CN115191448B - 防治烟草花叶病毒的微生物植物提取物复合剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种防治烟草花叶病毒的微生物植物提取物复合剂和应用。微生物植物提取物复合剂，包括植物提取物和益生菌菌粉；所述益生菌为纳豆芽孢杆菌CCTCC M 2019025；所述植物提取物为苦参提取物或者塞隆骨提取物。本发明提供的微生物植物提取物复合剂用于抑制烟草花叶病毒，防治烟草花叶病。本发明的实验结果显示，纳豆芽孢杆菌与苦参提取物复合后，对烟草花叶病毒具有不错的防治效果。

Description

防治烟草花叶病毒的微生物植物提取物复合剂及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种防治烟草花叶病毒的微生物植物提取物复合剂和应用。
背景技术
烟草花叶病毒(Tobacco_mosaic virus；TMV)是一种RNA病毒，专门感染植物，尤其是烟草植物，能使这些受感染的叶片看来斑驳污损，因此得名(mosaic为马赛克，也就是拼贴之意)。该病毒于1930年左右被发现存在，是烟草花叶病等的病原体，属于Tobamovirus群。烟草花叶病毒所感染的烟草花叶病严重危害烟叶产量和品质，常造成巨大的经济损失，成为优质烟叶生产的制约因素之一。因此，寻找一种经济、有效的烟草花叶病防治措施成为烟草生产上的迫切任务。
现有技术中，烟草花叶病的防治主要包括下列措施：
(1)开发新的抗病性强的烟草品种：该方式可以从根本上防治烟草花叶病毒，无需外源添加消灭病毒的制剂，但是新品种的筛选需要花费好多年的时间，并且需要耗费大量的人力和物力资源，目前抗病性特别强的烟草品种仍然欠缺，烟草花叶病仍然广泛存在。
(2)农业防治：通过科学管理烟田、注意田间卫生、种子消毒、轮作等方法来减少烟草花叶病毒的积累，尽可能选择病毒较少或者无病毒的区域种植烟草。目前已经发现了可以用于抑制烟草花叶病毒的抑制剂，张廷金等人(张廷金,余青,莫笑晗,等.几种新型烟草花叶病毒抑制剂的田间药效试验[J].昆明学院学报,2010,032(006):20-22)的研究结果显示，含1％3-丙酮基-3-羟基羟吲哚二甲基亚砜溶液1 000倍液,含0.4％苦木素的2％3-丙酮基-3-羟基羟吲哚微乳液500倍液两种制剂在接种烟草花叶病毒4周后仍然保持44.04％和47.71％的相对防效，这两种制剂对于烟草花叶病毒有不错的防治效果。农业防治的方法可以弥补烟草品种抗病力差的缺陷。
但是，上述“3-丙酮基-3-羟基羟吲哚二甲基亚砜溶液”与“3-丙酮基-3-羟基羟吲哚微乳液”均属于化学成分的病毒抑制剂，长期使用会导致土壤结构的破坏，现有技术已有许多过量施肥、施肥不当等原因导致的土壤板结问题，所以，仍需要开发新的烟草花叶病毒抑制剂，以满足烟草花叶病的防治需求。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种防治烟草花叶病毒的微生物植物提取物复合剂和应用，是有多种微生物复合而成的菌剂，能够抑制烟草花叶病毒，防治烟草花叶病。
本发明的目的是提供一种防治烟草花叶病毒的微生物植物提取物复合剂，包括植物提取物和益生菌菌粉；所述益生菌为纳豆芽孢杆菌CCTCC M 2019025；
所述植物提取物为苦参提取物或者塞隆骨提取物。
优选的，上述防治烟草花叶病毒的微生物植物提取物复合剂，所述植物提取物和益生菌菌粉的质量比例为1-10:1-10。
优选的，上述防治烟草花叶病毒的微生物植物提取物复合剂，所述植物提取物和益生菌菌粉的质量比例为5:1。
优选的，上述防治烟草花叶病毒的微生物植物提取物复合剂，制备苦参提取物的方法如下：
1)取新鲜苦参的根，洗净，通风干燥，粉碎成粉末；
2)粉末浸泡于40-55％乙醇溶液中，粉末与乙醇溶液的料液比为1:8-10，常温搅拌2h以上(优选的时间为2-4h)，过滤；
3)重复2)的步骤若干次，合并多次的滤液，浓缩，干燥，得到苦参提取物。
优选的，上述防治烟草花叶病毒的微生物植物提取物复合剂，塞隆骨提取物的制备步骤包括：
1)中药材塞隆骨粉碎成粉末；
2)粉末浸泡于70％乙醇溶液中，粉末与乙醇溶液的料液比为1:8-10，常温搅拌2h以上(优选的时间为2-4h)，过滤；
3)重复2)的步骤若干次，合并多次的滤液，浓缩，干燥，得到塞隆骨提取物。
优选的，上述防治烟草花叶病毒的微生物植物提取物复合剂，纳豆芽孢杆菌菌粉按照如下方法制备：将纳豆芽孢杆菌CCTCC M 2019025菌种活化，接种于营养肉汤培养基中培养60h以上(优选的时间为60-72h)，干燥，得到纳豆芽孢杆菌菌粉。
本发明还提供了一种上述防治烟草花叶病毒的微生物植物提取物复合剂的应用，所述微生物植物提取物复合剂用于抑制烟草花叶病毒，防治烟草花叶病。
优选的，上述防治烟草花叶病毒的微生物植物提取物复合剂，所述微生物植物提取物复合剂用于防治烤烟的烟草花叶病。
优选的，上述防治烟草花叶病毒的微生物植物提取物复合剂，所述微生物植物提取物复合剂用于抑制烟草花叶病毒U1株和U5株。
优选的，上述防治烟草花叶病毒的微生物植物提取物复合剂，防治烤烟的烟草花叶病的方法为：向烤烟叶片喷施微生物植物提取物复合剂的50倍稀释液。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、烟草花叶病毒是一种RNA病毒，基于此特点，本发明开发了一种防治烟草花叶病毒的微生物植物提取物复合剂，在这个复合剂中，植物来源于苦参的干燥的根，苦参根含有苦参碱和金雀花碱，具有抗菌的效果，目前尚未发现其用于抑制烟草花叶病毒。本发明研究了苦参提取物对于烟草花叶病毒的作用，研究发现，在较低剂量下，苦参对于烟草花叶病毒的抑制作用较少，苦参提取物浓度的增加，其对烟草花叶病毒的抑制作用也逐渐增加，最后趋于一个相对稳定的水平。
塞隆骨的传统作用是治疗风湿病骨病等(比如市售的塞隆风湿酒产品)，具有一定的抗炎效果，但是在本发明以前，未见其用于植物病害的研究，本发明研究了塞隆骨的抗烟草花叶病毒的效果，结果显示塞隆骨提取物具有一定的抑制烟草花叶病毒的效果。
纳豆芽孢杆菌CCTCC M 2019025(记载于专利CN112206243A中)是一种益生菌，研究发现其可以提高机体免疫力，调节人体胃肠道菌群平衡，但是并没有学者将该菌用来进行烟草花叶病的防治，微生物防治植物病已经是一种趋势，本发明将纳豆芽孢杆菌CCTCC M2019025与植物提取物(苦参提取物或者塞隆提取物)进行的联合，研究了对烟草花叶病毒的抑制效果以及对烟草花叶病的防治效果。结果显示，纳豆芽孢杆菌与苦参提取物复合后，对烟草花叶病毒具有不错的防治效果。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
1、材料
(1)在本发明的描述中，如未特殊说明，所用试剂均为市售，所用方法均为本领域常规技术。
(2)苦参提取物的制备步骤包括：1)取新鲜苦参的根，洗净，自然环境温度通风干燥，粉碎成80目粉末；2)粉末浸泡于50％乙醇溶液中，粉末与乙醇溶液的料液比为1:8，常温搅拌2h，过滤；3)重复2)的步骤2次，合并三次的滤液，40℃旋转蒸发浓缩至体积变为滤液总体积的1/20，40℃烘干，得到苦参提取物。
(3)塞隆骨提取物的制备步骤包括：1)购买中药材塞隆骨，粉碎成80目粉末；2)粉末浸泡于70％乙醇溶液中，粉末与乙醇溶液的料液比为1:8，常温搅拌2h，过滤；3)重复2)的步骤2次，合并三次的滤液，40℃旋转蒸发浓缩至体积变为滤液总体积的1/20，40℃烘干，得到塞隆骨提取物。
(4)纳豆芽孢杆菌菌粉的制备：将纳豆芽孢杆菌CCTCC M 2019025菌种活化，接种于营养肉汤培养基中，30℃培养60h，-20℃冷冻干燥，得到纳豆芽孢杆菌菌粉。
(5)烟草花叶病毒：
U1株系(张廷金,余青,莫笑晗,等.几种新型烟草花叶病毒抑制剂的田间药效试验[J].昆明学院学报,2010,032(006):20-22)。
U5株系(丁铭.云南烟草花叶病毒株系研究[D].云南大学)。
(6)烤烟品种：秦烟99。
K326：是美国诺斯朴〃金种子公司(Northup King Seed Company)用McNair 225(McNair30×NC95)杂交选育而成，1985年从美国引进云南省，1988年经云南省农作物品种审定委员会审定为推广品种1986～1988年参加全国烤烟良种区域试验，1989年全国烟草品种审定委员会审定为全国推广良种。
2、微生物植物提取物复合剂配方
配方1：苦参提取物与纳豆芽孢杆菌菌粉按照1:1的质量比例混合；
配方2：苦参提取物与纳豆芽孢杆菌菌粉按照1:5的质量比例混合；
配方3：苦参提取物与纳豆芽孢杆菌菌粉按照1:10的质量比例混合；
配方4：苦参提取物与纳豆芽孢杆菌菌粉按照5:1的质量比例混合；
配方5：苦参提取物与纳豆芽孢杆菌菌粉按照10:1的质量比例混合；
配方6：塞隆骨提取物与纳豆芽孢杆菌菌粉按照1:1的质量比例混合；
配方7：塞隆骨提取物与纳豆芽孢杆菌菌粉按照1:5的质量比例混合；
配方8：塞隆骨提取物与纳豆芽孢杆菌菌粉按照1:10的质量比例混合；
配方9：塞隆骨提取物与纳豆芽孢杆菌菌粉按照5:1的质量比例混合；
配方10：塞隆骨提取物与纳豆芽孢杆菌菌粉按照10:1的质量比例混合；
配方11：苦参提取物；
配方12：塞隆骨提取物；
配方13：纳豆芽孢杆菌菌粉。
上述各配方均采用50倍稀释液，用于实验。
3、实验方法与结果(不同配方对不同品种心叶烟的抑制作用结果)
(1)制备毒液
毒液制备参照“封立平,陈长法,孙伟,等.电化学酶联免疫分析法检测烟草花叶病毒和烟草环斑病毒[J].检验检疫科学,2003.”2.1.1的方法进行。下述所有实验采用相同浓度的毒液。
由于烟草花叶病毒在体外的稳定性强，不易消杀，所以我们直接进行光照培养箱防效试验，用烟草花叶病毒直接作用于烤烟，观察发病情况。
(2)接种毒液
将K326和秦烟99两个烤烟品种分别在光照培养箱中培养(环境湿度为70％)，长到5-6片真叶的时候，停止培养，取长势相近的多个烟株，在健康的心叶烟叶片表面上接种试剂(每个叶片蘸上100μL的毒液)，然后将烟株在光照培养箱中培养(环境湿度为70％，光照16h/d，光照强度2000lux)，叶片生长温度控制在25-27℃(该温度是烟草花叶病毒的适宜温度)。
接种试剂的方法采用“金光辉.植物源抗烟草花叶病毒活性物质的筛选,分离及抗病机理初探[D].郑州烟草研究院；中国烟草总公司郑州烟草研究院,2010”的方法进行，并测试不同配方对烟草花叶病毒的抑制效果。n＝5(也就是每个配方进行5个平行试验，取平均值)。
抑制效果(％)＝(左半叶的枯斑数-右半叶的枯斑数)/左半叶的枯斑数×100。
注意，接种的试剂为毒液与水按照1mL:10μg的比例混合，作为阳性对照，接种至左半叶；接种的试剂为毒液与配方物质1mL:10μg的混合物，作为实验组，接种至右半叶。
(3)实验结果
从表1的结果可以看出，当苦参提取物与纳豆芽孢杆菌复合时，病毒抑制效果最好，苦参提取物含量的增加，病毒的抑制效果也成增加的趋势，到配方4以及配方5的比例时，趋于平稳。对于塞隆骨提取物与纳豆芽孢杆菌复合时，也比单独施用塞隆骨提取物或者纳豆芽孢杆菌的抑制效果好。
表1是不同配方对不同品种心叶烟的U1株系抑制作用结果
Figure BDA0003795537620000071
鉴于表1的结果中，苦参提取物与纳豆芽孢杆菌复合的效果较优，且苦参苦参提取物对病毒的抑制效果优于塞隆骨提取物，所以表2中，我们仅以配方1-5以及配方11和配方13进行实验，结果显示，对于U5株系，
表2是不同配方对不同品种心叶烟的U5株系抑制作用结果
Figure BDA0003795537620000072
Figure BDA0003795537620000081
表1和表2的结果显示，苦参提取物、塞隆提取物以及纳豆芽孢杆菌均对烟草花叶病毒具有抑制作用。
4、实验方法与结果(不同接种量对不同品种心叶烟的抑制作用结果)
(1)制备毒液
毒液制备参照上述3(1)的方法进行。下述所有实验采用相同浓度的毒液。
(2)接种毒液
参照上述3(2)的方法进行。
注意，接种试剂采用配方4，接种浓度设置如下：
组别1：接种的试剂为：毒液与水按照1mL:1μg的比例混合，作为阳性对照，接种至左半叶；接种的试剂为毒液与配方物质1mL:1μg的混合物，作为实验组，接种至右半叶；
组别2：接种的试剂为：毒液与水按照1mL:10μg的比例混合，作为阳性对照，接种至左半叶；接种的试剂为毒液与配方物质1mL:10μg的混合物，作为实验组，接种至右半叶；
组别3：接种的试剂为：毒液与水按照1mL:50μg的比例混合，作为阳性对照，接种至左半叶；接种的试剂为：毒液与配方物质1mL:50μg的混合物，作为实验组，接种至右半叶。
抑制效果(％)＝(左半叶的枯斑数-右半叶的枯斑数)/左半叶的枯斑数×100。
表3是不同配方对不同品种心叶烟的U1株系抑制作用结果
Figure BDA0003795537620000082
表4是不同配方对不同品种心叶烟的U5株系抑制作用结果
Figure BDA0003795537620000091
表3和表4的结果显示，随着配方物质用量的提高，对烟草花叶病毒的抑制作用呈现增加的趋势，但是后面趋于平缓。
5、实验方法与结果(田间防效实验)
参照“张廷金,余青,莫笑晗,等.几种新型烟草花叶病毒抑制剂的田间药效试验[J].昆明学院学报,2010,032(006):20-22”的方法进行田间防效实验，本发明与该方法的区别是，我们采用的试剂为配方4，上述各配方均采用50倍稀释液，用于实验。
含1％3-丙酮基-3-羟基羟吲哚二甲基亚砜溶液1 000倍液作为药物对照。
单纯接种毒液作为病毒对照。
注意，配方4、药物对照以及病毒对照均需接种毒液。
空白对照仅接种无菌水。
调差所有烟株的发病情况，病级指数如下：
0级：全株无病；
1级，心叶脉明或轻微花叶，或上部1/3叶片花叶但不变形，植株无明显矮化；
2级，1/3-1/2叶片花叶，或少数叶片变形，或者主脉变黑，植株矮化为正常株高的2/3以上；
3级，1/2-2/3叶片花叶，或变形或主侧脉坏死，或者植株矮化为正常株高的1/2-2/3；
4级，全株叶片花叶，严重变形或坏死，病株矮化为正常株高的1/3-1/2。
发病率的计算参照张廷金等人的方法进行。
发病率结果参见表5，结果显示，配方4的50倍稀释液效果与含1％3-丙酮基-3-羟基羟吲哚二甲基亚砜溶液1 000倍液的防治效果相当，随着接种时间的延长，配方4的50倍稀释液的发病率增加缓慢。
表5发病率测试结果
1周 2周 3周 4周 5周
样品 24.6 35.7 40.6 48.3 51.4
药物对照 22.4 32.8 41.8 52.3 60.1
病毒对照 43.8 66.1 78.4 88.4 95.8
空白对照 0 0 0 1.5 3.3
需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (6)

1.防治烟草花叶病毒的微生物提取物复合剂，其特征在于，包括提取物和益生菌菌粉；所述益生菌为纳豆芽孢杆菌CCTCC M 2019025；
所述提取物为苦参提取物或者塞隆骨提取物；
其中，苦参提取物和益生菌菌粉的质量比例为1-10:1-10；
塞隆骨提取物和益生菌菌粉的质量比例为5:1或者10:1；
制备苦参提取物的方法如下：
1)取新鲜苦参的根，洗净，通风干燥，粉碎成粉末；
2)粉末浸泡于40-55％乙醇溶液中，粉末与乙醇溶液的料液比为1:8-10，常温搅拌2h以上，过滤；
3)重复2)的步骤若干次，合并多次的滤液，浓缩，干燥，得到苦参提取物；
塞隆骨提取物的制备步骤包括：
1)中药材塞隆骨粉碎成粉末；
2)粉末浸泡于70％乙醇溶液中，粉末与乙醇溶液的料液比为1:8-10，常温搅拌2h以上，过滤；
3)重复2)的步骤若干次，合并多次的滤液，浓缩，干燥，得到塞隆骨提取物。
2.根据权利要求1所述的防治烟草花叶病毒的微生物提取物复合剂，其特征在于，纳豆芽孢杆菌菌粉按照如下方法制备：将纳豆芽孢杆菌CCTCC M2019025菌种活化，接种于营养肉汤培养基中培养60h以上，干燥，得到纳豆芽孢杆菌菌粉。
3.根据权利要求1所述的防治烟草花叶病毒的微生物提取物复合剂的应用，其特征在于，所述微生物提取物复合剂用于抑制烟草花叶病毒，防治烟草花叶病。
4.根据权利要求3所述的防治烟草花叶病毒的微生物提取物复合剂的应用，其特征在于，所述微生物提取物复合剂用于防治烤烟的烟草花叶病。
5.根据权利要求3所述的防治烟草花叶病毒的微生物提取物复合剂的应用，其特征在于，所述微生物提取物复合剂用于抑制烟草花叶病毒U1株和U5株。
6.根据权利要求4所述的防治烟草花叶病毒的微生物提取物复合剂的应用，其特征在于，防治烤烟的烟草花叶病的方法为：向烤烟叶片喷施微生物提取物复合剂的50倍稀释液。
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