DE69836133T2

DE69836133T2 - Pflanzengene, die für fettsäurenepoxygenase kodieren und ihre verwendungen

Info

Publication number: DE69836133T2
Application number: DE69836133T
Authority: DE
Inventors: Sten Stymne; Allan Barton GREEN; Surinder Downer SINGH; Marit Lenman
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO; BASF Plant Science GmbH
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Priority date: 1997-04-15
Filing date: 1998-04-09
Publication date: 2007-08-16
Anticipated expiration: 2018-04-10
Also published as: NZ500542A; EA199900933A1; US6329518B1; ATE342361T1; JP2001518797A; KR100711074B1; WO1998046762A1; CA2286895A1; KR20010006468A; BR9808676A; DE69836133D1; PL336292A1; IL132393A; BR9808676B1; MX9909476A; ES2275301T3; EP0975765A1; CN100482797C; JP4108765B2; EP0975765B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein neue Gensequenzen, die für Fettsäureepoxygenaseenzyme codieren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Gensequenzen, die für Fettsäure-ρ12-Epoxygenaseenzyme, die hierin definiert sind, codieren. Noch spezieller stellt die vorliegende Erfindung cDNA- und genomische Gensequenzen bereit, die für Pflanzenfettsäureepoxygenasen, vorzugsweise ρ12-Epoxygenasen von Crepis palaestina oder Euphorbia lagascae, codieren. Die Gensequenzen der vorliegenden Erfindung stellen Mittel bereit, wodurch der Fettsäuremetabolismus in Organismen, wie Hefen, Schimmelpilzen, Bakterien, Insekten, Vögeln, Säugern und Pflanzen, insbesondere unter Umwandlung von ungesättigten Fettsäuren in epoxygenierte Fettsäuren in diesen geändert oder manipuliert werden kann. Die Erfindung erstreckt sich auf genetisch modifizierte ölanreichernde Organismen, die mit den vorliegenden Gensequenzen transformiert sind, und die dadurch abgeleiteten Öle. Die auf diese Weise hergestellten Öle ergeben Mittel für kostengünstige Ausgangsmaterialien zur Verwendung bei der effizienten Produktion von unter anderem Beschichtungen, Harzen, Klebstoffen, Kunststoffen, grenzflächenaktiven Mitteln und Gleitmitteln.
Durchgängig in dieser Beschreibung und den Ansprüchen, die folgen, sollen das Wort "umfassen" oder Variationen wie "umfasst" oder "umfassend", falls es nicht der Zusammenhang anders erfordert, so verstanden werden, dass sie den Einschluss einer angegebenen ganzen Zahl oder Gruppe ganzer Zahlen, jedoch nicht den Ausschluss einer anderen ganzen Zahl oder Gruppe ganzer Zahlen umfassen.
Bibliographische Einzelheiten der Veröffentlichungen, die in dieser Beschreibung durch den Autor angegeben sind, sind am Ende der Beschreibung zusammengefasst. Sequenzidentitätsnummern (SEQ ID NOs) für die in der Beschreibung angegebenen Nucleotid- und Aminosäuresequenzen sind nach der Bibliographie angegeben.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Weltweit besteht beträchtliches Interesse an der Herstellung chemischer Edukte, wie Fettsäuren, zur großtechnischen Verwendung aus erneuerbaren Pflanzenquellen statt aus nichterneuerbaren Petrochemikalien. Dieses Konzept stellt einen breiten Appell an Hersteller und Verbraucher auf der Basis von Ressourcenbewahrung dar und es ergibt eine signifikante Gelegenheit zur Entwicklung neuer gewerblicher Feldfrüchte für die Landwirtschaft.
Es gibt verschiedene Gruppen ungewöhnlicher Fettsäuren in der Natur und diese sind gut charakterisiert (Badam % Patil, 1981; Smith, 1970). Viele dieser ungewöhnlichen Fettsäuren besitzen gewerbliches Potential und dies führte zu Interesse an der Domestizierung derartiger Arten, um eine landwirtschaftliche Produktion spezieller Fettsäuren zu ermöglichen.
Eine Klasse von Fettsäuren von speziellem Interesse sind die Epoxyfettsäuren, die aus einer Acylkette bestehen, in der zwei aneinandergrenzende Kohlenstoffbindungen durch eine Epoxybrücke verknüpft sind. Aufgrund ihrer hohen Reaktivitäten finden sie beträchtliche Anwendungsmöglichkeiten bei der Herstellung von Beschichtungen, Harzen, Klebstof fen, Kunststoffen, grenzflächenaktiven Stoffen und Gleitmitteln. Diese Fettsäuren werden derzeit durch chemische Epoxydation von Pflanzenölen, hauptsächlich Sojaöl und Leinsamenöl, produziert, jedoch ergibt dieses Verfahren Gemische von mehreren und isomeren Formen und es umfasst bedeutende Verfahrenskosten.
Von anderen wurden Versuche unternommen, Wildpflanzen, die Epoxyfettsäuren enthalten, (beispielsweise Euphorbia lagascae, Vernonia galamensis) zu kommerziellen Quellen dieser Öle zu entwickeln. Jedoch schränken Probleme mit der agronomischen Eignung und dem Potential einer geringen Ausbeute die kommerzielle Verwendbarkeit von Ansätzen mit traditioneller Pflanzenzucht und Kultivierung stark ein.
Die rasch zunehmende Weiterentwicklung der Gentechnik erleichtert die Effizienz von kommerziell wichtigen gewerblichen Verfahren durch die Expression von Genen, die aus einem ersten Organismus oder einer ersten Art isoliert wurden, in einem zweiten Organismus oder einer zweiten Art, wobei diesem bzw. dieser neue Phänotypen verliehen werden, stark. Insbesondere können herkömmliche gewerbliche Verfahren effizienter oder kostengünstiger gestaltet werden, was zu größeren Ausbeuten pro Kosteneinheit durch die Anwendung gentechnischer Verfahren führt.
Darüber hinaus ergibt die entsprechende Wahl eines Wirtsorganismus zur Expression einer interessierenden Gensequenz die Produktion von Verbindungen, die von dem Wirt normalerweise nicht mit hoher Ausbeute und Reinheit produziert oder synthetisiert werden.
Jedoch bleibt trotz der allgemeinen Wirksamkeit von Gentechnik die Isolierung von Gensequenzen, die für wichtige Enzyme im Fettsäuremetabolismus codieren, insbesondere der Gene, die die Fettsäure-ρ12-Epoxygenaseenzyme codieren, die unter anderem zur Produktion von 12,13-Epoxy-9-octadecensäure (Vernolsäure) und 12,13-Epoxy-9,15-octadecadiensäure verantwortlich sind, ein Haupthindernis für die Entwicklung von gentechnisch veränderten Organismen, die diese Fettsäuren produzieren.
Bis zur vorliegenden Erfindung gab es nur begrenzte biochemische Daten, die die Natur von Fettsäureepoxygenaseenzymen, insbesondere ρ12-Epoxygenasen, zeigen. Jedoch scheint in Euphorbia lagascae die Bildung von 12,13-Epoxy-9-octadecensäure (Vernolsäure) aus Linolsäure durch ein Cytochrom-P450-abhängiges ρ12-Epoxygenaseenzym katalysiert zu sein (Bafor et al., 1993; Blee et al., 1994). Ferner besitzen sich entwickelnde Samen von Leinpflanzen die Fähigkeit zur Umwandlung von zugesetzter Vernolsäure in 12,13-Epoxy-9,15-octadecadiensäure durch eine endogene ρ15-Desaturase (Engeseth und Stymne, 1996). Epoxyfettsäuren können auch durch eine peroxidabhängige Peroxygenase in Pflanzengeweben produziert werden (Blee und Schuber, 1990).
Bei zur vorliegenden Erfindung führenden Arbeiten suchten die Erfinder, Gensequenzen zu isolieren, die für Gene codieren, die zur Produktion von Epoxyfettsäuren, wie 12,13-Epoxy-9-octadecensäure (Vernolsäure) oder 12,13-Epoxy-9,15-octadecadiensäure, wichtig sind, und diese Gensequenzen in hoch produktive kommerzielle Ölpflanzen und/oder andere ölanreichernde Organismen zu übertragen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein Aspekt der Erfindung stellt ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, das eine Fettsäureepoxygenase codiert oder komplementär zu einem eine Fettsäureepoxygenase codierenden Nucleinsäuremolekül ist.
Ein zweiter Aspekt der Erfindung stellt ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, das unter Bedingungen von mindestens niedriger Stringenz mit mindestens 20 fortlaufenden Nucleotiden von SEQ ID NO: 1 oder 3 oder 5 oder 19 oder 20 oder einer hierzu komplementären Sequenz hybridisiert.
Ein weiterer Aspetk der Erfindung stellt ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die zu mindestens 65 % identisch mit SEQ ID NO: 1 oder 3 oder 5 ist oder zu mindestens 75 % mit mindestens 200 fortlaufenden Nucleotiden in SEQ ID NO: 19 oder 20 oder einer hierzu komplementären Sequenz identisch ist, umfasst.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Genkonstrukt bereit, das das obige isolierte Nucleinsäuremolekül in entweder Sense- oder Antisense-Orientierung in funktioneller Verbindung mit einer Promotorsequenz umfasst.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Änderung der Konzentrationsmenge von Epoxyfettsäuren in einer Zelle, einem Gewebe, Organ oder Organismus bereit, wobei das Verfahren die Expression eines Sense-, Antisense-, Ribozym- oder Cosuppressionsmoleküls, das das obige isolierte Nucleinsäuremolekül umfasst, in der Zelle über einen Zeitraum und unter Bedingungen, die so ausreichend sind, dass die Konzentrationsmenge von Epoxyfettsäuren darin erhöht oder verringert wird, umfasst.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten, enzymatisch aktiven Epoxygenasepolypeptids in einer Zelle bereit, wobei das Verfahren die Expression des obigen isolierten Nucleinsäuremoleküls in der Zelle über einen Zeitraum und unter Bedingun gen, die so ausreichend sind, dass die dadurch codierte Epoxygenase produziert wird, umfasst.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten, enzymatisch aktiven Epoxygenasepolypeptids in einer Zelle bereit, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst:

(i) Produzieren eines Genkonstrukts, das das obige isolierte Nucleinsäuremolekül, das funktional unter die Kontrolle eines Promotors mit der Fähigkeit, die Expression der Gensequenz in der Zelle zu bewirken, und optional eines Expression-Enhancerelements gestellt wurde, umfasst;
(ii) Transformieren des Genkonstrukts in die Zelle und
(iii) Selektieren von Transformanten, die eine durch die Gensequenz codierte funktionale Epoxygenase in hohem Grade exprimieren.

Ein noch weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten, enzymatisch aktiven Epoxygenasepolypeptids in einer transgenen Pflanze bereit, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst:

(i) Produzieren eines Genkonstrukts, das das obige isolierte Nucleinsäuremolekül, das funktional unter die Kontrolle eines samenspezifischen Promotors und optional eines Expression-Enhancerelements gestellt wurde, umfasst, wobei die Gensequenzen auch strangaufwärts einer Transkriptionsterminatorsequenz platziert wurden;
(ii) Transformieren des Genkonstrukts in eine Zelle oder ein Gewebe der Pflanze; und
(iii) Selektieren von Transformanten, die eine durch die Gensequenz codierte funktionale Epoxygenase in hohem Grade in Samen exprimieren.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein rekombinantes Epoxygenasepolypeptid oder funktionales Enzymmolekül bereit.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt eine rekombinante Epoxygenase bereit, die eine Aminosäuresequenz, die in einer der Sequenzen SEQ ID NO: 2 oder 4 oder 6 angegeben ist, oder ein Homologon, Analogon oder Derivat derselben, das zu mindestens etwa 50 % damit identisch ist, umfasst.
Ein noch weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Produktion einer epoxygenierten Fettsäure in einer Zelle, einem Gewebe, Organ oder Organismus bereit, wobei das Verfahren die Inkubation von einer Zelle, einem Gewebe, Organ oder Organismus, die eine enzymatisch aktive rekombinante Epoxygenase exprimieren, mit einem Fettsäuresubstrat und vorzugsweise einem ungesättigten Fettsäuresubstrat über einen Zeitraum und unter Bedingungen, die so ausreichend sind, dass mindestens eine Kohlenstoffbindung, vorzugsweise eine Kohlenstoffdoppelbindung des Substrats in eine Epoxygruppe umgewandelt wird, umfasst.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein immunologisch interaktives Molekül bereit, das an das hierin beschriebene rekombinante Epoxygenasepolypeptid oder ein Homologon, Analogon oder Derivat desselben bindet.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine lineare Darstellung eines Expressionsplasmids, das ein Epoxygenasestrukturgen, das funktional unter die Kontrolle des verkürzten Napin-Promotors (FP1, rechter schraffierter Kasten) gestellt und strangaufwärts der NOS-Terminatorsequenz (rechter gepunkteter Kasten) platziert ist, umfasst. Die Epoxygenasegensequenz wird durch den rechten leeren rechteckigen Kasten angegeben. Das Konstrukt umfasst auch den NOS-Promotor (linker schraffierter Kasten), der die Expression des NPTII-Gens (linker leerer Kasten) antreibt und strangaufwärts des NOS-Terminators (linker gepunkteter Kasten) platziert ist. Die linken und rechten Randsequenzen des Ti-Plasmids von Agrobacterium tumefaciens sind ebenfalls angegeben.
2 ist eine schematische Darstellung, die das Alignment der Aminosäuresequenzen des Epoxygenasepolypeptids von Crepis palaestina (Cpal2, SEQ ID NO: 2), einer weiteren Epoxygenase, die von einer anderen Crepis sp. als C. palaestina stammt, die hohe Konzentrationsmengen von Vernolsäure produziert (CrepX, SEQ ID NO: 4), einer partiellen Aminosäuresequenz eines Epoxygenasepolypeptids, das von Vernonia galamensis stammt (Vgal1, SEQ ID NO: 6), der Aminosäuresequenz der ρ12-Acetylenase von Crepis alpina (Crep1, SEQ ID NO: 8), der ρ12-Desaturasen von A. thaliana (L26296, SEQ ID NO: 9), Brassica juncea (X91139, SEQ ID NO: 10), Glycine max (L43921, SEQ ID NO: 11), Solanum commersonii (X92847, SEQ ID NO: 12) und Glycine max (L43920, SEQ ID NO: 13) und der ρ12-Hydroxylase von Ricinus communis (U22378, SEQ ID NO: 14) zeigt. Unterstrichen sind drei histidinreiche Motive, die in nicht-hämhaltigen Monooxygenasen gemischter Funktion konserviert sind.
3 ist eine Kopie einer photographischen Darstellung einer Northern-Blot-Hybridisierung, die die samenspezifische Expression des Epoxygenasegens von Crepis palaestina am Beispiel von SEQ ID NO: 1 zeigt. Northern-Blot-Analyse von Gesamt-RNA von Blättern (Bahn 1) und sich entwickelnden Samen (Bahn 2) von Crepis palaestina. 15 μg Gesamt-RNA wurde auf einem Northern-Gel laufen gelassen und auf Hybond N⁺-Membran von Amersham nach den Vorschriften des Herstellers geblottet. Der Blot wurde bei 60 °C mit einer Sonde, die aus der 3'-nichttranslatierten Region von SEQ ID NO: 1 hergestellt wurde, hybridisiert. Der Blot wurde zweimal in 2 × SSC (NaCl-Natriumcitratpuffer) bei Raumtemperatur während 10 min und dann in 0,1 × SSC bei 60 °C während 20 min gewaschen.
4 ist eine schematische Darstellung, die die Nucleotidsequenz des entarteten PCR-Primers (5' → 3'-Richtung) der zur Isolierung der Epoxygenasegene von Euphorbia lagascae, die hierin beschrieben sind, verwendet wurde, zeigt.
5 ist eine Kopie einer photographischen Darstellung einer RNA-Dot-Blot-Hybridisierung, die die Expression des Epoxygenasegens, das als Beispiel in SEQ ID NO: 3 angegeben ist, in Pflanzen, die Vernolsäure produzieren, im Vergleich zu Pflanzen, die keine Vernolsäure produzieren, zeigt. 1 μg Gesamt-RNA wurde aus dem spezifizierten Gewebe isoliert und durch Dot-Blot auf die Hybond N⁺-Membran von Amersham nach den Vorschriften des Herstellers übertragen. Der Blot wurde bei 42 °C in 50 %-igem Formamid mit der relevanten, ³²P -markierten Sonde, die von SEQ ID NO: 3 hergestellt wurde, 16 h hybridisiert. Die Blots wurden zweimal in 2 × SSC (NaCl-Natriumcitratpuffer) bei Raumtemperatur und dann in 0,5 × SSC bei 55 °C während 20 min gewaschen. Audioradiographien wurden nach Exposition über Nacht erhalten. Panel A zeigt die Gesamt-RNA von sich entwickelnden Samen von Euphorbia lagascae (1), Euphorbia cyparissus (2), Vernonia galamensis (3) und Flachs (Linum usitatissimum) (4). Panel B zeigt die Gesamt-RNA von verschiedenen Geweben von Euphorbia lagascae, die sich entwickelnden Samen (1), Wurzeln (2) und Blätter (3) umfassen.
6 ist eine schematische Darstellung, die das subtraktive Hybridisierungsverfahren zeigt, das zur Isolierung der hierin beschriebenen Epoxygenasegene von Euphorbia lagascae verwendet wurde. Der +6cDNA-Pool bestand überwiegend aus samenspeicherungsproteinähnlichen Sequenzen. Ein Pool von 15 derartigen Sequenzen wurde biotinyliert und des weiteren von der +6cDNA subtrahiert. LH = lange Hybridisierung – 20 h; SH = kurze Hybridisierung – 3 h.
7 ist eine Kopie einer photographischen Darstellung einer RNA-Dot-Blot-Hybridisierung, die die Expression des Epoxygenasegens, das als Beispiel in SEQ ID NO: 20 angegeben ist, in Pflanzen, die Vernolsäure produzieren, im Vergleich zu Pflanzen, die keine Vernolsäure produzieren, zeigt. 1 μg Gesamt-RNA wurde aus dem spezifizierten Gewebe isoliert und durch Dot-Blot auf die Hybond N⁺-Membran von Amersham nach den Vorschriften des Herstellers übertragen. Der Blot wurde bei 42 °C in 50 %-igem Formamid mit der relevanten, ³²P-markierten Sonde, die von SEQ ID NO: 20 hergestellt wurde, 16 h hybridisiert. Die Blots wurden zweimal in 2 × SSC (NaCl-Natriumcitratpuffer) bei Raumtemperatur und dann in 0,5 × SSC bei 55 °C während 20 min gewaschen. Audioradiographien wurden nach Exposition über Nacht erhalten. Panel A zeigt die Gesamt-RNA von sich entwickelnden Samen von Euphorbia lagascae (1), Euphorbia cyparissus (2), Vernonia galamensis (3) und Flachs (Linum usitatissimum) (4). Panel B zeigt die Gesamt-RNA von verschiedenen Geweben von Euphorbia lagascae, die sich entwickelnden Samen (1), Wurzeln (2) und Blätter (3) umfassen.
8 ist eine schematische Darstellung eines binären Plasmidvektors, der eine Expressionskassette enthält, die den gekürzten samenspezifischen Napin-Promotor (Napin) und Nopalinsynthaseterminator (NT) mit einer dazwischenliegenden BamHI-Klonierungsstelle zusätzlich zu dem Kanamycin-Resistenzgen NPTII in funktioneller Verknüpfung mit den Nopalinsynthasepromotor(NP)- und Nopalinsynthaseterminator(NT)sequenzen umfasst. Die Expressionskassette wird von T-DNA-Linksrand(LB)- und -Rechtsrand(RB)sequenzen flankiert.
9 ist eine schematische Darstellung eines binären Plasmidvektors, der eine Expressionskassette enthält, die SEQ ID NO: 1, das funktional unter die Kontrolle eines gekürzten samenspezifischen Napin-Promotors (Napin) gestellt und strangaufwärts des Nopalinsynthaseterminators (NT) platziert wurde, zusätzlich zu dem Kanamycin-Resistenzgen NPTII, das funktional mit den Nopalinsynthasepromotor(NP)- und Nopalinsynthaseterminator(NT)sequenzen verbunden ist, umfasst. Die Expressionskassette ist von T-DNA-Linksrand(LB)- und
-Rechtsrand(RB)sequenzen flankiert. Zur Herstellung dieses Konstrukts wird SEQ ID NO: 1 in die BamHI-Stelle des in 8 angegebenen binären Vektors insertiert.
10 ist eine graphische Darstellung der Gaschromatographieregistrierkurven von Fettsäuremethylestern, die aus Ölsamen von nichttransformierten Arabidopsis thaliana-Pflanzen [Panel (a)] oder A. thaliana-Pflanzen (transgene Linie Cpal-17), die mit SEQ ID NO: 1 unter Verwendung des in 9 angegebenen Genkonstrukts transformiert wurden, [Panel (b) und (c)] hergestellt wurden. In Panel (a) und (b) wurden Fettsäuremethylester unter Verwendung einer Trennung einer gepackten Säule getrennt. In Panel (c) wurden die Fettsäuremethylester unter Verwendung von Kapillarsäulentrennung getrennt. Die Elutionspositionen von Vernolsäure sind angegeben.
11 ist eine graphische Darstellung, die die gemeinsame Verteilung von Epoxyfettsäuren in selbständig erhaltenen Samen an T₁-Pflanzen von Cpal2-transformierten Arabidopsis thaliana-Pflanzen, die unter Verwendung von Gaschromatographie bestimmt wurde, zeigt. Die Konzentrationsmengen von sowohl Vernolsäure (x-Achse) als auch 12,13-Epoxy-9-octadecadiensäure (y-Achse) wurden bestimmt und relativ zueinander aufgetragen. Die Daten zeigen eine positive Korrelation zwischen den Konzentrationsmengen dieser Fettsäuren in transgenen Pflanzen.
12 ist eine graphische Darstellung, die den Einbau einer ¹⁴C-Markierung in die Chloroformphase, die durch Lipidextraktion von Leinsamenkotyledonen während einer Zufuhr von markiertem Substrat erhalten wurde, zeigt. Verwendete Symbole: ⧫ Zufuhr von [¹⁴C]Ölsäure, ∎ Zufuhr von [¹⁴C]Vernolsäure.
13 ist eine graphische Darstellung, die den Einbau der ¹⁴C-Markierung in das Phosphatidylcholin von Leinsamenkotyledonen während einer Zufuhr von markiertem Substrat zeigt. Verwendete Symbole: ⧫ Zufuhr von [¹⁴C]Ölsäure, ∎ Zufuhr von [¹⁴C]Vernolsäure.
14 ist eine graphische Darstellung, die den Einbau der ¹⁴C-Markierung in die Triacylglycerine von Leinsamenkotyledonen während einer Zufuhr von markiertem Substrat zeigt. Verwendete Symbole: ⧫ Zufuhr von [¹⁴C]Ölsäure, ∎ Zufuhr von [¹⁴C]Vernolsäure.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein isolierten Nucleinsäuremolekül bereit, das für eine Fettsäureepoxygenase codiert oder komplementär zu einem eine Fettsäureepoxygenase codierenden isolierten Nucleinsäuremolekül ist.
Wenn das isolierte Nucleinsäuremolekül der Erfindung für ein Enzym codiert, das an der direkten Epoxidation von Arachidonsäure beteiligt ist, ist es besonders bevorzugt, wenn das betreffende Nucleinsäuremolekül von einer Nichtsäugerquelle stammt.
Der hier verwendete Ausdruck "stammt von" soll so verstanden werden, dass er angibt, dass eine spezielle Einheit oder eine Gruppe von Einheiten von der angegebenen Spezies stammt, jedoch nicht zwangsläufig direkt von der angegebenen Quelle erhalten wurde.
Der Ausdruck "Nichtsäugerquelle" bezeichnet einen beliebigen anderen Organismus als einen Säuger oder ein Gewebe oder eine Zelle, die von diesen abgeleitet sind.
Im vorliegenden Zusammenhang soll der Ausdruck "von einer Nichtsäugerquelle stammend" so verstanden werden, dass er anzeigt, dass eine spezielle Einheit oder Gruppe von Einheiten von Bakterien, Hefen, Vögeln, Amphibien, Reptilien, Insekten, Pflanzen, Pilzen, Schimmelpilzen und Algen oder anderen Nichtsäugern stammt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Quellorganismus ein beliebiger Organismus, der die genetisch bedingte Fähigkeit zur Synthese von Epoxyfettsäuren besitzt. Noch besser ist der Quellorganismus eine Pflanze, beispielsweise unter anderem, ohne hierauf beschränkt zu sein, Chrysanthemum spp., Crepis spp., Euphorbia spp. und Vernonia spp..
Noch besser ist der Quellorganismus aus der Liste von Crepis biennis, Crepis aurea, Crepis conyzaefolia, Crepis intermedia, Crepis occidentalis, Crepis palaestina, Crepis vesicaria, Crepis xacintha, Euphorbia lagascae und Vernonia galamensis ausgewählt. Weitere Arten sind nicht ausgeschlossen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Quellorganismus unter anderem eine Crepis sp., die hohe Konzentrationsmengen Vernolsäure enthält, wie Crepis palaestina, oder alternativ Vernonia galamensis oder Euphorbia lagascae.
Wenn das isolierte Nucleinsäuremolekül der Erfindung für ein ρ6-Epoxygenase- oder ρ9-Epoxygenaseenzym oder ρ12-Epoxygenase- oder ρ15-Epoxygenaseenzym codiert oder mindestens für ein Enzym codiert, das nicht an der direkten Epoxidation von Arachidonsäure beteiligt ist, kann das vorliegende Nucleinsäuremolekül aus einer beliebigen, das Enzym produzierenden Quelle stammen, wobei diese, ohne hierauf beschränkt zu sein, Hefen, Schimmelpilze, Bakterien, Insekten, Vögel, Säuger und Pflanzen umfasst.
Das Nucleinsäuremolekül der Erfindung gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen kann DNA, beispielsweise ein Gen, ein cDNA-Molekül, RNA-Molekül oder ein synthetisches Oligonucleotidmolekül, entweder ein einzelsträngiges oder doppelsträngiges und ungeachtet von Sekundärstruktureigenschaften, falls nicht speziell angegeben, sein.
Ein Verweis hierin auf ein "Gen" soll in dessen breitestem Zusammenhang genommen werden und er umfasst:

(i) ein klassisches genomisches Gen, das aus für die Transkription und/oder Translation regulatorischen Sequenzen und/oder einer codierenden Region und/oder nichttranslatierten Sequenzen (d.h. Introns, 5'- und 3'-nichttranslatierten Sequenzen) besteht; oder
(ii) mRNA oder cDNA, die den codierenden Regionen (d.h. Exons) und 5'- und 3'-nichttranslatierten Sequenzen des Gens entspricht.

Der Ausdruck "Gen" wird auch zur Beschreibung von synthe tischen oder Fusionsmolekülen, die das gesamte funktionale Produkt oder einen Teil eines funktionalen Produkts codieren, verwendet. Bevorzugte Epoxygenasegene der vorliegenden Erfindung können von einem natürlich vorkommenden Epoxygenasegen durch gentechnische Standardverfahren abgeleitet werden. Allgemein kann ein Epoxygenasegen einer Mutagenese zur Bildung von Einzel- oder Mehrfachnucleotidsubstitutionen, -deletionen und/oder -additionen unterzogen werden.
Nucleotidinsertionsderivate umfassen 5'- und 3'-terminale Fusionen sowie Intrasequenzinsertionen von einzelnen oder mehreren Nucleotiden. Insertionsnucleotidsequenzvarianten sind diejenigen, in die ein oder mehrere Nucleotide in eine vorgegebene Stelle in der Nucleotidsequenz eingeführt sind, obwohl eine willkürliche Insertion mit einem geeigneten Screening des gebildeten Produkts auch möglich ist.
Deletionsvarianten sind durch die Entfernung von einem oder mehreren Nucleotiden aus der Sequenz gekennzeichnet.
Substitutionsnucleotidvarianten sind diejenigen, in denen mindestens ein Nucleotid in der Sequenz entfernt wurde und ein unterschiedliches Nucleotid an dessen Stelle insertiert ist. Eine derartige Substitution kann "stumm" insofern sein, als die Substitution die durch den Codon festgelegte Aminosäure nicht ändert. Alternativ werden Substitutionen so gestaltet, dass eine Aminosäure durch eine andere, ähnlich wirkende Aminosäure oder eine Aminosäure ähnlicher Ladung, Polarität oder Hydrophobie ausgetauscht wird.
Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung soll der Ausdruck "Fettsäureepoxygenase" so verstanden werden, dass er ein beliebiges Enzym oder ein funktional äquivalentes oder enzymatisch aktives Derivat desselben, das die Biosynthese einer epoxygenierten Fettsäure durch Umwandlung einer Koh lenstoffbindung einer Fettsäure in eine Epoxygruppe und vorzugsweise durch Umwandlung einer Kohlenstoffdoppelbindung einer ungesättigten Fettsäure in eine Epoxygruppe katalysiert, bezeichnet. Obwohl dies die Erfindung nicht beschränken soll, kann eine Fettsäureepoxygenase die Biosynthese einer Epoxyfettsäure, die aus der Liste ausgewählt ist, die unter anderem 12,13-Epoxy-9-octadecensäure (Vernolsäure), 12,13-Epoxy-9,15-octadecadiensäure, 15,16-Epoxy-9,12-octadecadiensäure, 9,10-Epoxy-12-octadecensäure und 9,10-Epoxy-octadecansäure umfasst, katalysieren.
Der Ausdruck "Epoxy", "Epoxygruppe" und "Epoxyrest" bezeichnet, was dem Fachmann bekannt ist, einen dreigliedrigen Ring, der zwei Kohlenstoffatome und ein Sauerstoffatom durch Einfachbindungen wie im folgenden angegeben verknüpft, umfasst:
Entsprechend bezeichnet der Ausdruck "Epoxid" Verbindungen, die mindestens eine Epoxygruppe, wie im vorhergehenden definiert, umfassen.
Dem Fachmann ist klar, dass die Fettsäurenomenklatur auf der Länge der Kohlenstoffkette und der Position ungesättigter Kohlenstoffatome in der Kohlenstoffkette basiert. Daher werden Fettsäuren unter Verwendung der Kurzbezeichnung: Kohlenstoffinsgesamt:Doppelbindunginsgesamt Doppelbindungs(ρ)position bezeichnet, wobei die Doppelbindungen, falls nicht anders angegeben, cis sind. Beispielsweise ist Palmitinsäure (n- Hexadecansäure) eine gesättigte 16-Kohlenstoff-Fettsäure (d.h. 16:0), Ölsäure (Octadecensäure) eine ungesättigte 18-Kohlenstoff-Fettsäure mit einer Doppelbindung zwischen C-9 und C-10 (d.h. 18:1^ρ9) und Linolsäure (Octadecadiensäure) eine ungesättigte 18-Kohlenstoff-Fettsäure mit zwei Doppelbindungen zwischen C-9 und C-10 und zwischen C-12 und C-13 (d.h. 18:2^ρ9,12).
Jedoch kann im vorliegenden Zusammenhang ein Epoxygenaseenzym die Umwandlung einer beliebigen Kohlenstoffbindung in eine Epoxygruppe oder alternativ die Umwandlung einer beliebigen Doppelbindung in einem ungesättigten Fettsäuresubstrat in eine Epoxygruppe katalysieren. Im Hinblick darauf ist es dem Fachmann geläufig, dass die meisten einfach ungesättigten Fettsäuren höherer Organismen ungesättigte 18-Kohlenstoff-Fettsäuren (d.h. 18:1^ρ9) sind, während die meisten mehrfach ungesättigten Fettsäuren, die von höheren Organismen stammen, 18-Kohlenstoff-Fettsäuren sind, wobei mindestens eine der Doppelbindungen in diesen zwischen C-9 und C-10 positioniert ist. Ferner besitzen Bakterien ebenfalls einfach ungesättigte C16-Fettsäuren. Darüber hinaus kann die Epoxygenase der vorliegenden Erfindung auf mehr als ein einziges Fettsäuresubstratmolekül wirken und infolgedessen ist die vorliegende Erfindung nicht durch die Natur des Substratmoleküls, auf das das vorliegende Epoxygenaseenzym wirkt, beschränkt.
Vorzugsweise ist das Substratmolekül für die Epoxygenase der vorliegenden Erfindung eine ungesättigte Fettsäure, die mindestens eine Doppelbindung enthält.
Ferner können Epoxygenaseenzyme auf eine beliebige Zahl von Kohlenstoffatomen in einem beliebigen Substratmolekül wirken. Beispielsweise können sie unter anderem als ρ6-Epoxy genase-, ρ9-Epoxygenase-, ρ12-Epoxygenase- oder ρ15-Epoxygenaseenzyme gekennzeichnet werden. Entsprechend ist die vorliegende Erfindung nicht durch die Position des Kohlenstoffatoms in dem Substrat, auf das ein Epoxygenaseenzym wirken kann, beschränkt.
Der hier verwendete Ausdruck "ρ6-Epoxygenase" soll ein Epoxygenaseenzym bezeichnen, das die Umwandlung der ρ6-Kohlenstoffbindung eines Fettsäuresubstrats in eine ρ6-Epoxygruppe katalysiert und vorzugsweise die Umwandlung der ρ6-Doppelbindung von mindestens einer ungesättigten Fettsäure in eine ρ6-Epoxygruppe katalysiert.
Der hier verwendete Ausdruck "ρ9-Epoxygenase" soll ein Epoxygenaseenzym bezeichnen, das die Umwandlung der ρ9-Kohlenstoffbindung eines Fettsäuresubstrats in eine ρ9-Epoxygruppe katalysiert und vorzugsweise die Umwandlung der ρ9-Doppelbindung von mindestens einer ungesättigten Fettsäure in eine ρ9-Epoxygruppe katalysiert.
Der hier verwendete Ausdruck "ρ12-Epoxygenase" soll ein Epoxygenaseenzym bezeichnen, das die Umwandlung der ρ12-Kohlenstoffbindung eines Fettsäuresubstrats in eine ρ12-Epoxygruppe katalysiert und vorzugsweise die Umwandlung der ρ12-Doppelbindung von mindestens einer ungesättigten Fettsäure in eine ρ12-Epoxygruppe katalysiert.
Der hier verwendete Ausdruck "ρ15-Epoxygenase" soll ein Epoxygenaseenzym bezeichnen, das die Umwandlung der ρ15-Kohlenstoffbindung eines Fettsäuresubstrats in eine ρ15-Epoxygruppe katalysiert und vorzugsweise die Umwandlung der ρ15-Doppelbindung von mindestens einer ungesättigten Fett säure in eine ρ15-Epoxygruppe katalysiert.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich klar auf Gensequenzen, die für alle der oben aufgelisteten Epoxygenaseenzyme unter anderen codieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung codiert das isolierte Nucleinsäuremolekül für ein Fettsäureepoxygenaseenzym, das mindestens eine Kohlenstoffbindung in Palmitoleinsäure (16:1^ρ9), Ölsäure (18:1^ρ9), Linolsäure (18:2^ρ9,12), Linolensäure (18:3^ρ9,12,15) oder Arachidonsäure (20:4^ρ5,8,11,14) in eine Epoxyverbindung umwandelt. Vorzugsweise ist die Kohlenstoffbindung eine Kohlenstoffdoppelbindung.
Noch besser codiert das isolierte Nucleinsäuremolekül der Erfindung für ein Fettsäureepoxygenaseenzym, das mindestens eine oder beide Doppelbindungen in Linolsäure in eine Epoxygruppe umwandelt. Gemäß dieser Ausführungsform kann eine Epoxygenase, die sowohl die ρ9- als auch die ρ12-Doppelbindung von Linolsäure in eine Epoxygruppe umwandelt, diese Umwandlungen unabhängig voneinander derart, dass die Epoxygenase ein ρ9-Epoxygenase- und/oder ρ12-Epoxygenaseenzym, das hierin zuvor definiert wurde, ist, katalysieren.
In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform ist die Fettsäureepoxygenase der vorliegenden Erfindung eine ρ12-Epoxygenase, ρ15-Epoxygenase oder ρ9-Epoxygenase, die hierin zuvor definiert ist.
Noch besser ist die Fettsäureepoxygenase der Erfindung eine ρ12-Epoxygenase, die hierin zuvor definiert ist.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfin dung erfolgt die Bereitstellung eines isolierten Nucleinsäuremoleküls, das für Linoleat-ρ12-Epoxygenase codiert, ein Enzym, das mindestens die ρ12-Doppelbindung von Linolsäure in eine ρ12-Epoxygruppe umwandelt, wodurch 12,13-Epoxy-9-octadecensäure (Vernolsäure) produziert wird.
Ohne die vorliegende Erfindung einzuschränken, ist die bevorzugte Quelle für die ρ12-Epoxygenase der Erfindung eine Pflanze, insbesondere Crepis palaestina oder eine weitere Crepis sp., die von C. palaestina verschieden ist, jedoch hohe Konzentrationsmengen an Vernolsäure enthält, Vernonia galamensis oder Euphorbia lagascae.
Gemäß dieser Ausführungsform kann eine ρ12-Epoxygenase die Umwandlung von Palmitoleinsäure in 9,10-Epoxy-palmitinsäure und/oder die Umwandlung von Ölsäure in 9,10-Epoxy-stearinsäure und/oder die Umwandlung von Linolsäure in eine oder mehrere Verbindungen von 9,10-Epoxy-12-octadecensäure oder 12,13-Epoxy-9-octadecensäure oder 9,10,12,13-Diepoxy-stearinsäure und/oder die Umwandlung von Linolensäure in eine oder mehrere Verbindungen von 9,10-Epoxy-12,15-octadecadiensäure oder 12,13-Epoxy-9,15-octadecadiensäure oder 15,16-Epoxy-octadecadiensäure oder 9,10,12,13-Diepoxy-15-octadecensäure oder 9,10,15,16-Diepoxy-12-octadecensäure oder 12,13,15,16-Diepoxy-9-octadecensäure oder 9,10,12,13,15,16-Triepoxystearinsäure und/oder die Umwandlung von Arachidonsäure in eine oder mehrere Verbindungen von 5,6-Epoxy-8,11,14-tetracosatriensäure oder 8,9-Epoxy-5,11,14-tetracosatriensäure oder 11,12-Epoxy-5,8,14-tetracosatriensäure oder 14,15-Epoxy-5,8,11-tetracosatriensäure oder 5,6,8,9-Diepoxy-11,14-tetracosadiensäure oder 5,6,11,12-Diepoxy-8,14-tetracosadiensäure oder 5,6,14,15-Diepoxy-8,11-tetracosadiensäure oder 8,9,11,12-Diepoxy-5,14-tetracosadiensäure oder 8,9,14,15-Diepoxy-5,11-tetra cosadiensäure oder 11,12,14,15-Diepoxy-5,8-tetracosadiensäure oder 5,6,8,9,11,12-Triepoxy-14-tetracosensäure oder 5,6,8,9,14,15-Triepoxy-11-tetracosensäure oder 5,6,11,12,14,15-Triepoxy-8-tetracosensäure oder 8,9,11,12,14,15-Triepoxy-5-tetracosensäure unter anderem katalysieren.
Dem Fachmann ist klar, dass nicht alle oben aufgelisteten Substrate von einer natürlichen Quelle ableitbar sein können, doch ungeachtet dessen durch chemische synthetische Mittel produziert werden können. Die Umwandlung von sowohl natürlich vorkommenden als auch chemisch synthetisierten ungesättigten Fettsäuren in Epoxyfettsäuren liegt im Umfang der vorliegenden Erfindung und die einzige Anforderung besteht darin, dass das Nucleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung, das hierin beschrieben ist, für ein Enzym oder einen funktionalen Teil desselben codiert, das bzw. der zur Katalyse der Umwandlung fähig ist.
Gemäß der vorhergehenden Diskussion ist dem Fachmann klar, dass eine Fettsäureepoxygenase ein Cytochrom-P450-abhängiges Monooxygenaseenzym oder ein Monooxygenaseenzym gemischter Funktion oder alternativ ein peroxidabhängiges Peroxygenaseenzym oder ähnliches Enzym unter anderen sein kann. Jedoch ist die vorliegende Erfindung insbesondere auf die Epoxygenaseenzyme, die Monooxygenaseenzyme gemischter Funktion sind, und auf Nucleinsäuremoleküle mit Codierung für diese und Verwendungszwecke hierfür gerichtet. Entsprechend ist es besonders bevorzugt, wenn das Nucleinsäuremolekül der Erfindung für eine Fettsäureepoxygenase codiert, die ein Monooxygenaseenzym gemischter Funktion ist.
Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung soll der Ausdruck "Monooxygenaseenzym gemischter Funktion" so verstanden werden, dass er jedes Enzym bezeichnet, das die Epoxy genierung einer Kohlenstoffbindung oder Kohlenstoffdoppelbindung in ein Fettsäuremolekül katalysiert, wobei das Enzym ferner eine Aminosäuresequenz umfasst, die die im folgenden angegebenen drei histidinreichen Regionen enthält:

(i) His-(Xaa)_3-4-His,
(ii) His-(Xaa)_2-3-His-His und
(iii) His-(Xaa)_2-3-His-His,

_3-4

_2-3

Der Ausdruck "ähnlich einem Monooxygenaseenzym gemischter Funktion" soll jedes Enzym, das drei der oben aufgelisteten histidinreichen Regionen umfasst, bezeichnen.
In den hierin beschriebenen Beispielen der Erfindung zeigten die Erfinder auf, dass die hierin bereitgestellte Aminosäuresequenz von Crepis palaestina ein ρ12-Epoxygenaseenzym umfasst, das die charakteristischen Aminosäuresequenzmotive eines Monoosygenaseenzyms gemischter Funktion, das hierin im vorhergehenden definiert ist, umfasst. Die enge Aminosäuresequenzidentität zwischen dem ρ12-Epoxygenaseenzym von C. palaestina (SEQ ID NO: 2) und den Aminosäuresequenzen von Polypeptiden, die von einer nichtidentifizierten Crepis sp. und Vernonia galamensis stammen, die hierin bereitgestellt sind (SEQ ID NO: 4 und 6), im Vergleich zu den Aminosäuresequenzen anderer Monooxygenasen gemischter Funktion, wie Desaturasen und Hydroxylasen, legt nahe, dass die Aminosäuresequenzen von Crepis sp. und V. galamensis auch Fettsäureepoxygenaseenzyme sind und ρ12- Epoxygenaseenzyme sein können. Im Hinblick darauf ist die Aminosäuresequenz von Vernonia galamensis, die hierin als Beispiel angegeben ist, eine partielle Sequenz, die nur ein vollständiges histidinreiches Motiv (d.h. His-Arg-Asn-His-His) und eine partielle Sequenz des ersten histidinreichen Motivs (d.h. sie umfasst die letzten zwei Histidinreste des His-Glu-Cys-Gly-His-His-Motivs) umfasst, da die entsprechende Nucleotidsequenz mit Codierung hierfür durch eine Polymerasekettenreaktion als partielle cDNA-Sequenz unter Verwendung eines ersten Primers für dieses erste histidinreiche Motiv und eines zweiten Amplifikationsprimers, der für eine Region strangaufwärts des dritten histidinreichen Motivs (d.h. His-Val-Met-His-His) gestaltet wurde, amplifiziert wurde. Zusätzlich zeigt die Tatsache, dass die Sequenz von V. galamensis unter Verwendung eines für das erste histidinreiche Motiv spezifischen Primers amplifiziert wurde, dass die entsprechende Sequenz voller Länge auch dieses Motiv umfasst.
Entsprechend codiert in einer besonders bevorzugten Ausführungsform das Nucleinsäuremolekül der Erfindung für ein Epoxygenaseenzym einer Monooxygenase gemischter Funktion oder ein ähnliches Enzym, das von Crepis spp., das Crepis palaestina umfasst, stammt oder alternativ von Vernonia galamensis stammt. Gemäß dieser Ausführungsform ist es noch günstiger, wenn die vorliegende Epoxygenase mindestens eine Aminosäuresequenz umfasst, die drei oder mehr der im folgenden angegebenen histidinreichen Regionen enthält:

(i) His-Glu-Cys-Gly-His-His (SEQ ID NO: 15),
(ii) His-Arg-Asn-His-His (SEQ ID NO: 16) und
(iii) His-Val-Met-His-His (SEQ ID NO: 17)

Die vorliegende Erfindung erstreckt sich klar auf Epoxygenasegene, die von anderen Arten abgeleitet sind, die unter anderen die Epoxygenasegene umfassen, die von Chrysanthemum spp. und Euphorbia lagascae stammen.
In einer bevorzugten Ausführungsform, die die vorliegende Erfindung nicht beschränken soll, codieren die Epoxygenasegene anderer Arten, die durch die vorliegende Erfindung umfasst werden, für Monooxygenaseenzyme gemischter Funktion. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich ferner auf die isolierten oder rekombinanten Polypeptide, die durch derartige Gene codiert werden, und die Verwendungsmöglichkeiten der Gene und Polypeptide.
Die gemäß dieser Ausführungsform beschriebene Erfindung umfasst keine Nucleinsäuremoleküle, die andere Enzymaktivitäten als Epoxygenaseaktivitäten, die hierin definiert sind, codieren, insbesondere die ρ12-Desaturaseenzyme, die von Arabidopsis thaliana, Brassica juncea, Brassica napus oder Glycine max stammen, unter anderen, von denen bekannt ist, dass sie ähnliche histidinreiche Motive enthalten.
Im vorliegenden Zusammenhang bezeichnen "Homologa" einer Aminosäuresequenz die Aminosäuresequenzen oder Peptidsequenzen, die von Polypeptiden, Enzymen oder Proteinen der vorliegenden Erfindung abgeleitet sind, oder alternativ entsprechen sie im wesentlichen den oben aufgelisteten Aminosäuresequenzen ungeachtet etwaiger natürlich vorkommender Aminosäuresubstitutionen, -additionen oder -deletionen derselben.
Beispielsweise können Aminosäuren durch andere Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften, beispielsweise Hydrophobie, Hydrophilie, hydrophobem Moment, Antigenizität, Neigung zur Bildung oder zum Aufbrechen von α-Helixstrukturen oder β-Faltblattstrukturen und dergleichen, ausgetauscht werden. Alternativ oder zusätzlich können die Aminosäuren einer homologen Aminosäuresequenz durch andere Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften, beispielsweise Hydrophobie, Hydrophilie, hydrophobem Moment, Ladung oder Antigenizität und dergleichen, ausgetauscht werden.
Natürlich vorkommende Aminosäurereste, die hierin betrachtet werden, sind in Tabelle 1 beschrieben.
Ein Homologon einer Aminosäuresequenz kann ein synthetisches Peptid, das durch ein beliebiges, dem Fachmann bekanntes Verfahren, beispielsweise unter Verwendung von Fmoc-Chemie, produziert wurde, sein.
Alternativ kann ein Homologon einer Aminosäuresequenz von einer natürlichen Quelle, beispielsweise der gleichen oder einer anderen Art wie die Polypeptide, Enzyme oder Proteine der vorliegenden Erfindung stammen. Bevorzugte Quellen für Homologa der im vorhergehenden aufgelisteten Aminosäuresequenzen umfassen jede der hierin betrachteten Quellen.
"Analoga" einer Aminosäuresequenz umfassen die Aminosäuresequenzen, die mit den im vorhergehenden aufgelisteten Aminosäuresequenzen im wesentlichen identisch sind, ungeachtet des Auftretens von etwaigen nicht natürlich vorkommenden Aminosäureanaloga in diesen.
Bevorzugte nicht natürlich vorkommende Aminosäuren, die hierin betrachtet werden, sind im folgenden in Tabelle 2 aufgelistet.
Der Ausdruck "Derivat" in Bezug auf eine Aminosäure soll hierin im folgenden so verstanden werden, dass er Mutanten, Teile, Fragmente oder Polypeptidfusionen der im vorhergehenden aufgelisteten Aminosäuresequenzen bezeichnet. Derivate umfassen modifizierte Aminosäuresequenzen oder Peptide, wobei Liganden an einen oder mehrere der darin enthaltenen Aminosäurereste, beispielsweise Kohlehydrate, Enzyme, Proteine, Polypeptide oder Reportermoleküle, wie Radionuclide oder fluoreszierende Verbindungen, gebunden sind. Glycosylierte, fluoreszierende, acylierte oder alkylierte Formen der vorliegenden Peptide werden durch die vorliegende Erfindung ebenfalls betrachtet. Ferner können Derivate Fragmente oder Teile einer hierin offenbarten Aminosäuresequenz umfassen und sie liegen im Umfang der Erfindung, wie auch Homopolymere oder Heteropolymere, die zwei oder mehrere Kopien der vorliegenden Sequenzen umfassen.
Verfahren zur Derivatisierung von Peptiden sind einschlägig bekannt.
Substitutionen umfassen Aminosäureänderungen, wobei eine Aminosäure durch einen anderen natürlich vorkommenden oder unüblichen Aminosäurerest ersetzt ist. Derartige Substitutionen können als "konservativ" klassifiziert werden, wobei in diesem Fall ein Aminosäurerest durch eine andere natürlich vorkommende Aminosäure eines ähnlichen Charakters ersetzt ist, beispielsweise Gly1Ala, Val1Ile1Leu, Asp1Glu, Lys1Arg, Asn1Gln oder Phe1Trp1Tyr.
Durch die vorliegende Erfindung umfasste Substitutionen können auch "nichtkonservativ" sein, wobei ein Aminosäurerest, der in einem Repressorpolypeptid vorhanden ist, durch eine Aminosäure mit unterschiedlichen Eigenschaften, beispielsweise eine natürlich vorkommende Aminosäure von einer unterschiedlichen Gruppe, ersetzt ist (beispielsweise Substitution einer geladenen oder hydrophoben Aminosäure durch Alanin) oder wobei alternativ eine natürlich vorkommende Aminosäure durch eine unübliche Aminosäure ersetzt ist.
Aminosäuresubstitutionen sind typischerweise solche einzelner Reste, können jedoch solche von mehreren Resten, entweder geclustert oder verteilt, sein.
Aminosäuredeletionen sind üblicherweise von der Größenordnung von etwa 1–10 Aminosäureresten, während Insertionen von einer beliebigen Länge sein können. Deletionen und Insertionen können am N-Terminus, C-Terminus erfolgen oder innere Deletionen oder Insertionen sein. Allgemein sind Insertionen in der Aminosäuresequenz kleiner als amino- oder carboxylterminale Fusionen und von der Größenordnung von 1–4 Aminosäureresten.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich klar auf das vorliegende isolierte Nucleinsäuremolekül, wenn es in das Genom einer Zelle zusätzlich zu dem endogenen zellulären Komplement von Epoxygenasegenen integriert ist. Alternativ erstreckt sich die vorliegende Erfindung, wenn die Wirtszelle nicht normalerweise für Enzyme codiert, die zur Epoxyfettsäurebiosynthese erforderlich sind, auf das vorliegende isolierte Nucleinsäuremolekül, wenn es in das Genom der Zelle zusätzlich zum endogenen zellulären Genom integriert ist. TABELLE 1
TABELLE 2
Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, das die Nucleotidsequenz, die in einer der Sequenzen SEQ ID NO: 1 oder 3 oder 5 oder 19 oder 20 angegeben ist, oder eine hierzu komplementäre Sequenz oder ein Homologon, Analogon oder Derivat derselben umfasst.
Für Nomenklaturzwecke ist die in SEQ ID NO: 1 angegebene Nucleotidsequenz von Crepis palaestina abgeleitet und sie codiert für die Monooxygenasesequenz gemischter Funktion oder die einer Monooxygenase gemischter Funktion ähnliche Sequenz, die in SEQ ID NO: 2 angegeben ist. Wie hierin als Beispiel angegeben ist, weist die in SEQ ID NO: 2 angegebene Aminosäuresequenz Epoxygenaseaktivität, insbesondere ρ12-Epoxygenaseaktivität auf.
Die in SEQ ID NO: 3 angegebene Nucleotidsequenz entspricht einer cDNA, die von einer anderen Crepis sp. als C. palaestina stammt, die hohe Konzentrationsmengen Vernolsäure enthält. Die in SEQ ID NO: 4 angegebene Aminosäuresequenz entspricht der abgeleiteten Aminosäuresequenz des in SEQ ID NO: 3 bereitgestellten Epoxygenasegens von Crepis sp..
Die in SEQ ID NO: 5 angegebene Nucleotidsequenz entspricht amplifizierter DNA, die von Vernonia galamensis unter Verwendung von Amplifikationsprimern, die von einer Konsensussequenz von Monooxygenasen gemischter Funktion, die die Epoxygenasegensequenzen von Crepis spp. gemäß der Erfindung umfassen, abgeleitet sind, abgeleitet wurde. Die amplifizierte DNA umfasst eine partielle Epoxygenasegensequenz, die Nucleotidsequenzen mit der Fähigkeit zur Codierung des histidinreichen Motivs His-Arg-Asn-His-His, das für Monooxygenaseenzyme gemischter Funktion charakteristisch ist, umfasst. Die in SEQ ID NO: 6 angegebene Aminosäuresequenz entspricht der abgeleiteten Aminosäuresequenz des in SEQ ID NO: 5 bereitgestellten Epoxygenasegens von Vernonia galamensis.
Die in SEQ ID NO: 7 angegebene Nucleotidsequenz betrifft die partielle Sequenz eines Acetylenasegens von Crepis alpina, das als Sonde zur Isolierung des Nucleinsäuremoleküls, das die in SEQ ID NO: 1 angegebene Nucleotidsequenz umfasst, verwendet wurde. Die in SEQ ID NO: 8 angegebene Aminosäuresequenz entspricht der abgeleiteten Aminosäuresequenz der partiellen Sequenz des Acetylenasegens von C. alpina.
Der hier verwendete Ausdruck "Acetylenase" soll ein Enzym bezeichnen, das zur Katalyse der Umwandlung einer Kohlenstoffdoppelbindung in einem Fettsäuresubstratmolekül in eine Kohlenstoffdreifachbindung fähig ist oder alternativ zur Katalyse der Bildung einer Kohlenstoffdreifachbindung in einem Fettsäuremolekül fähig ist.
Die in SEQ ID NO: 18 angegebene Nucleotidsequenz entspricht einem entarteten Amplifikationsprimer, der zur Amplifikation vermuteter Epoxygenasegensequenzen von Euphorbia lagascae verwendet wurde. Im Hinblick darauf sind die in SEQ ID NO: 18 angegebenen Nucleotidreste die durch die IUPACIUB Biochemical Nomenclature Commission empfohlenen, wobei A für Adenin steht, C für Cytosin steht, G für Guanin steht, T für Thymin steht, Y für einen Pyrimidinrest steht, R für einen Purinrest steht, M für Adenin oder Cytosin steht, K für Guanin oder Thymin steht, S für Guanin oder Cytosin steht, W für Adenin oder Thymin steht, H für ein anderes Nucleotid als Guanin steht, W für ein anderes Nucleotid als Adenin steht, V für ein anderes Nucleotid als Thymin steht, D für ein anderes Nucleotid als Cytosin steht und N für einen beliebigen Nucleotidrest steht.
Die in SEQ ID NO: 19 angegebene Nucleotidsequenz stammt von Euphorbia lagascae und sie codiert für die vermutliche Cytochrom-P-450-abhängige Monooxygenasesequenz oder eine einer Cytochrom-P-450-abhängigen Monooxygenase ähnliche Sequenz.
Die in SEQ ID NO: 20 angegebene Nucleotidsequenz stammt von Euphorbia lagascae und sie codiert für die vermutliche Cytochrom-P-450-abhängige Monooxygenasesequenz oder eine einer Cytochrom-P-450-abhängigen Monooxygenase ähnliche Sequenz.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich klar auf die Genomgenäquivalente der cDNA-Moleküle, die als Beispiele in einer der Sequenzen SEQ ID NO: 1, 3, 5, 19 oder 20 angegeben sind.
In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes Nucleinsäuremole kül, das die in einer der Sequenzen SEQ ID NO: 1, 3, 5, 19 oder 20 angegebene Nucleotidsequenz oder ein Genomgenäquivalent der Nucleotidsequenz oder ein Homologon, Analogon oder Derivat derselben umfasst, bereit.
Für den vorliegenden Zweck sollen "Homologa" einer Nucleotidsequenz so verstanden werden, dass sie ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bezeichnen, das im wesentlichen gleich dem Nucleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung ist oder eine hierzu komplementäre Nucleotidsequenz ist, ungeachtet des Auftretens von einer oder mehreren Nucleotidsubstitutionen, -insertionen, -deletionen oder Umlagerungen in der Sequenz.
"Analoga" einer hierin angegebenen Nucleotidsequenz sollen so verstanden werden, dass sie ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bezeichnen, das im wesentlichen gleich einem Nucleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung ist oder eine hierzu komplementäre Nucleotidsequenz ist, ungeachtet des Auftretens beliebiger Nichtnucleotidbestandteile, die normalerweise in dem isolierten Nucleinsäuremolekül vorhanden sind, beispielsweise Kohlehydrate, radiochemische Stoffe, die Radionucleotide umfassen, Reportermoleküle, beispielsweise, ohne hierauf beschränkt zu sein, DIG, alkalische Phosphatase oder Meerrettichperoxidase unter anderen.
"Derivate" einer Nucleotidsequenz, die hierin angegeben sind, sollen so verstanden werden, dass sie ein beliebiges isoliertes Nucleinsäuremolekül bezeichnen, das signifikante Sequenzähnlichkeit mit der Sequenz oder einem Teil derselben enthält.
Allgemein werden Homologa, Analoga oder Derivate des Nucleinsäuremoleküls der Erfindung durch synthetische Mittel erzeugt oder alternativ von natürlich vorkommenden Quellen abgeleitet. Beispielsweise kann die Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung einer Mutagenese unter Bildung von Einzel- oder Mehrfachnucleotidsubstitutionen, -deletionen und/oder -insertionen, wie im vorhergehenden angegeben, unterzogen werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung codieren bevorzugte Homologa, Analoga oder Derivate der Nucleotidsequenzen, die in einer der Sequenzen SEQ ID NO: 1, 3, 5, 19 oder 20 angegeben sind, oder hierfür komplementäre Sequenzen für immunologisch aktive oder enzymatisch aktive Polypeptide.
Der hier verwendete Ausdruck "immunologisch aktiv" soll so verstanden werden, dass er die Fähigkeit eines Polypeptidmoleküls zum Auslösen einer Immunantwort in einem Säuger, insbesondere einer Immunantwort, die zur Bildung eines Antikörpermoleküls, beispielsweise, ohne hierauf beschränkt zu sein, eines IgM- oder IgG-Moleküls, oder eines Vollserums, das das Antikörpermolekül enthält, ausreichend ist, bezeichnet. Der Ausdruck "immunologisch aktiv" erstreckt sich auch auf die Fähigkeit eines Polypeptids zum Auslösen einer ausreichenden Immunantwort zur Bildung monoklonaler Antikörper, synthetischer Fab-Fragmente eines Antikörpermoleküls, eines Einzelkettenantikörpermoleküls oder sonstigen immuninteraktiven Moleküls.
Der hier verwendete Ausdruck "enzymatisch aktiv" soll so verstanden werden, dass er die Fähigkeit eines Polypeptidmoleküls zur Katalyse einer Enzymreaktion, insbesondere einer Enzymreaktion, die die Epoxygenierung einer Kohlenstoffbindung in einem Fettsäuresubstratmolekül umfasst, bezeichnet. Insbesondere kann der Ausdruck "enzymatisch aktiv", ohne die Erfindung zu beschränken, auch die Fähigkeit eines Polypeptidmoleküls zur Katalyse der Epoxygenierung von ρ-9 oder ρ-12 in einem Fettsäuresubstratmolekül, wie Linolsäure oder Vernolsäure, bezeichnen.
In einer alternativen Ausführungsform umfasst ein bevorzugtes Homologon, Analogon oder Derivat der Nucleotidsequenz, die in einer der Sequenzen SEQ ID NO: 1 oder 3 oder 5 angegeben ist, oder eine hierzu komplementäre Sequenz eine Nucleotidsequenz, die zu mindestens 65 % mit mindestens 20 fortlaufenden Nucleotiden darin identisch ist, außer einer Nucleotidsequenz, die für ein Acetylenaseenzym von Crepis sp. codiert.
Noch besser beträgt die prozentuale Identität mit einer der Sequenzen SEQ ID NO: 1 oder 3 oder 5 mindestens etwa 85 %. Noch besser ist ein Homologon, Analogon oder Derivat von SEQ ID NO: 1 oder 3 oder 5 zu mindestens etwa 90 % und noch besser zu mindestens etwa 95 % identisch mit mindestens 100 oder 250 oder 500 oder 1000 fortlaufenden Nucleotiden darin.
Die prozentuale Identität mit SEQ ID NO: 19 oder 20 oder hierzu komplementären Sequenzen beträgt mindestens etwa 75 % über mindestens etwa 200 fortlaufende Nucleotide, noch günstiger mindestens etwa 80 %, noch günstiger mindestens etwa 90 % und noch besser mindestens etwa 95 %, wobei mindestens etwa 99 % Identität umfasst werden. Nucleotidsequenzen, die mindestens 65 % über mindestens etwa 400 fortlaufende Nucleotide in SEQ ID NO: 19 oder 20 sind, liegen ebenfalls im Umfang der Erfindung.
Ein hierin angegebener Verweis auf prozentuale Identität oder prozentuale Ähnlichkeit zwischen zwei oder mehreren Nucleotid- oder Aminosäuresequenzen soll auf die Zahl identischer oder ähnlicher Reste in einem Nucleotid- oder Aminosäuresequenzalignment, das unter Verwendung eines dem Fachmann bekannten Standardalgorithmus bestimmt wurde, be zeichnen. Insbesondere können Nucleotid- und/oder Aminosäuresequenzidentitäten und -ähnlichkeiten unter Verwendung des Gap-Programms, das den Algorithmus von Needleman und Wunsch (1970) zur Maximierung der Zahl der Übereinstimmungen von Resten und Minimierung der Zahl der Sequenzlücken verwendet, berechnet werden. Das Gap-Programm ist Teil des Sequence and Analysis Software Package der Computer Genetics Group Inc., University Research Park, Madison, Wisconsin, USA (Devereux et al., 1984).
In einer weiteren alternativen Ausführungsform hybridisiert ein bevorzugtes Homologon, Analogon oder Derivat der Nucleotidsequenz, die in einer der Sequenzen SEQ ID NO: 1, 3, 5, 19 oder 20 angegeben ist, oder eine hierzu komplementäre Sequenz unter Bedingungen von mindestens niedriger Stringenz mit mindestens 20 fortlaufenden Nucleotiden, die von der Sequenz abgeleitet sind.
Noch günstiger ist die Stringenz der Hybridisierung eine mindestens mäßige Stringenz, noch besser eine mindestens hohe Stringenz.
Zum Zwecke der Festlegung des Stringenzgrades ist dem Fachmann klar, dass mehrere unterschiedliche Hybridisierungsbedingungen verwendet werden können. Beispielsweise kann eine niedrige Stringenz eine Hybridisierung und/oder eine Wäsche, die in 6 × SSC-Puffer, 0,1 % (Gew/V) SDS bei 28 °C durchgeführt wird, umfassen. Mäßige Stringenz kann eine Hybridisierung und/oder Wäsche, die in 2 × SSC-Puffer, 0,1 % (Gew/V) SDS bei einer Temperatur im Bereich von 45 °C bis 65 °C durchgeführt wird, umfassen. Hohe Stringenz kann eine Hybridisierung und/oder Wäsche, die in 0,1 × SSC-Puffer, 0,1 % (Gew/V) SDS bei einer Temperatur von mindestens 65 °C durchgeführt wird, umfassen.
Allgemein wird die Stringenz durch Verringerung der Konzentration von SSC-Puffer und/oder die Erhöhung der Konzentration von SDS im Hybridisierungspuffer oder Waschpuffer und/oder Erhöhung der Temperatur, bei der die Hybridisierung und/oder Wäsche durchgeführt werden, erhöht. Bedingungen für Hybridisierungen und Waschvorgänge sind dem Fachmann üblicher Erfahrung klar. Zum Zwecke der Klarstellung von Parametern, die die Hybridisierung zwischen Nucleinsäuremolekülen beeinflussen, kann allgemein auf die Seiten 2.10.8 bis 2.10.16 von Ausubel et al. (1987), das hierdurch als Bezug aufgenommen ist, verwiesen werden.
Die hierin offenbarten isolierten Nucleinsäuremoleküle können zur Isolierung oder Identifizierung von Homologa, Analoga oder Derivaten derselben aus anderen Zellen, Geweben oder Organtypen oder Zellen, Geweben oder Organen einer anderen Art unter Verwendung von einem einer Zahl von Mitteln, die dem Fachmann geläufig sind, verwendet werden.
Beispielsweise kann genomische DNA oder mRNA oder cDNA unter Bedingungen einer Hybridisierung von mindestens niedriger Stringenz oder äquivalenten Bedingungen mit einer zur Hybridisierung wirksamen Menge eines isolierten Nucleinsäuremoleküls, das die in einer der Sequenzen SEQ ID NO: 1, 3, 5, 19 oder 20 angegebene Nucleotidsequenz oder eine hierzu komplementäre Sequenz oder einen funktionellen Teil derselben umfasst, in Kontakt gebracht werden und eine Hybridisierung unter Verwendung eines Detektionsmittels detektiert werden.
Das Detektionsmittel kann ein Reportermolekül mit der Fähigkeit zur Bildung eines identifizierbaren Signals (beispielsweise ein Radioisotop, wie ³²P oder ³⁵S, oder ein biotinyliertes Molekül), das kovalent an das isolierte Nucleinsäuremolekül der Erfindung gebunden ist, sein.
In einem alternativen Verfahren ist das Detektionsmittel ein bekanntes Format der Polymerasekettenreaktion (PCR). Gemäß diesem Verfahren werden entartete Pools von Nucleinsäure-"Primermolekülen" einer Länge von etwa 15–50 Nucleotiden auf der Basis der in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 19 oder 20 offenbarten Nucleotidsequenzen oder einer hierzu komplementären Sequenz gestaltet. Die Homologa, Analoga oder Derivate (d.h. das "Templatmolekül") werden an zwei der Primermoleküle derart hybridisiert, dass ein erster Primer mit einer Region auf einem Strang des Templatmoleküls hybridisiert und ein zweiter Primer mit einer komplementären Sequenz desselben hybridisiert, wobei der erste und zweite Primer nicht in gleichen oder überlappenden Regionen des Templatmoleküls hybridisiert sind und wobei jeder Primer in 5'→3'-Orientierung, bezogen auf die Position, in der der andere Primer an dem entgegengesetzten Strang hybridisiert ist, positioniert ist. Spezifische Nucleinsäuremolekülkopien des Templatmoleküls werden enzymatisch in einer Polymerasekettenreaktion, einer Technik, die dem Fachmann geläufig ist, amplifiziert.
Die Primermoleküle können jeden natürlich vorkommenden Nucleotidrest (d.h. Adenin, Cytidin, Guanin, Thymidin) umfassen und/oder Inosin oder funktionale Analoga oder Derivate derselben, die in ein Polynucleotid eingearbeitet werden können, umfassen. Die Nucleinsäureprimermoleküle können auch in einem wässrigen Gemisch anderer Nucleinsäureprimermoleküle enthalten sein oder in einer im wesentlichen reinen Form sein.
Die detektierte Sequenz kann in einer rekombinanten Form, in einem Viruspartikel, Bakteriophagenpartikel, einer Hefezelle, Tierzelle oder Pflanzenzelle sein. Vorzugsweise stammen die verwandten Gensequenzen von einer anderen Pflanzenart.
Ein dritter Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, das die in einer der Sequenzen SEQ ID NO: 2 oder 4 oder 6 angegebene Aminosäuresequenz oder ein Homologon, Analogon oder Derivat derselben umfasst.
In einer hierin betrachteten Ausführungsform sind bevorzugte Homologa, Analoga oder Derivate der in SEQ ID NO: 2, 4 oder 6 angegebenen Aminosäuresequenzen immunologisch aktive oder enzymatisch aktive Polypeptide gemäß der obigen Definition.
In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung umfassen bevorzugte Homologa, Analoga oder Derivate der Aminosäuresequenz, die in einer Sequenz von SEQ ID NO: 2, 4 oder 6 angegeben sind, eine Aminosäuresequenz, die zu mindestens 60 % hiermit identisch ist, außer ein Acetylenasepolypeptid von Crepis sp.. Noch günstiger sind Homologa, Analoga oder Derivate von SEQ ID NO: 2 oder 4 oder 6, die von der vorliegenden Erfindung umfasst werden, zu mindestens etwa 85 % identisch, noch günstiger mindestens etwa 90 % identisch und noch besser mindestens etwa 95 % identisch und noch besser mindestens etwa 99 %–100 % hiermit identisch.
Homologa, Analoga oder Derivate von einer der Sequenzen SEQ ID NO: 2 oder 4 oder 6 können ferner eine histidinreiche Region gemäß der obige Definition umfassen. Noch günstiger umfasst die vorliegende Epoxygenase mindestens eine Aminosäuresequenz, die drei oder mehrere histidinreiche Regionen, die im folgenden angegeben sind, enthält:

Die gemäß dieser alternativen Ausführungsform beschriebene Erfindung umfasst nicht ρ12-Desaturaseenzyme, die unter anderen von Arabidopsis thaliana, Brassica juncea, Brassica napus oder Glycine max abgeleitet sind.
Das isolierte Nucleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung ist zur Entwicklung von Genkonstrukten verwendbar, die ein Sense-Molekül umfassen, wobei die Genkonstrukte für die Expression in einer Zelle, die das Nucleinsäuremolekül normalerweise nicht exprimiert, oder zur Überexpression des Nucleinsäuremoleküls in einer Zelle, die das Nucleinsäuremolekül normalerweise exprimiert, gestaltet sind.
Entsprechend stellt ein weiterer Aspekt der Erfindung ein Genkonstrukt bereit, das ein Sense-Molekül, das funktional mit einer Promotorsequenz verbunden ist, umfasst.
Der hier verwendete Ausdruck "Sense-Molekül" soll so verstanden werden, dass er ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bezeichnet, das eine Fettsäureepoxygenase codiert oder komplementär zu einem eine Fettsäureepoxygenase codierenden isolierten Nucleinsäuremolekül ist, wobei das Nucleinsäuremolekül in einem Format bereitgestellt wird, das zur Expression unter Bildung eines rekombinanten Polypeptids geeignet ist, wenn das Sense-Molekül in eine Wirtszelle durch Transfektion oder Transformation eingeführt wird.
Dem Fachmann ist klar, dass ein Genkonstrukt zur "Transfektion" einer Zelle verwendet werden kann, wobei es in diesem Fall in die Zelle ohne Integration in das Genom der Zelle eingeführt wird. Alternativ kann ein Genkonstrukt zur "Transformation" einer Zelle verwendet werden, wobei es in diesem Fall stabil in das Genom der Zelle integriert wird.
Ein Sense-Molekül, das einer Fettsäureepoxygenasegensequenz oder einem Homologon, Analogon oder Derivat derselben entspricht, kann in eine Zelle unter Verwendung eines bekannten Verfahrens zur Transfektion oder Transformation der Zelle eingeführt werden. Wenn eine Zelle durch das Genkonstrukt der Erfindung transformiert ist, kann ein ganzer Organismus aus einer einzigen transformierten Zelle unter Verwendung eines dem Fachmann bekannten Verfahrens regeneriert werden.
Daher können die hierin beschriebenen Epoxygenasegene zur Entwicklung einzelner Zellen oder ganzer Organismen verwendet werden, die Epoxyfettsäuren, die normalerweise von wilden oder natürlich vorkommenden Organismen, die zu den gleichen Gattungen oder Arten wie die Gattungen oder Arten, von denen die transfizierte oder transformierte Zelle abgeleitet ist, gehören, synthetisieren, oder zur Erhöhung der Konzentrationsmengen derartiger Fettsäuren über die normalerweise in derartigen wilden oder natürlich vorkommenden Organismen gefundenen Konzentrationsmengen verwendet werden.
In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform ist das isolierte Nucleinsäuremolekül der Erfindung zur Verringerung der Konzentrationsmenge von Epoxyfettsäuren in einer Zelle fähig, wenn es darin in Antisense-Orientierung oder als Ribozym oder Cosuppresionsmolekül unter der Kontrolle einer geeigneten Promotorsequenz exprimiert wird.
Eine Cosuppression ist die Verringerung der Expression eines endogenen Gens, die auftritt, wenn eine oder mehrere Kopien des Gens oder eine oder mehrere Kopien eines im we sentlichen ähnlichen Gens in die Zelle eingeführt werden. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auch auf die Verwendung einer Cosuppression zur Hemmung der Expression eines Epoxygenasegens, das hierin beschrieben ist.
Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung ist ein Antisense-Molekül ein RNA-Molekül, das ausgehend von dem komplementären Strang eines nukleären Gens gegenüber einem, der normalerweise unter Bildung eines "Sense"-mRNA-Moleküls, das in ein Polypeptid translatiert werden kann, transkribiert wird, transkribiert wird. Das Antisense-Molekül ist daher komplementär zu der Sense-mRNA oder einem Teil derselben. Obwohl die Wirkungsweise der Antisense-Moleküle der vorliegenden Erfindung nicht auf einen speziellen Mechanismus beschränkt wird, besitzt das Antisense-RNA-Molekül die Fähigkeit zur Bildung einer doppelsträngigen mRNA durch Basenpaarung mit der Sense-mRNA, was eine Translation der Sense-mRNA und anschließende Synthese eines Polypeptidgenprodukts verhindern kann.
Ribozyme sind synthetische RNA-Moleküle, die eine Hybridisierungsregion umfassen, die zu zwei Regionen von jeweils mindestens 5 fortlaufenden Nucleotidbasen in der Ziel-Sense-mRNA komplementär ist. Ferner besitzen Ribozyme eine hochspezifische Endoribonucleaseaktivität, die die Target-Sense-mRNA autokatalytisch spaltet. Eine vollständige Beschreibung der Funktion von Ribozymen ist bei Haseloff und Gerlach (1988) dargestellt und in der internationalen Patentanmeldung WO 89/05852 enthalten. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auf Ribozyme, die auf eine Sense-mRNA mit Codierung für ein hierin beschriebenes Epoxygenasepolypeptid als Ziel ausgerichtet sind, wodurch sie mit der Sense-mRNA hybridisieren und diese spalten, so dass sie nicht länger zur Translation unter Synthese eines funktionalen Polypeptidprodukts fähig ist.
Gemäß dieser Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Ribozym- oder Antisense-Molekül bereit, das eine Sequenz fortlaufender Nucleotidbasen umfasst, die zur Bildung eines über Wasserstoffbrücken gebundenen Komplexes mit einer Sense-mRNA mit Codierung für eine hierin beschriebene Epoxygenase unter Verringerung der Translation der mRNA fähig sind. Obwohl die bevorzugten Antisense- und/oder Ribozymmoleküle mit mindestens etwa 10 bis 20 Nucleotiden des Zielmoleküls hybridisieren, erstreckt sich die vorliegende Erfindung auf Moleküle mit der Fähigkeit zur Hybridisierung mit einer Strecke von mindestens etwa 50–100 Nucleotidbasen oder ein Molekül mit der Fähigkeit zur Hybridisierung mit einer Epoxygenase-mRNA voller Länge oder im wesentlichen voller Länge.
Es ist einschlägig klar, dass bestimmte Modifikationen, die unter anderem Nucleotidsubstitutionen umfassen, an den Antisense- und/oder Ribozymmolekülen der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden können, ohne die Wirksamkeit der Moleküle zur Hemmung der Expression des Epoxygenasegens zu zerstören. Vom Umfang der vorliegenden Erfindung werden daher beliebige Nucleotidsequenzvarianten, -homologa, -analoga oder Fragmente des Gens mit Codierung hierfür umfasst, wobei die einzige Bedingung darin besteht, dass die Nucleotidsequenzvariante, wenn sie transkribiert wird, ein Antisense- und/oder Ribozymmolekül ergibt, das zur Hybridisierung mit dem Sense-mRNA-Molekül fähig ist.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auf Genkonstrukte; die zur Erleichterung der Expression eines Sense-Moleküls, Antisense-Moleküls, Ribozymmoleküls oder Cosuppressionsmoleküls, die zur Änderung der Konzentrationsmenge von Epoxyfettsäuren in einer Zelle fähig sind, gestaltet sind.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das Sense-Molekül, Antisense-Molekül, Ribozymmolekül, Cosuppressionsmolekül oder Genzielausrichtungsmolekül, das zur Änderung der Epoxyfettsäurekomposition einer von einer Pflanze oder einem anderen Organismus abgeleiteten Zelle fähig ist, eine Nucleotidsequenz, die in einer der Sequenzen SEQ ID NO: 1, 3, 5, 19 oder 20 und noch günstiger in einer der Sequenzen SEQ ID NO: 1 oder 3 oder 5 und noch besser in SEQ ID NO: 1 angegeben ist, oder einen komplementären Strang, ein Homologon, Analogon oder Derivat hierfür.
Dem Fachmann ist auch klar, dass die Expression eines Sense-, Antisense-, Ribozym- oder Cosuppressionsmoleküls erfordern kann, dass das Nucleinsäuremolekül der Erfindung in funktioneller Verknüpfung mit einer Promotorsequenz platziert ist. Die Wahl eines Promotors für den vorliegenden Zweck kann in Abhängigkeit vom erforderlichen Expressionsgrad des Sense-Moleküls und/oder der Art, von der die Wirtszelle abgeleitet ist, und/oder der Gewebespezifität oder Entwicklungsspezifität der Expression des Sense-Moleküls, die erforderlich ist, variieren.
Ein Verweis hierin auf einen "Promotor" ist in dem breitesten Zusammenhang hierfür zu sehen und er umfasst die transkriptionsregulatorischen Sequenzen eines klassischen eukaryotischen genomischen Gens, die die TATA-Box, die für einen genauen Transkriptionsstart erforderlich ist, mit einer oder ohne eine CCAAT-Boxsequenz und weitere regulatorische Elemente (d.h. strangaufwärtige Aktivierungssequenzen, Enhancer und Silencer), die die Genexpression als Reaktion auf Entwicklungsreize und/oder äußere Reize oder in gewebespezifischer Weise ändern, umfassen. Im Zusammenhang der Erfindung umfasst der Ausdruck "Promotor" auch die transkriptionsregulatorischen Sequenzen eines klassichen prokaryotischen Gens, wobei sie in diesem Fall eine -35- Boxsequenz und/oder transkriptionsregulatorische Sequenzen einer -10-Box umfassen können.
Im vorliegenden Zusammenhang wird der Ausdruck "Promotor" auch zur Beschreibung eines synthetischen oder Fusionsmoleküls oder eines Derivats, das die Expression des Sense-Moleküls in einer Zelle verleiht, aktiviert oder verstärkt, verwendet. Bevorzugte Promotoren können zusätzliche Kopien von einem oder mehreren spezifischen regulatorischen Elementen zur weiteren Verstärkung der Expression des Sense-Moleküls und/oder zur Änderung der räumlichen Expression und/oder zeitlichen Expression des Sense-Moleküls enthalten. Beispielsweise können auf Kupfer ansprechende regulatorische Elemente angrenzend zu einer heterologen Promotorsequenz, die die Expression eines Sense-Moleküls antreibt, platziert werden, um dieser eine durch Kupfer induzierbare Expression zu verleihen.
Das Setzen eines Sense-, Antisense-, Ribozym- oder Cosuppressionsmoleküls unter die regulatorische Kontrolle einer Promotorsequenz bedeutet die Positionierung des Moleküls derart, dass die Expression durch die Promotorsequenz kontrolliert wird. Ein Promotor ist üblicherweise, jedoch nicht zwangsläufig, strangaufwärts oder 5' eines Nucleinsäuremoleküls, das er reguliert, positioniert. Ferner sind die regulatorischen Elemente, die einen Promotor umfassen, üblicherweise innerhalb von 2 kb der Transkriptionsstartstelle des Sense-, Antisense-, Ribozym- oder Cosuppressionsmoleküls oder eines diese umfassenden chimären Gens positioniert. Bei der Konstruktion von heterologen Promotor/Strukturgenkombinationen ist es allgemein bevorzugt, den Promotor in einem Abstand von der Gentranskriptionsstartstelle, der etwa gleich dem Abstand zwischen dem Promotor und dem Gen, das er kontrolliert, in dessen natürlicher Umgebung, d.h. dem Gen, von dem der Promotor abgelei tet ist, ist, zu positionieren. Wie einschlägig bekannt ist, kann eine gewisse Variation dieses Abstands ohne Verlust der Promotorfunktion passend sein. In ähnlicher Weise wird die bevorzugte Positionierung eines regulatorischen Sequenzelements in Bezug auf ein heterologes Gen, das unter dessen Kontrolle gestellt werden soll, durch die Positionierung des Elements in dessen natürlicher Einstellung, d.h. der Gene, von denen es abgeleitet ist, festgelegt. Wiederum kann, wie einschlägig bekannt ist, eine gewisse Variation dieses Abstands ebenfalls erfolgen.
Beispiele für Promotoren, die zur Verwendung in Genkonstrukten der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen Promotoren, die von den Genen von Viren, Hefen, Schimmelpilzen, Bakterien, Insekten, Vögeln, Säugern und Pflanzen abgeleitet sind, die zum Funktionieren in isolierten Zellen oder aus diesen regenerierten ganzen Organismen fähig sind. Der Promotor kann die Expression des Sense-, Antisense-, Ribozym- oder Cosuppressionsmoleküls konstitutiv oder differenziert im Hinblick auf das Gewebe, in dem die Expression erfolgt, oder im Hinblick auf das Entwicklungsstadium, in dem die Expression erfolgt, oder als Reaktion auf äußere Reize, wie physiologische Belastungen, Pathogene oder Metallionen, unter anderen regulieren.
Beispiele für Promotoren umfassen den CaMV 35S-Promotor, NOS-Promotor, Octopinsynthase(OCS)-Promotor, Arabidopsis thaliana-SSU-Gen-Promotor, Napin-samenspezifischen-Promotor, P₃₂-Promotor, BK5-T-imm-Promotor, lac-Promotor, tac-Promotor, Lambdaphagen-λ_L- oder -λ_R-Promotor, CMV-Promotor (US-Patent 5 168 062), T7-Promotor, lacUV5-Promotor, SV40-early-Promotor (US-Patent 5 118 627), SV40-late-Promotor (US-Patent 5 118 627), Adenoviruspromotor, Baculovirus-P10- oder Polyhedrinpromotor (US-Patent 5 23 041, 5 242 687, 5 266 317; 4 745 051 und 5 169 784) und dergleichen. Zusätz lich zu den hierin identifizierten spezifischen Promotoren sind zelluläre Promotoren für sogenannte Haushaltsgene verwendbar.
Bevorzugte Promotoren gemäß dieser Ausführungsform sind die Promotoren, die zum Funktionieren in Hefe-, Schimmelpilz- oder Pflanzenzellen fähig sind. Noch günstiger sind zur Verwendung gemäß dieser Ausführungsform verwendbare Promotoren zum Funktionieren in Zellen, die von ölhaltigen Hefen, ölhaltigen Schimmelpilzen oder Ölsamenfeldfruchtpflanzen, wie Flachs, der unter der Marke Linola^® (im folgenden als "Linola^®-Flachs" bezeichnet) vertrieben wird, Sonnenblume, Saflor, Sojabohne, Leinsamen, Sesam, Baumwollsamen, Erdnuss, Ölbaum oder Ölpalme, unter anderen, stammen.
Linola^® ist eine eingetragene Marke der Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation (CSIRO), Australien.
In einer stärker bevorzugten Ausführungsform kann der Promotor von einem genomischen Klon mit Codierung für ein Epoxygenaseenzym, vorzugsweise von den Genomgenäquivalenten von Epoxygenasegenen, die von Chrysanthemum spp., Crepis spp., die C. palaestina oder andere Crepis sp. umfassen, Euphorbia lagascae oder Vernonia galamensis abgeleitet sind, die hierin angegeben sind, abgeleitet sein.
In einer stärker bevorzugten Ausführungsform kann der Promotor von einem hoch exprimierten Samengen, wie dem Napingen, unter anderen abgeleitet sein.
Das Genkonstrukt der Erfindung kann ferner eine Terminatorsequenz umfassen und in eine geeignete Wirtszelle eingeführt werden, wo es unter Bildung eines rekombinanten Polypeptidgenprodukts oder alternativ eines Ribozym- oder Anti sense-Moleküls exprimiert wird.
Der Ausdruck "Terminator" bezeichnet eine DNA-Sequenz am Ende einer Transkriptionseinheit, die die Termination der Transkription signalisiert. Terminatoren sind 3'-nichttranslatierte DNA-Sequenzen, die ein Polyadenylierungssignal, das die Addition von Polyadenylatsequenzen an das 3'-Ende eines Primärtranskripts ermöglicht, enthalten. Terminatoren, die in Zellen aktiv sind, die von Viren, Hefen, Schimmelpilzen, Bakterien, Insekten, Vögeln, Säugern und Pflanzen abgeleitet sind, sind bekannt und in der Literatur beschrieben. Sie können aus Bakterien, Pilzen, Viren, Tieren und/oder Pflanzen isoliert werden.
Beispiele für Terminatoren, die zur Verwendung in den Genkonstrukten der vorliegenden Erfindung besonders geeignet sind, umfassen den Nopalinsynthase(NOS)genterminator von Agrobacterium tumefaciens, den Terminator des Cauliflower Mosaic Virus (CaMV)-35S-Gens, den Zein-Genterminator von Zea mays, die Rubisco Small Subunit(SSU)-Genterminatorsequenzen, Subclover Stunt Virus(SCSV)-Gensequenzterminatoren, einen beliebigen rho-unabhängigen Terminator von E. coli unter anderen.
Dem Fachmann sind weitere Promotorsequenzen und Terminatorsequenzen, die zur Verwendung bei der Durchführung der Erfindung geeignet sein können, geläufig. Derartige Sequenzen können ohne weiteres ohne übermäßigen Arbeitsaufwand verwendet werden.
Die Genkonstrukte der Erfindung können ferner eine Replikationsursprungssequenz, die zur Replikation in einer spezifischen Zellart, beispielsweise einer Bakterienzelle, erforderlich ist, wenn es erforderlich ist, dass das Genkonstrukt als episomales Genelement (beispielsweise Plas mid- oder Cosmidmolekül) in der Zelle gehalten wird, umfassen.
Bevorzugte Replikationsursprünge umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, die fl-ori- und colE1-Replikationsursprünge.
Das Genkonstrukt kann ferner ein selektierbares Markergen oder selektierbare Markergene, die in einer Zelle, in der das Genkonstrukt eingeführt ist, funktional sind, umfassen.
Der hier verwendete Ausdruck "selektierbares Markergen" umfasst jedes Gen, das einer Zelle, in der es exprimiert wird, einen Phänotyp verleiht, wobei die Identifizierung und/oder Selektion von Zellen, die mit einem Genkonstrukt der Erfindung oder einem Derivat desselben transfiziert oder transformiert sind, ermöglicht wird.
Hierin betrachtete geeignete selektierbare Markergene umfassen das Ampicillin-Resistenzgen (Amp^r), Tetracyclin-Resistenzgen (Tc^r), bakterielle Kanamycin-Resistenzgen (Kan^r), Phosphinothricin-Resistenzgen, Neomycinphosphotransferasegen (nptII), Hygromycin-Resistenzgen, β-Glucuronidase(GUS)gen, Chloramphenicolacetyltransferase(CAT)gen und Luciferasegen unter anderen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt eine transfizierte oder transformierte Zelle, ein Gewebe, Organ oder einen ganzen Organismus bereit, die ein rekombinantes Epoxygenasepolypeptid oder ein Ribozym-, Antisense- oder Cosuppressionsmolekül gemäß der Beschreibung hierin oder ein Homologon, Analogon oder Derivat desselben exprimieren.
Vorzugsweise ist das isolierte Nucleinsäuremolekül in einem Genkonstrukt gemäß der Beschreibung hierin enthalten. Das Genkonstrukt der vorliegenden Erfindung kann in eine Zelle durch verschiedene, dem Fachmann bekannte Techniken eingeführt werden. Die verwendete Technik kann in Abhängigkeit von den bekannten erfolgreichen Techniken für den speziellen Organismus variieren.
Mittel zur Einführung von rekombinanter DNA in Bakterienzellen, Hefezellen oder Pflanzen-, Insekten-, Pilze- (einschließlich Schimmelpilze), Vögel- oder Säugergewebe oder -zellen umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, die Transformation unter Verwendung von CaCl₂ und Variationen derselben, insbesondere das Verfahren gemäß der Beschreibung von Hanahan (1983), eine direkte DNA-Aufnahme in Protoplasten (Krens et al., 1982; Paszkowski et al., 1984), die PEG-vermittelte Aufnahme in Protoplasten (Armstrong et al., 1990), Mikroteilchenbeschuss, Elektroporation (Fromm et al., 1985), DNA-Mikroinjektion (Crossway et al., 1986), Mikroteilchenbeschuss von Gewebeexplantaten oder Zellen (Christou et al., 1988; Sanford, 1988), Vakuuminfiltration von Nucleinsäure in Gewebe oder im Falle von Pflanzen T-DNA-vermittelte Übertragung von Agrobacterium in das Pflanzengewebe gemäß der Beschreibung im wesentlichen bei An et al. (1985), Herrera-Estrella et al. (1983a, 1983b, 1985).
Zum Mikroteilchenbeschuss von Zellen werden Mikroteilchen in eine Zelle unter Bildung einer transformierten Zelle getrieben. Jede geeignete ballistische Zelltransformationsmethodik und -vorrichtung kann bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Beispiele für Vorrichtungen und Verfahren sind bei Stomp et al. (US-Patent 5 122 466) und Sanford und Wolf (US-Patent 4 945 050) offenbart. Wenn ballistische Transformationsverfahren verwendet werden, kann das Genkonstrukt ein Plasmid mit der Fähigkeit zur Replikation in der zu transformierenden Zelle enthal ten.
Beispiele für zur Verwendung in derartigen Systemen geeignete Mikroteilchen umfassen Goldkügelchen von 1 bis 5 μm. Das DNA-Konstrukt kann auf dem Mikroteilchen durch jede geeignete Technik, beispielsweise Abscheidung, abgelagert werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform, wobei das Genkonstrukt ein "Sense"-Molekül umfasst, ist es besonders bevorzugt, wenn das daraus hergestellte rekombinante Epoxygenasepolypeptid enzymatisch aktiv ist.
Alternativ kann, wenn die Zelle von einem mehrzelligen Organismus stammt und relevante Technologie verfügbar ist, ein ganzer Organismus aus der transformierten Zelle entsprechend einschlägig bekannten Verfahren regeneriert werden.
Dem Fachmann sind auch Verfahren zur Transformation, Regeneration und Vermehrung anderer Zellarten, beispielsweise der von Pilzen, geläufig.
Im Falle von Pflanzen kann Pflanzengewebe mit der Fähigkeit zur anschließenden klonalen Vermehrung, ob durch Organogenese oder Embryogenese, mit einem Genkonstrukt der vorliegenden Erfindung transformiert und dadurch eine ganze Pflanze regeneriert werden. Das spezielle gewählte Gewebe variiert in Abhängigkeit von den klonalen Vermehrungssystemen, die für die zu transformierende spezielle Art verfügbar und am besten geeignet ist. Beispiele für Zielgewebe umfassen Blattscheiben, Pollen, Embryos, Kotyledone, Hypokotyle, Megagametophyten, Callusgewebe, bestehendes Meristemgewebe (beispielsweise Apikalmeristem, Achselknospen und Wurzelmeristeme) und induziertes Meristemgewebe (bei spielsweise Kotyledonmeristem und Hypokotylmeristem).
Der hier verwendete Ausdruck "Organogenese" bedeutet einen Prozess, wodurch Sprosse und Wurzeln nacheinander aus meristematischen Zentren entwickelt werden.
Der hier verwendete Ausdruck "Embryogenese" bedeutet einen Prozess, wodurch Sprosse und Wurzeln sich zusammen in konzertierter Weise (nicht aufeinanderfolgend) entweder aus somatischen Zellen oder Gameten entwickeln.
Die regenerierten transformierten Pflanzen können durch eine Vielzahl von Mitteln, wie klonale Fortpflanzung oder klassische Zuchttechniken, vermehrt werden. Beispielsweise kann eine transformierte Pflanze der ersten Generation (oder T1) von sich aus vermehrt werden, wobei eine homozygote Transformante der zweiten Generation (oder T2) erhalten wird und die T2-Pflanzen durch klassische Zuchttechniken weiter vermehrt werden.
Die hierin betrachteten regenerierten transformierten Organismen können eine Vielzahl von Formen einnehmen. Beispielsweise können sie Chimäre von transformierten Zellen und nichttransformierten Zellen, klonale Transformanten (wobei beispielsweise alle transformierten Zellen die Expressionskassette enthalten), Transplantate von transformierten und nichttransformierten Geweben (beispielsweise bei Pflanzen ein auf einen nichttransformierten Schössling transplantierter transformierter Wurzelstock) sein.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Änderung der Konzentrationsmenge von Epoxyfettsäuren in einer Zelle, einem Gewebe, Organ oder Organismus bereit, wobei das Verfahren die Expression eines Sense-, Antisense-, Ribozym- oder Cosuppressionsmoleküls gemäß der Beschreibung hierin in der Zelle über einen Zeitraum und unter Bedingungen, die so ausreichend sind, dass die Konzentrationsmenge von Epoxyfettsäuren darin erhöht oder verringert wird, umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das vorliegende Verfahren die zusätzliche erste Stufe einer Transformation der Zelle, des Gewebes, Organs oder Organismus mit dem Sense-, Antisense-, Ribozym- oder Cosuppressionsmolekül.
Wie im vorhergehenden diskutiert wurde, kann das isolierte Nucleinsäuremolekül in einem Genkonstrukt enthalten sein.
Gemäß dieser Ausführungsform kann die Zelle, das Organ, Gewebe oder der Organismus, in dem das vorliegende Sense-, Antisense-, Ribozym- oder Cosuppressionsmolekül exprimiert wird, von Bakterien, Hefen, Pilzen (einschließlich Schimmelpilzen), Insekten, Pflanzen, Vögeln oder Säugern stammen.
Da ein rekombinantes Epoxygenasepolypeptid in der regenerierten Transformante sowie ex vivo produziert werden kann, stellt eine alternative bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Produktion eines rekombinanten enzymatisch aktiven Epoxygenasepolypeptids in einer Zelle bereit, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst:

(i) Produzieren eines Genkonstrukts, das cDNA- oder genomische Epoxygenasegensequenz der Erfindung, die funktional unter die Kontrolle eines Promotors mit der Fähigkeit, die Expression der Gensequenz in der Zelle zu bewirken, und optional eines Expression-Enhancerelements gestellt wurde, umfasst;
(ii) Transformieren des Genkonstrukts in die Zelle und
(iii) Selektieren von Transformanten, die die durch die Gensequenz codierte Epoxygenase in hohem Grade exprimieren.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten enzymatisch aktiven Epoxygenasepolypeptids in einer transgenen Pflanze bereit, das die folgenden Stufen umfasst:

(i) Produzieren eines Genkonstrukts, das die cDNA- oder genomische Epoxygenasegensequenz der Erfindung, die funktional unter die Kontrolle eines samenspezifischen Promotors und optional eines Expression-Enhancerelements gestellt wurde, umfasst, wobei die Gensequenzen auch strangaufwärts einer Transkriptionsterminatorsequenz platziert wurden;
(ii) Transformieren des Genkonstrukts in eine Zelle oder ein Gewebe der Pflanze und
(iii) Selektieren von Transformanten, die die durch die Gensequenz codierte Epoxygenase in hohem Grade in Samen exprimieren.

In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Pflanze eine Ölsamenart, die normalerweise bedeutende Mengen Linolsäure produziert, beispielsweise unter anderem Linola^®-Flachs, Ölraps, Sonnenblume, Saflor, Sojabohne, Leinsamen, Sesam, Baumwollsamen, Erdnuss, Olivenbaum oder Ölpalme.
In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Pflanze eine Ölsamenart, die normalerweise bedeutende Mengen an Linolsäure produziert, beispielsweise unter anderem Linola^®-Flachs, Sonnenblume oder Saflor.
Hierin beschriebene enzymatisch aktive rekombinante Epoxygenasen sind zur Produktion von epoxygenierten Fettsäuren aus ungesättigten Fettsäuresubstraten besonders verwendbar. Die vorliegende Erfindung betrachtet insbesondere die Produktion von spezifischen epoxygenierten Fettsäuren in Zellen oder regenerierten transformierten Organismen, die die spezifische epoxygenierte Fettsäure normalerweise nicht produzieren.
Entsprechend stellt ein weiterer Aspekt der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer epoxygenierten Fettsäure in einer Zelle, einem Gewebe, Organ oder Organismus bereit, wobei das Verfahren die Inkubation einer Zelle, eines Gewebes, Organs oder Organismus, die eine enzymatisch aktive rekombinante Epoxygenase der vorliegenden Erfindung exprimieren, mit einem Fettsäuresubstratmolekül, vorzugsweise einem ungesättigten Fettsäuresubstratmolekül über einen Zeitraum und unter Bedingungen, die so ausreichend sind, dass mindestens eine Kohlenstoffbindung des Substrats in eine Epoxygruppe umgewandelt wird, umfasst.
In einer alternativen. Ausführungsform umfasst das vorliegende Verfahren ferner die zusätzliche erste Stufe der Transformation oder Transfektion der Zelle, des Gewebes, Organs oder Organismus mit einem Nucleinsäuremolekül, das für die rekombinante Epoxygenase oder ein Homologon, Analogon oder Derivat derselben gemäß der vorhergehenden Beschreibung hierin codiert. Wie im vorhergehenden diskutiert, kann das isolierte Nucleinsäuremolekül in einem Genkonstrukt enthalten sein.
Gemäß dieser Ausführungsform stammt die Zelle, das Organ, Gewebe oder der Organismus, in dem die vorliegende Epoxygenase exprimiert wird, von einer Bakterie, Hefe, einem Pilz (einschließlich einem Schimmelpilz), einem Insekt, einer Pflanze, einem Vogel oder einem Säuger. Noch besser stammt die Zelle, das Organ, Gewebe oder der Organismus von einer Hefe, einer Pflanze oder einem Pilz, noch besser von einer ölhaltigen Hefe oder Pflanze oder einem ölhaltigen Pilz oder von einer Ölsamenpflanze, die die rekombinante Epoxygenase der Erfindung normalerweise nicht exprimiert.
Von den hierin betrachteten, wirtschaftlich wichtigsten Ölsamenpflanzen sind Genotypen von Flachs, Sonnenblume, Mais und Saflor mit hohem Linolgehalt bevorzugte Ziele. Sojabohne und Raps sind alternative Ziele, jedoch für eine maximale Epoxyfettsäuresynthese wegen ihrer geringeren Konzentrationsmengen an Linolsäuresubstrat und des Vorhandenseins einer aktiven ρ15-Desaturase, die mit der Epoxygenase um das Linolsäuresubstrat konkurriert, weniger geeignet.
Eine alternative Ausführungsform ist die Transformation von Linola^® (= Flachs mit geringem Linolsäuregehalt) mit der Epoxygenase der Erfindung. Linola^®-Flachs enthält normalerweise um 70 % Linolsäure, wobei sehr wenig davon (<2 %) durch ρ15-Desaturase anschließend in Linolensäure umgewandelt wird (Green, 1986).
Hierin betrachtete bevorzugte ungesättigte Fettsäuresubstrate umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, Palmitoleinsäure, Ölsäure, Linolsäure, Linolensäure und Arachidonsäure unter anderen.
Bei Pflanzenarten, die von Natur aus hohe Konzentrationsmengen an Vernolsäure enthalten, kann die ρ12-Epoxygenase darin sehr effizient zur Epoxidierung von Linolsäure sein. Infolgedessen betrachtet die vorliegende Erfindung insbesondere die Expression von rekombinanter ρ12-Epoxygenase, die von Euphorbia lagascae, Vernonia spp. und Crepis spp. stammt, in hohen Graden in transgenen Ölsamen während der Samenölsynthese, wobei hohe Konzentrationsmengen von Vernolsäure darin produziert werden.
Entsprechend ist Linolsäure ein besonders bevorzugtes Substrat gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung. Weitere Substrate sind nicht ausgeschlossen.
Die Produkte der im vorhergehenden aufgelisteten Substratmoleküle werden durch den Fachmann ohne übermäßigen Arbeitsaufwand ohne weiteres bestimmt. Besonders bevorzugte Fettsäuren, die gemäß der vorliegenden Erfindung produziert werden, umfassen unter anderen 12,13-Epoxy-9-octadecensäure (Vernolsäure) und 12,13-Epoxy-9,15-octadecadiensäure.
Die Bedingungen zur Inkubation von Zellen, Organen, Geweben oder Organismen, die die rekombinante Epoxygenase exprimieren, in Gegenwart des Substratmoleküls variieren zumindest in Abhängigkeit von der Aufnahme des Substrats in die Zelle, das Gewebe, Organ oder den Organismus und der Affinität der Epoxygenase für das Substratmolekül in der speziellen gewählten Umgebung. Optimale Bedingungen können durch den Fachmann auf dem relevanten Gebiet ohne weiteres bestimmt werden.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich klar auf das isolierte Öl, das Epoxyfettsäuren enthält, und/oder die isolierte Epoxyfettsäure selbst, die gemäß der Beschreibung hierin produziert wurde, und etwaige, davon hergeleitete Produkte, beispielsweise unter anderem Beschichtungen, Harze, Klebstoffe, Kunststoffe, grenzflächenaktive Mittel und Gleitmittel.
Die Erfinder zeigten ferner, dass die Monooxygenasen gemischter Funktion (MMO), die katalytische Funktionen wie Desaturierung, Acetylenierung, Hydroxylierung und/oder Epo xygenierung durchführen, eine Familie von Genen bilden, die beträchtliche Nucleotid- und Aminosäuresequenzähnlichkeit teilen. Beispielsweise sind die Desaturase-, Acetylenase-, Hydroxylase- und/oder Epoxygenaseenzyme, die auf Substratmoleküle einer ähnlichen Kettenlänge und Position etwaiger Kohlenstoffdoppelbindungen (falls vorhanden) wirken, miteinander enger verwandt als mit auf andere Substrate wirkenden Enzymen und sie können als "Familie" betrachtet werden.
Ohne an eine Theorie oder Wirkungsweise gebunden zu sein, hat die Sequenzähnlichkeit zwischen den Mitgliedern einer Genfamilie ihre Basis auf der Identität der beteiligten Substanz und der biochemischen Ähnlichkeit der Reaktionsereignisse, die an der Zielkohlenstoffbindung während der Modifizierungsreaktion auftreten, was nahe legt, dass divergierende Sequenzen in einer Familie katalytische Determinanten oder mindestens einen funktionalen Teil derselben, der zu den spezifischen katalytischen Eigenschaften der Familienmitglieder beiträgt, umfassen können.
Ein Beispiel für eine Familie sind die Desaturase-, Acetylenase-, Hydroxylase- und/oder Epoxygenaseenzyme, die Desaturierung, Acetylenierung, Hydroxylierung und/oder Epoxygenierung von jeweils der ρ12-Position von Linolsäure katalysieren (im folgenden als die "C18-ρ12-MMO-Familie" bezeichnet). Die Erfinder der vorliegenden Erfindung verglichen die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen von Mitgliedern der C18-ρ12-MMO-Familie zur Bestimmung der divergierenden Regionen derselben, die potentiell die Determinanten alternativer katalytischer Funktionen an der ρ12-Position (im folgenden als "vermutliche katalytische Determinanten" bezeichnet) umfassen.
Des weiteren wird das Vorhandensein derartiger Familien von fettsäuremodifizierenden MMOs im Hinblick auf eine andere Fettsäurekettenlänge und andere Doppelbindungspositionen einer Fettsäure betrachtet. Beispielsweise wird die C18-ρ15-Desaturase als zu einer Familie verwandter Enzyme mit der Fähigkeit zur Desaturierung, Acetylenierung, Hydroxylierung und/oder Epoxydation der ρ15-Position in C18-Fettsäuresubstraten, der C18-p15-MMO-Familie, gehörend betrachtet.
Durch die Produktion synthetischer Gene, in denen diese katalytischen Determinanten ausgetauscht wurden (als "Domain Swapping" bezeichnet), ist es möglich, Gene mit Codierung für eine katalytische Funktion in solche mit Codierung für alternative katalytische Funktionen umzuwandeln. Beispielsweise kann die ρ12-Epoxygenase der vorliegenden Erfindung in eine ρ12-Acetylenase durch Austausch von Teilen von deren C-terminalen und N-terminalen Sequenzen durch die äquivalenten Domänen von der ρ12-Acetylenase von Crepis alpina umgewandelt werden. In ähnlicher Weise kann das umgekehrte Domain Swapping ebenfalls durchgeführt werden.
Als weitere Verfeinerung können derartige Änderungen der katalytischen Funktion in ähnlicher Weise durch die Durchführung spezifischer Änderungen (beispielsweise Addition, Substitution oder Deletion) an nur den Aminosäuren innerhalb jeder Domäne, die zur Bestimmung der relevanten katalytischen Funktion entscheidend wichtig sind, (beispielsweise durch positionsspezifische Mutagenese) bewirkt werden.
Entsprechend betrachtet ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ein synthetisches Fettsäuregen, das eine von einem Epoxygenasegen gemäß der Beschreibung hierin abgeleitete Nucleotidsequenz umfasst, wobei das synthetische Fett säuregen für ein Polypeptid mit Epoxygenase- oder Acetylenase- oder Hydroxylase- oder Desaturaseaktivität codiert, wobei das Polypeptid entweder eine Aminosäuresequenz umfasst, die von einem natürlich vorkommenden Epoxygenase- oder Acetylenase- oder Hydroxylase- oder Desaturaseenzym verschieden ist, oder das Polypeptid katalytische Eigenschaften zeigt, die von einem natürlich vorkommenden Epoxygenase- oder Acetylenase- oder Hydroxylase- oder Desaturaseenzym verschieden sind, oder das Polypeptid eine Sequenz von Aminosäuren umfasst, die zu mindestens etwa 60 % identisch mit einem Teil von SEQ ID NO: 2 oder 4 oder 6 oder einem Homologon, Analogon oder Derivat des Teils ist.
Vorzugsweise ist das synthetische Fettsäuregen der Erfindung von einem ρ12-Epoxygenasegen abgeleitet.
In einer Ausführungsform codiert das synthetische Fettsäuregen der Erfindung für ein Fusionspolypeptid, in dem die N-terminalen und/oder C-terminalen Aminosäuren von einer der Sequenzen SEQ ID NO: 2 oder 4 oder 6 in-frame durch Aminosäuresequenzen eines unterschiedlichen Elements der gleichen Familie ersetzt sind.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die N-terminalen und/oder C-terminalen Aminosäuren von SEQ ID NO: 2 oder 4 oder 6 durch die entsprechenden Regionen der in 2 angegebenen Acetylenase-, Desaturase- oder Hydroxylasepolypeptide ersetzt. Noch günstiger sind mindestens etwa 30 Aminosäurereste von den N-terminalen und/oder C-terminalen Regionen von einer der Sequenzen SEQ ID NO: 2 oder 4 oder 6 in-frame durch die entsprechenden Regionen der in 2 angegebenen Acetylenase-, Desaturase- oder Hydroxylasepolypeptide ersetzt.
In einer alternativen Ausführungsform codiert das syntheti sche Fettsäuregen der Erfindung für ein Fusionspolypeptid, in dem die N-terminalen und/oder C-terminalen Aminosäuren einer Fettsäure-Acetylenase oder Fettsäure-Hydroxylase oder Fettsäure-Desaturase in-frame durch die N-terminale und/oder C-terminale Region von einer der Sequenzen SEQ ID NO: 2 oder 4 oder 6 ersetzt sind.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die N-terminalen und/oder C-terminalen Aminosäuren einer Fettsäure-Acetylenase oder Fettsäure-Hydroxylase oder Fettsäure-Desaturase in-frame durch die N-terminale und/oder C-terminale Region von einer der Sequenzen SEQ ID NO: 2 oder 4 oder 6 ersetzt. Noch besser ist die Fettsäure-Acetylenase oder Fettsäure-Hydroxylase oder Fettsäure-Desaturase aus der in 2 angegebenen Liste ausgewählt.
Noch besser sind mindestens etwa 30 Aminosäurereste aus den N-terminalen und/oder C-terminalen Regionen einer Fettsäure-Acetylenase oder Fettsäure-Hydroxylase oder Fettsäure-Desaturase in-frame durch die N-terminale und/oder C-terminale Region von einer der Sequenzen SEQ ID NO: 2 oder 4 oder 6 ersetzt.
Entsprechend erstreckt sich die vorliegende Erfindung auf beliebige Varianten der hierin angegebenen Epoxygenaseenzyme, wobei die Varianten von einem Epoxygenasepolypeptid gemäß der Beschreibung hierin abgeleitet sind und belegbare Acetylenase- oder Hydroxylase- oder Desaturaseaktivität zeigen und entweder eine Aminosäuresequenz zeigen, die von einem natürlich vorkommenden Acetylenase- oder Hydroxylase- oder Desaturaseenzym verschieden ist, oder katalytische Eigenschaften zeigen, die von einem natürlich vorkommenden Acetylenase- oder Hydroxylase- oder Desaturaseenzym verschieden sind, oder eine Aminosäuresequenz umfassen, die zu mindestens etwa 60 % identisch mit einer von SEQ ID NO: 2 oder 4 oder 6 ist.
In Bezug auf andere Aspekte der Erfindung können die hierin beschriebenen Varianten als rekombinante Polypeptide oder in transgenen Organismen produziert werden, sobald die vorliegenden synthetischen Gene in eine geeignete Wirtszelle eingeführt sind und darin exprimiert werden.
Die hierin beschriebenen rekombinanten Polypeptide oder ein Homologon, Analogon oder Derivat derselben können auch immunologisch aktive Moleküle sein.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ergibt ein immunologisch interaktives Molekül, das zur Bindung an ein rekombinantes Epoxygenasepolypeptid der Erfindung fähig ist.
Vorzugsweise umfasst das rekombinante Epoxygenasepolypeptid, an das das immunologisch interaktive Molekül binden kann, eine Aminosäuresequenz, die in einer der Sequenzen SEQ ID NO: 2, 4 oder 6 angegeben ist, oder ein Homologon, Analogon oder Derivat derselben.
In einer Ausführungsform ist das immunologisch interaktive Molekül ein Antikörpermolekül. Das Antikörpermolekül kann monoklonal oder polyklonal sein. Monoklonale oder polyklonale Antikörper können aus natürlich vorkommenden Antikörpern gegenüber einem Epitop oder einem Peptidfragment oder einem synthetischen Epoxygenasepeptid, das von einem rekombinanten Genprodukt abgeleitet ist, gewählt werden oder spezifisch gegen eine rekombinante Epoxygenase oder ein Homologon, Analogon oder Derivat derselben gebildet werden.
Sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper sind durch Immunisierung mit einem geeigneten Genprodukt oder Epitop oder Peptidfragment eines Genprodukts erhältlich. Alternativ können Fragmente von Antikörpern, beispielsweise Fab-Fragmente, verwendet werden. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auf rekombinante und synthetische Antikörper und Antikörperhybride. Als "synthetischer Antikörper" wird hierin einer betrachtet, der Fragmente und Hybride von Antikörpern umfasst.
Die hierin betrachteten Antikörper können zur Identifizierung von Gensequenzen, die verwandte Epoxygenasepolypeptide, die durch die hierin beschriebenen Ausführungsformen umfasst werden, exprimieren, verwendet werden.
Die einzige Bedingung zur erfolgreichen Detektion einer verwandten Epoxygenasegensequenz besteht darin, dass die Gensequenz exprimiert wird, wobei mindestens ein durch das Antikörpermolekül erkanntes Epitop produziert wird. Vorzugsweise wird zum Zweck, dass eine Expression zum Ermöglichen einer Detektion erhalten wird, die verwandte Gensequenz funktional hinter einer Promotorsequenz, beispielsweise dem bakteriellen lac-Promotor, platziert. Gemäß dieser bevorzugten Ausführungsform werden die Antikörper zur Detektion des Vorhandenseins eines Plasmids oder Bakteriophagen, der die verwandte Epoxygenase exprimiert, verwendet. Entsprechend sind die Antikörpermoleküle bei der Reinigung des Plasmids oder Bakteriophagen, der die verwandte Epoxygenase exprimiert, verwendbar.
Die vorliegenden Antikörpermoleküle können auch zur Reinigung der rekombinanten Epoxygenase der Erfindung oder eines natürlich vorkommenden Äquivalents oder eines Homologons, Analogons oder Derivats derselben verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung wird ferner unter Bezug auf die folgenden nichtbeschränkenden Beispiele beschrieben.
BEISPIEL 1
Charakterisierung von Epoxyfettsäuren in Euphorbia lagascae und Crepis spp.
Samen der Wildart von Euphorbia lagascae und von verschiedenen Crepis-Arten wurden durch Gasflüssigchromatographie auf das Vorhandensein von Epoxyfettsäuren gescreent.
Wie in Tabelle 3 angegeben ist, enthält Euphorbia lagascae sehr hohe Konzentrationsmengen der Epoxyfettsäure Vernolsäure in deren Samenöl. Für Samen von Crepis palaestina wurde gezeigt, dass sie 61,4 Gew.-% Vernolsäure und 0,75 Gew.-% an der Acetylenfettsäure Crepeninsäure von den gesamten Fettsäuren enthalten (Tabelle 3). TABELLE 3 Fettsäurezusammensetzung von Lipiden, die aus Samen von Crepis alpina, Crepis palaestina und Euphorbia lagascae stammen

^a Berechnet aus den Flächenprozent der gesamten integrierten Peakflächen bei der gasflüssigchromatographischen Bestimmung von Methylesterderivaten der Samenlipide

BEISPIEL 2
Biochemische Charakterisierung von Linoleat-ρ12-Epoxygenasen in Euphorbia lagascae und Crepis palaestina
Das Enzym Linoleat-ρ12-Epoxygenase synthetisiert Vernolsäure aus Linolsäure. Linoleat-ρ12-Epoxygenasen, die von Euphorbia lagascae und Crepis palaestina stammen, sind in den Mikrosomen lokalisiert. Die Enzyme von diesen Arten können zumindest in Membran(mikrosomalen)fraktionen, die aus sich entwickelnden Samen hergestellt wurden, aktiv bleiben.
Membranzubereitungen von Euphorbia lagascae und Tests von deren Epoxygenaseaktivitäten wurden gemäß der Beschreibung von Bafor et al. (1993) mit Inkubationen, die NADPH enthalten, falls nicht anders in Tabelle 4 angegeben, durchgeführt. Lipidextraktion, -abtrennung und -methylierung sowie GLC- und Radio-GLC-Trennung wurden im wesentlichen gemäß der Beschreibung bei Kohn et al. (1994) und Bafor et al. (1993) durchgeführt.
Membranzubereitungen von Crepis alpina und Crepis palaestina wurden wie im folgenden erhalten. Pflanzen von Crepis alpina und Crepis palaestina wurden in Treibhäusern gezüchtet und Samen wurden im mittleren Entwicklungsstadium (17–20 Tage nach dem Blühen) geerntet. Kotyledone wurden aus deren Samenhüllen gedrückt und mit Mörser und Pistill in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,2, der 0,33 M Saccharose, 4 mM NADH, 2 mM CoASH, 1 mg Rinderserumalbumin/ml und 4000 Einheiten Katalase/ml enthielt, homogenisiert. Das Homogenat wurde 10 min mit 18 000 × g zentrifugiert und der gebildete Überstand wurde 60 min mit 150 000 × g zentrifugiert, wobei ein mikrosomales Pellet erhalten wurde.
Standard-Desaturase-, -Acetylenase- und -Epoxygenaseassays mit Mikrosomenmembranen von Crepis-Arten wurden bei 25 °C mit Mikrosomenzubereitungen, die äquivalent mit 0,2 mg Mikrosomenprotein waren, die in frischem Homogenisierungspuffer und 10 nmol von entweder [1-¹⁴C]18:1-CoA oder [1-¹⁴C]18:2-CoA (spezifische Aktivität 85 000 dpm/nmol) in einem Gesamtvolumen von 360 μl suspendiert wurden, durchgeführt. Wenn NADPH als Coreduktionsmittel verwendet wurde, wurden die Membranen in Homogenisierungspuffer, in dem NADH durch NADPH ersetzt war, resuspendiert.
Die biochemische Charakterisierung der mikrosomalen Linoleat-ρ12-Epoxygenase, die von Euphorbia lagascae und Crepis palaestina stammte, wurde durchgeführt und die erhaltenen Daten wurden mit den biochemischen Eigenschaften von Oleat-ρ12-Desaturase- und Linoleat-ρ12-Acetylenaseenzymen, die von Mikrosomenzubereitungen von Crepis alpina stammten, verglichen (Tabelle 4).
Wie in Tabelle 4 gezeigt ist, zeigt die Linoleat-ρ12-Epoxygenase von Crepis palaestina ähnlich biochemische Merkmale wie die Linoleat-ρ12-Acetylenase und Oleat-ρ12-Desaturase von Crepis alpina insofern, als alle drei Enzyme O₂ erfordern, gleich gut mit entweder NADH oder NADPH als Coreduktionsmitteln wirken und durch Cyanid, jedoch nicht durch Kohlenmonoxid gehemmt werden. Ferner wird keines dieser Enzyme durch monoklonale Antikörper gegenüber Cytochrom-P450-Reduktase gehemmt.
Die Daten in Tabelle 4 legen nahe, dass die Linoleat-ρ12-Epoxygenase von Crepis palaestina zur gleichen Enzymklasse wie die mikrosomale Oleat-ρ12-Desaturase und Linoleat-ρ12-Acetylenase von Crepis alpina gehört.
Im Gegensatz dazu erfordert die Linoleat-ρ12-Epoxygenase von Euphorbia lagascae NADPH als Coreduktionsmittel, sie wird durch Cyanid nicht gehemmt, wird jedoch durch Kohlenmonoxid gehemmt (Tabelle 4). Ferner ermittelten die Erfinder, dass die Linoleat-ρ12-Epoxygenase von Euphorbia lagascae durch monoklonale Antikörper, die gegen eine Cytochrom-P450-Reduktaseenzym gebildet wurden, gehemmt wird. Diese Daten legen nahe, dass die Linoleat-ρ12-Epoxygenase von Euphorbia lagascae zur Cytochrom-P450-Proteinklasse gehört und daher biochemisch nicht mit der Linoleat-ρ12-Epoxygenase von Crepis palaestina verwandt ist. TABELLE 4 Vergleich der biochemischen Eigenschaften von Expoygenasen, Acetylenasen und Desaturasen, die von Crepis spp. und Euphorbia lagascae stammen
BEISPIEL 3
Strategie zur Klonierung von Epoxygenasegenen von Crepis palaestina
Die Klonierung der Epoxygenasegene von Crepis palaestina beruhte auf den Eigenschaften der in den vorhergehenden Beispielen beschriebenen Enzyme von C. palaestina und C. alpina.
Insbesondere wurde Poly(A)+RNA aus sich entwickelnden Samen von Crepis palaestina unter Verwendung eines QuickPrep Micro mRNA Purification Kit (Pharmacia Biotechnology) isoliert und zur Synthese einer Oligosaccharid-d(T)-primed doppelsträngigen cDNA verwendet. Die doppelsträngige cDNA wurde an EcoRI/NotI-Adaptoren (Pharmacia Biotechnology) ligiert und eine cDNA-Bibliothek wurde unter Verwendung des ZAP-cDNA-Gigapack Cloning Kit (Stratagene) konstruiert.
Einsträngige cDNA wurde aus RNA, die von dem sich entwickelnden Samen von Crepis alpina stammte, unter Verwendung von Standardverfahren hergestellt. Ein PCR-Fragment der Bezeichnung D12V (SEQ ID NO: 7) wurde durch Amplifizieren der einsträngigen cDNA unter Verwendung von Primern, die von den abgeleiteten Aminosäuresequenzen von Monooxygenasen gemischter Funktion von Pflanzen abgeleitet waren, erhalten.
Das D12V-Fragment wurde anschließend statistisch markiert und zum Screening der obigen cDNA-Bibliothek von Crepis palaestina auf Hybond N⁺-Membranfiltern von Amersham gemäß der Vorschrift des Herstellers unter Verwendung von Standardhybridisierungsbedingungen verwendet. Dieser Ansatz führte zur Reinigung eines rekombinanten Bakteriophagen der Bezeichnung Cpal2.
Die Nucleotidsequenz von Cpal2-cDNA wurde bestimmt und ist in SEQ ID NO: 1 angegeben.
Die Cpal2-cDNA schien von voller Länge zu sein. Eine schematische Darstellung eines Expressionsvektors, der die Cpal2-cDNA umfasst, ist in 1 angegeben. Das darin angegebene Genkonstrukt ist zur Einführung in Pflanzenmaterial zur Produktion einer transgenen Pflanze, die die vorliegende Epoxygenase exprimiert, gestaltet. Der Fachmann erkennt, dass ähnliche Expressionsvektoren ohne übermäßigen Arbeitsaufwand produziert werden können und zur Produktion transgener Pflanzen, die eine der Gensequenzen der vorliegenden Erfindung exprimieren, durch Ersetzen der Cpal2-cDNA durch eine andere Strukturgensequenz verwendet werden können.
Wie in 2 gezeigt ist, codierte die Nucleotidsequenz der Crep1-cDNA für ein Polypeptid, das zumindest auf der Aminosäureebene mit einem Acetylenaseenzym von Crepis alpina nahe verwandt war (Bafor et al. 1997; internationale Patentanmeldung PCT/SE97/00247).
Das 1,4-kb-Insert von pCpal2 wurde sequenziert (SEQ ID NO: 1) und es wurde gezeigt, dass es ein offenes Leseraster umfasst, das für ein Polypeptid einer Länge von 374 Aminosäuren codiert. Die abgeleitete Aminosäuresequenz von Cpal2 zeigte 81 % Identität und 92 % Ähnlichkeit mit der ρ12-Acetylenase von Crepis alpina und etwa 60 % Identität und 80 % Ähnlichkeit mit mikrosomalen ρ12-Desaturaseproteinen von Pflanzen (2). Jedoch umfasste das durch Cpal2 codierte Polypeptid signifikante Unterschiede der Aminosäuresequenz im Vergleich zu Nicht-Epoxygenaseenzymen. Insbesondere weist das Cpal2 eine Deletion von sechs fortlaufenden Aminosäuren in der 5'-terminalen Region im Vergleich zu allen mikrosomalen ρ12-Desaturasen und eine Deletion von zwei fortlaufenden Aminosäuren in der 3'-terminalen Region im Vergleich zur Crep-1-ρ12-Acetylenase auf (2).
Obwohl Gene von membrangebundener Fettsäuredesaturase be schränkte Sequenzhomologien zeigen, enthalten sie alle drei Regionen konservierter histidinreicher Motive, die im folgenden angegeben sind:

_3-4

_2-3

Die durch die Cpal2-cDNA codierte Aminosäuresequenz umfasst drei histidinreiche Motive, die den histidinreichen Motiven der ρ12-Desaturaseenzyme ähnlich, jedoch nicht mit diesen identisch sind. Diese Daten legen nahe, dass die Cpal2-cDNA für ein Enzym codiert, das zu der Enzymklasse von Monooxygenasen gemischter Funktion gehört.
Die Analyse von Fettsäuren, die in obigem Beispiel 1 dargestellt ist, zeigte, dass Vernolsäure zumindest in den Samen von Crepis palaestina vorhanden war. Dieses Enzym kann tatsächlich ausschließlich in den Samen von C. palaestina vorhanden sein. Die Expression des Cpal2-Gens wurde unter Verwendung der 3'-nichttranslatierten Region des Cpal2-cDNA-Klons als Hybridisierungssonde an Northern-Blots von mRNA, die von sich entwickelnden Samen und Blättern von C. palaestina stammte, untersucht. Wie in 3 gezeigt ist, wurde das Cpal2-Gen in sich entwi ckelnden Samen hoch exprimiert, jedoch konnte keine Expression in Blättern detektiert werden. Diese Daten sind mit dem Enzymaktivitätsprofil von Linoleat-ρ12-Epoxygenase von C. palaestina in diesen Geweben konsistent.
BEISPIEL 4
Strategie zur Klonierung von Epoxygenasegenen von Euphorbia lagascae
Die Klonierung der Epoxygenasegene von Euphorbia lagascae beruhte auf den Eigenschaften der Enzyme von E. lagascae, die in den vorhergehenden Beispielen beschrieben wurden.
In einem Ansatz, der zur Klonierung von Epoxygenasegenen von Euphorbia lagascae unternommen wurde, wurde RNA von unreifen Embryos von Euphorbia lagascae, die im Stadium der aktiven Vernolsäuresynthese entnommen wurden, gewonnen und zur Konstruktion einer cDNA-Bibliothek verwendet. Die cDNA-Bibliothek wurde in dem Lambda Zap II-Vektor (Stratagene) gemäß der Beschreibung im vorhergehenden Beispiel konstruiert, mit der Ausnahme, dass die cDNA-Inserts in direktionaler Weise in EcoRI-XhoI-Stellen des in den Lambdavektor eingebetteten Plasmidvektors kloniert wurden.
Der entartete PCR-Primer, der in 4 angegeben ist, (SEQ ID NO: 18) wurde synthetisiert und zur Amplifikation von Nucleotidsequenzen, die für P450-Enzymsequenzen aus der Euphorbia lagascae-cDNA-Bibliothek codieren, verwendet. Für PCR-Amplifikationsreaktionen wurde ein Aliquot von 100 μl der cDNA-Bibliothek mit Phenol:Chloroform [1:1 (V/V)] extrahiert und DNA durch Zugabe von 2 Volumina Ethanol gefällt und schließlich in 10 μl Wasser resuspendiert. Ein Aliquot (1 μl) der resuspendierten DNA wurde als Templat in einer PCR-Amplifikationsreaktion verwendet. PCR-Reaktionen wurden in 10 μl TaqI-Polymerasepuffer, der 200 μM jedes dNTP, 10 pmol des entarteten Primers, 1 pmol von T7-Polymerasepromotorprimer und 0,4 Einheiten TagI-Polymerase enthielt, durchgeführt.
Die Amplifikationsbedingungen waren 2 min bei 94 °C und fünf Zyklen, wobei jeder Zyklus 1 min bei 48 °C und anschließend 2 min bei 72 °C und anschließend 30 s bei 93 °C umfasste, dann 28 Zyklen, wobei jeder Zyklus 30 s bei 55 °C und anschließend 90 s bei 72 °C und anschließend 30 s bei 93 °C umfasste, und schließlich ein Zyklus, der 30 s bei 55 °C und anschließend 10 min bei 72 °C und anschließend 1 min bei 25 °C umfasste.
PCR-Produkte wurden gereinigt und unter Verwendung von EcoRI und XhoI verdaut und dann zur Sequenzcharakterisierung in einen Bluescript-Vektor subkloniert. Es wurde ermittelt, dass einer der PCR-Klone für eine P450-Sequenz codierte und er wurde als Sonde zur Isolierung eines cDNA-Klons voller Länge verwendet. Diese Nucleotidsequenz ist in SEQ ID NO: 19 angegeben. SEQ ID NO: 19 wies Ähnlichkeit mit anderen Mitgliedern der 2C-Familie von P450-Genen auf. Insbesondere zeigt SEQ ID NO: 19 im Durchschnitt 40 % Identität mit den humanen und Ratten-Arachidon-Epoxygenasesequenzen unter Verwendung des BLAST-Programms.
Ferner wurde gezeigt, dass das SEQ ID NO: 19-Transkript in Samen von Euphorbia lagascae, jedoch nicht in Wurzeln oder Blättern exprimiert wird (5B). Das SEQ ID NO: 19-Transkript wurde in sich entwickelnden Samen von Vernonia galamensis, jedoch nicht in denen von E. cyparissis oder Flachs, zwei Arten, die keine Epoxyfettsäuren produzieren, detektiert (5A und 5B).
In einem alternativen Ansatz, der zur Klonierung von Epoxygenasegenen von Euphorbia lagascae unternommen wurde, wurde eine subtraktive Hybridisierungsstrategie zur Isolierung von Genen, die spezifisch in einem Organismus, der hohe Konzentrationsmengen an Epoxyfettsäuren produziert, exprimiert werden, verwendet.
Insbesondere wurde das in 6 beschriebene subtraktive Hybridisierungsverfahren zur Isolierung von Epoxygenasegenen, die spezifisch in Euphorbia lagascae, die hohe Konzentrationsmengen der Epoxyfettsäure Vernolsäure produziert, (Beispiel 1) und nicht in der nahe verwandten Art Euphorbia cyparissus, die keine Vernolsäure produziert, exprimiert werden, verwendet.
Entsprechend wurde mRNA aus sich entwickelnden Embryos von Euphorbia lagascae in einem Stadium, in dem sie aktiv Vernolsäure synthetisieren, isoliert und zur Erzeugung sogenannter "Tester"-cDNA verwendet. Zusätzlich wurde mRNA aus den sich entwickelnden Embryos von E. cyparissis (in einem ähnlichen Entwicklungsstadium wie E. lagascae) isoliert und zur Erzeugung so genannter "Treiber"-cDNA verwendet.
Das subtraktive Hybridisierungsverfahren führte zu einer Bibliothek, die an Sequenzen, die ausschließlich in Euphorbia lagascae exprimiert wurden, angereichert war. Klone aus dieser Bibliothek wurden sequenziert und mindestens zwei Sequenzen wurden auf der Basis der Ähnlichkeit mit anderen P450-Sequenzen in der Datenbank als für P450-Proteine codierend identifiziert. Diese zwei P450-PCR-Klone wurden als Sonden zur Isolierung der entsprechenden cDNA-Klone voller Länge aus der früher angegebenen cDNA-Bibliothek verwendet.
Eine der isolierten P450-cDNAs, die die in SEQ ID NO: 20 angegebene Nucleotidsequenz umfasste, schien in Geweben von Euphorbia lagascae exprimiert zu werden (7B) und keine homologen Transkripte wurden in Samengewebe von E. cyparissus oder Flachs, zwei Arten, die keine Epoxyfettsäuren produzieren, detektiert. Die abgeleitete Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 20 zeigt, dass der cDNA-Klon von voller Länge ist und für ein P450-Enzym codiert. Diese Daten legen nahe, dass die cDNA, für die SEQ ID NO: 20 ein Beispiel ist, für eine Epoxygenase, beispielsweise die Linoleat-ρ12-Epoxygenase, die Linolsäure in Vernolsäure umwandelt, codieren kann.
BEISPIEL 5
Demonstration der Epoxygenaseaktivität
Die Bestätigung, dass die cDNA-Klone, die ein Beispiel für die Erfindung sind, Epoxygenaseaktivitäten codieren, wurde durch Transformation von Arabidopsis thaliana, die keine Epoxyfettsäuren, insbesondere Vernolsäure, produziert, mit jedem individuellen Kandidatenklon und die Untersuchung von transformiertem Gewebe auf das Vorhandensein von epoxygenierten Fettsäuren, die sie sonst produzieren würden, oder auf Hydroxyfettsäuren, die durch die Metabolisierung einer epoxygenierten Fettsäure durch die Wirkung endogener Epoxidhydrolasen gebildet werden könnten, (Blee und Schuber, 1990) erhalten.
Die Epoxygenase-cDNA, die SEQ ID NO: 1 umfasste, wurde in das in 8 angegebene binäre Vektorkonstrukt kloniert. Kurz gesagt wurde die cDNA-Sequenz von dem pCpal2-Plasmid (1) in das binäre Plasmid durch Verdau von pCpal2 mit EcoRI und Auffüllen der Enden des Restriktionsfragments unter Verwendung von T4-DNA-Polymeraseenzym subkloniert. Der binäre Vektor (8) wurde unter Verwendung von BamHI linearisiert und ebenfalls unter Verwendung von T4-DNA-Polymerase an den Enden aufgefüllt. Für die Endauf füllungsreaktionen wurde 1 μg cDNA-Insert oder DNA des linearisierten binären Vektors in 50 μl T4-DNA-Polymerasepuffer (33 mM Tris-Acetat, pH 7,9, 66 mM Kaliumacetat, 10 mM Magnesiumacetat und 5 mM DDT), der mit 100 mM jedes dNTP und 0,1 mg/ml BSA und 3 Einheiten T4-DNA-Polymerase ergänzt war, resuspendiert und während 6 min Inkubation bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Erhitzen bei 75 °C während 10 min gestoppt. Die glattendig gemachte cDNA und DNA des binären Vektors wurden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase und Standardligationsbedingungen gemäß der Empfehlung von Promega ligiert. Klone wurden ausgewählt, in denen die Sequenz SEQ ID NO: 1 hinter dem Napin-Promotor in Sense-Orientierung insertiert war, wodurch die Expression des Epoxygenasepolypeptids möglich war. Das binäre Plasmid, das SEQ ID NO: 1 in Sense-Orientierung funktional unter der Kontrolle des verkürzten Napin-Promotors beherbergt, ist schematisch in 9 dargestellt.
Das in 9 angegebene binäre Plasmid wurde unter Verwendung von Elektroporation in den Agrobacterium-Stamm AGLI transformiert und zur Transformation von Arabidopsis thaliana verwendet. Transgene A. thaliana-Pflanzen wurden nach dem Verfahren gemäß der Beschreibung bei Valvekens et al. (1988) und Dolferus et al. (1994) erhalten.
Transgene Pflanzen und nichttransformierte (d.h. Kontroll-) Pflanzen wurden bis zur Reife gezüchtet. Reife Samen jeder Pflanze wurden durch Standardtechniken bezüglich der Fettsäurezusammensetzung analysiert. Primärtransformanten(T₀)pflanzen wurden festgestellt und T1-Samen wurde von jeder Pflanze geerntet und bezüglich Fettsäurezusammensetzung durch Gaschromatographie analysiert. Für zwölf T₀-Pflanzen wurde gezeigt, dass sie Vernolsäure in ihren T1-Samenlipiden mit Konzentrationen im Bereich von 0,9 % bis 15,8 % der gesamten Fettsäuren enthielten, während nicht transformierte Kontrollpflanzen keine Vernolsäure enthielten (Tabelle 5). Die am stärksten exprimierende Pflanzenlinie war Cpal-17, wofür die GLC-Elutionsprofile (durch Analyse gepackter Säulen und Kapillarsäulenanalyse) in 10 angegeben sind. Das GLC-Elutionsprofil von einer gepackten Säule für die nichttransformierte Kontrolle ist ebenfalls in 10 angegeben. TABELLE 5 Vernolsäuremengen in transgenen A. thaliana-Linien, die SEQ ID NO: 1 exprimieren
Alternativ oder zusätzlich werden hierin beschriebene vermutliche Fettsäureepoxygenasesequenzen jeweils in Linum usitatissimum (Flachs) und Arabidopsis thaliana unter der Kontrolle des samenspezifischen Napin-Promotors transformiert. Transgene Flachs- und Arabidopsis thaliana-Pflanzen werden auf das Vorhandensein von Epoxyfettsäuren in Ölen von sich entwickelnden Samen untersucht. Frühere Arbeiten zeigten, dass, wenn Epoxyfettsäuren sich entwickelnden Flachsembryos zugeführt werden, diese in Triglyceride eingebaut werden (Beispiel 10).
Alternativ werden Hefen ebenfalls mit den Epoxygenaseklonen der Erfindung transformiert und auf die Produktion von Epoxyfettsäuren getestet.
BEISPIEL 6
Massenspektroskopische Bestätigung von Epoxyfettsäuren in T₁-Arabidopsis-Samen, die von primären T₀-transgenen-Pflanzen hervorgebracht wurden
Gaschromatographie der Methylester, die von Samenlipiden von T1-Samen von Cpal2-transformierten Arabidopsis thaliana-Pflanzen präpariert wurden, (Beispiel 5) zeigte das Vorhandensein von zwei zusätzlichen Fettsäuren im Vergleich zu den nichttransformierten Kontrollen. Die erste dieser Verbindungen wies eine Retentionszeit auf, die äquivalent der eines Vernolsäurestandards war. Die zweite Verbindung wies eine längere Retentionszeit auf und wurde vermutlich als 12,13-Epoxy-9,15-octadecadiensäure, ein erwartetes Derivat von Vernolsäure infolge der Desaturierung an der ρ15-Position durch die endogene ρ15-Desaturase von Arabidopsis thaliana, identifiziert.
Die Bestätigung der exakten Identität der zwei Peaks wurde durch Massenspektroskopie von Diolen, die aus der Epoxyfettsäurefraktion, die von Cpal2-transformierten Pflanzen stammte, präpariert wurden, erhalten. Die Diole wurden weiter in Trimethylsilylether umgewandelt und durch GC-MS DB23 auf einer Quarzglaskapillarsäule (Hewlett-Packard 5890 II GC gekoppelt an ein Hewlett Packard 5989A MS, das mit Elektronenstoß bei 70eV15 arbeitet) analysiert. Das Gesamtionenchromatogramm zeigte die folgenden zwei Peaks:

(i) Der als erstes eluierte Peak wies auffallende Ionen der Masse 73, 172, 275 und 299 auf, was anzeigte, dass die Epoxygruppe am C-12 einer C18-Fettsäure positioniert war und dass eine Doppelbindung zwischen der Epoxygruppe und dem Carboxylterminus auftrat. Dieses Massenspektrum war mit dem Spektrum eines Trimethylsilyletherderivats von Diolen, die aus reiner Vernolsäure (12,13-Epoxy-9-octadecensäure) hergestellt wurden, identisch; und
(ii) der als zweites eluierte Peak wies auffällige Ionen der Masse 73, 171, 273 und 299 auf, was das Vorhandensein von zwei Doppelbindungen und einer Epoxygruppe, die am C-12 einer C18-Fettsäure positioniert ist, anzeigte, was mit dem Massenspektrum für 12,13-Epoxy-9,15-octadecadiensäure konsistent ist.

BEISPIEL 7
Fettsäureanalyse von Cpal2-transgenen Arabidopsis-Pflanzen
Der T1-Samen, der von transformierten Arabidopsis thaliana-Pflanzen stammte, der den Cpal2-cDNA-Klon unter der Kontrolle des Napin-Promotors exprimierte, wurde keimen gelassen und T1-Pflanzen wurden ausgehend von fünf T₀-Linien (Nr. 4, 8, 13, 17 & 21 in Tabelle 5) etabliert. Der T2-Samen wurde von jeder T1-Pflanze geerntet und auf die Fettsäurezusammensetzung analysiert. Die Nachkommen der Transformanten Nr. 4, 8, 13 und 21 (Tabelle 5) trennten sich wie erwartet bezüglich des Vorhandenseins von Vernolsäure auf, wobei diese Pflanzen Vernolsäure im Bereich bis zu 3,1 % enthielten (Tabelle 6).
Alle T1-Pflanzen, die Vernolsäure enthielten, (d.h. Epoxy 18:1 in Tabelle 6) enthielten auch 12,13-Epoxy-9,15-octadecadiensäure (d.h. Epoxy 18:2 in Tabelle 6, siehe auch 11), was anzeigt, dass ein Teil der durch die Cpal2-Epoxygenase synthetisierten Vernolsäure anschließend durch die endogene ρ15-Desaturase desaturiert wurde. TABELLE 6 Fettsäurezusammensetzung von selbstentwickelten Samen, die auf T₁-Pflanzen hervorgebracht wurden, die von fünf primären Cpal2-Transformanten von Arabidopsis thaliana stammten
BEISPIEL 8
Fettsäureanalyse von Cpal2-transgenen Linola-Pflanzen
Das oben beschriebene binäre Plasmidkonstrukt, das den Cpal2-cDNA-Klon umfasste, (9) wurde in den Agrobacterium tumefaciens-Stamm AGL1 unter Verwendung von Elektro poration transformiert. Das transformierte A. tumefaciens wurde zur Infektion von Linum usitatissimum var. Eyre-Explantaten gemäß der Beschreibung von Lawrence et al. (1989) verwendet, wobei jedoch MS-Medium als das Basismedium zur Induktion von Wurzeln an regeneriertem Schösslingsmaterial verwendet wurde.
Für zwei primäre Linola-Transformanten (T0-Pflanzen) der Bezeichnung AP20 und AP21 wurde durch PCR unter Verwendung von Primern, die gegen das Cpal2-Gen gerichtet waren, und durch Zeigen, dass diese Pflanzen kanamycinresistent waren, bestätigt, dass sie transgen sind. Zehn T1-Samen von jeder Pflanze wurden individuell bezüglich der Fettsäurezusammensetzung unter Verwendung von Standardtechniken analysiert.
Wie in Tabelle 7 gezeigt ist, trennten sich Samen von AP20 in 3 Klassen auf, die aus drei Samen ohne Vernolsäure, zwei mit mehr als 0,7 % Vernolsäure und fünf mit mittleren Konzentrationsmengen (0,13–0,47 %) Vernolsäure bestanden.
In ähnlicher Weise trennten sich Samen von AP21 in 3 Klassen auf, die aus fünf Samen ohne Vernolsäure, zwei mit mehr als 0,25 % Vernolsäure und drei mit einer mittleren Konzentrationsmenge (0,09–0,14 %) Vernolsäure bestanden (Tabelle 8).
Daher wurden insgesamt zwölf Samen erhalten, die Vernolsäure enthielten. Acht von den zwölf AP20- und AP21-Samen, die Vernolsäure enthielten, enthielten auch 12,13-Epoxy-9,15-octadecadiensäure. TABELLE 7 Fettsäurezusammensetzung von 10 individuellen T1-Samen von der Linola-Cpal2-Primärtransformanten AP20
TABELLE 8 Fettsäurezusammensetzung von 10 individuellen T1-Samen von der Linola-Cpal2-Primärtransformanten AP21
Vier T1-Pflanzen wurden aus den kanamycinresistenten Schösslingen von AP20 etabliert. Für alle vier Pflanzen wurde anschließend gezeigt, dass sie Vernolsäure in deren T2-Samen produzieren (Tabelle 9). Die Konzentrationsmengen von 18:2-Epoxyfettsäuren wurden in diesen T2-Samen nicht analysiert. TABELLE 9 Fettsäurezusammensetzung von T2-Samen der Linola-Cpal2-T1-Nachkommen von AP20

na = nicht analysiert

BEISPIEL 9
Produktion von Epoxyfettsäuren in transgenen Organismen
Die Produktion eines an Vernolsäure reichen Öls wurde durch Transformation des hierin beschriebenen Epoxygenasegens, insbesondere SEQ ID NO: 1, in Arabidopsis thaliana gemäß der Beschreibung in den vorhergehenden Beispielen erreicht. Wie in Tabelle 5 angegeben ist, produzieren transgene A. thaliana-Linien, die SEQ ID NO: 1 exprimieren, in ihren Samen hohe Konzentrationsmengen an Vernolsäure, in Bezug auf andere Fettsäuren. Insbesondere beträgt in einer transgenen Linie (Cpal-17) die produzierte Vernolsäure die große Menge von 15,2 % (Gew/Gew) des Gesamtsamenfettsäuregehalts.
Die Produktion eines an Vernolsäure reichen Öls wird auch durch Transformation des hierin beschriebenen Epoxygenasegens, beliebig eines von SEQ ID NO: 1, 3, 5, 19, oder 20 und vorzugsweise beliebig eines von SEQ ID NO: 1 oder 3 oder 5, in einen ölanreichernden Organismus, der normaler weise sehr hohe Konzentrationsmengen an Linolsäure und minimal andere konkurrierende Enzymaktivitäten mit der Fähigkeit zur Verwendung von Linolsäure als Substrat aufweist, erreicht. Die Gensequenzen der Erfindung werden funktional unter die Kontrolle eines Promotors, der eine hochgradige Expression in Ölsamen hervorruft, beispielsweise den samenspezifischen Napin-Promotor, gestellt.
In einem alternativen Ansatz zur Transformation von A. thaliana werden Genotypen mit hohem Linolgehalt von Flachs, Sonnenblume, Mais oder Saflor mit der Epoxygenase der Erfindung transformiert. Hohe Konzentrationsmengen an Vernolsäure werden durch die transgenen Pflanzen während der Samenölsynthese produziert, wenn das Epoxygenasegen in hohen Graden exprimiert wird.
Alternativ wird Linola^®(= wenig Linolensäure)-Flachs mit der Epoxygenase der Erfindung transformiert. Hohe Konzentrationsmengen an Vernolsäure werden durch die transgenen Linola^®-Flachspflanzen während der Samenölsynthese produziert, wenn das Epoxygenasegen in hohen Graden exprimiert wird.
Ferner zeigten die Erfinder, dass markierte Vernolsäure, die sich entwickelnden Flachssamen zugeführt wird, nicht abgebaut wird, sondern in Speicherlipide in allen drei Positionen des Triglyceridmoleküls eingebaut wird (siehe Beispiel 10). Konsistent mit diesen Daten werden hohe Konzentrationsmengen an Vernolsäure, die durch die eingeführte Epoxygenase synthetisiert werden, in den Samenöltriglyceriden dieser Art ohne weiteres deponiert.
BEISPIEL 10
Einbau von Ölsäure und Vernolsäure in die Lipide von sich entwickelnden Leinsamenkotyledonen
Abgelöste, sich entwickelnde Leinsamenkotyledonen (sechs Paare bei jeder Inkubation, doppelte Inkubationen) im mittleren Stadium der Samenentwicklung (20 Tage nach dem Blühen) wurden mit 10 nmol der Ammoniumsalze von entweder [1-¹⁴C]Vernolsäure (spezifische Aktivität 3000 dpm/nmol) oder [1-¹⁴C]Ölsäure (spezifische Aktivität 5000 dpm/nmol) in 0,2 ml Phosphatpuffer, pH 7,2, 30 min bei 30 °C inkubiert. Die Kotyledonen wurden dann dreimal mit 1 ml destilliertem Wasser gespült und entweder unmittelbar in einer Ultra Turrax gemäß Bligh und Dyer (1959) extrahiert oder des weiteren in 0,5 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,2, 90 oder 270 min vor der Extraktion inkubiert. Ein Aliquot der Lipide in der Chloroformphase wurde methyliert und auf Silicagel-DC-Platten in n-Hexan/Diethylether/Essigsäure (85:15:1) getrennt. Der Rest der Lipide in der Chloroformphase jeder Probe wurde auf zwei getrennte Silicagel-DC-Platten appliziert und die Platten wurden in Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser (85:15:10:3,5, bezogen auf das Volumen) zur Auftrennung polarer Lipide und in n-Hexan/Diethylether/Essigsäure (60:40:1,5) zur Auftrennung neutraler Lipide entwickelt. Lipidbereiche mit einer Migration, die authentischen Standards entsprach, wurden entfernt und die Radioaktivität in jedem Lipid wurde durch Flüssigszintillationszählung quantitativ bestimmt.
Die Rückgewinnung der ¹⁴C-Markierung in der Chloroformphase ist in 12 angegeben. Etwas mehr als die Hälfte der zugegebenen Radioaktivität von sowohl [¹⁴C]Ölsäure als auch [¹⁴C]Vernolsäure wurde durch die Kotyledonen aufgenommen und als lipophile Substanzen nach der Pulsmarkierung von 30 min zurückgewonnen. Diese Menge blieb während der weiteren 270 min Inkubation mit beiden Substraten tatsächlich unverändert. Die Auftrennung radioaktiver Methylester von den Lipiden zeigte, dass der größte Teil der Radioaktivität (92 %) von [¹⁴C]Vernolsäure-Zufuhrexperimenten in Verbindungen mit der gleichen Wanderung wie Methylvernoleat lag, was anzeigt, dass die Epoxygruppe in den Leinsamenkotyledonen über die 270 min Inkubation intakt blieb.
Etwa 28 % der Aktivität von der Zufuhr von [¹⁴C]Vernolsäure, die in der Chloroformphase vorhanden war, fanden sich in Phosphatidylcholin nach 30 min und die Radioaktivität nahm auf nur 5 % nach 300 min Inkubation ab (13).
Etwa 22 % der Aktivität von der Zufuhr von [¹⁴C]Ölsäure, die in der Chloroformphase vorhanden war, fanden sich in Phosphatidylcholin nach 30 min und die Radioaktivität nahm auf etwa 11 % nach 300 min Inkubation ab (13).
Etwa 32 % der Aktivität von der Zufuhr von [¹⁴C]Vernolsäure, die in der Chloroformphase vorhanden war, fanden sich nach 30 min in Triacylglycerinen und die Radioaktivität nahm auf über 60 % nach 300 min Inkubation zu (14). Die Diacylglycerine enthielten etwa 24 % der Aktivität in den [¹⁴C]Vernolsäure-Zufuhrexperimenten und diese Menge blieb über die Inkubationsperioden ziemlich konstant.
Etwa 5 % der Aktivität von der Zufuhr von [¹⁴C]Ölsäure, die in der Chloroformphase vorhanden war, fanden sich nach 30 min in Triacylglycerinen und die Radioaktivität nahm auf 18 nach 300 min Inkubation zu (14). Die Diacylglycerine enthielten etwa 19 % der Aktivität in den [¹⁴C]Ölsäure-Zufuhrexperimenten und diese Menge blieb über die Inkubationsperioden ziemlich konstant.
Das obige Experiment zeigt, dass Leinsamenkotyledonen die Epoxygruppe von Vernolsäure nicht in großem Ausmaß metabolisieren. Es zeigt ferner, dass Leinsamenkotyledonen Mechanismen zur effizienten Entfernung von Vernolsäure aus Mem branlipiden und zum Einbau derselben in Triacylglyceride besitzen.
BEISPIEL 11
Klonierung von ρ12-Epoxygenasegenen aus andere Epoxysäuren enthaltenden Arten
Homologa des Cpal-ρ12-Epoxygenasegens werden von anderen Arten, die an Epoxyfettsäuren reich sind, durch Klonieren der Mitglieder der Genfamilie von ρ12-Monooxygenasen gemischter Funktion, die in sich entwickelnden Samen hoch exprimiert werden, und Vergleichen von deren Aminosäuresequenz mit denen bekannter ρ12-Desaturase- und ρ12-Epoxygenasesequenzen erhalten. Derartige Gene werden entweder durch Screening von cDNA-Bibliotheken von sich entwickelnden Samen mit Gensonden auf der Basis von entweder dem Cpal2-Gen (SEQ ID NO: 1) oder dem D12V-Fragment (SEQ ID NO: 7) oder durch Amplifikation von PCR-Fragmenten unter Verwendung von Primern, die gegen konservierte Sequenzen der ρ12-Monooxygenasen gemischter Funktion von Pflanzen gestaltet sind, wie hierin beschrieben, kloniert. Vermutliche ρ12-Epoxygenasesequenzen zeigen eine größere Gesamtsequenzidentität mit den hierin offenbarten ρ12-Epoxygenasesequenzen als den bekannten ρ12-Desaturasesequenzen.
In einem Beispiel für diese Ansatz wurde eine einer ρ12-Epoxygenase voller Länge ähnliche Sequenz von einer nichtidentifizierten Crepis sp., die hohe Konzentrationsmengen an Vernolsäure in deren Samenölen enthielt und von der bekannt ist, dass sie nicht Crepis palaestina ist, erhalten. Poly(A)+RNA wurde aus sich entwickelnden Samen dieser Crepis sp. unter Verwendung eines QuickPrep Micro mRNA Purification Kit (Pharmacia Biotechnology) isoliert und zur Synthese einer Oligosaccharid-d(T)-primed doppel strängigen cDNA verwendet. Die auf diese Weise erhaltene doppelsträngige cDNA wurde dann mit EcoR1/NotI-Adaptoren (Pharmacia Biotechnology) ligiert und eine cDNA-Bibliothek wurde unter Verwendung des ZAP-cDNA Gigapack Cloning Kit (Stratagene) konstruiert. Die cDNA-Bibliothek auf Hybond N+-Membranfiltern (Amersham) wurde mit dem statistisch markierten D12V-Fragment (SEQ ID NO: 7), das von Crepis alpina stammte, gemäß der Vorschrift des Herstellers unter Verwendung von Standardhybridisierungsbedingungen gescreent. Dies führte zur Reinigung eines rekombinanten Bakteriophagen der Bezeichnung CrepX.
Die Nucleotidsequenz der CrepX-cDNA wurde bestimmt und ist in SEQ ID NO: 3 angegeben. Die abgeleitete Aminosäuresequenz von CrepX (SEQ ID NO: 4) umfasst ein Protein von 374 Aminosäuren mit 97 % Identität mit der Cpal2-ρ12-Epoxygenasesequenz, jedoch nur 57 % Identität mit der L26296-ρ12-Desaturasesequenz von Arabidopsis thaliana. Dies zeigt klar das Vorhandensein eines Gens in einer anderen Crepis sp., die einen hohen Vernolsäuregehalt aufweist, wobei dieses Gen stark homolog zu dem Cpal2-ρ12-Epoxygenasegen ist und deutlich kein Desaturasegen ist.
In einem zweiten Beispiel für diesen Ansatz wurde eine partielle, ρ12-Epoxygenase ähnliche Sequenz aus der Vernolsäure enthaltenden Art Vernonia galamensis erhalten. Erststrang-cDNA-Template wurden von Gesamt-RNA, die aus sich entwickelnden Samen von V. galamensis isoliert wurde, unter Verwendung von Standardverfahren hergestellt.
Ein PCR-Fragment (einer Länge von 550 Nucleotiden) der Bezeichnung Vgal1 wurde durch Amplifikation der einzelsträngigen cDNA unter Verwendung von Primern, die von der abgeleiteten Aminosäuresequenz von Monooxygenasen gemischter Funktion von Pflanzen abgeleitet wurden, erhalten. Die Nucleotidsequenz der amplifizierten DNA wurde unter Verwendung von Standardverfahren bestimmt und ist in SEQ ID NO: 5 angegeben.
Das Alignment der abgeleiteten Aminosäuresequenz des Vgal1-PCR-Fragments (SEQ ID NO: 6) mit der vollen Sequenz von Cpal2-ρ12-Epoxygenase und der L26296-ρ12-Desaturase von Arabidopsis thaliana (2) zeigt, dass die amplifizierte Vgal1-Sequenz für eine Aminosäuresequenz codiert, die der die Aminosäurereste 103–285 umspannenden Region des Cpal2-Polypeptids entspricht. In dieser Region zeigte die Vgal1-Sequenz größere Aminosäureidentität mit der Cpal2-ρ12-Epoxygenasesequenz (67 %) als mit der ρ12-Desaturasesequenz von A. thaliana (60 %), was nahe legt, dass die amplifizierte DNA eher einer Epoxygenase- als einer Desaturasesequenz entspricht.
Dem Fachmann ist klar, dass die vorliegende Erfindung anderen Variationen und Modifikationen als den speziell hier beschriebenen unterzogen werden kann. Es ist klar, dass die Erfindung alle derartigen Varianten und Modifikationen umfasst. Die Erfindung umfasst auch alle Stufen, Merkmale, Zusammensetzungen und Verbindungen, auf die in dieser Beschreibung individuell oder kollektiv verwiesen wurde oder die angegeben sind, und alle möglichen Kombinationen von beliebigen zwei oder mehreren der Stufen oder Merkmale.
LITERATURSTELLEN

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das eine Epoxygenase codiert oder komplementär zu einem eine Epoxygenase codierenden isolierten Nucleinsäuremolekül ist, wobei die Epoxygenase ein Monooxygenasepolypeptid gemischter Funktion ist, das zur Katalyse der Epoxygenierung einer Kohlenstoffbindung in einem Fettsäuremolekül fähig ist, wobei die Epoxygenase eine Aminosäuresequenz mit den drei histidinreichen Motiven: (i) His-(Xaa)_3-4-His, (ii) His-(Xaa)_2-3-His-His und (iii) His-(Xaa)_2-3-His-His umfasst.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei die Kohlenstoffbindung eine Doppelbindung in einem ungesättigten Fettsäuremolekül ist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Epoxygenase ein Δ6-Epoxygenaseenzym, Δ9-Epoxygenaseenzym, Δ12-Epoxygenaseenzym oder Δ15-Epoxygenaseenzym ist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das von einer Pflanze abgeleitet ist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 4, wobei die Pflanze aus der Liste, die Crepis spp., Euphorbia spp., Chrysanthemum spp. und Vernonia spp. umfasst, ausgewählt ist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 4, wobei die Pflanze hohe Konzentrationsmengen an Vernolsäure produziert.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 5, wobei die Pflanze aus der Liste, die Crepis biennis, Crepis aurea, Crepis conyzaefolia, Crepis intermedia, Crepis occidentalis, Crepis palaestina, Crepis vesicaria, Crepis xacintha und Vernonia galamensis umfasst, ausgewählt ist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die zu mindestens etwa 65 % identisch mit einer der Sequenzen SEQ ID NO: 1, 3 oder 5 oder einer zu diesen komplementären Sequenz ist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 8, das zur Hybridisierung unter Bedingungen einer mindestens mäßigen Stringenz mit mindestens 20 fortlaufenden Nucleotiden, die in einer der Sequenzen SEQ ID NO: 1, 3 oder 5 oder einer zu diesen komplementären Sequenz enthalten sind, fähig ist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 9, das die in SEQ ID NO: 1, 3 oder 5 angegebene Nucleotidsequenz oder eine zu diesen komplementäre Nucleotidsequenz oder mindestens 20 fortlaufende Nucleotide derselben umfasst.
Genkonstrukt, das das isolierte Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 10 funktional mit einer Promotorsequenz verbunden umfasst, wobei das Nucleinsäuremolekül in Sense- oder Antisense-Orientierung, bezogen auf die Richtung der In-vivo-Transkription eines natürlich vorkommenden Epoxygenasegens einer Monooxygenase gemischter Funktion, transkribiert werden kann.
Verfahren zur Änderung der Konzentrationsmenge von Epoxyfettsäuren in einer Zelle, einem Gewebe, Organ, nichthumanen Organismus oder Mikroorganismus, wobei das Verfahren die Einführung eines Sense-, Antisense-, Ribozym- oder Cosuppressionsmoleküls, das das isolierte Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 10 umfasst, in eine Zelle, ein Gewebe, Organ oder einen nichthumanen Organismus und die Inkubation der Zelle über einen Zeitraum und unter Bedingungen, die so ausreichend sind, dass eine Expression des Sense-, Antisense-, Ribozym- oder Cosuppressionsmoleküls erfolgt, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Stufe der Einführung des Sense-, Antisense-, Ribozym- oder Cosuppressionsmoleküls eine stabile Transformation der Zelle, des Gewebes, Organs oder nichthumanen Organismus mit dem Sense-, Antisense-, Ribozym- oder Cosuppressionsmolekül umfasst.
Verfahren zur Produktion eines rekombinanten, enzymatisch aktiven Epoxygenasepolypeptids einer Monooxygenase gemischter Funktion in einer Zelle, wobei das Verfahren das Kultivieren einer Zelle, die das isolierte Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 10 umfasst, über einen Zeitraum und unter Bedingungen, die so ausreichend sind, dass eine Expression erfolgt, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, das die zusätzliche erste Stufe einer Transformation der Zelle mit dem isolierten Nucleinsäuremolekül umfasst.
Verfahren zur Produktion eines rekombinanten, enzymatisch aktiven Epoxygenasepolypeptids einer Monooxygenase gemischter Funktion in einer Zelle, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst: (i) Produzieren eines Genkonstrukts, das das isolierte Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 10, das funktional unter die Kontrolle eines Promotors mit der Fähigkeit, die Expression der Gensequenz in der Zelle zu bewirken, und optional eines Expression-Enhancerelements gestellt wurde, umfasst; (ii) Transformieren des Genkonstrukts in die Zelle und (iii) Selektieren von Transformanten, die eine durch die Gensequenz codierte funktionale Epoxygenase in hohem Grade exprimieren.
Verfahren zur Produktion eines rekombinanten, enzymatisch aktiven Epoxygenasepolypeptids einer Monooxygenase gemischter Funktion in einer transgenen Pflanze, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst: (i) Produzieren eines Genkonstrukts, das das isolierte Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 10, das funktional unter die Kontrolle eines samenspezifischen Promotors und optional eines Expression-Enhancerelements gestellt wurde, umfasst, wobei die Gensequenzen auch strangaufwärts einer Transkriptionsterminatorsequenz platziert wurden; (ii) Transformieren des Genkonstrukts in eine Zelle oder ein Gewebe der Pflanze; und (iii) Selektieren von Transformanten, die eine durch die Gensequenz codierte funktionale Epoxygenase in hohem Grade in Samen exprimieren.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Pflanze eine Ölsamenart ist, die normalerweise hohe Konzentrationsmengen an Linolsäure produziert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 oder 18, wobei die Pflanze aus der Liste, die Linola^®-Flachs, Ölraps, Sonnenblume, Saflor, Sojabohne, Leinsamen, Sesam, Baumwollsamen, Erdnuss, Ölbaum oder Ölpalme umfasst, ausgewählt ist.
Rekombinantes Epoxygenasepolypeptid einer Monooxygenase gemischter Funktion, das gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 19 produziert wurde.
Rekombinantes Epoxygenasepolypeptid einer Monooxygenase gemischter Funktion nach Anspruch 20, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die in einer der Sequenzen SEQ ID NO: 2, 4 oder 6 angegeben ist oder die zu mindestens etwa 50 % mit diesen identisch ist.
Verfahren zur Produktion einer epoxygenierten Fettsäure in einer Zelle, einem Gewebe, Organ, nichthumanen Organismus oder Mikroorganismus, wobei das Verfahren das Inkubieren einer Zelle, eines Gewebes, Organs oder eines nichthumanen Organismus, die das rekombinante Polypeptid nach Anspruch 20 oder 21 exprimieren, mit einem Fettsäuresubstrat über einen Zeitraum und unter Bedingungen, die so ausreichend sind, dass mindestens eine Kohlenstoffbindung des Substrats in eine Epoxygruppe umgewandelt wird, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das Fettsäuresubstrat eine ungesättigte Fettsäure ist und die Kohlenstoffbindung des Substrats, die epoxygeniert wird, eine Kohlenstoffdoppelbindung ist.
Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, wobei das Fettsäuresubstrat aus der Liste, die Palmitoleinsäure, Ölsäure, Linolsäure, Linolensäure, 9,15-Octadecadiensäure und Arachidonsäure umfasst, ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 24, wobei die Kohlenstoffbindung, die epoxygeniert wird, eine Δ6-Kohlenstoffbindung oder Δ9-Kohlenstoffbindung oder Δ12-Kohlenstoffbindung oder Δ15-Kohlenstoffbindung ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 25, wobei die epoxygenierte Fettsäure, die produziert wird, Vernolsäure ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 26, das die zusätzliche erste Stufe der Transformation oder Transfektion der Zelle, des Gewebes, Organs oder nichthumanen Organismus mit einem Nucleinsäuremolekül, das die rekombinante Epoxygenase einer Monooxygenase gemischter Funktion codiert, umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 27, wobei die Zelle, das Organ, Gewebe oder der nichthumane Organismus, in denen die rekombinante Epoxygenase einer Monooxygenase gemischter Funktion exprimiert wird, von einem Bakterium, einer Hefe, einem Pilz, einem Schimmelpilz, Insekt, einer Pflanze, einem Vogel oder einem nichthumanen Säuger stammt.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei die Hefe, Pflanze, der Pilz oder Schimmelpilz eine ölhaltige Hefe, Pflanze, ein ölhaltiger Pilz oder Schimmelpilz ist.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Pflanze eine Ölsaatpflanze ist, die die rekombinante Epoxygenase einer Monooxygenase gemischter Funktion normalerweise nicht in hohem Grade exprimiert.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Ölsaatpflanze aus der Liste, die Linola^®-Flachs, Ölraps, Sonnenblume, Saflor, Sojabohne, Leinsamen, Sesam, Baumwollsamen, Erdnuss, Ölbaum oder Ölpalme umfasst, ausgewählt ist.
Pflanze, die mit dem isolierten Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 10 transformiert ist, oder eine Zelle, ein Gewebe oder Organ, die davon abgeleitet sind, oder Nachkommen der Pflanze, die ebenfalls das Nucleinsäuremolekül umfassen.
Transformierte Pflanze, die zur Expression des rekombinanten Polypeptids nach den Ansprüchen 20 oder 21 fähig ist, oder eine Zelle, ein Gewebe oder Organ, die davon abgeleitet sind, oder die Nachkommen der Pflanze, die ebenfalls zur Expression des rekombinanten Polypeptids fähig sind.
Pflanze oder eine Zelle, ein Gewebe oder Organ, die davon abgeleitet sind, oder Nachkommen derselben nach den Ansprüchen 32 oder 33, die bzw. das Linola^®-Flachs, Ölraps, Sonnenblume, Saflor, Sojabohne, Leinsamen, Sesam, Baumwollsamen, Erdnuss, Ölbaum oder Ölpalme ist oder davon abgeleitet ist.
Pflanze oder eine Zelle, ein Gewebe oder Organ, die davon abgeleitet sind, oder Nachkommen derselben nach Anspruch 32 oder 33, die bzw. das Arabidopsis thaliana oder Linum usitatissimum ist oder davon abgeleitet ist.