BRPI0618236A2 - preparação de linhagens celulares principais de vacina usando culturas de suspensão de planta recombinante - Google Patents

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Matthew James Fanton
Janis K Mcmillen
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Abstract

PREPARAçãO DE LINHAGENS CELULARES PRINCIPAIS DE VACINA USANDO CULTURAS DE SUSPENSãO DE PLANTA RECOMBINANTE. A presente invenção fornece uma cultura de célula de planta para produzir agentes proteináceos que compreende uma linhagem celular deplanta estavelmente transformada para expressar um transgene que codifica um agente proteináceo e um meio de crescimento que suporta o crescimento da dita cultura de célula de planta, mas que não suporta o crescimento de Mycoplasmataceae e não contém materiais de origem animal. A linhagem celular de planta é capaz de ser passada continuamente tal que expressão consistente do transgene seja mantida durante a passagem. A linhagem celular de planta também é capaz de ser criopreservada tal que a expressão consistente do transgene seja recuperada por recuperação da criopreservação.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PREPARA-ÇÃO DE LINHAGENS CELULARES PRINCIPAIS DE VACINA USANDOCULTURAS DE SUSPENSÃO DE PLANTA RECOMBINANTE".
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO
Esse pedido reivindica o benefício do pedido provisório U.S. N9de Série 60/733.702, depositado em 4 de novembro de 2005.
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção geralmente refere-se aos campos de cultu-ra de célula de planta e produção de proteína em culturas de célula de plan-ta. Em particular, a invenção refere-se a um sistema de produção universal elinhagens de célula de planta capazes de produzir uma grande variedade deproteínas simples e complexas para uso como agentes terapêuticos e vaci-nas.
ANTECEDENTE DA INVENÇÃO
A tecnologia de DNA recombinante forneceu melhorias substan-ciais na segurança, qualidade, eficácia e custo de medicamentos farmacêu-ticos e veterinários incluindo vacinas. Vacinas de mucosa produzidas emplanta foram inventadas por Curtiss & Cardineau. Veja Patentes U.S. Nes5.654.184; 5.679.880 e 5.686.079 incorporadas aqui por referência. Outrosdescreveram plantas transgênicas que expressam antígenos imunoproteto-res e métodos para produção incluindo Arntzen, Mason e Lam. Veja Paten-tes U.S. NsS 5.484.717; 5.914.123; 6.034.298; 6.136.320; 6.194.560; e6.395.964 incorporadas aqui por referência em suas totalidades.
A produção de célula de planta usando cultura celular em ummeio definido evita a necessidade de componentes de origem animal nomeio de crescimento, eliminando essencialmente o risco de transmissão decontaminantes patogênicos a partir do processo de produção. Células deplantas são capazes de glicosilação pós-traducional e o meio de crescimentode célula de planta é geralmente mais econômico, fácil de manusear e pre-parar quando comparado a um meio de crescimento convencional atualmen-te usado na produção de vacinas.
Antígenos e proteínas de vacina de atividade farmacológica oubiológica relevante produzidos em sistemas de planta oferecem várias van-tagens sobre sistemas de produção convencional. Subunidades de proteínaderivadas de planta não podem reverter para virulência (uma característicade vacinas vivas produzidas convencionalmente ou de vetor vivo produzidasrecombinantemente). Subunidades de proteínas produzidas a partir de mé-todos de produção convencionais podem ser difíceis de produzir e purificardevido à instabilidade da proteína e problemas de extração bioquímica, ecomponentes de vacina de subunidade que requerem glicosilação não serãoglicosilados quando produzidos em procariotos.
Plantas fornecem benefícios únicos que são difíceis de obter apartir de qualquer sistema de DNA recombinante convencional ou derivadode mamífero. Tradicionalmente, vacinas de subunidades ou agentes protei-náceos são: 1) difíceis de purificar a partir de fontes recombinantes ou con-vencionais por causa de baixos rendimentos tornando sua produção proibiti-va; 2) instáveis devido à proteólise, pH ou solventes usados durante a purifi-cação; 3) menos eficazes porque eles não são nativos ou o processo de pu-rificação desnatura epítopos chave; e 4) misturadas com materiais externosde origem biológica quando produzidas em sistemas de mamíferos (mencio-nado acima).
Princípios de "linhagem celular principal" para produção biofar-macêutica utilizam organismos vivos como parte do procedimento de produ-ção e contam com alguns princípios básicos: 1) uma cultura única de origemdefinida e histórico de passagem é preservada com características definidasde fenótipo celular e características de produção desejadas; 2) a preserva-ção, tipicamente criopreservação, é de longa duração (abrangendo váriosanos ou mais); 3) a célula pode ser recuperada, expandida, passada indefi-nidamente em "semente de trabalho" e submetida a outro período de crio-preservação (um princípio que requer robustez da célula); e 4) a célula nãoperde as características definidas de fenótipo celular e características deprodução desejadas encontradas antes do congelamento inicial após umnúmero definido de passagens.
Assim, a técnica precisa de células de planta e culturas de célu-la de planta que forneçam crescimento a longo prazo, re-criopreservação eestabilidade de componentes alvo de bioprodução sob os princípios de se-mente principal.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A invenção fornece culturas de célula de planta e métodos decultivar e armazenar células dê planta para a produção de agentes proteiná-ceos adequados para compatibilidade regulatória e práticas de produçãoGMP (Boas Práticas de Produção). Em certos aspectos da invenção, cultu-ras de célula transgênica são usadas para expressar proteína biofarmacêuti-ca simples ou complexa e agentes peptídicos úteis em preparações de vaci-na, industriais, farmacêuticas e farmacológicas. Outros aspectos da inven-ção fornecem um sistema de produção de vacina produzido em célula deplanta. Além disso, as linhagens celulares principais de planta descritas aquiapresentam estabilidade e robustez suficientes para satisfazer necessidadesregulatórias.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figuras 1A e 1B (SEQ ID NOS: 1 e 2). A seqüência codificanteotimizada da planta e a seqüência de proteína do gene de HN da cepa NDVLasotan.
Figura 2. Mapa de pBBV-PHAS-iaaH que contém o marcadorselecionável de planta PAT (fosfinotricina acetil transferase) direcionado pelopromotor constitutivo de CsVMV (vírus do mosaico da nervura da mandioca)e terminado pelo elemento MAS 3' (manopina sintase). Elementos LB e RB(borda esquerda e direita de T-DNA) de Agrobacterium que delineiam oslimites do DNA que está integrado no genoma da planta.
Figura 3. Mapa de PCIH que é um "vetor molde" usado como umplasmídeo de partida para uma variedade de vetores de expressão em plan-ta para expressar antígenos imunoprotetores.
Figura 4. Mapa do vetor de expressão pCHN para a proteína HNde NDV. O cassete ou vetor de expressão de HN é direcionado pelo promo-tor constitutivo de CsVMV e terminado pelo elemento vspB 3' de soja.
Figura 5. Mapa do vetor de expressão pgHN para a proteína HNde NDV. O cassete de expressão de HN é direcionado pelo promotor GBSSespecífico de tubérculo com TEV 5' UTR e terminado pelo elemento vspB 3'de soja.
Figura 6. Mapa do vetor de expressão pgHN151 para a proteínaHN de NDV. O cassete de expressão de HN é direcioando pelo promotorGBSS específico de tubérculo com sua 5' UTR e íntron nativos, e terminadopelo elemento vspB 3' de soja. O vetor é derivado de pBBV-PHAS-iaaH, quecontém o marcador selecionável de planta PAT direcionado pelo promotorde CsVMV e terminado pelo elemento MAS 3'. LB e RB1 elementos das bor-das esquerda e direita de T-DNA que delineiam os limites do DNA que estáintegrado no genoma da planta.
Figura 7. Mapa do vetor de expressão pgHN153 para a proteínaHN de NDV. O cassete de expressão de HN é direcionado pelo promotorGBSS específico de tubérculo com sua 5' UTR e íntron nativos, e terminadopelo elemento faseolina 3' de feijão. O vetor é derivado de pBBV-PHAS-iaaH, que contem o marcador selecionável de planta PAT direcionado pelopromotor de CsVMV e terminado pelo elemento MAS 3'. LB e RB1 elementosdas bordas esquerda e direita de T-DNA que delineiam os limites do DNAque está integrado no genoma da planta.
Figura 8. Mapa do vetor de expressão pMHN para a proteína HNde NDVrO cassete de expressão de HN é direcionado pelo promotor consti-tutivo 40CSAMAS (direção P2) e terminado pelo elemento vspB 3' de soja.O vetor é derivado de pBBV-PHAS-iaaH, que contém o marcador selecioná-vel de planta PAT direcionado pelo promotor de CsVMV e terminado peloelemento MAS 3'. LB e RB1 elementos das bordas esquerda e direita de T-DNA que delineiam os limites do DNA que está integrado no genoma daplanta.
Figura 9. Mapa do vetor de expressão pCHA para o gene de HAde AIV A / turkey / Wisconsin / 68 (H5N9).
Figura 10 (SEQ ID NOS: 3 e 4). As seqüências de DNA e de pro-teína do gene HA de AIV A/turkey/Wisconsin/68 (H5N9).
Figura 11. Mapa do vetor intermediário pGLTB.Figura 12. Mapa do vetor intermediário pCLT105.
Figura 13. pDAB2423. Vetor binário que codifica VP2.
Figura 14 (SEQ ID NO: 10). A seqüência de DNA do gene deVP2 de IBDV, vírus da Doença Infecciosa da Bursa (IBD), cepa Ehime 91 muito virulenta.
SUMÁRIO DAS SEQÜÊNCIAS
SEQ ID NOS: 1 e 2, mostradas nas Figuras 1A e 1B, são a se-qüência codificante otimizada de planta e seqüência de proteína do gene deHN da cepa NDV "Lasota". SEQ ID NOS: 3 e 4, mostradas na Figura 10, são as seqüênciasde DNA e proteína do gene de HA de AIV A/turkey/ Wisconsin/68 (H5N9).
SEQ ID NO: 5 é um iniciador de PCR usado para finalizar (end-tailor) o promotor de CsVMV em pCPIH.
SEQ ID NO: 6 é um iniciador de PCR usado para finalizar (end- tailor) o promotor de CsVMV em pCPIH.
SEQ ID NO: 7 é um iniciador mutagênico usado para criar umsítio de Nco I.
SEQ ID NO: 8 é um iniciador de sentido direto complementar àregião 5'.
SEQ ID NO: 9 é um iniciador mutagênico usado para criar umsítio de Xhol.
SEQ ID NO: 10, mostrada na Figura 14 é a seqüência de DNAdo gene de VP2 do vírus da doença infecciosa da bursa.
SEQ ID NO: 11 é uma seqüência de DNA otimizada em plantaque codifica uma variação de E/91 VP2 (1425 bases). A região codificantepara E/91 VP2 otimizada em planta compreende as bases de 16 a 1383(1371 bases). Seis paradas de leitura são encontradas nas bases 1384 a1425.
SEQ ID NO: 12 compreende a sequencia da proteína E/91 VP2 codificada pela versão otimizada em planta da região codificante de E/91VP2 (SEQ ID NO: 11).
SEQ ID NO: 13 é a sequencia de DNA que codifica códons determinação da tradução ("Stop") em seis fases de leitura. A seqüência foiusada para terminar a tradução de fases abertas de leitura acidentais queacompanham a integração do DNA durante a transformação e inclui sítios dereconhecimento de enzima de restrição Sac I1 BstE II, e Bgl Il (TsukamotoK.. Koiima, C, Komori, Y., Tanimura1 N., Mase1 M., & Yamaguchi1 S. (1999)Protection of chickens against very virulent Vírus da doença infecciosa daBursa (IBDV) and Marek1S disease virus (MDV) with a recombinant MDV ex-pressing IBDV VP2. Virol. 257: 352-362.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Certos aspectos do pedido em questão fornecem uma cultura decélula de planta para produção de agentes proteináceos compreendendouma linhagem de célula de planta estavelmente transformada para expres-sar um transgene que codifica um agente proteináceo e um meio de culturaque suporta o crescimento da dita cultura de célula de planta, mas que nãosuporta o crescimento de Mycoplasmataceae e não contém materiais de ori-gem animal. A linhagem de célula de planta é capaz de ser passada conti-nuamente tal que a expressão consistente do transgene seja mantida duran-te a passagem e é capaz de ser criopreservada tal que a expressão consis-tente do transgene seja recuperada após a recuperação da criopreservação.
Outros aspectos do pedido em questão fornecem uma cultura decélula de planta que produz uma vacina proteinácea ou agente terapêuticoque tem uma ou mais das seguintes características: a) ausência de produtosanimais no meio de cultura/crescimento; b) livre de níveis detectáveis de me-tabólitos secundários de planta (por exemplo, metabólitos de nicotina); ou c)livre de níveis detectáveis de micoplasma, vírus, bactérias ou fungos. Assim,as culturas de célula de planta fornecidas pela invenção em questão podemter qualquer uma, duas ou todas três características descritas nesse pará-grafo (por exemplo, característica a); ou característica b); ou característicac); ou características a) e b); ou características a) e c); ou características b)e c); ou características a), b) e c)).
A invenção em questão também fornece um sistema de produ-ção de vacina baseado em uma planta estavelmente transformada que com-preende uma ou mais das seguintes características: a) seleção e estabele-cimento de uma linhagem celular principal de cultura de célula de planta re-combinante que expressa um agente proteináceo, pode ser armazenadapermanentemente e pode servir como a fonte para todas as outras passa-gens a partir das quais todas as outras sementes e passagens são deriva-das; b) habilidade para criar semente de trabalho (uma fonte armazenadaderivada da linhagem celular principal e usada para preparar sementes deprodução) e semente de produção (as células recombinantes em faixas es-pecificadas de níveis de passagem que são usadas sem propagação adicio-nal para iniciar a produção de um agente proteináceo feito de planta); c) a-gentes proteináceos podem ser produzidos por cultivar células de plantatransformadas estavelmente em um biorreator na ausência (sem o uso de)de produtos de origem animal (por exemplo, soros de origem de mamíferotais como cavalo, bovino fetal, etc.); d) segurança para administração a ani-mais através de liberação cutânea, intramuscular, intranasal ou oral; e) livrede níveis detectáveis de metabólitos secundários de planta (por exemplo,hidrocarbonetos aromáticos policíclicos e nitrosaminas, incluindo anatabina,anabasina, benzo(a)pireno, nicotina e nornicotina); f) livre de micoplasma,vírus, fungos ou bactérias; g) produz um agente proteináceo ou vacina que éestável como um pó Iiofilizado por longos períodos de até vários anos, prefe-rivelmente 1 a 10 anos e mais preferivelmente 1 a 5 anos, sob condiçõesambientais, refrigeradas ou de congelamento; h) o agente proteináceo agru-pado (vacina) (por exemplo, antígeno ou agente proteináceo de vacina emcombinação com adjuvantes) é estável por meses sob condições de refrige-ração; i) o sistema pode ser usado em um processo que pode ser realizadoem condições controladas e sem a necessidade de regenerar plantas férteis;j) o sistema fornece linhagens celulares principais que podem ser desconge-ladas com altas taxas de recuperação (por exemplo, taxas de recuperaçãode até 100% ou taxas de recuperação que são pelo menos ou maiores doque 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99% de recuperação); k) fornece apreparação e recuperação de semente de trabalho criopreservada em altosníveis de recuperação (por exemplo, taxas de recuperação de até 100% outaxas de recuperação que são pelo menos ou maiores do que 90, 91, 92, 93,94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de recuperação) de linhagens celulares principaiscriopreservadas; I) o agente proteináceo ou vacina resultante pode ser for-mulado em construções de vacina convencionais (agente proteináceo/vacinacombinados com adjuvantes conhecidos) ou novas construções de vacina(por exemplo, pastas de célula) e administradas para fornecer conversãosorológica e/ou proteção contra doença em indivíduos vacinados; m) forneceuma construção de vacina convencional ou nova que tem níveis 2,4-D abai-xo dos níveis de tolerância estabelecidos para animais de criação ou avesdomésticas; n) é expansível para processos de produção comercial (por e-xemplo, o sistema ou as células podem ser cultivados em frascos que vari-am de frascos de agitação a bioreatores que variam de 10 litros a 100.000litros; preferivelmente entre 100 litros a 1000 ou 5000 ou 10.000); o) produzuma linhagem de célula de planta que é estavelmente transformada; e/ou p)pode ser usada para a preparação de referências principais (master) ou detrabalho (um material de referência cuja potência está correlacionada dire-tamente ou indiretamente no animal hospedeiro (por exemplo, atividade bio-lógica de uma citocina ou antigenicidade/imunogenicidade de um antígenode vacina). Certos aspectos da invenção fornecem um sistema de produçãode vacina feito de planta que tem todas as características acima identificadas.
Como usada aqui, a expressão "livre de níveis detectáveis" deum metabólito secundário deve ser entendida significar que a substânciasendo testada não pode ser detectada usando técnicas padrão tais comotécnicas de GC/MS ou LC/MS. Os limites de detecção para essas técnicassão de 100 ng/ml. O termo "livre de micoplasma, vírus, fungos ou bactérias"significa que não há tal organismo presente como determinado por teste bio-lógico tal como descrito aqui no Exemplo 5.
Níveis de tolerância de 2,4-D para aves domésticas: Uma esti-mativa conservadora de resíduos de 2,4-D resultantes de vacinação paraprevenção de um vírus de doença de ave é irrelevante 0,007% da tolerânciaatual estabelecida pela EPA para 2,4-D em ovos. A tolerância atual estabe-lecida pela EPA para 2,4-D em aves domésticas é de 0,05 mg/kg ou 50Mg/kg. Uma estimativa conservadora de resíduos de 2,4-D que resultam davacinação para prevenção de um vírus de ave é irrelevante 0,00079% datolerância atual estabelecida pela EPA para 2,4-D em tecido de ave domés-tica.
As expressões "estavelmente transformada", "linhagem celularde planta estavelmente transformada" ou "sistema de produção de vacinabaseado em planta estavelmente transformada" ou expressão consistentede transgene" determinam linhagens de células de planta ou sistemas deprodução de vacina baseados em planta que crescem vigorosamente, pro-duzem o antígeno biologicamente e imunologicamente ativo por mais decem (100) passagens e, opcionalmente, contêm um inserto recombinante(evento genético) que permanece inalterado ao longo do tempo e número depassagens como demonstrado com base em análises genéticas tais comoSouthern blots, PCR, ou AFLP, resultando em nenhuma alteração significati-va na taxa de crescimento do fenótipo ou nos níveis de expressão do trans-gene.
Culturas de célula de planta como demonstrado nesse pedidopodem conter linhagens de célula de planta transformadas derivadas de umaplanta inferior, uma planta dicotiledônea ou uma planta monocotiledônea.Exemplos não Iimitantes de plantas dicotiledôneas a partir das quais as li-nhagens celulares transformadas podem ser derivadas são tomate, batata,batata doce, mandioca, legumes incluindo alfafa e soja, cenoura, morango,alface, carvalho, bordo, nogueira, rosa, hortelã, girassol, açafroa, algodão,tabaco, abóbora, margarida, canola ou cacto. Certos aspectos da invençãoutilizam linhagens celulares de tabaco tais como NT-1 ou BY-2. Onde a li-nhagem celular de planta transformada é derivada de uma planta monocoti-ledônea, plantas tais como trigo, turfa, grama, cereal, milho (maize/corn),arroz, aveia, trigo, cevada, sorgo, orquídea, íris, lírio, cebola, banana, cana-de-açúcar, sorgo ou palma, podem ser usadas para estabelecer a linhagemde célula de planta. Além disso, linhagens celulares podem ser estabeleci-das a partir de plantas inferiores tais como samambaias, gimnospermas, co-níferas, cavalinhas, licopódios, hepáticas, "hornworts", musgo, algas verme-lhas, algas marrons, gametófitos, esporófitos de pteridófitas ou algas verdes.Um grupo preferido de culturas de célula de planta úteis na presente inven-ção são as culturas de célula de planta de milho, arroz ou tabaco.
Agentes proteináceos farmacêuticos ou de vacina incluem, masnão são limitados a enzimas, toxinas, receptores celulares, ligantes, proteí-nas ou antígenos virais ou bacterianos, agentes transdutores de sinal, citoci-nas ou outras proteínas terapêuticas expressas em cultura de célula de plan-ta transgênica. Seqüências de polinucleotídeos que codificam tais agentesproteináceos farmacêuticos ou de vacina podem ser obtidas a partir de ba-ses de dados comerciais tais como as bases de dados EMBL, SWISSPROTou NCBI. Um agente proteináceo também pode ser uma ou mais proteínas(antígenos) de vírus patogênicos particulares incluindo, mas não limitado aproteína HA (hemaglutinina) de AIV (Vírus Influenza de Ave), uma glicoprote-ína tipo 1; a proteína HN (hemaglutinina/neuraminidase) de NDV de ave (Ví-rus da Doença de Newcastle), uma glicoproteína tipo 2, (veja Patente U.S.Ne 5.310.678, incorporada aqui por referência); uma proteína estrutural, VP2,do vírus da doença infecciosa da bursa (IBDV); uma enzima ADP ribosiltransferase (subunidade LT-A da toxina termolábil de E. coli)·, uma toxinabacteriana LT de E. coli constituída de duas subunidades, vírus humanosincluindo mas mão limitados a poliovírus, rinovírus humano (HRV)", vírus dahepatite A (HAV), vírus da imunodeficiência (HIV), papilomavírus humano(HPV), vírus do herpes simples (HSV), picornavírus tais como o vírus da fe-bre aftosa (FMDV), flavivírus tais como o vírus da Dengue e do Oeste doNilo e o vírus sincicial respiratório (RSV). Tipicamente, agentes proteináceosproduzidos em culturas de células de planta transgênicas são equivalentesem atividade funcional ou estrutural as mesmas proteínas isoladas de fontesnaturais. Exemplos não Iimitantes de antígenos virais também são descritosnas SEQ ID NOs: I, 2, 3, 4, 11 e 12.
Vacinação e vacinar são definidos como um meio de fornecerproteção ou induzir soroconversão (por exemplo, a produção de anticorpos)contra um patógeno por inocular um hospedeiro com uma preparação imu-nogênica que contém um agente proteináceo tal que o sistema imune dohospedeiro é estimulado e previne ou atenua a patologia indesejada subse-qüente associada com as reações do hospedeiro a exposições subseqüen-tes ao patógeno.
Uma vacina é uma composição usada para vacinar um animal,incluindo um humano, que contém pelo menos um agente proteináceo queinduz a estimulação do sistema imune do hospedeiro e previne ou atenuauma patologia indesejada subseqüente associada com as reações do hos-pedeiro a exposições subseqüentes às substâncias antigênicas imunoprote-toras do patógeno.
Um organismo patogênico é uma bactéria, vírus, fungo ou proto-zoário que causa uma doença ou condição fisiológica induzida/controladaem um animal ou hospedeiro que é infectado.
Para os propósitos desse pedido, um adjuvante é uma substân-ciá que acentua, aumenta, modera ou intensifica a resposta imune a um i-munógeno ou antígeno. Adjuvantes tipicamente aumentam tanto a respostaimune humoral como celular mas uma resposta aumentada de uma na au-sência da outra qualifica para definir um adjuvante. Além disso, adjuvantes eseus usos são bem conhecidos dos imunologistas e são tipicamente empre-gados para intensificar a resposta imune quando as doses de imunógenosão limitadas, quando o imunógeno é muito fràòamente imunogênico ouquando a via de administração é subótima. Assim, o termo "quantidade ad-juvante" é aquela quantidade de adjuvante capaz de aumentar a respostaimune a um dado imunógeno ou antígeno. A massa que iguala uma "quanti-dade adjuvante" variará e é dependente de uma variedade de fatores inclu-indo, mas não limitados às características do imunógeno, à quantidade deimunógeno administrada, à espécie do hospedeiro, à via de administração eao protocolo para administração do imunógeno. A "quantidade adjuvante"pode ser facilmente quantificada por experimentação de rotina dado um gru-po particular de circunstâncias. Isso está bem dentro da competência doversado na técnica e emprega tipicamente o uso de determinações de res-posta à dose de rotina a quantidades variáveis de imunógeno e adjuvanteadministradas. As respostas são medidas pela determinação de títulos deanticorpos séricos ou respostas mediadas por célula criadas para o imunó-geno usando ensaios imunoabsorventes ligados à enzima, rádio-imunoensaios, ensaios de hemaglutinação e semelhantes.
Uma dosagem eficaz é uma quantidade necessária para induziruma resposta imune em um ser humano ou animal, suficiente para o serhumano ou animal resistir eficazmente ao estímulo causado pelo agente pa-togênico ou responder a uma necessidade fisiológica do animal tal como umantígeno autoimune para diabetes. As dosagens administradas a tal humanoou animal serão determinadas por um médico, veterinário ou cientista treina-do tendo em vista circunstâncias relevantes que incluem a partícula ou com-binação de partículas imunoprotetoras particulares, a condição do ser huma-no ou animal e a via de administração escolhida. Geralmente, dosagens efi-cazes variam entre cerca de 1 ng a cerca de 0,5 mg e, preferivelmente, entrecerca de 1 ug a cerca de 50 ug. Para o Vírus da Doença de Newcastle (antí-geno HN) em aves domésticas as dosagens eficazes variam de cerca de 0,5ug a cerca de 50 ug, preferivelmente de cerca de 2,5 ug a cerca de 5 ug a -través da via SQ. Através da via IN/mucosa ocular, dosagens eficazes paraHN em aves domésticas variam de cerca de 0,5 ug a cerca de 50 ug, prefe-rivelmente de cerca de 5 ug a cerca de 25 ug e mais preferivelmente de cer-ca de 10 ug a cerca de 12 ug. Para o Vírus da Influenza Aviária (antígenoHA), dosagens eficazes variam de cerca de 0,5 ug a cerca de 50 ug, preferi-velmente de cerca de 1 ug a cerca de 30 ug e mais preferivelmente de cercade 24 ug a cerca de 26 ug através da via IN/ocular e preferivelmente de cer-ca de 1 ug a cerca de 5 ug através da via SQ. Para Doença Infecciosa daBursa (antígeno VP2) em aves domésticas, dosagens eficazes variam decerca de 0,5 ug a cerca de 50 ug, preferivelmente de cerca de 5 ug a cercade 25 ug e mais preferivelmente de cerca de 5 ug a cerca de 20 ug atravésda via SQ. Para o antígeno LT, dosagens orais eficazes variam de cerca de50 ng a cerca de 250 ng, preferivelmente de cerca de 100 ng a cerca de 200ng. Para antígeno LT dosagens SQ ou IN/ocular eficazes variam de cerca de50 ng a cerca de 100 ug; preferivelmente de cerca de 1 ug a cerca de 50 uge mais preferivelmente de cerca de 2 ug a cerca dé 10 ug. As faixas de do-sagem apresentadas aqui não pretendem limitar o escopo da invenção denenhuma forma e são apresentadas como guia geral para o praticante versado.
Planta transgênica é definida aqui como uma cultura de célulade planta, linhagem de célula de planta, cultura de tecido de planta, plantainferior, cultura de célula de planta monocotiledônea, cultura de célula deplanta dicotiledônea, ou progênie desses derivada de uma célula de plantatransformada ou protoplasto, em que o genoma da planta transformada con-tém DNA estranho, introduzido por técnicas de laboratório, não originalmentepresente em uma célula de planta não-transgênica nativa da mesma espé-cie. Os termos "planta transgênica" e "planta transformada" têm sido usadosalgumas vezes na técnica como termos sinônimos para definir uma plantacujo DNA contém uma molécula de DNA exógena.
Construção de cassetes de gene para transformar plantas ouculturas de célula de planta transformadas pode ser facilmente realizada porutilizar métodos bem conhecidos, tais como aqueles descritos em Sambrooket a/(1989); e Ausubel et al, (1987) Current Protocols in Molecular Bioloqy.,John Wiley and Sons, Nova Iorque, NY. A presente invenção também incluiseqüências de DNA que têm homologia de seqüência substancial com asseqüências descritas que codificam antígenos imunoprotetores ou agentesproteináceos tal que elas são capazes de ter o efeito descrito sobre a ex-pressão. Como usado no presente pedido, o termo "homologia de seqüênciasubstancial" é usado para indicar que uma seqüência de nucleotídeo (nocaso de DNA ou RNA) ou uma seqüência de aminoácido (no caso de umaproteína ou polipeptídeo) exibe equivalência funcional ou estrutural substan-cial com outra seqüência de nucleotídeo ou aminoácido. Qualquer diferençafuncional ou estrutural entre seqüências que têm homologia de seqüênciasubstancial será de minimis; isto é elas não irão afetar a habilidade da se-qüência funcionar como indicado no presente pedido. Seqüências que têmhomologia de seqüência substancial com as seqüências descritas aqui sãogeralmente variantes da seqüência descrita, tal como mutações, mas tam-bém podem ser seqüências sintéticas.
Na maioria dos casos, seqüências que têm 95% de homologiacom as seqüências especificamente descritas aqui funcionarão como equi-valentes, e em muitos casos consideravelmente menos homologia, por e-xemplo, 75% ou 80%, será aceitável. Localizar as partes dessas seqüênciasque não são críticas pode ser demorado, mas é de rotina e está dentro datécnica. Procedimentos exemplares para modificar seqüências de nucleotí-deo incluem usar mutagênese mediada por polinucleotídeo, direcionada aosítio. Veja, Zoller et al. (1984); Higuchi et a/(1988); Ho et ai (1989); Hortonetal. (1989); e PCR Technology: Principies and Applications for DNA Ampli-fication. (ed.) Erlich (1989).
Ao preparar os construtos úteis para essa invenção, os váriosfragmentos de DNA podem ser manipulados, a fim de fornecer seqüênciasde DNA na orientação correta e, conforme apropriado, na fase de leitura cor-reta. Adaptadores ou Iigantes podem ser empregados para unir fragmentosde DNA ou outras manipulações podem estar envolvidas para fornecer sítiosde restrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, remoção de sítios derestrição, ou semelhantes.
Ao executar as várias etapas, clonagem é empregada, a fim deamplificar um vetor que contém o promotor/gene de interesse para introdu-ção subseqüente nas células hospedeiras desejadas. Uma grande variedadede vetores de clonagem está disponível, onde o vetor de clonagem inclui umsistema de replicação funcional em E. coli e um marcador que permite a se-leção das células transformadas. Vetores ilustrativos incluem pBR322, sériepUC, pACYC184, série Bluescript (Stratagene) etc. Dessa forma, a seqüên-cia pode ser inserida no vetor em um sítio(s) de restrição, o plasmídeo resul-tante usado para transformar o hospedeiro de E. coli (por exemplo, cepas deE. coli HB101, JM101 e DH5a), a E. coli cultivada em um meio nutriente a-propriado e as células colhidas e Iisadas e o plasmídeo recuperado. A análi-se pode envolver análise de seqüência, análise de restrição, eletroforese, ousemelhantes. Após cada manipulação a seqüência de DNA a ser usadã noconstruto final pode ser restrita e unida à próxima seqüência, onde cada umdos construtos parciais pode ser clonado no mesmo ou em plasmídeos dife-rentes.
Vetores estão disponíveis ou podem ser facilmente preparadospara transformação de células de planta. Em geral, vetores de plasmídeo ouvirais devem conter todas as seqüências de controle de DNA necessáriaspara a manutenção e expressão de uma seqüência de DNA heteróloga emum dado hospedeiro. Tais seqüências de controle incluem geralmente umaseqüência líder e uma seqüência de DNA que codifica um códon de sinal deinício de tradução, um códon terminador de tradução, e uma seqüência deDNA que codifica um sinal 3' UTR que controla o processamento de RNAmensageiro. Seleção de elementos apropriados para otimizar a expressãoem qualquer espécie particular é um interesse de versados na técnica utili-zando os ensinamentos dessa descrição. Finalmente, os vetores devem terdesejavelmente um gene marcador que é capaz de fornecer uma proprieda-de fenotípica que permite identificação de células hospedeiras que contêm ovetor.
A atividade da seqüência codificante estranha (por exemplo, a-gente imunoprotetor ou agente proteináceo) inserido nas células de plantadepende da influência de DNA de planta endógeno adjacente ao inserto.Geralmente, a inserção de genes heterólogos parece ser aleatória usandoqualquer técnica de transformação; entretanto, atualmente^existe tecnologiapara produzir plantas com a recombinação sítio-específica de DNA em célu-las de planta (veja, WO 91/09957). Qualquer método ou combinação de mé-todos que resultem na expressão da seqüência ou seqüências desejadassob o controle do promotor é aceitável.
As culturas de célula de planta fornecidas aqui não são limitadasa nenhum método particular para transformar células de planta. Tecnologiapara introduzir DNA em células de planta é bem conhecida dos versados natécnica. Quatro métodos básicos para liberar DNA estranho em células deplanta foram descritos. Métodos químicos (Graham & van der Eb, Virology,54(02):536-539, 1973; Zatloukal, Wagner, Cotten, Phillips, Plank, Steinlein,Curiel, Birnstiel, Ann. N.Y. Acad. Sci., 660:136-153, 1992); Métodos físicosincluindo microinjeção (Capecchi, Cell, 22(2):479-488, 1980), eletroporação(Wong & Neumann, Biochim. Biophys. Res. Commun. 107(2):584-587, 1982;Fromm1 Taylor, Walbot1 Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82(17):5824-5828,1985;Pat. U.S. No. 5.384.253) e a arma gênica (Johnston & Tang, Methods Cell.Biol., 43(A):353-365, 1994; Fynan, Webster, Fuller5 Haynes, Santoro, Robin-son, Proc. Nati Acad. Sei. USA 90(24): 11478-11482, 1993); Métodos virais(Clapp, Clin. Perinatol., 20(1 ):155-168, 1993; Lu, Xiao, Clapp, Li, Broxmeyer,J. Exp. Med. 178(6):2089-2096, 1993; Eglitis & Anderson, Biotechniques,6(7):608-614, 1988; Eglitis, Kantoff, Kohn, Karson, Moen, Lothrop, Blaese,Anderson, Avd. Exp. Med. Bioi1 241:19-27, 1988); e métodos mediados porreceptor (Curiel, Agarwal, Wagner, Cotten, Proc. Natl. Acad. Sei. USA,88(19):8850-8854, 1991; Curiel, Wagner, Cotten, Birnstiel, Agarwal, Li, Loe-chel, Hu1 Hum. Gen. Ther., 3(2):147-154, 1992; Wagner et ai, Proc. Natl.Acad. Sei. USA, 89 (13):6099-6103, 1992).
A introdução de DNA em células de planta por meio de eletropo-ração é bem conhecida daqueles versados na técnica. Enzimas degradantesda parede celular, tais como enzimas degradantes de pectina, são usadaspara tornar as células receptoras mais suscetíveis à transformação por ele-troporação do que células não tratadas. Para realizar a transformação poreletroporação pode-se empregar tanto tecidos friáveis tal como uma culturade suspensão de células, ou calos embnògênicos, ou embriões imaturos ououtros tecidos organizados diretamente. Geralmente, é necessário degradarparcialmente as paredes celulares do material de planta alvo com enzimasdegradantes de pectina ou Iesionar mecanicamente de uma forma controla-da. Tal material de planta tratado está pronto para receber DNA estranho poreletroporação.
Outro método para liberar DNA transformante estranho a célulasde planta é por bombardeio de microprojétil de DNA. Nesse método, micro-partículas são revestidas com DNA estranho e liberadas nas células por umaforça propelente. Tais micro particular são feitas tipicamente de tungstênio,ouro, platina, e metais similares. Uma vantagem de bombardeio de microprojétil é que não são necessários nem o isolamento de protoplastos (Cristouet ai, 1988, Plant Physiol., 87:671-674,) nem a susceptibilidade à infecçãopor Agrobacterium. Uma modalidade ilustrativa de um método para liberarDNA em células de milho por aceleração é um Biolistics Particle DeliverySystem, que pode ser usado para impulsionar partículas revestidas comDNA ou células através de uma tela sobre uma superfície de filtro cobertacom células de milho cultivas em suspensão. A tela dispersa as partículaspara que elas não sejam liberadas às células receptoras em grandes agre-gados. Para o bombardeio, as células em suspensão são preferivelmenteconcentradas em filtros ou meio de cultura sólido. Alternativamente, embri-ões imaturos ou outras células alvo podem ser dispostas em meio de culturasólido. As células a ser bombardeadas são posicionadas em uma distânciaapropriada abaixo da placa que para o macroprojétil. Em transformação porbombardeio, pode-se otimizar as condições de cultura pré-bombardeio e osparâmetros de bombardeio para produzir os números máximos de transfor-mantes estáveis. Tanto os parâmetros físicos como biológicos para bombar-deio são importantes nessa tecnologia. Fatores físicos são aqueles que en-volvem manipular o precipitado de DNA/microprojétil ou aqueles que afetamo vôo e velocidade de qualquer um dos microprojéteis. Fatores biológicosincluem todas as etapas envolvidas na manipulação de células antes e ime-diatamente após o bombardeio, o ajuste osmótico de células alvo para aju-dar a aliviar o trauma associado com o bombardeio, e também a natureza doDNA transformante, tal como DNA Iinearizado ou plasmídeos superespirali-zados intactos.
Transferência mediada por Agrobacterium é um sistema ampla-mente aplicável para introduzir DNA estranho em células de planta porque oDNA pode ser introduzido em tecidos de plantas inteiras, eliminado a neces-sidade de regenerar uma planta intacta a partir de um protoplasto. O uso devetores de integração em planta mediados por Agrobacterium para introduzirDNA em células de planta é bem conhecido na técnica. Veja, por exemplo,os métodos descritos em Fraley et ai, 1985, Biotechnology, 3:629; Rogers etai, 1987, Meth. in Enzymoi, 153:253-277. Além disso, a integração do Ti-DNA é um processo relativamente preciso que resulta em poucos rearranjos.A região de DNA a ser transferida é definida pelas seqüências da borda, eDNA interveniente é geralmente inserido no genoma da planta como descritoem Spielmann et al., 1986, Mol. Geri. Genet., 205:34; Jorgensen et al., 1987,Mol. Gen. Genet., 207:471.
Vetores de transformação em Agrobacterium modernos são ca-pazes de replicação em E. coli assim como em Agrobacterium, permitindomanipulações convenientes. Além disso, avanços tecnológicos recentes emvetores para transferência de gene mediada por Agrobacterium melhoraramo arranjo de genes e sítios de restrição nos vetores para facilitar a constru-ção de vetores capazes de expressar várias proteínas ou polipeptídeos. Re-giões multiligante convenientes flanqueadas por um promotor e um sítio depoliadenilação para expressão direta de genes codificantes de polipeptídeoinseridos são adequadas para os presentes propósitos. Além disso, Agro-bacterium contendo genes de Ti armados e desarmados podem ser usadospara as transformações.
A transformação de protoplastos de planta pode ser obtida u-sando métodos baseados na precipitação com fosfato de cálcio, tratamentocom polietileno glicol, eletroporação e combinações desses tratamentos (ve-ja, por exemplo, Potrykus et ai., 1985, Mol. Gen. Genet, 199:183; Marcotte etal., Nature, 335:454, 1988). A aplicação desses sistemas a diferentes espé-cies CtejPlanta depende da habilidade de regenerar a espécie particulares apartir de protoplastos.
Para a prática da presente invenção, é preferível transformar aslinhagens de célula de planta que possam ser cultivadas e escalonadas ra-pidamente. O uso de culturas de célula de planta evita produção em campoaberto e reduz grandemente as chances de escape de gene e contaminaçãode alimentos. Culturas de células de tabaco em suspensão tais como NT-1 eBY-2 (Kato et a!. 1972, Proc. IV IFS: Ferment. Technol. Today 689-695; An,G., 1985 Plant Physiol. 79, 568-570; Nagata et al. 1992, International Reviewof Cytology 132, 1-30) são preferidas porque essas linhagens são particu-larmente suscetíveis a manuseio em cultura, são facilmente transformadas,produzem eventos integrados estavelmente e são receptíveis à criopreser-vação.
A linhagem celular de tabaco em suspensão, NT-1, é adequadapara a prática de presente invenção. Células NT-1 foram originalmente de-senvolvidas a partir de Nicotiana tabacum L.cv. bright yellow 2. A linhagemcelular NT-1 é amplamente usada e facilmente disponível; apesar disso,qualquer linhagem celular de tabaco em suspensão é compatível com a prá-tica da invenção. Além disso, a linhagem celular é variável e mudará emresposta às condições de cultura. Células NT-1 adequadas para uso nosexemplos abaixo estão disponíveis pela American Type Culture Collectionsob o número de acesso ATCC Nq 74840. Veja também a Patente U.S. N96.140.075, aqui incorporada por referência na sua totalidade.
Várias técnicas de cultura de célula de planta e sistemas quevariam de frascos de agitação de escala laboratorial a vasos de biorreator demilhares de litros foram descritos e são bem conhecidos na técnica de cultu-ra de célula de planta. Veja, por exemplo, Fischer, R. et al, 1999 BiotechnoiAppl. Biochem. 30, 109-112 e Doran, P., 2000 Current Opinions in Biotech-noiogy 11, 199-204. Após as células de planta transformadas terem sido cul-tivadas para a massa desejada, elas são coletadas, gentilmente lavadas ecolocadas em um tampão adequado para rompimento. Muitos tampões dife-rentes são compatíveis com a presente invenção. Em geral, o tampão é umasolução salina tamponada isotônica aquosa em valor de pH neutro oti próxi-mo a um pH neutro que não contem detergentes abrasivos que podem serusados para solubilizar membranas. Tampões preferidos incluem SalinaTamponada com Fosfato de Dulbecco e PBS contendo EDTA 1 mM.
Após preparar uma linhagem celular de planta estavelmentetransformada, as culturas da presente invenção podem ser finalizadas porconfirmar o inserto gênico (evento genético) usando amplificação por PCRdo inserto genômico inteiro seguido por digestão com enzima de restrição. Alinhagem celular principal e as linhagens celulares de trabalho devem entãoser avaliadas quando a contaminação bacteriana e fúngica de acordo com oprocedimento descrito em 9 CFR 113.26.
A recuperação inicial de células principais e de trabalho podeser sobre placas de ágar na forma de um calo. Isso pode ser seguido pelatransferência para culturas de suspensão líquidas. As variações de passa-gem para célula de trabalho e culturas de produção podem variar de 1 a 50ou 100 vezes.
Nenhum ingrediente de origem animal é usado para cultivar asculturas de célula de planta da presente invenção. Meio para placas de ágare culturas em suspensão são baseados em meio de cultura de planta co-mum (Murashige & Skoog; MS) e são descritos aqui em detalhe. Linhagenscelulares principais são armazenadas na fase de vapor de nitrogênio líquido.Culturas mantidas dessa maneira podem ser armazenadas indefinidamentee podem ser usadas para preparar culturas de calo em meio de ágar. Linha-gens celulares de trabalho são armazenadas na fase de vapor de nitrogêniolíquido e podem ser armazenadas indefinidamente e usadas para prepararculturas de calo.
Culturas de células principais e de células de trabalho usadascomo inóculo para células de trabalho ou produção de vacina podem sermantidas por ciclagem periódica de um calo em uma placa de ágar ou culti-vadas como uma cultura em suspensão. Células principais ou células detrabalho congeladas podem ser descongeladas e passadas para uma placade ágar e cultivadas uma ou mais vezes a 25°C por aproximadamente uma aduas semanas. O calo é então separado e usado pã?á inocular um frasco demeio de suspensão líquido para produzir uma célula de trabalho ou culturade produção. Culturas de célula de trabalho usadas como inóculo para cultu-ras de produção são cultivadas em temperatura ambiente com agitação con-tínua e passadas em meio de suspensão líquido. As culturas são passadasaproximadamente a cada 3-14 dias dependendo da quantidade de cresci-mento observada e podem ser repicadas a 1:3 ou 1:10 em cada passagem.
Para produzir uma linhagem celular de trabalho a partir de umaplaca de ágar de célula principal, um calo saudável é selecionado, separadoassepticamente e porções são colocadas em um frasco contendo meio desuspensão líquido. Linhagens celulares de trabalho também podem ser pas-sadas de cultura líquida para cultura líquida usando um repique a 1:3 ou1:10, enquanto se aumenta o volume da cultura até que um volume de umlitro seja obtido em frascos de agitação. Um a três litros de cultura de frascode agitação podem ser transferidos para um tanque agitado de dez litroscomo um inóculo. Culturas de produção são produzidas em um tanque agi-tado com um volume de trabalho de 100 litros. Um fermentador de 100 litrospode ser inoculado em uma proporção de 1:10 de cultura a partir de culturasde um tanque agitado ou de múltiplos frascos de agitação. Culturas em tan-ques agitados maiores do que dez litros são cultivadas em meio de suspen-são líquido sem o agente de seleção.
As culturas são cultivadas em temperatura ambiente com agita-ção contínua por um período de 3-14 dias para as culturas celulares de tra-balho. Na maioria dos casos as culturas celulares de trabalho são passadasa cada 7 dias com um repique a 1:10. Durante o escalonamento das célulasde trabalho, as culturas são passadas em um repique a 1:10 e são cultiva-das por pelo menos sete dias. As culturas de produção são cultivadas por 7-15 dias antes da coleta. As culturas são observadas diariamente quanto aocrescimento característico e amostras de cultura de produção são removidasassepticamente periodicamente para exame microscópico e determinaçãode volume globular. As células devem aumentar em densidade para um vo-lume globular (PCV) de aproximadamente 35% e devem conter pelo menos50% de células viáveis saudáveis, com base em uma estimativa visual, nomomento da coleta. O exame microscópico das células deve revelar um nú-cleo visível dentro das células, mas outras estruturas celulares não devemser observáveis.
A aeração pode variar dependendo da demanda de oxigênio dacultura. O oxigênio dissolvido deve ser controlado entre aproximadamente100% a 20%. A velocidade de agitação pode variar dependendo da deman-da de oxigênio, mas não deve exceder 500 rpm. Controlar o pH não é tipi-camente necessário. Culturas de produção podem ser colhidas entre 7 e 15dias após a inoculação por filtração por gravidade ou vácuo usando meiosde filtração convencionais. Procedimentos de purificação de proteína de roti-na podem então ser empregados para isolar a substância proteinácea far-macêutica.
Todas as patentes, pedidos de patente, pedidos provisórios epublicações referidas ou citadas aqui estão incorporadas por referência nasua totalidade, incluindo todas as figuras e tabelas, na medida em que elesnão são incompatíveis com os ensinamentos explícitos dessa especificação.
A seguir estão exemplos que ilustram procedimentos para prati-car a invenção. Esses exemplos não devem ser considerados como Iimitan-tes. Todas as porcentagens são em peso e todas as proporções de misturade solvente são em volume a menos que observado de outra maneira.
EXEMPLO 1: VETORES
Construção de gene: A seqüência codificante do gene de HN dacepa de NDV "Lasota" (acesso do Genbank AF077761), gene HA da cepade AIV ATurkey/Wisconsin/68, gene de VP2 da cepa E19 de IBDV (númerode acesso do GenBank X00493), e gene de LT de E. coli foram analisadosquanto ao uso de códon e a presença de motivos de seqüência indesejadosque poderiam mediar falso processamento de RNAm e instabilidade, ou me-tilação de DNA genômico. Veja Adang MJ, Brody MS, Cardineau G, EaganN, Roush RT, Shewmaker CK, Jones A, Oakes JV, McBride KE (1993) Theconstruction and expression of Bacillus thuringiensis cryIIIA gene in proto-plasts and potato plants. Plant Mol Biol 21:1131-1145. Uma seqüência codi-ficante otimizada em planta foi desenhada com preferência de códon híbridorefletindo uso de códon de tomate e batata (Ausubel F., et ai, eds. (1994)Current Protocols in Molecular Biology; vol. 3, p. A.1C.3 Haq TA, Mason HS,Clements JD, Arntzen CJ (1995) Oral immunization with a recombinant bac-terial antigen produced in transgenic plants. Science 268:714-716). A se-qüência desenhada para HN é mostrada na Figura 1. O gene de HN sintéticofoi construído por um fornecedor comercial (Retrogen) e foi recebido em doisplasmídeos separados contendo a metade 5' (p4187-4203-1) ou a 3'(p42111-4235-1 c-1) do gene clonado em pCR-Blunt.
Construção de plasmídeo: Vetores binários para transformaçõesde planta mediadas por Agrobacterium foram construídos com base no vetorpBBV-PHAS-iaaH mostrado na Figura 2, que usa o marcador de seleção deplanta fosfinotricina acetil transferase (PAT), descrito nas Patentes U.S. nú-meros: 5.879.903; 5.637.489; 5.276.268; e 5.273.894 aqui incorporadas porreferência, direcionados pelo promotor constitutivo de vírus do mosaico danervura da mandioca (CsVMV) descrito no WO 97/48819. Primeiro deleta-ram-se o gene iaaH e a seqüência do promotor da faseolina por digestão depBBV-PHAS-iaaH com Pacl é re-ligação para formar pCVMV-PAT; entãodeletou-se o único sítio de Hindlll por preenchê-lo com enzima de Klenow ereligação para formar pCPIH. Finalizou-se o promotor de CsVMV por PCRusando os iniciadores CVM-Asc (51-ATGGCGCGCCAGAAGGTAATTATCCAAG SEQ ID NO: 5) e CVM-Xho (5'-ATCTCGAGCCATGGTTTGGATCCA SEQ ID NO: 6) no pCPIH de molde, eclonou-se o produto em pBluescriptKS com cauda-T digerido com EcoRVpara fazer pKS-CVM7. Um mapa de pCPIH é mostrado na Figura 3. Cons-truíram-se o cassete de expressão de HN pKS-CHN por ligar o vetor pKS-CVM7/Ncol-EcoRI com 3 fragmentos de inserto: a metade 5' de HN emNcol/Pstl, a metade 3' de HN em Pstl/Kpnl, e o elemento vspB 3' de soja emKpnI-EcoRI (Haq 1995). O vetor de T-DNA binário pCHN foi então montadopor ligação do vetor pCPIH/Ascl-EcoRI e do fragmento Ascl-EcoRI de pKS-CHN. Uma mapa de pCHN é mostrado na Figura 4.
O promotor de amido sintase ligada a grânulo (GBSS), descritona Patente U.S. N5 5.824.798 incorporado aqui por referência, foi usado parafazer outros vetores. Esses construtos foram feitos usando um fragmento depromotor amplificado a partir de DNA genômico de Solanum tuberosum L.cv. "Desiree" usando iniciadores desenhados a partir da seqüência no aces-so do Genbank X83220 para a cultivar de batata Chinesa for "Dongnong".
Um iniciador mutagênico "GSS-Nco" (5'-[TGCCATGGTGATGTGTGGTCTACAA] SEQ ID NO: 7) foi usado para criarum sítio de Nco I sobrepondo o códon de início de tradução, junto com o ini-ciador de sentido direto "GSS-1.8F" (5'-[GATCTGACAAGTCAAGAAAATTG]SEQ ID NO: 8) complementar à região 5' em -1800 bp; o produto de PCR de1825 bp foi clonado em pBluescriptKS com cauda-T para fazer pKS-GBN, eseqüenciado. Um iniciador mutagênico "GSS-Xho" (5'-[AGCTCGAGCTGTGTGAGTGAGTG] SEQ ID NO: 9) foi usado para criar umsítio de Xhol a 3' do sítio de início de transcrição junto com o iniciador "GSS-1.8F"; o produto de PCR de 1550 foi clonado em pBluescriptKS com cauda-T para fazer pKS-GBX, e seqüenciado.
Um cassete de expressão do promotor de GBSS contendo a 5'UTR (região não traduzida) de TEV, descrito na Patente U.S. N9 5.891.665aqui incorporada por referência, foi construído por ligação do vetor pTH210digerido com HindIII/Xhol com o fragmento de HindIII/Xhol de pKS-GBX, queefetuou uma substituição do promotor 35S de CaMV pelo promotor de GBSSde 811 pb, para fazer pTH252A. Veja Haq TA, Mason HS, Clements JD,Arntzen CJ (1995) Oral immunization with a recombinant bacterial antigenproduced in transgenic plants. Science 268:714-716. O gene de HN foi inse-rido em pTH252A/Ncol-Kpnl por ligação com a metade 5' de HN emNcol/Pstl e a metade 3' de HN em Pstl/Kpnl para fazer pHN252A. O vetor deT-DNA binário pgHN foi feito por ligação do vetor pGLTB (mostrado na Figu-ra 11) digerido com Nsil e EcoRI com os fragmentos pHN252A/Nsil-Kpnl epTH210/Kpnl-EcoRI. Um mapa de pgHN é mostrado na Figura 5.
Um cassete de expressão do promotor de GBSS contendo a 5'UTR de GBSS, descrito na Patente U.S. No. 5.824.798, aqui incorporada porreferência, com seu íntron foi construído por ligação do vetor pTH210 (Haq1995) digerido com HindIII/Ncol com o fragmento de HindIII/NcÓI de pKS-GBN, que efetuou uma substituição do promotor 35S de CaMV (vírus domosaico da couve-flor)/ 5'UTR de TEV pelo promotor de GBSS de 1084bp/5'-UTR, para fazer pTH251A. O vetor de T-DNA binário pgHN151 foi feitopor ligação do vetor pCLT105 (mostrado na Figura 12) com fragmentos p-TH251 A/HindIII-Ncol e pHN252A/Ncol-Kpnl. Um mapa de pgHN151 é mos-trado na Figura 6.
Um cassete de expressão do promotor de GBSS contendo a 5'UTR de GBSS com seu íntron e o elemento 3' de faseolina de feijão (descri-to na Patente U.S. NQs 5.270.200; 6.184.437; 6.320.101, aqui incorporadapor referência) foi construído. Primeiro, pCPIH foi digerido no sítio único deKpnl, as extremidades coesivas foram preenchidas pela T4 DNA polimerase(blunted), e religadas para fazer pCPIHK, que tem o sítio de Kpnl removido.pCPIHK foi digerido com Nsil, seguido por preenchimento de extremidadescoesivas (blunting) com T4 DNA polimerase, e então digestão com Pacl. Ovetor resultante foi ligado com um fragmento de 2848 bp de pgHN151 digeri-do com Sacli seguido por preenchimento das extremidades coesivas com T4DNA polimerase, e então digestão com Pacl, para fazer pgHN153. Um mapade pgHN153 é mostrado na Figura 7.
Um promotor constitutivo quimérico (40CSAMAS Patentes U.S.Nos: 5.001.060; 5.573.932 e 5.290.924 aqui incorporadas por referência) foiusado para construir outro vetor de expressão para ΗΝ. O plasmídeo,pAGM149, foi digerido com EcoRV e digestão parcial com BamHI. Essefragmento foi ligado com pCHN digerido com Pmel/Pstl e a metade 5' dogene de HN sintético obtida por digestão de pKS-CHN com BamHI/Pstl. OpMHN resultante é mostrado na Figura 8.
Um plasmídeo contendo o gene de HA de AIVA/turkey/Wisconsin/68 (H5N9) foi obtido de David Suarez (SEPRL, Atenas,GA) (Figura 10). Ele foi finalizado por PCR para adicionar sítios de restriçãoNcol na extremidade 5' e Kpnl na 3', e inserido no vetor plBT210.1 (Haq etai, 1995), que contém o promotor 35S, 5'-UTR de TEV, e extremidade vspB3'. O cassete de expressão foi transferido para o vetor binário pGPTV-Kan(Becker et ai, Plant Mol Biol 1992; 20: 1T95-7) por digestão com Hindlll eEcoRI (parcial), para fazer plBT-HAO. O fragmento gene de HA/extremidade vspB3' de plBT-HAO foi obtido por digestão com Ncol e EcoRI(parcial), e inserido em pKS-CVM7 para fazer pKS-CHA. O cassete que con-tém o promotor de CsVMV, gene de HA, e extremidade vspB3' foi obtido depKS-CHA por digestão com Asel e EcoRI (parcial), e ligado com pCPIH parafazer pCHA, mostrado na Figura 9.
A seqüência otimizada em planta que codifica o gene de LT-B dacepa de E. coli H10407 é conhecida na técnica (Mason HS, Haq TA, Cle-ments JD, Arntzen CJ1 1998, Vaccine 16:1336-1343). A seqüência otimizadaem planta que codifica o gene de LT-A da cepa de E. coli H10407 foi descri-ta no WO/00/37609 que foi originalmente depositada como Pedido ProvisórioU.S. Número 60/113.507, os ensinamentos completos das quais estão aquiincorporados por referência. WO/00/37609 descreve a construção de trêsvetores de T-DNA binários (pSLT102, pSLT105, pSLT107) que foram usa-dos para transformação de célula de planta mediada por Agrobacterium tu-mefaciens de células NT-1 de Nicotiana tabacum no Exemplo 2. As linha-gens das células NT-1 transformadas resultantes (SLT102, SLT105 e S-LT107) expressaram e acumularam LT completamente montado e análogosde LT compreendidos de LT-B e formas modificadas da subunidade de LT-A.Figura 12 ilustra pSLT107, que contém um gene de LT-A modificado quesubstitui Ala72 por Arg 72. Produtos de expressão de SLT102 e SLT105 e-ram idênticos exceto que eles continham alterações diferentes no gene deLT-A (Ser63 para Lys63 em pSLT102; Arg192 para Gly192 em pSLT105.Essas linhagens contêm um número indeterminado de cópias da região deT-DNA dos plasmídeos estavelmente integradas no DNA cromossômico nu-clear. As células NT-1 transgênicas acumularam subunidades de LT-B quese agruparam em pentâmeros de ligação de gangliosídeo, em níveis de até0,4% da proteína solúvel total conforme determinado por ELISA dependentede gangliosídeo. As células NT-1 transgênicas também acumularam subuni-dades de LT-A modificadas, algumas das quais se agruparam com pentâme-ros de LT-B conforme determinado por ELISA dependente de gangliosídeousando anticorpos específicos para LT-A.
Um vetor binário para transformação de célula de planta media-da por Agrobacterium foi construído a partir de um vetor binário básico(pBBV) modificado no único sítio de BamHI com um ligante de Agel paraadição de VP2 e um cassete de expressão de marcador selecionável. VP2 éflanqueado por um elemento RB7 MAR (Patente U.S. N° 5.773.689; PatenteU.S. N9 5.773.695; Patente U.S. N° 6.239.328, WO 94/07902, e WO97/27207) e o promotor de CsVMV, com 3' UTR de ORF 24 de Agrobacteri-um tumifaciens (Atu) (número de acesso do GenBank X00493). O marcadorselecionável, PAT, é regulado pelo promotor de Ubiquitina 10 de Arabidopsisthaiiana (At) (Plant J. 1997. 11 (5): 1017; Plant Mol. Biol. 1993. 21(5):895; Ge-netics, 1995, 139(2):921) e 3' UTR de ORF 1 de Atu (Patente U.S. No.5428147; Plant Molecular Biology. 1983. 2:335; número de acesso do Gen-Bank X00493); o plasmídeo resultante pDAB2423 é mostrado na Figura 13.
Vírus da doença infecciosa da bursa (IBD), cepa Ehime 91 muitovirulenta (J Vet Med Sci. 1992. 54(1):153; JVI. 2002. 76(11):5637) foi usadopara produzir a seqüência de nucleotídeo de VP2 otimizada em planta, combase na seqüência de aminoácido de VP2 relatada (número de acesso doGenBank AB024076) com os aminoácidos #454-456 da cepa UK661 (núme-ro de acesso do GenBank NC_004178). (veja Figura 14 para a seqüência deVP2).
EXEMPLO 2: PREPARAÇÃO DE NICOTIANA TABACUMTRANSGÊNICOTrês a 4 dias antes da transformação, uma cultura de NT-1 deuma semana de idade foi subeultivada para meio fresco por adicionar 2 mlda cultura de NT-1 em 40 mL de meio NT-1. A subcuítura foi mantida no es-curo a 25+1°C em um agitador a 100 rpm.
Meio NT-1
<table>table see original document page 28</column></row><table>
Estoque de B1 Inositol (100x) (1 litro)
Tiamina HCl (VitB1)-0,1 g
MES (20x) (1 litro)
MES (ácido 2-N-morfolinoetanossulfônico) - 10 g
Mioinositol -10 g
Miller's I (1 litro)
KH2PO4 - 60 g<table>table see original document page 29</column></row><table>
Agrobacterium tumefaciens contendo o vetor de expressão deinteresse foi estriado a partir de um estoque de glicerol sobre uma placa demeio LB contendo 50 mg/L de espectinomicina. A cultura bacteriana foi incu-bada no escuro a 30°C por 24 a 48 horas. Uma colônia bem formada foi se-lecionada, e transferida para 3 mL de meio YM contendo 50 mg/L de espec-tinomicina. A cultura líquida foi incubada no escurto a 30 °C em um agitadorincubador a 250 rpm até que a OD6oo fosse 0,5 - 0,6. Isso levou aproxima-damente 24 horas.
Meio LB
Reaaente Por litro
<table>table see original document page 29</column></row><table>Meio YM
<table>table see original document page 30</column></row><table>
(Alternativamente, YM na forma de pó pode ser comprado (Gibco BRL; catá-logo #10090-011). Para fazer meio de cultura líquido, adicionar 11,1 g a 1litro de água)
No dia da transformação, 1 μL de acetosiringona 20 mM foi adi-cionado por mL de cultura de NT-1. O estoque de acetosiringona foi feito emetanol no dia da transformação. As células NT-1 foram Iesionadas para au-mentar a eficácia da transformação. Para a lesão, a cultura em suspensãofoi sugada repetidamente (20 vezes) para dentro e para fora de uma pipetaestéril de 5 mL de orifício amplo. Quatro mililitros da suspensão foram trans-feridos em cada uma de 10 placas de Petri de 60 χ 15 mm. Uma placa foireservada para ser usada como um controle não transformado. Aproxima-damente, 50 a 100 μL de suspensão de Agrobacterium foram adicionados acada uma das 9 placas restantes. As placas foram envolvidas com parafilmee então incubadas no escuro em um agitador a 100 rpm a 25 + 1°C por 3dias.
As células foram transferidas para um tubo de centrifuga cônicode 50 mL, estéril, e trazidas para um volume final de 45 mL com meio NTC(meio NT-1 contendo 500 mg/L de carbenicilina, adicionado após autoclava-ção). Elas foram misturadas, e então centrifugadas a 1000 rpm por 10 minem uma centrífuga equipada com um rotor de balde oscilante. O sobrena-dante foi removido, e o precipitado resultante foi ressuspenso em 45 mL deNTC. A lavagem foi repetida. A suspensão foi centrifugada, o sobrenadantefoi descartado, e o precipitado foi ressuspenso em 40 mL de NTC. Alíquotasde 5mL foram plaqueadas em cada placa de Petri (150 χ 15 mm) contendomeio NTCB10 (meio NTC solidificado com 8 g/L ágar/ágar; suplementadocom 10 mg/L de bialafos, adicionado após autoclavação). As placas foramenvolvidas com parafilme e cultivadas no escuro a 25 ± 1°C. Antes de trans-ferir para a sala de cultura, as placas foram deixadas abertas na capela defluxo laminar para permitir que o excesso de líquido evaporasse. Após 6 a 8semanas, os supostos transformantes apareceram. Eles foram selecionadose transferidos para NTCB5 (meio MTC solidificado com 8 g/l ágar/ágar; su-plementado com bialafos 5 mg/l, adicionado após autoclavação). As placasforam envolvidas com parafilme e cultivadas no escuro a 25 + 1 °C.
Supostos transformantes apareceram como pequenos agrupa-mentos de calo em um fundo de células mortas, não transformadas. Essescalos foram transferidos para meio NTCB5 e deixados crescer por váriassemanas. Porções de cada suposto transformante foram selecionadas poranálise por ELISA. Após pelo menos 2 execuções de ELISA, as linhagenscom os níveis de antígeno mais altos foram selecionadas. A quantidade dematerial de calo para cada uma das linhagens de elite foi então multiplicadaem culturas de placa e ocasionalmente em culturas líquidas.
EXEMPLO 3: ESTABILIDADE DE PROTEÍNAS FEITAS EM PLANTA
Proteínas extraídas de fontes recombinantes ou nativas são fre-qüentemente instáveis devido a proteases, glicosilases, Iipases ou outrasenzimas que co-purifucam com a proteína e componentes celulares. As pro-teínas e partículas imunoprotetorasllolàdas de células NT-1 são inerente-mente estáveis e são resistentes a muitos tipos diferentes de atividades deprocessamento à jusante. Na Figura 14, células CHN-18 foram colhidas deum fermentador de 10 litros em fase estacionária e filtradas, clarificadas porcentrifugação e microfluidizadas. Os sobrenadantes foram então filtradosatravés de um filtro de 0,2 ou 0,45 mícron para remover qualquer agentebacteriano que pudesse ter sido introduzido durante a manipulação atravésde filtração ou microfluidização, nenhum estabilizante foi adicionado a essassuspensões, a estabilidade é inerente às proteínas derivadas dessas célulastransgênicas. O material foi então armazenado a 2-7°C, 25°C ou congela-das a -80°C; o material foi descoberto ser estável em todas as temperaturas,mas o resultado mais interessante é que, quando mantidas a 25 °C (tempe-ratura ambiente) as proteínas isoladas foram descobertas ser estáveis (mos-trado na Figura 14). Embora variação no sinal tenha sido vista mês a mês, aquantidade de proteína isolada mostrou estabilidade notável após váriosmeses, a meia-vida que pode ser calculada a partir desses dados indica umameia-vida extrapolada de 8 meses (amostra de 0,45 mícron) e maior do queum a vários anos para a amostra filtrada em 0,2 mícron.
Deve ser compreendido que os exemplos e modalidades descri-tos aqui são para fins ilustrativos apenas e que várias modificações ou alte-rações com relação a eles serão sugeridas a versados na técnica e devemestar incluídas dentro do espírito e competência desse pedido e do escopodas reivindicações anexas. Além disso, quaisquer elementos ou limitaçõesde qualquer invenção ou modalidade dessa descrita aqui, podem ser combi-nados com qualquer e/ou todos os outros elementos ou limitações (individu-almente ou em qualquer combinação) ou qualquer outra invenção ou moda-lidade dessa descrita aqui, e todas as tais combinações estão contempladasdentro do escopo da invenção sem limitação a ela.
EXEMPLO 4: FORMULAÇÕES DE MEIOS
A seguir estão formulações de meios usados para cultivar ascélulas NT-1 nativas e células NT-1 recombinantes em ágar e em suspen-sões líquidas. Adicionalmente, a formulação de meio para criopreservar NT-1 e NT-1 recombinanté é definida.
PREPARAÇÃO DE MEIOS
A. Ingredientes
A menos que indicado de outra maneira, usar fornecedores con-fiáveis para obter químicos.
<table>table see original document page 32</column></row><table><table>table see original document page 33</column></row><table>Β. Formulações1. Lote de sais 10X
a. Ingredientes Quantidade/litro
<table>table see original document page 33</column></row><table>b. Preparação
i. Adicionar 750 mL de água RO/Dl a um recipiente apropriado. ii. Colocar o recipiente sobre uma placa de agitação aquecida emisturar com uma barra de agitação. Pode ser necessário aquecer a águapara dissolver todos os componentes.
iii. Adicionar todos os ingredientes à água.
iv. Após o componente final estar dissolvido, completar o volumepara 1000 mL.
v. Esterilizar a solução através de um filtro de 0,2 μ.
vi. Armazenar em temperatura ambiente e especificar uma datade validade de 1 ano.
B. 2. Bialafos (5 mg/mL)
a. Ingredientes Quantidade/50mL
<table>table see original document page 34</column></row><table>
b. Preparação
i. Adicionar 50 mL de água RO/Dl a um recipiente apropriado.
ii. Colocar o recipiente sobre uma placa agitadora e misturar comuma barra de agitação.
iii. Adicionar o Bialafos à água e misturar até dissolver. iv. Esterilizar através de um filtro de 0,2 μ.
ν. Armazenar congelado e especificar uma data de validade de 1ano.
B. 3. Vitaminas MS Modificadas 100X
a. Ingredientes Quantidade/litro
<table>table see original document page 34</column></row><table>
b. Preparação
i. 500 mL de água RO/Dl a um recipiente apropriado.
ii. Colocar o recipiente sobre uma placa agitadora misturar comuma barra de agitação.
iii. Adicionar todos os componentes à água.
iv. Após o componente final estar dissolvido, completar o volumepara 1000 mL.
ν. Esterilizar através de um filtro de 0,2 μ.
vi. Armazenar a 2QC-10-C e especificar uma data de validade de1 ano.
B. 4. L-Prolina (2.5 M)
<table>table see original document page 35</column></row><table>
b. Preparação
i. Adicionar 50 mL de água RO/Dl a um recipiente apropriado.
ii. Colocar o recipiente sobre uma placa agitadora e misturar comuma barra de agitação.
iii. Adicionar a L-Prolina à água.
iv. Após a L-Prolina estar dissolvida, completar o volume para100 mL.
v. Armazenar a 2°C-10°C e especificar uma data de validade de3 meses.
B. 5. Placas de áaar NT-1
<table>table see original document page 35</column></row><table>
b. Preparação
i. Adicionar 500 mL de água RO/Dl a um recipiente apropriado.
ii. Colocar o recipiente sobre uma placa agitadora aquecida emisturar com uma barra de agitação.
iii. Adicionar todos os componentes à água exceto o ágar.
iv. Após o componente final estar dissolvido, completar o volumepara 1000 mL.
v. Adicionar o ágar à solução e aquecer até o ágar estar comple-tamente dissolvido.
vi. Enquanto a solução ainda estiver quente, esterilizar a soluçãoatravés de um filtro de 0,2 μ.
vii. Deixar o meio esfriar até estar próximo da temperatura ambiente.
viii. Pipetar aproximadamente 25 mL de ágar em cada placa dePetri estéril de 15 cm2 e deixar cada placa esfriar completamente.
ix. Armazenar as placas invertidas a 2SC - 10eC e especificaruma data de validade de 3 meses.
B. 6. Meio NT-1 Líquido
a. Ingredientes Quantidade/litro
Fosfato de Potássio, Dibásico, 3*H20 180,0 g
Sacarose 30,0 g
Lote de Sais 10X 100mL
2,4-D (10 mg/ml) 0,11 mL
Água RO/Dl 1000 mL
b. Preparação
i. Adicionar 500 mL de água R0/D1 a um recipiente apropriado.
ii. Colocar o recipiente sobre uma placa agitadora e misturar comuma barra de agitação.
iii. Adicionar todos os componentes à água.
iv. Após o componente final estar dissolvido, completar o volumepara 1000 mL.
v. Repartir em alíquotas de 750 e autoclavar a > 121 -C por 30minutos.
vi. Armazenar a 2-C-10-C e especificar uma data de validade de 1 ano.
B. 7. Meio NH VP
a. Ingredientes Quantidade/litro
Mistura de Sal de Murashige & Skoog 4,33 g
Vitaminas MS Modificadas 100X 10,0 mL
2,4-D (10 mg/mL) 222 uL
L-Prolina (2.5M) 2,4 mLa. Inqredientes Quantidade/litro
<table>table see original document page 37</column></row><table>
b. Preparação
i. Adicionar 500 mL de água RO/Dl a um recipiente apropriado.
ii. Colocar o recipiente sobre uma placa agitadora e misturar comuma barra de agitação.
iii. Adicionar todos os componentes à água.
iv. Após o componente final ter dissolvido, completar o volumepara 1000 mL.
v. Repartir em alíquotas de 500 ml e autoclavar a £121 sC por 30minutos
vi. Armazenar a 2SC-10?C e especificar uma data de validade de1 ano.
B. 8. Meio de criopreservacão
a. Ingredientes Quantidade
<table>table see original document page 37</column></row><table>
b. Preparação
i. Adicionar o glicerol a um recipiente apropriado.
ii. Colocar o recipiente sobre uma placa agitadora aquecida emisturar com uma barra de agitação.
iii. Adicionar o meio NT1VP ao recipiente.
iv. Misturar em calor baixo e adicionar lentamente a sacaroseestar dissolvida.
v. Adicionar o DMSO.
vi. Esterilizar através de um filtro de 0,2 μ.
vii. Armazenar o meio a 2eC-10QC e especificar uma data de va-lidade de 1 ano.EXEMPLO 5
AVALIAÇÃO DE MEIO DE CRESCIMENTO E CULTURAS DE SUSPEN-SÃO DE CÉLULA DE PLANTA PARA SUPORTAR CRESCIMENTO DE Ml-COPLASMA
A linhagem celular de planta derivada de tabaco recombinante,CHN-18 NT-1, e os meios de crescimento descritos aqui não suportam cres-cimento de micoplasma. O objetivo desse estudo foi determinar se o meio decrescimento NT-1 ou culturas de suspensão de NT-1 e CHN-18 NT-1 podemsuportar o crescimento de duas espécies de micoplasma, Mycoplasma hyo-rhinis e Acholeplasma laidlawii.
O método seguiu 9 CFR 113.28. O material de teste foi colocadosobre placa de ágar de micoplasma no dia 0 do teste, antes da inoculaçãocom micoplasma, para demonstrar ausência de micoplasma no material deteste. O material de teste inoculado com os controles positivos de micoplas-ma não foi colocado sobre o ágar de micoplasma no dia 0 do teste. As sub-culturas do material de teste de inoculado com micoplasma a ágar de mico-plasma foram realizadas nos dias 3, 7, 10 e 14. No primeiro dia do teste,controles positivos foram preparados por inocular caldo de micoplasma eágar com controles positivos de micoplasma. Um controle negativo foi prepa-rado por inocular caldo de micoplasma e ágar com caldo de micoplasma. Oscontroles positivos e negativos foram subcultivados sobre ágar de mico-plasma nos dias 3, 7, 10 e 14. Todas as placas de ágar de micoplasma fo-ram examinadas 10-14 dias após inoculação quanto a colônias de mico-plasma típicas.
Os materiais de teste eram meio de crescimento de célula deplanta NT-1 e meio de crescimento de célula de planta CHN-18 assim comoas culturas celulares de suspensão de planta NT-1 e CHN-18. As culturas deplanta em suspensão foram inoculadas com micoplasma quando elas esta-vam crescendo ativamente, culturas de três a quatro dias de idade.
O meio de crescimento NT-1 não suportou o crescimento de mi-coplasma (Tabela 1). Nenhuma colônia de micoplasma observada em qual-quer uma das placas de ágar subcultivou a partir de meio de crescimentoNT-1 inoculado com organismos de controle positivo de micoplasma. O meioNT-1 que foi colocado sobre as placas de ágar antes dos controles positivosde micoplasma terem sido adicionados também não mostraram crescimentode micoplasma. Os controles positivos tiveram crescimento turvo no caldo demicoplasma e colônias de micoplasma foram observadas em todas as pla-cas de ágar de micoplasma. O controle negativo não cresceu no caldo demicoplasma e não houve colônias de micoplasma sobre nenhuma das pla-cas de ágar de micoplasma.
<table>table see original document page 39</column></row><table>
TNTC: numerosas demais para contar, >100 colônias por píaca
ND: não realizado, meio NT-1 sem organismos de controle positivo de mico-plasma foi testado no dia 0 e não teve colônias de micoplasma.
A cultura em suspensão de célula NT-1 não suportou o cresci-mento de micoplasma (Tabela 2). Nenhuma colônia de micoplasma obser-vada em qualquer uma das placas de ágar subcultivou a partir de uma cultu-ra de suspensão de célula NT-1 inoculada com organismos de controle posi-tivo de micoplasma. A cultura de suspensão de célula NT-1 que foi colocadasobre placas de ágar antes dos controles positivos de micoplasma teremsido adicionados também não mostraram crescimento de micoplasma. Oscontroles positivos tiveram crescimento turvo no caldo de micoplasma e co-lônias de micoplasma foram observadas em todas as placas de ágar de mi-coplasma. O controle negativo não teve crescimento no caldo de micoplas-ma e nenhuma colônia de micoplasma em nenhuma das placas de ágar demicoplasma.
Tabela 2. Crescimento de micoplasma em cultura de suspensão de célula NT-1
<table>table see original document page 40</column></row><table>
TNTC: numerosas demais para contar, >100 colônias por placa
ND: não realizado, cultura de suspensão de célula NT-1 sem organismos decontrole positivo de micoplasma foi testada no dia 0 e não tinha colônias demicoplasma.
O meio de crescimento e a cultura de suspensão de célula CHN-18 não suportaram o crescimento de micoplasma (Tabela 3). Ao houve colô-nias de micoplasma observadas em nenhuma das placas de ágar subculti-vadas a partir de meio de crescimento ou cultura de suspensão de célulaCHN-18 que foram inoculadas com organismos de controle positivo paramicoplasma. Nenhum crescimento de micoplasma foi observado no meioCHN-18 ou na cultura de suspensão de célula CHN-18 que foi colocada so-bre placas de ágar antes dos controles positivos de micoplasma terem sidoadicionados. Os controles positivos tiveram crescimento turvo no caldo demicoplasma e as colônias de micoplasma foram observadas em todas asplacas de ágar de micoplasma. o controle negativo não teve crescimento nocaldo de micoplasma e nenhuma colônia de micoplasma em nenhuma dasplacas de ágar.
<table>table see original document page 41</column></row><table>
TNTC: numerosas demais para contar, >100 colônias por placa
ND: não realizado, meio de crescimento e cultura de suspensão de célula
CHN-18 sem organismos de controle positivo de micoplasma foram testadosno dia 0 e não tinham colônias de micoplasma.
Micoplasma não cresceu nem no meio de crescimento NT-1 u-sado na produção das células NT-1 nem no meio de crescimento CHN-18.Além disso, nem uma cultura de suspensão de NT-1 nem uma cultura desuspensão de células CHN-18 foram capazes de suportar crescimento demicoplasma. Esses dados demonstram que os meios de crescimento NT-1 eCHN-18, e as culturas de células NT-1 e CHN-18 não são capazes de supor-tar o crescimento de micoplasma.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
<110> Mihaliak, Charles A.
Fanton( Matthew J.McMillen, Janis K.
<120> PREPARAÇÃO DE LINHAGENS CELULARES PRINCIPAIS DE VACINA USANDO
CULTURAS DE SUSPENSÃO DE PLANTA RECOMBINANTE<130> DAS-13 OX
<150> US 60/733,702
<151> 2005-11-04
<160> 13
<170> PatentIn versão 3.3
<210> 1<211> 1753
<212> DNA
<213> Vírus da doença de Newcastle
<220>
<221> Região de interesse biológico
<222> (1) . . (1753)
<223> Vide figuras Ia e Ib.
<220>
<221> Região de interesse biológico
<222> (1) . . (17 53)
<223> Seqüência codificante otimizada de planta do gene hemaglutini-
na/neuraminidase (HN) da cepa "Lasota" do vírus da doença deNewcastle (NDN)<400> 1
atggacagag cagtttcaca agtggcccta gagaatgatg agagggaagc caagaatacc 60
tggaggctta tattcagaat agccatctta ttccttactg tggtcaccct agcaatctct 120gttgcatccc tcctctattc tatgggagca agcaccccct cagacttggt gggcataccc 180acaagaatct ctagggcaga agaaaaaatc accagtaccc ttggctccaa ccaagatgtt 240gtggacagaa tctacaaaca ggtggcactt gaaagtccac ttgcattact caacacagag 300actaccatca tgaatgcaat taccagccta tcctatcaaa ttaatggggc tgccaacaat 360tcaggttggg gagccccaat tcatgatcca gactatattg gaggtattgg caaagagctt 420
attgtagatg atgcttcaga tgttacatct ttctatcctt cagctttcca ggaacacctg 480
aatttcattc ctgcacccac aactgggagt gggtgcacta gaataccctc atttgacatg 540
agtgctacac actactgcta cacacataat gttattctct ctggctgtag ggaccactct 600
cactcttatc aatacttagc tcttggagtt ctcagaacat ctgctactgg tagagtcttt 660
ttctcaactc ttaggagtat caacctagat gatacacaaa ataggaaaag ttgctctgta 720
tctgctacac ctttgggctg tgatatgcta tgcagtaaag taacagaaac tgaagaagag 780
gactataatt ctgctgtccc tacaaggatg gtgcatggca gattgggttt tgatggtcaa 840
tatcatgaaa aagatttgga tgtcactaca ttgtttgggg attgggtagc taattaccca 900
ggagttggag gtggtagctt cattgactcc agagtctggt tctctgtcta tggtggttta 960
aaacctaaca gtcctagtga tactgtgcaa gagggaaagt atgttatcta caagaggtat 1020
aatgatactt gtcctgatga acaggattac cagattagga tggctaagtc atcatacaaa 1080
ccaggaagat ttggaggtaa gaggatacaa caagctattt tgagtattaa ggttagcaca 1140
tcattgggag aggacccagt ccttactgtt ccaccaaaca ctgtaacact catgggagct 1200
gagggaagga ttttaactgt tggtactagc cattttcttt atcagagagg aagttcctat 1260
tttagcccag cattactgta tccaatgact gtgagcaaca agacagctac attacattca 1320
ccatatactt ttaatgcttt tacaagacct ggatcaattc cttgccaggc ttcagctaga 1380
tgtccaaatt catgtgtgac tggagtttac actgatcctt accctttgat attttacaga 1440
aatcatacct tgagaggggt ttttggaaca atgttggatg gtgttcaagc taggctcaat 1500
cctgcctctg ctgtttttga ttctacatca agatcaagaa taaccagggt ttcctctagt 1560
tccactaagg cagcatatac tacctccaca tgtttcaaag ttgtaaagac taacaaaact 1620
tattgtctga gcatagctga gatctctaac actctttttg gggagttcag aattgttcca 1680
cttttggtgg aaattctgaa ggatgatggt gtaagggaag caagatctgg ttaagtcttc 1740
aggtaccgag ctc 1753
<210> 2
<211> 577
<212> PRT
<213> Vírus da doença de Newcastle
<220>
<221> Região de interesse biológico
<223> Veja figuras 1a e 1b.
<220><221> Região de interesse biológico
<223> Seqüência de proteína otimizada de planta do gene hemoglutini-
na/neuraminidase (HN) da cepa "Lasota" do vírus da doença de
Newcastle
<400> 2
Met Asp Arg Ala Val Ser Gln Val Ala Leu Glu Asn Asp Glu Arg Glu1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Trp Arg Leu Ile Phe Arg Ile Ala He Leu Phe Leu20 25 30
Thr Val Val Thr Leu Ala Ile Ser Val Ala Ser Leu Leu Tyr Ser Met35 40 45
Gly Ala Ser Thr Pro Ser Asp Leu Val Gly Ile Pro Thr Arg Ile Ser
50 55 60
Arg Ala Glu Glu Lys Ile Thr Ser Thr Leu Gly Ser Asn Gln Asp Val
65 70 75 80
Val Asp Arg Ile Tyr Lys Gln Val Ala Leu Glu Ser Pro Leu Ala Leu
85 90 95
Leu Asn Thr Glu Thr Thr Ile Met Asn Ala Ile Thr Ser Leu Ser Tyr
100 105 110
Gln Ile Asn Gly Ala Ala Asn Asn Ser Gly Trp Gly Ala Pro Ile His
115 120 125
Asp Pro Asp Tyr Ile Gly Gly Ile Gly Lys Glu Leu Ile Val Asp Asp
130 135 140
Ala Ser Asp Val Thr Ser Phe Tyr Pro Ser Ala Phe Gln Glu His Leu
145 150 155 160
Asn Phe Ile Pro Ala Pro Thr Thr Gly Ser Gly Cys Thr Arg Ile Pro
165 170 175
Ser Phe Asp Met Ser Ala Thr His Tyr Cys Tyr Thr His Asn Val Ile
180 185 190
Leu Ser Gly Cys Arg Asp His Ser His Ser Tyr Gln Tyr Leu Ala Leu
195 200 205
Gly Val Leu Arg Thr Ser Ala Thr Gly Arg Val Phe Phe Ser Thr Leu210 215 220
Arg Ser Ile Asn Leu Asp Asp Thr Gln Asn Arg Lys Ser Cys Ser Val225 230 235 240
Ser Ala Thr Pro Leu Gly Cys Asp Met Leu Cys Ser Lys Val Thr Glu
245 250 255
Thr Glu Glu Glu Asp Tyr Asn Ser Ala Val Pro Thr Arg Met Val His
260 265 270
Gly Arg Leu Gly Phe Asp Gly Gln Tyr His Glu Lys Asp Leu Asp Val
275 280 285
Thr Thr Leu Phe Gly Asp Trp Val Ala Asn Tyr Pro Gly Val Gly Gly
290 295 300
Gly Ser Phe Ile Asp Ser Arg Val Trp Phe Ser Val Tyr Gly Gly Leu305 310 315 320
Lys Pro Asn Ser Pro Ser Asp Thr Val Gln Glu Gly Lys Tyr Val Ile
325 330 335
Tyr Lys Arg Tyr Asn Asp Thr Cys Pro Asp Glu Gln Asp Tyr Gln Ile
340 345 350
Arg Met Ala Lys Ser Ser Tyr Lys Pro Gly Arg Phe Gly Gly Lys Arg
355 360 365
Ile Gln Gln Ala Ile Leu Ser Ile Lys Val Ser Thr Ser Leu Gly Glu
370 375 380
Asp Pro Val Leu Thr Val Pro Pro Asn Thr Val Thr Leu Met Gly Ala385 390 395 400
Glu Gly Arg Ile Leu Thr Val Gly Thr Ser His Phe Leu Tyr Gln Arg
405 410 415
Gly Ser Ser Tyr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Tyr Pro Met Thr Val Ser
420 425 430
Asn Lys Thr Ala Thr Leu His Ser Pro Tyr Thr Phe Asn Ala Phe Thr
435 440 445
Arg Pro Gly Ser Ile Pro Cys Gln Ala Ser Ala Arg Cys Pro Asn Ser
450 455 460
Cys Val Thr Gly Val Tyr Thr Asp Pro Tyr Pro Leu Ile Phe Tyr Arg465 470 475 480
Asn His Thr Leu Arg Gly Val Phe Gly Thr Met Leu Asp Gly Val Gln
485 490 495
Ala Arg Leu Asn Pro Ala Ser Ala Val Phe Asp Ser Thr Ser Arg Ser500 505 510
Arg Ile Thr Arg Val Ser Ser Ser Ser Thr Lys Ala Ala Tyr Thr Thr
515 520 525
Ser Thr Cys Phe Lys Val Val Lys Thr Asn Lys Thr Tyr Cys Leu Ser530 535 540
Ile Ala Glu Ile Ser Asn Thr Leu Phe Gly Glu Phe Arg Ile Val Pro545 550 555 560
Leu Leu Val Glu Ile Leu Lys Asp Asp Gly Val Arg Glu Ala Arg Ser565 570 575
Gly
<210> 3
<211> 1647
<212> DNA
<213> Vírus da influenza aviária
<220>
<221> Região de interesse biológico
<222> (1)..C1647)
<223> Ver figura 10
<220>
<221> Região de interesse biológico
<222> (1)..(1647)
<223> Seqüência de DNA do gene hemoglutinina (HA) do vírus da influen-
za aviária (AIV) A/turkey/Wisconsin/68 (H5N9).<400> 3
gaccaaatct gcatcggtta tcatgcaaac aattcaacaa aacaagttga cacaatcatg 60gagaagaatg tgacggtcac acatgctcaa gatatactgg aaaaagagca caacgggaaa 120ctctgcagtc tcaaaggagt gaggcccctc attctgaagg attgcagtgt ggctggatgg 180cttcttggga acccaatgtg tgatgagttc ctaaatgtac cggaatggtc atatattgta 240gagaaggaca atccaaccaa tggcttatgt tatccgggag acttcaatga ttatgaagaa 300
ctgaagtatt taatgagcaa cacaaaccat tttgagaaaa ttcaaataat ccctaggaac 360
tcttggtcca atcatgatgc ctcatcagga gtgagctcag catgcccata caatggtagg 420
tcttcctttt tcaggagtgt ggtgtggttg atcaagaaga gtaatgtata cccaacaata 480
aagaggacct acaataacac caatgtagag gaccttctga tattgtgggg aatccatcac 540
cctaatgatg cagcggaaca aacggaactc tatcagaact cgaacactta tgtgtctgta 600
ggaacatcaa cactaaatca gaggtcaatt ccagaaatag ctaccaggcc caaagtgaat 660
ggacaaagtg gaagaataga atttttctgg acaatactaa ggccgaacga tgcaatcagc 720
tttgaaagta atgggaactt tatagctcct gaatatgcat acaagatagt taaaaaggga 780
gattcagcaa tcatgagaag cgaactggag tatggcaact gtgataccaa atgtcagacc 840
ccagtgggtg ctataaattc cagtatgcct tttcacaatg ttcatcccct taccattgga 900
gagtgtccca aatatgtcaa atcagataaa ctggtccttg caacaggact gaggaacgtg 960
cctcagagag aaacaagagg tctgtttgga gcaatagcag gattcataga aggggggtgg 1020
caaggaatgg tagatggatg gtatggttac catcatagca acgagcaggg aagtggatat 1080
gctgcagaca aagagtccac tcagaaagca atcgacggga tcaccaataa agtcaactca 1140
atcattgaca aaatgaacac tcaattcgaa gccgttggga aagaattcaa caacttagaa 1200
aggagaatag aaaatttgaa taagaaaatg gaagatggat ttctagatgt atggacttac 1260
aatgcagaac ttctggtgct catggaaaat gaaagaactc tggatttcca tgattcatat 1320
gtcaagaacc tatacgataa ggtccgactc cagctgagag ataatgcaaa agaattgggc 1380
aatgggtgtt tggagttctc ccacaaatgt gacaatgaat gcatggaaag tgtgagaaac 1440
ggaacgtatg actatccaca atactcagaa gaatcaaggc tgaacagaga ggaaatagat 1500
ggagtcaaat tggagtcaat gggcacctat cagatactat caatttactc aacagtggcg 1560
agttccctag cactggcaat catggtagct ggtctgtctt tttggatgtg ctccaatgga 1620
tcattgcaat gcagaatttg catctag 1647
<210> 4
<211> 548
<212> PRT
<213> Vírus da influenza aviária
<220>
<223> Ver figura 10.
<220><221> Região de interesse biológico
<223> Seqüência de DNA do gene hemoglutinina (HA) do vírus da influen-
za aviária (AIV) A/turkey/Wisconsin/68 (H5N9).
<400> 4
Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Lys Gln Val1 5 10 15
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile
20 25 30
Leu Glu Lys Glu His Asn Gly Lys Leu Cys Ser Leu Lys Gly Val Arg
35 40 45
Pro Leu Ile Leu Lys Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn
50 55 60
Pro Met Cys Asp Glu Phe Leu Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val65 70 75 80
Glu Lys Asp Asn Pro Thr Asn Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn
85 90 95
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys Tyr Leu Met Ser Asn Thr Asn His Phe Glu
100 105 110
Lys Ile Gln Ile Ile Pro Arg Asn Ser Trp Ser Asn His Asp Ala Ser 115 120 125
Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Asn Gly Arg Ser Ser Phe Phe
130 135 140
Arg Ser Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Ser Asn Val Tyr Pro Thr Ile145 150 155 160
Lys Arg Thr Tyr Asn Asn Thr Asn Val Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp
165 170 175
Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Glu Leu Tyr Gln
180 185 190
Asn Ser Asn Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 195 200 205
Ser Ile Pro Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly210 215 220Arg Ile Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Arg Pro Asn Asp Ala Ile Ser225 230 235 240
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile
245 250 255
Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Arg Ser Glu Leu Glu Tyr Gly
260 265 270
Asn Cys Asp Thr Lys Cys Gln Thr Pro Val Gly Ala Ile Asn Ser Ser
275 280 285
Met Pro Phe His Asn Val His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys
290 295 300
Tyr Val Lys Ser Asp Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val305 310 315 320
Pro Gln Arg Glu Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile
325 330 335
Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His
340 345 350
Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln
355 360 365
Lys Ala Ile Asp Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys
370 375 380
Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Asn Leu Glu385 390 395 400
Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp
405 410 415
Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg
420 425 430
Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Tyr Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val
435 440 445
Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Leu
450 455 460
Glu Phe Ser His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn465 470 475 480Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ser Arg Leu Asn Arg
485 490 495
Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Thr Tyr Gln Ile
500 505 510
Leu Ser Ile Tvr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met
515 520 525
Val Ala Gly Leu Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys
530 535 540
Arg Ile Cys Ile545
<210> 5
<211> 28<212> DNA
<213> Seqüência sintética
<220>
<221> Região de interesse biológico
<222> (1)..(28)
<223> Iniciador PCR, CVM-Asc, usado para finalizar o promotor do vírus
do mosaico da nervura da mandioca constitutivo em pCP!H.<400> 5
atggcgcgcc agaaggtaat tatccaag 28
<210> 6<211> 24
<212> DNA
<213> Seqüência sintética
<220>
<221> Região de interesse biológico
<222> (1)..(24)
<223> Iniciador PCR, CVM-Xho, usado para finalizar o promotor do vírus
da nervura da mandioca constitutivo em pCP!H.
<400> 6atctcgagcc atggtttgga tcca 24
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Seqüência sintética
<220>
<221> Região de interesse biológico
<222> (1)..(25)
<223> Iniciador mutagênico usado para criar um sítio de NcoI
<400> 7
tgccatggtg atgtgtggtc tacaa 25
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> Seqüência sintética
<220>
<221> Região de interesse biológico
<222> (1).. (23)
<223> Iniciador de sentido direto complementar à região 5'.
<400> 8
gatctgacaa gtcaagaaaa ttg 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Seqüência sintética
<220>
<221> Região de interesse biológico
<222> (1) . . (23)
<223> Iniciador mutagênico usado para criar um sítio de XhoI
<400> 9
agctcgagct gtgtgagtga gtg 23
<210> 10<211> 1368
<212> DNA
<213> Vírus da doença infecciosa da Bursa
<220>
<221> Região de interesse biológico
<222> (1)..(1368)
<223> Vide figura 14.
<220>
<221> Região de interesse biológico
<222> (1)..(1368)
<223> Seqüência de DNA do gene VP2 do vírus da doença infeccionsa
Bursa<400> 10
atgaccaacc tccaagatca aactcaacag attgttccct tcatacgcag ccttctcatg 60
ccaaccactg gacctgcttc cattcctgat gacaccttgg agaagcacac tctccgctct 120gagacctcaa cctacaactt gactgttggt gacactggct ctgggttgat tgtctttttc 180cctgggttcc ctggctccat tgtgggtgct cactacacat tgcagtccaa tggcaactac 240aagtttgatc aaatgctctt gactgcccag aatcttccag cctcctacaa ctattgccgt 300cttgtgtctc gctccctcac agtgaggtcc tcaacactcc ctggtggagt gtatgcactc 360aatggcacca tcaacgcagt gactttccaa ggaagccttt cagaattgac tgatgtgagc 42 0tacaatgggt tgatgtctgc aacagccaac atcaatgaca agattgggaa tgtccttgtt 480ggagaaggag tcaccgtcct ctcactccca acatcctatg atcttggcta tgtgagactt 540ggtgatccca ttcctgccat aggacttgat cccaaaatgg ttgccacatg tgacagctct 600gatcgtccaa gggtttacac catcacagca gctgatgact accaattctc ctcacagtac 660caagctggtg gagtcaccat cacactcttc tcagccaaca tagatgccat cacaagcctc 720agcattggtg gagaacttgt ctttcagaca tctgtccaag ggctcatcct tggtgccacc 780atctacttga ttggctttga tggcactgct gtcatcacca gagcagtggc tgcagacaat 840gggctcacag ctggcactga caacctcatg ccattcaaca ttgtgattcc cacctctgag 900atcacccagc caatcacttc catcaagttg gagatagtga cctcaaagtc cggtggacaa 960gctggtgatc agatgtcctg gtctgcatct gggagcttgg ctgtgaccat tcatggtggc 1020aactaccccg gagccctcag acctgtgact ttggttgcct atgaacgcgt tgcaactggc 1080tctgttgtca ctgttgctgg tgtcagcaac tttgagttga tcccaaatcc tgaacttgca 1140aagaacttggatcctctcaggacttccgcggcctttggtt<210><211><212><213><220><221><223>
<400>
agatctgaagcgcagccttccacactctccttgattgtcttccaatggcatacaactattggagtgtatgttgactgatggggaatgtccggctatgtgaacatgtgacattctcctcacgccatcacaaatccttggtggtggctgcagattcccacctaagtccggtgaccattcatgcgcgttgcaa
tcacagagta tggaaggttt gaccctggtg ccatgaacta cacaaaattg 1200
agagggacag acttggcatc aagactgttt ggccaaccag agagtacact 1260
agtacttcat ggaggttgct gacctcaaca gccctctcaa gatagctgga 1320
tcaaagacat cataagggct attcgtcgca tcgctgtt 136811
1425DNA
Vírus da doença infecciosa da BursaRegião de interesse biológico
Polinucleotídeo (DNA) codificando uma variação de E/91 VP2 (pro-teína estrutural do vírus da doença infecciosa da Bursa)11
acaacatgac caacctccaa gatcaaactc aacagattgt tcccttcata 60
tcatgccaac cactggacct gcttccattc ctgatgacac cttggagaag 120
gctctgagac ctcaacctac aacttgactg ttggtgacac tggctctggg 180
ttttccctgg gttccctggc tccattgtgg gtgctcacta cacattgcag 240
actacaagtt tgatcaaatg ctcttgactg cccagaatct tccagcctcc 300
gccgtcttgt gtctcgctcc ctcacagtga ggtcctcaac actccctggt 360
cactcaatgg caccatcaac gcagtgactt tccaaggaag cctttcagaa 420
tgagctacaa tgggttgatg tctgcaacag ccaacatcaa tgacaagatt 480
ttgttggaga aggagtcacc gtcctctcac tcccaacatc ctatgatctt 540
gacttggtga tcccattcct gccataggac ttgatcccaa aatggttgcc 600
gctctgatcg tccaagggtt tacaccatca cagcagctga tgactaccaa 660
agtaccaagc tggtggagtc accatcacac tcttctcagc caacatagat 720
gcctcagcat tggtggagaa cttgtctttc agacatctgt ccaagggctc 780
ccaccatcta cttgattggc tttgatggca ctgctgtcat caccagagca 840
acaatgggct cacagctggc actgacaacc tcatgccatt caacattgtg 900
ctgagatcac ccagccaatc acttccatca agttggagat agtgacctca 960
gacaagctgg tgatcagatg tcctggtctg catctgggag cttggctgtg 1020
gtggcaacta ccccggagcc ctcagacctg tgactttggt tgcctatgaa 1080
ctggctctgt tgtcactgtt gctggtgtca gcaactttga gttgatccca 1140aatcctgaac ttgcaaagaa cttggtcaca gagtatggaa ggtttgaccc tggtgccatg 1200
aactacacaa aattgatcct ctcagagagg gacagacttg gcatcaagac tgtttggcca 1260
accagagagt acactgactt ccgcgagtac ttcatggagg ttgctgacct caacagccct 1320
ctcaagatag ctggagcctt tggtttcaaa gacatcataa gggctattcg tcgcatcgct 1380
gtttgagtag ttagcttaat cacctagagc tcggtcacca gatct 1425
12
456
PRT
Vírus da doença infecciosa da Bursa
<210><211><212><213><220>
<221> Região de interesse biológico
<223> Variação de polipeptídeo de E/91 VP2 (proteína estrutural do
vírus da doença infecciosa de Bursa) codificada pela SEQ ID NO:11
<400> 12
Met Thr Asn Leu Gln Asp Gln Thr Gln Gln Ile Val Pro Phe Ile Arg1 5 10 15
Ser Leu Leu Met Pro Thr Thr Gly Pro Ala Ser Ile Pro Asp Asp Thr20 25 30
20 Leu Glu Lys His Thr Leu Arg Ser Glu Thr Ser Thr Tyr Asn Leu Thr35 40 45
Val Gly Asp Thr Gly Ser Gly Leu Ile Val Phe Phe Pro Gly Phe Pro
50 55 60
Gly Ser Ile Val Gly Ala His Tyr Thr Leu Gln Ser Asn Gly Asn Tyr 65 70 75 80
Lys Phe Asp Gln Met Leu Leu Thr Ala Gln Asn Leu Pro Ala Ser Tyr
85 90 95
Asn Tyr Cys Arg Leu Val Ser Arg Ser Leu Thr Val Arg Ser Ser Thr-100 105 110
Leu Pro Gly Gly Val Tyr Ala Leu Asn Gly Thr Ile Asn Ala Val Thr115 120 125
Phe Gln Gly Ser Leu Ser Glu Leu Thr Asp Val Ser Tyr Asn Gly Leu130 135 140
Met Ser Ala Thr Ala Asn Ile Asn Asp Lys Ile Gly Asn Val Leu Val145 150 155 160
Gly Glu Gly Val Thr Val Leu Ser Leu Pro Thr Ser Tyr Asp Leu Gly
165 170 175
Tyr Val Arg Leu Gly Asp Pro Ile Pro Ala Ile Gly Leu Asp Pro Lys
180 185 190
Met Val Ala Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile
195 200 205
Thr Ala Ala Asp Asp Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Tyr Gln Ala Gly Gly
210 215 220
Val Thr Ile Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala Ile Thr Ser Leu225 230 235 240
Ser Ile Gly Gly Glu Leu Val Phe Gln Thr Ser Val Gln Gly Leu Ile
245 250 255
Leu Gly Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly Thr Ala Val Ile
260 265 270
Thr Arg Ala Val Ala Ala Asp Asn Gly Leu Thr Ala Gly Thr Asp Asn
275 280 285
Leu Met Pro Phe Asn Ile Val Ile Pro Thr Ser Glu Ile Thr Gln Pro
290 295 300
Ile Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr Ser Lys Ser Gly Gly Gln305 310 315 320
Ala Gly Asp Gln Met Ser Trp Ser Ala Ser Gly Ser Leu Ala Val Thr
325 330 335
Ile His Gly Gly Asn Tyr Pro Gly Ala Leu Arg Pro Val Thr Leu Val
340 345 350
Ala Tyr Glu Arg Val Ala Thr Gly Ser Val Val Thr Val Ala Gly Val
355 360 365
Ser Asn Phe Glu Leu Ile Pro Asn Pro Glu Leu Ala Lys Asn Leu Val
370 375 380
Thr Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ala Met Asn Tyr Thr Lys Leu385 390 395 400
Ile Leu Ser Glu Arg Asp Arg Leu Gly Ile Lys Thr Val Trp Pro Thr
405 410 415
Arg Glu Tyr Thr Asp Phe Arg Glu Tyr Phe Met Glu Val Ala Asp Leu
420 425 430
Asn Ser Pro Leu Lys Ile Ala Gly Ala Phe Gly Phe Lys Asp Ile Ile
435 440 445
Arg Ala Ile Arg Arg Ile Ala Val
450 455
<210> 13
<211> 42
<212> DNA
<213> Vírus da doença infecciosa da Bursa
<220>
<221> Região de interesse biológico
<222> (1)..(42)
<223> Seqüência de DNA codificando códons de terminação da tradução
("stop") usada para terminar a tradução de estrutruas de leitu-ra aberta acidentais, seguida da integração do DNA durante atransformação (inclui sítios de reconhecimento das enzimas derestrição BstEII e Bg1 II).
<400> 13
tgagtagtta gcttaatcac ctagagctcg gtcaccagat ct 42

Claims (12)

1. Cultura de célula de planta para produzir agentes proteiná-ceos que compreende:a) uma linhagem celular de planta estavelmente transformadapara expressar um transgene que codifica um agente proteináceo;b) um meio de crescimento que suporta o crescimento da ditacultura de célula de planta mas que não suporta o crescimento de Myco-plasmataceae e não contém materiais de origem animal;em que a dita linhagem celular de planta é capaz de ser passada continua-mente tal que expressão consistente do transgene seja mantida durante apassagem e em que a dita linhagem celular de planta é capaz de ser crio-preservada tal que a expressão consistente do transgene seja recuperadapela recuperação da criopreservação.
2. Cultura de célula de planta de acordo com a reivindicação 1,em que a linhagem celular de planta transformada é uma linhagem celularde planta inferior, uma linhagem celular de dicotiledônea ou uma linhagemcelular de monocotiledônea.
3. Cultura de célula de planta de acordo com a reivindicação 2,em que a linhagem celular de planta transformada é dicotiledônea.
4. Cultura de célula de planta de acordo com a reivindicação 3,em que a dita linhagem celular de planta transformada é uma linhagem celu-lar de tabaco.
5. Cultura de célula de planta de acordo com a reivindicação 4,em que a dita linhagem celular de tabaco é selecionada a partir de NT-1 ouBY-2.
6. Cultura de célula de planta de acordo com a reivindicação 3,em que a dita linhagem celular transformada de dicotiledônea é derivada deuma planta selecionada a partir de tomate, batata, batata-doce, mandioca,legumes, incluindo alfafa e soja, cenoura, morango, alface, carvalho, bordo,noz, rosa, hortelã, girassol, açafroa, algodão, tabaco, abobora, margarida,canola ou cacto.
7. Cultura de célula de planta de acordo com a reivindicação 2,em que a dita linhagem celular transformada de monocotiledônea é derivadade uma planta selecionada a partir de trigo, turfa, grama, cereal, milho (mai-ze/corn), arroz, aveia, trigo, cevada, sorgo, orquídea, íris, lírio, cebola, bana-na, cana-de-açúcar, sorgo e palma.
8. Cultura de célula de planta de acordo com a reivindicação 2,em que a dita linhagem celular de planta inferior transformada é derivada desamambaias, gimnospermas, coníferas, cavalinhas, licopódios, hepáticas,"hornworts", musgo, algas vermelhas, algas marrons, gametófitos, esporófi-tos de pteridófitas ou algas verdes.
9. Cultura de célula de planta de acordo com qualquer uma dasreivindicações anteriores, em que o agente proteináceo é uma proteína deum vírus de ave.
10. Cultura de célula de planta de acordo com a reivindicação 9,em que a proteína é uma proteína hemaglutinina/neuraminidase de Vírus daDoença de Newcastle (NDV), uma proteína hemaglutinina de Vírus Influenzade Ave (AIV), ou uma proteína VP2 de Vírus da Doença Infecciosa da Bursa.
11.
Cultura de célula de planta de acordo com a reivindicação 9,em que a dita proteína compreende SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 ou SEQID NO: 12.
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100964462B1 (ko) * 2007-07-10 2010-06-16 성균관대학교산학협력단 형질전환 식물 유래의 조류독감 바이러스 백신 및 그 제조방법
US20120190004A1 (en) * 2009-06-23 2012-07-26 Biolex Therapeutics, Inc. Methods and compositions for the cryopreservation of duckweed
AR081302A1 (es) * 2010-06-24 2012-08-01 Brookhaven Science Ass Llc Acumulacion de acidos grasos omega-7 ( -7) en semillas de plantas
CN102559727A (zh) * 2010-12-10 2012-07-11 财团法人工业技术研究院 表达载体及应用微藻产生油脂的方法
US10421420B2 (en) * 2011-01-06 2019-09-24 Ford Global Technologies, Llc Methods and apparatus for reporting state of charge in electric vehicles
CN103999776B (zh) * 2014-06-16 2016-03-09 南京工业大学大丰海洋产业研究院 一种兰科植物快速繁殖培养基配方
CN104017814B (zh) * 2014-06-20 2016-08-24 西南大学 适于家蚕中部丝腺表达的鸡传染性法氏囊病病毒结构蛋白vp2及其表达载体和应用
CN109182370B (zh) * 2018-08-03 2022-06-17 浙江大学 一种植物多基因表达载体、转化子及其应用
CN110338059B (zh) * 2019-07-19 2021-05-04 华南农业大学 一种提高国兰根状茎增殖和分化效率的方法
CN111165357B (zh) * 2020-03-02 2022-03-22 东北林业大学 一种抑制玉蝉花愈伤组织增殖过程中内生菌污染的方法

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU602875B2 (en) 1985-12-18 1990-11-01 British Technology Group Limited Newcastle disease virus gene clones
GB8613481D0 (en) 1986-06-04 1986-07-09 Diatech Ltd Translation of mrna
US5637489A (en) 1986-08-23 1997-06-10 Hoechst Aktiengesellschaft Phosphinothricin-resistance gene, and its use
US5276268A (en) 1986-08-23 1994-01-04 Hoechst Aktiengesellschaft Phosphinothricin-resistance gene, and its use
US5273894A (en) 1986-08-23 1993-12-28 Hoechst Aktiengesellschaft Phosphinothricin-resistance gene, and its use
US5290924A (en) 1987-02-06 1994-03-01 Last David I Recombinant promoter for gene expression in monocotyledonous plants
ZA88319B (en) 1987-02-06 1988-08-12 Lubrizol Enterprises, Inc. Ocs enhancer
US5001060A (en) 1987-02-06 1991-03-19 Lubrizol Enterprises, Inc. Plant anaerobic regulatory element
US5270200A (en) 1988-04-12 1993-12-14 The Plant Cell Research Institute Arcelin seed storage proteins from phaseolus vulgaris
JP2709604B2 (ja) * 1988-06-29 1998-02-04 大日本製薬株式会社 マイコプラズマ汚染の防止または除去
DE68929405T2 (de) 1988-09-06 2003-02-06 Univ St Louis Orale-immunisierung durch verwendung von transgenen pflanzen
DE69033142T2 (de) 1989-12-22 1999-12-23 Du Pont Ortsspezifische rekombination von dns in pflanzenzellen
SE467358B (sv) 1990-12-21 1992-07-06 Amylogene Hb Genteknisk foeraendring av potatis foer bildning av staerkelse av amylopektintyp
US5384253A (en) 1990-12-28 1995-01-24 Dekalb Genetics Corporation Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes
US5612487A (en) 1991-08-26 1997-03-18 Edible Vaccines, Inc. Anti-viral vaccines expressed in plants
US6034298A (en) 1991-08-26 2000-03-07 Prodigene, Inc. Vaccines expressed in plants
US20010053367A1 (en) * 1991-08-26 2001-12-20 Prodigene, Inc. Vaccines expressed in plants
EP0663921B1 (en) 1992-10-05 2002-05-08 North Carolina State University Method for increasing expression and reducing expression variability of foreign genes in plant cells
US6239328B1 (en) 1992-10-05 2001-05-29 North Carolina State University Method for reducing expression variability of transgenes in plant cells
US5426108A (en) 1993-11-10 1995-06-20 American Cyanamid Company Antibiotic 31F508 ALPHA1, ALPHA2, BETA1 and BETA2
US6140075A (en) 1994-07-25 2000-10-31 Monsanto Company Method for producing antibodies and protein toxins in plant cells
AU691707B2 (en) 1994-10-24 1998-05-21 The Administrators Of The Tulane Eductional Fund Oral immunization with transgenic plants
EP0871356A1 (en) 1995-08-29 1998-10-21 University Of Hawaii Production of transgenic plants comprising the winged bean lysine- rich protein
US6395964B1 (en) 1995-10-24 2002-05-28 The Texas A&M University System Oral immunization with transgenic plants
US5773695A (en) 1996-01-26 1998-06-30 North Carolina State University Plant nuclear scaffold attachment region and method for increasing gene expression in transgenic cells
EP0964927B1 (en) 1996-06-20 2012-11-07 The Scripps Research Institute Cassava vein mosaic virus promoters and uses thereof
JP2002533068A (ja) 1998-12-22 2002-10-08 ボイス トンプソン インスティテュート フォア プラント リサーチ トランスジェニック植物に発現される経口で免疫原性の細菌エンテロトキシン
US6320101B1 (en) 1999-06-14 2001-11-20 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Enhancing inorganic carbon fixation by photosynthetic organisms
EP1620550B1 (en) * 2003-05-05 2010-07-07 Boyce Thompson Institute For Plant Research Vectors and cells for preparing immunoprotective compositions derived from transgenic plants
WO2004098530A2 (en) * 2003-05-05 2004-11-18 Dow Agrosciences Llc Stable immunoprophylactic and therapeutic compositions derived from transgenic plant cells and methods for production

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