KR20130026487A

KR20130026487A - 식물 종자 내에 오메가-７ 지방산의 축적

Info

Publication number: KR20130026487A
Application number: KR1020137001833A
Authority: KR
Inventors: 존 샹클린; 탐 후우 응구옌; 테렌스 에이 월쉬; 마크 에스 피드코위치; 에드워드 제이 휘틀
Original assignee: 브룩하벤 싸이언스 어쏘씨에이츠 엘엘씨; 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨
Priority date: 2010-06-24
Filing date: 2011-06-24
Publication date: 2013-03-13
Also published as: BR112012033037A2; MX2012015291A; UA113834C2; CN103429741B; JP2013532975A; CN103429741A; AR081302A1; PL2585599T3; HUE037067T2; US20110321194A1; AU2011270751A1; CL2012003663A1; WO2011163557A2; TW201207110A; WO2011163557A3; EP2585599A4; ZA201209082B; US9976155B2; CA2803599A1; AU2011270751A2

Abstract

조성물 및 방법은 식물 세포에서 신규한 Δ⁹-18:0 ACP 탈포화효소를 유전학적으로 코딩하고 발현시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 신규한 Δ⁹-18:0 ACP 탈포화효소를 코딩한다. 다른 실시양태에서, 아미노산 서열은 Δ⁹-18:0 ACP 탈포화효소 활성을 가진다. 방법은 전체 식물, 식물 종자, 및 식물 물질, 예를 들어, 종자 내에 특이 (unusual) 지방산의 양을 증가시킬 목적으로 식물 세포, 식물 물질 및 전체 식물 내에서 Δ⁹-18:0 ACP 탈포화효소의 발현을 수반할 수 있다.

Description

식물 종자 내에 오메가-７ 지방산의 축적{ACCUMULATION OF OMEGA-7 FATTY ACIDS IN PLANT SEEDS}

우선권 주장

본원은 미국 특허 가출원 61/358,318 (2010년 6월 24일자로 발명의 명칭 "ACCUMULATION OF N-7 FATTY ACIDS IN PLANT SEEDS"로 출원됨)의 출원일의 이익을 주장한다

기술 분야

특정 실시양태에서, 본 발명은 Δ⁹-16:0-ACP 탈포화효소로서 기능하는, Com25로 명명된 신규한 돌연변이체 리시누스 (Ricinus) Δ⁹-18:0-ACP 탈포화효소에 관한 것이다. 또 다른 실시양태는 식물에서 대사 분기점을 조작하기 위한, 예를 들어 탄소를 ω-7 지방산으로 되돌리기 위한 대사 조작 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 탄소를 식물 종자 내에서 ω-7 지방산으로 되돌리기 위한 대사 조작 전략의 일부로서 Com25를 발현시키는 방법에 관한 것이다.

자연에서 지방산 구조가 1,000개 이상 존재할 수 있다고 추정되었다 (Millar et al., (2000) Trends Plant Sci 5(3):95-101). 많은 이들 지방산은 일군의 전형적인 탈포화효소의 변이체에 의한 지방산의 유도체화에 의해 합성된다. 처음 단리된 상기 변이체 탈포화효소는 리시놀레산 합성을 담당하는 효소인, 피마자 배유로부터의 리시누스 올레에이트 히드록실라제였다 (Van de Loo et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(15):6743-6747). 이어서, 베르노니아 (Vernonia) 리놀레에이트 에폭시다제 및 크레피스 (Crepis) 올레에이트 아세틸레나제를 코딩하는 유전자가 발견되었다 (Lee et al., (1998) Science 280(5365):915-18). 이들 유전자의 단리를 통해, 오일용 작물에서 이들의 이종성 발현이 대응하는 특이 (unusual) 지방산의 축적을 용이하게 할 수 있다는 개념이 발생하였다 (Broun et al., (1997) Plant Journal 13:201-10). 그러나, 생성되는 특이 지방산 축적은 유전자가 그로부터 단리된 천연 공급원 식물에서 발견되는 것보다 예외없이 더 낮았다 (Napier, J.A. (2007) Annu. Rev. Plant Biol. 58:295-319).

특이 지방산을 축적하는 조직으로부터 단리된 변이체 탈포화효소의 특이적인 활성 프로필은 대응하는 특이 지방산을 생산하는 역할과 일치한다. 그러나, 이들은 현재까지 보고된 모든 스테아로일-ACP 탈포화효소에 비해 매우 불량한 특이적인 활성을 보이고, 이종성으로 발현될 때 변경된 지방산 표현형 생산시에 비효과적인 것으로 입증되었다 (Cahoon et al., (1994) Prog. Lipid Res. 33:155-63). 예를 들어, 모델 식물 아라비돕시스 (Arabidopsis)에서 강력한 종자-특이적 프로모터의 제어 하에 피마자 히드록실라제의 종자-특이적 발현은 단지 약 17%의 리시놀레산을 축적시켰을 뿐이고, 이것은 피마자 종자에서 발견되는 약 90%에 비해 훨씬 부족한 것이다 (Broun and Somerville (1997) Plant Physiol. 113:933-42). 이와 유사하게, 실망스러운 결과가, 아라비돕시스에서 에폭시게나제 및 아세틸레나제의 이종성 발현시에 각각 15 및 25% 축적되는 것으로 보고된 에폭시 및 아세틸렌계 지방산에 대해 보고되었다 (Lee et al., (1998) Science 280(5365):915-18). 불량한 활성을 보이는 것 이외에, 변이체 탈포화효소는 정제될 때 불용성 응집체를 형성하는 경향을 보였다. 낮은 안전성 및 불량한 촉매율은 최종적으로 기능 변경을 야기하는 돌연변이가 누적되면서 안전성 및/또는 전환률에 대한 선택이 이루어지는 유전자 복제 이벤트로서 발생하는 많은 새로 제시된 효소에 의해 공유되는 특성이다 ([Govindarajan and Goldstein (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5545-49]; [Goldstein (2001) in Protein Folding, Evolution and Design (Broglia, R. A., Shakhnovich, E. I., and Tiana, G., eds) CXLIV Vols., I.O.S. Press, Amsterdam]).

낮은 수준의 표적 지방산 축적에 대한 많은 가능성 있는 설명이 제시되었다 (Napier, J.A. (2007) Annu. Rev. Plant Biol. 58:295-319). 증거는 특정 효소가 특이 지방산의 트리아실글리세롤 내로의 혼입에서 핵심 역할을 수행할 수 있음을 제시한다. 예를 들어, 유전자 도입된 (transgenic) 브라시카 나푸스 (Brassica napus) 종자 내의 라우레이트의 축적은 캘리포니아 월계수 중간쇄 티오에스테라제와 함께 코코넛 리소포스파티드산 아실트랜스퍼라제의 동시 발현시에 50%로부터 60%로 증가하였다 (Knutzon et al., (1999) Plant Physiol. 120(3):739-46). 최근에, 피마자 히드록실라제와 함께 피마자 타입-2 아실-조효소 A:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (RcDGAT2)의 동시 발현은 리시놀레산의 축적을 약 17%로부터 약 30%로 증가시켰다 (Burgal et al., (2008) Plant Biotechnol. J. 6(8):819-31).

천연 생성 종에서 발견되는 것과 동등한, 유전자 도입 식물 내의 높은 수준의 특이 지방산의 축적이 보고되었다. 특이 지방산은 다양한 산업 및 용도에서 매우 바람직하기 때문에, 그 생산을 위해 설계된 유전자 도입 식물에서 특이 지방산의 보다 우수한 발현에 대한 필요성이 존재한다.

Com25로 명명된 신규한 변이체 탈포화효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 그의 아미노산 서열이 본원에 개시된다.

또한, 식물 종자 내의 특이 지방산의 조성 비율이 증가하도록, WT 피마자 Δ⁹-18:0 탈포화효소에 비해 Com25 효소의 향상된 탈포화효소 활성을 이용하기 위해 식물 세포에서 Com25를 발현시키는 방법이 개시된다. 일부 실시양태에서, 이 방법은 아라비돕시스에서 Com25를 발현시키는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 식물 종자에서 증가된 특이 지방산은 ω-7 지방산이다. 이들 실시양태에서, ω-7 지방산은 16:1Δ¹⁹ 및/또는 18:1Δ¹¹일 수 있다.

또한, 식물 종자 내의 특이 지방산의 조성 비율이 증가하도록, 색소체 및 색소체외 (extraplastidial) 지방산 연장이 손상된 식물 세포에서 Com25를 발현시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 아라비돕시스에서 Com25를 발현시키는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 식물 종자에서 증가된 특이 지방산은 ω-7 지방산이다. 이들 실시양태에서, ω-7 지방산은 16:1Δ¹⁹ 및/또는 18:1Δ¹¹일 수 있다.

식물 종자 내의 특이 지방산의 조성 비율이 증가하도록, KASII가 억제된 식물 세포에서 Com25를 발현시키는 추가의 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 아라비돕시스에서 Com25를 발현시키는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 식물 종자에서 증가된 특이 지방산은 ω-7 지방산이다. 이들 실시양태에서, ω-7 지방산은 16:1Δ¹⁹ 및/또는 18:1Δ¹¹일 수 있다.

또한, 식물 종자 내의 특이 지방산의 조성 비율이 증가하도록, KASII 및 색소체 및 색소체외 지방산 연장이 그 내부에서 억제된 식물 세포에서 Com25를 발현시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 아라비돕시스에서 Com25를 발현시키는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 식물 종자에서 증가된 특이 지방산은 ω-7 지방산이다. 이들 실시양태에서, ω-7 지방산은 16:1Δ¹⁹ 및/또는 18:1Δ¹¹일 수 있다.

상기 및 다른 특징은 첨부하는 도면과 함께 아래의 몇몇 실시양태의 상세한 설명으로부터 보다 분명해질 것이다.

도 1은 아라비돕시스의 색소체 및 소포체에서 지방산 합성 및 변형의 개략도이다. 16:0 탈포화효소에 의해 매개되는 반응이 표시된다; 1: Δ⁹-16:0-ACP 탈포화효소; 2: 색소체외 Δ⁹-16:0-ACP 탈포화효소. ω-7 FA, 즉, 16:1 Δ⁹ 및 18:1 Δ¹¹은 사각형으로 표시된다.
도 2는 아라비돕시스의 다양한 배경에서 Com25의 발현시에 FAME의 대표적인 기체 크로마토그래피 분리를 보여준다. 패널 A 및 B, WT; C 및 D, fab1; E 및 F, fab1/fae1. 패널 A, C 및 E, 비형질전환; B, D 및 F, Phas:Com25로 형질전환됨. FAME 피크가 표시된다: 16:0 (1), 16:1Δ⁹ (2), 16:2 (3), 18:0 (4), 18:1 Δ⁹ (5), 18:1Δ¹¹ (6), 18:2 (7), 20:0 (8), 20:1Δ¹¹ (6), 18:2 (7), 20:0 (8), 20:1Δ¹¹ (9), 18:3+20:1Δ¹³ (10), 및 22:1 (11).
도 3은 숙주 종자 내의 16:0 대 ω-7 축적 (몰%로서) 사이의 관계를 보여준다.
도 4는 다양한 배경 또는 아라비돕시스에서 Com25의 발현시에 FAME의 대표적인 기체 크로마토그래피 분리를 보여준다. 패널 A: 최고의 fab1/fae1, Phas:Com25, fab1-HPAS, AnΔ9DS, LnΔ9DS 형질전환체 식물주; 패널 B: 독산타 (Doxantha) 종자. 피크 지정은 도 2에서 설명된 바와 같다.
도 5는 본 발명의 특정 구성체 실시양태에서의 DNA 성분의 개략적 배열이다.

I. 몇몇 실시양태의 개요

서열 1에 적어도 60% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 Δ⁹ 탈포화효소를 코딩하는 핵산 분자가 본원에 개시된다. 핵산 분자는 유전자 조절 요소를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 조절 요소는 파세올린 프로모터일 수 있다.

또한, 서열 2에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 Δ⁹ 탈포화효소가 개시된다. 아미노산 서열이 서열 2에 적어도 80% 동일한 본 발명의 Δ⁹ 탈포화효소는 서열 2의 위치 114에 유사한 위치에 세린; 서열 2의 위치 117에 유사한 위치에 아르기닌; 서열 2의 위치 118에 유사한 위치에 시스테인, 서열 2의 위치 179에 유사한 위치에 류신; 및/또는 서열 2의 위치 188에 유사한 위치에 트레오닌을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 핵산 분자 및 Δ⁹ 탈포화효소는 동일한 종의 야생형 식물에서 관찰되는 양에 비해 식물 물질, 세포, 조직, 또는 전체 식물에서 특이 지방산의 양을 증가시키기 위해 식물 물질, 세포, 조직, 또는 전체 식물에서 발현될 수 있다. 본 발명의 다른 실시양태는 식물 물질, 세포, 조직, 또는 전체 식물 내의 특이 지방산의 양이 증가하도록 상기 식물 물질, 세포, 조직, 또는 전체 식물을 서열 1의 핵산 분자로 형질전환시키는 것을 포함하는, 식물 물질, 세포, 조직, 또는 전체 식물 내의 특이 지방산의 양을 증가시키는 방법을 포함한다.

바람직한 실시양태에서, 본원에서 개시되는 방법에 의해 형질전환된 식물 물질, 세포, 조직, 또는 전체 식물은 식물 물질, 세포, 조직, 또는 전체 식물 내의 16:0-ACP의 수준을 증가시키기 위한 하나 이상의 수단을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 식물 물질, 세포, 조직, 또는 전체 식물 내의 16:0-ACP의 수준을 증가시키기 위한 수단은 색소체외 탈포화효소의 발현; 예를 들어 fab1 유전자 내의 돌연변이 도입에 의한 KASII의 억제; 및/또는 예를 들어 fae1 유전자 내의 돌연변이의 도입에 의한 16:0 지방산의 연장 감소일 수 있다.

본원에서 개시되는 방법은 예를 들어 아라비돕시스 속의 식물, 또는 식물로부터 유래된 식물 물질에 대해 수행될 수 있다. 특정 실시양태는 식물 물질을 서열 1의 핵산 분자로 형질전환시키고; 형질전환된 식물 물질을 배양하여 식물을 얻는 것을 포함하는, 동일한 종의 야생형 식물에 비해 식물 내에 증가된 양의 특이 지방산을 포함하는 유전자 조작된 식물을 생성하거나 재생하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법에 의해 얻은 식물, 식물 물질, 식물 세포, 및 종자도 개시된다.

II. 약어

x:yΔ^z x개의 탄소 및 카르복실 말단으로부터 계수되는 위치 z에 y개의

이중 결합을 함유하는 지방산

ACP 아실 담체 단백질

COA 조효소 A

KASII β-케토아실-ACP 합성효소 II

FA 지방산

FAS 지방산 합성

FAME 지방산 메틸 에스테르

WT 야생형

III. 용어

지방산: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "지방산"은 보다 길고 짧은 사슬 길이의 산이 알려져 있지만 약 C12 내지 C22의 상이한 사슬 길이의 장쇄 지방산 (알칸산)을 의미한다. 지방산의 구조는 x:yΔ^z로 표시되고, 여기서 "x"는 탄소 (C)의 총수이고, "y"는 산의 카르복실 말단으로부터 계수되는 위치 "z"에서의 탄소 사슬 내의 이중 결합의 수이다.

특이 지방산: 본 발명의 목적에서, 특이 지방산은 천연 시스템에서의 그의 합성이 변이체 탈포화효소에 의한 FAS의 중간체의 변형에 의해 개시되는 것이다.

대사 경로: 용어 "대사 경로"는 대사 산물의 형성, 또는 또 다른 대사 경로의 개시를 달성하기 위해 효소에 의해 촉매되는 세포 내에서 발생하는 일련의 화학 반응을 의미한다. 대사 경로는 몇몇의 또는 많은 단계를 수반할 수 있고, 특이적인 반응 기질에 대해 상이한 대사 경로와 경쟁할 수 있다. 이와 유사하게, 한 대사 경로의 생성물은 또 다른 대사 경로의 기질일 수 있다.

대사 조작: 본 발명의 목적에서, "대사 조작"은 초기 기질을 요구되는 정확한 화학 구조를 갖는 생성물로 단계적으로 변형하는 것이 세포 내에서 작동하는 전체 대사 경로의 전체 체계 내에서 달성되도록, 세포 내의 하나 이상의 대사 경로를 변경하기 위한 전략의 합리적인 설계를 의미한다.

탈포화효소: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "탈포화효소"는 관심있는 지방산 또는 전구체를 생산하기 위해 하나 이상의 지방산을 탈포화시킬 (즉, 이중 결합을 도입할) 수 있는 폴리펩티드를 의미한다. 식물 가용성 지방산 탈포화효소는 이중 결합을 포화된 아실-ACP 기질 내에 위치특이적으로 도입한다. 반응은 탈포화효소 구조의 코어를 형성하는 4개의 나선 다발에 의해 배위결합된 2전자 환원된 이철 중심 (two-electron reduced diiron center)에 의한 분자 산소의 활성화를 포함한다. 본원에서 특히 관심이 있는 것은 Δ⁹ 탈포화효소이다.

Δ⁹-18:0¹-ACP 탈포화효소는 막 유동성의 유지를 위해 모든 식물이 필요로 한다. 상기 효소는 주로 스테아로일-ACP를 탈포화시키지만, 이것은 또한 팔미토일-ACP에 대해서도 작은 정도의 활성을 보인다.

변이체 탈포화효소: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "변이체 탈포화효소"는 특이 지방산 생산시의 기능과 일치하는 특이적인 활성 프로필을 보이는 탈포화효소를 포함한다. 변이체 탈포화효소는 유기체로부터 단리되거나, 또는 유도 진화 (directed evolution) 프로그램을 통해 조작될 수 있다.

자손체 식물: 본 발명의 목적에서, "자손체 식물"은 식물 육종 방법에 의해 얻을 수 있는 임의의 식물, 또는 그로부터 얻은 식물 물질을 의미한다. 식물 육종 방법은 당업계에 공지되어 있고, 천연 육종, 인공 육종, DNA 분자 마커 분석을 수반하는 선택 육종, 유전자 도입, 및 상업적인 육종을 포함한다.

식물 물질: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "식물 물질"은 식물로부터 얻은 임의의 세포 또는 조직을 의미한다.

핵산 분자: RNA, cDNA, 게놈 DNA, 및 이들의 합성 형태 및 혼합된 중합체의 센스 및 안티센스 (antisense) 가닥을 모두 포함할 수 있는 뉴클레오티드의 중합체 형태. 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시뉴클레오티드, 또는 어느 한 종류의 뉴클레오티드의 변형된 형태를 의미한다. 본원에서 사용되는 "핵산 분자"는 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"와 동의어이다. 이 용어는 단일- 및 이중 가닥 형태의 DNA를 포함한다. 핵산 분자는 천연 생성 및/또는 비-천연 생성 뉴클레오티드 연결에 의해 함께 연결된 천연 생성 및 변형된 뉴클레오티드 중의 하나 또는 둘 모두를 포함할 수 있다.

핵산 분자는 화학적으로 또는 생화학적으로 변형될 수 있거나, 또는 당업자가 쉽게 이해할 수 있는 바와 같은 비-천연 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 함유할 수 있다. 상기 변형은 예를 들어 표지, 메틸화, 하나 이상의 천연 생성 뉴클레오티드의 유사체를 사용한 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예컨대 비하전된 연결 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포르아미데이트, 카르바메이트 등), 하전된 연결 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 매달린 모이어티 (예를 들어, 펩티드), 삽입제 (intercalator) (예를 들어, 아크리딘, 소랄렌 등), 킬레이트, 알킬화제, 및 변형된 연결 (예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)을 포함한다. 용어 "핵산 분자"는 또한 단일 가닥, 이중 가닥, 부분적으로 이중체화, 삼중체화, 헤어핀 (hairpin), 원형 및 자물쇄 (padlocked) 입체형태를 비롯한 임의의 위상 (topological) 입체형태를 포함한다.

작동가능하게 연결된: 제1 핵산 서열은 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계로 존재할 때 제2 핵산 서열과 작동가능하게 연결된 것이다. 예를 들어, 프로모터는 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 줄 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 재조합 방식으로 생산될 때, 작동가능하게 연결된 핵산 서열은 일반적으로 연속적으로, 2개의 단백질 코딩 영역을 연결하기 위해 필요한 경우 동일한 해독 프레임으로 존재한다. 그러나, 핵산은 작동가능하게 연결되기 위해 연속적일 필요는 없다.

조절 요소: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "조절 요소"는 유전자 조절 활성을 갖는 핵산 분자; 즉, 작동가능하게 연결되는 전사가능한 핵산 분자의 전사 또는 번역에 영향을 주는 능력을 갖는 것을 의미한다. 조절 요소, 예컨대 프로모터, 리더, 인트론, 및 전사 종결 영역은 살아있는 세포의 유전자의 전체적인 발현에서 필수적인 기능을 수행하는 비-코딩 핵산 분자이다. 따라서, 식물에서 기능하는 단리된 조절 요소는 분자 조작 기술을 통한 식물 표현형 변형에 위해 유용하다. "조절 요소"는 특정 유전자가 언제, 어떤 수준으로 발현되지를 결정하는 일련의 뉴클레오티드를 의미한다. 조절 DNA 서열은 조절 단백질 또는 다른 단백질과 특이적으로 상호작용한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유전자 조절 활성"은 작동가능하게 연결된 핵산 분자의 전사 또는 번역에 영향을 줄 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 유전자 조절 활성을 갖는 단리된 핵산 분자는 일시적인 또는 공간적인 발현을 제공하거나 또는 작동가능하게 연결된 핵산 분자의 발현 수준 및 속도를 조정할 수 있다. 유전자 조절 활성을 갖는 단리된 핵산 분자는 프로모터, 인트론, 리더, 또는 3' 전사 종결 영역을 포함할 수 있다.

프로모터: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "프로모터"는 작동가능하게 연결된 유전자의 전사를 개시시키기 위해 RNA 중합효소 II 또는 다른 단백질, 예컨대 전사 인자 (전사를 조절하는 트랜스 작용 (trans-acting) 단백질 인자)의 인식 및 결합에 관련되는 핵산 분자를 의미한다. 프로모터는 작동가능하게 연결된 유전자의 전사를 초래하는 하위요소, 예컨대 시스-요소 (cis-element) 또는 인핸서 도메인을 자체에 함유할 수 있다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 기능성인 천연 또는 비-천연 프로모터이다. 식물 프로모터는 작동가능하게 연결된 유전자 또는 유전자들의 발현을 조정하기 위한 5' 조절 요소로서 사용될 수 있다. 식물 프로모터는 그의 일시적인, 공간적인, 또는 발달 발현 패턴에 의해 규정될 수 있다. 본원에서 설명되는 핵산 분자는 프로모터를 포함하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.

서열 동일성: 2개의 핵산 서열 사이의 또는 2개의 아미노산 서열 사이의 유사성은 서열 사이에 공유된 서열 동일성 수준의 측면에서 표현된다. 서열 동일성은 일반적으로 동일성 비율의 측면에서 표현된다; 비율이 높을수록 두 서열 사이의 유사성이 더 높다. 비교를 위해 서열을 정렬하는 방법은 아래에서 상세하게 설명된다.

아미노산 서열 내의 유사한 위치: 핵산 및 아미노산 서열은 다음 문단에서 설명되는 방법에 의해 정렬될 수 있다. 정렬시에, 한 서열 내의 위치는 위치가 컨센서스 서열 내에서 동일할 경우 정렬된 서열 내의 위치와 "유사한 위치"에 존재한다.

비교를 위해 서열을 정렬하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘은 다음과 같은 문헌에 기재되어 있다: [Smith and Waterman, Adv. Appl. math. 2:482, 1981]; [Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970]; [Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988]; [Higgins and Sharp, Gene 73:237-44, 1988]; [Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3, 1989]; [Corpet et al., Nucleic Acids Research 16:10881-10890, 1988]; [Huang, et al., Computer Applications in the Biosciences 8:155-65, 1992]; [Pearson et al., Methods in Molecular Biology 24:307-31, 1994]; [Tatiana et al., FEMS Microbiol. Lett., 174:247-50, 1990]; [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990] (서열-정렬 방법 및 상동성 계산의 상세한 고려사항).

더 내셔널 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션 (The National Center for Biotechnology Information) (NCBI) 베이식 로컬 얼라인먼트 써치 툴 (Basic Local Alignment Search Tool) (BLAST)은 서열-분석 프로그램, 예를 들어, blastp 및 blastn과 함께 사용하기 위해 인터넷 상에서 입수할 수 있다 (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). 상기 프로그램을 사용하여 서열 동일성을 결정하는 방법에 대한 설명은 blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastDocs에서 NCBI를 통해 인터넷 상에서 입수할 수 있다.

아미노산 서열의 비교를 위해, BLAST 프로그램의 "Blast 2 서열" 기능 (bl2seq)은 디폴트 파라미터를 사용하여 이용된다. 특정 파라미터는 예를 들어 미스매치 (mismatch)에 대한 페널티 (penalty) 또는 매치에 대한 보상을 제공하기 위해 당업자의 판단 하에 조정될 수 있다.

형질전환된: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "형질전환된"은 외래 핵산 분자, 예컨대 구성체가 그 내부에 도입된 세포, 조직, 기관, 또는 유기체를 의미한다. 도입된 핵산 분자는 도입된 폴리뉴클레오티드 분자가 후속적인 자손체에게 유전되도록 수여체 세포, 조직, 기관, 또는 유기체의 게놈 DNA 내로 통합될 수 있다. "유전자 도입된" 또는 "형질전환된" 세포 또는 유기체는 또한 세포 또는 유기체의 자손체 및 예를 들어 교배시에 모체로서 상기 유전자 도입 식물을 사용하는 육종 프로그램으로부터 생성되고 외래 핵산 분자의 존재에 따른 변경된 표현형을 보이는 자손체를 포함한다.

IV. 숙주 세포, 조직, 또는 유기체 내에서 특이 지방산을 축적하기 위한 체계적인 대사 조작 방법

A. 개요

본 발명의 실시양태는 예를 들어 식물 종자 내의 팔미톨레산 (16:1Δ⁹) 및 바센산 (18:1Δ¹¹)을 포함하는 ω-7 지방산 (FA)의 축적을 대사 조작하기 위한 체계적인 방법을 포함한다. 색소체 내에서 새로 합성된 지방산의 유동을 차단하는 방법을 예시하기 위해, 피마자 Δ⁹-18:0-탈포화효소의 16:0-탈포화효소 활성을 향상시키기 위한 유도 진화 프로그램에 의해 생성된 16:0-ACP 탈포화효소인 Com25를 종자-특이적 파세올린 프로모터의 제어 하에 발현시켰다. 임의의 종자-특이적 프로모터가 본원에 개시된 실시양태에서 사용될 수 있다. 이 방법은 ω-7 FA의 축적을 야생형 (WT)에서의 2% 미만으로부터 Com25 형질전환체에서의 약 14%로 증가시켰다.

추가의 예시적인 방법에서, 각각 색소체 및 색소체외 지방산 연장이 손상된 fab1/fae1 이중 돌연변이체에서 Com25의 발현은 ω-7 FA 축적을 약 50%로 증가시켰다. 또한, LTP170 프로모터의 제어 하에 추가의 Com25의 도입은 ω-7 FA 축적을 약 58%로 증가시켰고, 이것은 아마도 그의 낮은 전환률에 의한 탈포화효소 활성 제한이 극복되었음을 제시한다. 파세올린:Com25 구성체를 일련의 KASII-결핍 배경에서 발현시켰고, 약 30% 이하의 16:0 함량에 비례하여 ω-7 FA 함량이 증가하여 약 55% 이하의 총 ω-7 FA 축적이 관찰되었다. 흥미롭게도, 56% ω-7 FA를 축적한 유전자 도입체는 WT 식물의 2배를 초과하는, 약 19%의 16:0을 계속 함유하였다. 트리아실글리세롤로 가는 도중에 16:0의 유동을 차단하는 색소체외 16:0 탈포화효소의 발현을 조사하였다. fab1/fae1 이중 돌연변이체 배경에서 KASII의 억제와 함께 색소체 및 색소체외 탈포화효소의 동시 발현은 WT에서의 약 2%로부터 가장 우수하게 조작된 식물주에서의 약 71%로 ω-7 FA의 축적을 증가시켰고, 이것은 독산타 종자에서 발견되는 것과 동등하였다.

ω-7 FA는 다른 특이 FA처럼 천연 시스템에서 그의 합성이 변이체 탈포화효소에 의한 FAS의 중간체의 변형에 의해 개시되기 때문에 표적으로서 선택되었다 ([Cahoon et al., (1997) Plant Mol. Biol. 33:1105-10]; 및 [Cahoon et al., (1998) Plant Physiol. 117(2):593-8]). 또한, ω-7 FA는 천연 생성 불포화 지방산에 유사한 물리적 특성을 보유하면서 중합체 공급 원료로서의 잠재적인 상업적 적용성을 갖는다.

대사 조작 연구는 이전에 보고되지 않은 Δ⁹-16:0-아실 담체 단백질 (ACP) 탈포화효소인 Com25를 종자-특이적 프로모터의 제어 하에 모델 식물 아라비돕시스 내에 도입함으로써 개시하였다. 상승된 수준의 16:0을 함유하는 돌연변이체 배경의 선택에 의해 및 기질에 대한 경쟁에 영향을 줌으로써 탄소의 유동을 표적 지방산으로 전환하도록 설계된 구성체의 동시 발현에 의해 탄소 유동을 ω-7 FA로 전환하는 방법을 조사하였다. 색소체외 탈포화효소는 색소체로부터 배출된 후에 잔여 16:0를 탈포화시키기 위해 발현되었다.

fab1/fae1 배경에서 KASII의 억제와 함께 색소체 및 색소체외 탈포화효소의 동시 발현은 ω-7 FA의 축적을 WT에서의 2% 미만으로부터 약 71% 이하로 증가시켰고, 이것은 아스클레피아스 (Asclepias)에서 발견되는 것보다 높고 독산타 종자에서 발견되는 것과 동등하였다.

ω-7 지방산의 전구체인 16:0-ACP는 지방산 생합성의 처음 분기점에 존재하고, FatB 티오에스테라제 및 KASII 연장효소 (elongase)가 그에 대해 경쟁하고; 16:0-ACP 탈포화효소의 도입은 이를 3개 효소가 작용하는 경쟁 (three-way competition)으로 만든다. KASII 및 FATB의 억제는 기질에 대한 경쟁을 감소시키고 ω-7 FA의 축적을 증가시키기 위한 효과적인 방식이다. ω-7 FA 축적의 증가는 숙주 식물주에서 약 30%에서 포화가능하고, 이것은 상기 수준을 초과하면 탈포화효소가 제한되기 때문이다. 종자-특이적 프로모터의 제어 하에서 제2 카피의 발현에 의한 Com25의 투여량 증가는 ω-7 지방산의 축적을 추가로 증가시켰다. 그러나, 높은 ω-7 FA 축적체의 종자는 또한 16:0을 약 20% 범위의 수준으로 함유하였고, 이것은 색소체외 16:0을 탈포화시킬 기회를 제시한다. 2개의 색소체외 탈포화효소의 발현은 ω-7 FA의 축적을 증가시켰고, 이것은 성숙 종자에서 16:0을 약 50% 감소시켰다.

아래에서 보다 상세하게 설명되는 바와 같이, 체계적인 대사 조작은 최고의 fab1/fae1/Com25/LnΔ9D 및 AnΔ9D 식물주가 실질적으로 아스클레피아스에서 발견되는 것보다 높고 독산타 종자에서 발견되는 것과 동등한 71%의 ω-7 FA를 축적하기 때문에, 천연 공급원에서 관찰되는 것과 대등한 특이 지방산 축적 수준을 조작하기 위한 성공적인 전략일 수 있다.

B. 핵산

본 발명의 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 서열 1과 정렬될 때 증가된 동일성 비율을 보여준다. 이들 및 다른 실시양태 내의 구체적인 핵산 서열은 예를 들어 서열 2와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 핵산 분자는 예를 들어 코돈 축퇴성 (degeneracy)에 따라 허용가능한 뉴클레오티드 치환에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 실질적으로 변경하지 않으면서 변형될 수 있음이 당업자에 의해 이해된다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 프로모터를 포함한다. 프로모터는 벡터 구성체가 그 내부로 삽입되는 세포 종류를 기초로 하여 선택될 수 있다. 세균, 효모, 및 식물에서 기능하는 프로모터는 당업계에 공지되어 있다. 프로모터는 또한 그의 조절 특징을 기초로 하여 선택될 수 있다. 상기 특징의 예는 전사 활성의 향상, 유도성, 조직-특이성, 및 발달기-특이성을 포함한다. 식물에서, 유도가능, 바이러스 또는 합성 기원의, 구성적으로 활성인, 일시적으로 조절되는, 및 공간적으로 조절되는 프로모터가 문헌에 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Poszkowski, et al., (1989) EMBO J. 3:2719]; [Odell et al., (1985) Nature 313:810]; [Chau et al., (1989) Science 244:174-81] 참조).

종종 사용되는 구성적 프로모터는 예를 들어 CaMV 35S 프로모터, 향상된 CaMV 35S 프로모터, 현삼 모자이크 바이러스 프로모터, 만노핀 합성효소 프로모터, 노팔린 합성효소 프로모터, 및 옥토핀 합성효소 프로모터를 포함한다.

유용한 유도가능 프로모터는 예를 들어 완화제 (치환된 벤젠술폰아미드 제초제)의 적용에 의해 유도되는 살리실산 또는 폴리아크릴산에 의해 유도되는 프로모터, 열 충격 프로모터, 시금치 니트레이트 리덕타제 전사가능한 핵산 분자 서열로부터 유래된 니트레이트-유도가능 프로모터, 호르몬-유도가능 프로모터, 및 RuBP 카르복실라제 및 LHCP 패밀리의 작은 하위단위와 연관된 광-유도가능 프로모터를 포함한다.

유용한 조직-특이적, 발달 단계상-조절되는 프로모터의 예는 β-콜글리시닌 7Sα 프로모터 및 종자-특이적 프로모터를 포함한다. 종자 색소체에서 우선적인 발현에 유용한 식물 기능성 프로모터는 지방 종자에서의 지방산 생합성에 관여하는 단백질로부터의 및 식물 저장 단백질로부터의 것을 포함한다. 상기 프로모터의 예는 파세올린, 나핀, 제인, 대두 트립신 억제제, ACP, 스테아로일-ACP 탈포화효소, 및 올레오신과 같은 전사가능한 핵산 분자 서열로부터의 5' 조절 영역을 포함한다. 또 다른 예시적인 조직-특이적 프로모터는 종자 조직에 특이적인 렉틴 프로모터이다.

다른 유용한 프로모터는 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)의 종양 유도성 플라스미드 상의 노팔린 합성효소, 만노핀 합성효소, 및 옥토핀 합성효소 프로모터; 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 19S 및 35S 프로모터; 향상된 CaMV 35S 프로모터; 현삼 모자이크 바이러스 35S 프로모터; 리불로스-1,5-비스포스페이트 카르복실라제의 작은 하위단위 (ssRUBISCO)로부터의 광-유도가능 프로모터; 담배로부터의 EIF-4A 프로모터 (Mandel et al., (1995) Plant Mol. Biol. 29:995-1004); 옥수수 수크로스 합성효소; 옥수수 알콜 데히드로게나제 I; 옥수수 집광 복합체; 옥수수 열 충격 단백질; 아라비돕시스로부터의 키티나제 프로모터; LTP (지질 전달 단백질) 프로모터; 페튜니아 칼콘 이소머라제; 콩 글라이신 풍부 단백질 1; 감자 파타틴; 유비퀴틴 프로모터; 및 액틴 프로모터를 포함한다. 유용한 프로모터는 바람직하게는 종자-선택적, 조직 선택적, 또는 유도가능 프로모터이다. 종자-특이적 조절은 예를 들어 EP 0 255 378에 논의되어 있다.

C. 아미노산 서열

본 발명의 일부 실시양태에 따른 아미노산 서열은 서열 2와 정렬될 때 증가된 동일성 비율을 보여준다. 이들 및 다른 실시양태 내의 구체적인 아미노산 서열은 예를 들어 서열 2와 적어도 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 많은 실시양태에서, 서열 2와 정렬될 때 상기한 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열은 Δ⁹-18:0-ACP 탈포화효소의 효소 활성을 갖는 펩티드를 코딩한다.

D. Com25의 변경: 5개의 돌연변이

본 발명의 측면은 모 피마자 탈포화효소로부터 유래된 신규한 유전자 조작된 탈포화효소에 관한 것이다. 구체적인 실시양태에서, 유전자 조작된 탈포화효소는 Com25이다. Com25는 다음 5개의 아미노산 위치에서 모 피마자 탈포화효소와 상이하다: M114S, T117R, L118C, P179L, 및 G188T (성숙 피마자 탈포화효소 PDB 등록 1AFR에 따라 넘버링됨). 추가의 실시양태에서, 유전자 조작된 탈포화효소는 Com25 내의 이들 5개의 돌연변이 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 유전자 조작된 탈포화효소는 다음 위치에서 모 피마자 탈포화효소와 상이할 수 있다: M114S; T117R; L118C; P179L; G188T; M114S 및 T117R; M114S 및 L118C; M114S 및 P179L; M114S 및 G188T; T117R 및 L118C; T117R 및 P179L; T117R 및 G188T; L118C 및 P179L; L118C 및 G188T; P179L 및 G188T; M114S, T117R, 및 L118C; M114S, T117R, 및 P179L; M114S, T1117R, 및 G188T; M114S, L118C, 및 P179L; M114S, L118C, 및 G188T; M114S, P179L, 및 G188T; T117R, L118C, 및 P179L; T117R, L118C, 및 G188T; T117R, P179L, 및 G188T; 또는 L118C, P179L, 및 G188T.

E. 증가된 수준의 16:0 지방산을 함유하는 숙주.

바람직한 실시양태에서, Com25로 형질전환된 숙주 세포 또는 물질은 증가된 수준의 16:0 지방산을 보일 수 있다. 숙주 세포는 예를 들어 숙주 세포에서 16:0-ACP의 대사가 감소됨으로써 증가된 수준의 16:0 지방산을 보일 수 있다. 숙주 세포에서 16:0 지방산의 수준을 증가시키는 다른 방법이 사용될 수 있고, 상기 방법은 당업자의 판단에 의해 선택될 수 있다. 숙주 세포에서 16:0 지방산의 수준을 증가시키는 방법의 예는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 1) 숙주 세포에서 색소체외 탈포화효소의 발현; 2) fab1 유전자 내의 돌연변이의 도입에 의한 숙주 세포에서 KASII의 억제; 및 3) 예를 들어 fae1 유전자 내의 돌연변이의 도입에 의한 16:0 지방산의 연장 감소.

F. 식물 물질의 유전자 형질전환 방법

본 발명은 또한 서열 1에 적어도 60% 동일한 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 형질전환된 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다. 상기 핵산 분자는 또한 예를 들어 비-코딩 조절 요소, 예컨대 프로모터를 포함할 수 있다. 다른 서열이 또한 비-코딩 조절 요소 및 전사가능한 핵산 분자 서열과 함께 세포 내로 도입될 수 있다. 이들 다른 서열은 3' 전사 종결인자, 3' 폴리-아데닐화 신호, 다른 비번역된 서열, 수송 또는 표적화 서열, 선택가능 마커, 인핸서, 및 작동유전자를 포함할 수 있다.

형질전환 방법은 일반적으로 적합한 숙주 세포를 선택하고, 숙주 세포를 재조합 벡터로 형질전환시키고, 형질전환된 숙주 세포를 얻는 단계를 포함한다.

세포 내로의 DNA 도입 기술은 당업자에게 공지되어 있다. 이들 방법은 일반적으로 다음과 같은 5개의 범주로 분류될 수 있다: (1) 화학적 방법 ([Graham and Van der Eb (1973) Virology 54(2):536-9]; [Zatloukal et al., (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:136-53]); (2) 물리적 방법, 예컨대 미세주사 (Capechi (1980) Cell 22(2):479-88), 전기천공 ([Wong and Neumann, Biochim. Biophys. Res. Commun. (1982) 107(2):584-7]; [Fromm et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82(17):5824-8]; 미국 특허 5,384,253), 및 입자 가속 ([Johnston and Tang (1994) Methods Cell Biol. 43(A):353-65]; [Fynan et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(24):11478-82]); (3) 바이러스 벡터 (Clapp (1993) Clin. Perinatol. 20(1):155-68]; [Lu et al., (1993) J. Exp. Med. 178(6):2089-96]; [Eglitis and Anderson (1988) Biotechniques 6(7):608-14)]; (4) 수용체-매개 메카니즘 ([Curiel et al., (1992) Hum. Gen. Ther. 3(2):147-54]; [Wagner et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(13):6099-103]); 및 (5) 예컨대 아그로박테리움을 사용한 세균-매개 메카니즘. 별법으로, 핵산은 식물의 생식 기관에 직접 주사함으로써 화분 내에 직접 도입될 수 있다 ([Zhou et al., (1983) Methods in Enzymology 101:433]; [Hess (1987) Intern. Rev. Cytol. 107:367]; [Luo et al., (1988) Plant Mol. Biol. Reporter 6:165]; [Pena et al., (1987) Nature 325:274]). 다른 형질전환 방법은 예를 들어 미국 특허 5,508,184에 예시된 원형질체 형질전환을 포함한다. 핵산 분자는 또한 미성숙 배아 내로 주입될 수 있다 (Neuhaus et al., (1987) Theor. Appl. Genet. 75:30).

식물 세포의 형질전환을 위해 가장 통상적으로 사용되는 방법은 다음과 같다: 아그로박테리움-매개 DNA 전달 방법 (Fraley et al., (1983) Proc. natl. Acad. Sci. USA 80:4803) (미국 특허 5,824,877; 미국 특허 5,591,616; 미국 특허 5,981,840; 및 미국 특허 6,384,301에 예시됨) 및 비올리스틱 (biolistic) 또는 미세발사체 투사-매개 방법 (즉, 유전자총) (예컨대 미국 특허 5,550,318; 미국 특허 5,538,880; 미국 특허 6,160,208; 미국 특허 6,399,861; 및 미국 특허 6,403,865에 기재됨). 일반적으로, 핵 형질전환이 요구되지만, 색소체, 예컨대 엽록체 또는 전분체 (amyloplast)를 특이적으로 형질전환시키는 것이 바람직한 경우, 식물 색소체는 특정 식물 종, 예컨대 아라비돕시스, 담배, 감자 및 브라시카 종에 요구되는 핵산 분자의 미세발사체-매개 전달을 이용하여 형질전환시킬 수 있다.

아그로박테리움-매개 형질전환은 아그로박테리움 속에 속하는 유전자 조작된 토양 세균의 사용을 통해 달성된다. 몇몇의 아그로박테리움 종은 많은 식물 종 내로 임의의 요구되는 DNA 조각을 운반하도록 유전자 조작될 수 있는 "T-DNA"로서 알려진 특이적 DNA의 전달을 매개한다. T-DNA 매개 발병기전의 과정을 나타내는 주요 사건은 다음과 같다: 병독성 유전자의 유도, 및 TDNA의 처리 및 전달. 상기 과정은 많은 문헌의 주제이다 ([Ream (1989) Ann. Rev. Phytopathol. 27:583-618]; [Howard and Citovsky (1990) Bioassays 12:103-8]; [Kado (1991) Crit. Rev. Plant Sci. 10:1-32]; [Zambryski (1992) Annual Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 43:465-90]; [Gelvin (1993) in Transgenic Plants, Kung and Wu eds., Academic Press, San Diego, pp. 49-87]; [Binns and Howitz (1994) In Bacterical Pathogenesis of Plants and Animals, Dang, ed., Berlin: Springer Verlag., pp. 119-38]; [Hooykaas and Beijersbergen (1994) Ann. Rev. Phytopathol. 32:157-79]; [Lessl and Lanka (1994) Cell 77:321-4]; [Zupan and Zambryski (1995) Annual Rev. Phytopathol. 27:583-618]).

형질전환 방법에 상관없이 형질전환된 식물 세포를 선택 또는 평가하기 위해서, 세포 내로 도입된 DNA는 독성 화합물에 대한 내성을 식물 조직에 부여하는 화합물을 생산하는 기능을 재생가능 식물 조직에서 수행하는 유전자를 함유할 수 있다. 선택가능, 스크리닝가능한, 또는 평가가능한 마커로서 사용하기 위한 관심있는 유전자는 GUS, 녹색 형광 단백질 (GFP), 루시퍼라제, 및 항생제 또는 제초제 내성 유전자를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 항생제 내성 유전자의 예는 페니실린, 카나마이신 (및 네오마이신, G418, 블레오마이신); 메토트렉세이트 (및 트리메토프림); 클로람페니콜; 및 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하는 유전자를 포함한다. 예를 들어, 글리포세이트 내성은 제초제 내성 유전자에 의해 부여될 수 있다 (Della-Cioppa et al., (1987) Bio/Technology 5:579-84). 또한, 포스피노트리신, 비알라포 (bialapho)에 대한 내성, 및 양성 선택 메카니즘을 포함하고 이로 제한되지 않는 다른 선택 기구를 실행할 수 있고 (Joersbro et al., (1998) Mol. Breed. 4:111-7), 이는 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 간주된다.

이어서, 선택 또는 스크리닝에 의해 확인되고 재생을 지지하는 적절한 배지에서 배양된 형질전환된 세포는 식물로 성숙시킬 수 있다.

본원에 개시된 방법은 임의의 형질전환가능한 식물 세포 또는 조직과 함께 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 형질전환가능한 세포 및 조직은 식물을 생성하기 위해 추가로 증식할 수 있는 세포 또는 조직을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 당업자는 식물 세포 또는 조직이 분화된 식물을 형성할 수 있는 적절한 배양 조건 하에 외인성 DNA의 삽입 후에 많은 식물 세포 또는 조직이 형질전환될 수 있음을 인식할 것이다. 이들 목적에 적합한 조직은 미성숙 배아, 배반 조직, 현탁 세포 배양액, 미성숙 꽃, 줄기 분열조직, 노드 외식편 (nodal explant), 캘러스 조직, 배축 조직, 떡잎, 뿌리, 및 잎을 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다.

형질전환된 식물 원형질체 또는 외식편으로부터 식물의 재생, 발달, 및 배양은 당업계에 공지되어 있다 ([Weissbach and Weissbach (1988) Methods for Plant Molecular Biology, (Eds.) Academic Press, Inc., San Diego, CA]; [Horsch et al., (1985) Science 227:1229-31]). 상기 재생 및 성장 과정은 일반적으로 형질전환된 세포를 선택하고 이 세포를 발근 묘목기 (rooted plantlet stage)를 통해 통상적인 배발생 단계를 통해 배양하는 단계를 포함한다. 유전자 도입된 배아 및 종자는 유사하게 재생된다. 이 방법에서, 형질전환체는 일반적으로 성공적으로 형질전환된 세포를 선택하고 식물 새싹 (shoot)의 재생을 유도하는 선택 배지의 존재 하에 배양된다 (Fraley et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803). 이들 새싹은 일반적으로 2 내지 4개월 내에 얻어진다. 생성되는 유전자 도입된 발근 새싹은 이후에 적절한 식물 성장 배지, 예컨대 토양에 식재된다. 선택제 노출시에 생존한 세포, 또는 스크리닝 검정에서 양성으로 평가된 세포는 식물의 재생을 지지하는 배지에서 배양될 수 있다. 이어서, 새싹은 선택제 및 세균 성장을 방기하기 위한 항생제를 함유하는 적절한 발근 유도 배지로 옮길 수 있다. 많은 새싹에서 뿌리가 발생할 것이다. 이어서, 이들은 뿌리가 계속 발생하도록 하기 위해 토양 또는 다른 배지에 식재된다. 상기 개관된 바와 같은 방법은 일반적으로 사용되는 특정 식물주에 따라 상이할 것이고, 따라서 방법의 상세한 내용은 당업자의 판단에 따라 결정된다.

재생된 유전자 도입 식물은 자가수분되어 동형접합성 유전자 도입 식물을 제공할 수 있다. 별법으로, 재생된 유전자 도입 식물로부터 얻은 화분은 비-유전자 도입 식물, 바람직하게는 작물학상 중요한 종의 동계교배 식물주와 교배될 수 있다. 이와 반대로, 비-유전자 도입 식물로부터의 화분은 재생된 유전자 도입 식물을 수분시키기 위해 사용될 수 있다.

유전자 도입 식물은 형질전환된 핵산 서열을 그의 자손체로 전달할 수 있다. 유전자 도입 식물은 바람직하게는 형질전환된 핵산 서열에 대해 동형접합성이고, 유성생식의 결과로서 그 서열을 모든 그의 자손체에게 전달한다. 자손체는 유전자 도입 식물에 의해 생산된 종자로부터 성장할 수 있다. 이어서, 이들 추가의 식물은 자가수분되어 진정 육종 식물주를 생성할 수 있다.

이들 식물로부터의 자손체는 특히 유전자 발현에 대해 평가될 수 있다. 유전자 발현은 몇몇의 통상적인 방법, 예컨대 웨스턴 블로팅, 노던 블로팅, 면역침전, 및 ELISA (효소 결합 면역 흡착 검정)에 의해 검출될 수 있다. 형질전환된 식물은 또한 도입된 DNA의 존재 및 본 발명의 핵산 분자 및 아미노산 분자에 의해 부여된 발현 수준 및/또는 지방산 프로필에 대해 분석될 수 있다. 당업자는 형질전환된 식물의 분석을 위해 이용가능한 많은 방법을 알고 있다. 예를 들어, 식물 분석 방법은 서던 블롯 또는 노던 블롯, PCR-기반 방법, 생화학적 검정, 표현형 스크리닝 방법, 재배지 평가, 및 면역진단 검정을 포함하고 이로 제한되지 않는다.

쌍떡잎식물을 특이적으로 형질전환하기 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 이들 방법을 사용한 형질전환 및 식물 재생은 아라비돕시스 속의 멤버, 목화 (고시퓸 히르수툼 (Gossypium hirsutum)), 대두 (글라이신 맥스 (Glycine max)), 땅콩 (아라키스 히포가에아 (Arachis hypogaea)), 및 브라시카 속의 멤버를 포함하고 이로 제한되지 않는 많은 작물에 대해 설명되어 있다. 주로 아그로박테리움 투메파시엔스를 사용하여 쌍떡잎식물을 형질전환하고, 유전자 도입 식물을 얻기 위한 방법이 목화 (미국 특허 5,004,863; 미국 특허 5,159,135; 미국 특허 5,518,908); 대두 (미국 특허 5,569,834; 미국 특허 5,416,011; [McCabe, et al., (1988) Biotechnology 6:923]; [Christou et al., (1988) Plant Physiol. 87:671-4]; 브라시카 (미국 특허 5,463,174); 땅콩 ([Cheng et al., (1996) Plant Cell Rep. 15:653-7]; [McKently et al., (1995) Plant Cell Rep. 14:699-703]); 파파야; 및 완두콩 (Grant et al., (1995) Plant Cell Rep. 15:254-8)에 대해 발표되었다.

외떡잎식물을 형질전환하기 위한 방법이 또한 당업계에 공지되어 있다. 이들 방법을 사용한 형질전환 및 식물 재생은 보리 (호르데움 불라라에 (Hordeum vulgarae)); 옥수수 (제아 메이즈 (Zea mays)); 귀리 (아베나 사티바 (Avena sativa)); 오쳐드 그래스 (orchard grass) (닥틸리스 글로메라타 (Dactylis glomerata)); 벼 (오리자 사티바 (Oryza sativa), 예를 들어 인디카 (indica) 및 자포니카 (japonica) 변종 포함); 수수 (솔검 비콜로르 (Sorghum bicolor)); 사탕수수 (사카룸 (Saccharum) 종); 톨 페스큐 (tall fescue) (페스투카 아룬디나세아 (Festuca arundinacea)); 투르프그래스 (turfgrass) 종 (예를 들어, 아그로스티스 스톨로니페라 (Agrostis stolonifera), 포아 프라텐시스 (Poa pratensis), 스테노타프룸 세쿤다툼 (Stenotaphrum secundatum)); 밀 (트리티쿰 아에스티붐 (Triticum aestivum)); 및 알팔파 (메디카고 사티바 (Medicago sativa))포함하고 이로 제한되지 않는 많은 작물에 대해 설명되어 있다. 임의의 수의 관심있는 표적 작물에 대해 안정한 유전자 도입 식물의 생산을 위해 많은 형질전환 방법이 사용되고 변형될 수 있음은 당업자에게 자명하다.

임의의 식물이 본원에 개시된 방법에서 사용하기 위해 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 변형에 바람직한 식물은 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana), 보리지 (borage) (보라고 (Borago) 종), 카놀라 (Canola), 피마자 (리시누스 콤뮤니스 (Ricinus communis)), 코코아 열매 (테오브로마 카카오 (Theobroma cacao)), 옥수수 (제아 메이즈), 목화 (고시퓸 종), 크람베 (Crambe) 종, 쿠페아 (Cuphea) 종, 아마 (리눔 (Linum) 종), 레스쿠에렐라 (Lesquerella) 및 림난테스 (Limnanthes) 종, 리놀라 (Linola), 한련 (트로파에올룸 (Tropaeolum) 종), 오에노테라 (Oenothera) 종, 올리브 (올레아 (Olea) 종), 종려나무 (엘라에이스 (Elaeis) 종), 땅콩 (아라키스 종), 평지씨, 잇꽃 (카르타무스 (Carthamus) 종), 대두 (글라이신 및 소자 (Soja) 종), 해바라기 (헬리안투스 (Helianthus) 종), 담배 (니코티아나 (Nicotiana) 종), 베르노니아 종, 밀 (트리티쿰 종), 보리 (호르데움 종), 벼 (오리자 종), 귀리 (아베나 종), 수수 (솔검 종), 호밀 (세칼레 (Secale) 종) 또는 그라미네아에 (Gramineae)의 다른 멤버를 포함한다.

임의의 수의 관심있는 표적 작물로부터 안정한 유전자 도입 식물의 생산을 위해 많은 형질전환 방법이 사용되고 변형될 수 있음은 당업자에게 자명하다.

G. 유전자 도입된 종자

본 발명의 일부 실시양태에서, 유전자 도입된 종자는 서열 2에 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 이들 및 다른 실시양태에서, 유전자 도입된 종자는 서열 1에 적어도 60% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 종자는 증가된 수준의 특이 지방산, 예를 들어, ω-7 지방산, 예컨대 16:1Δ¹⁹ 및/또는 18:1Δ¹¹을 보인다. 종자는 생식력이 있는 유전자 도입 식물로부터 채취하고, 본 발명에 따른 핵산 서열 및 관심있는 또 다른 유전자 또는 핵산 구성체를 포함하는 교잡종 식물주를 비롯한 본 발명의 형질전환된 식물의 자손체 세대를 재배하기 위해 사용될 수 있다.

다음 실시예는 특정 특징 및/또는 실시양태를 예시하기 위해 제시된다. 이들 실시예는 본 발명을 설명되는 특정 특징 또는 실시양태로 제한하는 것으로 생각되지 않아야 한다.

실시예

실시예 I: 물질 및 방법

식물 성장 및 형질전환

아라비돕시스 식물을 E7/2™ 환경 제어 환경 성장 챔버 (콘비론 (Conviron))에서 300 마이크로아인쉬타인의 광 (1 마이크로아인쉬타인 = 광 1몰)에 연속적으로 노출된 상태에서 토양에서 성장시켰다. 식물을 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 GV3101을 사용하여 문헌 [Clough and Bent (1998) Plant J. 16(6):735-43]의 방법에 따라 형질전환시켰다. 본 발명자들은 25A 적색 카메라 필터와 함께 X5 LED™ 섬광 (이노바 (Inova))으로부터의 녹색광 조사시에 방출된 형광 (Stuitje et al., (2003) Plant Biotechnol. J. 1(4):301-9)에 의해 도입유전자를 보유하는 개개의 T₁ 종자를 확인하였다 (Pidkowich et al., (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104(11): 4742-7). 각각 필터 FITC 535 및 FITC 515를 사용하여 Zs-그린 (Green) 및 Ds-레드 (Red) 마커를 보유하는 종자들을 구분하기 위해 올림푸스 (Olympus) U-LH100HG™ 조명 시스템이 구비된 WILD™ M3Z 해부 현미경을 사용하였다. 종자-특이적 발현은 구성체를 파세올린 종자-저장 단백질 프로모터 또는 LTP170 프로모터의 제어 하에 놓음으로써 달성하였다 ([Slightom et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80(7):1897-1901]; 및 [van der Geest and Hall (1997) Plant Mol Biol. 33(3):553-7]).

Com25의 공급원

Com25는 길이가 18C 미만인 아실 사슬을 향한 개선된 활성을 갖는 변이체를 확인하기 위해 설계된 조합 포화 돌연변이 유발/선택 프로그램으로부터 생성된 리시누스 콤뮤니스 A⁹-18:0-ACP 탈포화효소의 변이체이다 (Whittle and Shanklin (2001) J. Biol. Chem. 276(24):21500-5). Com25는 다음 5개의 아미노산 위치에서 모 피마자 탈포화효소와 상이하다: M114S, T117R, L118C, P179L, 및 G188T (성숙 피마자 탈포화효소 PDB 등록 1AFR에 따라 넘버링됨).

플라스미드 구성체

Phas:Com25. 그의 진정한 수송 펩티드를 함유하도록 조작되고 5' PacI 및 3' XhoI 제한 부위에 인접한 피마자 변이체 Com25의 전체 개방 해독 프레임을 플라스미드 pDs-Red-Phas (Ds-Red 마커 존재)의 대응하는 부위 내로 클로닝하여 (Pidkowich et al., (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104(11): 4742-7), Phas:Com25를 생성하였다 (도 5).

Phas:Com25, LTP170:Com25. LTP170 프로모터는 프라이머 P17-5'BamHI (GGGATCCCCGGGTTGACATTTTTACCTTTTT; 서열 3) 및 P17-3'PacI (GGTTAATTAAGTCTTCAAACTCTAGGA; 서열 4)를 사용하여 아라비돕시스 게놈 DNA으로부터 증폭시키고, BamHI-PacI 단편의 단리 전에 pGEMT-Easy 내로 서브클로닝하고, 단편을 플라스미드 pDs-Red-Phas:Com25 (상기 설명함)의 대응하는 부위 내로 클로닝하여 pDs-Red-LTP170:Com25를 생성하였다. 파세올린 종결인자와 함께 Com25를 함유하는 단편을 BamHI 및 EcoRV를 사용하여 절제하고, 벡터 pDs-Red-LTP170-Com25 내의 BamHI 및 SmaI 제한 부위 내로 클로닝하여 Phas:Com25/LTP170:Com25를 생성하였다 (도 5).

Phas:Fab1-HPAS. 상기 구성체는 2 단계로 생성하였다; 먼저, Phas:FatB-HP를 생성하고, 이어서 FatB 유전자의 안티센스 부분을 삽입하여, 헤어핀을 포함하는 FatB 유전자의 센스 및 안티센스 부분을 분리하는 Fad2 인트론의 부분을 대체한다. 이를 달성하기 위해, 150 bp의 아라비돕시스 FatB 3'UTR을 센스 (프라이머 FatB-hps-5'PstI GGGCTGCAGAAACAAGTTTCGGCCACCAACC C; 서열 5 및 FatB-hps-3'XhoI CCCCTCGAGACATCAGAATTCGTAATGAT; 서열 6 사용) 및 안티센스 (프라이머 FatB-hpa-5'NheI GGGGCTAGCAAGTTTCGGCCACCAAC CC; 서열 7 및 FatB-hpa-3'PacI CCCTTAATTAAACATCAGAATTCGTAATGAT; 서열 8 사용) 배향 모두에서 게놈 DNA로부터 증폭시켰다. 이들 단편은 PstI/XhoI 및 NheI/PacI로 제한하고, 이를 사용하여 그의 동등한 부위에서 pGEM-T-Easy-HTM3 (Pidkowich et al., (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104(11): 4742-7) 내의 fab1의 5'UTR 센스 및 안티센스 부분을 대체하여 중간 플라스미드 pGEM-T-Easy-HTM4를 생성하였다. FatB 코딩 영역의 300 bp 안티센스 부분을 생성하기 위해서, 단편을 프라이머 FatB-Exon-5'Sp-Bam (CCACTAGTGGATCCACCTCTGCTACGTCGTCATT; 서열 9) 및 FatB-Exon-3'Bg-Sal (GGAGATCTGTCGACGTAGTTATAGCAGCAAGA AG; 서열 10)을 사용하여 증폭시키고, BamHI 및 SalI으로 제한된 단편을 사용하여, BglII 및 SpeI으로 제한한 후 Fad2-인트론의 일부를 대체하여 pGEM-T-Easy-HTM5를 생성하였다.

조립된 HPAS 단편을 PacI 및 XhoI을 사용하여 절제하고, pZs-Green-Phas:Com25 (상기한 플라스미드 pDs-Red-Phas:Com25, 형광 마커 pCVMV:Ds-Red가 녹색 형광 단백질 마커 pCVMV:Zs-Green™ (클론테크 (Clonetech))으로 대체됨)의 동등한 부위 내로 클로닝하여 플라스미드 Phas:FatB-HPAS (도 5)를 생성하였다.

Phas:AnD9d, Phas:LnD9D. 2개의 진균 아실-CoA D9 탈포화효소를 플라스미드 pDAB7318에 조합하였고, 두 유전자는 파세올루스 불가리스 (Phaseolus vulgaris)로부터의 종자-특이적 Phas 프로모터에 의해 유도되었다. 구성체 내의 제1 유전자는 식물에서의 최적 발현을 위해 재설계 및 합성되고 파세올루스 불가리스 파세올린 유전자로부터의 3' 비번역 영역 및 3' MAR에 융합된 아스페르길루스 니둘란스 (Aspergillus nidulans)로부터의 아실-CoA Δ9-탈포화효소였다 (US 특허 출원 20080260933 A1). 상기 구성체 내의 제2 탈포화효소 유전자는 역시 식물 발현을 위해 재설계 및 합성되고 아그로박테리움 투메파시엔스 ORF23 3' 비번역 영역에 융합된 렙토스파에리아 노도룸 (Leptosphaeria nodorum)으로부터의 아실-CoA Δ9-탈포화효소였다. 상기 탈포화효소는 렙토스파에리아 노도룸 서열결정 프로젝트 (Sequencing Project, Broad Institute of Harvard and MIT) (http://www.broad.mit.edu)에 의해 발표된 에스. 노도룸 게놈 서열의 상동성 검색에 의해 확인되었다. 이것은 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)의 ole1 돌연변이체의 보완에 의해 팔미테이트의 탈포화를 선호하는 것으로 밝혀졌다. Phas:Fab1-HPAS-Phas:Com25. 유전자 스태킹 (stacking) 실험을 단순화하기 위해, 플라스미드 Phas:Fab1/HPAS-Phas:Com25를, Com25 발현을 KASII 억제와 조합하기 위해 제작하였다. 이를 달성하기 위해서, 파세올린 종결인자를 Phas:Com25로부터 단리하고, 파세올린 프로모터 유도 Com25를 함유하는 EcoRV-EcoRV 단편과 함께 중간 벡터 pBL 내로 클로닝하여 pBL-Phas:Com25-PhasTer를 생성하였다. 상기 Com25 발현 카세트 (cassette)를 인접 EcoRI-EcoRI 제한 부위를 사용하여 절제하고, Phas:Fab1-HPAS 내의 대응하는 부위 내로 클로닝하여 Phas:Fab1-HPAS-Phas-Com25를 생성하였다. 도 5를 참고한다.

지방산 분석

단일 종자의 지방산을 분석하기 위해, 종자를 메탄올 내에서 0.2M 트리메틸술포늄 히드록시드와 함께 인큐베이팅함으로써 지방산 메틸 에스테르 (FAME)를 제조하였다 (Butte et al., (1982) Anal. Lett. 15(10):841-50). 대량의 종자를 유사하게 분석하기 위해, 종자를 1 h 동안 80℃에서 0.5 mL BCl₃ 내에서 인큐베이팅하고, 1 mL 헥산으로 추출한 후, N₂ 하에 건조시킴으로써 FAME를 제조하였다. FAME를 HP6890™ 기체 크로마토그래프-불꽃 이온화 검출기 (애질런트 테크놀로지스 (Agilent Technologies)), 또는 60-m x 250-μM SP-2390 모세관 컬럼 (수펠코 (Supelco))이 구비된 HP5890™ 기체 크로마토그래프-질량 분광계 (휴렛 패커드 (Hewlett-Packard))로 분석하였다. 오븐 온도를 분석 동안 1.1 mL/min의 유속으로 100℃에서 240℃로 15℃/min의 속도로 상승시켰다. 질량 분광법은 HP5973™ 질량 선택 검출기 (휴렛 패커드)를 사용하여 수행하였다. 본 발명자들은 일불포화된 FAME의 이중 결합 위치를 디메틸 술피드 유도체화에 의해 결정하였다 (Yamamoto et al., (1991) Chem. and Phys. Lipids 60(1):39-50).

실시예 II : WT 아라비돕시스에서 Com25 의 발현

아스클레피아스 (Hopkins and Chisholm (1961) Can. J. Biochem. Physiol. 39:829-35), 및 독산타 (Chisholm and Hopkins (1965) J. Am. Oil Chem. Soc. 42:49-50)를 포함하는 몇몇의 식물은 그의 종자에 ω-7 FA를 축적하는 것으로 보고되었다. 팔리톨레에이트 합성을 책임지는 탈포화효소를 코딩하는 유전자가 단리되었다. 대응하는 재조합 탈포화효소의 활성 ([Cahoon et al., (1997) Plant Mol. Biol. 33:1105-10]; [Cahoon et al., (1998) Plant Physiol. 117(2):593-8])은 많은 변이체 탈포화효소처럼, 전형적인 스테아로일-ACP 탈포화효소에서 보고된 것보다 더 낮았다 (Whittle and Shanklin (2001) J. Biol. Chem. 276(24):21500-5). 본 발명자들은 아스클레피아스 및 독산타 탈포화효소 및 피마자 탈포화효소의 몇몇의 변이체 (피마자 변종 5.2로부터의 탈포화효소 포함) 및 아라비돕시스에서 피마자 Δ⁹-18:0-탈포화효소의 16:0-탈포화효소 활성을 향상시키기 위해 설계된 유도 진화 실험 (Whittle and Shanklin (2001) J. Biol. Chem. 276(24):21500-5)으로부터 생성된 Com25의 발현 효과를 비교하였다. 이들 실험에서, Com25는 WT 아라비돕시스에서 16:1Δ⁹ 및 그의 연장 생성물 18:1Δ¹¹의 축적을 비형질전환된 식물에서의 거의 검출가능하지 않은 수준으로부터 각각 약 2% 및 약 12%로 증가시켰고; Com25 형질전환체에서 총 약 14%의 ω-7 지방산을 생성하여, 다른 탈포화효소보다 나은 결과를 보였다 (Bondaruk et al., (2007) Plant Breeding 126:186-94). 도 2A; 도 2B.

표 1은 Com25가 16:0-ACP 기질에 대해 피마자 WT (2.8 min^-1)보다 훨씬 개선된 k_cat (11.1 min^-1)를 보이지만, 피마자 변이체 5.2 (25.3 min^-1)에 대해 보고된 것에는 미치지 못함을 보여준다 (Whittle and Shanklin (2001) J. Biol. Chem. 276(24):21500-5). 그러나, Com25의 16:0-ACP에 대한 K_m (0.12 μM)은 피마자 변이체 5.2 (0.55)보다 4.6배 더 낮고, 피마자 WT (5.0)보다 42배 더 낮다. com25의 16:0-ACP 기질에 대한 91 μM^-1·min^-1의 생성되는 특이성 인자는 피마자 변이체 5.2의 약 2배이고 피마자 WT의 163배이다. 실제로, 16:0-ACP에 대한 Com25의 특이성 인자는 그의 천연 18:0-ACP 기질에 대한 피마자 WT의 것 (92 μM^-1·min^-1)과 동등하다. 피마자 변이체 5.2에 비해 16:0-ACP에 대한 Com25의 개선된 K_m은 Com25가 기질에 대해 FatB 및 KASII와 보다 효율적으로 경쟁함을 시사하고, 이것은 그의 발현이 그의 더 낮은 k_cat에도 불구하고 피마자 변이체 5.2보다 ω-7 FA의 더 많은 축적을 촉진하는 현상에 대한 설명을 제공한다.

실시예 IV : 증가된 수준의 16:0을 함유하는 숙주에서 Com25 의 발현

WT 아라비돕시스에서, 지방산을 16:0-ACP의 수준에서 제1 분기점까지 ACP 트랙 (track)을 통해 드 노보 (de novo)로 합성한다 (도 1). 팔미토일 티오에스테라제인 FATB가 작용할 경우, 16:0 유리 지방산은 색소체로부터 세포질로 방출되고, 여기서 CoA로 에스테르화된 후, 내막 시스템의 인지질 상에 에스테르 교환된다. 별법으로, β-케토아실-ACP 합성효소 II (KASII)는 대부분의 16:0-ACP를 18:0-ACP로 연장하고, 이때 ACP는 Δ⁹-스테아로일-ACP 탈포화효소에 의해 탈포화되어 올레오일-ACP를 생산한다. 올레오일-ACP 티오에스테라제인 FATA는 올레산을 방출시키고, 이는 색소체를 빠져나와, 팔미테이트처럼 CoA-티오에스테르로 활성화되고 인지질로 수송된다. ER 내에서, 올레에이트는 지방산 연장효소 (FAE) I의 작용을 통해 10:1Δ¹¹로 연장되거나, 또는 FAD2 및 FAD3의 작용에 의해 순차적으로 탈포화되어, 각각 리놀렌산 또는 리놀렌산을 생산할 수 있다.

16:0-ACP는 16:1Δ⁹-ACP로의 그의 탈포화에 의해 ω-7 생산에 사용될 수 있는 FA 합성 경로의 최초의 대사산물이다. 이를 달성하기 위해서, 종자-특이적 프로모터의 제어 하에 색소체 Δ⁹-16:0-ACP-특이적 탈포화효소를 발현할 가능성을 조사하였다 (도 1 (반응 1) 참조).

상기한 바와 같이, β-케토아실-ACP 합성효소 II (KASII)는 16:0-ACP를 18:0-ACP로 연장한다. 따라서, 증가된 수준의 16:0 기질을 함유하는, 저하된 KASII 활성을 갖는 식물주를 탐색하였다. 도 2는 종자 FA 메틸 에스테르의 대표적인 GC 트레이스 (trace)를 보여준다. 많은 돌연변이 유발 스크린에도 불구하고, 도 2C; 및 표 2에 제시된 바와 같이 WT의 약 10%에 비해 약 21%의 16:0을 함유하는, 잎 및 종자에서 증가된 16:0 수준을 보이는 단지 하나의 돌연변이체 fab1만이 보고되었다 (James and Dooner (1990) Theor. Apple Genet. 80:241-45). 생화학적 증거는 그의 활성이 돌연변이체에서 감소되었기 때문에 fab1 병변이 KASII에 존재함을 보여주었다 (Carlsson et al., (2002) Plant J. 29(6):761-70). fab1 내에서 Com25의 발현은 16:1Δ⁹ 및 18:1Δ¹¹의 축적을 각각 약 23% 및 약 16%로 증가시켰고, 총 약 39%의 ω-7 FA를 생성하였다 (도 2D; 및 표 2). fab1-1 배경에서 Com25의 발현시에 이와 같은 ω-7 FA의 큰 증가는 성숙 종자에서 총 16:0 축적의 증가와 상관성이 있고, 이것은 아마도 KASII에 의한 16:0-ACP 기질에 대한 경쟁의 감소에 의한 것이다.

본 발명자들은 또한 fab1 돌연변이를 fae1과 조합하였고, 그 이유는 C18의 C20 지방산으로의 색소체외 연장의 결여가 16:0 지방산의 양을 추가로 증가시키고, 분석을 단순화시키기 때문이다. 비형질전환된 이중 돌연변이체는 약 9%의 ω-7 지방산을 함유하고, 이것은 아마도 증가된 수준의 16:0-ACP 기질의 존재 하에 Δ⁹-18:0-ACP 탈포화효소에 의한 16:0-ACP의 증가된 탈포화를 반영한다 (도 2E; 및 표 2). fab1/fae1에서 Com25의 발현은 16:1Δ⁹ 및 18:1Δ¹¹을 각각 약 26% 및 약 23%로 증가시켰고, ω-7 FA를 약 50%로 증가시켰다 (도 2F; 및 표 2).

상기 결과로부터, fab1 및 fab1/fae1 종자에서 16:1의 증가된 축적은 증가된 16:0과 상관성이 있고, 따라서 본 발명자들은 16:0 수준이 fab1/fae1 이중 돌연변이체보다 더 높은, Com25를 발현하는 식물주를 탐색하였다. Fab1이 억제된 2개의 상기 돌연변이체가 최근에 보고되었고, 하나는 헤어핀 (HP)RNAi에 의해 억제되고 (Pidkowich et al., (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104(11): 4742-7), 다른 하나는 헤어핀-안티센스 (HPAS) RNAi로 불리는 신규한 억제 방법에 의해 억제된다 (Nguyen and Shanklin (2009) Journal of the American Oil Chemists Society 86:41-9). 이들 식물주는 각각 42% 및 46%에서 크게 상승한 종자 16:0 축적 수준을 보인다 (도 3). Com25에 의한 형질전환은 두 경우 모두에서 ω-7 FA를 추가로 약 5% 증가시켰다 (표 2). 따라서, 16:0의 낮은 수준에서 16:0 축적의 증가는 ω-7 FA 축적의 비례하는 증가에 의해 입증되는 바와 같이 증가된 Com25 탈포화를 예측하지만, 42% 또는 46% 16:0을 축적하는 숙주에서 ω-7 FA 축적 발현 사이에 차이가 없기 때문에, 상기 반응은 분명히 30%를 약간 초과하는 수준에서 포화될 수 있다 (도 3). 임의의 특정 이론에 매이기를 의도하지 않지만, 기질 이외의 다른 인자, 즉, 탈포화효소 풍부도 및/또는 환원제의 이용가능성이 이들 유전자 도입체에서 제한 요소가 되는 것이 가능하다.

최근에, 이형접합체에서 증가된 16:0 수준을 갖지만; 동형접합체는 배아 치사성 (lethal)인 것으로 밝혀진 T-DNA 낙아웃 (knockout) 대립유전자인 fab1-2가 설명되었다 (Pidkowich et al., (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104(11): 4742-7). 본 발명자들은 치사 표현형이 불포화된 지방산의 감소에 의해 발생한다고 가정하고, 상기 식물주에서 Com25의 발현이 생존력을 부여할 수 있다는 이론을 제시한다. 이와 대조적으로, fab1/fae1 이중 돌연변이체는 동형접합성 조건에서 생존가능하고, 성장 및 발달시에 WT과 구별하기 어렵다. 본 발명자들은 따라서 후속 실험을 위한 실험 숙주로서 fab1/fae1 이중 돌연변이체를 사용하였다.

실시예 V: Com25 유전자 투여량의 증가는 ω-7 축적의 증가를 야기한다.

전형적인 피마자 Δ⁹-18:0-ACP 탈포화효소의 k_cat는 42 min^-1이고 (Whittle and Shanklin (2001) J. Biol. Chem. 276(24):21500-5); 이것은 Δ⁹-16:0-ACP 탈포화효소에 대해 보고된 것보다 몇 배 더 높은 것이다 ([Cahoon et al., (1997) Plant Mol. Biol. 33:1105-10]; 및 [Cahoon et al., (1998) Plant Physiol. 117(2):593-8]). 상기 전환률은 유사한 Fe-의존성 산화 반응, 예컨대 시토크롬 P450의 것과 대등하지만, 이들 전환률은 많은 대사 효소보다 더 낮다 (많은 경우에, 10의 제곱 단위만큼). 탈포화효소의 낮은 전환률은 종자 내에 저장된 탄소의 대부분의 탈포화를 설명하기 위해 높은 수준의 단백질 발현을 필요로 하고, 이것은 다량의 탈포화효소가 ω-7 축적을 제한할 수 있을 가능성을 제시한다. 상기 가정을 시험하기 위해서, Com25를 종자-특이적 LTP170 프로모터 (종자 저장 단백질의 발현을 제어함)의 제어 하에 위치하도록 조작하고, 상기한 파세올린-유도 Com25 구성체와 함께 동시 발현시켰다. fab1/fae1 배경에서 파세올린 및 LTP170 프로모터의 제어 하에 Com25의 동시 발현은 ω-7 FA 축적을 약 50%로부터 약 58%로 증가시켰고; 16:1 Δ⁹의 증가 (약 6%)는 18:1Δ¹¹ (약 2%)보다 더 컸다. 상기 ω-7 FA 축적의 증가는 중간 정도이고, 이것은 Com25가 두 Com25 구성체를 발현하는 종자에서 제한 요소가 아닐 가능성을 시사한다.

실시예 VI : 색소체외 Δ ⁹ -16:0 탈포화효소의 발현은 ω-7 FA 축적을 증가시킨다.

앞에서 논의된 바와 같이, 높은 수준의 16:0을 축적하는 배경 아라비돕시스의 사용은 16:0-ACP 탈포화효소의 발현시에 ω-7 FA의 형성과 상관성이 있지만, 많은 16:0이 계속 색소체를 떠나고 종자 오일에 축적된다. 표 2를 참조한다. 따라서, 종자 오일 내의 상기 16:0의 축적을 감소시키는 2개의 방법이 고려되었다. 한 전략은 16:0-ACP로부터 16:0을 절단하는 팔미테이트 티오에스테라제 FATB (도 1)의 활성을 감소시키는 것이었다. HPAS-RNAi를 통한 FATB의 억제는 16:0 축적을 약 3% 감소시켰고, ω-7 FA는 약 6% 증가하였다 (표 2 참조). 색소체로부터 배출된 후 16:0을 탈포화시킴으로써 FATB의 억제에 의해 관찰되는 것을 초과하여 종자 16:0의 축적을 추가로 감소시킬 가능성을 조사하였다.

색소체로부터 방출된 유리 지방산은 트리아실글리세롤로서 축적되는 도중에 아실 Co-A 합성효소에 의해 CoA로 에스테르화된다 (Shockey et al., (2003) Plant Physiol. 132(2):1065-76). 이들 세포질 지방 아실 Co-A 및 인지질-연결 FA는 색소체외 탈포화효소에 대해 잠재적으로 이용가능한 기질의 풀을 나타낸다. 색소체외 진균 아스페르길루스 니둘란스 (An) 및 렙토스파에리아 노도룸 (Ln) 탈포화효소의 단독으로 또는 조합 발현을 아라비돕시스에서 16:0 수준의 감소에 대해 평가하였다. 파세올린 프로모터의 제어 하에 Ln 및 An으로부터의 2개의 탈포화효소의 동시 발현은 WT 아라비돕시스에서 16:0을 감소시킬 때 유망할 결과를 생성하였다. 따라서, KASII HPAS-RNAi 억제 식물주에서 단일 카피의 Com25의 발현과 함께 Ln 및 An 구성체의 발현을 시험하였다. LnΔ9D 및 AnΔ9 탈포화효소의 발현은 약 1/2의 16:0을 16:1Δ⁹로 전환시켰고, 이것은 종자 내의 16:0 축적을 약 19%로부터 약 11% (대략 WT 종자에서 관찰되는 수준)로 감소시켰고, 이에 대응하여 16:1Δ⁹는 약 27%로부터 43%로 증가하였다. 18:1Δ¹¹의 수준은 숙주 fab1/fae1/Com25 식물주 및 LnΔ9D 및 AnΔ9 탈포화효소로 형질전환된 상기 식물주에서 동일하게 유지되었고 (각각 약 25% 및 약 23%), 이것은 fae1 돌연변이체에서 16:1Δ⁹ 연장 활성이 거의 완전히 고갈됨을 보여준다. 상기 색소체 및 색소체외 탈포화효소를 동시 발현시키는 전략은 약 67%의 ω-7 FA의 평균 축적을 생성하였고, 개별 식물은 71%를 초과하는 축적을 보였다.

SEQUENCE LISTING <110> Dow AgroSciences LLC Brookhaven Science Associates, LLC Shanklin, John Nguyen, Tam Huu Walsh, Terence <120> ACCUMULATION OF OMEGA-7 FATTY ACIDS IN PLANT SEEDS <130> 2971.01-9666.1PC <160> 10 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 1092 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Com25 engineered from castor delta9-18:0-desaturase <400> 1 gcctctaccc tcaagtctgg ttctaaggaa gttgagaatc tcaagaagcc tttcatgcct 60 cctcgggagg tacatgttca ggttacccat tctatgccac cccaaaagat tgagatcttt 120 aaatccctag acaattgggc tgaggagaac attctggttc atctgaagcc agttgagaaa 180 tgttggcaac cgcaggattt tttgccagat cccgcctctg atggatttga tgagcaagtc 240 agggaactca gggagagagc aaaggagatt cctgatgatt attttgttgt tttggttgga 300 gacatgataa cggaagaagc ccttcccact tatcaaacaa gtctgaatcg ttgtgatgga 360 gttcgggatg aaacaggtgc aagtccgacg tcttgggcaa tttggacaag ggcatggact 420 gcggaagaga atagacatgg tgacctcctc aataagtatc tctacctatc tggacgagtg 480 gacatgaggc aaattgagaa gacaattcaa tatttgattg gttcaggaat ggatttgcgg 540 acagaaaaca gtccatacct tacgttcatc tatacatcat tccaggaaag ggcaaccttc 600 atttctcatg ggaacactgc ccgacaagcc aaagagcatg gagacataaa gttggctcaa 660 atatgtggta caattgctgc agatgagaag cgccatgaga cagcctacac aaagatagtg 720 gaaaaactct ttgagattga tcctgatggt accgttttgg cttttgctga tatgatgaga 780 aagaaaattt ctatgcctgc acacttgatg tatgatggcc gagatgataa tctttttgac 840 cacttttcag ctgttgcgca gcgtcttgga gtctacacag caaaggatta tgcagatata 900 ttggagttct tggtgggcag atggaaggtg gataaactaa cgggcctttc agctgaggga 960 caaaaggctc aggactatgt ttgtcggtta cctccaagaa ttagaaggct ggaagagaga 1020 gctcaaggaa gggcaaagga agcacccacc atgcctttca gctggatttt cgataggcaa 1080 gtgaagctgt ag 1092 <210> 2 <211> 363 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Com25 engineered from castor delta9-18:0-desaturase <400> 2 Ala Ser Thr Leu Lys Ser Gly Ser Lys Glu Val Glu Asn Leu Lys Lys 1 5 10 15 Pro Phe Met Pro Pro Arg Glu Val His Val Gln Val Thr His Ser Met 20 25 30 Pro Pro Gln Lys Ile Glu Ile Phe Lys Ser Leu Asp Asn Trp Ala Glu 35 40 45 Glu Asn Ile Leu Val His Leu Lys Pro Val Glu Lys Cys Trp Gln Pro 50 55 60 Gln Asp Phe Leu Pro Asp Pro Ala Ser Asp Gly Phe Asp Glu Gln Val 65 70 75 80 Arg Glu Leu Arg Glu Arg Ala Lys Glu Ile Pro Asp Asp Tyr Phe Val 85 90 95 Val Leu Val Gly Asp Met Ile Thr Glu Glu Ala Leu Pro Thr Tyr Gln 100 105 110 Thr Ser Leu Asn Arg Cys Asp Gly Val Arg Asp Glu Thr Gly Ala Ser 115 120 125 Pro Thr Ser Trp Ala Ile Trp Thr Arg Ala Trp Thr Ala Glu Glu Asn 130 135 140 Arg His Gly Asp Leu Leu Asn Lys Tyr Leu Tyr Leu Ser Gly Arg Val 145 150 155 160 Asp Met Arg Gln Ile Glu Lys Thr Ile Gln Tyr Leu Ile Gly Ser Gly 165 170 175 Met Asp Leu Arg Thr Glu Asn Ser Pro Tyr Leu Thr Phe Ile Tyr Thr 180 185 190 Ser Phe Gln Glu Arg Ala Thr Phe Ile Ser His Gly Asn Thr Ala Arg 195 200 205 Gln Ala Lys Glu His Gly Asp Ile Lys Leu Ala Gln Ile Cys Gly Thr 210 215 220 Ile Ala Ala Asp Glu Lys Arg His Glu Thr Ala Tyr Thr Lys Ile Val 225 230 235 240 Glu Lys Leu Phe Glu Ile Asp Pro Asp Gly Thr Val Leu Ala Phe Ala 245 250 255 Asp Met Met Arg Lys Lys Ile Ser Met Pro Ala His Leu Met Tyr Asp 260 265 270 Gly Arg Asp Asp Asn Leu Phe Asp His Phe Ser Ala Val Ala Gln Arg 275 280 285 Leu Gly Val Tyr Thr Ala Lys Asp Tyr Ala Asp Ile Leu Glu Phe Leu 290 295 300 Val Gly Arg Trp Lys Val Asp Lys Leu Thr Gly Leu Ser Ala Glu Gly 305 310 315 320 Gln Lys Ala Gln Asp Tyr Val Cys Arg Leu Pro Pro Arg Ile Arg Arg 325 330 335 Leu Glu Glu Arg Ala Gln Gly Arg Ala Lys Glu Ala Pro Thr Met Pro 340 345 350 Phe Ser Trp Ile Phe Asp Arg Gln Val Lys Leu 355 360 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> P17-5'BamHI primer <400> 3 gggatccccg ggttgacatt tttacctttt t 31 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> P17-3'PacI primer <400> 4 ggttaattaa gtcttcaaac tctagga 27 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> FatB-hps-5'PstI primer <400> 5 gggctgcaga aacaagtttc ggccaccaac cc 32 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> FatB-hps-3'XhoI primer <400> 6 cccctcgaga catcagaatt cgtaatgat 29 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> FatB-hpa-5'NheI primer <400> 7 ggggctagca agtttcggcc accaaccc 28 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> FatB-hpa-3'PacI primer <400> 8 cccttaatta aacatcagaa ttcgtaatga t 31 <210> 9 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> FatB-Exon-5'Sp-Bam primer <400> 9 ccactagtgg atccacctct gctacgtcgt catt 34 <210> 10 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> FatB-Exon-3'Bg-Sal primer <400> 10 ggagatctgt cgacgtagtt atagcagcaa gaag 34

Claims

서열 1에 적어도 60% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 Δ⁹ 탈포화효소를 코딩하는 핵산 분자.
제1항에 있어서, 유전자 조절 요소를 추가로 포함하는 핵산 분자.
제2항에 있어서, 유전자 조절 요소가 파세올린 프로모터 또는 LTP170 프로모터인 핵산 분자.
서열 2에 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 Δ⁹ 탈포화효소.
제4항에 있어서, 서열 2에 적어도 80% 동일한 아미노산이 서열 2의 위치 114에 유사한 위치에 세린; 서열 2의 위치 117에 유사한 위치에 아르기닌; 서열 2의 위치 118에 유사한 위치에 시스테인, 서열 2의 위치 179에 유사한 위치에 류신; 또는 서열 2의 위치 188에 유사한 위치에 트레오닌을 포함하는 것인 Δ⁹ 탈포화효소.
제4항에 있어서, 서열 2에 적어도 80% 동일한 아미노산이 서열 2의 위치 114에 유사한 위치에 세린; 서열 2의 위치 117에 유사한 위치에 아르기닌; 서열 2의 위치 118에 유사한 위치에 시스테인, 서열 2의 위치 179에 유사한 위치에 류신; 및 서열 2의 위치 188에 유사한 위치에 트레오닌을 포함하는 것인 Δ⁹ 탈포화효소.
식물 물질 내의 특이 지방산의 양이 증가하도록 식물 물질을 제1항의 핵산 분자로 형질전환시키는 것을 포함하는, 식물 물질 내의 특이 지방산의 양을 증가시키는 방법.
제7항에 있어서, 식물 물질을 제1항의 추가의 핵산 분자로 형질전환시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
제7항에 있어서, 식물 물질이 식물 물질 내의 16:0-ACP의 수준을 증가시키기 위한 수단을 포함하는 것인 방법.
제9항에 있어서, 식물 물질 내의 16:0-ACP의 수준을 증가시키기 위한 수단이 색소체외 탈포화효소의 발현인 방법.
제9항에 있어서, 식물 물질 내의 16:0-ACP의 수준을 증가시키기 위한 수단이 KASII의 억제인 방법.
제11항에 있어서, KASII의 억제가 fab1 유전자 내에 돌연변이를 도입함으로써 달성되는 것인 방법.
제9항에 있어서, 식물 물질 내의 16:0-ACP의 수준을 증가시키기 위한 수단이 식물 물질 내의 16:0 지방산의 연장을 감소시키는 것인 방법.
제13항에 있어서, 식물 물질 내의 16:0 지방산의 연장을 감소시키는 것이 fae1 유전자 내에 돌연변이를 도입함으로써 달성되는 것인 방법.
제7항에 있어서, 식물 물질이 식물이 아라비돕시스 (Arabidopsis), 보라고 (Borago), 카놀라 (Canola), 리시누스 (Ricinus), 테오브로마 (Theobroma), 제아 (Zea), 고시퓸 (Gossypium), 크람베 (Crambe), 쿠페아 (Cuphea), 리눔 (Linum), 레스쿠에렐라 (Lesquerella), 림난테스 (Limnanthes), 리놀라 (Linola), 트로파에올룸 (Tropaeolum), 오에노테라 (Oenothera), 올레아 (Olea), 엘라에이스 (Elaeis), 아라키스 (Arachis), 평지씨, 카르타무스 (Carthamus), 글라이신 (Glycine), 소자 (Soja), 헬리안투스 (Helianthus), 니코티아나 (Nicotiana), 베르노니아 (Vernonia), 트리티쿰 (Triticum), 호르데움 (Hordeum), 오리자 (Oryza), 아베나 (Avena), 솔검 (Sorghum), 세칼레 (Secale) 및 그라미네아에 (Gramineae)의 다른 멤버를 포함하는 군 중에서 선택되는 속으로부터 선택되는 식물로부터 얻는 것인 방법.
제7항에 있어서, 식물 물질이 식물 물질 내의 16:0-ACP의 수준을 증가시키기 위한 2개의 수단을 포함하는 것인 방법.
제16항에 있어서, 식물 물질 내의 16:0-ACP의 수준을 증가시키기 위한 제1 수단이 KASII의 억제이고, 식물 물질 내의 16:0-ACP의 수준을 증가시키기 위한 제2 수단이 식물 물질 내의 16:0 지방산의 연장을 감소시키는 것인 방법.
제7항에 있어서, 식물 물질이 식물 물질 내의 16:0-ACP의 수준을 증가시키기 위한 3개의 수단을 포함하는 것인 방법.
제18항에 있어서, 식물 물질 내의 16:0-ACP의 수준을 증가시키기 위한 제1 수단이 KASII의 억제이고, 식물 물질 내의 16:0-ACP의 수준을 증가시키기 위한 제2 수단이 식물 물질 내의 16:0 지방산의 연장을 감소시키는 것이고, 식물 물질 내의 16:0-ACP의 수준을 증가시키기 위한 제3 수단이 색소체외 탈포화효소의 발현인 방법.
제10항에 있어서, 색소체외 탈포화효소가 LnΔ9D 또는 AnΔ9 탈포화효소인 방법.
식물 물질을 제1항의 핵산 분자로 형질전환시키고;
형질전환된 식물 물질을 배양하여 식물을 얻는 것
을 포함하는, 야생형 식물에 비해 증가된 양의 특이 지방산을 식물 내에 포함하는 유전자 조작된 식물의 생성 방법.
제21항에 있어서, 식물이 아라비돕시스, 보라고, 카놀라, 리시누스, 테오브로마, 제아, 고시퓸, 크람베, 쿠페아, 리눔, 레스쿠에렐라, 림난테스, 리놀라, 트로파에올룸, 오에노테라, 올레아, 엘라에이스, 아라키스, 평지씨, 카르타무스, 글라이신, 소자, 헬리안투스, 니코티아나, 베르노니아, 트리티쿰, 호르데움, 오리자, 아베나, 솔검, 세칼레, 및 그라미네아에의 다른 멤버를 포함하는 군 중에서 선택되는 속으로부터 선택되는 것인 방법.
제21항의 방법에 의해 얻은 식물.
제23항의 식물로부터 얻은 식물 물질.
제24항에 있어서, 식물 물질이 종자인 식물 물질.