CN114431101B

CN114431101B - 一种甘蔗13c同位素标记的方法及装置

Info

Publication number: CN114431101B
Application number: CN202210108141.XA
Authority: CN
Inventors: 桂意云; 李海碧; 刘昔辉; 祝开; 韦金菊; 张荣华; 周会; 区惠平; 毛莲英
Original assignee: Guangxi Zhuang Nationality Autonomous Region Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Guangxi Zhuang Nationality Autonomous Region Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-01-28
Filing date: 2022-01-28
Publication date: 2023-02-28
Anticipated expiration: 2042-01-28
Also published as: CN114431101A

Abstract

本发明属于同位素示踪技术领域，具体涉及一种甘蔗¹³C同位素标记的方法，它包括以下步骤：(1)将甘蔗苗移栽至桶中待成活后，移到箱体中，在箱体中放入Na₂ ¹³CO₃；(2)待甘蔗苗长高至20‑25cm后，每隔1周进行一次¹³C标记，将HCl放入外置的进液控制器中，每次标记前密封箱体，向箱体内存放的Na₂ ¹³CO₃中，注入HCl溶液，6小时后解除箱体密封状态，淋水，继续密封箱体，16小时后，解除箱体密封状态；(3)进行4‑6次¹³C标记后，将甘蔗移出箱体，常规管理，收获蔗叶，获得¹³C标记蔗叶。通过本发明方法能够提高甘蔗¹³C标记的效率，避免¹³CO₂浪费，降低成本，获得¹³C标记蔗叶，为深入研究蔗叶还田下其碳养分在大气‑植物‑土壤中的归还情况提供材料。

Description

一种甘蔗13C同位素标记的方法及装置

技术领域

本发明属于同位素示踪技术领域，具体涉及一种甘蔗¹³C同位素标记的方法及装置。

背景技术

稳定性同位素¹³C脉冲标记技术是研究植物光合作用及其光合碳在植物-土壤-大气系统中周转规律的最科学高效方法之一。利用稳定性同位素¹³C脉冲标记技术可以提供植物各生育时期光合碳的分配信息，也可以科学区分不同碳源，研究土壤有机碳及其组分的分解程度和周转速率，示踪碳的迁移转化过程。

获取¹³C标记作物材料是研究作物碳在大气-植物-土壤中迁移转化的重要前提。目前，科研用¹³C标记材料主要通过人工标记获取。当前国内外许多学者标记的材料主要涉及小麦、水稻、玉米、大豆、湿地植物。然而，由于作物生理生化特性不同，同种标记方法和标记条件下，不同作物标记效果有差异，同类植物不同器官标记效果不同，同类植物相同器官在不同物侯期下的标记效果亦有不同。例如，文献名为霍莉莉等研究的“¹³CO₂脉冲标记植物的方法及效果研究”表明，每次标记通入丰度99％，纯度99.999％的¹³CO₂气体10L，标记4h，共标记4次，可使得湿地植物根、茎和叶的Atom％¹³C比未标记增加了1.03、1.78和0.91倍，大豆根、茎和叶的Atom％¹³C比未标记增加了1.20、 2.19和2.99倍，大豆标记效果优于湿地植物。因此，亟需根据需求探讨一种简单易行、低量高效、经济实用的标记方法，特别亟需对甘蔗作物的稳定性同位素¹³C脉冲标记方法的研究。

甘蔗是全球最重要的能源、糖料作物，由甘蔗生产产生的蔗叶生物资源十分丰富，约占植蔗地上部的20％。蔗叶还田是蔗区改善土壤结构、提升土壤肥力和增加土壤碳库的重要农业措施。研究蔗叶还田对土壤有机碳积累的影响、土壤有机碳库对蔗叶源碳的响应对于认识蔗叶源碳的转化途径、周转以及对土壤的碳库效应具有重要意义。然而，当前探讨甘蔗作物的稳定性同位素¹³C脉冲标记技术研究较少。因此，研究探索了¹³C脉冲标记甘蔗的技术方法及标记效果，为深入研究蔗叶光合碳在大气-植物-土壤中的周转提供科技方法与材料非常有必要。

发明内容

本发明旨在解决上述技术问题，提供一种甘蔗¹³C同位素标记的方法，通过本发明方法标记结果容易达到甘蔗研究试验的要求，能够提高密封性，从而提高标记的准确度，为深入研究蔗叶光合碳在大气-植物-土壤中的周转提供科技方法与材料。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

一种甘蔗¹³C同位素标记的方法，包括以下步骤：

(1)将甘蔗苗移栽至桶中待成活后，，移到箱体中，在箱体中放入Na₂ ¹³CO₃溶液；

(2)待甘蔗苗长高至20-25cm后，每隔1周进行一次¹³C标记，将HCl溶液放入外置的进液控制器中，每次标记前密封箱体，向箱体内存放的Na₂ ¹³CO₃中，注入HCl溶液，6-7小时后解除箱体密封状态，淋水，继续密封箱体，15-16小时后，解除箱体密封状态；

(3)进行4-6次¹³C标记后，将甘蔗移出箱体，常规管理，收获蔗叶，获得¹³C标记蔗叶。

优选地，本发明所述步骤(1)中，Na₂ ¹³CO₃的丰度为99atom％，Na₂ ¹³CO₃的加入量为每1m³的箱体体积加入0.64g/m³Na₂ ¹³CO₃。

优选地，本发明在箱体装有小风扇，在注入HCl溶液前，打开风扇。

优选地，本发明所述步骤(1)中，Na₂ ¹³CO₃放入箱体内的多个容器中，需要标记时，再注入HCl溶液。

优选地，本发明所述步骤(1)中，HCl溶液的体积浓度为2-4mol/L。

为了提高甘蔗¹³C标记效率，提高箱体的密封性，本发明还提供甘蔗¹³C同位素标记装置，包括箱体，所述箱体侧壁上设有箱门，在所述箱门的邻、对侧壁上设有多个密封装置；所述密封装置包括底座、安装座、封盖、螺栓、连接管、热缩套管和限位杆，所述底座设在所述箱体的侧壁上，所述底座上开设有通孔，所述通孔与箱体的内腔相连通，所述底座内固定安装有安装座，所述螺栓穿过封盖与安装座转动连接，且所述螺栓与所述封盖螺纹连接，所述螺栓远离安装座的一端固定安装有旋钮，所述封盖上固定安装有连接管，所述连接管贯穿所述封盖，所述连接管上套设有热缩套管，所述底座上固定安装有限位杆，所述限位杆贯穿所述封盖，且所述限位杆与封盖滑动配合。

优选地，本发明所述箱体装置还包括进液控制器，所述进液控制器穿过所述连接管贯穿所述箱体侧壁与所述箱体连通。本发明的HCl溶液放入进液控制器中，当需要标记甘蔗时，打开进液控制器，注入HCl溶液即可。

优选地，本发明所述箱体内顶部还装有风扇。

优选地，本发明所述底座上还设有与封盖相匹配的密封圈。

由于采用上述技术方案，本发明的有益效果为：

1、通过本发明方法能够提高甘蔗¹³C标记的效率，避免¹³CO₂浪费，降低成本，低量高效，获得¹³C标记蔗叶，为深入研究蔗叶光合碳在大气-植物-土壤中的周转提供材料。

2、本发明的甘蔗¹³C同位素标记装置能够显著提高箱体的密封性，防止¹³C标记时，¹³CO₂溢出造成浪费，同时设有的密封装置，具有通风和通进液控制器的效果，符合进液控制器不同管尺寸的使用，加热热缩套管后，连接管与进液控制器紧紧贴合，进一步提高箱体的密封性能，通过进液控制器注入HCl溶液时，产生的¹³CO₂不会泄露出来，避免原料的浪费，提高¹³C同位素标记效率和利用率。

附图说明

图1为本发明实施例中甘蔗碳同位素标记立体图。

图2为本发明实施例中密封装置结构立体图。

图中标记为：

1、箱体；2、箱门；3、密封装置；31、底座；32、热缩套管；33、封盖；34、螺栓；35、限位杆；36、安装座；37、连接管；4、栽培桶；5、进液控制器；6、风扇；7、容器。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1和图2所示，本实施例中，甘蔗¹³C同位素标记装置，包括箱体1，箱体1 为透明材料，有利于甘蔗进行光合作用，箱体1可根据需要选择合适的大小，所述箱体 1侧壁上设有箱门2，在所述箱门2的邻、对侧壁上设有多个密封装置3；所述密封装置 3包括底座31、安装座36、封盖33、螺栓34、连接管37、热缩套管32和限位杆35，所述底座31设在所述箱体1的侧壁上，所述底座31上开设有通孔，所述通孔与箱体1 的内腔相连通，所述底座31内固定安装有安装座36，所述螺栓34穿过封盖33与安装座36转动连接，且所述螺栓34与所述封盖33螺纹连接，所述螺栓34远离安装座36 的一端固定安装有旋钮，所述封盖33上固定安装有连接管37，所述连接管37贯穿所述封盖33，所述连接管37上套设有热缩套管32，所述热缩套管32远离箱体1一侧还设有与其相匹配的盖帽(未标记)，当需要放进液控制器5，将进液控制器5的软管放入箱体1内时，打开盖帽(未标记)，穿进连接管37中，加热热缩套管32，热缩套管32 收缩，与进液控制器5软管贴合，不要穿软管时，盖住盖帽(未标记)，进行密封，所述底座31上固定安装有限位杆35，所述限位杆35贯穿所述封盖33，且所述限位杆35 与封盖33滑动配合，为进一步提高密封性，所述安装座36上还设有与封盖33接触面相匹配的密封圈，当需要通风的时候，将螺栓34向外拧，打开封盖33，当需要密封时，将螺栓34向箱体1内拧紧，即可进行密封。

本发明所述箱体1装置还包括挂在其外侧壁上的进液控制器5，所述进液控制器5(类似于输液瓶)的软管穿过所述连接管37贯穿所述箱体1侧壁与所述箱体1连通，调节好进液控制器5软管的位置后，加热热缩套管32，热缩套管32收缩，与进液控制器5软管贴合，从而提高密封性，HCl溶液放入进液控制器5中，当需要标记甘蔗时，打开进液控制器5，注入HCl溶液到箱内，HCl溶液与箱体1内用容器7存放的Na₂ ¹³CO₃反应，即可进行标记，为了使得¹³CO₂在箱体1内分布均匀，在所述箱体1内顶部还装有风扇6，风扇6固定安装，外接电源，在箱体1外控制风扇6的开、关，在注入HCl溶液前，打开风扇6，所述箱体内还设有温度调节器(未标记)，控制温度为25-30℃。

实施例1

一种甘蔗¹³C同位素标记的方法，包括以下步骤：

(1)将甘蔗苗移栽至栽培桶中待成活后，移到长1.25m、宽1m、高1.25m的箱体中，在箱体中放入2个装有¹³C丰度为99atom％的Na₂ ¹³CO₃(Na₂ ¹³CO₃固体质量为0.5g) 容器(对角放)，将两个进液控制器挂在箱体外侧壁上，位于容器的上方；

(2)待甘蔗苗长高至20-25cm后，每隔1周进行一次¹³C标记，每次标记时间为 10:00～16:00，将100ml体积浓度为2mol/L HCl溶液放入外置的进液控制器中，每次标记前密封箱体，向箱体内存放的Na₂ ¹³CO₃中，注入HCl溶液，6小时后解除箱体密封状态，淋水，继续密封箱体，16小时后，解除箱体密封状态；

(3)进行4次¹³C标记后，将甘蔗移出箱体，移至温室大棚，进行常规管理，收获蔗叶，获得¹³C标记蔗叶。

实施例2

一种甘蔗¹³C同位素标记的方法，包括以下步骤：

(1)将甘蔗苗移栽至栽培桶中待成活后，移到长1.25m、宽1m、高1.25m的箱体中，在箱体中放入2个装有¹³C丰度为99atom％的Na₂ ¹³CO₃(Na₂ ¹³CO₃固体质量为1g)容器(对角放)，将两个进液控制器挂在箱体外侧壁上，位于容器的上方；

(2)待甘蔗苗长高至20-25cm后，每隔1周进行一次¹³C标记，每次标记时间为 10:00～15:00，将100ml体积浓度为4mol/L HCl溶液放入外置的进液控制器中，每次标记前密封箱体，向箱体内存放的Na₂ ¹³CO₃中，注入HCl溶液，7小时后解除箱体密封状态，淋水，继续密封箱体，15小时后，解除箱体密封状态；

(3)进行6次¹³C标记后，将甘蔗移出箱体，移至温室大棚，进行常规管理，收获蔗叶，获得¹³C标记蔗叶。

实施例3

与实施例3不同的是：步骤(3)中，标记的次数为6次。

¹³C标记蔗叶样品的制备方法为：从基部剪断蔗叶，用蒸馏水洗净，沥干后，蔗叶置于105℃烘箱中杀青15min，65℃恒温烘干至恒重，获得¹³C标记蔗叶样品。

本发明试验中的供试栽培桶中土壤采自广西农业科学院院本部基地甘蔗试验地，采样深度0-15cm。土壤取回后自然风干，去除植物残体，捶碎过2mm筛备用。土壤理化性质为：pH(H₂O)6.18，有机质17.1g/kg，碱解氮48.3mg/kg，速效磷0.30mg/kg，速效钾75.6mg/kg。供试甘蔗品种为桂糖58号(GT58)。本发明栽培桶直径25cm，高35cm，每桶装过2mm筛的风干土15kg。每桶按面积算出N1.17g/桶，P₂O₅0.47g/桶,K₂O 1.17g/ 桶。

本发明中，影响甘蔗叶¹³C的标记效率的因素有多种，为了验证Na₂ ¹³CO₃加入量对甘蔗叶³C的标记效率的影响，做如下对比试验：与实施例1基本相同，不同之处在于：Na₂ ¹³CO₃加入量为0g、0.1g、1g、2g。试验结果见表1。

表1不同Na₂ ¹³CO₃加入量对甘蔗叶³C的标记效率的影响

注：同一列不同字母表示在P<0.05水平差异显著，下同。

出于成本和标记效率考虑，Na₂ ¹³CO₃的标记用量和标记次数均应在满足作物¹³C丰度需求的前提下减少。后续研究蔗叶光合碳在大气-植物-土壤中的周转所需要的¹³C标记蔗叶的δ¹³C值达到16‰以上时，得到的¹³C标记蔗叶即可满足研究的需求。从表1可知，当其他条件相同的情况下，按照每1m³的箱体体积加入0.64g/m³的Na₂ ¹³CO₃时，甘蔗叶¹³C的标记效率(E_m)达到20.19％，因此，当标记次数相同时，Na₂ ¹³CO₃用量按照每1m³的箱体体积加入0.64g，得到的¹³C标记蔗叶即可达到要求，而当用量过少，得到的¹³C 标记蔗叶达不到研究要求，而用量过多，则造成材料的浪费，提高成本。

本发明中，为了进一步验证Na₂ ¹³CO₃加入量对甘蔗叶³C的标记效率的影响，继续做如下对比试验：与实施例3基本相同，不同之处在于：标记次数为6次。试验结果见表 2。

表2不同标记次数对甘蔗叶³C的标记效率的影响

注：同一列不同字母表示在P<0.05水平差异显著，下同。

从表2可知，当标记6次时，按照每1m³的箱体体积加入0.64g/m³的Na₂ ¹³CO₃时，¹³C 标记蔗叶的δ¹³C值远超16‰，再继续添加Na₂ ¹³CO₃量，超过量又更加多。再结合前面表 1的数据，可知，为节省材料，降低成本，其它条件相同的情况下，标记4次，按照每 1m³的箱体体积加入0.64g/m³的Na₂ ¹³CO₃时，即可获得δ¹³C值达到16‰以上的¹³C标记蔗叶，满足研究要求，获得最佳效果。

本发明中，为了验证标记次数对甘蔗叶³C的标记效率的影响，做如下对比试验：与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤(3)标记次数分别为2次和6次。试验结果见表3。

表3不同标记次数对甘蔗叶³C的标记效率的影响

注：同一列不同字母表示在P<0.05水平差异显著，下同。

从表3可知，当Na₂ ¹³CO₃用量相同时，进行标记4次时，获得的¹³C标记蔗叶即可达到研究要求(δ¹³C值达到16‰以上)，如果标记次数过少达到不到要求，如果标记次数过多，则浪费材料。

本发明中，为了验证开始标记时机对甘蔗叶³C的标记效率的影响，做如下对比试验：与实施例1基本相同，不同之处在于：所述(2)中，“待甘蔗苗长高至20-25cm”分别换成：“甘蔗苗长高至5-10cm后开始标记”、甘蔗苗长高至50-55cm后开始标记，另外还设不进行标记对照组，试验结果见表4。

表4不同开始标记时机对甘蔗叶³C的标记效率的影响

开始标记时机	δ<sup>13</sup>C/‰	E<sub>m/</sub>/％
			不进行标记	-0.802±0.003d	-
甘蔗苗长高至5-10cm后开始标记	12.21±0.065b	8.21
			甘蔗苗长高至20-25cm后开始标记	34.38±0.36a	20.19
甘蔗苗长高至50-55cm后开始标记	33.22±0.24c	19.34

注：同一列不同字母表示在P<0.05水平差异显著，下同。

从表4可知，标记时机对获得的¹³C标记蔗叶有一定的影响，甘蔗标记过早，甘蔗叶光合作用还比较弱，难吸收¹³CO₂，在标记次数相同的情况下，难获得符合要求的¹³C 标记蔗叶(δ¹³C值达到16‰以上)，标记过晚，甘蔗长得过高，需要更大的标记装置，对标记装置要求过高，提高成本。

上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims

1.一种甘蔗¹³C同位素标记的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将甘蔗苗移栽至桶中待成活后，移到箱体中，在箱体中放入Na₂ ¹³CO₃溶液；

(3)进行4-6次¹³C标记后，将甘蔗移出箱体，常规管理，收获蔗叶，获得¹³C标记蔗叶；

所述步骤(1)中，Na₂ ¹³CO₃中的¹³C丰度为99atom％，Na₂ ¹³CO₃的加入量为每1m³的箱体体积加入0.64-1.28g/m³Na₂ ¹³CO₃。

2.如权利要求1所述甘蔗¹³C同位素标记的方法，其特征在于：在箱体装有小风扇，在注入HCl溶液前，打开风扇。

3.如权利要求1所述甘蔗¹³C同位素标记的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，Na₂ ¹³CO₃放入箱体内的多个容器中，需要标记时，再注入HCl溶液。

4.如权利要求1所述甘蔗¹³C同位素标记的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，HCl溶液的体积浓度为2-4mol/L。