CN111165357B - 一种抑制玉蝉花愈伤组织增殖过程中内生菌污染的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抑制玉蝉花愈伤组织增殖过程中内生菌污染的方法。该抑制玉蝉花愈伤组织增殖过程中内生菌污染的方法包括采用镊子夹住出现内生菌的愈伤，在无菌滤纸上将其上的内生菌粘液蹭除，再将处理好的愈伤接种在添加了浓度为100mg/L的青霉素G钠溶液的增殖培养基上，培养30d，将成功抑菌后的愈伤再次接入无青霉素G钠溶液的增殖培养基中进行培养。该方法具有高效的杀菌、抑菌作用，抑制了玉蝉花愈伤组织增殖过程中的内生菌污染的现象，抑菌率达到86.67％，且愈伤健康，能够保证玉蝉花愈伤组织正常生长，成功解决玉蝉花愈伤组织增殖过程中内生菌难以去除的瓶颈问题。

Description

一种抑制玉蝉花愈伤组织增殖过程中内生菌污染的方法
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及到一种抑制玉蝉花愈伤组织增殖过程中内生菌污染的方法。
背景技术
玉蝉花(Iris ensata Thunb.)是鸢尾科，鸢尾属多年生草本花卉，性喜水湿，宜栽于浅水当中；土壤条件较好的旱生条件下也能正常生长。每年6、7月份开花，连续花期较长；叶片青翠似剑，绿期长。其品种繁多，花型花色丰富，适应性强，是绿化、美化香化城市，装饰花坛、花径、花带、路旁及草坪的优良植物材料，在园林绿化中有多种应用形式，正越来越受到人们的青睐。
专利CN102524081A公开了一种玉蝉花的组织培养方法，具体包括组织培养过程中初代培养、继代培养、增殖培养、生根培养以及炼苗移栽的步骤，但是没有涉及到愈伤组织增殖过程中产生的内生菌污染现象的处理方法。
目前虽然已有玉蝉花组织培养的相关研究开展，但仍存在愈伤组织增殖过程中出现透明且带有黏性的内生菌污染的情况，针对这一问题，我们经过实验研究，提供了一种抑制玉蝉花愈伤组织增殖过程中内生菌污染的方法，为玉蝉花再生体系的建立提供了帮助，对实现玉蝉花组培苗生产和优质种苗的提供具有重要现实意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抑制玉蝉花愈伤组织增殖过程中内生菌污染的方法，其减少了内生菌在玉蝉花愈伤组织增殖过程中的污染问题，愈伤组织的抑菌率高、增殖率高。
为实现上述目的,在本发明的一个实施方案中,本发明提供了一种抑制玉蝉花愈伤组织增殖过程中内生菌污染的方法，该方法包括：用镊子夹住出现内生菌的愈伤，在无菌滤纸上将其上的内生菌粘液蹭除，再将处理好的愈伤接种在添加了100mg/L青霉素G钠溶液的增殖培养基上，培养30d，将成功抑菌后的愈伤再次接入无青霉素G钠溶液的增殖培养基中进行培养；
在本发明的一个优选实施方案中,本发明提供了一种抑制玉蝉花愈伤组织增殖过程中的内生菌污染的方法，所述所述100mg/L青霉素G钠溶液的配制方法包括：称取100mg的粉状青霉素G钠，溶于无菌水中，最后定容至1L,制得浓度为100mg/L的青霉素G钠溶液；
在本发明的一个优选实施方案中,本发明提供了一种抑制玉蝉花愈伤组织增殖过程中的内生菌污染的方法，所述固体增殖培养基包括：MS+0.2mg/L 6-BA+0.1mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，培养基的pH值均调节至5.8～6.0；
在本发明的一个优选实施方案中，本发明提供了一种抑制玉蝉花愈伤组织增殖过程中的内生菌污染的方法，所述培养条件包括：培养室的培养温度为25±1℃、光照时间为14h/d、光照强度为25μmol/ (m2.s)。
附图说明
图1不同的抑菌剂抑制愈伤内生菌的效果。
具体实施方式
下面对本发明的技术方案作进一步进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施1：青霉素G钠对玉蝉花愈伤组织的影响。
本实施例中玉蝉花愈伤组织采用固体增殖培养基进行培养，用镊子夹住在愈伤增殖过程中出现透明且带有黏性的内生菌的愈伤，在无菌滤纸上的内生菌粘液蹭除，再将处理好的愈伤接种在添加了不同浓度的青霉素G钠的培养基上。其中固体增殖培养基的配方包括：MS+0.2mg/L 6-BA+0.1mg/L 2,4-D+30 g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，培养基的pH值均调节至5.8～6.0。
由如下表1可看出，当青霉素G钠浓度为100mg/L时，抑菌率为87％，愈伤黄色，无内生菌，健康；当青霉素G钠浓度为200mg/L时，抑菌率为80％，愈伤黄色，少部分白化；当青霉素G钠浓度为 300mg/L时，抑菌率为80％，愈伤黄色，颗粒硬化。
青霉素G钠100mg/L与200mg/L和300mg/L时的处理抑菌差异明显，而后两种浓度的处理抑菌差异不明显，同时愈伤状态变差。因此，青霉素G钠浓度为100mg/L时，达到最佳抑菌效果。
表1不同浓度的青霉素G钠对玉蝉愈伤组织的影响
青霉素G钠浓度(mg/L) 接种数量 抑菌率(％) 愈伤生长状况
100 20 86.67±6.67a 黄色无内生菌愈伤健康
200 20 80±11.55b 黄色少部分白化
300 20 80±11.55b 黄色颗粒硬化
实施2：羧苄青霉素对玉蝉花愈伤组织的影响
实施例中玉蝉花愈伤组织采用固体增殖培养基进行培养，用镊子夹住在愈伤增殖过程中出现透明且带有黏性的内生菌的愈伤，在无菌滤纸上的内生菌粘液蹭除，再将处理好的愈伤接种在添加了不同浓度的羧苄青霉素的培养基上。其中固体培养基的配方包括：MS+0.2mg/L 6-BA+0.1mg/L 2,4-D+30g/L 蔗糖+3.5g/L琼脂，培养基的pH值均调节至5.8～6.0。
由如下表2可看出，当羧苄青霉素浓度为50mg/L和100mg/L时，抑菌率为0，愈伤黄色，基部布满内生菌，颗粒不明显；羧苄青霉素浓度为200mg/L时，抑菌率为100％，愈伤白化，状态差，被毒害。
因此，当羧苄青霉素浓度较低时，无抑菌效果，当羧苄青霉素浓度较高时，抑菌率较高，但不利于愈伤组织的生长，因此，羧苄青霉素无法作为玉蝉花愈伤组织增殖过程中的抑菌剂。
表2不同浓度的羧苄青霉素对玉蝉愈伤组织的影响
羧苄青霉素浓度(mg/L) 接种数量 抑菌率(％) 愈伤生长状况
50 20 0.00±0.00b 黄色基部布满内生菌颗粒不明显
100 20 0.00±0.00b 黄色基部布满内生菌颗粒不明显
200 20 100.00±0.00a 白化状态差毒害
实施3：卡那霉素对玉蝉花愈伤组织的影响
实施例中玉蝉花愈伤组织采用固体增殖培养基进行培养，用镊子夹住在愈伤增殖过程中出现透明且带有黏性的内生菌的愈伤，在无菌滤纸上的内生菌粘液蹭除，再将处理好的愈伤接种在添加了不同浓度的卡那霉素的培养基上。其中固体培养基的配方包括：MS+0.2mg/L 6-BA+0.1mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，培养基的pH值均调节至5.8～6.0。
由如下表3可看出，当卡那霉素浓度为25mg/L时，抑菌率为0，愈伤浅黄，状态差；当卡那霉素浓度为50mg/L时，抑菌率为47％，初期培养基内有少量内生菌生长，后期愈伤组织全部死亡；当卡那霉素浓度为75mg/L时，抑菌率为100％，初期培养基内无内生菌生长，后期愈伤组织全部死亡。
卡那霉素的三个浓度抑菌效果差异显著，抑菌效果随着浓度增加而增强，但是从愈伤生长情况可以知道卡那霉素对愈伤具有毒害作用，会使其状态变差、颜色变淡直至死亡。因此，卡那霉素无法作为玉蝉花愈伤组织增殖过程中的抑菌剂。
表3不同浓度的卡那霉素对玉蝉愈伤组织的影响
卡那霉素浓度(mg/L) 接种数量 抑菌率(％) 愈伤生长状况
25 20 0.00±0.00c 浅黄状态差
50 20 46.67±1.67b 初期少量内生菌生长后期全部死亡
75 20 100.00±0.00a 初期无内生菌生长后期全部死亡
总之，增殖培养基MS+6-BA 0.5mg/L+2,4-D 0.5mg/L+青霉素G钠100mg/L是愈伤增殖过程中抑菌的适宜培养基，抑菌率为86.67％。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (4)

1.一种抑制玉蝉花愈伤组织增殖过程中内生菌污染的方法，其特征在于，所述方法包括：用镊子夹住出现内生菌的愈伤，在无菌滤纸上将 内生菌粘液蹭除，再将处理好的愈伤接种在添加了100mg/L青霉素G钠溶液的增殖培养基上，培养30d，将成功抑菌后的愈伤再次接入无青霉素G钠溶液的增殖培养基中进行培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述100mg/L青霉素G钠溶液的配制方法包括：称取100mg的粉状青霉素G钠，溶于无菌水中，最后定容至1L,制得浓度为100mg/L的青霉素G钠溶液。
3.根据权利要求 1所述的方法，其特征在于，所述增殖培养基包括：MS+0.2mg/L 6-BA+0.1mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，培养基的pH值均调节至5.8～6.0。
4.根据权利要求 1所述的方法，其特征在于，培养条件包括：培养室的培养温度为25±1℃、光照时间为14h/d、光照强度为25μmol/(m2.s)。
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