Säule S-Sepharose-Harz geladen, die mit S-Puffer äquilibriert worden ist. Nach dem Waschen der Säule mit weiterem S-Puffer wird die Säule mit 200 mM NaCl, 50 mM Bis-Tris-HCl, pH 6,0, 0,2% (w/v) CHAPS, 10 mM 2-Mercaptoethanol gespült. Jene Fraktionen mit Enzymaktivität werden vereinigt und ein zweites Mal gegen S-Puffer dialysiert.
Als nächstes wird die Probe an einer Mono-S FPLC-Säule von Pharmacia (Piscataway, NJ) wie folgt chromatographiert. Die dialysierte Probe aus der S-Sepharose-Säule wird auf eine 1 ml-Mono-S-Säule aufgegeben, die mit S-Puffer äquilibriert worden ist. Die Säule wird mit S-Puffer gewaschen, bis sich die Absorption bei 280 nm einpendelt. Ein 45 ml-Gradient wird auf die Säule angewendet, wobei S-Puffer und NaCl enthaltender S-Puffer verwendet werden. Die Aktivität eluiert zwischen 75 mM und 150 mM NaCl. Jene Fraktionen mit Enzymaktivität werden vereinigt und ein drittes Mal gegen S-Puffer dialysiert.
Schließlich wird die Probe an einer ACP-Säule wie folgt chromatographiert. Eine 15 ml an Sepharose gekoppeltes Acyl-Trägerprotein enthaltende Säule wird mit S-Puffer äquilibriert. Die dialysierte Probe aus der Mono-S-Säule wird bei 0,2 ml/min auf die ACP-Säule geladen. Die Säule wird mit S-Puffer gewaschen, bis sich die Absorption bei 280 nm auf eine Basislinie eingependelt hat. Ein 130 ml-Gradient wird unter Verwendung von S-Puffer und NaCl enthaltendem S-Puffer angewendet. Die Aktivität eluiert zwischen 50 mM und 80 mM NaCl. Jene Fraktionen mit Enzymaktivität werden vereinigt.
Beispiel 9C
Als eine dem Beispiel 9A oder 9B bevorzugtere Alternative werden vierzig Gramm Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP) mit 550 ml „Extraktionspuffer" gemischt, der 200 mM Bis-Tris-HCl, pH 6, 10 mM 2-Mercaptoethanol, 1% (w/v) Polyvinylpyrrolidon-10 umfasst. Diesem Gemisch werden 40 g gefrorene Cuphea-Samen zugegeben. Das Gemisch wird dann in einem Polytron-Homogenisator gemixt, bis keine intakten Samen mehr verbleiben und die Aufschlämmung glatt ist. Dieser und alle nachfolgenden Schritte werden bei 0–4°C ausgeführt. Das Präparat wird bei 12.000 × g für 2 Minuten zentrifugiert und mittels Filtration durch Miracloth weiter geklärt.
Dieses Präparat wird mit 100 ml abgesetztem Hydroxylapatit gemischt, das mit „Puffer A" (50 mM Bis-Tris-HCl, pH 6, 10 μM 2-Mercaptoethanol) äquilibriert worden ist. Drei Extraktvolumina 10 mM 2-Mercaptoethanol werden dann langsam über 30 Minuten unter ständigem Rühren zugegeben. Das Hydroxylapatit-Gel wird an einem gesinterten Glastrichter gesammelt und mit Puffer A gespült, bis der Abfluss farblos ist.
Das gesammelte Hydroxylapatit wird dann in eine Säule übertragen und mit Puffer A bei 2 ml/min weiter gespült, bis die Säule gepackt ist. Ein 400 ml-Elutionsgradient (2 ml/min) von Puffer A auf Puffer B (300 mM Kaliumphosphat, pH 6,9 in Puffer A) wird angewendet. Eluatfraktionen werden auf Hydrolyse von 10 : 0-ACP getestet. Es werden zwei überlappende Peaks mit Aktivität erhalten. Die den später eluierenden Peak enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und gegen Puffer A dialysiert.
Das dialysierte Material wird bei 1,3 ml/min auf eine mit Puffer A äquilibrierte 2,5 × 6,5 cm-Säule Blue-4-Agarose (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO aufgegeben. Die Säule wird mit Puffer A gewaschen und Enzymaktivität anschließend mit einem 400 ml-Gradienten von Puffer A auf Puffer C (1 M NaCl enthaltender Puffer A) eluiert. Die eluierten Fraktionen enthalten drei Peaks mit 10 : 0-ACP-Hydrolysaktivität. Jene Fraktionen, die den zweiten zu eluierenden Peak umfassen (eluiert durch ungefähr 0,4 M NaCl), werden vereinigt und gegen Puffer A dialysiert.
Das dialysierte Material wird bei 0,5 ml/min auf eine mit Puffer A äquilibrierte 1,7 × 6 cm-Säule von immobilisiertem 10 : 0-ACP-Analogon aufgegeben. (Diese Säule wird hergestellt, indem Heptylamin mit Iodessigsäureanhydrid in Diethylether zur Reaktion gebracht und das Produkt gereinigtem, reduziertem E. coli-ACP zugegeben wird. Die Reagenzienreste werden mittels Gelfiltrationschromatographie entfernt und das erhaltene 10 : 0-ACP-Analogon an CNBr-aktivierte Sepharose von Pharmacia nach den Anleitungen des Herstellers gekoppelt, wobei nicht reagierte Gruppen mit Tris blockiert werden). Die Säule wird mit Puffer A gespült und dann die Aktivität unter Anwendung eines 200 ml-Gradienten von Puffer A auf Puffer D (0,5 M NaCl enthaltender Puffer A) eluiert. Fraktionen, die dem eluierte Peak der 10 : 0-ACP-Aktivität entsprechen, werden vereinigt und gegen 50 mM Bis-Tris-HCl, pH 6, 10 mM 2-Mercaptoethanol, 0,2% (w/v) CHAPS, 5 mM Natriumascorbat dialysiert.
Beispiel 9D
Das in Beispiel 9C beschriebene Protokoll kann wie folgt weiter modifiziert werden. Die dem eluierten Peak der 10 : 0-ACP-Aktivität entsprechenden Fraktionen werden vereinigt und gegen Puffer E (50 mM Bis-Tris-HCl, pH 6,0, 0,2% CHAPS, 10 mM 2-Mercaptoethanol) dialysiert. Eine Mono-S-FPLC-Säule (MonoS^® HR5/5, Pharmacia LKB Biotechnology, NJ) wird mit Puffer E äquilibriert. Der dialysierte Pool wird auf die Säule geladen. Die gesamte C10- und C18 : 1-Aktivität scheint an die Säule zu binden. Die Aktivitäten können mit einem linearen 140 ml-Gradienten von (Puffer) auf (Puffer + 1 M NaCl) eluiert werden.
C18 : 1-Aktivität eluiert zwischen 75 mM und 100 mM NaCl. Es gibt einen zweiten Peak der Aktivität, der zwischen 150 mM und 175 mM NaCl eluiert. Der zweite Aktivitätspeak ist in erster Linie C10- und C18 : 1-Aktivität mit relativ wenig C12-, C14- oder C16-Aktivität. Jegliche C18 : 1-Aktivität im zweiten Peak könnte auf Kontamination durch C18 : 1-Restaktivität zurückzuführen sein.
Beispiel 10 – C10-Acyl-ACP-Thioesterase-Inhibitoruntersuchungen
Vorläufige Inhibitoruntersuchungen mit Material aus Beispiel 9A weisen darauf hin, dass die C10-bevorzugende Cuphea-Acyl-ACP-Thioesterase gegen Phenylmethylsulfonylfluorid und gegen Iodacetamid unempfindlich ist und durch 5 mM N-Ethylmaleimid vollständig inhibiert wird. Dies legt nahe, dass sie eher eine Esterase vom „aktiven Thiol"-Typ, als eine vom „aktiven Serin"-Typ ist.
Beispiel 11 – Cuphea-C10-Acyl-ACP-Thioesterase-Substratspezifität als Funktion der Kettenlänge
Beispiel 11A
Die Substratspezifität der Cuphea-C10-Acyl-ACP-Thioesterase gegenüber mittelkettigen Acyl-ACPs ist im Hydroxylapatit-Reinigungsstadium, wie in Beispiel 9A beschrieben ermittelt worden: Tabelle 6

Substrat Hydrolyseaktivität

(Mittelwert) (pmol/min)

C6-ACP 188

C8-ACP 485

C10-ACP 6950

C11-ACP 649

C12-ACP 1032

C14-ACP 4055
Die Aktivität gegenüber dem längerkettigen Substrat 14 : 0-ACP wird der Anwesenheit langkettiger Thioesterase-Aktivität zugeschrieben, und zwar analog zur langkettigen Thioesterase von Saflor-Samen und Avocado-Mesokarpgewebe, die in der publizierten Literatur beschrieben sind. Der Test des Präparats mit dem bevorzugten Substrat eines solchen Enzyms, 18 : 1-ACP, weist auf die Anwesenheit beträchtlicher Aktivität hin, was mit der Hypothese im Einklang steht. Die Aktivität gegenüber 10 : 0-Aktivität und die geringere Aktivitätsmenge gegenüber 8 : 0-ACP zeigt die Gegenwart von für mittlere Ketten spezifischer Thioesterase hin, die für die Produktion mittelkettiger Fettsäure in sich entwickelnden Cuphea hookeriana-Samen verantwortlich ist.
Die katalysierten Reaktionen habe sich als einfache Hydrolyse erwiesen. Die mit Ether extrahierten Produkte der Reaktionen zum „Zeitpunkt Null" sowie eine Stunde mit 6 : 0-ACP-, 8 : 0-ACP- und 10 : 0-ACP-Substrat wurden an Silika G Dünnschichtplatten (mobile Phase: Hexan/Diethylether/Essigsäure, 80 : 20 : 1 (v/v)) chromatographiert, um die Lipidklasse zu bestimmen. Laurinsäure wurde als unmarkierter Träger zugesetzt, um die Verflüchtigung freigesetzter kurzkettiger freier Fettsäuren zu hemmen. Tricarpin, Dicarpin, Monocarpin und Laurinsäure wurden als Standards verwendet. Die DC-Platte wurde zur Hälfte entwickelt und dann für 5 Minuten luftgetrocknet. Die Platte wurde dann in den Tank zurückgestellt und die Entwicklung bis zu 1 cm vom oberen Plattenrand vervoll ständigt. Die entwickelte Platte wurde getrocknet und dann für 800 Minuten an einem AMBIS (AMBIS Systems Inc., San Diego, CA) Radiochromatogrammscanner gescannt, um radioaktive Spots zu quantifizieren. Nach dem Scannen wurde die Platte in Ioodämpfen für 15 Minuten gefärbt, um die Lipide sichtbar zu machen. Die hauptsächlichen radiomakierten Produkte wanderten gemeinsam mit den freien Fettsäuren und waren im Wesentlichen in den für 1 Stunde inkubierten Proben stärker radioaktiv als im Vergleich dazu die Kontrollen zum Zeitpunkt Null.
Um zu verifizieren, dass die Kettenlängen der Produkte jene der entsprechenden Substrate waren, wurden die mit Ether extrahierten Produkte (mit einem unmarkierten Gemisch freier Fettsäure als Träger) mit KOH auf den Phenolphthalein-Endpunkt neutralisiert und dann mit Bromphenacylbromid derivatisiert und mittels Umkehrphasen-HPLC chromatographiert. Eine C18-Säule wurde in Verbindung mit einem Acetonitril/Wasser-Gradienten verwendet. In allen Fällen wurde nur eine Kettenlänge Produkt beobachtet, die mit der Substratkettenlänge identisch war.
Beispiel 11B
Das Präparat aus Beispiel 9C ist relativ selektiv bezüglich seiner Hydrolyse von Acyl-ACP-Thioestern, wie in der folgenden Tabelle gezeigt ist: (Diese Aktivitäten wurden wie folgt bestimmt. Fünfundzwanzig μl Probe wurden 75 μl Testpuffer zugesetzt, der 100 KHP₂O₄-KOH, pH 9, 0,2% (w/v) CHAPS 10 mM 2-Mercaptoethanol umfasste und radioaktiv markiertes Acyl-ACP für eine Endkonzentration von 0,5 μM enthielt. Nach Inkubation bei 30°C für 60 Minuten wurde die Reaktion durch Zugabe von 0,5 ml 10%ige (v/v) Essigsäure terminiert und das freigesetzte Fettsäureprodukt mit 1 ml Diethylether extrahiert. Die Enzymaktivität wurde durch die Radioaktivität dieses Etherextrakts gemessen, die mittels Flüssigszintillationszählung bestimmt wurde. Eine Korrektur wurde für die stattfindende geringe Menge nicht enzymatischer Hydrolyse vorgenommen.) Tabelle 7

Substrat Aktivität (cpm)

10 : 0-ACP 1010

12 : 0-ACP 393

14 : 0-ACP 30

16 : 0-ACP 262

18 : 0-ACP 696
Die Entfernung der langkettigen Thioesterase ist unvollständig, wie durch die teilweise Überlappung aller Peaks aus der Blue-4-Agarosesäule und die in obiger Tabelle gezeigten Daten nachgewiesen wird.
Beispiel 12 – Test auf C-18-bevorzugende Acyl-ACP-Thioesterase
Um auf langkettige Thioesterase-Aktivität zu testen, wurde 10 μl der zu analysierenden Enzymquelle bei Raumtemperatur für 10 Minuten in einer Lösung inkubiert, die 100 mM Tricin-NaOH, pH 8,5, und 3 μM ¹⁴C-Steaoryl-ACP oder 3 μM ¹⁴C-Oleoyl-ACP in einem Gesamtvolumen von 50 μl enthält. Acyl-ACP-Substrate werden wie in Beispiel 1 zur Herstellung von Lauroyl-ACP beschrieben hergestellt und in der Carboxy gruppe mit einer spezifischen Radioaktivität von 50–60 μCi/μmol radiomarkiert.
Die Reaktion wird durch Zugabe von 50 μl H₂O und 100 μl Isopropanol gestoppt, das je 1 mM Stearinsäure und Ölsäure enthält. Das Fettsäureprodukt der hydrolytischen Enzymwirkung wird vom nicht hydrolysierten Substrat durch Zugabe von 1 ml mit 50% Isopropanol in H₂O gesättigtem Petrolether extrahiert. Nach dem Absetzen für einige Minuten wird ein Aliquot der Petroletherschicht zur Bestimmung der Radioaktivität mittels Flüssigszintillationsspektrometrie entfernt.
Beispiel 13 – Reinigung und Identifizierung von C-18-bevorzugender Acyl-ACP-Thioesterase
Eine anfängliche Reinigung von Thioesterase-Protein aus sich entwickelnden Saflor-Samen, die anfänglich dem Verfahren von McKeon und Stumpf (J. Biol. Chem. 257, 12141–12147 (1982)) folgt, wird beschrieben. Saflor-Samen im Entwicklungsstadium aus im Gewächshaus gezüchteten Pflanzen werden zwischen 16 und 18 Tagen nach der Anthese geerntet, in Flüssigstickstoff eingefroren und bei –70°C gelagert.
Ungefähr 50 g gefrorener Samen werden in Flüssigstickstoff gemahlen und gesiebt, um große Samenschalenstücke zu entfernen, um ein feines Pulver zu erhalten. Das Pulver wird mit Aceton an einem Büchnertrichter gewaschen, bis in Filtrat keine gelbe Farbe mehr auftritt. Das Pulver wird dann luftgetrocknet und wie unten beschrieben weiter verarbeitet oder kann bei –70°C eingefroren gelagert werden.
Das getrocknete Acetonpulver wird abgewogen und mit dem fünfzehnfachen seines Gewichts 20 mM Kaliumphosphat, pH 6,8, zerrieben. Das Gemisch wird dann bei 12.000 × g für 20 Minuten zentrifugiert und dann durch eine Schicht Miracloth dekantiert.
Der Acetonpulverextrakt wird mit Eisessig auf pH 5,2 angesäuert, für 30 Minuten auf Eis gehalten und dann bei 12.000 × g für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird mit Eisessig auf pH 4,4 gestellt, für 30 Minuten auf Eis gehalten und dann wie oben zentrifugiert. Das Präzipitat wird in 0,02 M Kaliumphosphat (pH 6,8) resuspendiert, der pH auf 6,8 gestellt und die Suspension durch Zentrifugation bei 12.000 × g für 10 Minuten geklärt.
Die ACP-Sepharose 4B-Säule zur Affinitätschromatographie wird wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt. ACP wird aus E. coli-Stamm K-12 wie in Beispiel 1 beschrieben isoliert. Der geklärte Überstand aus der Säurepräzipitation wird in ACP-Säulenpuffer (20 mM Kaliumphosphat, 25% Glycerin (w/v), 0,1% CHAPS (w/v), pH 6,8) gelöst und auf eine 2,5 cm × 3,7 cm ACP-Sepharose 4B-Säule mit einer Aufgaberate von 50 ml pro Stunde aufgegeben. Die Aktivität wird mit einem Gradienten von 5 Bettvolumina von 20–400 mM Kaliumphosphat in ACP-Säulenpuffer eluiert. Die Aktivität eluierte als einzelner Peak bei 180–320 mM Kaliumphosphat und die Wiederfindung der Thioesterase betrug 100%.
Die aktiven Fraktionen aus der obigen ACP-Sepharose-Säule wurden vereinigt, auf 20 mM Kaliumphosphat, 0,1% CHAPS, 25% Glycerin verdünnt und auf eine andere ACP-Sepharose-Säule aufgegeben und wie oben beschrieben chromatographiert.
Das resultierende Material wurde dann auf eine Chromatofokussierungssäule zur weiteren Reinigung der Saflor-Thioesterase-Aktivität aufgegeben. Der Puffer des „Eluatstroms" aus der zweiten ACP-Säule wurde auf 20 mM Bis-Tris-HCl, 25% Glycerin (w/v), 0,1 CHAPS (w/v), pH 7,4, geändert („Start"-Puffer), indem in einer Ultrafiltrationsrührzelle von Amicon unter Verwendung einer PM-10-Membran konzentriert und verdünnt wurde. Eine Chromatofokussierungssäule (1 cm × 7,3 cm) wird mit PBE 94 (Pharmacia) gepackt, die mit „Start"-Puffer äquilibriert worden ist. Die Probe wird auf die PBE 94-Säule mit einer Flussrate von 35 ml pro Stunde aufgegeben und mit 3 Bettvolumina Startpuffer gewaschen. Der pN-Gradient wird gebildet und das Protein mit 60 ml pro Stunde durch Aufgeben von 82 ml Elutionspuffer eluiert, der je 100 ml 10 ml PB 74 (Pharmacia), 25 g Glycerin, 1 g CHAPS und ausreichend HCl enthält, um pH 4,0 zu erreichen. Zwei zusätzliche Bettvolumina des Elutionspuffers werden aufgegeben, nachdem die Säule pH 4,0 erreicht hat. Die Saflor-Thioesterase-Aktivität eluiert in zwei Peaks, einer bei ungefähr pH 5,2 und der zweite Peak im Bereich pH 4,5 bis 4,0. Fraktionen, die diese Peaks repräsentieren, werden mittels SDS-PAGE (Laemmli, supra) und Silberfärbung analysiert.
In beiden Peaks wurden zwei Hauptbanden beobachtet, die mit Thioesterase-Aktivität korrelieren. Diese Banden stelle Proteine dar, die relative Molekulargewichte von 34 und 40 kD aufweisen, wie durch Vergleich mit Proteinstandards abgeschätzt wurde.
Die Fraktionen der beiden Aktivitätspeaks aus der Chromatofokussierung werden getrennt vereinigt und wie oben beschrieben konzentriert. Die 34 und 40 kD-Thioesterase-Proteine werden für die Aminosäuresequenzierung durch Transfer dieser Proteine entweder auf Nitrozellulose- oder PVDF- (entweder Immobilon-P (Millipore, Bedford, MA) oder ProBlott (Applied Biosystems, Foster City, CA)) Membranen im Anschluss an die SDS-PAGE weiter isoliert. Nitrozellulose wird bevorzugt, wenn die Proteine anschließend enzymatisch verdaut werden, während ProBlott für N-terminale Sequenzierungsverfahren und Immobilon-P für Proben bevorzugt wird, die Bromcyan-Verdau unterzogen werden.
Beispiel 14 – Pflanzen-Thioesterase-Screening
In diesem Beispiel wird die Aminosäure- und Nucleinsäuresequenzierung von zwei beispielhaften Pflanzen-Acyl-ACP-Thioesterasen beschrieben. Diese Technik kann auch für die Sequenzierung anderer Pflanzen-Thioesterasen dieser Erfindung eingesetzt werden.
Alle Sequenzierungen werden mittels Edman-Abbau an einem Applied Biosystems 477A Pulsed-Liquid Phase Protein Sequencer durchgeführt; vom Sequenzierer produzierte Phenylthiohydantoin- (PTH-) Aminosäuren werden mit einem Applied Biosystems 120A PTN-Analyzer On-line analysiert. Daten werden und unter Verwendung eines Applied Biosystems Datenanalysesystem Modell 610A für den Apple Macintosh und auch an einem Digital Microvax unter Verwendung der ACCESS*CHROM-Software von PE NELSON Inc. (Cupertino, CA) erfasst und gespeichert. Sequenzdaten werden von einem Schreiber gelesen, der Eingangssignale vom PTH-Analyzer empfängt, und werden unter Verwendung der quantitativen Daten bestätigt, die von der Modell 610A-Software erhaltenen werden. Alle Sequenzdaten werden unabhängig von zwei Operatoren mit Hilfe des Datenanalysesystems gelesen.
Für als Peaks aus einer HPLC erhalte Peptidproben wird die Probe auf ein mit Polybrene beschichtetes Glasfaserfilter (Applied Biosystems, Foster City, CA) geladen, das im Sequenzierer 3 Vorzyklen unterzogen worden ist. Für Peptide, die reduziert und alkyliert worden sind, wird ein Teil des PTH-Aminosäureproduktmaterials aus jedem Sequenziererzyklus in einem Flüssigszintillationszähler gezählt. Für Proteinproben, die an Immobilon-P elektrogeblottet worden sind, wird die Bande von Interesse herausgeschnitten und dann über ein mit Polybrene beschichtetes Glasfaserfilter gelegt, das wie oben Vorzyklen unterzogen worden ist, und die Reaktionskassette gemäß den Spezifikationen des Herstellers zusammengebaut. Für Proteinproben, die an ProBlott elektrogeblottet worden sind, wird das Glasfaserfilter nicht benötigt.
Um Proteinsequenzen aus kleinen Probenmengen (5–30 pmol) zu erhalten, wurden der 477A-Konversionszyklus und der 120A-Analysator wie von Tempst und Riviere (Anal. Biochem. 183, 290 (1989)) beschrieben eingesetzt.
A. Sequenzierung proteolytischer Fragmente
Eine mittels ACP-Sepharose-Schritt von Beispiel 2 gereinigte Lorbeer-Thioesterase wird für proteolytischen Verdau und Sequenzierung vorbereitet. Die Probe (12 μg Thioesterase in 80 μl) wird denaturiert und reduziert, und zwar durch Erhitzen auf 95°C für 5 Minuten in 160 μl Probenpuffer nach Anderson (Anderson und Anderson, Anal. Biochem. 85, 331–340 (1978)) der 3% Natriumdodecylsulfat, 5% β-Mercaptoethanol, 20% Glycerin, 2% 3/10-Ampholyte und 2% Triton X-100 enthält. Proteine in 20 μl-Aliquoten (je 1 μg Gesamtprotein) werden mittels zweidimensionaler Elektrophorese wie von Anderson und Anderson (Anal. Biochem. 85, 331–340 und 341–354 (1978)) beschrieben getrennt mit der Ausnahme, dass das Plattengel der zweiten Dimension 1,5 mm stark ist. Nach der Elektrophorese in der zweiten Dimension wird jedes der Plattengele entfernt und Proteine innerhalb des Gels in einem Transblot-System (Bio-Rad, Richmond, CA) unter Anwendung des Verfahrens von Towbin et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354 (1979)) direkt auf eine Nitrozellulosemembran geblottet. Die Proteinspots an der Membran werden durch reversible Färbung mit Ponceau S (Sigma, St. Louis, MO) wie von Salinovich und Montelaro (Anal. Biochem. 156, 341–347 (1986)) beschrieben detektiert. Alternativ dazu können Spots durch Färbung mit Amidoschwarz (Schaffner und Weissman, Anal. Biochem. 56, 502–514 (1973)) detektiert werden.
Für Präparate der Thioesterase oder von Thioesterasen, die einem zusätzlichen Reinigungsschritt unterzogen worden sind, ist eindimensionale Polyacrylamidgelelektrophorese hinlänglich, um für die Sequenzierung ausreichend reines Protein herzustellen. In diesem Fall wird die Probe (12 μg Thioesterase in 80 μl) durch Erhitzen auf 95°C für 5 Minuten mit 20 μl eines 25% (v/v) Glycerin, 2,5% (w/v) Natriumdodecylsulfat (SDS) und 25% (v/v) β-Mercaptoethanol in 0,156 M Tris-HCl, pH 6,8, enthaltenden Probenpuffers reduziert und denaturiert. Proteine in gesonderten Aliquoten (30–35 μl) der Probe werden mittels eindimensionaler Elektrophorese wie von Laemmli (Nature 227, 680-685 (1970)) beschrieben getrennt, und zwar ein Aliquot je 1 cm-Lane an einem 1,5 mm starken Gel. Nach Beendigung der Elektrophorese wird das Gel entfernt, geblottet und danach werden die Proben wie für den zweidimensionalen Fall beschrieben behandelt.
In Präparaten für den Verdau werden dem Thioesterase-Protein entsprechende Banden aus jedem der Membranblots herausgeschnitten und in einem Kunststoffteströhrchen miteinander vereinigt. Die Behandlungs- und Verdauverfahren sind von Aebersold et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6970–6974) beschrieben worden. Die Membranstücke werden für 30 Minuten bei 37°C mit 1,0–1,2 ml frisch hergestelltem, 0,5%igen (w/v) Polyvinylpyrrolidon mit einem mittleren Molekulargewicht von 40.000 (PVP-40, Aldrich, Milwaukee, WI), gelöst in 100 mM Essigsäure, behandelt. Das überschüssige PVP-40 wird durch mehrere Waschschritte mit 3–4 ml Wasser (HPLC-Qualität) entfernt und die Entfernung von PVP-40 ist vollständig, wenn die Absorption von aufeinander folgenden Waschschritten bei 214 nm nicht mehr abnimmt oder diejenige des Wasserleerwerts erreicht. Die Stücke werden dann aus dem Waschröhrchen entfernt, klein geschnitten und in ein 1 ml-Eppendorf-Kunststoffröhrchen gegeben, und es werden 100 mM Tris-HCl oder 100 mM Natriumcarbonat, pH 8,2/Acetonitril, 95 : 5 (v/v) zugegeben, so dass die Flüssigkeit die Stücke gerade bedeckt. Der Verdau wird durch Zugeben von 10 μl Trypsin (Boehringer Mannheim, Sequenzierungsqualität; 100 μg/ml Lösung in 1 HCl) gestartet und die Probe bei 37°C für 8–24 Stunden unter gelegentlichem Rühren verdaut. Die zugegebene Proteasemenge liegt für gewöhnlich zwischen 1/20 und 1/10 des Gewichts des verdauten Proteins. Peptide eluieren während der Inkubation aus der Membran in den Verdauungspuffer. Der Verdau wird durch Zugabe von 10 μl 10%iger (v/v) Trifluoressigsäure (TFA) gestoppt. Alternativ dazu können die Stückchen in 100 mM Natriumphosphat oder 25 mM Ammoniumcarbonat, pH 7,8/Acetonitril, 95 : 5 (v/v) suspendiert und für 8–24 Stunden bei 25°C mit 10 μl Endoproteinase gluC (Boehringer Mannheim, Sequenzierungsqualität; 100 μg/ml Lösung in Wasser) verdaut werden.
Verdau mit Trypsin ermöglicht die Spaltung an Lysin- und Argininresten, wogegen Verdau mit gluC ab Glutaminsäureresten (und unter einigen Bedingungen an Asparaginsäureresten) spaltet. Verdau gesonderter Proben mit jeder der Proteasen gestattet die Identifizierung von überlappenden Peptiden und die Konstruktion längerer, für die PCR-Technologie brauchbarer Peptidsequenzen.
Das Verdauungsgemisch wird von den Nitrozellulosestücken entfernt, die Nitrozellulosestücke werden mit 1–5 100 μl-Volumina 0,05% (v/v) TFA gewaschen und diese Volumina auf ein Volumen von weniger als 100 μl in einem Speed-Vac (Savant, Farmingdale, NY) konzentriert. Diese Konzentrate werden dann in eine Vydac Umkehrphasen-Protein- & Peptid-C18-Säule (2,1 mm × 100 mm) injiziert, die an einem Applied Biosystems (Foster City, CA) Modell 130 Hochleistungsflüssigkeitschromatographen (HPLC) installiert ist. Die mobilen Phasen zur Elution von Peptiden waren: Puffer A: 0,1 M Natriumphosphat, pH 2,2; Puffer B: 70% Acetonitril in 0,1 M Natriumphosphat, pH 2,2. Ein dreistufiger Gradient von 10–55% Puffer B über zwei Stunden, 55–75% Puffer B über 5 Minuten und 75% Puffer B isokratisch für 15 Minuten bei einer Flussrate von 50 μl/min wird verwendet. Peptide werden bei 214 nm detektiert, händisch gesammelt und dann bei –20°C gelagert.
Die Trennung freigesetzter Peptide kann auch mittels Umkehrphasen-HPLC an einer C18-Säule (2 × 150 mm) unter Anwendung eines 120 Minuten-Gradienten erzielt werden, der von 7% auf 70% Acetonitril in 0,1% TFA bei einer Flussrate von 50 μl pro Minute ansteigt. Die Elution von Peptiden wird durch Absorption bei 214 nm beobachtet, wobei jedes Peptid in ein gesondertes Fraktionsröhrchen gesammelt wird. Die Peptide werden bei –20°C eingefroren gelagert, bis sie auf den Proteinsequenzierer (Applied Biosystems, Foster City, CA) aufgegeben werden.
Alternativ dazu können die Peptide von der HPLC-Trennung alkyliert werden. Alkylierung ermöglicht die Identifizierung von Cysteinresten am Sequenzierer, die ansonsten undetektiert bleiben. Das nicht angesäuerte Verdauungsgemisch wird durch Zugabe von 1 μl 10%igem (v/v) β-Mercaptoethanol (1,43 μmol) reduziert und bei 37°C für 2 Stunden inkubiert. Die reduzierten Peptide werden dann mit ungefähr 1,6 μmol [³H]-Iodessigsäure (200 mCi/mmol) für 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln alkyliert. In Abhängigkeit von der β-Mercaptoethanol-Konzentration kann die [³H]-Iodessigsäure auf ein Verhältnis von 1;1,1 eingestellt werden. Das Gemisch wird dann mit 10 μl 10% (v/v) TFA angesäuert, auf die Umkehrphasen-HPLC-Säule aufgegeben und wie oben beschrieben weiter behandelt. Andere Alkylierungsreagenzien, einschließlich Iodacetamid und 4-Vinylpyridin können verwendet werden. Das letztere Reagens bewirk die Bildung von Pyridylethyl-Cysteinresten, die am Proteinsequenzierer durch die einzigartige Retentionszeit ihrer entsprechenden PTH-Aminosäurederivate identifizierbar sind.
Die Lorbeer-Thioesterasen des 34 kD-Paars werden unabhängig sequenziert (A und B). Die Peptidsequenzen sind in Tabelle 8 gezeigt. Es wird angemerkt, dass mehrere der Bande A- und Bande B-Peptide in ihrer Sequenz entweder identisch oder nahezu identisch waren.
Tabelle 8
N-terminale Proteine können auch ohne Verdau sequenziert werden. Beispielsweise werden Proteine für 30 Minuten im folgenden Puffer auf Immobilon-P PVDF elektrogeblottet: 12,5 mM Tris/5 mM Glycin in 10% (v/v) Methanol. Nach dem Elektroblotten werden Membranen in 0,1% (w/v) Coomassie-Blau in 50% (v/v) Methanol/10% (v/v) Essigsäure für 5 Minuten gefärbt und 2–3 Mal für je 2 Minuten in 50% (v/v) Methanol/10% (v/v) Essigsäure entfärbt. Danach werden die PVDF-Membranen für 30 Minuten luftgetrocknet und dann trocken in hitzeversiegelten Plastikbeuteln bei –20°C gelagert. Auf PVDF geblottetes Protein wird direkt verwendet, um die N-terminale Sequenz des intakten Proteins zu bestimmen.
Auf diese Weise wird die N-terminale Aminosäure der 34 kD-Lorbeer-Thioesterase ermittelt als:
SQ 837 Seq.-ID Nr. 39 LEWKPKPK (L) PE (L) LD
Weiters wird die Sequenz einer Lorbeer-Thioesterase, die etwas schneller als das Bande B-Peptid wandert, ermittelt als:
SQ 840 Seq.-ID Nr. 40 LLDDHFGLHGLVFRRTFAIRSYEVGPDR
B. Bromcyan-Spaltung von Protein und Trennung von Peptiden
Als ein alternatives Verfahren kann Bromcyan-Spaltung durchgeführt werden. Beispielsweise wie mit den 34 und 40 kD-Saflor-Thioesterase-Proteinen unter Anwendung der im Peptid-Design Peptide Separation System Technical Manual von Promega Inc. (Madison, WI) beschriebenen Methodik beispielhaft dargestellt. Die unten in Tabelle 9 gezeigten Peptide wurden auf diese Weise erhalten.
Die Proteine werden an SDS-Polyacrylamidgelen der Elektrophorese unterzogen (Laemmli, supra) und an Immobilon-P PVDF wie oben beschrieben geblottet. Proteinbanden werden aus dem Blot herausgeschnitten und jede Bande in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, das 200 μl einer Lösung von 10 mg/ml Bromcyan in 70% (v/v) Ameisensäure enthält. Die Proteinbanden werden in dieser Lösung über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert und nach dieser Inkubation werden die Bromcyan-Lösungen entfernt und vereinigt. Die vereinigte Lösung wird unter einem ständigen Stickstoffstrom mit einem Reacti-Vap-Evaporator (Pierce, Rockford, IL) getrocknet. Bromcyan-Peptide werden unter Verwendung eines Peptidelutionslösungsmittels der folgenden Zusammensetzung von der Immobilon-P PVDF-Membran eluiert: 70% (v/v) Isopropanol, 0,2% (v/v) Trifluoressigsäure, 0,1 mM Lysin und 0,1 mM Thioglykolsäure. 200 μl dieses Elutionslösungsmittels werden jedem Röhrchen zugegeben und die Röhrchen für 2 Stunden bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Vortexen inkubiert. Die Elutionslösungsmittel werden dann aus jedem Röhrchen entfernt, vereinigt, dem die getrocknete Bromcyan-Lösung enthaltenden Röhrchen zugegeben und wie oben beschrieben getrocknet. Das Elutionsverfahren wird mit frischem Elutionslösungsmittel für weitere 2 Stunden wiederholt und des vereinigte Lösungsmittel dem vorher getrockneten Material zugegeben und wiederum getrocknet. 50 μl Wasser (HPLC-Qualität) wird dann den getrockneten Peptiden zugesetzt und das Wasser durch Verdampfung in einer Speed-Vac (Savant Inc., Farmingdale, NY) entfernt.
Die Peptide werden unter Anwendung eines Tris/Tricin-SDS-PAGE-Systems getrennt, das jenem von Schägger und von Jagow (Anal. Biochem. 166, 368–379 (1987)) beschrieben ähnlich ist. Vorgefertigte 16%ige oder 10–20%ige (Gradienten-) Acrylamid-Tricin-SDS-PAGE-Gele (Novex Inc., Encinitas, CA) wurde für die Trennung verwendet. Die Gele werden in einem Tall Mighty SmaIl-Elektrophoreseapparat von Hoefer Scientific Instruments (San Francisco, CA) gefahren. Vor der Elektrophorese der Peptide werden die Gele mit Thioglykolsäure, die dem Kathodenpuffer in einer Konzentration von 0,1–0,2 mM zugesetzt wurde, für 30–60 Minuten bei einer konstanten Spannung von 30 Volt laufen gelassen. Der verwendete Laufpuffer wird aus einer ebenfalls von Novex stammenden 10x-Stammlösung bereitet; die Endkonzentration (1x) ist 0,1 M Tris, 0,1 M Tricin und 0,1% (w/v) SDS. Die getrockneten Peptide werden in 15 μl Wasser (HPLC-Qualität) und 15 μl 2x-Probenpuffer resuspendiert, der aus 0,125 M Tris-HCl, 2% (w/v) SDS, 5% (v/v) β-Mercaptoethanol, 20% (v/v) Glycerin und 0,0025% (w/v) Bromphenolblau besteht, und vor dem Aufgeben auf das Gel für 5 Minuten aufgekocht.
Die Gele werden bei einer konstanten Spannung von 125–150 Volt für ungefähr 1 Stunde laufen gelassen oder bis der Signalfarbstoff begonnen hat, aus der unteren Kante des Gels auszulaufen. Die Gele werden in Transferpuffer (125 mM Tris, 50 mM Glycin, 10% (v/v) Methanol) für 15–30 Minuten vor dem Transfer getränkt. Die Gele werden auf ProBlott Sequenzierungsmembranen für 2 Stunden bei einer konstanten Spannung von 50 Volt geblottet. Die Membranen werden mit Coomassie-Blau (0,1% in 50% (v/v) Me thanol/10% (v/v) Essigsäure) gefärbt und für 3 × 2 Minuten in 50% (v/v) Methanol/10% (v/v) Essigsäure entfärbt. Die Membranen werden vor der trockenen Lagerung bei –20°C für 30–45 Minuten luftgetrocknet.
An ProBlott geblottete Peptide können direkt auf die Sequenziererkassette des Proteinsequenzierers ohne Zusatz eines mit Polybrene beschichteten Glasfaserfilters aufgegeben werden. Die Peptide werden unter Anwendung eines leicht modifizierten Reaktionszyklus, BLOT-1, der von Applied Biosystems bereitgestellt wurde, sequenziert. Ferner wird Lösung S3 (Butylchlorid) durch ein 50 : 50-Gemisch von S1 und S2 (n-Heptan und Ethylacetat) ersetzt. Diese beiden Modifizierungen werden verwendet, wann immer an ProBlott geblottete Proben sequenziert werden.
Aminosäuresequenzen von Bromcyan-Fragmenten der 34 und 40 kD-Proteine werden durch das oben beschriebene N-terminale Sequenzierungsverfahren bestimmt. Auf diese Weise erhaltene Sequenzen sind in Tabelle 9 dargestellt, worin die Einbuchstaben-Abkürzung für Aminosäuren verwendet wird und X eine nicht identifizierte Aminosäure kennzeichnet.
Tabelle 9
Da das obige Protokoll eine partielle Bromcyan-Spaltung bewirkt, werden Peptide variierender relativer Molekulargewichte erhalten, die gemeinsame Aminosäuresequenzen aufweisen. Die ermittelte Aminosäuresequenz eines der Peptide (Sequenz nicht gezeigt) entsprach der Aminosäuresequenz eines Saflor-Desaturase-Proteins (Thompson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 2578–2582 (1991)).
C. Isolierung und Assemblierung von cDNA
Wenn einmal die Aminosäuresequenzen ermittelt sind, können sie dazu verwendet werden, um die DNA-Sequenz der Pflanzen-Thioesterase über die Polymerasekettenreaktions- (PCR-) Technologie zu erhalten. Folglich werden Oligonucleotidfragmente an einem Applied Biosystems Modell 380A DNA-Synthesizer zu Aminosäuresequenzen synthetisiert, welche die geringste Redundanz zur Verwendung als PCR-Primer aufweisen. Es werden Restriktionsstellen in die Enden der Oligonucleotidprimer konstruiert, so dass die resultierenden DNA-Fragmente bei der Klonierung leicht manipuliert werden können. Gereinigte, aus der Pflanzen-Thioesterase-Quelle isolierte genomische DNA oder RNA werden in der Reaktion als Template verwendet.
PCR-Reaktionen werden mit Taq-Polymerase (Gene Amp Kit) und dem DNA-Thermocycler (Perkin-Elmer/Cetus) in zwei verschiedenen Kombinationen der Oligonucleotide als 5'- oder 3'-Primer durchgeführt. Die erhaltenen DNA-Produkte werden zur Trennung an einem Agarosegel laufen gelassen. DNA-Sequenzen werden mittels Didesoxy-Kettenterminationsverfahren von Sangenr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463–5467 (1977), unter Verwendung des 7-Deaza-dGTP-Reagent Kit mit Sequenase Version 2 Enzyme (United States Biochemical Corp., Cleveland, OH) bestimmt. Die Sequenzdaten werden mit der IntelliGenetics Suite der Molekularprogramme Gel und SEQ analysiert.
1. RNA-Isolierung
Gesamt-RNA wird aus Lorbeer-Samen in der Entwicklungsphase gemäß dem Verfahren von Turpen und Griffith (Biotechniques 4, 11–15 (1986)) isoliert. Kurz gesagt werden 50 g frisches, gefrorenes Material in 4 M Guanidiniumthiocyanat und 2% Sarcosyl homogenisiert. Das geklärte Lysat wird auf einen 5,7 M CsCl-Polster überschichtet und für 5,5 Stunden bei 50.000 Upm zentrifugiert. Das RNA-Pellet wird in Wasser wiederaufgelöst, mit Phenol und Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Das erhaltene Pellet wird in Wasser resuspendiert und stellt die Gesamt-RNA-Fraktion dar. Poly(A)-RNA wird aus diesem Material gemäß Maniatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York (1982)) isoliert.
2. PCR-Erzeugung einer partiellen Thioesterase-cDNA
Die Proteinsequenzinformation aus den Peptiden der Tabelle 8 wird verwendet, um degenerierte Oligonucleotide (Seq.-ID Nr. 32–33) zu konstruieren. (Siehe 1). Diese Oligonucleotide werden als Primer verwendet, um die Thioesterase-Sequenz aus Lorbeer-Embryo-Gesamt-cDNA zu amplifizieren (Lee et al., Science 339, 1288–1291 (1988)). Folglich wird Poly (A)-RNA aus Lorbeer-Embryos mit reverser Transkriptase M-MLV (BRL, Bethesda, MD) revers transkribiert, um eine einzelsträngige cDNA zu erhalten. Diese cDNA wird als Templat für die Thioesterase-spezifischen Oligonucleotide in der PCR verwendet. Die Reaktion wird gemäß der Anleitungen des Herstellers durchgeführt, wobei der Thermocycler auf das folgende zyklische Programm eingestellt wird: 30 Zyklen; 1 Minute bei 94°C, 1 Sekunde bei 65°C, Abfall von 2 Minuten von 65°C hinunter auf 50°C und 2 Minuten bei 74°C. Die PCR-Reaktionen werden mittels Agarosegelelektrophorese analysiert. Das der resultierenden 800 bp-Bande entsprechende DNA-Fragment wird kloniert. Die DNA-Analyse (Seq.-ID Nr. 34–35 und 2) zeigt, dass dieses DNA-Fragment tatsächlich für mehrere Thioesterase-Peptide der Erfinder kodiert.
3. Isolierung von Thioesterase-cDNA-Klonen
Das PCR-erzeugte 800 bp-DNA-Fragment wird mit ³²P markiert (Random Primed DNA-Markierungsset, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) und als Sonde verwendet, um ungefähr 2 Millionen Plaques einer herkömmlich erzeugten cDNA-Bibliothek zu screenen: doppelsträngige, Oligo-dT-geprimte cDNA wird aus der Lorbeer-Samen-Poly(A)-RNA gemäß Gubler und Hoffman, Gene 25, 263–269 (1983), synthetisiert; EcoRI-Linker werden an die Enden ligiert und das resultierende Material in einen Bakteriophagenvektor, LambdaZAP, Stratagene, La Jolla, CA, kloniert.
Der längste Bibliothek-Klon überlappt für 112 bp mit der PCR-Sequenz der Erfinder (100% Sequenzübereinstimmung auf dieser Strecke). Er erstreckt sich weiter zum 3'-Ende des Transkripts, siehe 2.
Durch Verknüpfen des 800 bp-Fragments mit dem längsten Bakteriophagenklon an der gemeinsamen HindIIl-Stelle (siehe 2, Lane (345)) wird ein 1200 bp langes angrenzendes DNA-Fragment mit einem potentiellen Leseraster von ungefähr 1000 kodierenden Basenpaaren erzeugt.
Um den vollständigen Klon zu erhalten, kann eine zweite cDNA-Bibliothek aus Lorbeer-Poly(A)+ RNA im Plasmidklonierungsvektor pCGN1703 konstruiert werden. pCGN-1703 leitet sich vom handelsüblichen Klonierungsvektor Bluescribe M13- (Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA) her und wird folgendermaßen hergestellt. Der Polylinker von Bluescribe M13- wird durch Verdau mit BamHI, Behandlung mit Mung-Bean-Endonuclease und Ligation stumpfer Enden verändert, um ein BamHI-deletiertes Plasmid, pCGN1700, zu erzeugen. pCGN1700 wird mit EcoRI und SstI (benachbarte Restriktionsstellen) verdaut und mit einem synthetischen Linker anneliert, der Restriktionsstellen für BamHI, PstI, XbaI, ApaI und SmaI, einen 5'-Überhang AATT und einen 3'-Überhang RCGA aufweist. Die Insertion des Linkers in pCGN1700 eliminiert die EcoRI-Stelle, bildet die sich in Bluescribe findende SstI-Stelle (hierin manchmal auch als „SacI" bezeichnet) neu und fügt die neuen Restriktionsstellen an, die am Linker enthalten sind. Das resultierende Plasmid pCGN1702 wird mit HindIIl verdaut und die Enden werden mit Klenow-Enzym abgestumpft; die lineare DNA wird mit Pvull teilweise verdaut und mit T4-DNA-Ligase in verdünnter Lösung ligiert. Ein Transformant, bei dem die lac-Promotor-Region deletiert ist, wird ausgewählt (pCGN1703) und als Plasmidklonierungsvektor verwendet.
Kurz gesagt erfolgt die cDNA-Synthese wie folgt. Der Plasmidklonierungsvektor wird mit SstI verdaut und es werden Homopolymer-T-Schwänze an den kohäsiven Enden des resultierenden 3'-Überhangs unter Verwendung terminaler Desoxynucleotidyl-Transferase erzeugt. Das Plasmid mit Schwanzanhang wird vom unverdauten Plasmid oder Plasmid ohne Schwanzanhang mittels Oligo(dA)-Cellulosechromatographie getrennt. Der erhaltene Vektor dient als Primer zur Synthese von cDNA-Erststrängen, die kovalent an eines der Vektorplasmid-Enden gebunden sind. Die cDNA-mRNA-Vektor-Komplexe werden mit terminaler Transferase in Gegenwart von Desoxyguanosintriphosphat behandelt, wodurch G-Schwänze an den Enden der cDNA-Stränge erzeugt werden. Der zusätzliche, der BamHI-Stelle benachbarte cDNA-mRNA-Komplex wird durch BamHI-Verdau entfernt, wodurch ein cDNA-mRNA-Vektor-Komplex mit einem kohäsiven Bam-HI-Ende an einem Ende und einem G-Schwanz am anderen Ende verbleibt. Dieser Komplex wird unter Verwendung eines synthetischen, zyklisierenden Linkers zyklisiert, der ein kohäsives 5'-BamHI-Ende, Erkennungssequenzen für die Restriktionsenzyme Notl, EcoRI und SstI und ein 3'-C-Schwanzende aufweist. Nach Ligation und Reparatur werden die zirkulären Komplexe in E. coli-Stamm DH5α (BRL, Gaithersburg, MD) transformiert, um die cDNA-Bibliothek zu erzeugen. Die Lorbeer-Embryo-cDNA-Bank im Plasmidvektor pCGN1703 enthält ungefähr 1,5 × 10⁶ Klone mit einer mittleren cDNA-Insertgröße von ungefähr 500 Basenpaaren.
Eine Volllängen-cDNA der Lorbeer-Thioesterase, 3A-17 (pCGN3822), wurde aus der pCGN1703-Bibliothek durch Screening mit dem oben beschriebenen, ³²P-markierten, mittels PCR erzeugten 800 bp-Fragment der Thioesterase isoliert.
4. cDNA-Sequenz
Zusammenfassend sind ungefähr 1.200 bp zusammenhängender DNA-Sequenz in 2 gezeigt. Dies umfasst ungefähr 80–90% der kodierenden Region für die reife Lorbeer-Thioesterase und eine 3'-untranslatierte Sequenz von 200 bp, die Translationsstop- und Poly(A)-Additionssequenzen enthält.
Die 580 bp der nun sequenzierten kodierenden Region machen schätzungsweise ungefähr 60% des gesamten Leserasters des reifen Proteins aus. Diese Teilsequenz kodiert, wenn sie translatiert wird, für ein Polypeptid, das viele der Sequenzen aus Tabelle 8 (Seq.-ID Nr. 1–25) enthält, wovon einige angeglichen in 2 gezeigt sind. Peptide, für die nicht kodiert wird, könnten in den noch nicht sequenzierten Regionen der cDNAs lokalisiert sein oder von völlig anderen Proteinen stammen. Mehrere andere Peptide wie Peptid 701 (Seq.-ID Nr. 14) unterscheiden sich etwas von der vorhergesagten Proteinsequenz, siehe 2. Dies könnte auf die Anwesenheit einer Genfamilie für Thioesterase hinweisen.
Ein zweites 580 bp-DNA-Fragment, das durch das cDNA-Bibliothek-Screening erhalten wurde, könnte ebenfalls den Nachweis für eine Genfamilie liefern. Diese Sequenz zeigt auf der DNA-Ebene ungefähr 80% Sequenzidentität mit dem oben beschriebenen Klon (3). Die Sequenz in der oberen Zeile (Seq.-ID Nr. 35) stellt den oben beschriebenen Klon dar und die untere Sequenzzeile (Seq.-ID Nr. 36) stellt des zweite 580 bp-Fragment dar. Auf der Aminosäureebene wird eine höhere Degeneration beobachtet.
Die Sequenz (Seq.-ID Nr. 38) des Volllängen-Thioesterase-cDNA-Klons 3A-17 ist in 4B dargestellt. Die translatierte Sequenz (Seq.-ID Nr. 37) dieses Klons ist in 4A dargestellt. Das exakte „Start"-Methionin ist nicht ermittelt worden, sehr wohl jedoch eines der an Positionen 1, 5 und 13 der translatierten Aminosäuresequenz befindlichen Methionine.
Beispiel 15 – Isolierung einer C-18-bevorzugenden Saflor-Acyl-ACP-Thioesterase-cDNA
Die Sequenzinformation aus Bromcyan-Peptidsequenzen (Seq.-ID Nr. 26–31) der 34 und 40 kD-Saflor-Banden der Tabelle 9 aus Beispiel 14B wird analysiert, um eine Peptidkarte des Saflor-Thioesterase-Proteins zu erhalten. Der Vergleich der Molmassen (wie mittels SDS-PAGE abgeschätzt) von Peptiden, die gemeinsame Aminosäuresequenzen aufweisen, wird dazu verwendet, um Reihenfolge und Abstand zwischen diesen Peptiden im Thioesterase-Protein zu bestimmen. Homologievergleiche dieser Peptide mit der Aminosäuresequenz der Lorbeer-Thioesterase (4B) bestätigen die in 5 gezeigte Peptidkarte. Die Zahlen zwischen den Peptidstellen kennzeichnen die geschätzte Basenpaartrennung an einer Thioesterase-cDNA für Sequenzen, die den S828-, S829-, S830- und S834-Peptidsequenzen entsprechen.
Degenerierte Oligonucleotidprimer für die PCR werden aus Aminosäuresequenzen der Saflor-Thioesterase-Peptidfragmente S828, 5829, S830 und S834 entworfen. Das S830-hergeleitete Oligonucleotidgemisch 830 wird als Vorwärtsprimer (bindet an Antisense-Strang und primt die Synthese von Sense-Thioesterase-DNA) verwendet und S829-Oligonucleotidgemische 829-1R und 829-2R werden als reverse Primer (binden an den Sense-Strang und primen die Synthese von Antisense-Thioesterase-DNA) in PCR-Reaktionen verwendet, die Saflor-Samen-cDNA (aus der unten beschriebenen cDNA-Bibliothek) als Templat einsetzen.
Oligonucleotidgemisch 830 enthält alle möglichen Sequenzen, die für Aminosäuren 5-11 des Peptids S830 kodieren könnten mit der Ausnahme, dass das für Glycin an Position 5 gewählte Codon GGC ist, das Codon ACC für Threonin an Position 9 gewählt ist (mit einem an der dritten Base ebenfalls aufgenommenen Inosin) und nur die ersten beiden Nucleotide der möglichen Codons für Valin an Position 11 aufgenommen sind. S830 enthält ferner Nicht-Thioesterase-Sequenzen am 5'-Ende, die für eine Ncol-Stelle kodieren, um die Klonierung der PCR-Produkte zu erleichtern.
Oligonucleotidgemisch 829-1R enthält alle möglichen Komplemente von Sequenzen, die für Aminosäuren 1–6 des Peptids S829 kodieren könnten mit der Ausnahme, dass die ersten beiden Nucleotide möglicher Codons für Asparagin an Position 6 aufgenommen sind. 829-1R enthält ferner das Komplement für ein Methionin-Codon am 3'-Ende, und es kann angenommen werden, dass sich ein Methioninrest an dieser Position befindet, das im Bromcyan-Verdau abgespalten wurde. S829-1 R enthält ferner Nicht-Thioesterase-Sequenzen am 5'-Ende, die für eine HindIIl-Stelle kodieren, um die Klonierung der PCR-Produkte zu erleichtern.
Oligonucleotidgemisch 829-2R enthält alle möglichen Komplemente von Sequenzen, die für Aminosäuren 19–25 des Peptids S829 kodieren könnten mit der Ausnahme, dass eine Inosin-Base für die dritte Position des Codons für Isoleucin an Position 22 aufgenommen ist, das Codon ACG für Threonin an Position 24 gewählt wird (mit einem an der dritten Base ebenfalls aufgenommenen Inosin) und nur die ersten beiden Nucleotide der möglichen Codons für Histidin an Position 25 aufgenommen sind. S829-2R enthält ferner Nicht-Thioesterase-Sequenzen am 5'-Ende, die für eine HindIIl-Stelle kodieren, um die Klonierung der PCR-Produkte zu erleichtern.
Auf ähnliche Weise werden Oligonucleotidgemische aus Aminosäuren 10–16 des Peptids S828 (828 ist ein Vorwärts-Primer mit BamHI-Stellensequenzen am 5'-Ende), Aminosäuren 12–18 des Peptids S834 (834 ist ein Vorwärts-Primer mit XbaI-Stellensequenzen am 5'-Ende) und Aminosäuren 8–14 des Peptids 5834 (834R ist ein reverser Primer mit SaII-Stellensequenzen am 5'-Ende) entworfen.
PCR-Reaktionen werden mit Taq-Polymerase und Thermocycler (Perkin/Elmer Cetus) gemäß den Spezifikationen des Herstellers durchgeführt. Zyklusparameter können abgeändert werden, um eine maximale Ausbeute des Thioesterase-PCR-Produkts zu erhalten.
PCR-Produkte werden mittels Agarosegelelektrophorese analysiert und es wird die ^-800 bp-Bande beobachtet. Von S834 und 5828 hergeleitete Oligonucleotide werden ver wendet, um entweder mittels weiterer PCR unter Verwendung das 5830/5829-PCR-Produkts als Templat oder mittels Southern-Hybridisierung des S830/S829-PCR-Produkts zu verifizieren, dass die Bande Thiosterase-DNA darstellt. Die DNA-Sequenz des ^-800 bp-Produkt wird bestimmt, um zu verifizieren, dass das Fragment für einen Teil des Saflor-Thioesterase-Proteins kodiert.
Das ^-800 bp-Thioesterase-Fragment wird mit ³²P markiert und als Sonde für das Screening einer im Plasmidklonierungsvektor pCNG1703 konstruierten Saflor-cDNA-Bibliothek verwendet. Die cDNA-Bibliothek wird aus Poly(A)+ RNA konstruiert, die aus Saflor-Embryos isoliert wurde, die an Tagen 14–17 nach der Anthese durch ein von Goldberg et al. (Developmental Biol. 83, 210–217 (1981)) modifiziertes, ursprünglich von Jackson und Larkins (Plant Physiol 57, 5–10 (1976)) beschriebenes Verfahren geerntet wurden.
Die polyadenylierte RNA wird verwendet, um eine cDNA-Bibliothek im Plasmidklonierungsvektor pCGN1703 wie in Beispiel 14.C.3 beschrieben zu konstruieren. Die auf diese Weise erhaltene Sailor-Embryo-cDNA-Bank enthält ungefähr 3–5 × 10⁶ Klone mit einer mittleren cDNA-Insertgröße von ungefähr 1.000 Basenpaaren.
Beispiel 16 – Expression der mittlere Ketten bevorzugenden Acyl-ACP-Thioesterase in E. coli
In diesem Beispiel wird die Expression von Lorbeer-Thioesterase-Proteinen in E. coli beschrieben.
Die in Beispiel 14 beschriebene trunkierte Lorbeer- (1.200 bp-) cDNA wird als ein 30 kD-Protein in einer E. coli-Wirtszelle exprimiert und es werden Daten bereitgestellt, die nachweisen, dass das cDNA-Fragment dem Transformanten eine erhöhte C12-Acyl-ACP-Thioesteraseaktivität verleiht.
Ein pET3a-Vektor (Rosenberg et al., Gene 56, 125–135 (1987)) wird im E. coli-Stamm BL21 (PE3) (Studier und Moffat, ). Mol. Biol. 189, 113–130 (1986)) als Wirt für diese Untersuchung verwendet. Der pET3a-Vektor enthält einen Promotor und 33 bp des 5'-Leserasters des Bakteriophagen T7. T7-Polymerase steht unter der regulatorischen Kontrolle eines Isopropyl-b-D-thiogalactopyranosid- (IPTG-) induzierbaren lac-UV5-Promotors, der sich im E. coli BL21- (DE3-) Stamm findet. Folglich wird durch Zusatz von IPTG zum mit pET3a transformierten E. coli BL21 (DE3) der T7-Promotor aktiviert.
Es werden Konstrukte hergestellt, die die trunkierte, durch Deletion des BamHI/EcoRI-Fragments und Ersatz der Thioesterase-Sequenz im Leseraster fusionierte cDNA der 2 enthalten. Die E. coli-Zellen werden mit pET3a-Konstrukten transformiert, die die Thioesterase (pET3a-TH10) und unmodifiziertes pET3a als Kontrolle enthalten. Die E. coli-Zellen werden bei 37°C in Flüssigmedium gezüchtet und die Expression durch Zugabe von 1 mM IPTG induziert. Nach 1 Stunde Induktion werden die Zellen durch Zentrifugation geerntet, in Testpuffer resuspendiert und durch Ultraschallbehandlung lysiert. Zelltrümmer werden durch weitere Zentrifugation entfernt und der Überstand in Aktivitätstests wie in Beispiel 1 verwendet.
Tabelle 10
Die Ergebnisse zeigen, dass ein Lysat von E. coli-Kontrollzellen hydrolytische Aktivität gegenüber allen getesteten Acyl-ACP-Substraten enthält, wobei langkettige Substrate bevorzugt werden. Die pET3a-TH10-Ergebnisse mit den Kontrollergebnissen vergleichend ist es offenkundig, dass sich das Muster der Substratpräferenzen unterscheidet. Das Lysat des Transformanten zeigt im Vergleich zum Kontroll-Lysat stark erhöhte Aktivität mit 12 : 0-ACP in Bezug auf die anderen Substrate. Diese erhöhte 12 : 0-ACP-Aktivität beweist, dass dieses cDNA-Fragment genügend Lorbeer-12 : 0-ACP-Thioesterase-Gen umfasst, um in E. coli-Zellen aktives Enzym zu produzieren.
Zusätzlich wird das gesamte reife Lorbeer-Thioesterase-Protein als eine lac-Fusion in E. coli exprimiert. Die in Beispiel 14 beschriebene Sequenzanalyse der Volllängen-Lorbeer-Thioesterase-cDNA pCGN3822 offenbart eine XbaI-Stelle an Base 394. Der Verdau dieser XbaI-Stelle spaltet die kodierende Region unmittelbar 5' des Codons, das Leucin an Aminosäureposition 72 verkörpert. Dieses Leucin ist als ein Kandidat für den wie in Beispiel 14a beschriebenen terminalen Aminorest identifiziert worden.
Ein Fragment von ungefähr 1.200 bp der pCGN3822-cDNA wird durch Verdau mit XbaI erzeugt, das wie oben beschrieben an der postulierten Proteinstartstelle des reifen Proteins und in den Vektorsequenzen spaltet, die das 3'-Ende der cDNA flankieren. Das XbaI-Fragment wird an den XbaI-Verdau der Minus-Version eines Bluescribe M13(+/–)-(auch pBS+/– genannt) Klonierungsvektors (Stratagene, San Diego, CA) kloniert. Der Thioesterase-Genklon wird so insertiert, dass das reife Protein sich im Leseraster mit einem Teil des lacZ-Gens des Bluescribe-Vektors unter der Kontrolle des lac-Promotors befindet.
Das resultierende Konstrukt pCGN3823 und ein Kontroll-Bluescribe-Konstrukt, die ein in entgegengesetzter Richtung insertiertes Lorbeer-Thioesterase-Gen aufweisen, werden in E. coli insertiert. Die E. coli-Zellen werden bei 37°C in Flüssigmedium gezüchtet und die Expression aus dem lac-Promotor durch Zugabe von IPTG auf eine Endkonzentration von 0,1 mM IPTG induziert. Eine Stunde nach der Induktion werden die Zellen wie oben beschrieben geerntet, lysiert und auf die trunkierte Lorbeer-Thioesterase hin getestet.
Tabelle 11
Die Ergebnisse zeigen, dass ein Lysat von E. coli-Zellen, die das postulierte reife Lorbeer-Thioesterase-Enzym exprimieren, eine signifikant höhere Aktivität gegenüber einem 12 : 0-ACP-Substrat als gegenüber anderen ACP-Substraten variierender Kohlenstoffkettenlängen aufweist. Zusätzlich ist diese Aktivität um mehr als zwei Größenordnungen höher als jene in einem Lysat von E. coli-Zellen, die die trunkierte Lorbeer-Thioesterase exprimieren.
Es sind Untersuchungen durchgeführt worden, um zu ermitteln, ob die Expression des Lorbeer-Thioesterase-Proteins in E. coli-Zellen eine Wirkung auf die Fettsäurezusammensetzung dieser Zellen hat. Anfängliche Untersuchungen sind fehlgeschlagen, eine wesentliche Änderung der Fettsäurezusammensetzungen der die Lorbeer-Thioesterase enthaltenden E. coli-Zellen festzustellen.
Eine Substratanalyse des aus Samen in der Entwicklungsphase wie in Beispiel 2 beschrieben gereinigten Lorbeer-Thioesterase-Enzyms wird ebenfalls durchgeführt. Ergebnisse sind in untenstehender Tabelle 12 dargestellt.
Tabelle 12
Der Vergleich der Ergebnisse der Substratanalyse der Thioesterase in den E. coli-Extrakten und wie aus den Lorbeer-Samen in der Entwicklungsphase gereinigt offenbart, dass das Aktivitätsprofil des Enzym aus den beiden Quellen bezüglich der Aktivität mit C8-, 10-, 12-, 14-, 16- und 18-ACP-Substraten im Wesentlichen identisch ist. Obwohl das aus Embryos gereinigte Enzym mit C18 : 1-Substraten etwas aktiver als das in E. coli exprimierte Enzym ist, wird angenommen, dass dies auf die Aktivität einer langkettigen Thioesterase zurückzuführen ist, die aus dem mittelkettigen Thioesterase-Proteinpräparat nicht entfernt wird.
Beispiel 17 – Transformation mit Pflanzen-Thioesterase
A. Konstrukte zur Expression von Lorbeer-Thioesterase in Pflanzenzellen, die Phaseolin-, Napin-, CaMV35S- und Bce4-Promotorregionen nützen, werden wie folgt hergestellt.
Phaseolin/Thioesterase
Ein 1,45 kb-Fragment von 3A-17 wird durch Verdau mit BaII und SaII erhalten. Die BaII-Stelle befindet sich an Position 149 des cDNA-Inserts und die SaII-Stelle im Polylinker, der sich 3' des cDNA-Inserts befindet. Folglich enthält dieses Insert die gesamte für Thioesterase kodierende Region und die gesamte cDNA-3'-Region, einschließlich des Polyadenylierungssignals AAATAA, das sich an den Basen 1447–1452 befindet, und enthält ferner die direkt 3' der cDNA befindlichen Restriktionsverdaustellen KpnI, SmaI, XbaI und SaII.
Ein 850 bp-BgIII-Fragment der nicht kodierenden β-Phaseolin-5'-Region wurde aus p8.8pro (Hoffman et al., EMBO J. 6, 3213–3221 (1987)) erhalten und in pCU9 (Vieira und Messing, supra) an der Baml-Stelle kloniert, um pTV796 zu liefern. Das Phaseolin-Fragment in pTV796 ist so orientiert, dass sich die SmaI-Stelle von pUC9 3' des Phaseolin-Promotors befindet. Ein ^-850 bp-Fragment wird durch Verdau von pTV796 mit HindIIl und SmaI erzeugt und gelgereinigt.
Der Phaseolin-Promotor (HindIII/SmaI) und die für Thioesterase kodierende Region (BaII/SaII) werden mittels Dreiwege-Ligation in einen Bluescript- (Stratagene) Klonierungsvektor verbunden, der mit HindIII und SaII verdaut worden ist. Das gebildete Plasmid enthält das Phaseolin-Promotor/Thioesterase-Konstrukt an einem HindIIl/SaII-Fragment, das von verschiedenen Restriktionsstellen, einschließlich einer 5'-Baml-Stelle und einer 3'-KpnI-Stelle flankiert wird. Keine zusätzliche nicht kodierende Pflanzen-3'-Region wird bereitgestellt, da das Thioesterase-Fragment ein Polyadenylierungssignal enthält. Das Phaseolin-Promotor/Thioesterase-Fragment kann durch Verdau mit BamHI und KpnI oder alternativ dazu durch teilweisen Verdau mit XbaI erhalten werden und in einen geeigneten binären Vektor, wie z. B. pCGN1557 oder pCGN1578 (McBride und Summerfelt, Plant Mol. Biol. 14, 269–276 (1990)) zur Pflanzentransformation ligiert werden.
35S/Thioesterase/mas
Ein BaII/PstI-Fragment der Thioesterase-cDNA 3A-17, das ungefähr 1.200 bp enthält und die gesamte kodierende Region enthält, wird durch teilweisen Verdau mit den Restriktionsenzymen BaII und PstI und Gelreinigung des 1.200 bp-Fragments erhalten. Das Fragment wird in einen Plasmidklonierungsvektor, wie z. B. den Bluescript-Vektor (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), der mit PstI und BamHI verdaut worden ist, ligiert und die BamHI-Stelle mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I aufgefüllt. In diesem Verfahren wird die BamHI-Stelle durch Ligation an die BaII-Stelle der Thioesterase-cDNA wiederhergestellt.
Das resultierende Plasmid wird mit BamHI und EcoRI verdaut, um das Thioesterase-Fragment von ungefähr 1.200 bp zu erhalten. Dieses Fragment wird in ein BamHI/Eco-RI-DNA-Fragment von ungefähr 4,4 kb kloniert, das ungefähr 0,94 kb der nicht kodierenden 5'-Sequenz aus einem Caulimomosaikvirus- (CaMV-) 35S-Gen (unmittelbar 5' der BamHI-Stelle), ungefähr 0,77 kb nicht kodierender 3'-Sequenz aus einem Agrobacterium tumefaciens-Manopin-Synthase- (mas-) Gens (unmittelbar 3' der EcoRI-Stelle) und ein pUC19- (New England BioLabs, Beverly, MA) Gerüst enthält, Das BamHI/EcoRI-Fragment wird durch teilweisen Verdau eines größeren Plasmidvektors und Gelreinigung des gewünschten 4,4 kb-Fragments erhalten. Bei der 35S-5'-Region handelt es sich um Basen b492 bis 7433 des Stamms CM1841 (Gardner et al., Nucl. Acids Res. 9, 2871–2887 (1981)), die sich in Bezug auf die Transkriptionsstartstelle von ungefähr –640 bis ungefähr + 2 befindet. Bei der nicht kodierenden mas-3'-Region handelt es sich um Basen 19.239 bis 18.474 des Octopin-Ti-Plasmids pTiAb (Nummerierung entspricht der des nahe verwandten pTi15955, wie von Barker et al. (Plant Mol. Biol. 2, 335–350 (1983)) publiziert).
Das resultierende 35S/Thioesterase/mas-Plasmid wird an den flankierenden BgIII-Stellen verdaut und in einen BamHI-verdauten binären Vektor, wie z. B. pCGN1557 und pCGN1578 (McBride und Summerfelt, supra) kloniert.
Bce4/Thioesterase
A 1,45 kb-Thioesterase-cDNA-BaII/SaII-Fragment wird wie oben beschrieben hergestellt. Eine Bce4-Expressionskassette, pCGN1879, die eine bevorzugte Expression bei der frühen Samenentwicklung bereitstellt, wird in mitangemeldeten US-Patentanmeldung mit der laufenden Nummer 07/494.722 beschrieben, die hierin durch Verweis aufgenommen ist.
Ein Fragment von ungefähr 1 kb der nicht kodierenden Bce4-5'-Region, dessen 3'-Ende sich unmittelbar 5' des Bce4-Startcodons befindet, wird durch Verdau von pCGN1870 mit XbaI und XhoI und Gelreinigung des resultierenden 1 kb-Fragments erhalten.
Der Bce4-Promotor (XbaI/XhoI) und die für Thioesterase kodierende Region (BaII/SaII) werden durch Dreiwege-Ligation in einen Bluescribe- (Stratagene) Klonierungsvektor verbunden, der mit XbaI und SaII verdaut worden ist. Das resultierende Plasmid enthält das Bce4-Promotor/Thioesterase-Konstrukt an einem XbaI/SaII-Fragment, das von ver schiedenen Restriktionsstellen, einschließlich einer 5'-BamHI-Stelle und einer 3'-KpnI-Stelle flankiert ist. Keine zusätzliche nicht kodierende Pflanzen-3'-Region wird bereitgestellt, das das Thioesterase-Fragment ein Polyadenylierungssignal enthält. Das Bce4-Promotor/Thioesterase-Fragment kann durch Verdau mit BamHI und teilweisen Verdau mit KpnI (oder Asp718, das dieselbe Erkennungsstelle besitzt) oder alternativ dazu durch teilweisen Verdau mit XbaI erhalten und in einen geeigneten binären Vektor, wie z. B. pCGN1557 oder pCGN1578 (McBride und Summerfelt, supra) zur Pflanzentransformation ligiert werden.
Napin/Thioesterase/Napin
Die Napin-Expressionskassette pCGN1808 wird in der mitangemeldeten US-Patentanmeldung mit der laufenden Nummer 07/550.804 (erteilt US 5.420.034 ) beschrieben.
pCGN1808 wird dahingehend modifiziert, dass es flankierende Restriktionsstellen enthält, damit nur die Expressionssequenzen und nicht der Antibiotikumsresistenzmarker auf binäre Vektoren wie pCGN1557 übertragen werden (McBride und Summerfelt, supra). Synthetische Oligonucleotide, die KpnI-, Notl- und HindIIl-Restriktionsstellen enthalten, werden an der einzigartigen HindIIl-Stelle von pCGN1808 ligiert und anneliert, so dass nur eine HindIIl-Stelle gewonnen wird. Das resultierende Plasmid pCGN3200 enthält einzigartige HindIIl-, Notl- und KpnI-Restriktionsstellen am 3'-Ende der Napin-3'-Regulationssequenzen, wie durch Sequenzanalyse bestätigt wurde.
Der Hauptteil der Napin-Expressionskassette wird aus pCGN3200 durch Verdau mit HindIIl und SacI und Ligation an HindIIl- und SacI-verdautes pIC19R subkloniert (Marsh et al., Gene 32, 481–485 (1984)), um pCGN3212 herzustellen. Die äußersten 5'-Sequenzen der Napin-Promotorregion werden mittels PCR unter Verwendung von pCGN-3200 als Templat und zwei Primern neu konstruiert, die die SacI-Stelle und die Verbindung des Napin-5'-Promotors und des pUC-Gerüsts von pCGN3200 aus dem pCGN-1808-Konstrukt flankieren. Der Vorwärts-Primer enthält Clal-, HindIIl-, Notl und KpnI- Restriktionsstellen sowie die Nucleotide 408–423 der Napin-5'-Sequenz (aus der EcoRV-Stelle) und der reverse Promotor enthält das Komplement der Napin-Sequenzen 718-739, das eine einzigartige SacI-Stelle im 5'-Promotor umfasst. Die PCR wurde mit einem Perkin Elmer/Cetus-Thermocycler gemäß den Spezifikationen des Herstellers durchgeführt. Das PCR-Fragment wird als ein stumpfendiges Fragment in mit Hincll verdautes pUC8 (Vieira und Messing, Gene 19, 259–268 (1982)) subkloniert, um pCGN3217 zu liefern. Die Sequenzierung von pCGN3217 über das Napin-Insert verifiziert, dass mittels PCR keine ungeeigneten Nucleotide eingeführt wurden. Die Napin-5-Sequenzen in pCGN3217 werden an den verbliebenen Rest der Napin-Expressionskassette durch Verdau mit ClaI und SacI und Ligation an mit ClaI und SacI verdautem pCGN3212 ligiert. Die resultierende Expressionskassette pCGN3221 wird mit HindIII verdaut und die Napin-Expressionssequenzen werden gelgereinigt und an mit HindIII verdautem pIC20H (Marsh, supra) ligiert. Die endgültige Expressionskassette ist pCGN3223 und enthält vor dem Hintergrund von Ampicillin-Resistenz im Wesentlichen identische 1.725-Napin-5'- und 1.265-3'-Regulationssequenzen, wie sie sich in pCGN1808 finden. Die Regulationssequenzen werden von HindIII-, NotI- und KpnI-Restriktionsstellen flankiert und einzigartige SaII-, BgIII-, PstI- und XhoI-Klonierungsstellen befinden sich zwischen den nicht kodierenden 5'- und 3'-Regionen.
Das oben beschriebene 1.200 bp-BaII/PstI-Thioesterase-cDNA-Fragment wird in die Napin-Expressionskassette pCGN3223 kloniert, die mit SaII verdaut worden ist, und die SaII-Stelle unter Verwendung des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I aufgefüllt, gefolgt vom Verdau mit PstI. Die SaII-Stelle wird in dieser Ligation rekonstituiert.
Das durch diese Manipulationen erzeugte Napin/Thioesterase/Napin-Plasmid wird mit BamHI verdaut und mit KpnI teilweise verdaut, um ein Fragment von ungefähr 3,3 kb zu erzeugen. Dieses Fragment enthält ^-1,7 bp der nicht kodierenden Napin-5'-Sequenz, das ^-1.200 bp-BaII/PstI-Thioesterase-cDNA-Fragment und ^-0,33 kb der nicht kodierenden 3'-Napin-Region, wobei der Rest der 1.265 kb von Napin 3' wegen der BamHI-Stelle in dieser Region deletiert worden sind. Das -3,3 kb-Fragment wird an KpnI/BamHI verdautes pCGN1557 oder pCGN1578 (McBride und Summerfelt, supra) zur Pflanzentransformation ligiert.
B. Eine Vielzahl von Verfahren sind entwickelt worden, um eine DNA-Sequenz von Interesse in das Genom eines Pflanzenwirten zu insertieren, um die Transkription oder Transkription und Translation der Sequenz zu erhalten, um phänotypische Veränderungen zu bewirken.
Brassica-Transformation
Samen von Brassica napes cv. Westar werden in 95% Ethanol für 2 Minuten getränkt, in einer 1,0%igen Lösung von Natriumhypochlorit, die einen Tropfen Tween 20 enthält, für 45 Minuten sterilisiert und drei Mal in sterilem, destilliertem Wasser gespült. Die Samen werden dann in Magenta-Boxen mit einem Zehntel der Konzentration von mit Pyriodoxin (50 μg/l), Nicotinsäure (50 μg/l), Glycin (200 μg/l) und 0,6% Phytagar (Gibco), pH 5,8 ergänztem Murashige-Minimal-Organics-Medium (Gibco, Grand Island, NY) ausplattiert. Die Samen werden in einer Percival-Kammer bei 22°C in einer 16-stündigen Lichtperiode mit kaltem fluoreszentem und rotem Licht einer Intensität von ungefähr 65 μ-Einstein pro Quadratmeter pro Sekunde (μEm^–2S^–2) zur Keimung gebracht.
Keimachsen werden aus 5–7 Tagen alten Keimlingen herausgeschnitten, in Stücke von ungefähr 4 mm Länge geschnitten und auf Feeder-Platten ausplattiert (Morsch et al., Science 227, 1229–1231 (1985)). Feeder-Platten werden einen Tag vor Verwendung durch Ausplattieren von 1,0 ml Tabak-Suspensionskultur auf eine Petrischale (100 × 25 mm) hergestellt, die ungefähr 30 ml MS-Salzbasis (Carolina Biological, Burlington, NC), 100 mg/l Inositol, 1,3 mg/l Thiamin-HCl 200 mg KHP₂O₄ mit 3% Sucrose, 2,4-D (1,0 mg/l), 0,6% (w/v) Phytagar enthält, und vor dem Autoklavieren auf pH 5,8 gestellt (MS 0/1/0-Medium). Eine sterile Filterpapierscheibe (Whatman 3 mm) wird vor der Verwendung oben auf die Feeder-Schicht gelegt. Die Tabak-Suspensionskulturen werden wöchentlich durch Transfer von 10 ml Kultur in 100 ml frisches MS-Medium wie für die Feeder-Platten beschrieben mit 2,4-D (0,2 mg/l) und Kinetin (0,1 mg/l) subkultiviert. In Experimenten, wo keine Feeder-Zellen verwendet werden, werden Keimachsen-Explantate geschnitten und auf eine Filterpapierscheibe oben auf das MS0/1/0-Medium gelegt. Alle Keimachsen-Explantate werden auf Feeder-Platten für 24 Stunden bei 22°C in Dauerlicht einer Intensität von 30 μEm^–2S^–2 bis 65 μEm^–2S^–2 vorinkubiert.
Einzelkolonien des A. tumefaciens-Stamms EHA 101, die ein binäres Plasmid enthalten, werden auf 5 ml MG/L-Bouillon übertragen und über Nacht bei 30°C gezüchtet. Keimachsen-Explantate werden in 7–12 ml MG/L-Bouillon mit auf 1 × 10⁸ Bakterien/ml verdünnten Bakterien eingetaucht und nach 10–15 Minuten auf Feeder-Platten gegeben. Je Liter enthält MG/L-Bouillon 5 g Mannitol, 1 g L-Glutaminsäure oder 1,15 g Natriumglutamat, 0,25 g KHP₂O₄, 0,10 g NaCl, 0,10 g MgSO₄·7H₂O, 1 mg Biotin, 5 g Trypton und 2,5 g Hefeextrakt und die Bouillon wird auf pH 7,0 gestellt. Nach 48 Stunden Coinkubation mit Agrobacterium werden die Keimachsen-Transplantate auf B5 0/110-Kallus-Induktionsmedium übertragen, das filtersterilisiertes Carbenicillin (500 mg/l, nach dem Autoklavieren zugesetzt) und Kanamycinsulfat (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) in Konzentrationen von 25 mg/l enthält.
Nach 3–7 Tagen Kultur bei 65 μEm^–2S^–2 Dauerlicht wird an der Schnittfläche Kallusgewebe sichtbar und die Keimachsen-Explantate werden auf Schösslings-Induktionsmedium B5BZ (B5-Salze und Vitamine, ergänzt mit 3 mg/l Benzylaminopurin, 1 mg/l Zeatin, 1 Sucrose, 0,6% Phytagar und pH auf 5,8 gestellt) übertragen. Dieses Medium enthält auch Carbenicillin (500 mg/l) und Kanamycinsulfat (25 mg/l). Die Keimachsen-Explantate werden alle zwei Wochen auf frischem Schösslings-Induktionsmedium subkultiviert.
Schösslinge erneuern sich aus den Keimachsen-Kallussen nach einem bis drei Monaten. Zumindest 1 cm hohe, grüne Schösslinge werden aus den Kallussen herausgeschnitten und auf ein Medium gegeben, das B5-Salze und Vitamine, 1% Sucrose, Carbeniciliin (300 mg/l), Kanamycinsulfat (50 mg/l) und 0,6% (w/v) Phytagar enthält. Nach 2–4 Wochen werden Schösslinge, die grün bleiben, an der Basis herausgeschnitten und in Ma genta-Boxen übertragen, die Wurzel-Induktionsmedium (B5-Salze und Vitamine, 1% Sucrose, 2 mg/l Indolbuttersäure, 50 mg/l Kanamycinsulfat und 0,6% Phytagar) enthält. Grüne, verwurzelte Schösslinge werden auf Thioesterase-Aktivität getestet.
Erdnuss-Transformation
DNA-Sequenzen von Interesse können als Expressionskassetten, die zumindest eine Promotorregion, ein Gen von Interesse und eine Terminationsregion umfassen, in ein Pflanzengenom über Partikelbeschuss wie in der Europäischen Patentanmeldung 332.855 und in der laufenden Anmeldung USSN 07/225.332, eingereicht am 27. Juli 1988, beschrieben eingeführt werden.
Kurz gesagt werden Wolfram- oder Goldpartikel einer Größe im Bereich von 0,5 μM- 3 μM mit DNA einer Expressionskassette beschichtet. Diese DNA kann sich in Form eines wässrigen Gemisches oder eines trockenen DNA/Partikel-Präzipitats befinden.
Als Target für den Beschuss verwendetes Gewebe kann von Keimblatt-Explantaten, Schösslings-Meristem, unreifen Blättchen und Antheren stammen.
Der Beschuss des Gewebes mit den DNA-beschichteten Partikeln wird unter Verwendung einer Biolistics^TM-Partikelkanone (Dupont, Wilmington, DE) durchgeführt. Die Partikel werden in variablen Anständen im Bereich von 1 cm – 14 cm von der Laufmündung in den Lauf gegeben. Das zu beschießende Gewebe wird unter die Sperrplatte gegeben; die Testung wird am Gewebe in Abständen bis zu 20 cm durchgeführt. Im Moment des Abschusses wird das Gewebe durch ein Nylonnetz oder eine Kombination von Nylonnetzen mit maschenweiten von 10 μm bis 300 μm geschützt.
Nach dem Beschuss können die Pflanzen nach dem Verfahren von Atreya et al. (Plant Science Letters 34, 379–383 (1984)) regeneriert werden. Kurz gesagt werden Embryo-Achsengewebe oder Keimblattsegmente auf MS-Medium (Murashige und Skoog, Phy siol. Plant. 15, 473 (1962)) (MS plus 2,0 mg/l 6-Benzyladenin (BA) für die Keimblattsegmente) gegeben und im Dunkeln für 1 Woche bei 25 +/– 2°C inkubiert und werden anschließend in kaltes, weißes, fluoreszentes Dauerlicht (6,8 W/m²) verlegt. Am 10. Kultivierungsstag werden die Pflänzchen in Töpfe versetzt, die sterile Erde enthalten, werden für 3–5 Tage im Schatten gehalten und schließlich ins Gewächshaus verlegt.
Die mutmaßlich transgenen Schösslinge werden eingewurzelt. Die Integration exogener DNA in das Pflanzengenom kann mit verschiedenen Verfahren bestätigt werden, die dem Fachkundigen bekannt sind.
Beispiel 18 – Erlangen anderer Pflanzen-Thioesterasen
Da nun die Sequenz (Aminosäure und DNA) für Lorbeer-Thioesterase erlangt worden ist, können ähnliche Gene aus anderen Pflanzenquellen leicht isoliert werden. In diesem Beispiel werden zwei Verfahren beschrieben, um andere Thioesterase-Gene zu isolieren: (a) mittels DNA-Hybridisierungstechniken unter Verwendung von Sequenzen oder Sequenzinformation aus dem Lorbeer-Thioesterase-Gen und (B) mittels immunologischer Kreuzreaktivität unter Verwendung von Antikörpern gegen das Lorbeer-Protein als Sonde.
Für beide dieser Techniken sind cDNA- oder Genom-Bibliotheken aus den gewünschten Pflanzen erforderlich. Viele Verfahren der Konstruktion von cDNA- oder Genom-Bibliotheken werden beispielsweise in Kapitel 8 und 9 von Maniatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989)) bereitgestellt. Das in Beispiel 14 beschriebene Verfahren kann ebenfalls für die cDNA-Bibliothekskonstruktion verwendet werden.
A. Sonden zur Verwendung in DNA-Hybridisierungen, um andere Pflanzen-Thioesterase-Gene zu erhalten, können aus den bereitgestellten Lorbeer-Thioesterase-Gensequen zen oder alternativ dazu mittels PCR unter Verwendung von Oligonucleotiden aus der bereitgestellten Lorbeer-Thioesterase-Peptidsequenz erhalten werden.
In diesem Beispiel wird das mittels PCR erzeugte DNA-Fragment von 800 bp als Sonde verwendet. Northern-Analyse von Embryo-RNA aus den gewünschten Pflanzenspezies wird durchgeführt, um geeignete Hybridisierungsbedingungen zu ermitteln. RNA wird aus Embryo wie in Beispiel 14.C. beschrieben isoliert, in einem Formaldehyd/Agarosegel der Elektrophorese unterzogen und wie von Fourney et al. (Focus, Bethseda Research Laboratories/Life Technologies Inc., 10, 5–7 (1988)) beschrieben auf ein Nylonmembranfilter übertragen. Die ³²P-Markierte Sonde (Random-Primed-DNA-Markierungsset, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) wird einer Hybridisierungslösung zugesetzt, die 50% Formamid, 6 × SSC (oder 6 × SSPE), 5 × Denhardts Reagens, 0,5% SDS und 100 μg/ml denaturierte Lachsspermien-DNA-Fragmente enthält Die die markierte Sonde enthaltende Hybridisierungslösung wird mit dem Northern-Filter bei ungefähr 40°C für 18 Stunden oder länger inkubiert, um die Hybridisierung der Sonde an homologe (50–80%) Sequenzen zu ermöglichen. Das Filter wird dann bei niedriger Stringenz (Raumtemperatur bis 42°C in ungefähr 1 × SSC) gewaschen.
Hybridisierungs- und Waschtemperaturen können auf Basis der geschätzten Schmelztemperatur der Sonde wie in Beltz et al. (Methods in Enzymology 100, 266–285 (1983)) erörtert abgestimmt werden. In weiteren Tests wird die Temperatur entweder in den Hybridisierungs- oder Waschschritten erhöht und/oder die Salzkonzentration erniedrigt, um die Detektion der spezifisch hybridisierenden Sequenz zu verbessern.
Wenn eine brauchbare Sonde und geeignete Hybridisierungs- und Waschbedingungen wie oben bestimmt worden sind, werden cDNA-Bibliotheken unter Verwendung des ³²P-markierten Fragments unter optimalen Bedingungen gescreent.
Beispielsweise kann ein Kampher- (Cinnamomum camphora) Thioesterase-Klon unter Verwendung der Nucleinsäure- und Aminosäuresequenzinformation aus den Lorbeer- und Saflor-Thioesterase-Klonen isoliert werden. Homologie des Lorbeer-ThioesterasecDNA-Klons mit aus Kampher-Embryos in der Entwicklungsphase isolierter RNA kann mittels Northern-Analyse wie folgt festgestellt werden. Gesamt-RNA wird aus 1 g Kampher-Embryos in der Entwicklungsphase mittels Anpassung des in Current Protocols in Molecular Biology, Seiten 4.3.1–4.3.4 (Ausubel et al. (Hrsg.), John Wiley & Sons (1987)) beschriebenen SDS/Phenol-Extraktionsverfahrens isoliert. Der Zermahlungspuffer für diese Extraktion enthält 100 mM LiCl, 100 mM Tris, pH 9, 10 mM EDTA, 1% SDS und 0,5% β-Mercaptoethanol: Zur Extraktion von 1 g Embryos werden 10 ml Zermahlungspuffer plus 3 ml auf pH 8 äquilibriertes Phenol den zermahlenen Embryos zugesetzt. Der Homogenisierungsschritt kann in einem Mörser anstelle eines Polytron wie im publizierten Verfahren beschrieben durchgeführt werden und der Erwärmungsschritt, der der Homogenisierung in diesem Schritt folgt, wird weggelassen. Zentrifugation, Phenol/ Chloroform-Extraktionen der Probe und Lithiumchlorid-Präzipitation der RNA werden beschrieben.
Gesamt-RNA (10–20 μg) wird in einem Formaldehyd/Agarosegel der Elektrophorese unterzogen und wie von Fourney et al. (supra) beschrieben auf ein Nylonmembranfilter übertragen. Eine Sonde zur Hybridisierung des Northern-Filters wird aus einem SaII-Verdau von pCGN3822, der Volllängen-Lorbeer-Thioesterase-cDNA mittels PCR unter Verwendung von Oligonucleotiden zur Saflor-Thioesterase-cDNA-Sequenz hergestellt, um ein Fragment von ungefähr 1.300 bp zu erzeugen. Der Vorwärts-Primer enthält die Nucleotide 212 bis 228 der Saflor-Thioesterase-cDNA-Sequenz (Seq.-ID Nr. 38) und der reverse Primer ist das Komplement zu den Nucleotiden 1.510 bis 1.526 der cDNA-Sequenz. Das Fragment wird unter Verwendung eines Prep-A-Gene-DNA-Reinigungssets (BioRad, Richmond, CA) gelgereinigt und unter Verwendung eines Random-Priming-Markierungssets von Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN) radioaktiv markiert. Das Northern-Filter wird über Nacht in 50% Formamid, 5X SSC, 50 mM Natriumphosphat (pH 7), 5X Denhardts Lösung, 0,1% SDS, 5 mM EDTA und 0,1 mg/ml denaturierter DNA bei 30°C hybridisiert. Die Autoradiographie des hybridisierten Filters lässt ein starkes Hybridisierungssignal an einer RNA-Bande von ungefähr 1.300 bp in der Kampher-Embryo-Probe erkennen.
Um ein Fragment des Kampher-Thioesterase-Gens zu erhalten, wird eine PCR unter Verwendung von Oligonucleotiden zu Peptiden durchgeführt, die zwischen den Lorbeer- und Saflor-Thioesterasen konserviert sind. Der Vorwärts-Primer, 828-1-2800 ist ein Gemisch aus allen möglichen kodierenden Sequenzen für Aminosäuren 101–107 des Lorbeer-Thioesterase-Proteins (Seq.-ID Nr. 37) und Aminosäuren 16–22 des Saflor-Thioesterase-Peptids 5828 (Seq.-ID Nr. 26). Diese Aminosäuresequenzen sind identisch, wenn man annimmt, dass die unbekannte Aminosäure an Position 18 von 5828 ein Serin ist. Der Primer (28 bp) wird so entworfen, dass ein Inosin (I) oder Cytosin (C) eingebaut wird, wo die Base ein beliebiges von A, G, T oder C sein könnte. Die unbekannte dritte Base der abschließenden Aminosäure, Glycin, wird nicht in die Oligonucleotidsequenz eingebaut und es wird die Sequenz CTGGATCC an das 5'-Ende angefügt, um eine Bam-HI-Restriktionsstelle aufzunehmen. Der reverse Primer, 829-2a-2789 ist ein Gemisch aus allen möglichen Komplementen zu den kodierenden Sequenzen für Aminosäuren 271–276 des Lorbeer-Thioesterase-Proteins (Seq.-ID Nr. 37) und Aminosäuren 1–6 des Saflor-Thioesterase-Peptids S829 (Seq.-ID Nr. 27). Diese 6 Aminosäuren-Peptidregionen unterscheiden sich nur in ihrer zweiten Aminosäure (wobei dieser Rest als Glutamin im der Lorbeer- und als Lysin im Saflor-Peptid identifiziert worden ist) und beide Aminosäurecodons sind im Oligonucleotidgemisch vertreten. Der reverse Primer (26 bp) baut ein I oder ein C ein, wo die Base A, G, T oder C sein könnte, und es wird die Sequenz GCCTCGAG am 5'-Ende angefügt, um eine XhoI-Restriktionsstelle anzufügen.
Polymerasekettenreaktionen werden unter Verwendung revers transkribierter Kampher-RNA als Templat durchgeführt. Die Reaktionen werden in einem Biosycler Oven (Bios Corp., New Haven, CT) durchgeführt, der für die folgenden Zyklen programmiert ist:
Zyklus N wird gefahren und 6 Mal wiederholt, worauf Zyklus P gefahren und 37 Mal wiederholt wird.
Eine Bande mit ungefähr 500–600 bp wird mittels Agarosegelelektrophorese der PCR-Produkte identifiziert. Dies ist die ungefähre Fragmentgröße, die aus der Analyse des Abstands zwischen den Peptiden in der Lorbeer-Thioesterase-Sequenz vorhergesagt wurde. Das PCR-Fragment wird in einen geeigneten Klonierungsvektor subkloniert und dessen DNA-Sequenz ermittelt, um die Thioesterase-Sequenz zu verifizieren. Das Fragment kann dann angewendet werden, um eine Kampher-cDNA oder genomische Bibliothek zu screenen, um einen Kampher-Thioesterase-Klon zu isolieren.
B. Für immunologisches Screening werden Antikörper gegen Lorbeer-Thioesterase hergestellt, indem Kaninchen oder Mäuse mit dem Aus Lorbeer gereinigten Thioesterase-Protein oder mit dem in E. coli wie in Beispiel 16 beschrieben exprimierten, trunkierten Thioesterase-Protein injiziert werden.
Für verwandte Proteine kodierende Gene werden mittels Screening der cDNA-Bibliothek aus der Pflanze von Interesse isoliert, die die auf den in Kapitel 12 von Maniatis et al. (supra) beschriebenen Expressionsvektor gt11 übertragen worden ist. Die Bibliotheken werden dann ausplattiert, zur Produktion von Proteinen aus den klonierten Genen induziert und zur Immobilisierung für das Screening an Membranen abgehoben. Die Thioesterase-Antikörper werden auf die immobilisierte Proteine enthaltenden Filter aufgegeben, um die Bindung des Antikörpers an verwandte Proteine zu erlauben. Für Thioesterase-Proteine kodierende Klone werden durch Detektion des Antikörper/Protein-Komplexes an Nitrozellulosefiltern unter Verwendung eines sekundären Antikörper/Enzym-Konjugatsystems identifiziert, das alkalische Phosphatase wie von Oberfelder (Focus, BRL/Life Technologies Inc., 11, 1–5 (1989)) beschrieben einsetzt.
Analyse:
Mittels DNA-Hybridisierung oder immunologischer Screening-Technologien identifizierte Klone werden dann gereinigt und die DNA unter Anwendung von Techniken isoliert, wie sie in Maniatis et al. (supra) bereitgestellt sind. Die DNA-Sequenz der Gene wird wie in Beispielen 14 und 15 beschrieben ermittelt. Auf diese Weise wird verifiziert, dass die Klone für eine verwandte Thioesterase kodieren. Alternativ dazu wird das Protein in E. coli wie oben für Lorbeer-Thioesterase beschrieben exprimiert, um zu zeigen, dass es die gewünschte Aktivität aufweist. Die neu isolierten Pflanzen-Thioesterase-Sequenzen können auch dazu verwendet werden, um Gene für Thioesterasen aus anderen Pflanzenspezies unter Anwendung der oben beschriebenen Techniken zu isolieren.
Mit den obigen Beispielen wird der Nachweis entscheidender Faktoren in der Produktion langkettiger und mittelkettiger Fettsäuren beschrieben. Es wird ein Protokoll bereitgestellt, um teilweise gereinigte, C12-bevorzugende Acyl-ACP-Thioesterase aus California-Lorbeer zu erhalten, es werden verschiedene Eigenschaften des Proteins beschrieben, einschließlich Verfahren zur Erlangung und Verwendung von dazu in Beziehung stehender Aminosäure- und Nucleinsäuresequenz. Eine cDNA-Teilsequenz der Lorbeer-Thioesterase wird ebenfalls mit einem Nachweis der Aktivität des von ihr kodierten Polypeptids bereitgestellt. Eine vollständige Sequenz der Lorbeer-Thioesterase wird mit verschiedenen Konstrukten zur Verwendung in Wirtszellen ebenfalls angeführt. Zusätzlich werden Verfahren zum Erlangen eines teilweise gereinigten Präparats einer C10-bevorzugenden Acyl-ACP-Thioesterase aus Cuphea hookeriana ebenfalls bereitgestellt.
Eine lange Ketten bevorzugende Acyl-ACP-Thioesterase aus Saflor wird ebenfalls beschrieben. Durch diese Erfindung kann man die Aminosäure- und Nucleinsäuresequenzen, die für Pflanzen-Thioesterasen kodieren, aus einer Vielzahl von Quellen und für eine Vielzahl von Anwendungen erlangen.
Alle in dieser Patentbeschreibung erwähnten Veröffentlichungen und Patentanmeldungen spiegeln den Ausbildungsstand jender Fachleute wider, auf die sich die vorliegende Erfindung bezieht.
Obgleich die vorangehende Erfindung einigermaßen ausführlich veranschaulichend und beispielhaft beschrieben worden ist, liegt auf der Hand, dass gewisse Änderungen und Modifizierungen innerhalb des Schutzumfangs der angefügten Ansprüche vorgenommen werden können.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Rekombinantes DNA-Konstrukt, das eine Nucleinsäure umfasst, die für eine Pflanzen-Acyl-ACP-Thioesterase oder einen Abschnitt davon mit Hydrolaseaktivität gegenüber einem oder mehreren Fettacyl-ACP-Substraten kodiert, worin die Nucleinsäure eine Sequenz umfasst, die zumindest 50%ige Sequenzidentität mit den Sequenzen der Seq.-ID Nr. 34 oder Seq.-ID Nr. 35 aufweist.
Konstrukt nach Anspruch 1, worin die Sequenz mit einer zweiten Nucleinsäure verbunden ist, die von Natur aus nicht mit der Sequenz verbunden ist.
Konstrukt nach Anspruch 1 oder 2, worin die Sequenz mit einer Markierung verbunden ist.
Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Sequenz für eine Vorläufer-Pflanzen-Thioesterase kodiert.
Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die in 5'->3'-Transkriptionsrichtung eine in einer Wirtszelle funktionelle Transkriptionsregulationsregion und die Sequenz umfasst.
Konstrukt nach Anspruch 5, das weiters eine in einer Wirtszelle funktionelle Translationsregulationsregion unmittelbar 5' zur Sequenz und eine Transkriptions-Translations-Terminationsregulationsregion 3' zur Sequenz umfasst.
Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 6, das eine Expressionskassette umfasst, die fähig ist, eine Thioesterase in einer Wirtszelle zu produzieren, die in 5'->3'-Transkriptionsrichtung eine in der Wirtszelle funktionelle Transkriptionsinitiationsregulationsregion, eine in der Pflanzen-Thioesterase funktionelle Translationsinitiationsregulationsregion und eine in der Wirtszelle funktionelle Transkriptions- und Transla tionsterminationsregulationsregion umfasst, worin die für Thioesterase kodierende Sequenz unter der Kontrolle der Regulationsregionen steht.
Konstrukt nach Anspruch 7, worin die Wirtszelle eine Pflanzenzelle ist.
Konstrukt nach Anspruch 8, worin die Transkriptionsinitiationsregion von einem Gen erhalten wird, das bevorzugt in Pflanzensamengewebe exprimiert wird.
Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin die Sequenz von Umbellularia californica (Bay) oder Cuphea hookerania (Cuphea) erhältlich ist.
Prokaryotische Wirtszelle, die ein Konstrukt nach einem der vorangegangenen Ansprüche umfasst.
Wirtszelle, die ein rekombinantes DNA-Konstrukt umfasst, wobei das DNA-Konstrukt eine Nucleinsäure umfasst, die für eine Pflanzen-Acyl-ACP-Thioesterase oder einen Abschnitt davon mit Hydrolaseaktivität gegenüber einem oder mehreren Fettacyl-ACP-Substraten kodiert, worin die Nucleinsäure eine Sequenz umfasst, die zumindest 50%ige Sequenzidentität mit den Sequenzen der Seq.-ID Nr. 34 oder Seq.-ID Nr. 35 aufweist, und worin die Sequenz mit einer zweiten Nucleinsäuresequenz verbunden ist, die von Natur aus nicht mit der Sequenz verbunden ist.
Zelle nach Anspruch 12, worin die Zelle eine Pflanzenzelle ist.
Zelle nach Anspruch 13, worin die Pflanzenzelle in vivo vorliegt.
Zelle nach Anspruch 14, worin die Pflanzenzelle eine Brassica-Pflanzenzelle ist.
Verfahren zur Herstellung einer Thioesterase in einer Wirtszelle, die ein rekombinantes DNA-Konstrukt aufweist, wobei das DNA-Konstrukt eine Nucleinsäure umfasst, die für eine Pflanzen-Acyl-ACP-Thioesterase oder einen Abschnitt davon mit Hydrolaseaktivität gegenüber einem oder mehreren Fettacyl-ACP-Substraten kodiert, worin die Nucleinsäure eine Sequenz umfasst, die zumindest 50%ige Sequenzidentität mit den Sequenzen der Seq.-ID Nr. 34 oder Seq.-ID Nr. 35 aufweist, und worin die Sequenz mit einer zweiten Nucleinsäuresequenz verbunden ist, die von Natur aus nicht mit der Sequenz verbunden ist.
Verfahren nach Anspruch 16, worin die Wirtszelle eine Pflanzenzelle ist und das Konstrukt in das Genom der Pflanzenzelle integriert wird.
Verfahren nach Anspruch 17, worin die Pflanzenzelle in vivo vorliegt.
Wirtszelle, die eine nach einem der Ansprüche 16 bis 18 hergestellte Pflanzen-Thioesterase umfasst.
Zelle nach Anspruch 19, die eine Pflanzenzelle ist und bei der das Konstrukt in das Genom der Pflanzenzelle integriert ist.
Verfahren zum Modifizieren der Fettsäuren in einer Pflanzenzelle von einem bestimmten Prozentsatz an längerkettigen Fettsäuren zu kürzerkettigen Fettsäuren, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: das Integrieren eines Konstrukts nach einem der Ansprüche 1 bis 10, das eine mittlere Ketten bevorzugende Acyl-ACP-Thioesterase exprimiert, unter Bedingungen, welche die Transkription der Sequenz ermöglichen, in das Genom einer Pflanzenzelle; und das Züchten der Pflanzenzelle oder ihrer Nachkommenschaft.
Verfahren zum Modifizieren der Fettsäurezusammensetzung von aus einer Ölsamen-Erntepflanze erzeugten Triglyceriden von einem bestimmten Prozentsatz an län gerkettigen Fettsäuren zu kürzerkettigen Fettsäuren, wobei das Verfahren Folgendes umfass: das Integrieren eines Konstrukts nach einem der Ansprüche 1 bis 10, das eine mittlere Ketten bevorzugende Acyl-ACP-Thioesterase exprimiert, unter Bedingungen, welche die Transkription der Sequenz ermöglichen, in das Genom einer Pflanzenzelle; und das Züchten der Pflanzenzelle oder ihrer Nachkommenschaft.
Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, worin die Pflanzenzelle eine Ölsamen-Embryopflanzenzelle ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 23, worin der Prozentsatz an längerkettigen Fettsäuren verringert wird und der Prozentsatz an mittelkettigen Fettsäuren erhöht wird.
Pflanzenzelle mit einem modifizierten Anteil an Fettsäuren im Vergleich zu einem Samen der Pflanze mit einem nativen Anteil an Fettsäuren, hergestellt nach einem Verfahren, das Folgendes umfasst: das Züchten einer Pflanze, bei der in das Genom von Embryozellen ein rekombinantes DNA-Konstrukt integriert ist, wobei das DNA-Konstrukt eine Nucleinsäure umfasst, die für eine Pflanzen-Acyl-ACP-Thioesterase oder einen Abschnitt davon mit Hydrolaseaktivität gegenüber einem oder mehreren Fettacyl-ACP-Substraten kodiert, worin die Nucleinsäure eine Sequenz umfasst, die zumindest 50%ige Sequenzidentität mit den Sequenzen der Seq.-ID Nr. 34 oder Seq.-ID Nr. 35 aufweist, und worin die Sequenz mit einer zweiten Nucleinsäuresequenz verbunden ist, die von Natur aus nicht mit der Sequenz verbunden ist, worin das Konstrukt Regulationsregionen umfasst, um für die Expression der Sequenz zu sorgen, die während der Lipid-Ansammlung im Samen funktionell sind, um Samen unter Bedingungen zu erzeugen, welche die Aktivität der Regulationsregionen fördern, sowie das Ernten des Samens.
Pflanzensamen nach Anspruch 25, worin die Pflanze Brassica napus ist.
Pflanzensamen nach Anspruch 25 oder 26, worin der Samen ein Ölsamen ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 24, worin die Erntepflanze aus der aus Rapssamen, Sonnenblumen, Saflor, Baumwolle, Cuphea, Sojabohne, Erdnuss, Kokosnuss, Ölpalme und Mais bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren zur Herstellung von Pflanzenöl, welches das Gewinnen von Pflanzensamen nach Anspruch 27 und das Isolieren von Öl daraus umfasst.