KR20080075855A

KR20080075855A - 재조합 식물 현탁배양을 이용한 백신 마스터 세포주제조방법

Info

Publication number: KR20080075855A
Application number: KR1020087013417A
Authority: KR
Inventors: 찰스 에이 미할락; 메튜 제이 팬턴; 제니스 케이 맥밀렌
Original assignee: 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨
Priority date: 2005-11-04
Filing date: 2006-10-23
Publication date: 2008-08-19
Also published as: CA2628308A1; EP1942931A2; WO2007055894A2; EP1942931A4; JP2009514547A; CN101355961A; ZA200803557B; BRPI0618236A2; US7553666B2; AU2006312126A1; TW200738128A; US20100009449A1; US7964403B2; AR056153A1; US20070107086A1; WO2007055894A3; NZ568562A

Abstract

본 발명은 식물세포배양, 및 규제요건(regulatory compliance)와 GMP(우수 제조관리기준) 관리기준에 적합한 단백질 제제 생산을 위해 식물세포를 배양하고 보관하는 방법을 제공한다. 본 발명의 특정 견지에서는, 트랜스제닉 세포배양이 백신, 산업적, 의약적, 약리학적 조제에 있어서 유용한 단순 또는 복합 생물의약 단백질 및 펩티드 제제 발현에 사용된다. 본 발명의 다른 견지에서는, 식물세포에서 생산된 백신 생산 시스템을 제공한다. 아울러, 식물 마스터 세포주들은 규제 요건을 맞추기에 충분한 안정성과 강건성을 나타낸다.

세포배양, 마스터 세포주, 백신, GMP, 단백질

Description

재조합 식물 현탁배양을 이용한 백신 마스터 세포주 제조방법{PREPARATION OF VACCINE MASTER CELL LINES USING RECOMBINANT PLANT SUSPENSION CULTURES}

본 출원은 2005년 11월 4일자로 출원된 미국 가특허 출원 제 60/733,702호에 대한 우선권의 이익을 주장한다.

본 발명은 식물세포 배양 및 식물세포 배양에서의 단백질 생산 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 치료제와 백신에 사용하기 위한 목적의 광범위한 단순, 복합 단백질을 생산해낼 수 있는 생산 시스템 일체 및 세포주에 관한 것이다.

재조합 DNA 기술은 백신을 포함한 약제 및 수의약품의 안전성, 품질, 효능 및 비용 측면에서 괄목할 만한 성장을 제공해 왔다. 식물에서 생산된 점막 백신은 커티스(Curtiss)와 카디뉴(Cardineau)에 의해 발명되었는데, 본 출원의 참조문헌으로 병합되어 있는 미국특허번호 5,654,184; 5,679,880 및 5,686,079를 참조한다. Arntzen, Mason 및 Lam을 포함한 다른 학자들은 면역보호성 항원을 발현하는 트랜스제닉(transgenic) 식물들과 생산방법에 대해 밝혀냈다. 본 출원의 참조문헌으로 병합되어 있는 미국특허번호 5,484,717; 5,914,123; 6,034,298; 6,136,320; 6,194,560; 및 6,395,964를 참조한다.

한정배지에서 세포배양을 이용하여 식물세포를 생산하는 것은, 생산 공정에 서 병원성 오염원들을 방출할 위험을 없애는 생장배지에 있어서 동물 유래 원료물질이 필요하지 않다. 식물세포들은 번역후 글리코실화(posttranslational glycosylation)가 가능하고, 식물세포 생장배지는 일반적으로 백신 제조 목적으로 지금까지 사용되어 온 기존의 생장배지에 비해서 더 저렴하고, 취급 및 제조가 더 간편하다.

식물 시스템에서 생산된 약리학적 또는 관련 생물학적 활성을 지닌 백신 항원 및 단백질들은 기존의 생산 시스템에 비해 많은 장점을 제공한다. 식물 유래 소단위 단백질들은 병원성(기존의 또는 재조합 방식으로 생산된 벡터를 가진 생백신의 특성)으로의 회귀가 불가능하다. 기존의 제조방법으로 생산된 소단위 단백질들은 단백질 불안정성과 생화학적 추출 문제 때문에 생산 및 정제에 어려움이 있을 수 있으며, 글리코실화를 요구하는 소단위 백신 원료들은 원핵세포에서는 글리코실화되지 않는 경향이 있다.

식물들은 단독의 기존 또는 포유동물 유래의 재조합 DNA 기술로부터는 유도하기 어려운 독특한 이점을 제공한다. 종래에는, 소단위 백신이나 단백질 제제들이, 1) 생산을 방해하게 하는 낮은 수율 때문에 재조합 또는 기존의 원료로부터 정제하기 어렵고; 2) 단백분해, pH, 또는 정제공정에서 사용되는 용제 때문에 불안정하고; 3) 그들이 천연 물질이 아니거나, 또는 상기 정제공정이 주요 항원결정부위(epitope)를 분해하기 때문에 덜 효율적이고; 4) 포유동물계(상기 언급하였음)에서 생산될 때에는 생물적 근원의 외래 물질로 인해 방해를 받는다.

생물의약 생산을 위한 "마스터 세포주(Master cell line)" 원리는 제조공정 의 일부로서 생물을 이용하고, 몇가지 기본 원칙에 따른다: 1) 한정된 최초 및 경과 히스토리의 단독 배양은 제한된 특성의 세포 표현형(phenotype)과 원하는 제조 특성을 가지고 보존된다; 2) 보존, 통상적으로 동결보존(cryopreservation)이 장시간 지속된다(수년 이상 지연됨); 3) 세포가 무제한으로 "작업용 균주(working seed)"로 회수(recovery), 팽창(expansion), 계대(passage)될 수 있으며, 또 다른 동결보존 주기로 진행하게 된다 (세포의 강건성(robustness)을 요구하는 원칙); 4) 세포가 한정된 수의 계대 이후 초기 동결상태 이전에 발견된, 제한된 특성을 지닌 세포 표현형과 원하는 제조 특성을 잃지 않는다.

따라서, 당해 기술분야에서는 마스터 균주(master seed) 원리 하에서 장시간 생장, 재-동결보존, 생물제조 표적 구성요소들의 안정성을 제공하는 식물세포와 식물세포배양이 요구되고 있다.

본 발명의 특정 견지에서는 단백질 제제를 암호화하는 트랜스제닉 유전자(transgene)를 발현하기 위해 안정적으로 형질전환된 식물 세포주를 포함하는, 단백질 제제를 생산하는 식물세포배양, 및 상기 식물세포배양의 생장은 지원하지만 미코플라스마타케아이(Mycoplasmataceae)의 생장은 지원하지 않으며 동물 유래 원료물질을 함유하지 않는 생장배지를 제공한다. 상기 식물 세포주는 지속적으로 계대(passage)될 수 있기 때문에 계대 중에 일관된 트랜스제닉 유전자 발현이 유지되고, 동결보존될 수 있기 때문에 동결보존으로부터 회복시에 일관된 트랜스제닉 유전자 발현이 회수된다.

본 발명의 다른 견지에서는 단백질성 백신 또는 치료제를 생산하며, 다음 중 하나 이상의 특성을 지닌 식물세포배양을 제공한다: a) 상기 배양/생장배지 내 동물 원료산물 부재; b) 감지가능한 수준의 식물 2차 대사산물의 부재 (예, 니코틴 대사산물); c) 감지가능한 수준의 마이코플라즈마(mycoplasma), 바이러스, 박테리아, 균류(fungi)의 부재. 따라서, 본 발명에 의해 제공된 상기 식물세포배양은 상기 언급한 특성들 중 어느 하나, 둘, 또는 세 개 모두를 가질 수 있다 (예, 특성 a); 또는 특성 b); 또는 특성 c); 또는 특성 a) 및 특성 b); 또는 특성 a) 및 특성 c); 또는 특성 b) 및 특성 c); 또는 특성 a) 및 특성 b) 및 특성 c)).

또한 본 발명은 안정적으로 형질전환된 식물 기반 백신 생산 시스템을 제공하는데, 상기 시스템은 다음 특성 중 하나 이상을 포함한다: a) 단백질 제제를 발현하고, 영구 저장이 가능하고, 그로부터 모든 다른 균주(seed)와 계대(passage)들이 유도되는 모든 다른 계대원으로서 작용할 수 있는 재조합 식물세포배양 마스터 세포주의 선택 및 확립; b) 작업용 균주(working seed)(상기 마스터 세포주로부터 유도되고 생산 균주를 만드는데 사용되는 저장된 소스) 및 생산 균주(production seed)(식물에서 제조된 단백질 제제의 생산을 개시하기 위해 추가 증식 없이 사용되는 특정범위의 계대 수준에서의 재조합 세포)를 만들어내는 능력; c) 안정적으로 형질전환된 식물세포를 동물 원료 산물(예, 말, 우태 등 포유동물의 혈청)의 부재 하(이용 안함)에 생물반응기에서 키움으로써 생산 가능한 단백질 제제; d) 표피, 근육내, 비강내, 또는 구강 전달을 통한 동물에의 투여에 있어서의 안전함; e) 감지가능한 수준의 식물 이차 대사산물 (예, 아나타빈(anatabine), 아나바신(anabasine), 벤조피렌(benzo(a)pyrene), 니코틴, 노르니코틴(nornicotine)을 포함하는 폴리사이클릭 방향족 탄화수소 및 니트로스아민(nitrosamine))의 부재; f) 마이코플라즈마, 바이러스, 균류, 또는 박테리아의 부재; g) 수년, 바람직하게는 1~10년, 더욱 바람직하게는 1~5년에 이르는 장시간 동안 주변, 냉장 또는 냉동 조건 하에서 동결건조 분말로서 안정적인 단백질 제제 또는 백신 생산; h) 냉장 조건 하에서 여러 달 동안 안정적인 조합된 단백질 제제 (백신) (예, 보강제와 조합된 형태의 백신 항원 또는 단백질 제제); i) 비옥한 식물을 재분화하기 위한 필요성분을 포함한 조건 및 포함하지 않고 수행될 수 있는 공정에서 사용 가능한 시스템; j) 높은 회수율(예, 100%에 이르는 회수율 또는 최소한 90, 91, 92, 93, 94. 95, 96, 97, 98, 99%이거나 그 이상의 회수율)로 해동될 수 있는 마스터 세포주를 제공하는 시스템; k) 동결보존된 마스터 세포주로부터 동결보존된 작업용 균주의 생산 및 회수에 대한 높은 회수율(예, 100%에 이르는 회수율 또는 최소한 90, 91, 92, 93, 94. 95, 96, 97, 98, 99%이거나 그 이상의 회수율) 제공; l) 기존의 백신 조립체(공지의 보강제와 조합된 단백질 제제/백신) 또는 신규 백신 조립체(예, 세포 페이스트)로 제형화되고, 접종된 개체에 혈청학적 전환(serological conversion) 및/또는 질병 보호를 제공하기 위해 투여될 수 있는 단백질 제제 또는 백신 결과물; m) 가축 또는 가금류에 대해 확립된 수준 이하의 2,4-D 내성 수준을 보유한 기존의 또는 신규한 백신 조립체의 제공; n) 상업적 제조공정(예, 셰이크 플라스크(shake flask)에서 10~100,000리터, 바람직하게는 100~1,000, 또는 5,000 또는 10,000리터 규모의 생물배양기에 이르는 용기에서 배양될 수 있는 시스템 혹은 세포) 규모의 가변성; o) 안정적으로 형질전환되는 식물 세포주 생산; 및/또는 p) 마스터 및 작업용 레퍼런스(reference)(그 독성이 숙주 동물(예, 사이토킨(cytokine)의 생물학적 활성 또는 백신 항원의 항원원성(antigenicity)/면역원성(immunogenicity))에 직간접적으로 상호연관된 레퍼런스 물질) 생산 목적으로 사용 가능할 것. 본 발명의 특정 견지에서는 상기 나열된 특성들 전부를 가진, 식물에서 제조되는 백신 생산 시스템을 제공한다.

여기서 사용되는 바와 같이, 이차 대사산물의 "감지할 수 있는 수준의 부재"라 함은 분석되는 물질이 GC/MS 및 LC/MS과 같은 표준 기술로는 감지될 수 없음을 의미하는 것으로 해석되어야 한다. 이들 기술들에 대한 감지 한계는 100ng/ml이다. "마이코플라즈마, 바이러스, 균류, 박테리아의 부재"라 함은 이하 실시예 5에서 설명하는 것과 같은 생물학적 실험에 의해 감지되는 정도의 생물이 존재하지 않음을 의미한다.

가금류에 대한 2,4-D 내성 수준: 조류 질병 바이러스의 예방을 위한 백신투여로부터 얻어지는 2,4-D 조각들의 보수적 추정치는 달걀에 대한 현재 EPA 규정 2,4-D 내성의 미미한 수준인 0.007%이다. 가금류에 대해 2,4-D에 대해 확립된 상기 현재 EPA 내성은 0.05 mg/kg 또는 50 mg /kg이다. 조류 바이러스의 예방을 위한 백신투여로부터 얻어지는 2,4-D 조각들의 보수적 추정치는 가금류 조직에 대한 현재 EPA 규정 2,4-D 내성의 미미한 수준인 0.00079%이다.

"안정적으로 형질전환된", "안정적으로 형질전환된 식물 세포주" 또는 "안정적으로 형질전환된 식물 기반 백신 생산 시스템" 또는 "일관된 트랜스제닉 유전자 발현"은 왕성하게 생장하고, 100회 이상의 계대 동안 생물학적 및 면역학적으로 활성을 가진 항원을 생산하고, 선택적으로, 표현형 생장률, 또는 트랜스제닉 유전자 발현수준에 아무런 중대한 변화를 가져오지 않는 사우던 블랏(Southern blot), PCR, AFLP 등의 유전학적 분석방법에 기초하여 언급된 만큼의 시간과 계대 횟수가 경과해도 불변하여 존재하는 재조합 삽입 (유전학적 이벤트)을 포함하는 식물 세포주 또는 식물 기반 백신 생산 시스템을 제공한다.

본 출원에서 앞서 언급한 식물세포배양은 하등식물, 쌍자엽식물 또는 단자엽식물로부터 유래한 형질전환된 식물 세포주들을 포함할 수 있다. 형질전환된 세포주들을 유도할 수 있는 쌍자엽식물들의 한정되지 않은 예들에는 토마토, 감자, 고구마, 카사바(cassava), 알팔파(alfalfa)와 콩(soybean) 등의 두류(legumes), 당근, 딸기, 양상치(lettuce), 떡갈나무(oak), 단풍나무(maple), 땅콩, 장미, 민트, 해바라기, 홍화(safflower), 목화, 담배, 스쿼시(squash), 데이지(daisy), 카놀라(canola), 또는 선인장이 있다. 본 발명의 특정 견지에서는 NT-1 또는 BY-2와 같은 담배 세포주들을 이용한다. 상기 형질전환된 식물 세포주가 단자엽식물로부터 유도되는 곳에는, 상기 식물 세포주 확립을 위해서 밀, 잔디, 잔디밭, 곡물, 옥수수(maize) 또는 콘(corn), 벼(rice), 귀리(oat), 밀, 보리(barley), 수수(sorghum), 난(orchid), 아이리스, 백합, 양파, 바나나, 사탕수수(sugarcane), 수수, 또는 팜(palm) 등의 식물들이 사용될 수 있다. 부가적으로, 세포주들은 양치류(ferns), 겉씨식물(gymnosperms), 송백류(conifers), 속새류(horsetails), 석송류(club mosses), 우산이끼류(liver warts), 뿔이끼류(hornworts), 이끼류(mosses), 홍조류(red algaes), 갈조류(brown algaes), 포자식물(pteridophytes)의 배우체(gametophytes), 포자체(sporophytes), 또는 녹조류(green algae) 등의 하등식물들로부터 확립될 수 있다. 본 발명에서 이용하기에 바람직한 식물 세포주 집단은 콘(corn), 벼 또는 담배 식물에서 유도된 식물세포배양이다.

단백질 의약 또는 백신 제제들에는 독소, 세포 수용체, 리간드, 바이러스 또는 박테리아 단백질 또는 항원, 신호전달 제제, 사이토카인(cytokine), 또는 트랜스제닉 식물세포배양에서 발현된 기타 치료 단백질이 포함되지만, 이들에만 한정되는 것은 아니다. 이러한 단백질 의약 또는 백신 제제들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열들은 EMBL, SWISSPROT, NCBI 데이터베이스 등 시판 데이터베이스로부터 구할 수 있다. 단백질 제제는 AIV(조류인플루엔자 바이러스(Avian Influenza Virus))의 HA(헤마그글루티닌(hemagglutinin)) 단백질, 타입 1 당단백질; 조류 NDV(뉴캐슬 질병 바이러스(Newcastle Disease Virus)의 HN(헤마그글루티닌(hemagglutinin)/뉴라미니다아제(neuraminidase)) 단백질, 타입 2 당단백질, (미국특허번호 제5,310,678호 참조, 여기서 병합 참조되어 있음); 전염성 낭병 바이러스(infectious bursa disease virus (IBDV))의 구조 단백질, VP2; ADP 리보스 전달효소(대장균 이열성 독소(heat labile toxin)의 LT-A 소단위); 두 개의 소단위로 만들어진 대장균의 박테리아 독소 LT, 독감 바이러스(human rhinovirus (HRV)), A형 간염 바이러스(hepatitis A virus (HAV)), 면역결핍성 바이러스(immunodeficiency virus (HIV)), 사람 유두종 바이러스(human papillomavirus (HPV)), 단순포진 바이러스(herpes simplex virus (HSV)), 구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus (FMDV)) 등의 피코르나바이러스(picornaviruses), 뎅기(Dengue)와 웨스트나일(West Nile) 바이러스 등의 플라비바이러스(flaviviruses) 및 호흡기 합포체 바이러스(respiratory syncytial virus (RSV))를 포함하지만 이들에만 제한되는 것은 아닌 사람 바이러스를 포함하는 특정 병원성 바이러스로부터의 하나 이상의 단백질 (항원)일 수 있다. 트랜스제닉 식물세포배양에서 생산되는 전형적인 단백질 제제들은 기능적 또는 구조적 활성에 있어서 천연물에서 분리된 동일 단백질들과 동등하다. 바이러스 항원에 대한 한정되지 않은 예시들이 또한 이하 서열목록번호: 1, 2, 3, 4, 11, 12에 나타나 있다.

접종(vaccination) 및 접종행위(vaccinating)는 숙주를 단백질 제제가 포함된 면역 제제로 접종하는 것에 의해 숙주 면역 체계가 자극받고, 연이은 병원균 노출에 대한 숙주의 반응과 연관된 일련의 원하지 않는 병리현상을 예방하거나 감소시킴으로써, 병원균에 대한 예방을 제공하거나 혈청전환(예, 항체 생산)을 유발하는 수단으로 정의된다.

백신은 인간을 포함한 동물을 접종하는 데 사용되는 조성물로서, 상기 숙주면역체계의 자극을 유발하고, 연이은 병원균 면역보호 항원 물질의 노출에 대한 숙주의 반응과 연관된 일련의 원하지 않는 병리현상을 예방하거나 감소시키는 최소한 하나의 단백질 제제를 포함하고 있다.

병원성 생물은 그것이 감염시킨 동물이나 숙주 내에서 질병을 일으키거나, 유발/제어된 생리 환경을 일으키는 박테리아, 바이러스, 균류, 원생동물이다.

본 발명의 목적상, 보강제(adjuvant)는 면역원이나 항원에 대한 상기 면역 반응을 가속화, 증가, 완화(moderate), 또는 강화하는 물질이다. 통상적으로 보강제들은 체액성 및 세포성 면역반응 모두를 강화시키지만, 보강제를 제한할 만한 다른 특성들이 없는 상태에서는 둘 다에 대해 증가된 반응을 강화한다. 더욱이, 보강제들과 그들의 용도는 면역학자들에게는 주지하며, 면역원의 투입이 제한될 때, 상기 면역원이 면역기능이 약할 때, 또는 투여경로가 준-최적일 때에, 상기 면역 반응을 강화하기 위해 일반적으로 채용된다. 따라서, "보강제 양"이라 함은 주어진 면역원이나 항원에 대한 상기 면역 반응을 강화할 수 있는 보강제의 양을 말한다. '보강제 양'과 동등한 양이 변하게 될 것이며, 면역원의 특성, 투여된 면역원의 양, 숙주 종류, 투여 경로, 및 면역원 투여 방법을 포함하지만 이들에만 제한되는 것은 아닌 다양한 요인에 따라 변하게 된다. "보강제 양"은 특정 환경이 주어진 통상적인 실험에 의해 용이하게 정량화가 가능하다. 이는 당해 분야 통상의 기술을 가진 자에게 주지하며, 투여된 면역원과 보강제의 변화하는 양에 대해 보통 수준의 투약 반응 결정을 이용하는 것을 채택한다. 반응은 효소결합면역측정법(enzyme linked immunosorbant assay(ELISA)), 방사면역측정법(radio immune assay), 혈구응집법(hemagglutination assay) 등을 이용하여, 혈청 항체 역가(serum antibody titer) 또는 면역원에 의해 제기된 세포매개성 반응을 결정함으로써 측정된다.

효과적인 투여량은, 사람이나 동물이 병원성 제제로 인해 유발된 위험에 효과적으로 저항하거나, 당뇨병에 대한 자가면역 항원 등 동물의 생리적 필요에 반응하기 위해 충분한 만큼의 사람 또는 동물 내 면역반응을 유발하기 위해 필요한 양이다. 상기 사람이나 동물에 투여된 양은 특정 면역보호 입자라든지 입자들의 조합, 상기 사람이나 동물의 상태, 선택된 투여경로를 포함한 관련 환경의 측면에서 의사, 수의사, 또는 숙련된 과학자에 의해 결정될 것이다. 일반적으로, 효과적인 투여량은 1 ng 내지 약 0.5 mg이며, 바람직하게는 약 1 ug 내지 약 50 ug에 이른다. 가금류에서 뉴캐슬 질병 바이러스(HN 항원)에 대한 효과적인 투여량은 약 0.5 ug 내지 약 50 ug, 바람직하게는 SQ 경로를 통한 약 2.5 ug 내지 약 5 ug이다. 가금류에서 HN에 대한 효과적인 양은 약 0.5 ug 내지 약 50 ug, 바람직하게는 약 5 ug 내지 약 25 ug, 더욱 바람직하게는 IN/안구 점막 경로를 통한 약 10 ug 내지 약 12 ug이다. 조류인플루엔자 바이러스 (HA 항원)에 대한 효과적인 양은 약 0.5 ug 내지 약 50 ug, 바람직하게는 약 1 ug 내지 약 30 ug, 더욱 바람직하게는 IN/안구 점막 경로를 통한 약 24 ug 내지 약 26 ug이고, SQ 경로를 통한 약 1 ug 내지 약 5 ug이 바람직하다. 가금류에서 전염성 낭증 바이러스 (VP2 항원)에 대한 효과적인 양은 약 0.5 ug 내지 약 50 ug, 바람직하게는 약 5 ug 내지 약 25 ug, 더욱 바람직하게는 SQ 경로를 통한 약 5 ug 내지 약 20 ug이다. LT 항원에 대한 효과적인 구강 투여량은 약 50 ug 내지 약 250 ug, 바람직하게는 약 100 ug 내지 약 200 ug이다. LT 항원에 대한 효과적인 SQ 또는 IN/안구 투여량은 약 50 ug 내지 약 100 ug, 바람직하게는 약 1 ug 내지 약 50 ug, 더욱 바람직하게는 약 2 ug 내지 약 10 ug이다. 상기에서 제시된 상기 투여량은 어떠한 방식으로든지 본 발명의 범위를 제한하기 위한 의도는 아니며, 기술 실무자들을 위한 일반 지침으로서 제시되는 것이다.

트랜스제닉 식물(transgenic plant)은 식물세포배양, 식물 세포주, 식물조직배양, 하등식물, 단자엽식물 세포배양, 쌍자엽식물 세포배양, 또는 형질전환 식물세포나 원형질체에서 유도된 그 자손으로 정의되는데, 여기서 상기 형질전환 식물의 게놈은 실험실 기술로 도입되었으며 자생, 동일 종의 비-형질전환 식물세포에서는 원래 존재하지 않는 외래 DNA를 포함한다. "트랜스제닉 식물"과 "형질전환 식물"이라 함은 당업계에서는 DNA가 외래 DNA 분자를 포함하는 식물을 한정하는 동의어로 종종 사용되어져 왔다.

식물 형질전환 또는 형질전환된 식물세포배양용 유전자 카세트(gene cassette)의 구성은 샘브룩(Sambrook) 외(1989); 및 어스벨(Ausubel) 외(1987) 분자생물학에 있어서 현존하는 프로토콜( Current Protocols in Molecular Biology ), John Wiley 및 Sons, New York, NY에 개시된 기법들과 같은 주지의 기법을 활용하여 용이하게 이루어질 수 있다. 본 발명은 또한 면역보호 항원 또는 단백질 제제를 암호화하는 개시된 서열과 실질적 서열 상동성을 갖는 DNA 서열을 포함하고 있어서, 발현에 있어서 개시된 것과 같은 효과를 가질 수 있다. 본 출원에서 사용되는 것처럼, "실질적 서열 상동성"이라 함은 뉴클레오티드 서열(DNA 또는 RNA 경우) 또는 아미노산 서열(단백질 또는 폴리펩티드 경우)이 다른 뉴클레오티드나 아미노산 서열과 실질적, 기능성, 구조적 동질성을 보여준다는 사실을 나타내기 위해 사용된다. 실질적 서열 동질성을 갖는 서열들 간의 기능적 또는 구조적 차이는 미미할 것이다; 즉 그들은 본 출원에서 언급한 것과 같이 작용하는 서열의 능력에 영향을 미치지 않을 것이다. 여기서 개시된 서열들과 실질적 서열 상동성을 갖는 서열들은 대개 돌연변이와 같은 상기 개시된 서열의 변형이며, 반면 합성 서열 또한 가능하다.

대부분의 경우에, 여기서 특정적으로 개시된 서열들과 95% 상동성을 갖는 서열들은 동등하게 작용할 것이며, 대부분의 경우에 보다 낮은 상동성, 예를 들어 75% 또는 80%,을 갖는 서열들이 수용 가능할 것이다. 이들 서열들의 부분들에 대한 위치를 정하는 것은 시간이 소요되는 일이지만, 당업계에서는 일상적이고 주지하다. 올리고뉴클레오티드 서열을 변형하는 기술들의 예시에는 폴리뉴클레오티드 매개, 자리 지정 돌연변이(site-directed mutagenesis)를 이용하는 것이 포함된다. Zoller 외(1984); Higuchi 외(1988); Ho 외(1989); Horton 외(1989); 및 PCR 기술: DNA 증폭의 원리와 적용( Technology : Principles and Applications for DNA Amplification), (ed.) Erlich (1989)를 참조한다.

본 발명에 유용한 구성을 준비함에 있어서, 적절한 방향성(orientation)을 가지며 적절한 해독 프레임(reading frame)을 갖는 DNA 서열을 제공할 수 있도록, 다양한 DNA 절편이 조작될 수 있다. 상기 DNA 절편들을 연결하기 위해서 어댑터(adapter) 또는 링커(linker)들이 채택되거나, 편리한 제한 자리, 과잉 DNA의 제거, 제한 자리의 제거 등을 제공하기 위한 다른 조작기술들이 이용될 수도 있다.

상기 다양한 단계들을 실행함에 있어서, 뒤에 이어지는 표적 숙주 세포들 속으로 도입시키기 위해 특정 프로모터/유전자를 함유한 벡터를 증폭시킬 수 있기 위해서는 클로닝이 이용된다. 광범위한 클로닝 벡터들이 이용될 수 있는데, 상기 클로닝 벡터에는 대장균에서 작용하는 복제 시스템과, 상기 형질전환된 세포들의 선별을 가능하게 하는 마커(marker)가 포함된다. 예시적인 벡터들에는 pBR322, pUC 시리즈, pACYC184, 블루스크립트(Bluescript) 시리즈 (스트라타진(Stratagene))가 포함된다. 따라서, 상기 서열은 적당한 제한 자리에서 벡터 내로 삽입되고, 그 결과물인 플라스미드는 상기 대장균 숙주(예, 대장균 균주 HB101, JM101, DH5a)를 형질전환시키기 위해 사용되고, 상기 대장균은 적당한 영양배지에서 생장되고, 세포들은 채취(harvest), 용리(lyse)되고, 상기 플라스미드는 회수된다. 분석은 서열분석, 제한자리 분석, 전기영동 등이 관여한다. 각각의 조작 이후, 최종 구성에 사용될 상기 DNA 서열은 제한되고 다음 서열에 연결되는데, 상기 구성의 부분들 각각은 동일하거나 상이한 플라스미드 내에서 클로닝될 수 있다.

벡터들은 식물세포 형질전환을 위해 구입가능하거나 용이 제조 가능하다. 일반적으로, 플라스미드 또는 바이러스 벡터들은 주어진 숙주 내에서 이성 DNA(heterologous DNA) 서열의 유지와 발현에 필요한 DNA 조절 서열(DNA control sequence)들 전부를 가지고 있어야 한다. 상기 조절 서열들은 일반적으로 선도서열(leader sequence)과 번역 개시-신호 코돈, 번역 종결 코돈을 코딩하는 DNA 서열,및 전령RNA(mRNA) 가공을 조절하는 3' UTR 신호 코딩 DNA 서열을 포함한다. 어떠한 특정 종에서 발현을 최적화하기 위해 적절한 요소들을 선별하는 것은 본 출원의 교시를 활용하는 업계 통상의 기술 영역에 해당한다. 마지막으로, 벡터들은, 벡터를 갖는 숙주세포들의 식별이 가능하도록 표현형 특성을 제공할 수 있는 마커 유전자를 가지는 것이 바람직하다.

식물세포 내로 삽입된 외래 코딩 서열(예, 면역보호 제제 또는 단백질 제제)의 활성은 삽입체에 접하고 있는 내생 식물 DNA의 영향에 의해 결정된다. 일반적으로, 이형 유전자들의 삽입은 형질전환 기술을 이용하여 무작위적인 것으로 보인다; 하지만, 그 기술은 현재 식물세포 내로 DNA의 위치 특정 재조합을 지닌 식물을 생산하기 위한 것으로 존재한다 (WO 91/09957 참조). 프로모터의 조절 하에 원하는 서열 또는 서열들의 발현에 이르게 하는 하나 또는 조합된 기법들이 채택 가능하다.

여기서 제공된 식물세포배양은 식물세포 형질전환을 위한 어떠한 특정 기술에든지 한정되지 않는다. DNA를 식물세포 내로 도입하는 기술은 당업계 기술자들에게는 주지한 사실이다. 외래 DNA를 식물세포 내로 전달하는 네 개의 기초 기술들이 지금까지 설명된 바 있다. 화학적 기술 (Graham 및 van der Eb, Virology, 54(02):536-539, 1973; Zatloukal, Wagner, Cotten, Phillips, Plank, Steinlein, Curiel, Birnstiel, Ann . N.Y. Acad . Sci ., 660:136-153, 1992); 미세주입(microinjection)을 포함한 물리적 기술 (Capecchi, Cell, 22(2):479-488, 1980), 전기천공법(electroporation) (Wong 및 Neumann, Biochim . Biophys . Res . Commun. 107(2):584-587, 1982; Fromm, Taylor, Walbot, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 82(17):5824-5828,1985; U.S. Pat. No. 5,384,253) 및 유전자총(gene gun) (Johnston 및 Tang, Methods Cell . Biol ., 43(A):353-365, 1994; Fynan, Webster, Fuller, Haynes, Santoro, Robinson, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90(24):11478-11482, 1993); 바이러스 기술 (Clapp, Clin . Perinatol ., 20(1):155-168, 1993; Lu, Xiao, Clapp, Li, Broxmeyer, J. Exp . Med . 178(6):2089-2096, 1993; Eglitis 및 Anderson, Biotechniques, 6(7):608-614, 1988; Eglitis, Kantoff, Kohn, Karson, Moen, Lothrop, Blaese, Anderson, Avd . Exp . Med . Biol ., 241:19-27, 1988); 및 수용체 매개 기술 (Curiel, Agarwal, Wagner, Cotten, Proc . Natl . Acad. Sci . USA, 88(19):8850-8854, 1991; Curiel, Wagner, Cotten, Birnstiel, Agarwal, Li, Loechel, Hu, Hum . Gen . Ther ., 3(2):147-154, 1992; Wagner 외, Proc. Natl . Acad . Sci . USA, 89 (13):6099-6103, 1992).

전기천공법에 의해 DNA를 식물세포 내로 도입하는 것은 당업계에 주지하다. 미처리된 세포들에 비해 전기천공에 의한 형질전환에 대해 더욱 감수성이 있는 수혜세포(recipient cell)들을 제공하기 위해서 펙틴 분해효소와 같은 식물 세포벽 분해효소들이 사용된다. 전기천공에 의한 형질전환을 유효하게 하기 위해서는 세포 현탁배양과 같은 무른 조직, 또는 배아 캘러스(callus), 또는 미성숙 배아나 기타 기관 조직을 직접 채용할 수도 있다. 일반적으로 펙틴 분해효소라든지 제어된 방식으로 기계적 상처로 표적 식물체의 세포벽을 부분적으로 분해하는 것이 필요하다. 이렇게 처리된 식물체는 전기천공에 의해 외래 DNA를 받아들일 준비가 된다.

외래 형질전환 DNA를 식물세포 내에 전달하기 위한 또 다른 방법은 미세사출 총(microprojectile bombardment) 기법이다. 이 기법에서는, 미세입자들이 외래 DNA로 입혀지고, 추진력(propelling force)에 의해 세포 속으로 전달된다. 상기 미세입자들은 통상적으로 텅스텐, 금, 플라티늄, 및 유사 금속들로 만들어진다. 미세사출 총 기법의 장점은 원형질의 분리(Cristou 외, 1988, Plant Physiol ., 87:671-674,) 나, 아그로박테리아 감염에 대한 민감도가 필요하지 않다는 데 있다. DNA를 가속화에 의해 옥수수(maize) 세포 속으로 전달하는 방법에 대한 일 실시예는 바이오리스틱스 입자전달 시스템(Biolistics Particle Delivery System)인데, 이것은 DNA로 입혀진 입자들 또는 세포들을 현탁액 내 배양된 콘 세포로 입혀진 여과면 위로 스크린을 통해 추진시키기 위해서 이용될 수 있다. 상기 스크린은 상기 입자들을 분산시켜서 커다란 덩어리 상태로 수혜세포(recipient cell)들에 전달되지 않도록 한다. 상기 사출을 위해, 바람직하게 현탁액 내 세포들은 여과재나 고체 배양배지 상에 밀집하게 된다. 선택적으로, 미성숙 배아 또는 기타 표적 세포들이 고체 배양배지 상에 배열될 수도 있다. 사출 대상 세포들은 상기 미세주입 정지판(microprojectile stopping plate) 아래에 적당한 거리에 위치한다. 사출 형질전환에서는, 최대수의 안정한 형질전환체를 수득하기 위해 사출 전 배양(prebombardment culturing) 조건 및 사출 파라미터들을 최적화할 수 있다. 사출을 위해서는 물리적 및 생물학적 파라미터들이 당해 기법에서 중요하다. 물리적 요인들은 상기 DNA/미세주입 침전물을 조작하는 데에 관여하는 것들 또는 상기 미세주입체들의 비행(flight) 및 속도(velocity)에 영향을 미치는 것들이다. 생물학적 요인들에는 사출 이전과 직후의 세포 조작, 사출과 관련된 장애를 제거하도록 도와주는 표적세포들의 삼투압 조절, 및 선상 DNA 또는 과다코일형 플라스미드와 같은 형질전환 DNA의 성질 조작에 관여하는 모든 단계가 포함된다.

아그로박테리아 매개 전달은 외래 DNA를 식물세포 내로 도입함에 있어서 널리 적용가능한 시스템인데, 원형질로부터 건전 식물(intact plant)을 재생시킬 필요성 없이 상기 DNA가 전체 식물 조직 내로 도입될 수 있기 때문이다. DNA를 식물세포 내로 도입하기 위한, 아그로박테리아 매개 식물 삽입 벡터의 이용은 당업계에 주지한 사실이다. 예를 들면 프랠리(Fraley) 외, 1985, Biotechnology, 3:629; 로저스(Rogers) 외, 1987, Meth . in Enzymol ., 153:253-277에 기술된 방법들을 참고한다. 더욱이, Ti-DNA의 삽입은 재배열을 거의 형성하지 않는, 상대적으로 정교한 공정이다. 전달 대상 DNA의 영역은 경계 서열들에 의해 결정되며, 삽입 DNA는 일반적으로 스필만(Spielmann) 외, 1986, Mol . Gen . Genet ., 205:34; 요르겐슨(Jorgensen) 외, 1987, Mol . Gen . Genet ., 207:471에 기술된 바와 같이 식물 게놈 내로 삽입된다.

현대적인 아그로박테리아 형질전환 벡터들은 평이한 조작을 가능하게 하면서, 아그로박테리아 뿐만 아니라 대장균 내에서 복제가 가능하다. 아울러, 최근의 아그로박테리아 매개 유전자 전달을 위한 벡터 분야의 기술 진보로 인해, 다양한 단백질과 폴리펩티드를 발현할 수 있는 벡터의 구성을 실현하기 위한, 상기 벡터 내 유전자 배열과 제한자리들이 입증되었다. 삽입된 폴리펩티드 코딩 유전자의 직접 발현을 위해서 프로모터와 아데닐중합화 자리에 의해 측면 위치한 편리한 복합-링커 영역들이 목적 달성을 위해 적합하다. 추가적으로, 무장되었거나 무장되지 않은 Ti 유전자 모두를 함유하는 아그로박테리아가 상기 형질전환에 사용될 수 있다.

식물 원형질의 형질전환은 염화칼슘 침전, 폴리에틸렌 글리콜 처리, 전기천공, 이들 처리법들을 조합하여 이루어질 수 있다(예, Potrykus 외, 1985, Mol . Gen. Genet ., 199:183; Marcotte 외, Nature, 335:454, 1988 참고). 이들 시스템들을 다양한 식물종에 적용하는 것은 특정 종들을 원형질로부터 재생시키는 능력에 좌우된다.

본 발명의 실시를 위해서는, 신속하게 배양되고 증식될 수 있는 식물 세포주들을 형질전환시키는 것이 바람직하다. 식물 세포배양의 이용은 개방형 생산이 일어나지 않게 하며, 유전자 탈출 및 식량 오염 가능성을 상당부분 감소시킨다. NT-1 및 BY-2 (Kato 외 1972, Proc. IV IFS: Ferment. Technol. Today 689-695; An, G., 1985 Plant Physiol . 79, 568-570; Nagata 외 1992, International Review of Cytology 132, 1-30.) 등의 담배 현탁 세포배양들이 선호되는데, 왜냐하면 이들 세포주들이 특히 배양 내 조작에 민감하고, 쉽게 형질전환되고, 안정적으로 결집된 이벤트들을 형성하고, 동결보존이 용이하기 때문이다. 상기 담배 현탁 세포주, NT-1,가 본 발명을 실시하기 위해 적합하다. NT-1 세포들은 원래 니코티아나 타바쿰 엘.시브이.(Nicotiana tabacum L.cv.) 밝은노랑 2에서 개발되었다. 상기 NT-1 세포주는 널리 사용되고 쉽게 수득 가능하다; 비록, 어떠한 담배 현탁 세포주든지 본 발명 실행과 맞아떨어지긴 하더라도 말이다. 게다가, 상기 세포주는 변할 수 있고, 배양조건에 따라 변할 것이다. 하기 실시예들에서 이용하기에 적합한 NT-1 세포들은 미국 표준균주은행(American Type Culture Collection)으로부터 ATCC No. 74840로 구입가능하다. 또한 본 출원에 병합참조되어 있는 미국특허 제6,140,075를 참조한다.

많은 식물세포배양 기술과 실험실 규모 셰이커 플라스크에서 수천 리터 생물반응기에 이르는 시스템들이 설명되어 왔고, 식물세포배양 분야에 주지되어 있다. 예를 들면, 피셔(Fischer), R. 외, 1999 Biotechnol . Appl . Biochem . 30, 109-112 및 도란(Doran), P., 2000 Current Opinions in Biotechnology 11, 199-204를 참조한다. 형질전환된 식물세포들은 원하는 양으로 배양된 후에, 재배되고, 부드럽게 세척되고, 파열을 위해 적당한 완충액 속에 놓이게 된다. 많은 다양한 완충액들이 본 발명과 양립 가능하다. 일반적으로 상기 완충액은 중성 pH 또는 그 근처의 등장 완충염 수용액으로서, 세포막을 용해시키는 데 사용될 수 있는 거친 세제를 함유하지 않는다. 선호되는 완충액에는 둘베코(Dulbecco)의 인산염 완충액과 1mM EDTA를 포함하는 PBS가 포함된다.

안정적으로 형질전환된 식물세포주를 준비하고 나면, 본 발명의 배양은 전체 유전자 삽입의 PCR 증폭과 이어지는 제한효소 소화를 이용하여 유전자 삽입(유전적 이벤트)을 확인하는 것에 의해 완료된다. 마스터 세포주와 작업용 세포주들은 이후 9 CFR 113.26에 나타난 공정에 따라 박테리아와 균류 오염을 위해 평가되어야 한다.

마스터 또는 작업용 세포들의 초기 회수는 캘러스(callus) 형태의 한천 평판 상에서 가능하다. 이는 이어서 액체 현탁배양으로 전달된다. 작업용 세포와 생산 배양을 위한 계대 범위는 1 내지 50 또는 100회에 이른다.

동물 유래 성분들은 본 발명의 상기 식물세포배양을 생장시키기 위해 전혀 사용되지 않는다. 한천 평판과 현탁배양용 배지들은 일반적인 식물배양 배지(Murashige 와 Skoog; MS) 를 기반으로 하며, 여기에 상세히 설명되어 있다. 마스터 세포주들은 액체 질소의 증기상(vapor phase)에 보관된다. 이러한 방식으로 보존된 배양들은 영구 보관이 가능하며, 한천 배지 상에 캘러스 배양을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 작업용 세포주들은 액체 질소의 증기상에 보관되고, 영구 보관이 가능하며, 캘러스 배양을 제조하기 위해 사용될 수 있다.

작업용 세포 또는 백신 생산을 위한 접종물(inoculums)로서 사용되는 마스터 세포 및 작업용 세포 배양들은 한천 평판 상의 캘러스의 주기적인 순환에 의해 보존되거나 현탁배양으로서 생장될 수 있다. 냉동 마스터 세포 또는 작업용 세포들은 해동되고 한천 평판으로 전달(pass)되고, 25℃에서 약 1 내지 2주 동안 1회 이상 배양될 수 있다. 이후 작업용 세포나 생산 배양을 제조할 목적으로, 상기 캘러스는 별도 분리되고, 액체 현탁배지의 플라스크를 접종하기 위해 사용된다. 작업용 세포배양들은 실온에서 지속적인 교반으로 생장된 생산배양에 대한 접종물로 사용되고, 액체 현탁배지에 전달된다. 배양들은 관찰된 생장 정도에 따라서 약 3-17일 마다 전달되고, 매 전달마다 1:3 또는 1:10로 분할(split)될 수 있다.

마스터 세포 한천 평판으로부터 작업용 세포주를 생산하기 위해서, 건강한 캘러스(callus)가 선별되고, 무균 상태로 별도 분리되고, 액체 현탁배지를 함유하는 플라스크 내에 놓여지게 된다. 또한 작업용 세포주들은 셰이커 플라스크 내 부피가 1 리터에 도달할 때까지 배양의 부피를 증가시키면서 액체배지에서 액체배지로 1:3 또는 1:10 분할을 이용하여 전달될 수도 있다. 1 내지 3 리터의 셰이커 플라스크 배양은 접종으로 10 리터 교반 탱크에 옮겨진다. 생산 배양들은 100 리터 작업 부피를 가진 교반 탱크에서 생산된다. 100 리터 발효기가 1:10 배양 비율로 교반 탱크 내지 다중 셰이커 플라스크 배양으로부터 접종될 수도 있다. 10 리터 이상의 교반 탱크 내의 배양들은 선별제(selection agent) 없이 액체 현탁배지 내에서 생장한다.

상기 배양들은 지속적으로 교반하면서 주변온도 환경에서 상기 작업용 세포배양의 경우 3-14 일 동안 생장한다. 대부분의 경우에 상기 작업용 세포배양들은 7일 마다 1:10 분할되면서 통과된다(pass). 상기 작업용 세포들의 대규모화(scale-up) 중에, 상기 배양들은 1:10 분할로 통과되고, 적어도 7일 동안 생장된다. 상기 생산 배양들은 채취되기 전에 7-15일 간 생장된다. 배양들은 매일 특징적 생장에 대해 관찰되고, 생산 배양들의 시료들은 현미경 실험과 농축 세포 용적 결정을 위해 무균 상태에서 주기적으로 제거된다. 외관 측정을 기초로, 채취 시점에, 세포들은 약 35% 농축 세포 용적 (PCV)까지 농도가 증가하고, 적어도 50% 건강한 생균 세포를 포함해야 한다. 세포들의 현미경 실험은 세포 내 핵을 식별 가능하게 밝혀내야 하지만, 다른 세포내 구조물들은 관찰 가능하지 않아야 한다.

통기 방법은 상기 배양의 산소 요구량에 따라 달라진다. 용존 산소는 약 100% 내지 20% 사이에서 조절되어야 한다. 교반 속도는 상기 산소 요구량에 따라 달라질 수 있지만, 500 rpm을 초과해선 안된다. pH 조절은 일반적으로 필요하지 않다. 생산 배양들은 접종 후 7 및 15 일 사이에서 기존의 여과 배지를 사용하여 중력 또는 진공 여과에 의해 채취될 수 있다. 이후 약학적 단백질 물질을 분리하기 위해서 통상적인 단백질 정제 공정이 채용될 수도 있다.

여기서 인용된 모든 특허, 특허출원, 가특허출원, 공개공보는 모든 도면, 표를 포함한 그 전체로서 본 발명의 설명 교시와 불일치하지 않는 범위까지 참고자료로 병합되어 있다.

하기에는 본 발명을 실행하기 위한 공정들을 설명하는 실시예들이 있다. 이들 실시예들은 발명을 제한하기 위한 것이어서는 안된다. 달리 표기되지 않으면 모든 백분율들은 중량에 관한 것이고, 모든 용제 혼합비율은 용적에 관한 것이다.

도 1A 및 1B (서열목록번호:1 및 2)는 NDV 균주 "라소타"의 HN 유전자의 식물 최적화 암호화 서열 및 단백질 서열이다.

도 2는 구성요소 CsVMV(카사바 정맥 모자이크 바이러스) 프로모터에 의해 구동되고 MAS 3'(마노핀 합성효소) 요소에 의해 종결되는 식물 선택성 마커 PAT (포스피노트리신 아세틸 전이효소), 식물 게놈 속으로 삽입되는 DNA의 경계를 묘사하는 아그로박테리아로부터의 LB와 RB (좌, 우 T-DNA 경계) 요소를 포함하는 pBBV-PHAS-iaaH의 맵이다.

도 3은 면역보호 항원을 발현하기 위한 다양한 식물 발현벡터를 위해 개시 플라스미드로 사용되는 "템플릿 벡터"인 pC!H의 맵이다.

도 4는 NDV HN 단백질을 위한 pCHN 발현벡터의 맵이다. HN 발현벡터 또는 카세트는 구성요소 CsVMV 프로모터에 의해 구동되고 콩 vspB 3' 요소에 의해 종결된다.

도 5는 NDV HN 단백질을 위한 pgHN 발현벡터의 맵이다. HN 발현 카세트는 TEV 5' UTR을 지닌 tuber-특이성 GBSS 프로모터에 의해 구동되고 콩 vspB 3' 요소에 의해 종결된다.

도 6은 NDV HN 단백질을 위한 pgHN151 발현벡터의 맵이다. HN 발현 카세트는 천연 5' UTR과 인트론을 지닌 tuber-특이성 GBSS 프로모터에 의해 구동되고 콩 vspB 3' 요소에 의해 종결된다. 상기 벡터는 CsVMV 프로모터에 의해 구동되고 MAS 3'(마노핀 합성효소) 요소에 의해 종결되는 식물 선택성 마커 PAT, 식물 게놈 속으로 삽입되는 DNA의 경계를 묘사하는 LB와 RB, 좌 우 T-DNA 경계 요소,를 포함하는 pBBV-PHAS-iaaH으로부터 유도된다.

도 7은 NDV HN 단백질을 위한 pgHN153 발현벡터의 맵이다. HN 발현 카세트는 천연 5' UTR과 인트론을 지닌 tuber-특이성 GBSS 프로모터에 의해 구동되고 콩 파세올린(phaseolin) 3' 요소에 의해 종결된다. 상기 벡터는 CsVMV 프로모터에 의해 구동되고 MAS 3'(마노핀 합성효소) 요소에 의해 종결되는 식물 선택성 마커 PAT, 식물 게놈 속으로 삽입되는 DNA의 경계를 묘사하는 LB와 RB, 좌 우 T-DNA 경계 요소,를 포함하는 pBBV-PHAS-iaaH으로부터 유도된다.

도 8은 NDV HN 단백질을 위한 pMHN 발현벡터의 맵이다. HN 발현 카세트는 구성요소 4OCSDMAS 프로모터 (P2 방향)에 의해 구동되고 콩 vspB 3' 요소에 의해 종결된다. 상기 벡터는 CsVMV 프로모터에 의해 구동되고 MAS 3'(마노핀 합성효소) 요소에 의해 종결되는 식물 선택성 마커 PAT, 식물 게놈 속으로 삽입되는 DNA의 경계를 묘사하는 LB와 RB, 좌 우 T-DNA 경계 요소,를 포함하는 pBBV-PHAS-iaaH으로부터 유도된다.

도 9는 AIV A / turkey / Wisconsin / 68 (H5N9)의 HA 유전자를 위한 pCHA 발현벡터의 맵이다.

도 10 (서열목록번호:3 및 4)은 AIV A / turkey / Wisconsin / 68 (H5N9)의 HA 유전자의 DNA 서열 및 단백질 서열이다.

도 11은 pGLTB 중간 벡터의 맵이다.

도 12는 pCLT105 중간 벡터의 맵이다.

도 13은 VP2를 암호화하는 이중 벡터 pDAB2423이다.

도 14 (서열목록번호:10)는 IBDV 전염성 낭증 바이러스, 맹독성 균주 Ehime 91의 VP2 유전자의 DNA 서열이다.

서열목록의 요약

도 1A 및 1B에 나타난 서열목록번호:1 및 2는 NDV 균주 "라소타"의 HN 유전자의 식물 최적화 암호화 서열 및 단백질 서열이다.

도 10에 나타난 서열목록번호:3 및 4는 AIV A / turkey / Wisconsin / 68 (H5N9)의 HA 유전자의 DNA 서열 및 단백질 서열이다.

서열목록번호:5는 pCP!H 상의 CsVMV 프로모터 끝단을 재단하는 데에 사용되는 PCR 프라이머이다.

서열목록번호:6은 pCP!H 상의 CsVMV 프로모터 끝단을 재단하는 데에 사용되는 PCR 프라이머이다.

서열목록번호:7은 Nco I 자리를 생성하는 데에 사용되는 돌연변이 프라이머이다.

서열목록번호:8은 5' 영역에 상보적인 순방향 프라이머이다.

서열목록번호:9는 Xho I 자리를 생성하는 데에 사용되는 돌연변이 프라이머이다.

도 14에 나타난 서열목록번호:10은 IBDV 전염성 낭증 바이러스의 VP2 유전자의 DNA 서열이다.

서열목록번호:11은 E/91 VP2 (1425 염기)의 변형을 암호화하는 식물 최적화 DNA 서열이다. E/91 식물 최적화 VP2를 위한 상기 암호화 영역은 염기 16 내지 1383 (1371 염기)를 포함한다. 염기 1384 내지 1425 에서 6개의 프레임 정지부위가 발견된다.

서열목록번호:12는 E/91 VP2 암호화 영역 (서열목록번호:11)의 식물 최적화 버전에 의해 암호화된 E/91 VP2 단백질의 서열을 포함한다.

서열목록번호:13은 6개의 프레임 내의 번역 종결("정지") 코돈을 암호화하는 DNA 서열이다. 상기 서열은 형질전환 중에 DNA 삽입에 이은 비의도성 개방형 프레임의 번역을 종결시키기 위해 사용되었으며, Sac I BstE II, 및 Bgl II 제한효소 인식자리 (Tsukamoto K., Kojima, C., Komori, Y., Tanimura, N., Mase, M., and Yamaguchi, S. (1999) IBDV VP2 발현 재조합 MDV를 가진 맹독성 전염성 낭증 바이러스(IBDV)와 Marek 질병 바이러스(MDV)로부터의 닭의 보호. Virol. 257: 352-362.)를 포함한다.

실시예 1: 벡터

유전자 구성: NDV 균주 "라소타(Lasota)" (유전자은행 등록번호 (Genbank accession) AF077761)의 HN 유전자, AIV 균주 ATurkey/Wisconsin/68의 HV 유전자, IBDV 균주 E19 (GenBank accession number X00493)의 VP2 유전자, 및 대장균의 LT 유전자의 암호화 서열이 코돈 사용, 및 가(spurious) mRNA 가공 및 불안정성을 매개할 수 있는, 원하지 않는 서열 모티프(motif)의 존재 , 또는 게놈 DNA의 메틸화를 위해 분해되었다. Adang MJ, Brody MS, Cardineau G, Eagan N, Roush RT, Shewmaker CK, Jones A, Oakes JV, McBride KE (1993) The construction and expression of Bacillus thuringiensis cryIIIA gene in protoplasts and potato plants. Plant Mol Biol 21:1131-1145를 참조한다. 식물-최적화 암호화 서열은 하이브리드 코돈 선호 반영 토마토와 감자 코돈 활용으로 고안되었다 (Ausubel F., 외, eds. (1994) Current Protocols in Molecular Biology , vol . 3 , p. A.1C.3 Haq TA, Mason HS, Clements JD, Arntzen CJ (1995) Oral immunization with a recombinant bacterial antigen produced in transgenic plants. Science 268:714-716). HN에 대해 바람직한 서열은 도 1에 보여진다. 합성 HN 유전자는 상업적 공급자(Retrogen)에 의해 조립되었으며, pCR-Blunt로 클로닝된 유전자의 5' (p4187-4203-1) 또는 3' (p42111-4235-1c-1) 절반씩을 포함하는 두 개의 분리된 플라스미드에 도입되었다.

플라스미드 구성: 미국 특허번호 5,879,903; 5,637,489; 5,276,268; 5,273,894에 개시되고 여기에 참고자료로 병합되어 있는 것 처럼, 식물 선택 마커 포스피노트리신 아세틸 전이효소(phosphinothricin acetyl transferase, PAT)를 사용하는, 도 2에 나타난 pBBV-PHAS-iaaH 벡터를 기초로 아그로박테리아 매개 식물 형질전환용 이중 벡터(Binary vector)가 구성되었으며, WO 97/48819에 기재된 카사바 옆맥 모자이크 바이러스 프로모터 (CsVMV)에 의해 구동된다. 맨 처음 우리는 pBBV-PHAS-iaaH를 PacI로 소화시키는 것에 의해 상기 iaah 유전자 서열과 파세올린 프로모터 서열(phaseolin promoter sequence)을 제거하고, 재-연결시켜 pCVMV-PAT를 형성하였다; 그런 다음 우리는 클레나우 효소(Klenow enzyme)로 채우는 것에 의해 하나의 HindIII 자리를 제거하고 재-연결시켜 pCP!H를 형성하였다.

본 발명자들은 상기 CsVMV 프로모터를 pCP!H 상에 있는 CVM-Asc (5'-AtggcGCgccagaaggtaattatccaag 서열목록번호:5)과 CVM-Xho (5'-ATCTCGAGccatggtttggatcca 서열목록번호:6) 프라이머로 PCR에 의해 꼬리를 재단(end-tailor)하였고, 상기 EcoRV가 소화하고, T-꼬리를 가진 pBluescriptKS에서의 산물을 클로닝하여 pKS-CVM7를 제조하였다. pCP!H의 맵은 도 3에 보여진다. 우리는 pKS-CVM7/NcoI-EcoRI 벡터를 3 개의 삽입 절편과 연결시키는 과정에 의해 상기 HN 발현 카세트 pKS-CHN를 구성하였다. 상기 3 개의 삽입 절편은 NcoI/PstI 상의 HN 5' 절반, PstI/KpnI 상의 HN 3' 절반, 및 KpnI-EcoRI (Haq 1995) 상의 콩 vspB 3' 성분이다. 그런 다음 이중 T-DNA 벡터 pCHN은 pCP!H/AscI-EcoRI 벡터와 pKS-CHN의 AscI-EcoRI 절편의 연결에 의해 조립되었다. pCHN의 맵은 도 4에서 보여 진다.

미국특허번호 5,824,798호에 기재되어 있고 여기에 병합 참조되어 있는 전분립합성효소(granule bound starch synthase, GBSS) 프로모터가 다른 벡터들을 제조하기 위해 사용되었다. 이들 구성체들은 중국 감자 품종 "Dongnong"에 대한 유전자은행 등록번호 X83220 서열로부터 고안된 프라이머를 사용하면서, 감자(Solanum tuberosum L. cv.) 품종인 "Desiree"의 게놈 DNA에서 증폭된 프로모터 조각을 이용하여 만들어졌다.

변이유발 프라이머(mutagenic primer) "GSS-Nco" (5'-[TGCCATGGTGATGTGTGGTCTACAA] 서열목록번호:7)는 번역개시코돈을 덮으면서, 1800bp에서 5' 영역에 상보적인 순방향 프라이머(forward primer) "GSS-1.8F" (5'-[GATCTGACAAGTCAAGAAAATTG] 서열목록번호:8)와 함께 Nco I 자리를 생성하기 위해 사용되었다; 1825bp PCR 산물은 T-꼬리를 가진 pBluescriptKS에서 클로닝되어 pKS-GBN를 형성하고, 서열화되었다. 변이유발 프라이머(mutagenic primer) "GSS-Xho" (5'-[AGCTCGAGCTGTGTGAGTGAGTG] 서열목록번호:9)는 프라이머 "GSS-1.8F"와 함께 XhoI 자리를 생성하기 위해 사용되었다; 1550bp PCR 산물은 T-꼬리를 가진 pBluescriptKS에서 클로닝되어 pKS-GBX를 형성하고, 서열화되었다.

미국특허번호 5,891,665호에 기재되어 있고 여기에 병합 참조되어 있는 TEV 5'UTR(비번역 영역)을 포함하는 GBSS 프로모터 발현 카세트가 HindIII/XhoI로 소화된 pTH210 벡터와 pKS-GBX의 HindIII/XhoI 조각을 연결하는 것에 의해 조립되었는데, CaMV 35S 프로모터를 811 bp GBSS 프로모터로 치환하는 것에 영향을 주었으며, pTH252A를 형성하였다. Haq TA, Mason HS, Clements JD, Arntzen CJ (1995) Oral immunization with a recombinant bacterial antigen produced in transgenic plants. Science 268:714-716를 참조한다. HN 유전자는 NcoI/PstI 상의 HN 5' 절반 및 PstI/KpnI 상의 HN 3' 절반과의 연결에 의해 pTH252A/NcoI-KpnI 속으로 삽입되어, pHN252A를 형성하였다. 이중 T-DNA벡터 pgHN은 NsiI 및 EcoRI로 소화된 pGLTB 벡터(도 11에 보여짐)와 pHN252A/NsiI-KpnI 및 pTH210/KpnI-EcoRI 조각을 연결하는 것에 의해 생성되었다. pgHN의 맵은 도 5에 보여진다.

미국특허번호 제5,824,798호에 기재되어 있고 여기에 병합 참조되어 있으며, 그 인트론을 갖는, GBSS 5'UTR을 포함하는 GBSS 프로모터 발현 카세트가 HindIII/NcoI로 소화된 pTH210 벡터(Haq 1995)와 pKS-GBN의 HindIII/NcoI 조각을 연결하는 것에 의해 조립되었는데, (콜리플라워 모자이크 바이러스, cauliflower mosaic virus) CaMV 35S 프로모터/TEV 5'UTR를 1084 bp GBSS 프로모터/5'UTR로 치환하는 것에 영향을 주었으며, pTH251A를 형성하였다. 이중 T-DNA벡터 pgHN151은 pCLT105 벡터(도 12에 보여짐)와 pTH251A/HindIII-NcoI 및 pHN252A/NcoI-KpnI 조각을 연결하는 것에 의해 생성되었다. pgHN151의 맵은 도 6에 보여진다.

미국특허번호 제5,270,200호; 제6,184,437호; 제6,320,101호에 기재되어 있고 여기에 병합 참조되어 있으며, 그 인트론을 갖는, GBSS 5'UTR을 포함하는 GBSS 프로모터 발현 카세트가 구성되었다. 먼저, pCP!H가 특정한 KpnI 자리에서 소화되고, T4 DNA 중합효소로 무뎌지고, 재-연결되어 KpnI 자리가 제거된 pCP!HK를 형성하였다. pCP!HK는 NsiI로 소화되고 나서, T4 DNA 중합효소로 무뎌지고, PacI로 소 화되었다. 그 결과 벡터는 SacI로 소화되고 나서, T4 DNA 중합효소로 무뎌지고, PacI로 소화된 pgHN151으로부터의 2848 bp 조각과 연결되어, pgHN153를 형성하였다. pgHN153의 맵은 도 7에 보여진다.

키메릭 프로모터 ((4OCS△MAS 미국특허번호 제5,001,060호; 제5,573,932호; 제5,290,924호에 기재되어 있고 여기에 병합 참조되어 있음)가 HN에 대한 또 다른 발현벡터 구성을 위해 사용되었다. 플라스미드 pAGM149가 EcoRV로 소화되었으며 BamHI로 부분 소화되었다. 이 조각은 PmeI/PstI로 소화된 pCHN 및 pKS-CHN의 BamHI/PstI에 의한 소화로 얻어진 합성 HN 유전자의 5' 절반과 연결되었다. 그 결과물인 pMHN은 도 8에 보여진다.

AIV A/turkey/Wisconsin/68 (H5N9)의 HA 유전자를 포함하는 플라스미드가 데이비드 수아레즈(David Suarez)로부터 얻어졌다(SEPRL, Athens, GA) (도 10). 그것은 PCR로 말단이 재단되어 5' 말단에는 제한 자리 NcoI가, 3' 말단에는 KpnI가 첨가되었으며, 35S 프로모터, TEV 5'-UTR, 및 vspB 3' 말단을 포함하는 pIBT210.1 벡터 (Haq 외, 1995) 속으로 삽입되었다. 이러한 발현 카세트는 HindIII 및 EcoRI (부분적) 소화에 의해 이중 벡터 pGPTV-Kan (Becker 외, Plant Mol Biol 1992; 20: 1195-7)에 전달되었고, pIBT-HAO를 형성하였다. pIBT-HAO로부터 HA 유전자/vspB3' 말단 절편이 얻어졌다. pIBT-HAO로부터 상기 HA 유전자/vspB3' 말단 절편은 NcoI 및 EcoRI (부분적) 소화에 의해 얻어졌으며, pKS-CVM7 내로 삽입되어 pKS-CHA를 형성하였다. CsVMV 프로모터, HA 유전자, 및 vspB3' 말단을 포함하는 카세트는 AscI 및 EcoRI (부분적) 소화에 의해 pKS-CHA로부터 얻어졌으며, pCP!H와 연결되어 pCHA 를 형성하였다. 도 9에 보여진다.

대장균 균주 H10407의 LT-B 유전자를 암호화하는 식물-최적화 서열은 해당 분야에 알려져 있다 (Mason HS, Haq TA, Clements JD, Arntzen CJ, 1998, Vaccine 16:1336-1343). 대장균 균주 H10407의 LT-A 유전자를 암호화하는 식물-최적화 서열은 미국 가특허출원번호 제60/113,507호를 원출원으로 하는 WO/00/37609에 기재되어 있으며, 그 전체적인 교시내용은 여기서 참고문헌으로 병합 참조되어 있다. WO/00/37609는 실시예2 부분에서 근두암종균(Agrobacterium tumefaciens)이 매개한 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum ) NT-1 세포들의 식물세포 형질전환에 사용된 세 개의 T-DNA 벡터 (pSLT102, pSLT105, pSLT107)의 구성에 대해 기재하고 있다. 그 결과 형질전환된 NT-1 세포주들(SLT102, SLT105 및 SLT107)은 완전히 조립된 LT-B로 이루어진 LT 및 LT 유사체들과 LT-A 소단위들의 변형된 형태들을 발현하고 축적했다. 도 12는 pSLT107를 도시하고 있는데, Ala72를 Arg72로 교체하는 변형된 LT-A 유전자를 포함하고 있다. SLT102 및 SLT105 발현 산물은 상기 LT-A 유전자에 있어서의 다양한 변경(pSLT102에서는 Ser63를 Lys63로; pSLT105에서는 Arg192를 Gly192로)을 포함한다는 것을 제외하면 일치하였다. 이들 세포주들은 핵 염색체 DNA 내로 안정하게 도입된 플라스미드들의 미확립된 사본의 T-DNA 영역을 포함한다. 트랜스제닉 NT1 세포들은 갱글리오시드 의존성 ELISA에 의해 결정된 것처럼 전체 가용성 단백질의 0.4%에 이르는 수준에서 갱글리오시드-결합 오합체들(ganglioside-binding pentamers)로 조립된 LT-B 소단위들을 축적했다. 또한 트랜스제닉 NT1 세포들은 변형된 LT-A 소단위들을 축적했는데, 이들 중 일부는 LT-A 특정 항체를 이용하여 갱글리오시드 의존성 ELISA에 의해 결정된 것처럼 LT-B 오합체들로 조립되었다.

아그로박테리아 매개 식물세포 형질전환에 대한 이중 벡터(binary vector)는 VP2의 첨가를 위해 특정한 BamHI 자리에서 AgeI 링커로 변형된 기본적인 이중 벡터(pBBV)와 선택성 마커 발현 카세트로부터 구성되었다. VP2는 RB7 MAR 부위 (미국특허번호 제5,773,689호; 제5,773,695호; 제6,239,328호, WO 94/07902, WO 97/27207)와 근두암육종(Atu) ORF 24 (유전자은행 등록번호 X00493) 3' UTR을 가진, CsVMV 프로모터에 의해 측면이 채워진다. 선택성 마커 PAT는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana ,At) 유비퀴틴(Ubiquitin) 10 프로모터 (Plant J. 1997. 11(5):1017; Plant Mol. Biol. 1993. 21(5):895; Genetics, 1995, 139(2):921) 및 Atu ORF 1 (U.S. Patent No. 5428147; Plant Molecular Biology. 1983. 2:335; 유전자은행 등록번호 X00493) 3'UTR로 조절되고; 그 결과물 플라스미드 pDAB2423는 도 13에 보여진다.

전염성 낭증 (IBD) 바이러스, 맹독성 균주 Ehime 91(J Vet Med Sci. 1992. 54(1):153; JVI. 2002. 76(11):5637)가 균주 UK661(유전자은행 등록번호 NC_004178)로부터 아미노산 #454-456을 가진, 보고된 VP2 아미노산 서열(유전자은행 등록번호 AB024076)을 기초로 상기 VP2 식물-최적화 뉴클레오티드 서열을 생산 하는 데에 사용되었다. (VP2 서열에 대해 도 14 참조)

실시예 2: 트랜스제닉 니코티아나 타바쿰( Nicotiana tabacum) 의 제조

형질전환 3 내지 4일 전, 2ml의 NT-1 배양을 40ml NT-1 배지로 첨가시키는 것에 의해 배지를 신선하게 하기 위해 1주일 된 NT-1 배양이 이차배양되었다. 상기 이차배양된 것은 암 상태에서 25±1℃에서 셰이커에 100rpm으로 보관되었다.

NT -1 배지

시약 리터당

MS 염	4.3 g
MES stock (20X)	50 ml
B1 이노시톨 stock (100X)	10 ml
Miller's I stock	3 ml
2,4-D (1 mg / ml )	2.21 ml
수크로오스	30 g
pH to 5.7 + 0.03

B1 이노시톨 Stock (100x)(1 리터)

티아민 HCl (Vit B1) - 0.1 g

MES (20x) (1 리터)

MES (2-N-모르포리노에탄술포닉산) - 10 g

미오이노시톨(Myoinositol) - 10 g

Miller's I (1 리터)

KH₂PO₄ - 60 g

MS 염기성 염	1 리터 DI water 당
변형 MS 비타민 (100X) 미오-이노시톨 무수인산 일수소칼륨 MES 2,4-D (10mg/ml) 수크로오스 L-프롤린	10ml 100mg 137.4g 0.5g 222ul 30g

변형 MS 비타민	1 리터 DI water 당
니코틴산	5mg/L
피로독신 HCL	50mg/L
티아민 HCL	200mg/L
글리신	200mg/L

2.5 M L-프롤린 Stock

M.W = 115.1 g/L

100 ml의 2.5 M Stock 준비

115.1 / 10 = 11.51 X 2.5 = 28.775 grams in 100 mls

대상 발현벡터를 가지는 근두암종균이 글리세롤 스톡(stock)으로부터 스펙티노마이신 50ml/l을 함유하는 LB 배지 평판 위에 도말되었다. 상기 균 배양이 암 상태에서 24 내지 48 시간 동안 인큐베이트되었다. 한 개의 양호하게 형성된 콜로니가 선별되었으며, 50mg/L 스펙티노마이신을 함유하는 3ml YM 배지에 옮겨졌다. OD₆₀₀ 이 0.5 - 0.6이 될 때까지 상기 액체 배양은 암 상태, 30℃, 인큐베이터 셰이커 안에서 250rpm 조건으로 인큐베이트되었다. 이 과정은 약 24시간이 소요되었다.

LB Medium

시약 리터 당

Bacto-tryptone	10 g
이스트 추출물	5 g
NaCl	10 g
Difco Bacto Agar	15 g

YM 배지

시약 리터 당

이스트 추출물	400 mg
마니톨	10 g
NaCl	100 mg
MgSO₄·H₂0	200 mg
KH₂PO₄	500 mg

(택일적으로, YM 분말 형태가 구입가능하다(Gibco BRL; catalog #10090-011). 액체 배양배지 제조를 위해서는 11.1g을 1리터 물에 첨가함.)

형질전환하는 날, 20 mM 아세토시링온(acetosyringone) 1㎕이 NT-1 배양 ml 당 첨가되었다. 상기 아세토시링온 스톡은 형질전환하는 날에 에탄올에 만들어졌다. 상기 NT-1 세포들은 형질전환 효능을 높이기 위해 손상(wound)되었다. 손상을 위해, 상기 현탁배양은 5ml 와이어보어 멸균 피펫(wide-bore sterile pipette)을 통해 반복 (20회) 상승 및 하강이 실시되었다. 상기 현탁배양 중 4ml가 10, 60 x 15mm 페트리 판(Petri plate) 각각으로 옮겨졌다. 하나의 판이 비-형질전환 대조군으로 사용되기 위해서 별도로 놓여졌다. 대략, 근두암종균 현탁액 50 내지 100㎕가 남아 있는 9개의 판 각각에 첨가되었다. 상기 판들을 파라필름으로 씌운 다음 암 상태, 셰이커에서 100rpm, 25±1℃ 조건으로 3일 간 인큐베이트되었다.

세포들을 멸균, 50ml 코니칼 원심분리 튜브(conical centrifuge tube)에 옮기고, 최종 용적이 45ml가 될 때까지 NTC 배지에서 배양하였다 (500mg/L 카르베니실린을 가진 NT-1 배지, 고압증기멸균(autoclaving) 후 첨가됨). 상기 세포들을 혼합한 다음, 1000rpm에서 10분 동안 날개회전자(swinging bucket rotor)가 장착된 원심분리기 안에서 원심분리시켰다. 상층액은 제거하고, 결과물 펠릿은 45ml NTC에서 재현탁시켰다. 세척을 반복하였다. 상기 현탁액을 원심분리하였으며, 상층액은 제거하고, 상기 펠릿은 40ml NTC에서 재현탁시켰다. 5ml 분취량(aliquot)은 NTCB10 배지(8g/l 한천/한천으로 고형화된 NTC 배지; 10mg/l bialaphos이 보충됨, 고압증기멸균 후 첨가됨)를 갖는 각각의 페트리 판 (150 x 15 mm) 위에 놓여졌다. 상기 판들을 파라필름으로 씌운 다음 암 상태, 25±1℃에서 보관하였다. 배양실로 옮기기 전에, 판들은 무균작업대(laminar flow hood)에 개방 상태로 놓이게 해서, 초과 액체가 증발하도록 하였다. 6 내지 8주 후에, 추정 형질전환체(putative transformant)들이 출현했다. 그것들이 선발되고, 신선한 NTCB5 배지(8g/l 한천/한천으로 고형화된 NTC 배지; 5mg/l bialaphos이 보충됨, 고압증기멸균 후 첨가됨)에 옮겨졌다. 상기 판들을 파라필름으로 씌운 다음 암 상태, 25±1℃에서 배양하였다.

추정 형질전환체들은 죽은 비-형질전환된 세포들을 배경으로 하는 작은 덩어리 형태의 캘러스처럼 보였다. 이들 캘러스들을 NTCB5 배지에 옮기고, 수 주 동안 생장되도록 하였다. 각각의 추정 형질전환체의 부위들이 ELISA 분석을 위해 선발되었다. 최소한 2회 ELISA 후에, 가장 높은 항원 수준을 가진 세포주들이 선별되었다. 그 후 상기 엘리트 세포주 각각에 대한 캘러스 물질들이 판 배양과 이 따금 액체 배양에서 증식되었다.

실시예 3: 식물이 생산한 단백질의 안정성

재조합 또는 천연 원료에서 추출한 단백질들은 상기 단백질과 세포 구성요소들을 동시에 정제(co-purify)하는 프로테아제(proteases), 글리코실화 효소(glycosylases), 리파아제(lipases) 또는 기타 효소들 때문에 종종 불안정하다. NT-1 세포들로부터 분리된 상기 단백질들과 면역보호 입자들은 원래 안정하고 다수의 다양한 형태의 다운스트림 공정 활동에도 강한 특성을 갖는다. 도 14에서는, CHN-18 세포들을 고정상 10리터 발효기로부터 채취하고, 원심분리에 의해 여과시키고, 미세유화(microfluidize)시켰다. 그런 다음 상층액은 0.2 내지 0.45 마이크론 필터를 사용해 여과시켜서, 여과나 미세유화 조작 중에 도입되었을 수도 있는 세균 제제를 제거시켰다. 어떠한 안정제도 이들 현탁액에 첨가하지 않았고, 안정성은 이들 트랜스제닉 세포들에서 유도된 상기 단백질에 타고난 특성이다. 이후 물질은 2-7℃, 25℃에서 보관하거나,-80℃에서 동결시켰다; 상기 물질은 모든 온도범위에서 안정적인 것으로 발견되었지만, 가장 흥미로운 결과는 25℃ (주변 온도)에 놓였을 때 분리된 단백질들이 안정적인 것으로 발견되었다는 사실(도 14에 보여짐)이다. 비록 신호에 있어서 변화(variation)는 달이 거듭되면서 나타났지만, 수개월 후 분리된 단백질은 놀랄만한 안정성을 보여주었다. 이들 데이터로부터 산출가능한 반감기(half life)는 추산된 반감기가 8개월(0.45 마이크론 샘플)이며, 0.2 마이크론 여과 샘플의 경우 1 내지 수년 이상이다.

여기서 설명된 실시예들과 예시들은 단지 발명의 이해를 돕기 위한 목적일 뿐이며, 다양한 변형 및 변화가 그러한 목적 내에서 당업계 기술자들에게 제시될 수 있고, 본 발명의 사상 및 첨부된 청구항들의 범위 이내에서 포함되어져야 한다. 또한, 여기서 개시된 어떠한 발명과 그 실시예의 구성요소 또는 한정들 또한 여기서 개시된 다른 발명이나 그 실시예의 해당 및/또는 다른 구성요소 또는 한정들(단독 또는 조합 형태)과 조합될 수 있고, 그러한 모든 조합형태들은 제한 없이 본 발명의 범위에 포함될 수 있다.

실시예 4: 배지 조성

하기는 한천과 액체 현탁 상의 천연 NT-1 세포들과 재조합 NT-1 세포들을 배양하기 위해 사용되는 배지 조성이다. 추가로, NT-1 재조합 NT-1을 동결보존하기 위한 상기 배지 조성이 한정된다.

배지 제조

A. 조성성분

별도 언급이 없으면, 화학물질 조달을 위해 신뢰할 만한 구입처를 이용함

한천	Potassium Iodide
Ammonium Nitrate	Potassium Nitrate
Boric Acid, 분말	Potassium Phosphate, Dibasic, 3*H₂O
Calcium Chloride, Anhydrous	Potassium Phosphate, Dibasic, Anhydrous
Cobalt Chloride, 6*H₂O	Potassium Phosphate, Monobasic
Copper (II) Sulfate, 5*H₂O	L-프롤린
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	피록시딘 HCl
EDTA, Disodium, 2*H₂O	RO/DI water
글리신	Sodium Chloride
이노시톨	Sodium Molybdate, 2*H₂O
Iron (II) Sulfate, 7*H₂O	Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous
Magnesium Sulfate, Anhydrous	수크로오스
Manganese Sulfate, 1*H₂O	티아민 HCl
MES, 1*H₂O	Zinc Sulfate, 7*H₂O
Murashige 및 Skoog 염 혼합물 (MS 염)	Bialaphos, PhytoTechnology Labs, D-309
니코틴산	2,4-D, 10 mg/ml soln., PhytoTechnology Labs, B131
Potassium Chloride

B. 조성

1. 10X 배치 염

a. 조성성분 양/리터

Ammonium Nitrate	16.5 g
Boric Acid, 분말	62.0 mg
Cobalt Chloride, 6*H₂O	0.25 mg
Copper (II) Sulfate 5*H₂O	0.25 mg
EDTA, Disodium, 2*H₂O	372.6 mg
Iron (II) Sulfate 7*H₂O	278.0 mg
Manganese Sulfate 1*H₂O	169.0 mg
Sodium Molybdate, 2*H₂O	2.5 mg
Potassium Iodide	8.3 mg
Potassium Nitrate	19.0 g
Potassium Phosphate, Monobasic	1.7 g
Zinc Sulfate, 7*H₂O	86.0 mg
Magnesium Sulfate, Anhydrous	1.807 g
Calcium Chloride, Anhydrous	3.322 g
티아민 HCl	10.0 mg
이노시톨	1.0 g
MES, 1*H₂O	5.0 g
RO/DI Water	1000 mL

b. 제조

i. RO/DI water 750ml를 적당한 용기에 가한다.

ii. 상기 용기를 가열된 교반 평판에 놓고, 교반막대(stir bar)로 혼합한다. 모든 구성요소들을 용해하기 위해 필요시 상기 RO/DI water을 가열할 수도 있다.

iii. 상기 조성성분들 전부를 상기 RO/DI water에 가한다.

iv. 최종 구성요소가 용해된 후, 부피를 1000mL까지 높인다.

v. 상기 용액을 0.2μ 필터로 멸균시킨다.

vi. 실온에 보관하고, 1년 만료기간을 지정한다.

B. 2. Bialaphos (5mg/mL)

a. 조성성분 양/50mL

Bialaphos	250.0 mg
RO/DI water	50 mL

b. 제조

i. RO/DI water 50ml를 적당한 용기에 가한다.

ii. 상기 용기를 가열된 교반 평판에 놓고, 교반막대로 혼합한다.

iii. 상기 Bialaphos를 상기 RO/DI water에 가하고, 용해될 때까지 혼합한다.

iv. 0.2μ 필터로 멸균시킨다.

v. 냉동 보관하고, 1년 만료기간을 지정한다.

B. 3. 100X 변형 MS 비타민

a. 조성성분 양/리터

니코틴산	5.0 mg
피록시딘 HCl	50.0 ml
티아민 HCl	50.0 mg
글리신	200.0 mg
RO/DI Water	1000 mL

b. 제조

i. RO/DI water 500ml를 적당한 용기에 가한다.

iii. 상기 조성성분들 전부를 상기 RO/DI water에 가한다.

iv. 최종 구성요소가 용해된 후, 부피를 1000mL까지 높인다.

v. 상기 용액을 0.2μ 필터로 멸균시킨다.

vi. 2℃-10℃에서 보관하고, 1년 만료기간을 지정한다.

B. 4. L-프롤린 (2.5M)

a. 조성성분 양/100mL

L-프롤린	28.775 g
RO/DI Water	100 mL

b. 제조

i. RO/DI water 50ml를 적당한 용기에 가한다.

iii. 상기 L-프롤린을 상기 RO/DI water에 가한다.

iv. 상기 L-프롤린이 용해된 후, 부피를 100mL까지 높인다.

v. 2℃-10℃에서 보관하고, 3개월 만료기간을 지정한다.

B. 5. NT-1 한천 평판

a. 조성성분 양/리터

Potassium Phosphate, Dibasic, 3*H₂O	180.0 mg
수크로오스	30.0 g
10X 배치 염	100 mL
2,4-D (10 mg/ml)	0.11 mL
한천	8.0 g
RO/DI water	1000 mL

b. 제조

i. RO/DI water 500ml를 적당한 용기에 가한다.

iii. 상기 한천을 제외한 상기 조성성분 전부를 상기 RO/DI water에 가한다.

iv. 최종 조성성분이 용해된 후, 부피를 1000mL까지 높인다.

v. 상기 한천을 상기 용액에 가하고, 상기 한천이 완전히 녹을 때까지 가열한다.

vi. 상기 용액이 여전히 뜨거우면, 상기 용액을 0.2μ 필터로 멸균시킨다.

vii. 배지를 실온에 근접할 때까지 냉각시킨다.

viii.약 25mL의 한천을 각각 15 cm² 멸균 페트리 접시에 피펫팅하고, 각 평판이 완전히 냉각되도록 한다.

ix. 2℃-10℃에서 뒤집어서 보관하고, 3개월 만료기간을 지정한다.

B. 6. NT-1 액체 배지

a. 조성성분 양/리터

Potassium Phosphate, Dibasic, 3*H₂O	180.0 g
수크로오스	30.0 g
10X 배치 염	100 mL
2,4-D (10 mg/ml)	0.11 mL
RO/DI water	1000 mL

b. 제조

i. RO/DI water 500ml를 적당한 용기에 가한다.

iii. 상기 조성성분들 전부를 상기 RO/DI water에 가한다.

iv. 최종 구성요소가 용해된 후, 부피를 1000mL까지 높인다.

v. 750ml 분취량(aliquots)으로 만들고 121℃ 이상에서 30분간 고압증기멸균(autoclave)시킨다.

vi. 2℃-10℃에서 보관하고, 1년 만료기간을 지정한다.

B. 7. NT1VP 배지

a. 조성성분 양/리터

Murashige 및 Skoog 염 혼합물	4.33 g
100X 변형 MS 비타민	10.0 mL
2,4-D (10 mg/mL)	222 uL
L-프롤린 (2.5M)	2.4 mL
Potassium Phosphate, Dibasic, Anhydrous	137.4 g
MES	500.0 mg
이노시톨	100.0 mg
수크로오스	30.0 g
RO/DI Water	1000 mL

b. 제조

i. RO/DI water 500ml를 적당한 용기에 가한다.

iii. 상기 조성성분들 전부를 상기 RO/DI water에 가한다.

iv. 최종 구성요소가 용해된 후, 부피를 1000mL까지 높인다.

v. 500ml 분취량(aliquots)으로 만들고 121℃ 이상에서 30분간 고압증기멸균(autoclave)시킨다.

vi. 2℃-10℃에서 보관하고, 1년 만료기간을 지정한다.

B. 8. 동결보존 배지

a. 조성성분 양

NT1VP 배지	226.64 mL
글리세롤	46.06 g
수크로오스	342.27 g
DMSO	35.5 mL

b. 제조

i. 상기 글리세롤을 적당한 용기에 가한다.

iii. 상기 NT1VP 배지를 상기 용기에 가한다.

iv. 낮은 열에서 혼합하고, 용해될 때까지 상기 수크로오스를 서서히 가한다.

v. 상기 DMSO를 가한다.

vi. 0.2μ 필터로 멸균시킨다.

vii. 2℃-10℃에서 보관하고, 1년 만료기간을 지정한다.

실시예 5: 마이코플라즈마 생장을 지원하는 식물세포생장배지와 현탁배양의 평가

재조합 담배-유도 식물 세포주, CHN-18 NT-1, 및 여기서 개시된 생장배지는 마이코플라즈마(mycoplasma)의 생장을 지원하지 않는다. 본 연구의 목적은 NT-1 생장배지 또는 NT-1와 CHN-18 NT-1 현탁배양이 두 종의 마이코플라즈마, Mycoplasma hyorhinis 및 Acholeplasma laidlawii의 생장을 지원하는지를 결정하기 위한 것이다.

평가방법은 9 CFR 113.28을 따랐다. 실험 0일째에, 마이코플라즈마 접종 전에, 시료에 마이코플라즈마가 없음을 확인하기 위해 시료가 마이코플라즈마 한천 위에 놓여졌다. 0일째에, 상기 마이코플라즈마 양성 대조군이 접종된 시료는 마이코플라즈마 한천 위에 놓여지지 않았다. 마이코플라즈마 한천에 대한 상기 마이코플라즈마가 접종된 시료의 이차배양이 3, 7, 10, 14일째에 실시되었다. 실험 첫째 날, 마이코플라즈마 브로스(broth)와 마이코플라즈마 양성 대조군을 가진 한천을 접종하여 양성 대조군을 준비하였다. 마이코플라즈마 브로스(broth)와 마이코플라즈마 브로스를 가진 한천을 접종하여 음성 대조군을 준비하였다. 3, 7, 10, 14일째에, 상기 양성 및 음성 대조군이 마이코플라즈마 한천 위로 이차배양되었다. 상기 마이코플라즈마 한천 평판 전부가 마이코플라즈마 콜로니에 대한 접종 10-14일 후 검사되었다.

상기 시료들은 NT-1 및 CHN-18 식물 현탁 세포배양들뿐만 아니라 NT-1 식물 세포생장배지와 CHN-18 식물세포생장배지였다. 상기 식물 현탁 배양들은 활발히 생장하는 중에 3 내지 4일된 배양일 때 마이코플라즈마로 접종되었다.

상기 NT-1 생장배지는 마이코플라즈마의 생장을 지원하지 않았다(표 1). 마이코플라즈마 양성 대조군이 접종된 NT-1 생장배지로부터 이차배양된 상기 마이코플라즈마 한천 평판 상에서는 마이코플라즈마 콜로니가 발견되지 않았다. 상기 마이코플라즈마 양성 대조군이 첨가되기 전에 한천 평판 위에 놓인 상기 NT-1 배지 또한 마이코플라즈마 생장을 보이지 않았다. 상기 양성 대조군은 상기 마이코플라즈마 브로스에서 상당히 생장하였으며 마이코플라즈마 콜로니들이 상기 마이코플라즈마 한천 평판 전부에서 발견되었다. 상기 음성 대조군은 상기 마이코플라즈마 브로스에서 생장하지 않았으며 마이코플라즈마 콜로니들이 상기 마이코플라즈마 한천 평판 어디에서도 발견되지 않았다.

표 1. NT-1 생장배지에서의 마이코플라즈마 생장
	마이코플라즈마 콜로니 갯수
	0일	3일	7일	10일	14일
음성 대조군	0	0	0	0	0
M. hyorhinis 양성 대조군	33	TNTC	TNTC	TNTC	TNTC
A. laidlawii 양성 대조군	TNTC	TNTC	TNTC	TNTC	TNTC
NT-1 배지 + M. hyorhinis	ND	0	0	0	0
NT-1 배지 + A. laidlawii	ND	0	0	0	0

TNTC:　 너무 많아서 계수불가(too numerous to count), 평판 당 100콜로니 이상

ND:　미진행, 마이코플라즈마 양성 대조군 없는 NT-1 배지가 0일째에 시험되었으며, 마이코플라즈마 콜로니가 발견되지 않음 　

상기 NT-1 세포 현탁배양은 마이코플라즈마의 생장을 지원하지 않았다(표 2). 마이코플라즈마 양성 대조군이 접종된 NT-1 세포 현탁배양으로부터 이차배양된 상기 마이코플라즈마 한천 평판 상에서는 마이코플라즈마 콜로니가 발견되지 않았다. 상기 마이코플라즈마 양성 대조군이 첨가되기 전에 한천 평판 위에 놓인 상기 NT-1 세포 현탁배양 또한 마이코플라즈마 생장을 보이지 않았다. 상기 양성 대조군은 상기 마이코플라즈마 브로스에서 상당히 생장하였으며 마이코플라즈마 콜로니들이 상기 마이코플라즈마 한천 평판 전부에서 발견되었다. 상기 음성 대조군은 상기 마이코플라즈마 브로스에서 생장하지 않았으며 마이코플라즈마 콜로니들이 상기 마이코플라즈마 한천 평판 어디에서도 발견되지 않았다.

표 2. NT-1 현탁 세포배양에서의 마이코플라즈마 생장
	마이코플라즈마 콜로니 갯수
	0일	3일	7일	10일	14일
음성 대조군	0	0	0	0	0
M. hyorhinis 양성 대조군	33	TNTC	TNTC	TNTC	TNTC
A. laidlawii 양성 대조군	TNTC	TNTC	TNTC	TNTC	TNTC
NT-1 배양	0	ND	ND	ND	ND
NT-1 배양 + 　M. hyorhinis	ND	0	0	0	0
NT-1 배양 + A. laidawii	ND	0	0	0	0

TNTC:　 너무 많아서 계수불가, 평판 당 100콜로니 이상

ND:　미진행, 마이코플라즈마 양성 대조군 없는 NT-1 세포 현탁배양이 0일째에 시험되었으며, 마이코플라즈마 콜로니가 발견되지 않음

상기 CHN-18 생장배지와 세포 현탁배양은 마이코플라즈마의 생장을 지원하지 않았다(표 3). 마이코플라즈마 양성 대조군이 접종된 CHN-18 생장배지와 세포 현탁배양으로부터 이차배양된 상기 마이코플라즈마 한천 평판 상에서는 마이코플라즈마 콜로니가 발견되지 않았다. 상기 마이코플라즈마 양성 대조군이 첨가되기 전에 한천 평판 위에 놓인 상기 CHN-18 생장배지와 CHN-18 세포 현탁배양은 또한 마이코플라즈마 생장을 보이지 않았다. 상기 양성 대조군은 상기 마이코플라즈마 브로스에서 상당히 생장하였으며 마이코플라즈마 콜로니들이 상기 마이코플라즈마 한천 평판 전부에서 발견되었다. 상기 음성 대조군은 상기 마이코플라즈마 브로스에서 생장하지 않았으며 마이코플라즈마 콜로니들이 상기 마이코플라즈마 한천 평판 어디에서도 발견되지 않았다.

표 3. CHN-18 생장배지와 CHN-18 세포 현탁배양에서의 마이코플라즈마 생장
	마이코플라즈마 콜로니 갯수
	0일	3일	7일	10일	14일
음성 대조군	0	0	0	0	0
M. hyorhinis 양성 대조군	41	TNTC	53	41	13
A. laidlawii 양성 대조군	TNTC	TNTC	TNTC	TNTC	TNTC
CHN-18 배지 + M. hyorhinis	ND	0	0	0	0
CHN-18 배지 + A. laidlawii	ND	0	0	0	0
CHN-18 배양 + 　M. hyorhinis	ND	0	0	0	0
CHN-18 배양 + A. laidawii	ND	0	0	0	0

TNTC:　 너무 많아서 계수불가, 평판 당 100콜로니 이상

ND:　미진행, 마이코플라즈마 양성 대조군 없는 CHN-18 생장배지와 세포 현탁배양이 0일째에 시험되었으며, 마이코플라즈마 콜로니가 발견되지 않음

마이코플라즈마는 NT-1 세포 생산에 사용된 상기 NT-1 생장배지에서나 상기 CHN-18 생장배지에서 생장하지 않았다. 아울러, NT-1의 현탁배양이나 CHN-18의 현탁배양 또한 마이코플라즈마의 생장을 지원하지 않았다. 이러한 결과는 상기 NT-1 및 CHN-18 생장배지, 및 NT-1 및 CHN-18 세포배양이 마이코플라즈마 생장을 지원할 수 없음을 의미한다.

SEQUENCE LISTING <110> Mihaliak, Charles A. Fanton, Matthew J. McMillen, Janis K. <120> Preparation of Vaccine Master Cell Lines Using Recombinant Plant Suspension Cultures <130> DAS-130X <150> US 60/733,702 <151> 2005-11-04 <160> 13 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1753 <212> DNA <213> Newcastle Disease Virus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1753) <223> See Figures 1a and 1b. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1753) <223> Plant optimized coding sequence of the hemaglutinin/neuraminidase (HN) gene of Newcastle Disease Virus (NDV) strain "Lasota" <400> 1 atggacagag cagtttcaca agtggcccta gagaatgatg agagggaagc caagaatacc 60 tggaggctta tattcagaat agccatctta ttccttactg tggtcaccct agcaatctct 120 gttgcatccc tcctctattc tatgggagca agcaccccct cagacttggt gggcataccc 180 acaagaatct ctagggcaga agaaaaaatc accagtaccc ttggctccaa ccaagatgtt 240 gtggacagaa tctacaaaca ggtggcactt gaaagtccac ttgcattact caacacagag 300 actaccatca tgaatgcaat taccagccta tcctatcaaa ttaatggggc tgccaacaat 360 tcaggttggg gagccccaat tcatgatcca gactatattg gaggtattgg caaagagctt 420 attgtagatg atgcttcaga tgttacatct ttctatcctt cagctttcca ggaacacctg 480 aatttcattc ctgcacccac aactgggagt gggtgcacta gaataccctc atttgacatg 540 agtgctacac actactgcta cacacataat gttattctct ctggctgtag ggaccactct 600 cactcttatc aatacttagc tcttggagtt ctcagaacat ctgctactgg tagagtcttt 660 ttctcaactc ttaggagtat caacctagat gatacacaaa ataggaaaag ttgctctgta 720 tctgctacac ctttgggctg tgatatgcta tgcagtaaag taacagaaac tgaagaagag 780 gactataatt ctgctgtccc tacaaggatg gtgcatggca gattgggttt tgatggtcaa 840 tatcatgaaa aagatttgga tgtcactaca ttgtttgggg attgggtagc taattaccca 900 ggagttggag gtggtagctt cattgactcc agagtctggt tctctgtcta tggtggttta 960 aaacctaaca gtcctagtga tactgtgcaa gagggaaagt atgttatcta caagaggtat 1020 aatgatactt gtcctgatga acaggattac cagattagga tggctaagtc atcatacaaa 1080 ccaggaagat ttggaggtaa gaggatacaa caagctattt tgagtattaa ggttagcaca 1140 tcattgggag aggacccagt ccttactgtt ccaccaaaca ctgtaacact catgggagct 1200 gagggaagga ttttaactgt tggtactagc cattttcttt atcagagagg aagttcctat 1260 tttagcccag cattactgta tccaatgact gtgagcaaca agacagctac attacattca 1320 ccatatactt ttaatgcttt tacaagacct ggatcaattc cttgccaggc ttcagctaga 1380 tgtccaaatt catgtgtgac tggagtttac actgatcctt accctttgat attttacaga 1440 aatcatacct tgagaggggt ttttggaaca atgttggatg gtgttcaagc taggctcaat 1500 cctgcctctg ctgtttttga ttctacatca agatcaagaa taaccagggt ttcctctagt 1560 tccactaagg cagcatatac tacctccaca tgtttcaaag ttgtaaagac taacaaaact 1620 tattgtctga gcatagctga gatctctaac actctttttg gggagttcag aattgttcca 1680 cttttggtgg aaattctgaa ggatgatggt gtaagggaag caagatctgg ttaagtcttc 1740 aggtaccgag ctc 1753 <210> 2 <211> 577 <212> PRT <213> Newcastle Disease Virus <220> <221> misc_feature <223> See Figures 1a and 1b. <220> <221> misc_feature <223> Plant optimized protein sequence of the hemaglutinin/neuraminidase (HN) gene of Newcastle Disease Virus (NDV) strain "Lasota" <400> 2 Met Asp Arg Ala Val Ser Gln Val Ala Leu Glu Asn Asp Glu Arg Glu 1 5 10 15 Ala Lys Asn Thr Trp Arg Leu Ile Phe Arg Ile Ala Ile Leu Phe Leu 20 25 30 Thr Val Val Thr Leu Ala Ile Ser Val Ala Ser Leu Leu Tyr Ser Met 35 40 45 Gly Ala Ser Thr Pro Ser Asp Leu Val Gly Ile Pro Thr Arg Ile Ser 50 55 60 Arg Ala Glu Glu Lys Ile Thr Ser Thr Leu Gly Ser Asn Gln Asp Val 65 70 75 80 Val Asp Arg Ile Tyr Lys Gln Val Ala Leu Glu Ser Pro Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Asn Thr Glu Thr Thr Ile Met Asn Ala Ile Thr Ser Leu Ser Tyr 100 105 110 Gln Ile Asn Gly Ala Ala Asn Asn Ser Gly Trp Gly Ala Pro Ile His 115 120 125 Asp Pro Asp Tyr Ile Gly Gly Ile Gly Lys Glu Leu Ile Val Asp Asp 130 135 140 Ala Ser Asp Val Thr Ser Phe Tyr Pro Ser Ala Phe Gln Glu His Leu 145 150 155 160 Asn Phe Ile Pro Ala Pro Thr Thr Gly Ser Gly Cys Thr Arg Ile Pro 165 170 175 Ser Phe Asp Met Ser Ala Thr His Tyr Cys Tyr Thr His Asn Val Ile 180 185 190 Leu Ser Gly Cys Arg Asp His Ser His Ser Tyr Gln Tyr Leu Ala Leu 195 200 205 Gly Val Leu Arg Thr Ser Ala Thr Gly Arg Val Phe Phe Ser Thr Leu 210 215 220 Arg Ser Ile Asn Leu Asp Asp Thr Gln Asn Arg Lys Ser Cys Ser Val 225 230 235 240 Ser Ala Thr Pro Leu Gly Cys Asp Met Leu Cys Ser Lys Val Thr Glu 245 250 255 Thr Glu Glu Glu Asp Tyr Asn Ser Ala Val Pro Thr Arg Met Val His 260 265 270 Gly Arg Leu Gly Phe Asp Gly Gln Tyr His Glu Lys Asp Leu Asp Val 275 280 285 Thr Thr Leu Phe Gly Asp Trp Val Ala Asn Tyr Pro Gly Val Gly Gly 290 295 300 Gly Ser Phe Ile Asp Ser Arg Val Trp Phe Ser Val Tyr Gly Gly Leu 305 310 315 320 Lys Pro Asn Ser Pro Ser Asp Thr Val Gln Glu Gly Lys Tyr Val Ile 325 330 335 Tyr Lys Arg Tyr Asn Asp Thr Cys Pro Asp Glu Gln Asp Tyr Gln Ile 340 345 350 Arg Met Ala Lys Ser Ser Tyr Lys Pro Gly Arg Phe Gly Gly Lys Arg 355 360 365 Ile Gln Gln Ala Ile Leu Ser Ile Lys Val Ser Thr Ser Leu Gly Glu 370 375 380 Asp Pro Val Leu Thr Val Pro Pro Asn Thr Val Thr Leu Met Gly Ala 385 390 395 400 Glu Gly Arg Ile Leu Thr Val Gly Thr Ser His Phe Leu Tyr Gln Arg 405 410 415 Gly Ser Ser Tyr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Tyr Pro Met Thr Val Ser 420 425 430 Asn Lys Thr Ala Thr Leu His Ser Pro Tyr Thr Phe Asn Ala Phe Thr 435 440 445 Arg Pro Gly Ser Ile Pro Cys Gln Ala Ser Ala Arg Cys Pro Asn Ser 450 455 460 Cys Val Thr Gly Val Tyr Thr Asp Pro Tyr Pro Leu Ile Phe Tyr Arg 465 470 475 480 Asn His Thr Leu Arg Gly Val Phe Gly Thr Met Leu Asp Gly Val Gln 485 490 495 Ala Arg Leu Asn Pro Ala Ser Ala Val Phe Asp Ser Thr Ser Arg Ser 500 505 510 Arg Ile Thr Arg Val Ser Ser Ser Ser Thr Lys Ala Ala Tyr Thr Thr 515 520 525 Ser Thr Cys Phe Lys Val Val Lys Thr Asn Lys Thr Tyr Cys Leu Ser 530 535 540 Ile Ala Glu Ile Ser Asn Thr Leu Phe Gly Glu Phe Arg Ile Val Pro 545 550 555 560 Leu Leu Val Glu Ile Leu Lys Asp Asp Gly Val Arg Glu Ala Arg Ser 565 570 575 Gly <210> 3 <211> 1647 <212> DNA <213> Avian Influenze Virus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1647) <223> See Figure 10 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1647) <223> DNA sequence of the hemagglutinin (HA) gene of Avian Influenza Virus (AIV) A/turkey/Wisconsin/68 (H5N9). <400> 3 gaccaaatct gcatcggtta tcatgcaaac aattcaacaa aacaagttga cacaatcatg 60 gagaagaatg tgacggtcac acatgctcaa gatatactgg aaaaagagca caacgggaaa 120 ctctgcagtc tcaaaggagt gaggcccctc attctgaagg attgcagtgt ggctggatgg 180 cttcttggga acccaatgtg tgatgagttc ctaaatgtac cggaatggtc atatattgta 240 gagaaggaca atccaaccaa tggcttatgt tatccgggag acttcaatga ttatgaagaa 300 ctgaagtatt taatgagcaa cacaaaccat tttgagaaaa ttcaaataat ccctaggaac 360 tcttggtcca atcatgatgc ctcatcagga gtgagctcag catgcccata caatggtagg 420 tcttcctttt tcaggagtgt ggtgtggttg atcaagaaga gtaatgtata cccaacaata 480 aagaggacct acaataacac caatgtagag gaccttctga tattgtgggg aatccatcac 540 cctaatgatg cagcggaaca aacggaactc tatcagaact cgaacactta tgtgtctgta 600 ggaacatcaa cactaaatca gaggtcaatt ccagaaatag ctaccaggcc caaagtgaat 660 ggacaaagtg gaagaataga atttttctgg acaatactaa ggccgaacga tgcaatcagc 720 tttgaaagta atgggaactt tatagctcct gaatatgcat acaagatagt taaaaaggga 780 gattcagcaa tcatgagaag cgaactggag tatggcaact gtgataccaa atgtcagacc 840 ccagtgggtg ctataaattc cagtatgcct tttcacaatg ttcatcccct taccattgga 900 gagtgtccca aatatgtcaa atcagataaa ctggtccttg caacaggact gaggaacgtg 960 cctcagagag aaacaagagg tctgtttgga gcaatagcag gattcataga aggggggtgg 1020 caaggaatgg tagatggatg gtatggttac catcatagca acgagcaggg aagtggatat 1080 gctgcagaca aagagtccac tcagaaagca atcgacggga tcaccaataa agtcaactca 1140 atcattgaca aaatgaacac tcaattcgaa gccgttggga aagaattcaa caacttagaa 1200 aggagaatag aaaatttgaa taagaaaatg gaagatggat ttctagatgt atggacttac 1260 aatgcagaac ttctggtgct catggaaaat gaaagaactc tggatttcca tgattcatat 1320 gtcaagaacc tatacgataa ggtccgactc cagctgagag ataatgcaaa agaattgggc 1380 aatgggtgtt tggagttctc ccacaaatgt gacaatgaat gcatggaaag tgtgagaaac 1440 ggaacgtatg actatccaca atactcagaa gaatcaaggc tgaacagaga ggaaatagat 1500 ggagtcaaat tggagtcaat gggcacctat cagatactat caatttactc aacagtggcg 1560 agttccctag cactggcaat catggtagct ggtctgtctt tttggatgtg ctccaatgga 1620 tcattgcaat gcagaatttg catctag 1647 <210> 4 <211> 548 <212> PRT <213> Avian Influenze Virus <220> <221> misc_feature <223> See Figure 10. <220> <221> misc_feature <223> Protein sequence of the hemagglutinin (HA) gene of Avian Influenza Virus (AIV) A/turkey/Wisconsin/68 (H5N9). <400> 4 Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Lys Gln Val 1 5 10 15 Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile 20 25 30 Leu Glu Lys Glu His Asn Gly Lys Leu Cys Ser Leu Lys Gly Val Arg 35 40 45 Pro Leu Ile Leu Lys Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 50 55 60 Pro Met Cys Asp Glu Phe Leu Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val 65 70 75 80 Glu Lys Asp Asn Pro Thr Asn Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn 85 90 95 Asp Tyr Glu Glu Leu Lys Tyr Leu Met Ser Asn Thr Asn His Phe Glu 100 105 110 Lys Ile Gln Ile Ile Pro Arg Asn Ser Trp Ser Asn His Asp Ala Ser 115 120 125 Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Asn Gly Arg Ser Ser Phe Phe 130 135 140 Arg Ser Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Ser Asn Val Tyr Pro Thr Ile 145 150 155 160 Lys Arg Thr Tyr Asn Asn Thr Asn Val Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp 165 170 175 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Glu Leu Tyr Gln 180 185 190 Asn Ser Asn Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 195 200 205 Ser Ile Pro Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly 210 215 220 Arg Ile Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Arg Pro Asn Asp Ala Ile Ser 225 230 235 240 Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 245 250 255 Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Arg Ser Glu Leu Glu Tyr Gly 260 265 270 Asn Cys Asp Thr Lys Cys Gln Thr Pro Val Gly Ala Ile Asn Ser Ser 275 280 285 Met Pro Phe His Asn Val His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 290 295 300 Tyr Val Lys Ser Asp Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val 305 310 315 320 Pro Gln Arg Glu Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile 325 330 335 Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His 340 345 350 Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln 355 360 365 Lys Ala Ile Asp Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys 370 375 380 Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Asn Leu Glu 385 390 395 400 Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp 405 410 415 Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg 420 425 430 Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Tyr Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val 435 440 445 Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Leu 450 455 460 Glu Phe Ser His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn 465 470 475 480 Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ser Arg Leu Asn Arg 485 490 495 Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Thr Tyr Gln Ile 500 505 510 Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met 515 520 525 Val Ala Gly Leu Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys 530 535 540 Arg Ile Cys Ile 545 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(28) <223> PCR primer, CVM-Asc, used to end-tailor the constitutive cassava vein mosaic virus (CsVMV) promoter on pCP!H. <400> 5 atggcgcgcc agaaggtaat tatccaag 28 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> PCR primer, CVM-Xho, used to end-tailor the cassava vein mosaic virus (CsVMV) promoter on pCP!H. <400> 6 atctcgagcc atggtttgga tcca 24 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> Mutagenic primer used to create a Nco I site. <400> 7 tgccatggtg atgtgtggtc tacaa 25 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(23) <223> Forward primer complementary to the 5' region. <400> 8 gatctgacaa gtcaagaaaa ttg 23 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Synthetic sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(23) <223> Mutagenic primer used to create a XhoI I site. <400> 9 agctcgagct gtgtgagtga gtg 23 <210> 10 <211> 1368 <212> DNA <213> Infectious Bursal Disease Virus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1368) <223> See Figure 14. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1368) <223> DNA sequence of VP2 gene of Infectious Bursal Disease Virus. <400> 10 atgaccaacc tccaagatca aactcaacag attgttccct tcatacgcag ccttctcatg 60 ccaaccactg gacctgcttc cattcctgat gacaccttgg agaagcacac tctccgctct 120 gagacctcaa cctacaactt gactgttggt gacactggct ctgggttgat tgtctttttc 180 cctgggttcc ctggctccat tgtgggtgct cactacacat tgcagtccaa tggcaactac 240 aagtttgatc aaatgctctt gactgcccag aatcttccag cctcctacaa ctattgccgt 300 cttgtgtctc gctccctcac agtgaggtcc tcaacactcc ctggtggagt gtatgcactc 360 aatggcacca tcaacgcagt gactttccaa ggaagccttt cagaattgac tgatgtgagc 420 tacaatgggt tgatgtctgc aacagccaac atcaatgaca agattgggaa tgtccttgtt 480 ggagaaggag tcaccgtcct ctcactccca acatcctatg atcttggcta tgtgagactt 540 ggtgatccca ttcctgccat aggacttgat cccaaaatgg ttgccacatg tgacagctct 600 gatcgtccaa gggtttacac catcacagca gctgatgact accaattctc ctcacagtac 660 caagctggtg gagtcaccat cacactcttc tcagccaaca tagatgccat cacaagcctc 720 agcattggtg gagaacttgt ctttcagaca tctgtccaag ggctcatcct tggtgccacc 780 atctacttga ttggctttga tggcactgct gtcatcacca gagcagtggc tgcagacaat 840 gggctcacag ctggcactga caacctcatg ccattcaaca ttgtgattcc cacctctgag 900 atcacccagc caatcacttc catcaagttg gagatagtga cctcaaagtc cggtggacaa 960 gctggtgatc agatgtcctg gtctgcatct gggagcttgg ctgtgaccat tcatggtggc 1020 aactaccccg gagccctcag acctgtgact ttggttgcct atgaacgcgt tgcaactggc 1080 tctgttgtca ctgttgctgg tgtcagcaac tttgagttga tcccaaatcc tgaacttgca 1140 aagaacttgg tcacagagta tggaaggttt gaccctggtg ccatgaacta cacaaaattg 1200 atcctctcag agagggacag acttggcatc aagactgttt ggccaaccag agagtacact 1260 gacttccgcg agtacttcat ggaggttgct gacctcaaca gccctctcaa gatagctgga 1320 gcctttggtt tcaaagacat cataagggct attcgtcgca tcgctgtt 1368 <210> 11 <211> 1425 <212> DNA <213> Infectious Bursal Disease Virus <220> <221> misc_feature <223> Polynucleotide (DNA) encoding a variation of E/91 VP2 (structural protein from Infectious Bursal Disease Virus) <400> 11 agatctgaag acaacatgac caacctccaa gatcaaactc aacagattgt tcccttcata 60 cgcagccttc tcatgccaac cactggacct gcttccattc ctgatgacac cttggagaag 120 cacactctcc gctctgagac ctcaacctac aacttgactg ttggtgacac tggctctggg 180 ttgattgtct ttttccctgg gttccctggc tccattgtgg gtgctcacta cacattgcag 240 tccaatggca actacaagtt tgatcaaatg ctcttgactg cccagaatct tccagcctcc 300 tacaactatt gccgtcttgt gtctcgctcc ctcacagtga ggtcctcaac actccctggt 360 ggagtgtatg cactcaatgg caccatcaac gcagtgactt tccaaggaag cctttcagaa 420 ttgactgatg tgagctacaa tgggttgatg tctgcaacag ccaacatcaa tgacaagatt 480 gggaatgtcc ttgttggaga aggagtcacc gtcctctcac tcccaacatc ctatgatctt 540 ggctatgtga gacttggtga tcccattcct gccataggac ttgatcccaa aatggttgcc 600 acatgtgaca gctctgatcg tccaagggtt tacaccatca cagcagctga tgactaccaa 660 ttctcctcac agtaccaagc tggtggagtc accatcacac tcttctcagc caacatagat 720 gccatcacaa gcctcagcat tggtggagaa cttgtctttc agacatctgt ccaagggctc 780 atccttggtg ccaccatcta cttgattggc tttgatggca ctgctgtcat caccagagca 840 gtggctgcag acaatgggct cacagctggc actgacaacc tcatgccatt caacattgtg 900 attcccacct ctgagatcac ccagccaatc acttccatca agttggagat agtgacctca 960 aagtccggtg gacaagctgg tgatcagatg tcctggtctg catctgggag cttggctgtg 1020 accattcatg gtggcaacta ccccggagcc ctcagacctg tgactttggt tgcctatgaa 1080 cgcgttgcaa ctggctctgt tgtcactgtt gctggtgtca gcaactttga gttgatccca 1140 aatcctgaac ttgcaaagaa cttggtcaca gagtatggaa ggtttgaccc tggtgccatg 1200 aactacacaa aattgatcct ctcagagagg gacagacttg gcatcaagac tgtttggcca 1260 accagagagt acactgactt ccgcgagtac ttcatggagg ttgctgacct caacagccct 1320 ctcaagatag ctggagcctt tggtttcaaa gacatcataa gggctattcg tcgcatcgct 1380 gtttgagtag ttagcttaat cacctagagc tcggtcacca gatct 1425 <210> 12 <211> 456 <212> PRT <213> Infectious Bursal Disease Virus <220> <221> misc_feature <223> Polypeptide variation of E/91 VP2 (structural protein from Infectious Bursal Disease Virus) encoded by SEQ ID NO: 11. <400> 12 Met Thr Asn Leu Gln Asp Gln Thr Gln Gln Ile Val Pro Phe Ile Arg 1 5 10 15 Ser Leu Leu Met Pro Thr Thr Gly Pro Ala Ser Ile Pro Asp Asp Thr 20 25 30 Leu Glu Lys His Thr Leu Arg Ser Glu Thr Ser Thr Tyr Asn Leu Thr 35 40 45 Val Gly Asp Thr Gly Ser Gly Leu Ile Val Phe Phe Pro Gly Phe Pro 50 55 60 Gly Ser Ile Val Gly Ala His Tyr Thr Leu Gln Ser Asn Gly Asn Tyr 65 70 75 80 Lys Phe Asp Gln Met Leu Leu Thr Ala Gln Asn Leu Pro Ala Ser Tyr 85 90 95 Asn Tyr Cys Arg Leu Val Ser Arg Ser Leu Thr Val Arg Ser Ser Thr 100 105 110 Leu Pro Gly Gly Val Tyr Ala Leu Asn Gly Thr Ile Asn Ala Val Thr 115 120 125 Phe Gln Gly Ser Leu Ser Glu Leu Thr Asp Val Ser Tyr Asn Gly Leu 130 135 140 Met Ser Ala Thr Ala Asn Ile Asn Asp Lys Ile Gly Asn Val Leu Val 145 150 155 160 Gly Glu Gly Val Thr Val Leu Ser Leu Pro Thr Ser Tyr Asp Leu Gly 165 170 175 Tyr Val Arg Leu Gly Asp Pro Ile Pro Ala Ile Gly Leu Asp Pro Lys 180 185 190 Met Val Ala Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile 195 200 205 Thr Ala Ala Asp Asp Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Tyr Gln Ala Gly Gly 210 215 220 Val Thr Ile Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala Ile Thr Ser Leu 225 230 235 240 Ser Ile Gly Gly Glu Leu Val Phe Gln Thr Ser Val Gln Gly Leu Ile 245 250 255 Leu Gly Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly Thr Ala Val Ile 260 265 270 Thr Arg Ala Val Ala Ala Asp Asn Gly Leu Thr Ala Gly Thr Asp Asn 275 280 285 Leu Met Pro Phe Asn Ile Val Ile Pro Thr Ser Glu Ile Thr Gln Pro 290 295 300 Ile Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr Ser Lys Ser Gly Gly Gln 305 310 315 320 Ala Gly Asp Gln Met Ser Trp Ser Ala Ser Gly Ser Leu Ala Val Thr 325 330 335 Ile His Gly Gly Asn Tyr Pro Gly Ala Leu Arg Pro Val Thr Leu Val 340 345 350 Ala Tyr Glu Arg Val Ala Thr Gly Ser Val Val Thr Val Ala Gly Val 355 360 365 Ser Asn Phe Glu Leu Ile Pro Asn Pro Glu Leu Ala Lys Asn Leu Val 370 375 380 Thr Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ala Met Asn Tyr Thr Lys Leu 385 390 395 400 Ile Leu Ser Glu Arg Asp Arg Leu Gly Ile Lys Thr Val Trp Pro Thr 405 410 415 Arg Glu Tyr Thr Asp Phe Arg Glu Tyr Phe Met Glu Val Ala Asp Leu 420 425 430 Asn Ser Pro Leu Lys Ile Ala Gly Ala Phe Gly Phe Lys Asp Ile Ile 435 440 445 Arg Ala Ile Arg Arg Ile Ala Val 450 455 <210> 13 <211> 42 <212> DNA <213> Infectious Bursal Disease Virus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> DNA sequence encoding translation termination ("Stop") codons, used to terminate translation of inadvertant open reading frames following DNA integration during transformation (includes Sac I BstE II, and Bgl II restriction enzyme recogniton sites). <400> 13 tgagtagtta gcttaatcac ctagagctcg gtcaccagat ct 42

Claims

단백질 제제를 생산하는 식물세포배양으로서,

a) 단백질 제제를 암호화하는 트랜스제닉(transgenic) 유전자를 발현하도록 안정적으로 형질전환된 식물 세포주;

b) 상기 식물세포배양의 생장은 지원하지만, 마이코플라즈마타케아(Mycoplasmataceae)의 생장은 지원하지 않으며, 동물 유래 원료물질을 포함하지 않는 생장배지; 를 포함하고,

여기서 상기 식물 세포주는 지속적으로 계대될 수 있어서 계대 중에 트랜스제닉 유전자 발현이 지속되고, 여기서 상기 식물 세포주는 동결보존될 수 있어서 동결보존으로부터 회복시에 트랜스제닉 유전자 발현이 회수되는 것을 만족하는, 식물세포배양.
제1항에 있어서,

상기 형질전환된 식물 세포주는 하등식물 세포주, 쌍자엽식물 세포주 또는 단자엽식물 세포주인 것을 만족하는, 식물세포배양.
제2항에 있어서,

상기 형질전환된 식물 세포주는 쌍자엽성인 것을 만족하는, 식물세포배양.
제3항에 있어서,

상기 형질전환된 식물 세포주는 담배 세포주인 것을 만족하는, 식물세포배양.
제4항에 있어서,

상기 담배 세포주는 NT-1 또는 BY-2 중에서 선택되는 것을 만족하는, 식물세포배양.
제3항에 있어서,

상기 쌍자엽성 형질전환된 식물 세포주는 토마토, 감자, 고구마, 카사바(cassava), 알팔파(alfalfa)와 콩(soybean)을 포함한 두류(legumes), 당근, 딸기, 양상치(lettuce), 떡갈나무(oak), 단풍나무(maple), 땅콩, 장미, 민트, 해바라기, 홍화(safflower), 목화, 담배, 스쿼시(squash), 데이지(daisy), 카놀라(canola), 또는 선인장으로 이루어진 그룹에서 선택되는 식물로부터 유도되는 것을 만족하는, 식물세포배양.
제2항에 있어서,

상기 형질전환된 단자엽식물 세포주는 밀, 잔디, 잔디밭, 곡물, 옥수수(maize) 또는 콘(corn), 벼(rice), 귀리(oat), 밀, 보리(barley), 수수(sorghum), 난(orchid), 아이리스, 백합, 양파, 바나나, 사탕수수(sugarcane), 수수, 및 팜(palm)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 식물로부터 유도되는 것을 만족하는, 식물세포배양.
제2항에 있어서,

상기 형질전환된 하등식물 세포주는 양치류(ferns), 겉씨식물(gymnosperms), 송백류(conifers), 속새류(horsetails), 석송류(club mosses), 우산이끼류(liver warts), 뿔이끼류(hornworts), 이끼류(mosses), 홍조류(red algaes), 갈조류(brown algaes), 포자식물(pteridophytes)의 배우체(gametophytes), 포자체(sporophytes), 또는 녹조류(green algae)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 것으로부터 유도되는 것을 만족하는, 식물세포배양.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 단백질 제제는 조류 바이러스로부터의 단백질인 것을 만족하는, 식물세포배양.
제9항에 있어서,

상기 단백질은 뉴캐슬 질병 바이러스(NDV)로부터의 헤마그글루티닌/뉴라미니다아제 단백질, 조류인플루엔자 바이러스(AIV)로부터의 헤마그글루티닌 단백질, 또는 전염성 낭병 바이러스로부터의 VP2 단백질인 것을 만족하는, 식물세포배양.
제9항에 있어서,

상기 단백질은 서열목록번호: 2, 서열목록번호: 4 또는 서열목록번호: 12를 포함하는 것을 만족하는, 식물세포배양.