ES2275301T3 - Genes de apoxigenasa vegetal de acido graso y la utilizacion de estos genes. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere de forma general a nuevas secuencias genéticas que codifican a la encima epoxigenasa de ácido graso. En particular la invención se refiere a unas secuencias genéticas que codifican la enzima 12-epoxigenasa de ácido graso que comprende las funciones mixtas de enzimas de monooxigenasas. En particular, la presente invención proporciona las secuencias de cADN que codifican las epoxigenasas de los ácidos grasos de las plantas, en particular la 12- epoxigenasa Crepis palaestina y derivados homólogos y análogos de éstos. Las secuencias genéticas de la presente invención proporcionan los medios por las que se puede alterar o manipular el metabolismo de los ácidos grasos en organismos tales como levaduras, mohos, bacterias, insectos, aves, mamíferos y plantas, y en particular para convertir los ácidos grasos insaturados a ácidos grasos epoxigenados. La invención se extiende a organismos genéticamente modificados que acumulan aceite y transformados con estas secuencias genéticas y a los aceites obtenidos de estos organismos. Los aceites así producidos permiten obtener materias primas convenientemente ventajosas para una producción eficaz de revestimientos, resinas, colas, plásticos, tensioactivos y lubricantes, etc.

Description

Genes de epoxigenasa vegetal de ácido graso y la utilización de estos genes.

La presente invención se relaciona generalmente con nuevas secuencias genéticas que codifican a las enzimas epoxigenasas de ácido graso. En particular, la presente invención se relaciona con secuencias genéticas que codifican a las enzimas \Delta12-epoxigenasas de ácido graso como se las define aquí. Más particularmente, la presente invención provee ADNc y secuencias genómicas de genes que codifican epoxigenasas vegetales de ácido graso, preferiblemente a las \Delta12-epoxigenasas de Crepis palaestina o Euphorbia lagascae. Las secuencias genéticas de la presente invención proveen los medios por medio de los cuales se puede alterar o manipular el metabolismo del ácido graso en organismos tales como levaduras, mohos, bacterias, insectos, aves, mamíferos y plantas, en particular para convertir allí dentro ácidos grasos insaturados en ácidos grasos epoxigenados. La invención se extiende a los organismos modificados genéticamente que acumulan aceite transformados con las secuencias genéticas objetivo y a los aceites derivados de allí. Los aceites producidos así proveen los medios para utilizar las materias primas con mayor rentabilidad en la producción eficiente de recubrimientos, resinas, encolados, plásticos, tensoactivos y lubricantes, entre otros.

A lo largo de estas especificaciones y de las reivindicaciones que van a continuación, a menos que el contexto lo requiera de otra manera, la palabra "comprender", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", se entenderá que implican la inclusión de un número entero establecido o grupos de enteros pero no la exclusión de ningún otro entero o grupo de enteros.

Los detalles bibliográficos de las publicaciones mencionadas por el autor en esta descripción están reunidos a final de la misma. Los números de identificación de la secuencia (SEQ. ID. NO.), para las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos mencionadas en la descripción, están definidos después de la bibliografía.

Antecedentes de la invención

Existe un interés considerable en todo el mundo en la producción de materias primas químicas, tales como ácidos grasos, para uso industrial a partir de fuentes vegetales renovables en vez de fuentes petroquímicas no renovables. Este concepto es muy atractivo para los fabricantes y consumidores sobre la base de la conservación de los recursos y provee una oportunidad significativa para la agricultura para desarrollar nuevos cultivos industriales.

Existe una gran diversidad de ácidos grasos inusuales en la naturaleza que han sido bien caracterizados (Badam & Patil, 1981; Smith, 1970). Muchos de estos ácidos grasos inusuales tienen potencial industrial y esto ha conducido a un gran interés en la domesticación de tales especies para permitir la producción agrícola de ácidos grasos particulares.

Una clase de ácidos grasos de interés particular son los ácidos grasos epóxidos, que consisten de una cadena acílica en la cual dos enlaces de carbono adyacentes están unidos por medio de un puente epóxico. Debido a su gran reactividad, ellos tienen considerable aplicación en la producción de recubrimientos, resinas, encolados, plásticos, tensoactivos y lubricantes. Estos ácidos grasos son actualmente producidos por medio de epoxidación química de aceites vegetales, principalmente aceite de soja y aceite de linaza, sin embargo, este proceso produce mezclas de formas múltiples e isómeras e involucra costos de procesamiento significativos.

Se están haciendo ensayos por parte de otros grupos para desarrollar algunas plantas silvestres que contienen ácidos grasos epóxidos (por ejemplo, Euphorbia lagascae, Vernonia galamensis) para convertirlas en fuentes comerciales de estos aceites. Sin embargo, los problemas relacionados con la adaptabilidad agronómica y el bajo potencial productivo limitan severamente la utilidad comercial de los cultivos de plantas tradicionales y de acceso a los cultivos.

El rápido incremento en la sofisticación de la tecnología de ADN recombinante facilita grandemente la eficiencia de los procesos industriales de importancia comercial, por medio de la expresión de genes aislados a partir de un primer organismo o especie en un segundo organismo o especie para conferirle nuevos fenotipos. Más particularmente, los procesos industriales convencionales pueden hacerse más eficientes o más rentables, dando como resultado un mayor rendimiento por unidad de costo por medio de la aplicación de técnicas de ADN recombinante.

Además, la escogencia apropiada de organismos huéspedes para la expresión de una secuencia genética de interés provee lo necesario para la producción de compuestos que no son normalmente producidos o sintetizados por el huésped, con alto rendimiento y pureza.

Sin embargo, a pesar de la efectividad general de la tecnología de ADN recombinante, el aislamiento de las secuencias genéticas que codifican enzimas importantes en el metabolismo de ácido graso, en particular los genes que codifican a las enzimas \Delta12-epoxigenasas de ácido graso responsables de la producción del ácido 12,13-epoxi-9-octadecenóico (ácido vernólico) y del ácido 12,13-epoxi-9,15-octadecadienóico, entre otros, permanece como un obstáculo mayor para el desarrollo de organismos genéticamente modificados por ingeniería genética que producen a estos ácidos grasos.

Hasta la presente invención, existían únicamente datos bioquímicos limitados que indicaban la naturaleza de las enzimas epoxigenasas de ácido graso, en particular las \Delta12-epoxigenasas. Sin embargo, en Euphorbia lagascae, la formación del ácido 12,13-epoxi-9-octadecenóico (ácido vernólico) a partir del ácido linoleico parece ser catalizado por una enzima \Delta12-epoxigenasa que depende del citocromo P450 (Bafor y colaboradores, 1993; Blee y colaboradores, 1994). Adicionalmente, el desarrollo de semillas de plantas de linaza tiene la capacidad de convertir el ácido vernólico añadido al ácido 12,13-epoxi-9,15-octadecadienóico por medio de una \Delta15 desaturasa endógena (Engeseth y Stymne, 1996). Los ácidos grasos epóxidos pueden ser producidos también por medio de una peroxigenasa que depende de peróxido en los tejidos de la planta (Blee y Schuber, 1990).

En los trabajos que condujeron a la presente invención, los inventores buscaron aislar secuencias genéticas que codifiquen genes que sean importantes para la producción de ácidos grasos epóxidos, tales como el ácido 12,13-epoxi-9,15-octadecadienóico y transferir estas secuencias genéticas dentro de plantas de semillas oleaginosas altamente productivas y/o de otros organismos que acumulan aceite.

Resumen de la invención

Un aspecto de la invención provee una molécula aislada de ácido nucleico que codifica o es complementaria a una molécula aislada de ácido nucleico que codifica a una epoxigenasa de ácido graso.

Un segundo aspecto de la invención provee una molécula aislada de ácido nucleico que hibrida al menos bajo condiciones poco rigurosas al menos hasta 20 nucleótidos contiguos de las SEQ ID NOs: 1 ó 3 ó 5 ó 19 ó 20, o una secuencia complementaria de la misma.

Un aspecto adicional de la invención provee una molécula aislada de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 65% idéntica a la SEQ ID NO: 1 ó 3 ó 5 que es al menos 75% idéntica a al menos 200 nucleótidos contiguos en las SEQ ID NOs: 19 ó 20, o una secuencia complementaria de la misma.

Un aspecto adicional de la invención provee una construcción genética que comprende a la molécula aislada de ácido nucleico supra, ya sea en orientación sentido o antisentido, en conexión operable con una secuencia del
promotor.

Un aspecto adicional de la invención provee un método para alterar el nivel de ácidos grasos epóxidos en una célula, tejido, órgano u organismo, dicho método comprendiendo la expresión de una molécula cosupresora o molécula de ribozima sentido o antisentido que comprenden a la molécula aislada de ácido nucleico supra en dicha célula durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para que se incremente o se reduzca el nivel de ácidos grasos epóxidos allí dentro.

Un aspecto adicional de la invención provee un método para producir un polipéptido de una epoxigenasa recombinante enzimáticamente activa en una célula, dicho método comprendiendo la expresión de la molécula aislada de ácido nucleico supra en dicha célula durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para que se produzca la epoxigenasa codificada por esta.

Un aspecto adicional de la invención provee un método para producir un polipéptido de una epoxigenasa recombinante enzimáticamente activa en una célula, dicho método comprendiendo las etapas de:

(i)

producir una construcción genética que comprende a la molécula aislada de ácido nucleico supra colocada operablemente bajo el control de un promotor capaz de conferir expresión sobre dicha secuencia genética en dicha célula, y opcionalmente un elemento reforzador de la expresión;

(ii)

transformar dicha construcción genética dentro de dicha célula; y

(iii)

seleccionar los transformantes que expresen una epoxigenasa funcional codificados por la secuencia genética en un nivel alto.

Un aspecto aún adicional de la invención provee un método para producir un polipéptido de una epoxigenasa recombinante enzimáticamente activa en una planta transgénica que comprende las etapas de:

(i)

producir una construcción genética que comprende a la molécula aislada de ácido nucleico supra colocada operablemente bajo el control de un promotor específico para la semilla y opcionalmente un elemento reforzador de la expresión, en donde dichas secuencias genéticas están colocadas también secuencia arriba de una secuencia de terminación de la transcripción;

(ii)

transformar dicha construcción genética dentro de una célula o tejido de dicha planta; y

(iii)

seleccionar los transformantes que expresen una epoxigenasa funcional codificados por la secuencia genética en un nivel alto en las semillas.

Un aspecto adicional de la invención provee un polipéptido de una epoxigenasa recombinante o molécula funcional de una enzima.

\newpage

Un aspecto adicional de la invención provee una epoxigenasa recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NOs: 2 ó 4 ó 6 o un homólogo, análogo o derivado de las mismas que es al menos aproximadamente 50% idéntico a las mismas.

Un aspecto aún adicional de la invención provee un método para producir un ácido graso epoxigenado en una célula, tejido, órgano u organismo, dicho método comprendiendo incubar una célula, tejido, órgano u organismo que expresa a una epoxigenasa recombinante enzimáticamente activa con un sustrato de ácido graso y preferiblemente, un sustrato insaturado de ácido graso, durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para que un carbono enlazado, preferiblemente un carbono doblemente enlazado, de dicho sustrato sea convertido en un grupo epoxi.

Un aspecto adicional de la invención provee una molécula inmunológicamente interactiva que se enlaza al polipéptido de la epoxigenasa recombinante descrito aquí o a un homólogo, análogo o derivado del mismo.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una representación lineal de un plásmido de expresión que comprende a un gen estructural de la epoxigenasa, colocado operativamente bajo el control del promotor truncado de la napina (FP1; casilla sombreada a mano derecha) y colocado secuencia arriba de la secuencia terminal NOS (casilla punteada a mano derecha). La secuencia genética de la epoxigenasa se indica por medio de la casilla rectangular sin relleno a mano derecha. La construcción también comprende al promotor NOS (casilla sombreada a mano izquierda) que dirige la expresión del gen NPTII (casilla sin relleno a mano izquierda) y colocado secuencia arriba del terminal NOS (casilla punteada a mano izquierda). También se indican las secuencias en el margen derecho y el margen izquierdo del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens.

La Figura 2 es una representación esquemática mostrando el alineamiento de las secuencias de aminoácidos del polipéptido de la epoxigenasa de Crepis palaestina (Cpa12; SEQ ID NO: 2), una epoxigenasa adicional derivada de una Crepis sp. diferente de la C. palaestina que produce niveles altos de ácido vernólico (CrepX; SEQ ID NO: 4), una secuencia parcial de aminoácidos de un polipéptido de epoxigenasa derivado de Vernonia galamensis (Vgal1; SEQ ID NO: 6), la secuencia de aminoácidos de la \Delta12 acetilenasa de Crepis alpina (Crep1; SEQ ID NO: 8), las \Delta12 desaturasas de A. thatiana (L26296; SEQ ID NO: 9), Brassica juncea (X91139; SEQ ID NO: 10), Glycine max (L43921; SEQ ID NO: 11), Solanum commersonii (X92847; SEQ ID NO: 12) y Glycine max (L43920; SEQ ID NO: 13), y la \Delta12 hidroxilasa de Ricinos communis (U22378, SEQ ID NO: 14). Los subrayados son tres motivos ricos en histidina que se conservan en monoxigenasas de función mezclada que no contienen hemo.

La Figura 3 es una copia de una representación fotográfica de una hibridación de transferencias de northern que muestra la expresión específica de la semilla del gen de la epoxigenasa de Crepis palaestina ejemplificada por la SEQ ID NO: 1. El análisis de las transferencias de Northern del ARN total de las hojas (senda 1) y de semillas en desarrollo (senda 2) de Crepis palaestina. Se corrieron 15 \mug de ARN total sobre un gel de Northern y se transfirieron sobre membranas Hybond N^{+} de Amersham de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La transferencia se hibridó a 60ºC con una sonda elaborada a partir de la región 3' no traducida de la SEQ ID NO: 1. La transferencia fue lavada dos veces en 2 x SSC (búfer de Citrato de Sodio-NaCl) a temperatura ambiente durante 10 minutos, luego en 0,1 x SSC a 60ºC durante 20 minutos.

La Figura 4 es una representación esquemática que muestra la secuencia de nucleótidos del iniciador PCR degenerado (dirección 5'a 3') utilizada para aislar los genes de la epoxigenasa de Euphorbia lagascae descritos aquí.

La Figura 5 es una copia de una representación fotográfica de una hibridación de una transferencia de ARN con forma de punto que muestra la expresión del gen de la epoxigenasa ejemplificado en la SEQ ID NO: 3 en plantas que producen ácido vernólico comparado con plantas que no producen ácido vernólico. Se aisló 1 \mug de ARN total a partir del tejido especificado y del punto transferido sobre la membrana Hybond N^{+} de Amersham de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La transferencia fue hibridada a 42ºC en formamida al 50% con la sonda relevante marcada con ^{32}P elaborada a partir de la SEQ ID NO: 3 durante 16 horas. Las transferencias fueron lavadas dos veces en 2 x SSC (búfer de Citrato de Sodio-NaCl) a temperatura ambiente y luego en 0,5 x SSC a 55ºC durante 20 minutos. Se obtuvieron autorradiografías después de una exposición durante la noche. El panel A muestra el ARN total a partir de la semilla en desarrollo de Euphorbia lagascae (1), Euphorbia cyparissus (2), Vermonia galamensis (3), y de lino (Linum usitatissimum) (4). El panel B muestra el ARN total de diferentes tejidos de Euphorbia lagascae, incluida la semilla en desarrollo (1), raíz (2) y hoja (3).

La Figura 6 es una representación esquemática que muestra el método de hibridación sustractiva utilizado para aislar los genes de la epoxigenasa de Euphorbia lagascae descritos aquí. El conjunto de +6ADNc consistió predominantemente de secuencias tipo proteína para almacenamiento de semilla. Se biotinilaron un conjunto de 15 tales secuencias y se restaron adicionalmente del +6ADNc. LH = Hibridación Larga - 20 horas; SH = Hibridación Corta - 3 horas.

La Figura 7 es una copia de una representación fotográfica de una hibridación de una transferencia de ARN con forma de punto que muestra la expresión del gen de la epoxigenasa ejemplificado en la SEQ ID NO: 20 en plantas que producen ácido vernólico comparado con plantas que no producen ácido vernólico. Se aisló 1 \mug de ARN total a partir del tejido especificado y del punto transferido sobre la membrana Hybond N^{+} de Amersham de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La transferencia fue hibridada a 42ºC en formamida al 50% con la sonda relevante marcada con ^{32}P elaborada a partir de la SEQ ID NO: 20 durante 16 horas. Las transferencias fueron lavadas dos veces en 2 x SSC (búfer de Citrato de Sodio-NaCl) a temperatura ambiente y luego en 0,5 x SSC a 55ºC durante 20 minutos. Se obtuvieron autorradiografías después de una exposición durante la noche. El panel A muestra el ARN total a partir de la semilla en desarrollo de Euphorbia lagascae (1), Euphorbia cyparissus (2), Vermonia galamensis (3), y de lino (Linum usitatissimum) (4). El panel B muestra el ARN total de diferentes tejidos de Euphorbia lagascae, incluida la semilla en desarrollo (1), raíz (2) y hoja (3).

La Figura 8 es una representación esquemática de un vector de plásmido binario que contiene un casete de expresión que comprende un promotor truncado específico para semilla de napina (Napina) y un terminal de nopalina sintasa (NT), con un sitio para clonación BamHI entre ellos, además del gen para resistencia a la kanamicina NPTII conectado operativamente a las secuencias del promotor de la nopalina sintasa (NP) y del terminal de la nopalina sintasa (NT). El casete de expresión está flanqueado por secuencias de T-ADN en el borde izquierdo (LB) y en el borde derecho (RB).

La Figura 9 es una representación esquemática de un vector plásmido binario que contiene un casete de expresión que comprende a la SEQ ID NO: 1 localizado operativamente bajo el control de un promotor truncado específico para semilla de napina (Napina) y secuencia arriba del terminal de la nopalina sintasa (NT), además del gen de resistencia a la kanamicina NPTII conectado operativamente a las secuencias del promotor de la nopalina sintasa (NP) y del terminal de la nopalina sintasa (NT). El casete de expresión está flanqueado por secuencias de T-ADN en el borde izquierdo (LB) y en el borde derecho (RB). Para producir esta construcción, se inserta la SEQ ID NO: 1 dentro del sitio BamHI del vector binario expuesto en la Figura 8.

La Figura 10 es una representación gráfica de trazas en cromatografía gaseosa de ésteres metílicos de ácido graso preparados a partir de semillas oleaginosas de plantas no transformadas de Arabidopsis thaliana [panel (a)], o plantas de A. thaliana (línea transgénica Cpal-17) que han sido transformadas con la SEQ ID NO: 1 utilizando la construcción genética expuesta en la Figura 9 [paneles (b) y (c)]. En los paneles (a) y (b), se separaron los ésteres metílicos de ácido graso utilizando columnas empacadas para separación. En el panel (c), los ésteres metílicos de ácido graso se separaron utilizando una columna capilar para la separación. Se indican las posiciones para la elusión del ácido vernólico.

La Figura 11 es una representación gráfica que muestra la distribución de la unión de los ácidos grasos epóxidos en semilla autogama sobre plantas T_{1} de plantas Arabidopsis thaliana transformadas con Cpal2 como se determinó utilizando cromatografía gaseosa. Los niveles tanto del ácido vernólico (eje x) como del ácido 12,13-epoxi-9,15-octadecadienóico (eje y) se determinaron y se graficaron en relación el uno con el otro. Los datos muestran una correlación positiva entre los niveles de estos ácidos grasos en plantas transgénicas.

La Figura 12 es una representación gráfica que muestra la incorporación de la etiqueta con ^{14}C dentro de la fase en cloroformo obtenida a partir de la extracción de lípidos de la cotiledóneas de linaza durante la alimentación del sustrato marcado. Símbolos utilizados: \blacklozenge, alimentación con ácido oleico [^{14}C]; \blacksquare, alimentación con ácido vernólico [^{14}C].

La Figura 13 es una representación gráfica que muestra la incorporación de la etiqueta con ^{14}C dentro de la fosfatidilcolina de cotiledóneas de la linaza durante la alimentación del sustrato marcado. Símbolos utilizados: \blacklozenge, alimentación con ácido oleico [^{14}C]; \blacksquare, alimentación con ácido vernólico [^{14}C].

La Figura 14 es una representación gráfica que muestra la incorporación de la etiqueta con ^{14}C dentro de triacilgliceroles de cotiledóneas de la linaza durante la alimentación del sustrato marcado. Símbolos utilizados: \blacklozenge, alimentación con ácido oleico [^{14}C]; \blacksquare, alimentación con ácido vernólico [^{14}C].

Descripción detallada de las modalidades preferidas

Un aspecto de la presente invención provee una molécula aislada de ácido nucleico que codifica o es complementaria a una molécula aislada de ácido nucleico que codifica a una epoxigenasa de ácido graso.

En donde la molécula aislada de ácido nucleico de la invención codifica a una enzima que está involucrada en la epoxidación directa del ácido araquidónico, se prefiere particularmente que la molécula de ácido nucleico objetivo se derive de una fuente que no sea de mamífero.

Como se lo utiliza aquí, el término "derivado de" se lo debe utilizar para indicar que un entero particular o grupo de enteros se ha originado a partir de las especies especificadas, pero no ha sido necesariamente obtenido directamente a partir de la fuente especificada.

El término "fuente diferente a la de los mamíferos" se refiere a cualquier organismo diferente a la de un mamífero o un tejido o célula derivada de los mismos.

En el presente contexto, el término "derivado de una fuente diferente a la de los mamíferos" se lo debe utilizar para indicar que un entero particular o grupo de enteros se han derivado a partir de bacterias, levaduras, aves, anfibios, reptiles, insectos, plantas, mohos, mohos y algas u otros no mamíferos.

En una modalidad preferida de la presente invención, el organismo fuente es cualquiera de tales organismos que posean la capacidad genética para sintetizar ácidos grasos epóxidos. Más preferiblemente, el organismo fuente es una planta tal como, pero no limitada a Chrysanthemum spp., Crepis spp, Euphorbia spp., y Vernonia spp., entre otros.

Aún más preferiblemente, el organismo fuente se selecciona de la lista que comprende Crepis biennis, Crepis aurea, Crepis conyzaefolia, Crepis intermedia, Crepis occidentalis, Crepis palaestina, Crepis vesicaria, Crepis xacintha, Euphorbia lagascae y Vernonia galamensis. Otras especies no están excluidas.

En una modalidad particularmente preferida de la presente invención, el organismo fuente es un Crepis sp. que contiene niveles altos de ácido vernólico tales como Crepis palaestina, entre otros o alternativamente, Vernonia galamensis o Euphorbia lagascae.

En donde la molécula aislada de ácido nucleico de la invención codifica a una enzima \Delta6-epoxigenasa o \Delta9-epoxigenasa o una enzima \Delta12-epoxigenasa o \Delta15-epoxigenasa, o al menos codifique a una enzima que no está involucrada en la epoxidación directa de ácido araquidónico, se puede derivar la molécula de ácido nucleico objetivo a partir de cualquier fuente que produzca dicha enzima, incluyendo, pero no limitándose a, levaduras, mohos, bacterias, insectos, aves, mamíferos y plantas.

La molécula de ácido nucleico de la invención de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores puede ser ADN, tal como un gen, molécula de ADNc, molécula de ARN o una molécula de oligonucleótido sintético, ya sea monocatenaria o bicatenaria e independientemente de cualquiera de las características de la estructura secundaria a menos que se haya establecido específicamente.

La referencia que se hace aquí a un "gen" se toma en su contexto más amplio e incluye:

(i)

un gen genómico clásico que consiste de secuencias reguladoras transcripcionales y/o de traducción y/o de una región de codificación y/o de secuencias no traducidas (esto es, intrones, secuencias no traducidas 5' y 3'); o

(ii)

ARNm o ADNc correspondiente a las regiones de codificación (esto es, exones) y a las secuencias no traducidas 5' y 3' del gen.

El término "gen" es también utilizado para describir moléculas sintéticas o de fusión que codifican todo o parte de un producto funcional. Los genes preferidos de la epoxigenasa de la presente invención se pueden derivar a partir de un gen de epoxigenasa de ocurrencia natural por medio de técnicas recombinantes estándar. Generalmente, un gen de epoxigenasa puede ser sometido a mutagénesis para producir sustituciones, supresiones y/o adiciones de nucleótidos, múltiples o sencillas.

Los derivados insercionales de nucleótidos incluyen fusiones terminales 5' y 3' así como inserciones intrasecuencia de nucleótidos múltiples o sencillos. Las variantes de la secuencia insercional de nucleótidos son aquellas en las cuales uno o más nucleótidos son introducidos en un sitio predeterminado en la secuencia de nucleótidos aunque la inserción aleatoria también es posible con una evaluación selectiva adecuada del producto resultante.

Las variantes de supresión se caracterizan por la remoción de uno o más nucleótidos de la secuencia.

Las variantes por sustitución de nucleótidos son aquellas en las cuales al menos un nucleótido en la secuencia ha sido removido y se ha insertado un nucleótido diferente en su lugar. Tal sustitución puede ser "silenciosa" por cuanto la sustitución no cambia al aminoácido definido por el codón. Alternativamente, los sustituyentes están diseñados para alterar un aminoácido por otro aminoácido que actúe en forma similar, o por un aminoácido con carga, polaridad o hidrofobicidad similar.

En el contexto de la presente invención, el término "epoxigenasa de ácido graso" debe entenderse que se refiere a cualquier enzima o derivado enzimáticamente activo o equivalente funcional de la misma que catalice la biosíntesis de un ácido graso epoxigenado, por medio de la conversión de un enlace carbonado de un ácido graso en un grupo epoxi y preferiblemente, por medio de la conversión de un enlace carbonado doble de un ácido graso insaturado en un grupo epoxi. Aunque no limita la invención, una epoxigenasa de ácido graso puede catalizar la biosíntesis de un ácido graso epóxico seleccionado de la lista que comprende al ácido 12,13-epoxi-9-octadecenóico (ácido vernólico), al ácido 12,13-epoxi-9,15-octadecadienóico, al ácido 15,16-epoxi-9,12-octadecadienóico, al ácido 9,10-epoxi-12-octadecenóico, y al ácido 9,10-epoxi-octadecanóico, entre otros.

El término "epoxi", "grupo epoxi" y "residuo epoxi" será conocido por aquellos capacitados en el arte para referirse a un anillo de tres miembros que comprende dos átomos de carbono y un átomo de oxígeno enlazados por medio de enlaces sencillos como sigue:

1

Por lo tanto, el término "epóxido" se refiere a compuestos que comprenden al menos un grupo epoxi como se definió aquí anteriormente.

Aquellos capacitados en el arte saben que la nomenclatura de ácidos grasos se basa en la longitud de la cadena carbonada y en la posición de los átomos de carbono insaturados dentro de aquella cadena carbonada. Por lo tanto, los ácidos grasos se diseñan utilizando la notación taquigráfica:

Carbono_{total}: dobles enlaces_{totales}^{posición \ de \ los \ dobles \ enlaces(\Delta)},

en donde los dobles enlaces son cis a menos que se indique otra cosa. Por ejemplo, el ácido palmítico (ácido n-hexadecanóico) es un ácido graso saturado de 16 átomos de carbono (esto es, 16:0), ácido oleico (ácido octadecenóico) es un ácido graso insaturado de 18 átomos de carbono con un doble enlace entre C-9 y C-10 (esto es, 18:1^{\Delta 9}), y el ácido linoleico (ácido octadecadienóico) es un ácido graso insaturado de 18 átomos de carbono con dos dobles enlaces entre C-9 y C-10 y entre C-12 y C-13 (esto es, 18:2^{\Delta 9,12}).

Sin embargo, en el presente contexto una enzima epoxigenasa puede catalizar la conversión de cualquier enlace de carbono a un grupo epoxi o alternativamente, la conversión de cualquier doble enlace en un sustrato de ácido graso insaturado a un grupo epoxi. En este sentido, aquellos capacitados en el arte saben que la mayoría de los ácidos grasos monoinsaturados de organismos superiores son ácidos grasos insaturados de 18 átomos de carbono con al menos uno de los dobles enlaces localizados allí entre C-9 y C-10. Adicionalmente, las bacterias también procesan a los ácidos grasos monoinsaturados de 16 átomos de carbono. Además, la epoxigenasa de la presente invención puede actuar sobre más de una molécula sencilla de sustrato de ácido graso y, en consecuencia, la presente invención no está limitada por la naturaleza de la molécula de sustrato sobre la cual actúa la enzima epoxigenasa objetivo.

Preferiblemente, la molécula de sustrato para la epoxigenasa de la presente invención es un ácido graso insaturado que contiene al menos un doble enlace.

Además, las enzimas epoxigenasas pueden actuar sobre cualquier cantidad de átomos de carbono en cualquier molécula de sustrato. Por ejemplo, ellas se pueden caracterizar como enzimas \Delta6-epoxigenasa, \Delta9-epoxigenasa, \Delta12-epoxigenasa o \Delta15-epoxigenasa, entre otras. Por lo tanto, la presente invención no está limitada por la posición del átomo de carbono en el sustrato sobre el cual puede actuar una enzima epoxigenasa.

El término "\Delta6-epoxigenasa" como se lo utiliza aquí debe entenderse que se refiere a una enzima epoxigenasa que cataliza la conversión del enlace de carbono \Delta6 de un sustrato de ácido graso a un grupo epoxi \Delta6 y preferiblemente, cataliza la conversión del doble enlace \Delta6 de al menos un ácido graso insaturado a un grupo epoxi \Delta6.

El término "\Delta9-epoxigenasa" como se lo utiliza aquí debe entenderse que se refiere a una enzima epoxigenasa que cataliza la conversión del enlace de carbono \Delta9 de un sustrato de ácido graso a un grupo epoxi \Delta9 y preferiblemente, cataliza la conversión del doble enlace \Delta9 de al menos un ácido graso insaturado a un grupo epoxi \Delta9.

Como se lo utiliza aquí, el término "\Delta12-epoxigenasa" debe entenderse que se refiere a una enzima epoxigenasa que cataliza la conversión del enlace de carbono \Delta12 de un sustrato de ácido graso a un grupo epoxi \Delta12 y preferiblemente, cataliza la conversión del doble enlace \Delta12 de al menos un ácido graso insaturado a un grupo epoxi \Delta12.

Como se lo utiliza aquí, el término "\Delta15-epoxigenasa" debe entenderse que se refiere a una enzima epoxigenasa que cataliza la conversión del enlace de carbono \Delta15 de un sustrato de ácido graso a un grupo epoxi \Delta15 y preferiblemente, cataliza la conversión del doble enlace \Delta15 de al menos un ácido graso insaturado a un grupo epoxi \Delta15.

La presente invención claramente se extiende a secuencias genéticas que codifican a todas las enzimas epoxigenasas enlistadas supra, entre otras.

En una modalidad preferida de la invención, la molécula aislada de ácido nucleico codifica a una enzima epoxigenasa de ácido graso que convierte al menos un enlace de carbono en ácido palmitoleico (16:1^{\Delta 9}), ácido oleico (18:1^{\Delta 9}), ácido linoleico (18:2^{\Delta 9,12}), ácido linolénico (18:3^{\Delta 9,12,15}), o ácido araquidónico (20:4^{\Delta 5,8,11,14}) a un enlace epoxi. Preferiblemente, el enlace de carbono es un doble enlace de carbono.

Más preferiblemente, la molécula aislada de ácido nucleico de la invención codifica a una enzima epoxigenasa de ácido graso que convierte al menos uno o ambos dobles enlaces en el ácido linoleico en un grupo epoxi. De acuerdo con esta modalidad, una epoxigenasa que convierte tanto al doble enlace \Delta9 como al doble enlace \Delta12 del ácido linoleico en un grupo epoxi, puede catalizar tales conversiones independientemente una de la otra de tal forma que dicha epoxigenasa es una enzima \Delta9-epoxigenasa y/o una \Delta12-epoxigenasa como se definió aquí anteriormente.

En una modalidad alternativa preferida, la epoxigenasa de ácido graso de la presente invención es una \Delta12-epoxigenasa, una \Delta15-epoxigenasa o una \Delta9-epoxigenasa como se definió aquí anteriormente.

Más preferiblemente, la epoxigenasa de ácido graso de la invención es una \Delta12-epoxigenasa como s definió aquí anteriormente.

En una modalidad particularmente preferida de la invención, se provee una molécula aislada de ácido nucleico que codifica a la linoleato \Delta12-epoxigenasa, la enzima que convierte al menos al doble enlace \Delta12 del ácido linoléico en un grupo \Delta12-epoxi, produciendo por lo tanto al ácido 12,13-9-octadecenóico (ácido vernólico).

Aunque no limita a la presente invención, la fuente preferida de la \Delta12-epoxigenasa de la invención es una planta, en particular Crepis palaestina o una Crepis sp. adicional que es distinta de C. palaestina pero que contiene niveles altos de ácido vernólico, Vernonia galamensis o Euphorbia lagascae.

De acuerdo a esta modalidad, una \Delta12-epoxigenasa puede catalizar la conversión de ácido palmitoleico en ácido 9,10-epoxi-palmítico y/o la conversión de ácido oleico en ácido 9,10-epoxi-esteárico y/o la conversión de ácido linoleico en uno cualquiera o más de los ácidos 9,10-epoxi-12-octadecenóico ó 12,13-epoxi-9-octadecenóico ó 9,10,12,13-diepoxi-esteárico, y/o la conversión de ácido linolénico en uno cualquiera o más de los ácidos 9,10-epoxi-12,15-octadecadienóico ó 12,13-epoxi-9,15-octadecadienóico ó 15,16-epoxi-octadecadienóico ó 9,10,12,13-diepoxi-15-octadecenóico ó 9,10,15,16-diepoxi-12-octadecenóico ó 12,13,15,16-diepoxi-9-octadecenóico ó 9,10,12,13,15,16-triepoxi-esteárico y/o la conversión del ácido araquidónico en uno cualquiera o más de los ácidos 5,6-epoxi-8,11,14-tetracosatrienóico ó 8,9-epoxi-5,11,14-tetracosatrienóico ó 11,12-epoxi-5,8,14-tetracosatrienóico ó 14,15-epoxi-5,8,11-tetracosatrienóico ó 5,6,8,9-diepoxi-11,14-tetracosadienóico ó 5,6,11,12-diepoxi-8,14-tetracosadienóico ó 5,6,14,15-diepoxi-8,11-tetracosadienóico ó 8,9,11,12-diepoxi-5,14-tetracosadienóico o 8,9,14,15-diepoxi-5,11-tetracosadienóico ó 11,12,14,15-diepoxi-5,8-tetracosadienóico ó 5,6,8,9,11,12-triepoxi-14-tetracosenóico ó 5,6,8,9,14,15-triepoxi-11-tetracosenóico ó 5,6,11,12,14,15-triepoxi-8-tetracosenóico ó 8,9,11,12,14,15-triepoxi-5-tetracosenóico, entre otros.

Aquellos capacitados en el arte pueden saber que no todos los sustratos enlistados supra se pueden derivar de una fuente natural, pero a pesar de esto, pueden ser producidos por medio de síntesis química. La conversión tanto del ácido graso insaturado sintetizado químicamente como del de ocurrencia natural en ácidos grasos epóxidos está dentro del alcance de la presente invención, siendo el único requisito el que la molécula de ácido nucleico de la presente invención como la descrita aquí codifique a una enzima o parte funcional de la misma que sea capaz de catalizar dicha conversión.

De acuerdo a la discusión anterior, aquellos capacitados en el arte sabrán que una epoxigenasa de ácido graso puede ser una enzima monoxigenasa que depende del citocromo P450 o de una enzima monoxigenasa de función mixta o alternativamente de una enzima peroxigenasa que depende de peróxido, o una enzima similar, entre otras. Sin embargo, la presente invención está dirigida particularmente a aquellas enzimas epoxigenasas que son enzimas monoxigenasas de función mixta y a moléculas de ácido nucleico que codifican a las mismas y los usos para estas. Por lo tanto, se prefiere particularmente que la molécula de ácido nucleico de la invención codifique a una epoxigenasa de ácido graso que es una enzima monoxigenasa de función mixta.

En el contexto de la presente invención, el término "enzima monoxigenasa de función mixta" se debe tomar como referencia a cualquier enzima que catalice la epoxigenación de un enlace de carbono o de un doble enlace de carbono en una molécula de ácido graso, en donde dicha enzima comprende además una secuencia de aminoácidos que contiene tres regiones ricas en histidina como sigue:

	(i)	His-(Xaa)_{3-4}-His;
	(ii)	His-(Xaa)_{2-3}-His-His; y
	(iii)	His-(Xaa)_{2-3}-His-His,

en donde His designa histidina, Xaa designa a cualquier residuo aminoácido de ocurrencia natural como se expone aquí en la Tabla 1, el entero (Xaa)_{3-4} se refiere a una secuencia de aminoácidos que comprende tres o cuatro repeticiones de Xaa, y el entero (Xaa)_{2-3} se refiere a una secuencia de aminoácidos que comprende dos o tres repeticiones de Xaa.

El término "tipo enzima monoxigenasa de función mixta" se debe tomar como referencia a cualquier enzima que comprenda tres de las regiones ricas en histidina enlistadas supra.

En la ejemplificación de la invención descrita aquí, los inventores han demostrado que la secuencia de aminoácidos de la Crepis palaestina proveída aquí comprende una enzima \Delta12-epoxigenasa que incluye los motivos de la secuencia de aminoácidos característica de una enzima monoxigenasa de función mixta como se definió aquí anteriormente. La cercana identidad de la secuencia de aminoácidos entre la enzima \Delta12-epoxigenasa de C. palaestina (SEQ ID NO: 2) y las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos derivados de una Crepis sp. no identificada y una Vernonia galamensis como la proveída aquí (SEQ ID NOs: 4 y 6), comparada con las secuencias de aminoácidos de otras monoxigenasas de función mixta tal como las desaturasas y las hidroxilasas, sugiere que dichas secuencias de aminoácidos de Crepis sp. y V. galamensis son también enzimas epoxigenasa de ácido graso y pueden ser enzimas \Delta12-epoxigenasa. En este sentido, la secuencia de aminoácidos de Vernonia galamensis ejemplificada aquí, es una secuencia parcial que comprende solamente un motivo completo rico en histidina (esto es, His-Arg-Asn-His-His) y una secuencia parcial del primer motivo rico en histidina (esto es, comprende a los dos últimos residuos de histidina del motivo His-Glu-Cys-Gly-His-His), ya que la secuencia de nucleótidos correspondiente que codifica a la misma fue amplificada por medio de la reacción en cadena de la polimerasa como una secuencia parcial de ADNc, utilizando un primer iniciador para este primer motivo rico en histidina y un segundo iniciador de amplificación diseñado para una región secuencia arriba del tercer motivo rico en histidina (esto es, His-Val-Met-His-His). Adicionalmente, el hecho de que la secuencia de V. galamensis fuera amplificada utilizando un iniciador específico para el primer motivo rico en histidina indica que la secuencia de longitud completa correspondiente comprendería también a este motivo.

Por lo tanto, en una modalidad preferida particular, la molécula de ácido nucleico de la invención codifica a una enzima epoxigenasa monoxigenasa de función mixta o una enzima similar derivada de Crepis spp., incluida la Crepis palaestina o alternativamente, derivada de Vernonia galamensis. De acuerdo a esta modalidad, se prefiere aún más que la epoxigenasa objetivo comprenda al menos una secuencia de aminoácidos que contiene tres o más regiones ricas en histidina como sigue:

	(i)	His-Glu-Cys-Gly-His-His	(SEQ ID NO: 15);
	(ii)	His-Arg-Asn-His-His	(SEQ ID NO: 16); y
	(iii)	His-Val-Met-His-His	(SEQ ID NO: 17),

o un homólogo, análogo o derivado de las mismas, en donde His designa histidina, Glu designa glutamato, Cys designa cisteína, Gly designa glicina, Arg designa arginina, Asn designa asparagina, Val designa valina, Met designa metionina.

La presente invención claramente se extiende a los genes de la epoxigenasa derivados de otras especies, incluidos los genes de la epoxigenasa derivados de Chrysanthemum spp. y Euphorbia lagascae, entre otros.

En una modalidad preferida, aun cuando no limita a la presente invención, los genes de la epoxigenasa de otras especies que son abarcadas por la presente invención codifican a las enzimas monoxigenasas de función mixta. La presente invención se extiende además a los polipéptidos recombinantes o aislados codificados por tales genes y a los usos de dichos genes y polipéptidos.

La invención descrita de acuerdo a esta modalidad no abarca a las moléculas de ácido nucleico que codifican a las actividades de la enzima diferentes a las actividades de la epoxigenasa como se definió aquí, en particular las enzimas \Delta12-desaturasa derivadas de Arabidopsis thaliana, Brassica juncea, Brassica napus o Glycine max, entre otras, que son conocidas por contener motivos similares ricos en histidina.

En el presente contexto, "homólogos" de una secuencia de aminoácidos se refiere a aquellas secuencias de aminoácidos o secuencia de péptidos que se derivan de polipéptidos, enzimas o proteínas de la presente invención o alternativamente, corresponden sustancialmente a las secuencias de aminoácidos enlistados supra, a pesar de cualquier sustitución, adición o supresión de aminoácidos de ocurrencia natural de las mismas.

Por ejemplo, los aminoácidos pueden ser reemplazados por otros aminoácidos que tengan propiedades similares, por ejemplo hidrofobicidad, hidrofilicidad, momento hidrófobo, antigenicidad, propensión a formar o a romper estructuras \alpha-helicoidales o estructuras en lámina \beta, y así sucesivamente. Alternativamente, o adicionalmente, los aminoácidos de una secuencia de aminoácidos homólogos pueden ser reemplazados por otros aminoácidos que tengan propiedades similares, por ejemplo hidrofobicidad, hidrofilicidad, momento hidrófobo, carga o antigenicidad, etc.

Los residuos aminoácidos de ocurrencia natural contemplados aquí se describen en la Tabla 1.

Un homólogo de una secuencia de aminoácidos puede ser un péptido sintético producido por medio de cualquier método conocido por aquellos capacitados en el arte, tal como por medio del uso de química Fmoc.

Alternativamente, un homólogo de una secuencia de aminoácidos se puede derivar de una fuente natural, ya sea de la misma o de otra especie como los polipéptidos, enzimas o proteínas de la presente invención. La fuentes preferidas de homólogos de las secuencias de aminoácidos enlistadas supra incluyen a cualquiera de las fuentes contempladas aquí.

Los "análogos" de una secuencia de aminoácidos abarcan a aquellas secuencias de aminoácidos que son sustancialmente idénticas a las secuencias de aminoácidos enlistadas supra a pesar de la presencia de cualquiera de los análogos de los aminoácidos de ocurrencia no natural allí dentro.

Los aminoácidos preferidos de ocurrencia no natural contemplados aquí se enlistan más abajo en la Tabla 2.

El término "derivado" en relación con una secuencia de aminoácidos debe ser utilizado para referirse de aquí en adelante a mutantes, partes, fragmentos o fusiones de polipéptidos de las secuencias de aminoácidos enlistadas supra. Los derivados incluyen secuencias modificadas de aminoácidos o péptidos en los cuales los ligandos están unidos a uno o más de los residuos aminoácidos contenidos allí dentro, tales como carbohidratos, enzimas, proteínas, polipéptidos o moléculas reporteras tales como radionúclidos o compuestos fluorescentes. Las formas glicosiladas, fluorescentes, aciladas o alquiladas de los péptidos objetivo son también contempladas por la presente invención. Adicionalmente, los derivados pueden comprender fragmentos o partes de una secuencia de aminoácidos divulgados aquí y están dentro del alcance de la invención, que son los homopolímeros o heteropolímeros que comprenden dos o más copias de las secuencias objetivo.

Los procedimientos para derivatización de péptidos son bien conocidos en el arte.

Las sustituciones abarcan alteraciones en los aminoácidos en los cuales un aminoácido es remplazado con un residuo aminoácido diferente de ocurrencia natural o un residuo aminoácido no convencional. Tales sustituciones se pueden clasificar como "conservadoras", en cuyo caso un residuo aminoácido es remplazado con otro aminoácido de ocurrencia natural de carácter similar, por ejemplo Gly\leftrightarrowAla, Val\leftrightarrowIle\leftrightarrowLeu, Asp\leftrightarrowGlu, Lys\leftrightarrowArg, Asn\leftrightarrowGln o Phe\leftrightarrowTrp\leftrightarrowTyr.

Las sustituciones abarcadas por la presente invención pueden ser también "no conservadoras", en las cuales un residuo aminoácido que esta presente en un polipéptido represor es sustituido con un aminoácido que tiene propiedades diferentes, tales como un aminoácido de ocurrencia natural de un grupo diferente (por ejemplo, un aminoácido sustituido o cargado o hidrófobo con alanina), o alternativamente, en el cual un aminoácido de ocurrencia natural es sustituido con un aminoácido no convencional.

Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de residuos únicos, pero pueden ser de residuos múltiples, ya sea agrupados o dispersos.

Las supresiones de aminoácidos serán usualmente del orden aproximadamente de 1-10 residuos aminoácidos, mientras que las inserciones pueden ser de cualquier longitud. Las supresiones y las inserciones pueden hacerse en el N-terminal, el C-terminal o ser supresiones o inserciones internas. Generalmente, las inserciones dentro de la secuencia de aminoácidos serán más pequeñas que las fusiones amino o carboxi terminales y del orden de 1-4 residuos aminoácidos.

La presente invención claramente se extiende a la molécula objetivo aislada de ácido nucleico cuando se le integra dentro del genoma de una célula como una adición al complemento celular endógeno de los genes de la epoxigenasa. Alternativamente, en donde la célula huésped no codifica normalmente a las enzimas requeridas para la biosíntesis de ácido graso epóxico, la presente invención se extiende hasta la molécula objetivo aislada de ácido nucleico cuando se integra dentro del genoma de dicha célula como una adición al genoma celular endógeno.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2

3

4

5

Un Segundo aspecto de la presente invención provee una molécula aislada de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NOs: 1 ó 3 ó 5 ó 19 ó 20 o una secuencia complementaria de la misma, o un homólogo, análogo o derivado de la misma.

Para los propósitos de la nomenclatura, la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 se deriva de Crepis palaestina y codifica a la secuencia de la monoxigenasa de función mixta o una secuencia como la de la monoxigenasa de función mixta expuesta en la SEQ ID NO: 2. Como se ejemplifica aquí, la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2 tiene actividad de epoxigenasa, más particularmente actividad de la \Delta12-epoxigenasa.

La secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 3 corresponde a un ADNc derivado de una Crepis sp. diferente a la C. palaestina que contiene niveles altos de ácido vernólico. La secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4 corresponde a la secuencia de aminoácidos derivada del gen de la epoxigenasa de Crepis sp. proveído en la SEQ ID NO: 3.

La secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 5 corresponde al ADN amplificado derivado de Vernonia galamensis utilizando iniciadores de amplificación derivados de una secuencia de consenso de monoxigenasas de función mixta, incluidas las secuencias de la invención del gen de la epoxigenasa de Crepis spp. El ADN amplificado comprende una secuencia parcial del gen de la epoxigenasa, que incluye secuencias de nucleótidos capaces de codificar al motivo rico en histidina His-Arg-Asn-His-His que es característico de las enzimas monoxigenasas de función mixta. La secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 6 corresponde a la secuencia de aminoácidos derivada del gen de la epoxigenasa de Vernonia galamensis proveído en la SEQ ID NO: 5.

La secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 7 se relaciona con la secuencia parcial de un gen de la acetilenasa de Crepis alpina que fue utilizada como una sonda para aislar a la molécula de ácido nucleico que comprende a la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 8 corresponde a la secuencia de aminoácidos derivada de dicha secuencia parcial del gen de la acetilenasa de C. alpina.

Como se lo utiliza aquí, el término "acetilenasa" debe ser utilizado para referirse a una enzima que es capaz de catalizar la conversión de un doble enlace de carbono en una molécula de sustrato de ácido graso en un enlace triple de carbono o alternativamente, que es capaz de catalizar la formación de un enlace triple de carbono en una molécula de ácido graso.

La secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 18 corresponde a un iniciador degenerado para amplificación utilizado para amplificar las secuencias putativas del gen de la epoxigenasa de Euphorbia lagascae. En este sentido, los residuos nucleótidos mostrados en la SEQ ID NO: 18 son aquellos recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB, en donde A representa Adenina, C representa Citosina, G representa Guanina, T representa Timina, Y representa a un residuo de pirimidina, R representa a un residuo de purina, M representa Adenina o Citosina, K representa Guanina o Timina, S representa Guanina o Citosina, W representa Adenina o Timina, H representa a un nucleótido diferente de Guanina, B representa a un nucleótido diferente de Adenina, V representa a un nucleótido diferente de Timina, D represente a un nucleótido diferente de Citosina y N representa a cualquier residuo nucleótido.

La secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 19 se deriva de Euphorbia lagascae y codifica a la secuencia de la monoxigenasa dependiente del citocromo P450 o a una secuencia tipo monoxigenasa dependiente del citocromo P450.

La secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 20 se deriva de Euphorbia lagascae y codifica a la secuencia putativa de la monoxigenasa dependiente del citocromo P450 o a una secuencia tipo monoxigenasa dependiente del citocromo P450.

La presente invención claramente se extiende a los equivalentes del gen genómico de las moléculas de ADNc ejemplificadas en cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 19 ó 20.

En una modalidad más particularmente preferida, la presente invención provee una molécula aislada de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 19 ó 20 o un equivalente del gen genómico de dicha secuencia de nucleótidos o un homólogo, análogo o derivado de la
misma.

Para el propósito presente, "homólogos" de una secuencia de nucleótidos deberá entenderse que se refiere a una molécula aislada de ácido nucleico que es sustancialmente la misma que la molécula de ácido nucleico de la presente invención o su secuencia complementaria de nucleótidos, a pesar de la ocurrencia dentro de dicha secuencia, de una o más sustituciones de nucleótidos, inserciones, supresiones, o reordenamientos.

"Análogos" de una secuencia de nucleótidos expuesta aquí deberá entenderse que se refiere a una molécula aislada de ácido nucleico que es sustancialmente la misma que una molécula de ácido nucleico de la presente invención o su secuencia complementaria de nucleótidos, a pesar de la ocurrencia de cualquiera de los constituyentes no nucleótidos que no está normalmente presente en dicha molécula aislada de ácido nucleico, por ejemplo carbohidratos, radioquímicos incluidos los radionucleótidos, las moléculas reporteras tales como, pero sin limitarse a DIG, fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano, entre otros.

"Derivados" de una secuencia de nucleótidos expuesta aquí deberá entenderse que se refiere a cualquier molécula aislada de ácido nucleico que contiene una similitud de secuencia significativa con dicha secuencia o con una parte de la misma.

Generalmente, homólogos, análogos o derivados de la molécula de ácido nucleico de la invención son producidos por medios sintéticos o alternativamente, derivados de fuentes de ocurrencia natural. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de la presente invención puede ser sometida a mutagénesis para producir sustituciones, supresiones y/o inserciones de nucleótidos sencillos o múltiples como se indicó supra.

En una modalidad de la invención, los homólogos, análogos o derivados preferidos de las secuencias de nucleótidos expuestas en cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 19 ó 20 o secuencias complementarias de las mismas, codifican polipéptidos inmunológicamente activos o enzimáticamente activos.

Como se lo utiliza aquí, el término "inmunológicamente activo" deberá entenderse que se refiere a la capacidad de una molécula de polipéptido para provocar una respuesta inmune en un mamífero, en particular una respuesta inmune suficiente para producir una molécula de anticuerpo tal como, pero no limitada a, una molécula de IgM o de IgG o de suero entero que contenga a dicha molécula de anticuerpo. El término "inmunológicamente activo" también se extiende a la capacidad de un polipéptido para provocar una respuesta inmune suficiente para la producción de anticuerpos monoclonales, de fragmentos sintéticos de Fab de una molécula de anticuerpos, de una molécula de anticuerpo de cadena sencilla o de otra molécula inmunointeractiva.

Como se lo utiliza aquí, el término "enzimáticamente activo" deberá entenderse que se refiere a la capacidad de una molécula de polipéptido para catalizar una reacción enzimática, en particular una reacción enzimática que comprende la epoxigenación de un enlace de carbono en una molécula de sustrato de ácido graso. Más particularmente, en tanto que no limita a la invención, el término "enzimáticamente activo" puede referirse también a la capacidad de una molécula de polipéptido para catalizar la epoxigenación de \Delta-9 o \Delta-12 en una molécula de sustrato de ácido graso tal como ácido linoléico o ácido vernólico.

En una modalidad alternativa, un homólogo, análogo o derivado preferido de la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NOs: 1 ó 3 ó 5, o una secuencia complementaria de las mismas, comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos 65% idéntica a al menos 20 nucleótidos contiguos allí dentro, diferente a la secuencia de nucleótidos que codifica a una enzima acetilenasa de Crepis sp.

Más preferiblemente, el porcentaje de identidad con cualquiera de las SEQ ID NOs: 1 ó 3 ó 5 es aproximadamente al menos del 85%. Aún más preferible, un homólogo, análogo o derivado de las SEQ ID NOs: 1 ó 3 ó 5 es aproximadamente al menos del 90% y aún más preferiblemente aproximadamente al menos del 95% de identidad con al menos 100 ó 250 ó 500 ó 1.000 nucleótidos contiguos allí dentro.

El porcentaje de identidad con las SEQ ID NOs: 19 ó 20, o con las secuencias complementarias de las mismas es aproximadamente al menos del 75% al menos aproximadamente sobre 200 nucleótidos contiguos, aún más preferiblemente aproximadamente al menos del 80%, todavía aún más preferiblemente aproximadamente al menos del 90% y todavía aún más preferiblemente aproximadamente al menos del 95%, incluido aproximadamente al menos 99% de identidad. Las secuencias de nucleótidos que son al menos 65% sobre aproximadamente al menos 400 nucleótidos contiguos en las SEQ ID NOs: 19 ó 20 están también dentro del alcance de la invención.

La referencia que se hace aquí a un porcentaje de identidad o porcentaje de similitud entre dos o más nucleótidos o secuencias de aminoácidos deberá entenderse que se refiere al número de residuos idénticos o similares en una alineación de secuencia de nucleótidos o de aminoácidos, como se determina utilizando cualquier algoritmo estándar conocido por aquellos capacitados en el arte. En particular, las identidades y similitudes de una secuencia de nucleótidos y/o de aminoácidos se pueden calcular utilizando el programa Gap, que utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) para maximizar el número de correspondencias de los residuos y minimizar el número de vacíos en la secuencia. El programa Gap es parte del Paquete de Software para Secuenciación y Análisis del Computer Genetics Group Inc.,
University Research Park, Madison, Wisconsin, Estados Unidos de América (Devereux y colaboradores, 1984).

En una modalidad alternativa adicional, un homólogo, análogo o derivado preferido de la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 19 ó 20 o una secuencia complementaria de las mismas, se hibrida al menos bajo condiciones poco rigurosas al menos hasta 20 nucleótidos contiguos derivados de dicha secuencia.

Más preferiblemente, la rigurosidad de la hibridación es al menos de rigurosidad moderada, aún más preferiblemente al menos rigurosidad alta.

Para los propósitos de definir el nivel de rigurosidad, aquellos capacitados en el arte sabrán que se pueden emplear varias condiciones diferentes de hibridación. Por ejemplo, una rigurosidad baja puede comprender una hibridación y/o un lavado llevados a cabo en búfer 6xSSC, SDS al 0,1% (p/v) a 28ºC. Una rigurosidad moderada puede comprender una hibridación y/o un lavado llevados a cabo en búfer 2xSSC, SDS al 0,1% (p/v) a una temperatura en el rango entre 45ºC y 65ºC. Una rigurosidad alta puede comprender una hibridación y/o un lavado llevados a cabo en búfer 0,1xSSC, SDS al 0,1% (p/v) a una temperatura de al menos 65ºC.

Generalmente, la rigurosidad se incrementa reduciendo la concentración de búfer SSC, y/o incrementando la concentración de SDS en el búfer de hibridación o en el búfer de lavado y/o incrementando la temperatura a la cual se llevan a cabo la hibridación y/o el lavado. Las condiciones para las hibridaciones y los lavados son bien entendidas por aquellos normalmente capacitados en el arte. Para los propósitos de clarificación de los parámetros que afectan la hibridación entre moléculas de ácido nucleico, se puede hacer referencia convenientemente a las páginas 2.10.8 hasta 2.10.16 de Ausubel y colaboradores (1987), que se incorpora aquí por referencia.

Las moléculas aisladas de ácido nucleico divulgadas aquí pueden ser utilizadas para aislar o identificar homólogos, análogos o derivados de las mismas a partir de otras células, tejidos, o tipos de órganos, o a partir de las células, tejidos, u órganos de otras especies utilizando cualquiera entre una variedad de medios conocidos por aquellos capacitados en el arte.

Por ejemplo, el ADN genómico, o el ARNm, o el ADNc pueden ser puestos en contacto, al menos bajo condiciones de hibridación de baja rigurosidad o equivalentes, con una cantidad efectiva para hibridación de una molécula aislada de ácido nucleico que comprende a la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 19 ó 20 o una secuencia complementaria de las mismas, o una parte funcional de las mismas, y detectar la hibridación utilizando un medio de detección.

El medio de detección puede ser una molécula reportera capaz de producir una señal identificable (por ejemplo, un radioisótopo tal como ^{32}P o ^{35}S o una molécula biotinilada) enlazada covalentemente a la molécula aislada de ácido nucleico de la invención.

En un método alternativo, el medio de detección es cualquier formato conocido de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). De acuerdo a este método, las reservas degeneradas de "moléculas de iniciador" de ácido nucleico aproximadamente de 15-50 nucleótidos de longitud están diseñadas con base en las secuencias de nucleótidos divulgadas en las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 19 ó 20 o una secuencia complementaria de las mismas. Los homólogos, análogos o derivados (esto es, la "molécula patrón" se hibridan con dos de dichas moléculas de iniciador, de tal manera que un primer iniciador hibride a una región sobre una cadena de la molécula patrón y un segundo iniciador hibride a una secuencia complementaria de la misma, en donde el primero y el segundo iniciadores no estén hibridados dentro de la misma región o una región superpuesta de la molécula patrón, y en donde cada iniciador se posiciona en una orientación 5' a 3' con relación a la posición en la cual el otro iniciador se hibrida sobre la cadena opuesta. Las copias específicas de la molécula de ácido nucleico de la molécula patrón se amplifican enzimáticamente en una reacción en cadena de la polimerasa, una técnica que es bien conocida para alguien capacitado en el arte.

Las moléculas de iniciador pueden comprender a cualquier residuo nucleótido de ocurrencia natural (esto es, adenina, citidina, guanina, timina) y/o puede comprender inosina o análogos funcionales o derivados de la misma, capaces de ser incorporados dentro de una molécula de polinucleótido. Las moléculas de ácido nucleico del iniciador pueden estar contenidas también en una mezcla acuosa de otras moléculas de ácido nucleico del iniciador o estar en forma sustancialmente pura.

La secuencia detectada puede estar en una forma recombinante, en una partícula de virus, en una partícula de bacteriófago, en una célula de levadura, en una célula animal, o en una célula de una planta. Preferiblemente, la secuencia genética relacionada se origina a partir de otra especie de planta.

Un tercer aspecto de la presente invención provee una molécula aislada de ácido nucleico que codifica a la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NOs: 2 ó 4 ó 6 o un homólogo, análogo o derivado de las mismas.

En una modalidad contemplada aquí, los homólogos, análogos o derivados preferidos de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NOs: 2, 4 ó 6 son polipéptidos inmunológicamente activos o enzimáticamente activos como se definió supra.

En una modalidad alternativa de la invención, los homólogos, análogos o derivados preferidos de las secuencias de aminoácidos expuestas en cualquiera de las SEQ ID NOs: 2, 4 ó 6 comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos 60% idéntica a las mismas, diferente a un polipéptido de acetilenasa de Crepis sp. Más preferiblemente, los homólogos, análogos o derivados de las SEQ ID NOs: 2 ó 4 ó 6 que son abarcados por la presente invención, son aproximadamente al menos 85% idénticos, aún más preferiblemente aproximadamente al menos 90% idénticos y todavía aún más preferiblemente aproximadamente al menos 95% idénticos, y todavía más preferiblemente aproximadamente al menos 99%-100% idénticos a las mismas.

Los homólogos, análogos o derivados de cualquiera de las SEQ ID NOs: 2 ó 4 ó 6 pueden comprender además una región rica en histidina como se definió supra. Aún más preferiblemente, la epoxigenasa objetivo comprende al menos una secuencia de aminoácidos que contiene tres o más regiones ricas en histidina como sigue:

	(i)	His-Glu-Cys-Gly-His-His	(SEQ ID NO: 15);
	(ii)	His-Arg-Asn-His-His	(SEQ ID NO: 16); y
	(iii)	His-Val-Met-His-His	(SEQ ID NO: 17),

o un homólogo, análogo o derivado de las mismas.

\newpage

La invención descrita de acuerdo a esta modalidad alternativa no abarca a las enzimas \Delta12-desaturasas derivadas de Arabidopsis thaliana, Brassica juncea, Brassica napus o Glycine max, entre otras.

La molécula aislada de ácido nucleico de la presente invención es útil para desarrollar construcciones genéticas que comprenden una molécula sentido en donde dichas construcciones genéticas se diseñan para la expresión en una célula que normalmente no expresa a dicha molécula de ácido nucleico o la sobre expresión de dicha molécula de ácido nucleico en una célula que normalmente expresa a dicha molécula de ácido nucleico.

Por lo tanto, un aspecto adicional de la invención provee una construcción genética que comprende una molécula sentido que está operativamente conectada a una secuencia del promotor.

El término "molécula sentido" como se lo utiliza aquí deberá entenderse que se refiere a una molécula aislada de ácido nucleico que codifica o es complementaria a una molécula de ácido nucleico que codifica a una epoxigenasa de ácido graso en donde dicha molécula de ácido nucleico es proveída en un formato adecuado para su expresión para producir un polipéptido recombinante cuando dicha molécula sentido se introduce dentro de una célula huésped por medio de transfección o de transformación.

Aquellos entrenados en el arte sabrán que una construcción genética puede ser utilizada para "transfectar" una célula, en cuyo caso se la introducirá dentro de dicha célula sin integración dentro del genoma de la célula. Alternativamente, una construcción genética puede ser utilizada para "transformar" una célula, en cuyo caso se integra en forma estable dentro del genoma de dicha célula.

Una molécula sentido que corresponde a una secuencia del gen de la epoxigenasa de ácido graso o un homólogo, análogo o derivado de la misma, puede ser introducido dentro de una célula utilizando cualquier método conocido para la transfección o la transformación de dicha célula. En donde una célula se transforma por medio de la construcción genética de la invención, se puede regenerar un organismo completo a partir de una célula única transformada, utilizando cualquier método conocido por aquellos capacitados en el arte.

Por lo tanto, los genes de la epoxigenasa descritos aquí pueden ser utilizados para desarrollar células sencillas u organismos completos que sinteticen ácidos grasos epóxidos que normalmente no son producidos por organismos silvestres o de ocurrencia natural que pertenecen al mismo género o especie que el género o especie a partir del cual se deriva la célula transfectada o transformada, o para incrementar los niveles de tales ácidos grasos más arriba de los niveles normalmente encontrados en tales organismos silvestres o de ocurrencia natural.

En una modalidad alternativa preferida, la molécula aislada de ácido nucleico de la invención es capaz de reducir el nivel de ácidos grasos epóxidos en una célula, cuando se expresan allí dentro, en la orientación antisentido o como una molécula de ribosoma o de cosupresión, bajo el control de una secuencia adecuada del promotor.

La cosupresión es la reducción en expresión de un gen endógeno que se presenta cuando una o más copias de dicho gen, o una o más copias de un gen sustancialmente similar son introducidas dentro de la célula. La presente invención también se extiende al uso de cosupresión para inhibir la expresión de un gen de epoxigenasa como se describió aquí.

En el contexto de la presente invención, una molécula antisentido es una molécula de ARN que se transcribe a partir de la cadena complementaria de un gen nuclear que normalmente se transcribe para producir una molécula "sentido" de ARNm o una parte de la misma. Aunque no limita la forma de acción de las moléculas antisentido de la presente invención a ningún mecanismo específico, la molécula antisentido de ARN posee la capacidad de formar un ARNm bicatenario por medio de apareamiento de bases con el ARNm sentido, que puede prevenir la traducción del ARNm sentido y la síntesis posterior de un polipéptido como producto génico.

Las ribozimas son moléculas sintéticas de ARN que comprenden una región de hibridación complementaria a dos regiones, cada una al menos de 5 bases nucleótidas continuas en el ARNm sentido objetivo. Además, las ribozimas poseen actividad endoribonucleasa altamente específica, que escinde autocatalíticamente al ARNm sentido objetivo. Una descripción completa de la función de las ribozimas es presentada por Haseloff y Gerlach (1988) y está contenida en la Solicitud Internacional de Patente No. WO89/05852. La presente invención se extiende a las ribozimas cuyo ARNm sentido objetivo codifica a un polipéptido epoxigenasa descrito aquí, hibridando por lo tanto a dicho ARNm sentido y escindiéndolo, de tal manera que ya no pueda ser traducido para sintetizar a un producto polipeptídico funcional.

De acuerdo a esta modalidad, la presente invención provee una ribozima o molécula antisentido que comprende una secuencia de bases contiguas de nucleótidos que son capaces de formar un complejo por medio de enlaces de hidrógeno con un ARNm sentido que codifica a una epoxigenasa descrita aquí, para reducir la traducción de dicho ARNm. Aunque las moléculas antisentido y/o las moléculas de ribozima preferidas hibridan aproximadamente al menos con 10 a 20 nucleótidos de la molécula objetivo, la presente invención se extiende a moléculas capaces de hibridar aproximadamente al menos con 50-100 bases nucleótidas de longitud, o una molécula capaz de hibridar a una ARNm epoxigenasa de longitud completa o sustancialmente completa.

Se entiende en el arte que ciertas modificaciones, incluidas las sustituciones de nucleótidos entre otras, pueden ser hechas con moléculas antisentido y/o de ribozima de la presente invención, sin destruir la eficacia de dichas moléculas en la inhibición de la expresión del gen de la epoxigenasa. Por lo tanto, está dentro del alcance de la presente invención el incluir a cualquiera de las variantes, homólogos, análogos o fragmentos de la secuencia de nucleótidos de dicho gen que los codifica, siendo el único requisito el que dicha variante de la secuencia de nucleótidos, cuando se transcribe, produce una molécula antisentido y/o una molécula de ribozima que es capaz de hibridar a dicha molécula de ARNm sentido.

La presente invención se extiende a construcciones genéticas diseñadas para facilitar la expresión de una molécula sentido, una molécula antisentido, molécula de ribozima, o molécula cosupresora que es capaz de alterar el nivel de ácidos grasos epóxidos en una célula.

En una modalidad particularmente preferida, la molécula sentido, una molécula antisentido, una molécula de ribozima, una molécula cosupresora, o una molécula para dirigir al gen que son capaces de alterar la composición del ácido graso epóxido de una célula derivada de una planta o de otro organismo, comprende una secuencia de nucleótidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 19 ó 20 y más preferiblemente en cualquiera de las SEQ ID NOs: 1 ó 3 ó 5 y aún más preferiblemente en la SEQ ID NO: 1 o una cadena complementaria, homólogo, análogo o derivado de la misma.

Aquellos capacitados en el arte también sabrán que la expresión de una molécula sentido, antisentido, de ribozima o cosupresora pueden requerir que la molécula de ácido nucleico de la invención sea colocada en conexión operativa con una secuencia del promotor. La escogencia del promotor para el presente propósito puede variar dependiendo del nivel de expresión de la molécula sentido requerida y/o de las especies a partir de las cuales se deriva la célula huésped y/o la especificidad del tejido o la especificidad en el desarrollo de la expresión de la molécula sentido que se requiere.

La referencia aquí a un "promotor" se debe tomar en su contexto más amplio e incluye a las secuencias reguladoras transcripcionales de un gen genómico eucariota clásico, que incluye a la caja TATA que se requiere para el inicio preciso de la transcripción, con o sin una secuencia de la caja CCAAT y elementos reguladores adicionales (esto es, secuencias de activación secuencia arriba, reforzadores y silenciadores) que alteran la expresión génica en respuesta a los estímulos externo y/o de desarrollo, o en una forma específica para el tejido. En el contexto de la presente invención, el término "promotor" también incluye a las secuencias reguladoras transcripcionales de un gen procariota clásico, en cuyo caso puede incluir una secuencia de caja a -35 y/o secuencias reguladoras transcripcionales de caja a -10.

En el presente contexto, el término "promotor" es utilizado también para describir una molécula sintética o de fusión, o derivada que confiera, active o refuerce la expresión de dicha molécula sentido en una célula. Los promotores preferidos pueden contener copias adicionales de uno o más elementos reguladores específicos, para reforzar adicionalmente la expresión de la molécula sentido y/o para alterar la expresión espacial y/o la expresión temporal de dicha molécula sentido. Por ejemplo, los elementos reguladores en respuesta al cobre pueden ser colocados en forma adyacente a una secuencia heteróloga del promotor que dirige la expresión de una molécula sentido para conferir una expresión inducible por el cobre sobre ella.

La colocación de una molécula sentido, antisentido, de ribozima o cosupresora bajo el control regulador de una secuencia del promotor significa posicionar a dicha molécula de tal manera que la expresión este controlada por medio de la secuencia del promotor. Un promotor se posiciona usualmente, pero no necesariamente, secuencia arriba o 5' de una molécula de ácido nucleico a la cual regula. Además, los elementos reguladores que comprenden a un promotor se posicionan usualmente dentro de 2 kb del sitio de inicio de la transcripción de la molécula sentido, antisentido, de ribozima o cosupresora o del gen quimérico que la incluye. En la construcción de combinaciones del gen promotor/estructural heterólogo, se prefiere generalmente ubicar al promotor a una distancia del sitio de inicio de la transcripción del gen que sea aproximadamente la misma que la distancia entre ese promotor y el gen que el controla en su ambiente natural, esto es, el gen a partir del cual se deriva el promotor. Como se conoce en el estado del arte, alguna variación en esta distancia puede ser acomodada sin perdida de la función del promotor. En forma similar, El posicionamiento preferido de un elemento regulador de la secuencia con respecto a un gen heterólogo para ser colocado bajo su control, se define por medio de la ubicación del elemento en su ambiente natural, esto es, los genes a partir de los cuales se deriva. Nuevamente, como se conoce en el estado del arte, también puede ocurrir alguna variación en esta distancia.

Los ejemplos de promotores adecuados para ser utilizados en construcciones genéticas de la presente invención incluyen a promotores derivados a partir de los genes de virus, levaduras, mohos, bacterias, insectos, aves, mamíferos y plantas que se capaces de funcionar en células aisladas o en organismos completos regenerados a partir de allí. El promotor puede regular la expresión de la molécula sentido, antisentido, de ribozima o cosupresora en forma constitutiva, o diferencial con respecto al tejido en el cual ocurre la expresión o, con respecto a la etapa de desarrollo en la cual ocurre la expresión, o en respuesta a estímulos externos tales como estrés fisiológico, patógenos, o iones metálicos, entre otros.

Los ejemplos de promotores incluyen al promotor CaMV 35S, al promotor NOS, al promotor de la octopina sintasa (OCS), al promotor del gen SSU de la Arabidopsis thaliana, al promotor específico para la semilla de napina, al promotor P_{32}, al promotor BK5-T imm, al promotor lac, al promotor tac, a los promotores del fago lambda \lambda_{L} o \lambda_{R}, al promotor CMV (patente estadounidense No. 5.168.062), al promotor T7, al promotor lacUV5, al promotor temprano SV40 (patente estadounidense No. 5.118.627), al promotor tardío SV40 (patente estadounidense No. 5.118.627), al promotor del adenovirus, al promotor del baculovirus P10 o al promotor de la polihedrina (patente estadounidense Nos. 5.243.041, 5.242.687, 5.266.317, 4.745.051 y 5.169.784), y similares. Además de los promotores específicos identificados aquí, son útiles los promotores celulares para los así llamados genes caseros o de mantenimiento.

Los promotores preferidos de acuerdo a esta modalidad son aquellos promotores que son capaces de funcionar en levaduras, mohos o células de plantas. Más preferiblemente, los promotores adecuados para ser utilizados de acuerdo a esta modalidad son capaces de funcionar en células derivadas de levaduras oleaginosas, mohos oleaginosos o en plantas de cultivos de semillas oleaginosas, tal como el lino vendido bajo la marca comercial Linola® (de ahora en adelante mencionado como "lino Linola®"), girasol, cártamo, soja, linaza, ajonjolí, semilla de algodón, cacahuete, palma de oliva o palma aceitera, entre otros.

Linola® es una marca registrada de la Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization (CSIRO), Australia.

En una modalidad más preferida, el promotor se puede derivar de un clon genómico que codifica a una enzima epoxigenasa, preferiblemente derivada del gen genómico equivalente de los genes de la epoxigenasa derivados de Chrysanthemum spp., Crepis spp. incluida C. palaestina u otras Crepis sp., Euphorbia lagascae o Vernonia galamensis, que se mencionan aquí.

En una modalidad más preferida, el promotor se puede derivar de un gen de semilla altamente expresado, tal como el gen de napina, entre otros.

La construcción genética de la invención puede comprender además una secuencia terminadora y ser introducida dentro de una célula huésped adecuada en donde es capaz de ser expresada para producir un polipéptido recombinante como producto génico o alternativamente, una molécula de ribozima o antisentido.

El término "terminadora" se refiere a una secuencia de ADN en el extremo de una unidad transcripcional que señala la terminación de la transcripción. Los terminadores son secuencias de ADN 3' no traducidas que contienen una señal de poliadenilación, que facilita la adición de secuencias de poliadenilato al extremo 3' de un transcripto primario. Los terminadores activos células derivadas de virus, levaduras, mohos, bacterias, insectos, aves, mamíferos y plantas son conocidos y están descritos en la literatura. Ellos se pueden aislar a partir de bacterias, hongos, virus, animales y/o plantas.

Ejemplos de terminadores particularmente adecuados para el uso en las construcciones genéticas de la presente invención incluyen al terminador el gen de la nopalina sintasa (NOS) de Agrobacterium tumefaciens, al terminador del gen 35S del virus del mosaico de la Coliflor (CaMV), Aldo terminador del gen zein de Zea mays, a las secuencias del terminador del gen de la pequeña subunidad de Rubisco (SSU), a los terminadores de la secuencia del gen del virus achaparrado de trébol subterráneo (SCSV), cualquier terminador de E. coli independiente de rho-, entre otros.

Aquellos capacitados del arte sabrán de secuencias adicionales del promotor y de secuencias del terminador que pueden ser adecuadas para el uso en la realización de la invención. Tales secuencias pueden ser utilizadas fácilmente sin ninguna experimentación excesiva.

Las construcciones genéticas de la invención pueden incluir además un origen de secuencia de replicación que se requiere para la replicación en un tipo de célula específico, por ejemplo una célula bacterial, cuando se requiere que dicha construcción genética se mantenga como un elemento genético episomal (por ejemplo, molécula de plásmido o de cósmido) en dicha célula.

Los orígenes preferidos de replicación incluyen, pero no se limitan a, los orígenes de replicación f1-ori y colE1.

La construcción genética puede comprender además un gen o genes marcadores seleccionables que son funcionales en una célula dentro de la cual se introduce dicha construcción genética.

Como se lo utiliza aquí, el término "gen marcador seleccionable" incluye a cualquier gen que confiera un fenotipo sobre una célula en la cual se exprese para facilitar la identificación y/o la selección de células que son transfectadas o transformadas con una construcción genética de la invención o un derivado de la misma.

Los genes marcadores seleccionables apropiados contemplados aquí incluyen resistencia a la ampicilina (Amp^{r}), un gen de resistencia a la tetraciclina (Tc^{r}), un gen de resistencia a la kanamicina bacteriana (Kan^{r}), un gen de resistencia a la fosfinotricina, un gen de neomicina fosfotransferasa (nptII), un gen de resistencia a la higromicina, un gen de la \beta-glucoronidasa (GUS), un gen de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) y un gen de la luciferasa, entre otros.

Un aspecto adicional de la presente invención provee una célula, tejido, órgano u organismo completo transfectado o transformado se expresa a un polipéptido epoxigenasa recombinante o molécula de ribozima, antisentido o cosupresora como se describe aquí, o un homólogo, análogo o derivado de los mismos.

Preferiblemente, la molécula aislada de ácido nucleico está contenida dentro de una construcción genética como la descrita aquí. La construcción genética de la presente invención puede ser introducida dentro de una célula por medio de diferentes técnicas conocidas por aquellos capacitados en el arte. La técnica utilizada puede variar dependiendo de las técnicas exitosas conocidas para aquel organismo particular.

El medio para introducir ADN recombinante dentro de células bacterianas, células de levadura, o tejidos o células de plantas, insectos, hongos (incluidos mohos), de aves o de mamíferos, pero no se limitan a, transformación utilizando CaCl_{2} y variaciones del mismo, en particular el método descrito por Hanahan (1983), incorporación directa de ADN dentro de los protoplastos (Krens y colaboradores, 1982; Paszkowski y colaboradores, 1984), incorporación mediada por PEG a los protoplastos (Armstrong y colaboradores, 1990), bombardeo de micropartículas, electroporación (Fromm y colaboradores, 1985), microinyección de ADN (Crossway y colaboradores, 1986), bombardeo de micropartículas de explantes o de células (Christou y colaboradores, 1988; Sanford, 1988), infiltración al vacío del tejido con ácido nucleico, o en el caso de las plantas, transferencia mediada por T-ADN a partir de Agrobacterium al tejido de la planta como lo describieron esencialmente An y colaboradores (1985), Herrera-Estrella y colaboradores (1983a, 1983b, 1985).

Para el bombardeo de las células con micropartículas, se impulsa una micropartícula dentro de una célula para producir una célula transformada. Se puede utilizar cualquier metodología y aparatos de balística adecuados para transformación de la célula en la realización de la presente invención. Ejemplos de aparatos y de procedimientos son divulgados por Stomp y colaboradores (patente estadounidense No. 5.122.466) y Sanford y Wolf (patente estadounidense No. 4.945.050). Cuando se utilizan procedimientos balísticos de transformación, la construcción genética puede incorporar un plásmido capaz de replicación en la célula que va a ser transformada.

Los ejemplos de micropartículas adecuadas para ser utilizadas en tales sistemas incluyen esferas de oro de 1 a 5 \mum. La construcción de ADN se puede depositar sobre la micropartícula por medio de cualquier técnica adecuada, tal como precipitación.

En una modalidad particularmente preferida, en donde la construcción genética comprenda una molécula "sentido", se prefiere particularmente que el polipéptido recombinante de epoxigenasa producido a partir de allí sea enzimáticamente activo.

Alternativamente, en donde la célula se derive de un organismo multicelular y donde la tecnología relevante esté disponible, se puede regenerar un organismo completo a partir de la célula transformada, de acuerdo con procedimientos bien conocidos del arte.

Aquellos capacitados del arte conocerán los métodos para transformar, regenerar y propagar otro tipo de células, tales como aquellas de los hongos.

El caso de las plantas, el tejido de la planta capaz de propagación clonal posterior, ya sea por medio de organogénesis o de embriogénesis, puede ser transformado con una construcción genética de la presente invención y una planta completa regenerada a partir de allí. El tejido particular escogido variará dependiendo de los sistemas clonales de propagación disponibles y más adecuados para las especias particulares que están siendo transformadas. Los ejemplos de tejidos objetivo incluyen discos de hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocótilos, megagametofitos, tejido calloso, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristema apical, yemas axilares, y meristemas de la raíz), y tejidos inducidos de meristema (por ejemplo, meristema del cotiledón y meristema del hipocótilo).

El término "organogénesis", como se lo utiliza aquí, significa un proceso por medio del cual se desarrollan en forma secuencial brotes y raíces a partir de centros meristemáticos.

El término "embriogénesis", como se lo utiliza aquí, significa un proceso por medio del cual los brotes y las raíces se desarrollan juntos en una forma concertada (no secuencial), ya sea a partir de células somáticas o de gametos.

Las plantas transformadas regeneradas se pueden propagar por medio de una variedad de medios, tales como por medio de técnicas de propagación clonal o de reproducción clásica. Por ejemplo, un a primera generación de una planta transformada (o T1) puede ser autogama para producir homocigotos transformados de segunda generación (o T2), y las plantas T2 propagadas además a través de técnicas clásicas de reproducción.

Los organismos transformados regenerados contemplados aquí pueden tomar una variedad de formas. Por ejemplo, ellos pueden ser quimeras de células transformadas y de células no transformadas; los transformantes clonales (por ejemplo, todas las células transformadas para contener el casete de expresión); injertos de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, en plantas, un conjunto de raíces transformadas implantadas a un injerto no transformado).

Un aspecto adicional de la invención provee un método para alterar el nivel de ácidos grasos epóxidos en una célula, tejido, órgano u organismo, dicho método comprendiendo la expresión de una molécula sentido, antisentido, de ribozima o cosupresora como se describe aquí en dicha célula durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para incrementar o reducir allí dentro el nivel de ácidos grasos epóxidos.

En una modalidad preferida, el método objetivo comprende la primera etapa adicional de transformar la célula, tejido, órgano u organismo con la molécula sentido, antisentido, de ribozima o cosupresora.

Como se discutió supra, la molécula aislada de ácido nucleico puede estar contenida dentro de una construcción genética.

De acuerdo con esta modalidad, la célula, órgano, tejido u organismo en el cual la molécula objetivo sentido, antisentido, de ribozima o cosupresora se expresa, se puede derivar de una bacteria, levadura, hongo (incluido un moho), insecto, planta, ave o mamífero.

Debido a que el polipéptido de la epoxigenasa recombinante puede ser producido en el transformante regenerado así como ex vivo, una modalidad alternativa preferida de la presente invención provee un método para producir un polipéptido recombinante de epoxigenasa enzimáticamente activo en una célula, dicho método comprendiendo las etapas de:

(i)

producir una construcción genética que comprenda al ADNc o a la secuencia genética de la epoxigenasa genómica de la invención colocada operativamente bajo el control de un promotor capaz de conferir expresión sobre dicha secuencia genética en dicha célula, y opcionalmente un elemento reforzador de la expresión;

(ii)

transformar dicha construcción genética dentro de dicha célula; y

(iii)

seleccionar a los transformantes que expresan a la epoxigenasa codificada por la secuencia genética a un nivel alto.

Una modalidad particularmente preferida de la presente invención provee un método para producir un polipéptido recombinante de epoxigenasa enzimáticamente activo en una planta transgénica que comprende las etapas de:

(i)

producir una construcción genética que comprenda al ADNc o a la secuencia genética de la epoxigenasa genómica de la invención colocada operativamente bajo el control de un promotor específico para la semilla y opcionalmente un elemento reforzador de la expresión, en donde dichas secuencias genéticas están colocadas también secuencia arriba de una secuencia terminadora de transcripción;

(ii)

transformar dicha construcción genética dentro de una célula o tejido de dicha planta; y

(iii)

seleccionar a los transformantes que expresan a la epoxigenasa codificada por la secuencia genética a un nivel alto en las semillas.

En una modalidad más particularmente preferida, la planta es una especie oleaginosa que normalmente produce niveles significativos de ácido linoléico, por ejemplo lino Linola®, colza oleaginosa, girasol, cártamo, soja, linaza, ajonjolí, semilla de algodón, cacahuete, palma de oliva o palma aceitera, entre otros.

En una modalidad aún más particularmente preferida, la planta es una especie oleaginosa que normalmente produce niveles significativos de ácido linoléico, por ejemplo lino Linola®, girasol o cártamo, entre otros.

Las epoxigenasas recombinantes enzimáticamente activas descritas aquí son particularmente útiles para la producción de ácidos grasos epoxigenados a partir de sustratos de ácido graso no saturado. La presente invención contempla especialmente la producción de ácidos grasos epoxigenados específicos en células u organismos transformados regenerados que normalmente no producen aquel ácido graso epoxigenado específico.

Por lo tanto, un aspecto adicional de la invención provee un método para producir un ácido graso epoxigenado en una célula, tejido, órgano u organismo, dicho método comprendiendo incubar una célula, tejido, órgano u organismo que exprese a una epoxigenasa recombinante enzimáticamente activa de la presente invención con una molécula sustrato de ácido graso, preferiblemente una molécula sustrato de ácido graso no saturado, durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para que al menos un enlace de carbono de dicho sustrato sea convertido en un grupo epoxi.

En una modalidad alternativa, el método objetivo comprende además la primera etapa adicional de transformar o transfectar la célula, tejido, órgano u organismo con una molécula de ácido nucleico que codifique a dicha epoxigenasa recombinante o a un homólogo, análogo o derivado de la misma, como se describió aquí anteriormente. Como se discutió supra, la molécula aislada de ácido nucleico puede estar contenida dentro de una construcción genética.

De acuerdo a esta modalidad, la célula, órgano, tejido u organismo en el cual la epoxigenasa objetivo se expresa, se deriva de una bacteria, levadura, hongo (incluido un moho), insecto, planta, ave o mamífero. Más preferiblemente, la célula, órgano, tejido u organismo se deriva de una levadura, planta u hongo, aún más preferiblemente a partir de una levadura oleaginosa o planta u hongo, o a partir de una planta oleaginosa que normalmente no expresa a la epoxigenasa recombinante de la invención.

Entre las plantas oleaginosas económicas principales contempladas aquí, son objetivos principales los genotipos muy linoléicos de lino, girasol, maíz y cártamo. La soja y la semilla de colza son objetivos alternativos pero son menos adecuados para una síntesis máxima de ácido graso epóxido debido a sus bajos niveles de sustrato de ácido linoléico y a la presencia de una \Delta15-desaturasa activa que compite con la epoxigenasa por el sustrato de ácido linoléico.

Una modalidad alternativa es la transformación de Linola® (= lino con bajo ácido linoléico) con la epoxigenasa de la invención. El lino Linola® normalmente contiene alrededor de 70% de ácido linoléico con muy poco de ésta (< 2%) siendo posteriormente convertido a ácido linolénico por medio de \Delta15-desaturasa (Green, 1986).

Los sustratos preferidos de ácido graso insaturado contemplados aquí incluyen, pero no se limitan a, ácido palmitoléico, ácido oleico, ácido linoléico, ácido linolénico, y ácido araquidónico, entre otros.

En especies de plantas que naturalmente contienen altos niveles de ácido vernólico, la \Delta12-epoxigenasa allí dentro puede ser muy eficiente en la epoxidación de ácido linoléico. En consecuencia, la presente invención contempla particularmente la expresión de \Delta12-epoxigenasa recombinante derivada de Euphorbia lagascae, Vernonia spp. y Crepis spp. en niveles altos en oleaginosas transgénicas durante la síntesis de aceite de semillas, para producir altos niveles de ácido vernólico allí dentro.

Por lo tanto, el ácido linoléico es un sustrato particularmente preferido de acuerdo a esta modalidad de la invención. No están excluidos otros sustratos adicionales.

Los productos de las moléculas de sustrato enlistadas supra serán fácilmente determinadas por aquellos capacitados en el arte, sin una experimentación excesiva. Los ácidos grasos epóxidos particularmente preferidos producidos de acuerdo a la presente invención incluyen al ácido 12,13-epoxi-9-octadecenóico (ácido vernólico) y al ácido12,13-epoxi-9,15-octadecadienóico, entre otros.

Las condiciones para la incubación de células, órganos, tejidos u organismos que expresan a la epoxigenasa recombinante en presencia de la molécula sustrato, variarán, dependiendo al menos de la incorporación del sustrato dentro de la célula, tejido, órgano u organismo, y de la afinidad de la epoxigenasa por la molécula de sustrato en el ambiente particular seleccionado. Las condiciones óptimas pueden ser fácilmente determinadas por aquellos capacitados en el arte relevante.

La presente invención claramente se extiende al aceite aislado que contiene ácidos grasos epóxidos, y/o al ácido graso epóxido aislado en sí mismo, producido como se describió aquí y a cualquiera de los productos derivados de allí, por ejemplo recubrimientos, resinas, encolados, plásticos, tensoactivos y lubricantes, entre otros.

Los inventores han mostrado además que la monoxigenasa de función mixta (MMO) que realizan funciones catalíticas tales como desaturación, acetilenación, hidroxilación y/o epoxigenación, forman una familia de genes que comparten una considerable similitud de secuencia de nucleótidos y de aminoácidos. Por ejemplo, las enzimas desaturasa, acetilenasa, hidroxilasa y/o epoxigenasa que actúan sobre moléculas de sustrato que tienen una longitud y posición similares en la cadena de cualquier doble(s) enlace(s) (si está(n) presente(s)) están más estrechamente relacionadas entre sí que las enzimas que actúan sobre otros sustratos, y pueden ser consideradas como una "familia".

Sin estar ligada a ninguna teoría o modo de acción, la similitud de secuencias entre los miembros de cualquier familia de genes tiene su base en la identidad del sustrato involucrado y la similitud bioquímica de los eventos de reacción que ocurren en el enlace de carbono objetivo durante la reacción de modificación, sugiriendo que secuencias divergentes dentro de una familia pueden incluir determinantes catalíticos o al menos una parte funcional de los mismos que contribuyen a las propiedades catalíticas específicas de los miembros de la familia.

Un ejemplo de una familia son las enzimas desaturasa, acetilenasa, hidroxilasa y/o epoxigenasa que catalizan desaturación, acetilenación, hidroxilación y/o epoxigenación respectivamente, de la posición \Delta12 del ácido linoléico (de aquí en adelante denominada como la "familia \Delta12-MMO C18"). Los actuales inventores han comparado las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de miembros de la familia \Delta12-MMO C18 para determinar las regiones divergentes de la misma que potencialmente comprende a los determinantes de funciones catalíticas alternativas en la posición \Delta12 (de aquí en adelante denominadas como "determinantes catalíticos putativos").

Además, la presencia de tales familias de los MMO que modifican al ácido graso se contempla con respecto a otra longitud de la cadena de ácido graso y a las posiciones de los dobles enlaces. Por ejemplo, se contempla la \Delta15-desaturasa C18 por pertenecer a una familia de enzimas relacionadas capaces de desaturación, acetilenación, hidroxilación y/o epoxidación de la posición \Delta15 en los sustratos de ácido graso C18, la familia \Delta15-MMO C18.

Por medio de la producción de genes sintéticos en los cuales estos determinantes catalíticos han sido intercambiados (denominado como "permutación del dominio"), es posible convertir genes que codifican una función catalítica en aquellas funciones catalíticas alternativas de codificación. Por ejemplo, la \Delta12 epoxigenasa de la presente invención puede ser convertida en una \Delta12 acetilenasa por medio del reemplazo de porciones de sus secuencias C-terminal y N-terminal con los dominios equivalentes de una \Delta12 acetilenasa de Crepis alpina. En forma similar, también puede realizarse la permutación inversa del dominio.

Como un refinamiento adicional, tales cambios en la función catalítica pueden verse afectados en forma similar haciendo cambios específicos (por ejemplo, adición, sustitución o supresión) solamente en aquellas aminoácidos dentro de cada dominio que son críticos para determinar la función catalítica relevante (tal como una mutagénesis dirigida al sitio).

Por lo tanto, un aspecto adicional de la presente invención contempla a un gen sintético de ácido graso que comprende una secuencia de nucleótidos derivada de un gen de la epoxigenasa como se describió aquí como en donde dicho gen sintético de ácido graso codifica a un polipéptido con actividad de epoxigenasa o de acetilenasa o de hidroxilasa o de desaturasa, en donde dicho polipéptido comprende ya sea una secuencia de aminoácidos que difiere de una enzima epoxigenasa de ocurrencia natural o de una acetilenasa o de una hidroxilasa o de una desaturasa, o en donde dicho polipéptido exhibe propiedades catalíticas que son diferentes de las de una enzima epoxigenasa de ocurrencia natural o de una acetilenasa o de una hidroxilasa o de una desaturasa o dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que son aproximadamente al menos 60% idénticos a una parte de la SEQ ID NO: 2 o de la 4 o de la 6 o un homólogo, análogo o derivado de dicha parte.

Preferiblemente, el gen sintético de ácido graso de la invención se deriva de un gen de \Delta12 epoxigenasa.

En una modalidad, el gen sintético de ácido graso de la invención codifica a un polipéptido de fusión en el cual los aminoácidos N-terminales y/o C-terminales de cualquiera de las SEQ ID NO: 2 ó 4 ó 6 son reemplazados, en el marco, por secuencias de aminoácidos de un miembro diferente de la misma familia.

En una modalidad particular preferida, los aminoácidos N-terminales y/o C-terminales de las SEQ ID NO: 2 ó 4 ó 6 son reemplazados por las regiones correspondientes de los polipéptidos de la acetilenasa, desaturasa o hidroxilasa expuestos en la Figura 2. Más preferiblemente, aproximadamente al menos 30 residuos aminoácidos de las regiones N-terminales y/o C-terminales de cualquiera de las SEQ ID NO: 2 ó 4 ó 6 son reemplazados, en el marco, por las regiones correspondientes de los polipéptidos de la acetilenasa, desaturasa o hidroxilasa expuestos en la Figura 2.

En una modalidad alternativa, el gen sintético de ácido graso de la invención codifica a un polipéptido de fusión en el cual los aminoácidos N-terminales y/o C-terminales de una acetilenasa de ácido graso o una hidroxilasa de ácido graso o una desaturasa de ácido graso son reemplazados, en el marco, por la región N-terminal y/o C-terminal de cualquiera de las SEQ ID NO: 2 ó 4 ó 6.

En una modalidad particularmente preferida, los aminoácidos N-terminales y/o C-terminales de una acetilenasa de ácido graso o una hidroxilasa de ácido graso o una desaturasa de ácido graso son reemplazados, en el marco, por la región N-terminal y/o C-terminal de cualquiera de las SEQ ID NO: 2 ó 4 ó 6. Aún más preferiblemente, la acetilenasa de ácido graso o la hidroxilasa de ácido graso o la desaturasa de ácido graso se seleccionan de la lista expuesta en la Figura 2.

Todavía aún más preferiblemente, aproximadamente al menos 30 residuos aminoácidos de las regiones N-terminal y/o C-terminal de una acetilenasa de ácido graso o una hidroxilasa de ácido graso o una desaturasa de ácido graso son reemplazados, en el marco, por la región N-terminal y/o C-terminal de cualquiera de las SEQ ID NOs: 2 ó 4 ó 6.

Por lo tanto, la presente invención se extiende a cualquiera de las variantes de las enzimas epoxigenasa mencionadas aquí, en donde dichas variantes se derivan de un polipéptido de epoxigenasa como se describió aquí y exhibe actividad demostrable de acetilenasa o de hidroxilasa o de desaturasa, y comprende ya sea a una secuencia de aminoácidos que difiere de una enzima acetilenasa o hidroxilasa o desaturasa de ocurrencia natural, o exhibe propiedades catalíticas que son diferentes de las de la enzima acetilenasa o hidroxilasa o desaturasa de ocurrencia natural, o comprende una secuencia de aminoácidos que es aproximadamente al menos 60% idéntica a cualquiera de las SEQ ID NOs: 2 ó 4 ó 6.

Como con otros aspectos de la invención, las variantes descritas aquí pueden ser producidas como polipéptidos recombinantes o en organismos transgénicos, una vez que los genes sintéticos sean introducidos dentro de una célula huésped adecuada y expresados allí dentro.

Los polipéptido recombinantes descritos aquí o un homólogo, análogo o derivado de los mismos, pueden ser también moléculas inmunológicamente activas.

Un aspecto adicional de la presente invención provee una molécula inmunológicamente interactiva que es capaz de enlazarse a un polipéptido recombinante de epoxigenasa de la invención.

Preferiblemente, el polipéptido recombinante de epoxigenasa al cual la molécula inmunológicamente interactiva es capaz de enlazarse comprende una secuencia aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NOs: 2, 4 ó 6, aún un homólogo, o análogo o derivado de las mismas.

En una modalidad, la molécula inmunológicamente interactiva es una molécula de anticuerpo. La molécula de anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. Los anticuerpos monoclonales o policlonales se pueden seleccionar a partir de los anticuerpos de ocurrencia natural para un epítopo, o fragmento de péptido, o péptido sintético de epoxigenasa derivado de un producto génico recombinante creado específicamente contra una epoxigenasa recombinante o un homólogo, análogo o derivado de la misma.

Tanto el anticuerpo monoclonal como el policlonal se pueden obtener por medio de inmunización con un producto génico apropiado, o epítopo, o fragmento de péptido de un producto génico. Alternativamente, se pueden utilizar fragmentos de anticuerpos, tales como los fragmentos Fab. La presente invención se extiende a los anticuerpos sintéticos y recombinantes y a los híbridos de anticuerpo. Un "anticuerpo sintético" se considera aquí que incluye fragmentos e híbridos de anticuerpos.

Los anticuerpos contemplados aquí pueden ser utilizados para identificar secuencias genéticas que expresan polipéptidos relacionados de epoxigenasa abarcados por las modalidades descritas aquí.

El único requisito para la detección exitosa de una secuencia genética relacionada de epoxigenasa es que dicha secuencia genética se exprese para producir al menos un epítopo reconocido por medio de la molécula de anticuerpo. Preferiblemente, para los propósitos de obtener expresión para facilitar la detección, se coloca la secuencia genética relacionada operativamente detrás de una secuencia del promotor, por ejemplo el promotor bacterial lac. De acuerdo a esta modalidad preferida, los anticuerpos se emplean para detectar la presencia de un plásmido o bacteriófago que exprese la epoxigenasa relacionada. Por lo tanto, las moléculas de anticuerpo también son útiles en la purificación del plásmido o del bacteriófago que exprese a la epoxigenasa relacionada.

Las moléculas de anticuerpo objetivo también se pueden emplear para purificar a la epoxigenasa recombinante de la invención o a un equivalente de ocurrencia natural o a un homólogo, análogo o derivado de la misma.

La presente invención es descrita además con referencia a los siguientes Ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1 Caracterización de los ácidos grasos epóxidos en Euphorbia lagascae y en Crepis spp

Se seleccionaron las semillas de la especie silvestre Euphorbia lagascae y de diferentes especies de Crepis por medio de cromatografía líquido gas para la presencia que ácidos grasos epóxidos.

Como se muestra en la Tabla 3, Euphorbia lagascae contiene niveles muy altos del ácido graso epóxido, ácido vernólico, en su aceite de la semilla. Se mostró que las semillas de Crepis palaestina contenían 61,4% en peso de ácido vernólico y 0,71% en peso del ácido graso acetilénico, ácido crepénico, de los ácidos grasos totales (Tabla 3).

TABLA 3

6

Ejemplo 2

La enzima, linoleato \Delta12-epoxigenasa sintetiza al ácido vernólico a partir del ácido linoleico. Las linoleato \Delta12-epoxigenasas derivadas a partir de Euphorbia lagascae y de Crepis palaestina se localizan en los microsomas. Las enzimas de estas especies al menos pueden permanecer activas en fracciones de membrana (microsómica) preparadas a partir de semillas en desarrollo.

Las preparaciones de membranas a partir de Euphorbia lagascae y los ensayos de sus actividades de epoxigenasa fueron realizados como lo describen Bafor y colaboradores (1993) con incubaciones que contienen NADPH, a menos que se indique otra cosa en la Tabla 4. La extracción de lípidos, separación y metilación así como las separaciones por medio de GLC y radio-GLC fueron realizadas esencialmente como lo describen Kohn y colaboradores (1994) y Bafor y colaboradores (1993).

Las preparaciones de las membranas a partir de Crepis alpina y de Crepis palaestina fueron obtenidas como sigue. Se cultivaron plantas de Crepis alpine y Crepis palaestina en invernaderos y se cosecharon las semillas en su etapa media de desarrollo (17-20 días después de la floración). Los cotiledones fueron sacados de las cubiertas de las semillas y homogenizados con mortero y pistilo en búfer de fosfato 0,1M, pH 7,2 que contenía sacarosa 0,33M, NADH 4 mM, CoASH 2 mM, 1 mg de albúmina de suero bovino/ml y 4.000 unidades de catalasa/ml. El homogenizado fue centrifugado durante 10 min a 18.000 x g y el sobrenadante resultante centrifugado durante 60 min a 150.000 x g para obtener un precipitado microsómico.

Los ensayos estándar de desaturasa, acetilenasa y epoxigenasa con membranas microsómicas de la especie Crepis se llevaron a cabo a 25ºC con preparaciones microsómicas equivalentes a 0,2 mg de proteína microsómica resuspendida en búfer fresco para homogenización y 10 nmol ya sea de [1-^{14}C]18:1-CoA o de [1-^{14}C]18:2-CoA (actividad específica 85.000 d.p.m./nmol) en un volumen total de 360 \mul. Cuando se utilizó NADPH como coreductor, las membranas fueron resuspendidas en búfer de homogenización donde NADH había sido reemplazado NADPH.

Se llevó a cabo la caracterización bioquímica de la linoleato \Delta12-epoxigenasa microsómica derivada a partir de Euphorbia lagascae y de Crepis palaestina y los datos obtenidos fueron comparados con las características bioquímicas de las enzimas oleato \Delta12-desaturasa y linoleato \Delta12-acetilenasa derivadas a partir de preparaciones microsómicas de Crepis alpina (Tabla 4).

Como se muestra en la Tabla 4, la linoleato \Delta12-epoxigenasa de Crepis palaestina exhibe rasgos bioquímicos similares a la linoleato \Delta12-acetilenasa y la oleato \Delta12-desaturasa de Crepis alpina, en la medida en que las tres enzimas requieran O_{2}, trabajen igualmente bien ya sea con NADH o con NADPH como los coreductores, y son inhibidos por cianuro pero no por monóxido de carbono. Adicionalmente, ninguna de estas enzimas es inhibida por anticuerpos monoclonales contra la reductasa del citocromo P450.

Los datos de la Tabla 4 sugieren que la linoleato \Delta12-epoxigenasa de Crepis palaestina pertenece a la misma clase de enzimas que la oleato \Delta12-desaturasa microsómica y la linoleato \Delta12-acetilenasa de Crepis alpina.

En contraste, la linoleato \Delta12-epoxigenasa de Euphorbia lagascae requiere NADPH como el coreductor, no es inhibida por cianuro, pero es inhibida por monóxido de carbono (Tabla 4). Adicionalmente, los inventores han descubierto que la linoleato \Delta12-epoxigenasa de Euphorbia lagascae es inhibida por anticuerpos monoclonales surgidos contra una enzima reductasa del citocromo P450. Estos datos sugieren que la linoleato \Delta12-epoxigenasa de Euphorbia lagascae pertenece a la clase de proteínas del citocromo P450 y no está por lo tanto relacionada bioquímicamente con la linoleato \Delta12-epoxigenasa de Crepis palaestina.

TABLA 4

7

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3 Estrategia para clonación de genes de epoxigenasa de Crepis palaestina

La clonación de los genes de epoxigenasa de Crepis palestina contó con las características de las enzimas de C. palaestina y de C. alpina descritas en los Ejemplos anteriores.

En particular, se aisló el ARN poli (A)+ a partir de semillas en desarrollo de Crepis palaestina usando un kit de purificación QuickPrep Micro mRNA (Pharmacia Biotechnology) y utilizado para sintetizar un ADNc bicatenario iniciado con oligosacárido d(T). Se ligó el ADNc bicatenario así obtenido a adaptadores EcoRI/NotI (Pharmacia Biotechnology) y se construyó una genoteca de ADNc utilizando el kit de clonación ZAP-cDNA Gigapack (Stratagene).

El ADNc monocatenario fue preparado a partir de ARN derivado de las semillas en desarrollo de Crepis alpina, utilizando procedimientos estándar. Se obtuvo un fragmento de la PCR, designado como D12V (SEQ ID NO: 7), por medio de amplificación del ADNc monocatenario utilizando iniciadores derivados de las secuencias deducidas de aminoácidos de monoxigenasas de la planta con función mixta.

El fragmento D12V fue marcado posteriormente en forma aleatoria y utilizado para seleccionar la genoteca de ADNc de Crepis palaestina supra sobre filtros de membrana Hybond N^{+} de Amersham de acuerdo a las prescripciones del fabricante, utilizando condiciones de hibridación estándar. Esta aproximación resultó en la purificación de un bacteriófago recombinante, designado como Cpa12.

Se determinó la secuencia de nucleótidos del ADNc de Cpa12 y se la expuso en la SEQ ID NO: 1.

El ADNc de Cap12 parece ser de longitud completa. Una representación esquemática de un vector de expresión que comprende al ADNc de Cap12 es presentada en la Figura 1. La construcción genética expuesta allí está diseñada para ser introducida dentro del material de la planta para la producción de una planta transgénica que exprese a la epoxigenasa objetivo. Aquellos entrenados en el arte reconocerán que se pueden producir vectores similares de expresión, sin experimentación excesiva, y utilizarlos para la producción de plantas transgénicas que expresen cualquiera de las secuencias genéticas de la actual invención, por medio del reemplazo del ADNc de Cpa12 con otra secuencia génica estructural.

Como se muestra en la Figura 2, la secuencia de nucleótidos del ADNc de Crep1 codificó a un polipéptido que estaba muy cercanamente relacionado con el nivel de aminoácidos, al menos para una enzima acetilenasa de C. alpina (Bafor y colaboradores, 1997; Solicitud Internacional de Patente No. PCT/SE97/00247).

El inserto de 1,4 kb de pCpal2 fue secuenciado (SEQ ID NO: 1) y se mostró que contiene un marco de lectura abierta que codifica a un polipéptido de 374 aminoácidos de longitud. La secuencia deducida de aminoácidos de Cpa12 mostró un 81% de identidad y un 92% de similitud con la \Delta12-acetilenasa de Crepis alpina, y aproximadamente 60% de identidad y 80% de similitud con las proteínas de la \Delta12-desaturasa microsómica de la planta (Figura 2). Sin embargo, el péptido codificado por Cpa12 contiene diferencias significativas en la secuencia de aminoácidos comparada con las enzimas no epoxigenasas. En particular, la Cpa12 tiene una supresión de seis aminoácidos contiguos en la región 5' terminal comparado con todas las \Delta12-desaturasas microsómicas, y una supresión de dos aminoácidos contiguos en la región terminal 3' comparado con la \Delta12-acetilenasa de Crep1 (Figura 2).

Aunque los genes de la desaturasa de ácido graso enlazado a la membrana muestran homologías de secuencia limitadas, todas ellas contienen tres regiones de motivos conservados ricos en histidina como sigue:

	(i)	His-(Xaa)_{3-4}-His;
	(ii)	His-(Xaa)_{2-3}-His-His; y
	(iii)	His-(Xaa)_{2-3}-His-His,

en donde His designa a histidina, Xaa designa a cualquier residuo aminoácido de ocurrencia natural como se expone aquí en la Tabla 1, el entero (Xaa)_{3-4} se refiere a una secuencia de aminoácidos que contiene tres o cuatro repeticiones de Xaa, y el entero (Xaa)_{2-3} se refiere a una secuencia de aminoácidos que contiene dos o tres repeticiones de Xaa. Se sugiere que estas regiones ricas en histidina son parte del centro activo de la enzima (Shanklin y colaboradores, 1994).

La secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc de Cpa12 contiene tres motivos ricos en histidina similares, pero no idénticos, a los motivos ricos en histidina de las enzimas \Delta12-desaturasas. Estos datos sugieren que el ADNc de Cpa12 codifica a una enzima que pertenece a la clase de enzimas monoxigenasa de función mixta.

El análisis de ácidos grasos presentado en el Ejemplo 1 supra indica que el ácido vernólico estaba presente al menos en las semillas de Crepis palaestina. Esta enzima puede en realidad estar presente exclusivamente en las semillas de d C. palaestina. La expresión del gen Cpa12 fue examinada utilizando la región no traducida 3' del clon de ADNc de Cpa12 como una sonda de hibridación sobre transferencias de northern de ARNm derivado de semillas en desarrollo y de hojas de C. palaestina. Como se muestra en la Figura 3, el gen Cpa12 fue altamente expresado en las semillas en desarrollo pero no se podía detectar expresión en las hojas. Estos datos son consistentes con el perfil de actividad de la enzima de la linoleato \Delta12-epoxigenasa de C. palaestina en estos tejidos.

Ejemplo 4 Estrategia para la clonación de los genes de epoxigenasa de Euphorbia lagascae

La clonación de los genes de epoxigenasa de Euphorbia lagascae cuanta con las características de las enzimas de E. lagascae como se describió en los Ejemplos precedentes.

En una aproximación realizada para clonar los genes de epoxigenasa de Euphorbia lagascae, se recolectó ARN a partir de embriones inmaduros de Euphorbia lagascae tomados en una etapa de síntesis activa de ácido vernólico y se lo utilizó para construir una genoteca de ADNc. La genoteca de ADNc fue construida en el vector Lambda Zap II (Stratagene) como se describió en el Ejemplo anterior, con la excepción de que los insertos de ADNc fueron clonados en una forma direccional dentro de los sitios EcoRI-XhoI del vector plásmido embebido en el vector lambda.

Se sintetizó el iniciador PCR degenerado expuesto en la Figura 4 (SEQ ID NO: 18) y se lo utilizó para amplificar las secuencias de nucleótidos que codifican a las secuencias de la enzima P450 de la genoteca de ADNc de Euphorbia lagascae. Para las reacciones de amplificación de la PCR, se extrajo una alícuota de 100 \mul de la genoteca de ADNc con fenol:cloroformo [1:1(v/v)] y se precipitó el ADN por medio de la adición de 2 volumenes de etanol y finalmente se lo resuspendió en 100 \mul de agua. Se utilizó una alícuota (1 \mul) del ADN resuspendido como patrón en una reacción de amplificación por PCR. Las reacciones por PCR fueron realizadas en 10 \mul de búfer TaqI polimerasa que contenía 200 \muM de cada dNTP, 10 pmol del iniciador degenerado, 1 pmol del iniciador del promotor T7 polimerasa y 0,4 unidades de TaqI polimerasa.

Las condiciones de amplificación fueron 2 min a 94ºC, y cinco ciclos, cada ciclo comprendiendo 1 min a 48ºC seguido por 2 min a 72ºC seguido por 30 seg a 93ºC, luego 28 ciclos, cada ciclo comprendiendo 30 seg a 55ºC seguido por 90 seg a 72ºC seguido por 30 seg a 93ºC, y finalmente un ciclo comprendiendo 30 seg a 55ºC seguido por 10 min a 72ºC seguido por 1 min a 25ºC.

Los productos PCR fueron purificados y digeridos utilizando EcoRI y XhoI, y luego subclonados dentro del vector Bluescript para la caracterización de la secuencia. Se encontró que uno de los clones PCR codifica una secuencia de P450 y fue utilizado como una sonda para aislar un clon de ADNc de longitud completa. Esta secuencia de nucleótidos es expuesta en la SEQ ID NO: 19. La SEQ ID NO: 19 tenía similitud con otros miembros de la familia 2C de los genes de P450. En particular, la SEQ ID NO: 19 muestra en promedio un 40% de identidad con las secuencias de la epoxigenasa araquidónica humana y de rata, utilizando el programa BLAST.

Adicionalmente, se mostró que el transcripto con la SEQ ID NO: 19 se expresa en las semillas de Euphorbia lagascae pero no en las raíces o en las hojas (Figura 5B). El transcripto con la SEQ ID NO: 19 fue detectado en las semillas en desarrollo de Vernonia galamensis pero no en aquellas de E. cyparissis o de lino, dos especies que no producen ácidos grasos epóxidos (Figuras 5A y 5B).

En una aproximación alternativa realizada para clonar a los genes de epoxigenasa de Euphorbia lagascae, se empleó una estrategia de hibridación sustractiva para aislar los genes que se expresan específicamente en un organismo que produce niveles altos de ácidos grasos epóxidos.

En particular, el método de hibridación sustractiva descrito en la Figura 6 fue empleado para aislar los genes de la epoxigenasa que se expresaron específicamente en Euphorbia lagascae, que produce niveles altos del ácido graso epóxido, ácido vernólico (Ejemplo 1) y no en la especie estrechamente relacionada Euphorbia cyparissus, que no produce ácido vernólico.

Por lo tanto, se aisló el ARNm de los embriones en desarrollo de Euphorbia lagascae en una etapa en donde ellos están sintetizando activamente ácido vernólico y utilizado para generar al así llamado ADNc "probador". Adicionalmente, se aisló el ARNm a partir de los embriones en desarrollo de E. cyparissis (en una etapa similar de desarrollo que E. lagascae) y utilizado para generar al así llamado ADNc "conductor".

El procedimiento de hibridación sustractiva conduce a una genoteca que fue enriquecida por secuencias exclusivamente expresadas en Euphorbia lagascae. Los clones de esta genoteca fueron secuenciados y al menos dos de las secuencias fueron identificadas por codificar a las proteínas de P450 con base en la similitud con otras secuencias de P450 en la base de datos. Estos dos clones por PCR de P450 fueron utilizados como sondas para aislar a los clones correspondientes de ADNc de longitud completa de la genoteca de ADNc mencionada anteriormente.

Uno de los ADNc aislados de P450, que contiene a la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 20, parece ser expresada en los tejidos de Euphorbia lagascae (Figura 7B) y no se detectaron transcriptos homólogos en el tejido de la semilla de E. cyparissus o de lino, dos especies que no producen ácidos grasos epóxidos. La secuencia deducida de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20 indica que el clon de ADNc es de longitud completa y codifica a una enzima de P450. Estos datos sugieren que el ADNc ejemplificado por la SEQ ID NO: 20 puede codificar a una epoxigenasa, por ejemplo la linoleato \Delta12-epoxigenasa que convierte al ácido linoleico en ácido vernólico.

Ejemplo 5 Demostración de la actividad de la epoxigenasa

La confirmación de que los clones de ADNc que ejemplifican la invención codifican las actividades de la epoxigenasa fue obtenida por medio de la transformación de Arabidopsis thaliana, que no produce ácidos grasos epóxidos, en particular ácido vernólico, con cada clon candidato individual y examinando el tejido transformado por la presencia de ácidos grasos epoxigenados que ellos no producirían de otra manera, o por los hidroxi ácidos grasos que se pueden formar a partir del metabolismo de un ácido graso epoxigenado por medio de la acción de hidrolasas epóxidas endógenas (Blee y Schuber, 1990).

El ADNc de la epoxigenasa que contiene la SEQ ID NO: 1 fue clonado dentro de la construcción del vector Binario expuesto en la Figura 8. En resumen, la secuencia de ADNc fue subclonada a partir del plásmido pCpal2 (Figura 1) dentro del plásmido binario, por medio de la digestión de pCpal2 con EcoRI y rellenando el extremo del fragmento de restricción utilizando a la enzima T4 ADN polimerasa. El vector Binario (Figura 8) fue linealizado utilizando BamHI y también rellenando el extremo utilizando T4 ADN polimerasa. Para las reacciones de relleno del extremo se resuspendió 1 \mug de inserto de ADNc o del ADN del vector Binario linealizado en 50 \mul de búfer con T4 ADN polimerasa (Tris-acetato 33 mM pH 7,9, acetato de potasio 66 mM, acetato de magnesio 10 mM y DDT 5 mM) suplementado con 100 mM de cada dNTP y 0,1 mg/ml de BSA y 3 unidades de T4 ADN polimerasa, y se incubó por un período de 6 min a 37ºC. La reacción se suspendió por medio de calentamiento a 75ºC durante 10 min. El ADNc con extremo romo y el ADN del vector Binario fueron ligados utilizando T4 ADN ligasa y las condiciones estándar de ligación recomendadas por Promega. Se seleccionaron los clones en los cuales se inserto la secuencia SEQ ID NO: 1 por detrás del promotor de napina, en la orientación sentido, permitiendo así la expresión del polipéptido epoxigenasa. El plásmido Binario que cosecha la SEQ ID NO: 1, en la orientación sentido, operativamente bajo el control del promotor truncado de napina, se representa esquemáticamente en la Figura 9.

El plásmido Binario expuesto en la Figura 9 fue transformado dentro de una cepa de Agrobacterium AGLI utilizando electroporación y utilizado para transformar a la Arabidopsis thaliana. Las plantas de A. thaliana se obtuvieron de acuerdo al método descrito por Valvekens y colaboradores (1988) y Dolferus y colaboradores (1994).

Las plantas transgénicas y las plantas no transformadas (esto es, de control) crecieron hasta la madurez. La semilla madura de cada planta fue analizada por la composición de ácidos grasos por medio de técnicas estándar. Se establecieron las plantas con transformante primario (T_{o}) y se cosecharon las semillas T1 de cada planta y se las analizó por la composición de ácidos grasos por medio de cromatografía de gases. Doce plantas T_{o} mostraron que contenían ácido vernólico en los lípidos de sus semillas en concentraciones en un rango entre 0,9% y 15,8% de ácidos grasos totales, mientras que las plantas de control no transformadas no contenían ácido vernólico (Tabla 5). La línea de plantas con expresión más alta fue la Cpal-17, para la cual se presentan los perfiles de elución por GLC (por análisis a través de una columna empacada y de una columna capilar) en la Figura 10. El perfil de elución por GLC de la columna empacada para el control no transformado es mostrado también en la Figura 10.

TABLA 5

9

Alternativamente, o adicionalmente, las secuencias putativas de epoxigenasa de ácido graso descritas aquí son transformadas cada una dentro de Linum usitatissimun (lino) y Arabidopsis thaliana bajo el control del promotor específico para la semilla de napina. Las plantas de lino transgénico y de Arabidopsis thaliana se examinaron por la presencia de ácidos grasos epóxidos en oleaginosas en desarrollo. El trabajo previo ha mostrado que si se alimentan los ácidos grasos epóxidos a los embriones de lino en desarrollo, éstos se incorporan dentro de los triglicéridos (Ejemplo 10).

Alternativamente, las levaduras también son transformadas con los clones de epoxigenasa de la invención y ensayados para la producción de ácidos grasos epóxidos.

Ejemplo 6 Confirmación por espectroscopia de masas de los ácidos grasos epóxidos en semilla de Arabidopsis T_{1} soportada sobre plantas transgénicas primarias T_{0}

La cromatografía de gases de los ésteres metílicos preparados a partir de los lípidos de semilla de semilla T1 de plantas de Arabidopsis thaliana transformadas con Cpal2 (Ejemplo 5) reveló la presencia de dos ácidos grasos adicionales comparado con los controles no transformados. El primero de estos compuestos tenía un tiempo de retención equivalente a aquel del estándar de ácido vernólico. El segundo compuesto tenía un tiempo de retención más largo y fue identificado putativamente como ácido 12,13-epoxi-9,15-octadecadienóico, un derivado esperado de ácido vernólico, resultante de la desaturación en la posición A 15 por medio de la \Delta15-desaturasa endógena de Arabidopsis thaliana.

La confirmación de la identidad exacta de los dos picos se obtuvo por medio de espectroscopía de masas de dioles que fueron preparados a partir de la fracción de ácido graso epóxido derivada de plantas transformadas con Cpal2. Los dioles fueron convertidos además en éteres de trimetilsililo y analizados por medio de GC-MS DB23 sobre una columna capilar de sílice fundida (Hewlett-Packard 5890 II GC acoplada a un Hewlett-Packard 5989A MS trabajando en impacto electrónico a 70eV15). El cromatograma iónico total mostró dos picos como sigue:

(i)

El primer pico de elución tenía iones prominentes de masa 73, 172, 275 y 299, indicando que el grupo epoxi estaba posicionado en C-12 de un ácido graso C18 y que ocurrió un doble enlace entre el grupo epoxi y el carboxilo terminal. Este espectro de masas fue idéntico al espectro de un éter de trimetilsililo derivado de dioles preparados a partir de ácido vernólico puro (ácido 12,13-epoxi-9-octadecenóico); y

(ii)

El segundo pico de elución tenía iones prominentes de masa 73, 171, 273 y 299, indicando la presencia de dos dobles enlaces y un grupo epoxi posicionado en C-12 de un ácido graso C18, consistente con el espectro de masa para el ácido 12,13-epoxi-9,15-octadecadienóico.

Ejemplo 7 Análisis de ácidos grasos de plantas transgénicas de Arabidopsis Cpal2

La semilla T1 derivada de plantas transformadas de Arabidopsis thaliana que expresan al clon de ADNc Cpa12 bajo el control del promotor de napina fue germinada y se establecieron plantas T1 a partir de cinco líneas T_{0} (Nos. 4, 8, 13, 17 & 21 en la Tabla 5). Se cosechó la semilla T2 de cada planta T1 y se la analizó por la composición de ácidos grasos. La progenie de los transformantes Nos. 4, 8, 13 y 21 (Tabla 5) segregada como se esperaba por la presencia de ácido vernólico, con aquellas plantas conteniendo ácido vernólico en un rango hasta del 3,1% (Tabla 6).

Todas las plantas T1 que contenían ácido vernólico (esto es, epoxi 18:1 en la Tabla 6) también contenían ácido 12,13-epoxi-9,15-octadecadienóico (esto es, epoxi 18:2 en la Tabla 6; ver también la Figura 11), indicando que algo del ácido vernólico sintetizado por la epoxigenasa Cpal2 fue posteriormente desaturada por medio de la \Delta15-desaturasa endógena.

TABLA 6

11

(Continuación)

12

\newpage

(Continuación)

14

Ejemplo 8 Análisis de ácidos grasos de plantas transgénicas de Linola Cpal2

La construcción del plásmido binario descrita anteriormente que contiene al clon de ADNc Cpal2 (Figura 9) fue transformada dentro de la cepa AGL1 de Agrobacterium tumefaciens, utilizando electroporación. La A. tumefaciens transformada fue utilizada para infectar a los explantes de Eyre de una variedad de Linum usitatissimun como lo describen Lawrence y colaboradores (1989), excepto que el medio MS fue utilizado como el medio básico para la inducción de las raíces sobre material regenerado de vástago.

Dos transformantes primarios de Linola (plantas T0) denominados AP20 y AP21 fueron confirmados como transgénicos por medio de PCR utilizando iniciadores dirigidos contra el gen Cpal2 y por medio de la demostración de que estas plantas eran resistentes a la kanamicina. Se analizaron diez semillas T1 individualmente para la composición de ácidos grasos utilizando técnicas estándar.

Como se muestra en la Tabla 7, las semillas de AP20 segregadas en 3 clases, constaban de tres semillas sin ácido vernólico, dos con ácido vernólico superior al 0,7%, y cinco con niveles intermedios de ácido vernólico (0,13-0,47%).

En forma similar, las semillas de AP21 segregadas en 3 clases, constaban de cinco semillas sin ácido vernólico, dos con ácido vernólico superior al 0,25%, y tres con un nivel intermedio de ácido vernólico (0,09-0,14%) (Tabla 8).

Por lo tanto, se obtuvo un total de doce semillas que contenían ácido vernólico. Ocho de las doce semillas de AP20 y AP21 que contenían ácido vernólico también contenían ácido 12,13-epoxy-9,15-octadecadienóico.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 7

15

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 8

16

\newpage

Se establecieron cuatro plantas T1 de los semilleros de AP20 resistentes a la kanamicina. Se mostró posteriormente que las cuatro plantas producían ácido vernólico en sus semillas T2 (Tabla 9). Los niveles de ácidos grasos epóxidos 18:2 no fueron analizados en estas semillas T2.

TABLA 9

19

Ejemplo 9 Producción de ácidos grasos epóxidos en organismos transgénicos

La producción de un aceite rico en ácido vernólico se logro por medio de la transformación del gen de la epoxigenasa descrito aquí, en particular de la SEQ ID NO: 1, dentro de Arabidopsis thaliana, como se describió en los Ejemplos anteriores. Como se muestra en la Tabla 5, las líneas transgénicas de A. thaliana que expresan la SEQ ID NO: 1 producen niveles altos de ácido vernólico en sus semillas, con relación a otros ácidos grasos. En particular, en una línea transgénica (Cpal-17), el ácido vernólico producido es tan alto como el 15,2% (p/p) del contenido total de ácido graso en las semillas.

La producción de un aceite rico en ácido vernólico se logra también por medio de la transformación del gen de la epoxigenasa descrito aquí, en cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 19 ó 20 y preferiblemente en cualquiera de las SEQ ID NOs: 1 ó 3 ó 5, dentro de cualquier organismo que acumula aceite que normalmente tiene niveles muy altos de ácido linoléico y actividad mínima de otras enzimas que compiten, capaz de utilizar ácido linoléico como sustrato. Las secuencias genéticas de la invención se colocan operativamente bajo el control de un promotor que produce expresión de alto nivel en oleaginosas, por ejemplo el promotor específico para semillas de napina.

En otra aproximación alternativa para la transformación de A. thaliana, se transformaron genotipos linoléicos altos de lino, girasol, maíz o cártamo con la epoxigenasa de la invención. Los altos niveles de ácido vernólico se producen por medio de plantas transgénicas durante la síntesis de aceite de semilla, cuando el gen de la epoxigenasa se expresa en niveles altos.

Alternativamente, se transforma lino Linola® (= ácido linolénico bajo) con la epoxigenasa de la invención. Los altos niveles de ácido vernólico son producidos por medio de plantas transgénicas de lino Linola® durante la síntesis de aceite de semilla, cuando el gen de la epoxigenasa se expresa en niveles altos.

Adicionalmente, los inventores han mostrado que el ácido vernólico marcado alimentado a las semillas de lino en desarrollo no se degrada sino que se incorpora dentro de lípidos de almacenamiento en todas las tres posiciones de la molécula de triglicérido (ver Ejemplo 10). Consistente con estos datos, los niveles altos de ácido vernólico sintetizado por la epoxigenasa introducida se depositan fácilmente en los triglicéridos de aceite de semilla de esta especie.

Ejemplo 10 Incorporación de ácido oleico y de ácido vernólico dentro de los lípidos de los cotiledones de la semilla de lino en desarrollo

Los cotiledones separados de la semilla de lino en desarrollo (seis pares en cada incubación, incubaciones por duplicado) en la etapa media del desarrollo de la semilla (20 días después de la floración) fueron incubados con 10 nmol de las sales de amonio ya sea del ácido vernólico[1-^{14}C] (actividad específica 3000 d.p.m./nmol) o ácido oleico[1-^{14}C] (actividad específica 5000 d.p.m./nmol) en 0,2 ml de búfer de fosfato pH 7,2 durante 30 min a 30ºC. Se lavaron entonces los cotiledones tres veces con 1 ml de agua destilada y se extrajo inmediatamente ya sea en un Ultra Turrax de acuerdo con Bligh y Dyer (1959) o se incubó adicionalmente en 0,5 ml de búfer de fosfato 0,1 M pH 7,2 durante 90 ó 270 min antes de la extracción. Se metiló una alícuota de los lípidos en la fase de cloroformo y se separó sobre placas para TLC en gel de sílice en n-hexano/dietiléter/ácido acético (85:15:1). El resto de los lípidos en la fase de cloroformo de cada muestra fueron aplicados sobre dos placas separadas para TLC en gel de sílice y se desarrollaron las placas en cloroformo/metanol/ácido acético/agua (85:15:10:3,5 en volumen) para la separación de lípidos polares y en n-hexano/dietiléter/ácido acético (60:40:1,5) para la separación de lípidos neutros. Las áreas de lípido con migración correspondientes a estándares auténticos fueron removidas y se cuantificó la radioactividad en cada lípido por medio del recuento de centelleo líquido.

La recuperación del marcador ^{14}C en la fase de cloroformo es descrita en la Figura 12. Algo más de la mitad de la radioactividad añadida tanto del ácido oleico[^{14}C] como de ácido vernólico[^{14}C] fueron recibidos por los cotiledones y recobrados como sustancias lipofílicas después de 30 min de la marcación por impulso. Esta cantidad permaneció virtualmente inalterada durante los 270 min adicionales de incubación con ambos sustratos. La separación de los metilésteres radioactivos de los lípidos mostró que la mayor parte de la radioactividad (92%) de los experimentos alimentados con ácido vernólico[^{14}C] residió en compuestos con la misma migración del metil-vernolato, indicando que el grupo epoxi permaneció intacto en los cotiledones de las semillas de lino durante los 270 min de la
incubación.

Aproximadamente 28% de la actividad a partir de la alimentación con ácido vernólico[^{14}C] que estaba presente en la fase de cloroformo residía en la fosfatidilcolina después de 30 min, y la radioactividad disminuyó hasta únicamente el 5% a los 300 min de la incubación (Figura 13).

Aproximadamente 22% de la actividad a partir de la alimentación con ácido oleico[^{14}C] que estaba presente en la fase de cloroformo residía en la fosfatidilcolina después de 30 min, y la radioactividad disminuyó hasta aproximadamente el 11% a los 300 min de la incubación (Figura 13).

Aproximadamente 32% de la actividad a partir de la alimentación con ácido vernólico[^{14}C] que estaba presente en la fase de cloroformo residía en los triacilgliceroles después de 30 min, y la radioactividad incremento hasta el 60% a los 300 min de la incubación (Figura 14). Los diacilgliceroles contenían algo como el 24% de la actividad en los experimentos de alimentación con ácido vernólico[^{14}C] y esta cantidad permaneció bastante constante durante los períodos de incubación.

Aproximadamente 5% de la actividad a partir de la alimentación con ácido oleico[^{14}C] que estaba presente en la fase de cloroformo residía en los triacilgliceroles después de 30 min, y la radioactividad incrementó hasta el 18% a los 300 min de la incubación (Figura 14). Los diacilgliceroles contenían algo como el 19% de la actividad después de 30 min en los experimentos de alimentación con ácido oleico[^{14}C] y esta cantidad permaneció bastante constante durante los períodos de incubación.

El experimento anterior muestra que los cotiledones de la semilla de lino no metabolizan al grupo epoxi del ácido vernólico en gran medida. Además muestra que los cotiledones de la semilla de lino poseen mecanismos para remover en forma eficiente al ácido vernólico de los lípidos de la membrana e incorporarlos dentro de los triacilgliceroles.

Ejemplo 11 Clonación de los genes de \Delta12-epoxigenasa de otras especies que contienen epoxi ácido

Los homólogos del gen de la \Delta12-epoxigenasa Cpal2 se obtienen a partir de otras especies que son ricas en ácidos grasos epóxidos, por medio de la clonación de los miembros de la familia de genes de monoxigenasas de función mixta A12 que se expresan altamente en las semillas en desarrollo y comparando sus secuencias de aminoácidos con aquellas secuencias conocidas de \Delta12-desaturasa y \Delta12-epoxigenasa. Tales genes se clonan ya sea por selección de genotecas de ADNc de semilla en desarrollo con sondas genéticas con base ya sea en el gen Cpal2 (SEQ ID NO: 1) o el fragmento D12V (SEQ ID NO: 7), o por medio de amplificación de fragmentos por PCR utilizando iniciadores diseñados contra secuencias conservadas de las monoxigenasas de la planta de función mixta A12, como se describió aquí. Las secuencias putativas \Delta12-epoxigenasa muestran una mayor identidad de secuencia total con las secuencias de la \Delta12-epoxigenasa divulgada aquí, que con las secuencias conocidas de la A12-desaturasa.

En un ejemplo de esta aproximación, se obtuvo una secuencia de longitud completa del tipo de la \Delta12-epoxigenasa a partir de una Crepis sp. no identificada que contenía niveles altos de ácido vernólico en sus aceites de semilla y conocida por no ser Crepis palaestina. Se aisló ARN poli(A)+ a partir de semillas en desarrollo de esta Crepis sp. usando un kit de purificación QuickPrep Micro mRNA (Pharmacia Biotechnology) y utilizado para sintetizar un ADNc bicatenario iniciado con oligosacárido d(T). Se ligó el ADNc bicatenario así obtenido a adaptadores EcoRI/NotI (Pharmacia Biotechnology) y se construyó una genoteca de ADNc utilizando el kit de clonación ZAP-cDNA Gigapack (Stratagene). Se seleccionó la genoteca de ADNc sobre filtros de membrana Hybond N+ (Amersham) con el fragmento D12V marcado en forma aleatoria (SEQ ID NO: 7) derivado de Crepis alpina como lo describe el fabricante, utilizando condiciones estándar de hibridación. Esto resultó en la purificación de un bacteriófago recombinante designado como CrepX.

Se determinó la secuencia de nucleótidos del ADNc de CrepX y se la expuso en la SEQ ID NO: 3. La secuencia deducida de aminoácidos de CrepX (SEQ ID NO: 4) contiene una proteína de 374 aminoácidos que tiene 97% de identidad con la secuencia de la \Delta12-epoxigenasa Cpal2, pero únicamente 57% de identidad con la secuencia de la \Delta12-desaturasa L26296 de Arabidopsis thaliana. Esto demuestra claramente la presencia de un gen en otra Crepis sp. que tiene un alto contenido de ácido vernólico, cuyo gen es altamente homólogo con el gen de la \Delta12-epoxigenasa Cpal2 y claramente no es un gen de desaturasa.

En un segundo ejemplo de esta aproximación, se obtuvo una secuencia parcial del tipo de la \Delta12-epoxigenasa de la especie de Vernonia galamensis que contiene ácido vernólico. Se prepararon patrones de ADNc de la primera cadena a partir del ARN total aislado de las semillas en desarrollo de V. galamensis utilizando procedimientos estándar.

Se obtuvo un fragmento de PCR (550 nucleótidos de longitud), designado como VgaII, por medio de la amplificación del ADNc monocatenario utilizando iniciadores derivados de la secuencia deducida de aminoácidos de las monoxigenasas de función mixta de la planta. Se determinó la secuencia de nucleótidos del ADN amplificado utilizando procedimientos estándar y se la expone en la SEQ ID NO: 5.

El alineamiento de la secuencia deducida de aminoácidos del fragmento de PCR Vgal1 (SEQ ID NO: 6) con la secuencia completa de la \Delta12-epoxigenasa Cpal2 y de la \Delta12-desaturasa L26296 de Arabidopsis thaliana (Figura 12) demuestra que la secuencia amplificada de Vgal1 codifica a una secuencia de aminoácidos que corresponde a la región de expansión de los residuos aminoácidos 103-285 del polipéptido Cpal2. Dentro de esta región, la secuencia de Vgal1 mostró una mayor identidad de aminoácidos con la secuencia de la \Delta12-epoxigenasa Cpal2 (67%) que con la secuencia de la A12-desaturasa de A. thaliana (60%), sugiriendo que el ADN amplificado corresponde a una epoxigenasa en vez de a una secuencia de desaturasa.

Aquellos capacitados en el arte sabrán que la presente invención es objeto de variaciones y de modificaciones diferentes a aquellas específicamente descritas aquí. Se debe entender que la invención incluye a todas estas variaciones y modificaciones. La invención también incluye todas las etapas, características, composiciones y compuestos mencionados o indicados en esta descripción, individual o colectivamente, y a cualquiera o a todas las combinaciones de dos o más de dichas etapas o características.

Referencias

1. An y colaboradores (1985) EMBO J. 4:277-284.

2. Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, RE, Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., y Struhl, K. (1987). En: Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience (ISBN 047150338).

3. Badami, R.C., y Patil, K.B. (1981) Progress in Lipid Research, 19, 119-53.

4. Bafor, M., Smith, M.A., Jonsson, L., Stobart, K. y Stymne, S. (1993) Arch. Biochem. Biophys. 303, 145-151.

5. Bafor, M., Banas, A., Wiberg, E., Lenman, M., Stahl, U. y Stymne, S. (1997) En: Williams, J.P., Mobasher, K.U., Lem, N.W. (eds) Physiology, biochemistry and molecular biology of plant lipids. Kluwer Academic Publisher, Dordrecht. En prensa.

6. Blee y Schuber (1990) J. Biol. Chem. 265, 12887-12894.

7. Blee, E., Wilcox, A.L., Marnett, J.M., Schuber, F. (1993) J. Biol. Chem. 268, 1798-1715.

8. Blee, E., Stahl, S., Schuber, F. y Stymne, S. (1994) Biochem. Biophys. Res. Comm. 197, 778-784

9. Bligh, E.G. and Dyer, W.J. (1959) Can. J. Biochem. Physiol. 230, 379-288.

10. Bozak, K.R., Yu, H., Sirevag, R. y Christoffersen, R.E. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3904-3908.

11. Christou, P., McCabe, D.E., Swain, W.F. (1988). Plant Physiol 87, 671-674.

12. Crossway y colaboradores (1986) Mol. Gen. Genet. 202, 179-185.

13. Devereux, J., Haeberli, P. y Smithies, O. (1984). Nucl. Acids Res. 12, 387-395.

14. Dolferus y colaboradores Plant Physiol.(1994) 105, 1075-1087.

15. Engeseth, N. & Stymne, S. (1996) Planta 198, 238-245

16. Fromm y colaboradores (1985) Proc. Natl. Acad Sci. (USA) 82,5824-5828.

17. Haseloff, J. y Gerlach, W.L. (1988). Nature 334, 586-594.

18. Herrera-Estrella y colaboradores (1983a) Nature 303, 209-213.

19. Herrera-Estrella y colaboradores (1983b) EMBO J. 2, 987-995.

20. Herrera-Estrella y colaboradores (1985) En: Plant Genetic Engineering, Cambridge University Press, NY, páginas 63-93.

21. Kohn, G., Hartmann, E., Stymne, S. & Beutelmann, P. (1994) J. Plant Physiol. 144, 265-271

22. Krens, F.A., Molendijk, L., Wullems, G.J. y Schilperoort, R.A. (1982). Nature 296, 72-74.

23. Lawrence, G.J., Ellis, J.G., Finnegan, E.J., Dennis, E.S. y Peacock, W. J. (1989) En: Breeding Research: The Key to Survival of the Earth (Iyama, S. y Takeda, G. eds) 6th International Congress of SABRAO. páginas 535-538.

24. Lazo, G.R., Stein, P.A. y Ludwig, R.A. (1991). Bio/technology 9, 963-967.

25. Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453.

26. Pazkowski y colaboradores (1984) EMBO J. 3, 2717-2722.

27. Pietrzak, M., Shillito, R.D., Hohn, T. y Potrykus, I. (1986). Nucl. Acids Res. 14, 5857-5868.

28. Sanger, F., Nicklin, S. y Coulson, A.R. (1977). Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 72, 5463-5467.

29. Shanklin, J., Whittle, E. y Fox, B.G. (1994) Biochemistry 33, 12787-12794.

30. Valvekens y colaboradores (1988) Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 85, 5536-5540.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization AND Sten Stymne

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: GENES DE EPOXIGENASA VEGETAL DE ÁCIDO GRASO Y LA UTILIZACIÓN DE ESTOS GENES

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 20

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DIRECCIÓN: DAVIES COLLISON STREET

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 1 LITTLE COLLINS STREET

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: MELBOURNE

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: VICTORIA

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: AUSTRALIA

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

ZIP: 3000

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA QUE PUEDE LEERSE EN EL COMPUTADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

COMPUTADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICTUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE LA SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICTUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE LA SOLICITUD: AU PO6223

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 15 DE ABRIL DE 1997

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICTUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE LA SOLICITUD: AU PO6226

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 15 DE ABRIL DE 1997

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICTUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE LA SOLICITUD: US 60/043706

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 16 DE ABRIL DE 1997

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICTUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE LA SOLICITUD: US 60/050403

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 20 DE JUNIO DE 1997

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: HUGHES, DR E JOHN L

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

REFERENCIA/NÚMERO DEL EXPEDIENTE: MRO/EJH/JMC

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE LAS TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: +61 3 9254 2777

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: +61 3 9254 2770

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TELEX: AA 31787

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1358 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 30..1151

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

20

21

22

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 374 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

24

25

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1312 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Crepis sp.

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 26..1147

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

27

28

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 374 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

30

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 550 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Vernonia galamensis

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..545

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

33

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 183 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

35

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 177 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Crepis alpina

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..177

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 59 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 383 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Arabidopsis thaliana

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

39

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 384 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Brassica juncea

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

41

42

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 383 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Glycine max

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

44

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 383 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Solanum commersonii

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

46

47

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 387 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Glycine max

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

48

49

50

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 387 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Ricinos communis

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

51

52

53

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Glu Cys Gly His His}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Arg Asn His His}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Val Met His His}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGAATTCCY TBMGNNNNYT SGGNHTBGG

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1610 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Euphorbia lagascae

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 8..1546

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

55

56

57

58

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1698 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 8..1504

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

59

60

61

62

Claims (35)

1. Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica o es complementaria a una molécula aislada de ácido nucleico que codifica a una epoxigenasa que es un polipéptido de monoxigenasa de función mixta que es capaz de catalizar la epoxigenación de un enlace de carbono en una molécula de ácido graso, en donde dicha epoxigenasa comprende una secuencia de aminoácidos que tiene los tres motivos ricos en histidina:

(i) His-(Xaa)_{3-4}-His; (ii) His-(Xaa)_{2-3}-His; y (iii) His-(Xaa)_{2-3}-His-His.

2. La molécula aislada de ácido nucleico de acuerdo a la reivindicación 1, en donde el enlace de carbono es un doble enlace en una molécula de ácido graso insaturada.

3. La molécula aislada de ácido nucleico de acuerdo a las reivindicaciones 1 ó 2, en donde dicha epoxigenasa es una enzima \Delta6-epoxigenasa, una enzima \Delta9-epoxigenasa, una enzima \Delta12-epoxigenasa o una enzima \Delta15-epoxigenasa.

4. La molécula aislada de ácido nucleico de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, derivada de una planta.

5. La molécula aislada de ácido nucleico de acuerdo a la reivindicación 4, en donde la planta se selecciona de la lista que comprende Crepis spp., Euphorbia spp., Chrysanthemum spp. y Vernonia spp.

6. La molécula aislada de ácido nucleico de acuerdo a la reivindicación 4, en donde la planta produce niveles altos de ácido vernólico.

7. La molécula aislada de ácido nucleico de acuerdo a la reivindicación 5, en donde la planta se selecciona de la lista que comprende Crepis biennis, Crepis aurea, Crepis conyzaefolia, Crepis intermedia, Crepis occidentalis, Crepis palaestina, Crepis vesicaria, Crepis xacintha y Vernonia galamensis.

8. La molécula aislada de ácido nucleico de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende una secuencia de nucleótidos que es aproximadamente al menos 65% idéntica a una cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 3 ó 5 o una secuencia complementaria de las mismas.

9. La molécula aislada de ácido nucleico de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 capaz de hibridación al menos bajo condiciones rigurosas moderadas para al menos 20 nucleótidos contiguos contenidos dentro de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 3 ó 5 o una secuencia complementaria de las mismas.

10. La molécula aislada de ácido nucleico de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en las SEQ ID NOs: 1, 3 ó 5, p una secuencia complementaria de nucleótidos de las mismas o al menos 20 nucleótidos contiguos de la misma.

11. Una construcción genética que comprende a la molécula aislada de ácido nucleico de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 operativamente conectada a una secuencia promotora, en donde dicha molécula de ácido nucleico es capaz de ser transcrita en la orientación sentido o antisentido con relación a la dirección de una transcripción in vivo de un gen de ocurrencia natural de la epoxigenasa monoxigenasa de función mixta.

12. Un método para alterar el nivel de ácidos grasos epóxidos en una célula, tejido, órgano, organismo no humano, o microorganismo, dicho método comprendiendo introducir una molécula sentido, antisentido, de ribozima o cosupresora que comprende a la molécula aislada de ácido nucleico de acuerdo a cualquiera de la reivindicaciones 1 a 10 en una célula, tejido, órgano u organismo no humano e incubar dicha célula durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para que ocurra la expresión de dicha molécula sentido, antisentido, de ribozima o cosupresora.

13. El método de acuerdo a la reivindicación 12, en donde la etapa de introducir la molécula sentido, antisentido, de ribozima o cosupresora comprende la transformación en forma estable de la célula, tejido, órgano u organismo no humano con la molécula sentido, antisentido, de ribozima o cosupresora.

14. Un método para producir un polipéptido recombinante de epoxigenasa monoxigenasa de función mixta enzimáticamente activo en una célula, dicho método comprendiendo cultivar una célula que comprende a la molécula aislada de ácido nucleico de acuerdo a cualquiera de la reivindicaciones 1 a 10 durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para que ocurra la expresión.

\newpage

15. El método de acuerdo a la reivindicación 14, que comprende la primera etapa adicional de transformar la célula con la molécula aislada de ácido nucleico.

16. Un método para producir un polipéptido recombinante de epoxigenasa monoxigenasa de función mixta enzimáticamente activo en una célula, dicho método comprendiendo las etapas de:

(i)

producir una construcción genética que comprende a la molécula aislada de ácido nucleico de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 colocada operablemente bajo el control de un promotor capaz de conferir expresión sobre dicha secuencia genética en dicha célula, y opcionalmente un elemento reforzador de la expresión;

(ii)

transformar dicha construcción genética dentro de dicha célula; y

(iii)

seleccionar los transformantes que expresan una epoxigenasa funcional codificada por la secuencia genética en un nivel alto.

17. Un método para producir un polipéptido recombinante de epoxigenasa monoxigenasa de función mixta enzimáticamente activo en una planta transgénica, comprendiendo las etapas de:

(i)

producir una construcción genética que comprende a la molécula aislada de ácido nucleico de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 colocada operablemente bajo el control de un promotor específico para la semilla y opcionalmente un elemento reforzador de la expresión, en donde dichas secuencias genéticas se ubican también secuencia arriba de una secuencia terminadora de la transcripción;

(ii)

transformar dicha construcción genética dentro de una célula o tejido de dicha planta; y

(iii)

seleccionar los transformantes que expresan una epoxigenasa funcional codificada por la secuencia genética en un nivel alto en las semillas.

18. El método de acuerdo a la reivindicación 17, en donde la planta es una especie oleaginosa que normalmente produce niveles altos de ácido linoleico.

19. El método de acuerdo a las reivindicaciones 17 ó 18, en donde la planta se selecciona de la lista que comprende lino Linola®, colza oleaginosa, girasol, cártamo, soja, linaza, ajonjolí, semilla de algodón, cacahuete, palma de oliva o palma aceitera.

20. Un polipéptido recombinante de epoxigenasa monoxigenasa de función mixta producido de acuerdo con el método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19.

21. Un polipéptido recombinante de epoxigenasa monoxigenasa de función mixta de acuerdo a la reivindicación 20, que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NOs: 2, 4 ó 6 o que es aproximadamente al menos 50% idéntica a las mismas.

22. Un método para producir un ácido graso epoxigenado en una célula, tejido, órgano, organismo no humano, o microorganismo, dicho método comprendiendo incubar una célula, tejido, órgano u organismo no humano que exprese al polipéptido recombinante de acuerdo a las reivindicaciones 20 ó 21 con un sustrato de ácido graso durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para que al menos un enlace de carbono de dicho sustrato sea convertido en un grupo epoxi.

23. El método de acuerdo a la reivindicación 22, en donde el sustrato de ácido graso es un ácido graso insaturado y el enlace de carbono de dicho sustrato que está epoxigenado es un enlace doble de carbono.

24. El método de acuerdo a las reivindicaciones 22 ó 23, en donde el sustrato de ácido graso se selecciona de la lista que comprende ácido palmitoleico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolénico, ácido 9,15-octadecadienóico y ácido araquidónico.

25. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, en donde el enlace de carbono que es epoxigenado es un enlace de carbono \Delta6 o un enlace de carbono \Delta9 o un enlace de carbono \Delta12 o un enlace de carbono \Delta15.

26. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, en donde el ácido graso epoxigenado que se produce es ácido vernólico.

27. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, que comprende la primera etapa adicional de transformar o de transfectar la célula, tejido, órgano u organismo no humano con una molécula de ácido nucleico que codifica a la epoxigenasa recombinante monoxigenasa de función mixta.

\newpage

28. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 22 a 27, en donde la célula, órgano, tejido u organismo no humano en el cual se expresa la epoxigenasa recombinante monoxigenasa de función mixta se deriva de una bacteria, levadura, hongo, moho, insecto, planta, ave o mamífero no humano.

29. El método de acuerdo a la reivindicación 28 en donde la levadura, planta, hongo o moho es una levadura, planta, hongo o moho oleaginoso.

30. El método de acuerdo a la reivindicación 29 en donde la planta es una planta oleaginosa que no expresa normalmente a la epoxigenasa recombinante monoxigenasa de función mixta en un nivel alto.

31. El método de acuerdo a la reivindicación 30 en donde la planta oleaginosa se selecciona de la lista que comprende lino Linola®, colza oleaginosa, girasol, cártamo, soja, linaza, ajonjolí, semilla de algodón, cacahuete, palma de oliva o palma aceitera.

32. Una planta transformada con la molécula aislada de ácido nucleico de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o una célula, tejido u órgano derivado de allí o la progenie de dicha planta que comprende también a dicha molécula de ácido nucleico.

33. Una planta transformada que es capaz de expresar al polipéptido recombinante de acuerdo a las reivindicaciones 20 ó 21 o una célula, tejido u órgano derivado de allí o la progenie de dicha planta que es capaz también de expresar a dicho polipéptido recombinante.

34. La planta o una célula, tejido u órgano derivado de allí o la progenie de los mismos de acuerdo a las reivindicaciones 32 ó 33, que es o se deriva de lino Linola®, colza oleaginosa, girasol, cártamo, soja, linaza, ajonjolí, semilla de algodón, cacahuete, palma de oliva o palma aceitera.

35. La planta o una célula, tejido u órgano derivado de allí o la progenie de los mismos de acuerdo a las reivindicaciones 32 ó 33, que es o se deriva de Arabidopsis thaliana o de Linum usitatissimum.