TW201713680A - 嵌合型竹嵌紋病毒蛋白質與粒子、使用嵌合型竹嵌紋病毒載體而從衍生自基因轉殖植物的懸浮細胞中生產它們的方法，以及它們的應用 - Google Patents

Abstract

本發明揭示一種編碼一融合蛋白質以及一外來蛋白質的核酸建構物，其中該融合蛋白質包含有：(i)一載體片段，其含有一竹嵌紋病毒外殼蛋白質的胺基酸序列或它的一節段；以及(ii)一免疫原性異源性片段，其被融合至該載體片段並且具有一為至少3個胺基酸殘基的長度；以及該外來蛋白質包含有一含有一默化抑制子蛋白質的胺基酸序列的多肽。本發明亦揭示一嵌合型竹嵌紋病毒蛋白質以及包含有該嵌合型竹嵌紋病毒蛋白質的嵌合型竹嵌紋病毒粒子之製備與應用。

Description

嵌合型竹嵌紋病毒蛋白質與粒子、使用嵌合型 竹嵌紋病毒載體而從衍生自基因轉殖植物的懸浮細胞中生產它們的方法，以及它們的應用

本發明是有關於一種編碼一融合蛋白質以及一外來蛋白質的核酸建構物，其中該融合蛋白質包含有：(i)一載體片段(earrier fragment)，其含有一竹嵌紋病毒(Bamboo mosaic virus,BaMV)外殼蛋白質(coat protein,CP)的胺基酸序列或它的一節段(segment)；以及(ii)一免疫原性異源性片段(immunogenic heterologous fragment)，其被融合至該載體片段並且具有一為至少3個胺基酸殘基的長度；以及該外來蛋白質包含有一含有一默化抑制子蛋白質(silencing suppressor protein)的胺基酸序列的多肽。本發明亦有關於一嵌合型竹嵌紋病毒蛋白質以及包含有該嵌合型竹嵌紋病毒蛋白質的嵌合型竹嵌紋病毒粒子之製備與應用。

口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是一種經由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)的感染所引起的疾病。FMDV是一種屬於小核醣核酸病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)的單股RNA病毒(single-stranded RNA virus)。FMDV粒子(FMDV particles)是由4種殼體蛋白質(capsid protein)(亦即VP1、VP2、VP3以及VP4)所組成，其中VP1蛋白質含有主要的抗原領域(antigenic domain)，因而常被用來製備一對抗FMDV的候選疫苗(candidate vaccine)。

目前臨床上用於預防FMD的疫苗包括：去活化的疫苗(inactivated vaccine)、減毒疫苗(attenuated vaccine)、合成疫苗(synthetic vaccine)以及DNA疫苗。然而，這些疫苗常因不完全去活化而具有安全疑慮並且可能會產生嚴重的副作用[例如，食慾不振(poor appetite)以及過敏(allergy)]。因此，本領域的相關研究人員皆致力於開發有效並且不會產生非所欲的副作用的FMDV疫苗。

近年來，使用植物表現系統(plant expression system)來生產對抗病原體的疫苗對於傳統的疫苗生產系統而言是一種安全的替代方式。使用植物表現系統的優點包括：沒有被動物病原體(animal pathogen)汙染的風險、較低的生產成本(production cost)以及非常大規模生產(very large-scale production)的可能性。在植物表現系統中，使用以植物病毒為基礎的載體(plant virus-based vector)來表現 外來蛋白質(foreign protein)是一種常見的方法，而此種方法涉及將感興趣的基因插入(insert)至該以植物病毒為基礎的載體中，接著將之感染(infect)植物細胞並且表現外來蛋白質。目前常見的以植物病毒為基礎的載體包括：以菸草嵌紋病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)為基礎的載體、以竹嵌紋病毒(Bamboo mosaic virus,BaMV)為基礎的載體、以蕪菁皺病毒(Turnip crinkle virus,TCV)為基礎的載體以及以番茄叢生矮化病毒(Tomato bushy stunt virus,TBSV)為基礎的載體等。

BaMV是一種屬於甲型線形病毒科(Alphaflexiviridae)馬鈴薯X病毒屬(Potexvirus)的單股RNA病毒，它會感染單子葉植物(monocotyledonous plant)以及雙子葉植物(dicotyledonous plant)[例如，本氏菸草(Nicotiana benthamiana)以及白藜(Chenopodium quinoa)]。BaMV的基因組具有5個主要的開放閱讀架構(open reading frames,ORFs)(亦即ORF1至ORF5)，其中ORF1編碼出一用於病毒複製的RNA-依賴型RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)，以及ORF5編碼出一用於病毒包被(virus encapsidation)的外殼蛋白質(coat protein,CP)。

已有研究指出，以BaMV為基礎的載體可被應用於開發對抗病原體的疫苗。例如，帶有高毒力傳染性法氏囊病病毒(very virulent Infectious bursal disease virus,vvIBDV)VP2蛋白質編碼基因以及N端截短的BaMV CP編碼基因的重組型BaMV質體pBIBD2可被應用於生產對抗 IBDV的疫苗(Chen T.H.et al.(2012),Virus Research,166：109-115)。

TW I412588(對應於EP 1942188 B1、CN 101611144 B以及US 2009/0311284 A1)揭示一種編碼融合多肽之經分離核酸，其中該融合多肽包括一含有BaMV CP之序列的載體片段，以及一與該載體片段融合的免疫原性異源片段，而該免疫原性異源片段含有FMDV VP1蛋白質之序列或含有其免疫原性區段。特別地，於此件台灣專利案的實施例中，帶有嵌合型BaMV基因組的質體pBVP1被構築，繼而將該質體pBVP1(溶於雙蒸餾水中)分別接種至菸草以及白藜的葉片中俾以進行葉片細胞的感染，接著從被感染的葉片細胞中純化出嵌合型BaMV病毒粒子[它具有FMDV VP1抗原決定位(epitope)]。之後，無特定病原體(specific pathogen free)的豬隻被肌肉內注射以經純化的嵌合型BaMV病毒粒子。在肌肉內注射之後的第6週之時，以相同劑量的嵌合型BaMV病毒粒子來對豬隻進行增幅注射(boosting injection)，繼而在增幅注射之後的第0、28、42、56以及63天之時收集血清並將之拿來進行酵素結合免疫吸附分析(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)。而實驗結果發現：以嵌合型BaMV病毒粒子來免疫豬隻會誘發豬隻生成抗-FMDV VP1抗體。另外，在嵌合型BaMV病毒粒子的增幅注射之後的第3週之時，以一為1×10⁵ TCID₅₀的FMDV O/Taiwan/97分離株來攻毒豬隻，繼而監測豬隻的FMD症狀歷時14天。而實驗結果發現：經嵌合 型BaMV病毒粒子免疫的豬隻在FDMV攻毒之後不會產生FMD症狀，因此該嵌合型BaMV病毒粒子可供用於製備對抗FMDV的疫苗。

RNA默化(RNA silencing)是一種發生於真核生物中的基因調節與防禦機制(gene regulation and defense mechanism)。對於植物而言，RNA默化是一種用於對抗植物病毒侵入的誘導性防禦反應，而許多植物病毒會藉由編碼(encode)默化抑制子蛋白質(silencing suppressor protein)(例如，默化抑制子蛋白質P15、默化抑制子蛋白質P19、默化抑制子蛋白質P21以及默化抑制子蛋白質P38)來抵抗此種防禦反應。已有文獻報導，默化抑制子蛋白質會對植物的生長產生負面影響。例如，在Siddiqui S.A.et al.(2008),Mol.Plant Microbe Interact.,21：178-187中，Siddiqui S.A.等人將7種病毒默化抑制子建構物(viral silencing suppressor construct)藉由電穿孔法(electroporation)來分別引入根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)中，然後藉由農桿菌-媒介的轉形法(Agrobacterium-mediated transformation)而將這7種建構物分別轉形至本氏菸草以及紅花菸草(Nicotiana tabacum)的葉圓片(leaf disc)中，藉此而得到14種轉形株。之後，這14種轉形株是使用康那黴素(kanamycin,Km)篩選而在MS培養基中被再生(regeneration)，藉此而得到有根的小植株(rooted plantlet)。接著，將所得到的有根的小植株轉移至盆(pot)中並於一具有一為16小時的光週期(photoperiod)的 溫室(25℃)中生長至成熟而得到14株基因轉殖株R0(transgenic line R0)。接著，從所得到的基因轉殖株R0中選擇10株並取它們的種子，繼而於含有Km的MS培養基中進行發芽，然後轉移至土壤並在溫室中生長而得到基因轉殖株R1。之後，從基因轉殖株R1中選擇具有被改變的表現型(altered phenotype)的5株獨立的R1株並取它們的種子，繼而於含有Km的MS培養基中進行發芽並挑選2或3株100%發芽的獨立株(亦即基因轉殖株R2)，然後觀察這些本氏菸草基因轉殖株R0、R1與R2以及紅花菸草基因轉殖株R0、R1與R2的表現型。而實驗結果顯示：默化抑制子蛋白質會對本氏菸草基因轉殖株以及紅花菸草基因轉殖株造成嚴重的畸形(malformation)[例如，默化抑制子蛋白質P19會造成本氏菸草基因轉殖株的葉片有毛並且呈輕微鋸齒狀以及花梗(flower stalk)彎曲]。

就申請人所知，使用以BaMV為基礎的載體而在植物中生產FMDV疫苗的習知方法具有無法控制環境因子、無法在每一個植物細胞中表現免疫活性蛋白質以及無法符合現行藥品優良製造規範(current good manufacturing practice,CGMP)等缺點。因此，申請人嘗試提供一種具有生產時間短、效率高、生產成本低廉、無毒性、高安全性、高免疫保護效力、符合CGMP以及符合與基因轉殖植物有關的法規的FMDV疫苗。

發明概要

於是，在第一個方面，本發明提供一種編碼一融合蛋白質以及一外來蛋白質的核酸建構物，其中該融合蛋白質包含有：(i)一載體片段，其含有一竹嵌紋病毒外殼蛋白質的胺基酸序列或它的一節段；以及(ii)一免疫原性異源性片段，其被融合至該載體片段並且具有一為至少3個胺基酸殘基的長度；以及該外來蛋白質包含有一含有一默化抑制子蛋白質的胺基酸序列的多肽。

在第二個方面，本發明提供一種表現匣，其包含有一如上所述的核酸建構物。

在第三個方面，本發明提供一種嵌合型竹嵌紋病毒蛋白質，它是由一如上所述的核酸建構物所編碼。

在第四個方面，本發明提供一種宿主細胞，其包含有一如上所述的表現匣。

在第五個方面，本發明提供一種嵌合型竹嵌紋病毒粒子，其包含有一如上所述的嵌合型竹嵌紋病毒蛋白質。

在第六個方面，本發明提供一種用於生產一嵌合型竹嵌紋病毒蛋白質的方法，其包括：(i)將一如上所述的核酸建構物轉形至一本氏菸草細胞內；(ii)將所形成的基因轉殖本氏菸草細胞培養於一適於該核酸建構物表現的培養條件下，俾以形成該嵌合型 竹嵌紋病毒蛋白質；以及(iii)從該基因轉殖本氏菸草細胞中純化出該嵌合型竹嵌紋病毒蛋白質。

在第七個方面，本發明提供一種用於生產一嵌合型竹嵌紋病毒粒子的方法，其包括：(i)將一如上所述的核酸建構物轉形至根癌土壤桿菌內；(ii)將所形成的根癌土壤桿菌轉形株轉形至一本氏菸草植株；(iii)將所得到的基因轉殖本氏菸草植株的一葉片進行懸浮細胞培養，藉此而得到一懸浮細胞培養物；(iv)將該懸浮細胞培養物培養於一適於該核酸建構物表現的培養條件下，俾以形成該嵌合型竹嵌紋病毒粒子；以及(v)從該懸浮細胞培養物中純化出該嵌合型竹嵌紋病毒粒子。

在第八個方面，本發明提供一種對抗口蹄疫病毒的動物用疫苗，其包含有一如上所述的嵌合型竹嵌紋病毒粒子。

在第九個方面，本發明提供一種用於預防口蹄疫的藥學組成物，其包含有一如上所述的嵌合型竹嵌紋病毒粒子。

在第十個方面，本發明提供一種用於預防口蹄疫的方法，其包括對一需要預防口蹄疫的個體投藥以一如 上所述的嵌合型竹嵌紋病毒粒子。

本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯。

發明的詳細說明

為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。

要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。

除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。為表清楚，下面的界定被使用於本文中。

如本文中所用的，“多肽(polypeptide)”、“胜肽(peptide)”和“蛋白質”等術語可被相互交換使用，並且意指一種由胺基酸殘基所構成的聚合物，其中一或多個胺基酸殘基是天然存在的胺基酸(naturally occurring amino acids)或人造的化學仿效物(artificial chemical mimics)。

在本文中，胺基酸可以其全名、三個字母的縮 寫以及單一字母符號來表示，這是本技藝中已詳知的。此外，依照胜肽標示的慣例，蛋白質的左端是N端(胺基端)，而右端是C端(羧基端)。

如本文中所用的，“核酸”、“核酸序列”或“核苷酸序列”等術語意指呈單股或雙股形式的去氧核糖核苷酸序列或核糖核苷酸序列，且當中包含有已知的天然存在的核苷酸(naturally occurring nucleotides)或人造化學仿效物(artificial chemical mimics)。如本文中所用的，“核酸”此術語可與“基因”、“DNA”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”和“聚核苷酸”交換使用。

如本文中所用的，“重組型載體(recombinant vector)”、“表現載體(expression vector)”以及“表現匣(expression cassette)”等術語可被交換地使用，並且意指任一種重組型表現系統，它可於活體外(in vitro)或活體內(in vivo)，在任一種勝任的宿主細胞(competent host cell)內組成地(constitutively)或可誘導地(inducibly)表現一被選定的核酸序列。該重組型載體可為一線性或環形表現系統，且涵蓋保持游離基因(episomal)形式或是被整合至宿主細胞的基因組內的表現系統。該重組型表現系統可具有或不具有自我複製的能力，它可能只會驅使宿主細胞的短暫表現。

如本文中所用的，術語“融合蛋白質(fusion protein)”以及“融合基因產物(fusion gene product)”可被交替地使用，並且意指由一融合基因所編碼的蛋白質以及多 肽。

如本文中所用的，“細胞”、“宿主細胞”、“轉形宿主細胞(transformed host cell)”、“重組型宿主細胞(recombinant host cell)”以及“基因轉殖細胞(transgenic cell)”等術語可被互換使用，而且不僅指特定的個體細胞(individual cells)還包括繼代培養的子代(sub-cultured offsprings)或可能的子代(potential offsprings)。子代細胞可能在後續世代中因為突變作用或環境影響而發生特定的遺傳修飾(genetic modification)，而致使子代細胞事實上可能與母細胞並不相一致，但子代細胞仍被涵蓋在本文中所用的術語的範疇內。

如本文中所用的，“轉形(transformation)”、“轉染(transfection)”以及“轉殖基因(transgene)”等術語可被交替地使用，並且泛指將一核酸分子引入一選定的宿主細胞內的方式。依據本技藝中已知的技術，一核酸分子(例如，一重組型DNA建構物或一重組型載體)可藉由多種技術而被引入至一選定的宿主細胞內，例如電穿孔法(electroporation)、微注射法(microinjection)以及粒子撞擊法(particle bombardment)。

使用以竹嵌紋病毒(Bamboo mosaic virus,BaMV)為基礎的載體而在植物中生產FMDV疫苗的習知方法具有無法控制環境因子、無法在每一個植物細胞中表現免疫活性蛋白質以及無法符合CGMP等缺點。為了克服這些缺點，申請人嘗試利用以竹嵌紋病毒(Bamboo mosaic virus,BaMV) 為基礎的載體來構築一編碼一融合蛋白質以及一外來蛋白質的核酸建構物，繼而將該核酸建構物轉形至根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)中而得到一帶有該核酸建構物的轉形株。接著，該核酸建構物是藉由農桿菌-媒介的轉形法(Agrobacterium-mediated transformation)而被轉形至一本氏菸草(Nicotiana benthamiana)植株中，藉此而得到一基因轉殖本氏菸草植株。之後，對所得到的基因轉殖本氏菸草植株進行癒合組織誘發(callus induction)，接而對所得到的癒合組織進行繼代培養而形成癒合組織生物質(callus biomass)。接著，對所形成的癒合組織生物質進行培養而得到基因轉殖本氏菸草細胞，然後從所得到的基因轉殖本氏菸草細胞中萃取出嵌合型BaMV蛋白質以及純化出具有默化抑制子蛋白質的嵌合型BaMV病毒粒子(chimeric BaMV virus particles,CVPs)。之後，本發明的嵌合型BaMV蛋白質經由西方墨點分析(Western blotting)以及酵素結合免疫吸附分析(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)而被證實會累積於基因轉殖本氏菸草細胞中。另外，申請人對天竺鼠進行CVPs的皮下注射(subcutaneous injection)，俾以評估CVPs對於牠們的免疫效力。而實驗結果顯示：本發明的CVPs能夠在天竺鼠中誘發抗-FMDV專一性抗體的產生。

於是，本發明提供一種編碼一融合蛋白質以及一外來蛋白質的核酸建構物，其中該融合蛋白質包含有：(i)一載體片段，其含有一竹嵌紋病毒外殼蛋白質的胺 基酸序列或它的一節段；以及(ii)一免疫原性異源性片段，其被融合至該載體片段並且具有一為至少3個胺基酸殘基的長度；以及該外來蛋白質包含有一含有一默化抑制子蛋白質的胺基酸序列的多肽。

在本發明的一個較佳具體例中，該載體片段具有一如序列辨識編號：6所示的胺基酸序列。

依據本發明，該免疫原性異源性片段含有一FMDV VP1抗原決定位(epitope)的胺基酸序列。

依據本發明，該FMDV VP1抗原決定位包括那些為熟習此項技術人士可易於獲得的FMDV的分離株(例如，可購自於國內或國外寄存機構者)的VP1抗原決定位，或者利用本技藝中所慣用的微生物分離方法而從天然來源中所分離純化出的新穎分離株的VP1抗原決定位。

在本發明的一個較佳具體例中，該FMDV VP1抗原決定位具有一如序列辨識編號：3所示的胺基酸序列。

依據本發明，該多肽含有一默化抑制子蛋白質P38的胺基酸序列。在本發明的一個較佳具體例中，該默化抑制子蛋白質P38具有一如序列辨識編號：14所示的胺基酸序列。

依據本發明，該多肽含有一默化抑制子蛋白質P19的胺基酸序列。在本發明的一個較佳具體例中，該默化抑制子蛋白質P19具有一如序列辨識編號：15所示的胺基酸序列。

本發明亦提供一種表現匣，其包含有一如上所述的核酸建構物。

依據本發明的表現匣可使用一具有本技藝中的通常技術者所熟知的標準技術而被製備。在本發明的一個較佳具體例中，該表現匣是嵌合型BaMV表現匣pBdT38-VP1。在本發明的另一個較佳具體例中，該表現匣是嵌合型BaMV表現匣pBdT19-VP1。

適用於本發明的表現匣可以含有其他表現控制要素(expression control elements)，例如一啟動子(promoter)、一轉錄終止位址(transcription termination site)、一核糖體結合位址(ribosome binding site)、一RNA剪接位址(RNA splicing site)、一個聚腺苷酸化位址(polyadenylation site)以及一個轉譯終止位址(translation termination site)。

適用於本發明的表現匣還可包含另外的調控要素(regulatory elements)，例如一轉錄/轉譯的增強子序列(enhancer sequence)、一調節序列以及至少一個供在適當的條件下篩選該表現匣的標記基因(marker gene)[諸如，抗生素抗性基因(antibiotic-resistance gene)]或報導基因(reporter gene)。

本發明亦提供一種嵌合型BaMV蛋白質，它是由一如上所述的核酸建構物所編碼。

在本發明的一個較佳具體例中，該嵌合型BaMV蛋白質具有一如序列辨識編號：18所示的胺基酸序列。在 本發明的另一個較佳具體例中，該嵌合型BaMV蛋白質具有一如序列辨識編號：19所示的胺基酸序列。

依據本發明的嵌合型BaMV蛋白質可使用一具有本技藝中的通常技術者所熟知的標準蛋白質分離純化技術而被進行純化。這些標準蛋白質分離純化技術包括，但不限於：鹽析法(salting out)、溶劑沉澱法(solvent precipitation)、透析法(dialysis)、超濾法(ultrafiltration)、凝膠過濾法(gel filtration)、離心過濾法(centrifugal filtration)、SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)、等電點電泳法(isoelectric point electrophoresis)、逆相層析法(reverse phase chromatography)、陰離子交換層析法(anion exchange chromatography)、親和力層析法(affinity chromatography)以及色層焦集法(chromatofocusing)。

依據本發明的表現匣可以被用來轉形或轉染一被欲求的宿主細胞。因此，本發明提供一種宿主細胞，其包含有一如上所述的表現匣。

適用於本發明的宿主細胞包括，但不限於：植物細胞[例如，本氏菸草細胞、紅花菸草(Nicotiana tabacum)細胞以及白藜(Chenopodium quinoa)細胞]、酵母菌細胞、昆蟲細胞以及哺乳動物細胞。

較佳地，該宿主細胞是一植物細胞。在本發明的一個較佳具體例中，該宿主細胞是一本氏菸草的懸浮細胞。

本發明亦提供一種嵌合型BaMV粒子，其包含有一如上所述的嵌合型BaMV蛋白質。

如本文中所用的，術語“病毒粒子(virus particles)”與“病毒(viruses)”可被交替地使用，並且意指具有完全或部分組裝的殼體(capsid)之病毒。

本發明亦提供一種用於生產一嵌合型BaMV蛋白質的方法，其包括：(i)將一如上所述的核酸建構物轉形至一本氏菸草細胞內；(ii)將所形成的基因轉殖本氏菸草細胞培養於一適於該核酸建構物表現的培養條件下，俾以形成該嵌合型BaMV蛋白質；以及(iii)從該基因轉殖本氏菸草細胞中純化出該嵌合型BaMV蛋白質。

如本文中所用的，術語“培育(cultivation)”、“培育(cultivating)”以及“培養(culturing)”可被交替地使用。

本發明亦提供一種用於生產一嵌合型BaMV粒子的方法，其包括：(i)將一如上所述的核酸建構物轉形至根癌土壤桿菌內；(ii)將所形成的根癌土壤桿菌轉形株轉形至一本氏菸草植株；(iii)將所得到的基因轉殖本氏菸草植株的一葉片進行懸浮細胞培養，藉此而得到一懸浮細胞培養物； (iv)將該懸浮細胞培養物培養於一適於該核酸建構物表現的培養條件下，俾以形成該嵌合型BaMV粒子；以及(v)從該懸浮細胞培養物中純化出該嵌合型BaMV粒子。

依據本發明的嵌合型BaMV粒子經由活體內動物試驗而被證實能夠在天竺鼠中誘發抗-FMDV抗體的產生。

因此，本發明提供一種對抗FMDV的動物用疫苗，其包含有一如上所述的嵌合型BaMV粒子。

依據本發明的動物用疫苗可進一步包含有一選自於由下列所構成之群組中的佐劑(adjuvant)：弗倫氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant)、弗倫氏不完全佐劑(Freund’s incomplete adjuvant)、鋁膠(aluminum gel)、油質佐劑(W/O/W型)、油包水型(water-in-oil,W/O)乳劑、水包油型(oil-in-water,O/W)乳劑、刀豆素A(Concanavalin A,Con A)，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該佐劑是油質佐劑(W/O/W型)。

本發明亦提供一種用於預防FMD的藥學組成物，其包含有一如上所述的嵌合型BaMV粒子。

如本文中所用的，術語“預防(preventing)”或“預防(prevention)”意指當一藥物被使用於一沒有疾病發病(disease onset)的症狀但具有疾病發病的高風險的個體時，停止或延緩(delaying)疾病發病的症狀。

依據本發明的藥學組成物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地(parenterally)或口服地(orally)投藥的劑型，這包括，但不限於：注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、無菌的粉末(sterile powder)、錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pill)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)以及類似之物。

依據本發明的藥學組成物可以一選自於由下列所構成的群組中的非經腸道途徑(parenteral routes)來投藥：腹膜內注射(intraperitoneal injection)、皮下注射以及肌肉內注射(intramuscular injection)。在本發明的一個較佳具體例中，該藥學組成物被製成適於以皮下注射而被投藥的劑型。在本發明的另一個較佳具體例中，該藥學組成物被製成適於以肌肉內注射而被投藥的劑型。

依據本發明的藥學組成物可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之藥學上可接受的載劑。例如，該藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於由下列所構成之群組中的試劑：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑 (excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、稀釋劑(diluent)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)、甜味劑(sweetening agent)、調味劑(flavoring agent)、染色試劑(coloring agent)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

本發明亦提供一種用於預防FMD的方法，其包括對一需要預防FMD的個體投藥以一如上所述的嵌合型BaMV粒子。

依據本發明，該嵌合型BaMV粒子的投藥劑量與投藥次數會視下列因素而變化：投藥途徑以及需要預防FMD的個體之體重、年齡、身體狀況與反應。一般而言，依據本發明的藥學組成物可呈單一劑量或是分成數個劑量的形式而被口服地或非經腸道地投藥。

本發明之其他的特徵及功效，將於參照圖式的實施方式中清楚地呈現，其中：圖1是野生型BaMV表現匣pBaMV-S、嵌合型BaMV表現匣pBVP1、嵌合型BaMV表現匣pBdT38-VP1以及嵌合型BaMV表現匣pBdT19-VP1的架構圖；圖2顯示各個基因轉殖本氏菸草細胞株的生長曲線，其中Nt表示非基因轉殖本氏菸草細胞株；圖3是一電泳膠片圖，其顯示使用引子對Ba5353R-F、 Ba6366-R以及得自於各個基因轉殖本氏菸草細胞株的嵌合型BaMV RNA樣品來進行RT-PCR所得到的PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳分析結果，其中M表示標記；以及Nt表示非基因轉殖本氏菸草細胞株；圖4是一西方墨點分析圖，其顯示得自於各個基因轉殖本氏菸草細胞株的嵌合型BaMV蛋白質的表現情形，其中M表示標準分子標記(standard molecular marker)；Nt表示非基因轉殖本氏菸草細胞株；以及“*”表示經降解的BVP1；圖5是一西方墨點分析圖，其顯示從基因轉殖本氏菸草細胞株B2B27中所純化出的野生型BaMV-S粒子以及從基因轉殖本氏菸草細胞株BdT38與基因轉殖本氏菸草細胞株BdT19中所純化出的CVPs的表現情形，其中M表示標準分子標記；以及“*”表示經降解的BVP1；圖6顯示得自於各個基因轉殖本氏菸草細胞株的BVP1相對於TSP的濃度百分比，其中Nt表示非基因轉殖本氏菸草細胞株；以及圖7是一西方墨點分析圖，其中“*”表示經降解的BVP1。

較佳實施例之詳細說明

本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。

實施例

一般實驗材料：

1. 下面實施例中所使用的限制酶是購自於諾貝爾生物有限公司。

2. 下面實施例中被使用來進行聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)的引子(primers)是委託源資國際生物科技股份有限公司來代為合成。

3. 下列實驗材料是購自於Bio-Rad：Mini-PROTEAN^® Tetra Cell蛋白質電泳裝置以及Mini Trans-Blot^®電泳轉印槽(Mini Trans-Blot^® Electrophoretic Transfer Cell)。

4. 下列實驗材料是購自於Calbiochem：Miracloth濾紙。

5. 下列實驗材料是購自於Duchefa Biochemie：固態MS培養基(solid MS medium)。

6. 下列實驗材料是購自於Jackson Immuno Research：綴合有鹼性磷酸酶的山羊抗-兔子IgG(goat anti-rabbit IgG conjugated with alkaline phosphatase)以及綴合有鹼性磷酸酶的山羊抗-天竺鼠IgG(goat anti-guinea pig IgG conjugated with alkaline phosphatase)。

7. 下列實驗材料是購自於Sigma-Aldrich：p-硝苯磷酸溶液(p-nitrophenyl phosphate solution)。

8. 下列實驗材料是購自於SEPPIC：Montanide ISA 206油質佐劑(Montanide ISA 206 oily adjuvant)(W/O/W型)。

9. 下列實驗材料是購自於Thermo Scientific：NBT/BCIP 顯色試劑(color development reagent)。

10. 下面實施例中所使用的野生型竹嵌紋病毒(wild-type Bamboo mosaic virus,wild-type BaMV)表現匣(expression cassette)pBaMV-S(9439bps)是依據Yang C.D.et al.(2007),BMC Biotechnol.,7：62當中所述的方法而被構築，它具有一個35S啟動子(35S promoter)、一RNA-依賴型RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)編碼基因、一個三重疊基因區蛋白質1(triple gene block protein 1,TGBp1)編碼基因、一個三重疊基因區蛋白質2(triple gene block protein 2,TGBp2)編碼基因、一個三重疊基因區蛋白質3(triple gene block protein 3,TGBp3)編碼基因、一具有如序列辨識編號：1所示的胺基酸序列的BaMV外殼蛋白質(coat protein,CP)編碼基因(序列辨識編號：2)、一個35S終結子(35S terminator)以及限制酶HindIII與SacI切割位址。

11. 下面實施例中所使用的嵌合型BaMV(chimeric BaMV)表現匣pBVP1(9442bps)是依據Yang C.D.et al.(2007)(同上述)當中所述的方法而被構築，它具有一個35S啟動子、一RdRp編碼基因、一TGBp1編碼基因、一TGBp2編碼基因、一TGBp3編碼基因、一具有如序列辨識編號：3所示的胺基酸序列的口蹄疫病毒VP1抗原決定位(Foot-and-mouth disease virus VP1 epitope,FMDV VP1 epitope)(對應於一具有如序列辨識編號：4 所示的胺基酸序列的FMDV VP1蛋白質從N端算起第128個胺基酸殘基至第164個胺基酸殘基)編碼基因(序列辨識編號：5)、一具有如序列辨識編號：6所示的胺基酸序列的N端截短的BaMV CP(缺少從N端算起35個連續的胺基酸殘基)編碼基因(序列辨識編號：7)、一個35S終結子以及限制酶AgeI、NcoI、NotI與HindIII切割位址。

12. 下面實施例中所使用的兔子抗-FMDV VP1抗體(rabbit anti-FMDV VP1 antibody)、兔子抗-BaMV CP抗體(rabbit anti-BaMV coat protein antibody,rabbit anti-BaMV CP antibody)、兔子抗-默化抑制子蛋白質P19抗體(rabbit anti-silencing suppressor protein P19 antibody)以及兔子抗-默化抑制子蛋白質P38抗體(rabbit anti-silencing suppressor protein P38 antibody)是依據Yang C.D.et al.(2007)(同上述)當中所述的方法而被製備。

13. 下面實施例中所使用的根癌土壤桿菌菌株C58C1(Agrobacterium tumefaciens strain C58C1)是由美國農業部農業研究局植物基因表現中心(Plant Gene Expression Center,Agricultural Research Service,United States Department of Agriculture)的David Ow教授所提供。

14. 下面實施例中所使用的野生型本氏菸草(Nicotiana benthamiana)植株是購自於菸葉試驗所。

15. 下面實施例中所使用的無病原體(pathogen-free)雄性天竺鼠(8週大，體重約為300g)是購自於國家實驗動物中心。

一般實驗方法：

1. 除非另有指明，在本發明中所採用的實驗方法[包括DNA選殖(DNA cloning)、PCR以及反轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)]是使用本領域中熟悉此項技術人士所詳知的技術或者依據製造商所提供的操作指引來進行。

2. 轉形(transformation)：

在下面的實施例中，一所欲的DNA片段是藉由使用電穿孔法(操作參數為：2.5kV、25μF以及400Ω)而被轉形至根癌土壤桿菌菌株C58C1中。之後，使用一含有50ppm的安比西林(ampicillin)、10ppm的四環素(tetracycline)以及10ppm的康那黴素(kanamycin)的LB培養基進行篩選，藉此而得到一經確認轉形成功的根癌土壤桿菌轉形株。

3. 蛋白質樣品的分析：

在下面的實施例中，蛋白質樣品是採用熟習此項技藝者所詳知且慣用的技術來進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析與西方墨點分析(Western blotting)，而所使用的儀器與試劑分別如下所述：

(1)SDS-PAGE分析是使用Mini-PROTEAN^® Tetra Cell蛋白質電泳裝置來進行。

(2)蛋白質轉印(protein transfer)是使用Mini Trans-Blot^®電泳轉印槽以及聚二氟乙烯(PVDF)膜[polyvinylidene difluoride(PVDF)membrane]來進行。

(3)化學發光染色(chemiluminescence staining)是使用NBT/BCIP顯色試劑來進行呈色反應。

4. 血清樣品的製備：

將由實驗動物所採集到的血液在4℃下以3000rpm離心歷時10分鐘，所得到的血清樣品被冷凍保存於-20℃下備用。

5. 統計學分析(statistical analysis)：

在下面的實施例中，實驗數據是以平均值(mean)±標準偏差(standard deviation,S.D.)來表示。各組間實驗數據的差異是藉由變異數分析(analysis of variance,ANOVA)來進行評估，若所得到的統計分析結果是p<0.05，代表有統計學顯著性(statistical significance)。

實施例1. 基因轉殖本氏菸草細胞株(transgenic Nicotiana benthamiana cell line)的製備

A、構築嵌合型BaMV表現匣pBdT38-VP1以及嵌合型BaMV表現匣pBdT19-VP1：

首先，以蕪菁皺病毒(Turnip crinkle virus)的cDNA作為模版(template)，並使用一組針對蕪菁皺病毒的p38基因的完整編碼序列(complete coding sequence)(NCBI登錄編號HQ589261)而被設計之具有下面所示核苷酸序列的引子對P38前向引子P38 DraIII F與P38反向引子P38 DraIII R來進行PCR，藉此而擴增出一個帶有p38基因(序列辨識編號：8)的PCR產物(1080bps)。

P38前向引子P38 DraIII F

(序列辨識編號：9)

P38反向引子P38 DraIII R

(序列辨識編號：10)

上述兩個引子被設計成具有限制酶DraIII的切割位址(如底線所標示者)。

接著，使用限制酶DraIII而從嵌合型BaMV表現匣pBVP1中切出一個大小為8356bps的DNA片段[它被稱為載體DNA(carrier DNA)]，俾以移除TGBp1至TGBp3編碼基因。之後，使用限制酶DraIII而從上面所得到的PCR產物中切出一個大小為1065bps之含有完整的p38基因的DNA片段[它被稱為插入物DNA(insert DNA)]。之後，使用T4 DNA接合酶而將該載體DNA與該插入物DNA進行接合(ligation)，藉此而得到一大小為9421bps的重組型表現匣(rebombinant expression cassette)(下稱“表現匣1”)。

另外，以番茄叢生矮化病毒(Tomato bushy stunt virus)的cDNA作為模版，並使用一組針對番茄叢生矮化病毒的p19基因的完整編碼序列(NCBI登錄編號AJ288926，)而被設計之具有下面所示核苷酸序列的引子對P19前向引子P19 DraIII F與P19反向引子P19 DraIII R來進行PCR，藉此而擴增出一個帶有p19基因(序列辨識編號：11)的PCR 產物(543bps)。

P19前向引子P19 DraIII F

(序列辨識編號：12)

P19反向引子P19 DraIII R

(序列辨識編號：13)

上述兩個引子被設計成具有限制酶DraIII的切割位址(如底線所標示者)。

接著，使用限制酶DraIII而從嵌合型BaMV表現匣pBVP1中切出一個大小為8364bps的DNA片段(它被稱為載體DNA)，俾以移除TGBp1至TGBp3編碼基因。之後，使用限制酶DraIII而從上面所得到的PCR產物中切出一個大小為528bps之含有完整的p19基因的DNA片段(它被稱為插入物DNA)。之後，使用T4 DNA接合酶而將該載體DNA與該插入物DNA進行接合，藉此而得到一大小為8892bps的重組型表現匣(下稱“表現匣2”)。

之後，該等表現匣1以及表現匣2是藉由定序分析來確認它們的核苷酸序列的正確性。接著，將該等表現匣1以及表現匣2分別藉由使用適當的限制酶(例如ApaI以及SacI)而次選殖至一pKn二元載體(pKn binary vector)(11794bps)中，藉此而分別得到嵌合型BaMV表現匣pBdT38-VP1(9429bps)以及嵌合型BaMV表現匣pBdT19-VP1(8892bps)。

有關該嵌合型BaMV表現匣pBdT38-VP1、該嵌 合型BaMV表現匣pBdT19-VP1、該野生型BaMV表現匣pBaMV-S以及該嵌合型BaMV表現匣pBVP1的架構分別被顯示於圖1中。

B、使用野生型BaMV表現匣pBVP1以及各個嵌合型BaMV表現匣來轉形根癌土壤桿菌菌株C58C1：

將上面第A項當中所述的該嵌合型BaMV表現匣pBdT38-VP1、該嵌合型BaMV表現匣pBdT19-VP1、該野生型BaMV表現匣pBaMV-S以及該嵌合型BaMV表現匣pBVP1依據上面“一般實驗方法”的第2項「轉形」當中所述的方法來分別轉形至根癌土壤桿菌菌株C58C1中，藉此而得到帶有該野生型BaMV表現匣pBaMV-S、該嵌合型BaMV表現匣pBVP1、該嵌合型BaMV表現匣pBdT38-VP1以及該嵌合型BaMV表現匣pBdT19-VP1的根癌土壤桿菌轉形株。

C、基因轉殖本氏菸草植株(transgenic Nicotiana benthamiana plant line)的製備與基因轉殖本氏菸草細胞株的培育：

在上面第B項當中所述的帶有該野生型BaMV表現匣pBaMV-S、該嵌合型BaMV表現匣pBVP1、該嵌合型BaMV表現匣pBdT38-VP1以及該嵌合型BaMV表現匣pBdT19-VP1的根癌土壤桿菌轉形株是藉由農桿菌-媒介的轉形法(Agrobacterium-mediated transformation)來將該野生型BaMV表現匣pBaMV-S、該嵌合型BaMV表現匣pBVP1、該嵌合型BaMV表現匣pBdT38-VP1以及該嵌合型BaMV 表現匣pBdT19-VP1分別轉形至野生型本氏菸草植株中，藉此而得到4種基因轉殖本氏菸草植株。

之後，將這4種基因轉殖本氏菸草植株以及野生型本氏菸草植株分別依據下述方法來進行癒合組織誘發(callus induction)。首先，將本氏菸草植株置於一溫度維持在25℃以及光週期(photoperiod)被設定為16小時光照/8小時黑暗的玻璃溫室(glasshouse)中進行培養。在發芽之後(postgerminaion)的第50天之時，收取本氏菸草植株的葉子並以自來水予以洗滌，接著使用10%漂白溶液(bleaching solution)來對經洗滌的葉子進行表面滅菌(surface sterilization)。之後，以自來水來對經滅菌的葉子進行洗滌直至肥皂殘留物(soap residue)被完全地移除，然後使用解剖刀(scalpel)來將經洗滌的葉子切成小片(small discs)，接著將該等小片置於一含有固態MS培養基[補充有3%蔗糖(sucrose)、1mg/L萘乙酸(naphthalene acetic acid)、0.5mg/L裂殖素(kinetin)、100mg/L肌醇(myoinositol)以及200mg/L酪蛋白水解產物(casein hydrolyte)]的培養盤中進行培養歷時5至6週，藉此而得到一呈白色的癒合組織(callus)。接著，將所得到的癒合組織置於相同的培養盤中來進行繼代培養(subculture)，藉此而得到癒合組織生物質(callus biomass)。

之後，對所得到的各個癒合組織生物質各取2g並將之置於一含有25mL的液態MS培養基(liquid MS medium)(補充有3%蔗糖、1mg/L萘乙酸、0.5mg/L裂殖素、 100mg/L肌醇以及200mg/L酪蛋白水解產物)的125-mL錐形瓶中進行培養。接著，每週更換新鮮培養基(25mL)一次，共計更換3次。之後，將所形成的細胞懸浮液(cell suspension)吸取至一個500-mL錐形瓶中至一最終體積為150mL，俾以增加生物質位準(biomass level)以及將細胞持續維持在對數期(log phase)，然後於一溫度維持在25±1℃以及光週期(45L mol光子/m²/s)被設定為16小時光照/8小時黑暗的振盪器(120rpm)中進行培養歷時7天，藉此而得到4種基因轉殖本氏菸草細胞株以及1種非基因轉殖本氏菸草細胞株，它們被使用作為種源(seed)以供後續的實驗之用。

有關各個基因轉殖本氏菸草細胞株的詳細資訊[包括細胞株名稱、各個基因轉殖本氏菸草細胞株所帶有的BaMV表現匣以及BaMV病毒粒子(BaMV virus particles)]被顯示於表1中。

實施例2. 具有默化抑制子蛋白質的CVPs對於基因轉殖本氏菸草細胞株的生長的影響

為了探討具有默化抑制子蛋白質的CVPs是否會對基因轉殖本氏菸草細胞株的生長產生有害的影響(detrimental effect)，下面的實驗被進行。

實驗方法：

首先，對依據上面實施例1的第C項當中所得到的各個基因轉殖本氏菸草細胞株以及非基因轉殖本氏菸草細胞株的種源取等量(equal amount)並置於一含有25mL的新鮮激素培養基(hormonal medium)的125-mL培養瓶中，然後分別在一溫度維持在25℃以及光週期被設定為16小時光照/8小時黑暗的振盪器(120rpm)中進行繼代培養。接 著，在繼代培養之後(postsubculture)的第3、7、10、14、17、21、24以及30天之時分別收取所形成的懸浮培養物(suspension culture)[亦即懸浮的生物質(suspended biomass)]，然後藉由使用Miracloth濾紙來進行過濾。之後，收集新鮮生物質並以無菌水(sterile water)予以洗滌以移除糖(sugar)以及其它殘留物質(residual material)，繼而測定各個生物質的生長速率(growth rate)。所得到的結果被顯示於圖2中。

結果：

圖2顯示各個基因轉殖本氏菸草細胞株的生長曲線(growth curve)。由圖2可見，無論是非基因轉殖本氏菸草細胞株或是基因轉殖本氏菸草細胞株，在繼代培養之後的第3天之時，細胞生長皆維持在遲滯期(lag phase)，接而維持在對數期，然後在繼代培養之後的第21天之時達至頂峰。特別地，各個本氏菸草細胞株中的生物質在繼代培養之後的第8至15天之間有顯著的增加。這個實驗結果顯示：具有默化抑制子蛋白質P38的CVPs不會對基因轉殖本氏菸草細胞株BdT38產生有害的影響，以及具有默化抑制子蛋白質P19的CVPs亦不會對基因轉殖本氏菸草細胞株BdT19產生有害的影響。

實施例3. 嵌合型BaMV的基因組(the genome of a chimeric BaMV)在基因轉殖本氏菸草細胞株中的穩定性分析

為了檢測不同嵌合型BaMV RNA在基因轉殖本 氏菸草細胞株中的穩定性，在繼代培養之後的第21天之時，申請人從懸浮的生物質中萃取嵌合型BaMV的總RNA，繼而將所得到的總RNA拿來進行嵌合型BaMV的cDNA的製備。FMDV-VP1-BaMV CP編碼區域是使用專一性引子對而在RT-PCR中被擴增。

實驗方法：

首先，對依據上面實施例1的第C項當中所得到的各個基因轉殖本氏菸草細胞株以及非基因轉殖本氏菸草細胞株的種源取等量並置於一含有25mL的新鮮激素培養基的125-mL培養瓶中，然後分別在一溫度維持在25℃以及光週期被設定為16小時光照/8小時黑暗的振盪器(120rpm)中進行繼代培養。接著，在繼代培養之後的第21天之時收取所形成的懸浮的生物質。

之後，嵌合型BaMV的總RNA是從各個基因轉殖本氏菸草細胞株的懸浮的生物質中被萃取。接著，所得到的嵌合型BaMV的總RNA是依據Cheng S.F.et al.(2010),BMC Plant Biol.,10：286當中所述的方法來進行cDNA的製備，並且該FMDV-VP1-BaMV CP編碼區域是使用具有下面所示核苷酸序列的引子對(亦即前向引子Ba5353R-F與BaMV反向引子Ba6366-R)來進行RT-PCR，藉此而擴增出一個帶有FMDV-VP1-BaMV CP編碼區域的PCR產物(1013bps)。經擴增的PCR產物是在一為1%的瓊脂糖凝膠(agarose gel)中被分離。

前向引子Ba5353R-F

5’-caccatgtgaaataataataaacg-3’(序列辨識編號：16)

反向引子Ba6366-R

5’-tggaaaaaactgtagaaaccaaaagg-3’(序列辨識編號：17)

結果：

圖3是一電泳膠片圖，其顯示使用引子對Ba5353R-F、Ba6366-R以及得自於各個基因轉殖本氏菸草細胞株的嵌合型BaMV RNA樣品來進行RT-PCR所得到的PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis)分析結果。由圖3可見，如預期的，該等經擴增的PCR產物具有一為大約1kb的大小，這表示不同嵌合型BaMV RNA會在基因轉殖本氏菸草細胞株中穩定地複製，特別是基因轉殖本氏菸草細胞株BdT38以及基因轉殖本氏菸草細胞株BdT19。這個實驗結果顯示：默化抑制子蛋白質P38以及默化抑制子蛋白質P19會分別使得嵌合型BaMV RNA在基因轉殖本氏菸草細胞株BdT38以及基因轉殖本氏菸草細胞株BdT 19中持續且穩定地表現。

實施例4. 嵌合型BaMV蛋白質(chimeric BaMV protein)以及CVPs在基因轉殖本氏菸草細胞株中的表現情形

實驗方法：

A、西方墨點分析：

(1)嵌合型BaMV蛋白質在基因轉殖本氏菸草細胞株中的表現情形：

首先，對依據上面實施例1的第C項當中所得 到的各個基因轉殖本氏菸草細胞株以及非基因轉殖本氏菸草細胞株的種源取等量並置於一含有25mL的新鮮激素培養基的125-mL培養瓶中，然後分別在一溫度維持在25℃以及光週期被設定為16小時光照/8小時黑暗的振盪器(120rpm)中進行繼代培養。接著，在繼代培養之後的第21天之時收取所形成的懸浮的生物質，然後對每0.1g的細胞添加250μL的蛋白質萃取緩衝液(protein extraction buffer)[含有50mM Tris-HCl(pH 8)、10mM KCl、10mM MgCl₂、1mM EDTA、20%甘油(glycerol)、2% SDS以及10% β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol)]，並予以混合均勻。將所形成的細胞混合物置於微量離心管中，然後於100℃下煮沸歷時5分鐘。接著，於25℃下以8000rpm離心歷時5分鐘後，收集上澄液並以此作為總蛋白質樣品。

之後，從各個基因轉殖本氏菸草細胞株以及非基因轉殖本氏菸草細胞株中所萃取出的總蛋白質樣品是依據上面“一般實驗方法”的第3項「蛋白質樣品的分析」當中所述的方法來進行SDS-PAGE分析以及西方墨點分析。在西方墨點分析中，針對各個蛋白質所使用的一次抗體(primary antibody)以及二次抗體(secondary antibody)分別被顯示於下面表2中。

(2)CVPs以及野生型BaMV-S粒子在基因轉殖本氏菸草細胞株中的表現情形：

首先，申請人依據Lin N.S.and Chen C.C.(1991),Phytopathology,81：1551-1555當中所述的方法來進行CVPs以及野生型BaMV-S粒子的純化。簡言之，對依據上面實施例1的第C項當中所得到的基因轉殖本氏菸草細胞株B2B27、BdT38以及BdT19的種源取等量並置於一含有25mL的新鮮激素培養基的125-mL培養瓶中，然後分別在一溫度維持在25℃以及光週期被設定為16小時光照/8小時黑暗的振盪器(120rpm)中進行繼代培養。接著，在繼代培養之後的第21天之時收取所形成的懸浮的生物質(20g)，然後使用液態氮(liquid nitrogen)以及萃取緩衝液(extraction buffer)[含有0.5M硼酸(boric acid)(pH 8.5)、1mM EDTA以及0.5% β-巰基乙醇]並於4℃下來對懸浮的生物質進行均質處理。接著，將所得到的均質物(homogenate)以12000 g進行離心歷時10分鐘，繼而將所得到的上澄液與1%(v/v)的4M K₂HPO₄混合，然後於4℃下將2%(v/v)的2M CaCl₂逐滴地添加至所形成的混合物中歷時10分鐘。之後，將所得到的混合物以12000g進行離心歷時10分鐘，然後所形成的上澄液於4℃下被混合以2% Triton X-100以及PEG 6000歷時30分鐘，接而將所得到的混合物以12000g進行離心歷時10分鐘。接著，以BE緩衝液[含有0.05M硼酸鹽(borate)(pH 8)以及1mM EDTA]來散浮沉澱物(pellet)，然後以8000rpm進行離心歷時5分鐘。之後，將上澄液吸取至一離心管中，然後藉由通過5mL的20%蔗糖墊(sucrose cushion)並以136000×g來進行離心歷時1小時，藉此而得到經純化的CVPs以及野生型BaMV-S粒子。

之後，從基因轉殖本氏菸草細胞株B2B27中所純化出的野生型BaMV-S粒子以及從基因轉殖本氏菸草細胞株BdT38與基因轉殖本氏菸草細胞株BdT19中所純化出的CVPs是依據上面“一般實驗方法”的第3項「蛋白質樣品的分析」當中所述的方法來進行SDS-PAGE分析以及西方墨點分析。在西方墨點分析中，針對各個蛋白質所使用的一次抗體以及二次抗體分別被顯示於下面表3中。

B、酵素結合免疫吸附分析(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)：

首先，對依據上面實施例1的第C項當中所得到的各個基因轉殖本氏菸草細胞株以及非基因轉殖本氏菸草細胞株的種源取等量並置於一含有25mL的新鮮激素培養基的125-mL培養瓶中，然後分別在一溫度維持在25℃以及光週期被設定為16小時光照/8小時黑暗的振盪器(120rpm)中進行繼代培養。接著，在繼代培養之後的第21天之時收取所形成的懸浮的生物質，然後對每0.1g的細胞添加250μL的蛋白質萃取緩衝液[含有50mM Tris-HCl(pH 8)、1mM EDTA以及1mM β-巰基乙醇]，並予以混合均勻。將所形成的細胞混合物置於微量離心管中，然後於100℃下煮沸歷時5分鐘。接著，於25℃下以8000rpm離心歷時5分鐘後，收集上澄液並以此作為總可溶性蛋白質(total soluble protein,TSP)樣品，繼而藉由Bradford蛋白質分析法(Bradford protein assay)來測定TSP濃度。

接著，將含有2.5μg的TSP樣品的100μL的0.1M碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液(carbonate/bicarbonate buffer)(pH 9.6)以及含有0.1μg的被表現於大腸桿菌(Escherichia coli)中的經純化的FMDV-重組型VP1蛋白質(purified Foot-and-mouth disease virus-recombinant VP1 protein,purified FMDV-rVP1 protein)的100μL的0.1M碳酸鹽/碳酸氫鹽緩衝液加入至一個96井的培養盤中，於37℃下進行培育歷時1小時。之後，移除各井中的液體並以 含有0.05% Tween 20的PBS(亦即PBST)予以洗滌3次，接著在每井中加入100μL的封阻緩衝液(blocking buffer)[亦即含有0.5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的PBS]，於37℃下進行培育歷時1小時。之後，移除各井中的液體並以PBST予以洗滌3次，接著在每井中加入100μL的兔子抗-FMDV VP1抗體(以封阻緩衝液予以稀釋5000倍)，於37℃下反應歷時1小時。之後，移除各井中的液體並以PBST予以洗滌1次，接著在每井中加入100μL的綴合有鹼性磷酸酶的山羊抗-兔子IgG(以封阻緩衝液予以稀釋5000倍)，於37℃下反應歷時1小時。之後，移除各井中的液體並以PBST予以洗滌3次，接著在每井中加入100μL的p-硝苯磷酸溶液，於37℃下進行呈色反應歷時45分鐘。之後，以一Spectramax M2微量培養盤讀取儀(Spectramax M2 microplate reader)在波長405nm下來測量各井的吸光值(OD₄₀₅)。接著，將所測得的OD₄₀₅吸光值分別根據預先以具有已知數量(known amount)的細菌FMDV-rVP1-抗體複合物(bacterial FMDV-rVP1-antibody complex)相對於其自身的OD₄₀₅數值而被換算成嵌合型VP1抗原決定位-經融合的BaMV CP(chimeric VP1 epitope-fused BaMV CP)(以下簡稱為“BVP1”)濃度(mg/mL)。BVP1相對於TSP的濃度百分比(%)是藉由將所測得的BVP1濃度以及TSP濃度分別代入下列公式(1)而被計算出：公式(1)：A=(B/C)×100

其中：A=BVP1相對於TSP的濃度百分比(%)

B=BVP1濃度(mg/mL)

C=TSP濃度(mg/mL)

結果：

圖4是一西方墨點分析圖，其顯示得自於各個基因轉殖本氏菸草細胞株的嵌合型BaMV蛋白質的表現情形。由圖4可見，得自於基因轉殖本氏菸草細胞株BdT38以及基因轉殖本氏菸草細胞株BdT19的蛋白質樣品在31kDa附近顯示出一清晰的帶(band)，但得自於基因轉殖本氏菸草細胞株B2B27以及基因轉殖本氏菸草細胞株BVP1-16-7所具者無此情形。使用抗-BaMV CP抗體來進行西方墨點分析亦觀察到相似的結果。在基因轉殖本氏菸草細胞株BdT38以及基因轉殖本氏菸草細胞株BdT19中有偵測到一高位準的BaMV CP，但在基因轉殖本氏菸草細胞株B2B27以及基因轉殖本氏菸草細胞株BVP1-16-7中無此情形。野生型BaMV CP與嵌合型BaMV CP在分子量上的差異表示VP1抗原決定位與BaMV CP產生穩定的融合(stable fusion)。除了非基因轉殖本氏菸草細胞株以及基因轉殖本氏菸草細胞株B2B27之外，BVP1被表現於其餘基因轉殖本氏菸草細胞株(包括BVP1-16-7、BdT38以及BdT19)中。使用抗-BaMV CP抗體來探測所有蛋白質樣品顯示出BVP1的降解(degradation)，然而使用抗-FMDV VP1抗體來探測顯示出在BaMV CP上有顯著數量之經融合的FMDV VP1抗原決定位。另外，在基因轉殖本氏菸草細胞株BdT38以及基因轉殖本氏菸草細胞株BdT19中分別偵測到默化抑制子蛋 白質P38以及默化抑制子蛋白質P19的表現，但在基因轉殖本氏菸草細胞株BVP1-16-7以及基因轉殖本氏菸草細胞株B2B27中無此情形。

圖5是一西方墨點分析圖，其顯示從基因轉殖本氏菸草細胞株B2B27中所純化出的野生型BaMV-S粒子以及從基因轉殖本氏菸草細胞株BdT38與BdT19中所純化出的CVPs的表現情形。由圖5可見，與野生型BaMV CP相較之下，嵌合型蛋白質(亦即BVP1)顯示出顯著較慢的移動(migration)，這表示FMDV-VP1胜肽與BaMV CP產生穩定的融合。

圖6顯示得自於各個基因轉殖本氏菸草細胞株的BVP1相對於TSP的濃度百分比。由圖6可見，BVP1在基因轉殖本氏菸草細胞株BdT38以及基因轉殖本氏菸草細胞株BdT19中的表現是顯著地高於在基因轉殖本氏菸草細胞株BVP1-16-7中所具者。

綜合以上的實驗結果，申請人認為：嵌合型BaMV蛋白質以及CVPs會累積於基因轉殖本氏菸草細胞株中，特別是基因轉殖本氏菸草細胞株BdT38以及基因轉殖本氏菸草細胞株BdT19。

實施例5. CVPs對於天竺鼠的免疫效力

為了評估CVPs對於誘發抗體的效力，依據上面實施例4的“實驗方法”的第A項「西方墨點分析」當中所述的得自於基因轉殖本氏菸草細胞株BdT38以及基因轉殖本氏菸草細胞株BdT19之經純化的CVPs被拿來進行下面 的實驗。

實驗方法：

A、以CVPs來免疫天竺鼠：

天竺鼠(n=3)分別被皮下注射以200μg之經純化的CVPs(得自於基因轉殖本氏菸草細胞株BdT38或BdT19)[在一為1：1(v/v)的比例下被乳化以Montanide ISA 206油質佐劑(W/O/W型)]。所有天竺鼠在皮下注射之後的第8天之時被追加免疫以相同數量的經純化的CVPs。第一次追加免疫是被皮下注射以及第二次與第三次追加免疫是被肌肉內注射。接著，在第一次皮下注射之後的第1、21、28以及35天之時從經免疫的天竺鼠中採集血液，然後依據上面“一般實驗方法”的第4項當中所述的方法來進行血清樣品的製備。由此所得到的血清樣品被使用作為一次抗體並且拿來進行下面第B項的實驗。

B、西方墨點分析：

將得自於基因轉殖本氏菸草細胞株BdT38以及基因轉殖本氏菸草細胞株BdT19之經純化的CVPs參照上面“一般實驗方法”的第3項「蛋白質樣品的分析」當中所述的方法來進行SDS-PAGE分析以及西方墨點分析。在西方墨點分析中，針對各個蛋白質所使用的一次抗體以及二次抗體分別被顯示於下面表4中。

結果：

圖7是一西方墨點分析圖。由圖7可見，CVPs的注射會致使對抗BVP1以及FMDV-rVP1的專一性抗血清的產生。這個實驗結果顯示：經純化的CVPs可以在天竺鼠中誘發專一性抗體的產生。

於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。

雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。

<110> 國立中興大學

<120> 嵌合型竹嵌紋病毒蛋白質與粒子、使用嵌合型竹嵌紋病毒載體而從衍生自基因轉殖植物的懸浮細胞中生產它們的方法，以及它們的應用

<130> CP-31057

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 242

<212> PRT

<213> 竹嵌紋病毒

<400> 1

<210> 2

<211> 729

<212> DNA

<213> 竹嵌紋病毒

<400> 2

<210> 3

<211> 37

<212> PRT

<213> 口蹄疫病毒

<400> 3

<210> 4

<211> 213

<212> PRT

<213> 口蹄疫病毒

<400> 4

<210> 5

<211> 111

<212> DNA

<213> 口蹄疫病毒

<400> 5

<210> 6

<211> 207

<212> PRT

<213> 竹嵌紋病毒

<400> 6

<210> 7

<211> 624

<212> DNA

<213> 竹嵌紋病毒

<400> 7

<210> 8

<211> 1056

<212> DNA

<213> 蕪菁皺病毒

<400> 8

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於擴增p38基因的前向引子P38 DraIII F

<400> 9

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於擴增p38基因的反向引子P38 DraIII R

<400> 10

<210> 11

<211> 519

<212> DNA

<213> 番茄叢生矮化病毒

<400> 11

<210> 12

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於擴增p19基因的前向引子P19 DraIII F

<400> 12

<210> 13

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於擴增p19基因的反向引子P19 DraIII R

<400> 13

<210> 14

<211> 351

<212> PRT

<213> 蕪菁皺病毒

<400> 14

<210> 15

<211> 172

<212> PRT

<213> 番茄叢生矮化病毒

<400> 15

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於擴增FMDV-VP1-BaMV CP編碼區域的前向引子Ba5353R-F

<400> 16

<210> 17

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於擴增FMDV-VP1-BaMV CP編碼區域的反向引子Ba6366-R

<400> 17

<210> 18

<211> 595

<212> PRT

<213> 人工的序列

<220>

<223> 嵌合型竹嵌紋病毒蛋白質

<400> 18

<210> 19

<211> 416

<212> PRT

<213> 人工的序列

<220>

<223> 嵌合型竹嵌紋病毒蛋白質

<400> 19

Claims (26)

1. 一種編碼一融合蛋白質以及一外來蛋白質的核酸建構物，其中該融合蛋白質包含有：(i)一載體片段，其含有一竹嵌紋病毒外殼蛋白質的胺基酸序列或它的一節段；以及(ii)一免疫原性異源性片段，其被融合至該載體片段並且具有一為至少3個胺基酸殘基的長度；以及該外來蛋白質包含有一含有一默化抑制子蛋白質的胺基酸序列的多肽。
2. 如請求項1的核酸建構物，其中該載體片段具有一如序列辨識編號：6所示的胺基酸序列。
3. 如請求項1的核酸建構物，其中該免疫原性異源性片段含有一口蹄疫病毒VP1抗原決定位的胺基酸序列。
4. 如請求項3的核酸建構物，其中該口蹄疫病毒VP1抗原決定位具有一如序列辨識編號：3所示的胺基酸序列。
5. 如請求項1的核酸建構物，其中該多肽含有一默化抑制子蛋白質P38的胺基酸序列。
6. 如請求項1的核酸建構物，其中該多肽含有一默化抑制子蛋白質P19的胺基酸序列。
7. 如請求項5的核酸建構物，其中該默化抑制子蛋白質P38具有一如序列辨識編號：14所示的胺基酸序列。
8. 如請求項6的核酸建構物，其中該默化抑制子蛋白質P19具有一如序列辨識編號：15所示的胺基酸序列。
9. 一種表現匣，其包含有一如請求項1至8中任一項的核 酸建構物。
10. 一種嵌合型竹嵌紋病毒蛋白質，它是由一如請求項1至8中任一項的核酸建構物所編碼。
11. 一種宿主細胞，其包含有一如請求項9的表現匣。
12. 如請求項11的宿主細胞，它是一植物的一細胞。
13. 如請求項12的宿主細胞，其中該植物是本氏菸草。
14. 如請求項12的宿主細胞，其中該細胞是一懸浮細胞。
15. 一種嵌合型竹嵌紋病毒粒子，其包含有一如請求項10的嵌合型竹嵌紋病毒蛋白質。
16. 一種用於生產一嵌合型竹嵌紋病毒蛋白質的方法，其包括：(i)將一如請求項1至8中任一項的核酸建構物轉形至一本氏菸草細胞內；(ii)將所形成的基因轉殖本氏菸草細胞培養於一適於該核酸建構物表現的培養條件下，俾以形成該嵌合型竹嵌紋病毒蛋白質；以及(iii)從該基因轉殖本氏菸草細胞中純化出該嵌合型竹嵌紋病毒蛋白質。
17. 一種用於生產一嵌合型竹嵌紋病毒粒子的方法，其包括：(i)將一如請求項1至8中任一項的核酸建構物轉形至根癌土壤桿菌內；(ii)將所形成的根癌土壤桿菌轉形株轉形至一本氏菸草植株； (iii)將所得到的基因轉殖本氏菸草植株的一葉片進行懸浮細胞培養，藉此而得到一懸浮細胞培養物；(iv)將該懸浮細胞培養物培養於一適於該核酸建構物表現的培養條件下，俾以形成該嵌合型竹嵌紋病毒粒子；以及(v)從該懸浮細胞培養物中純化出該嵌合型竹嵌紋病毒粒子。
18. 一種對抗口蹄疫病毒的動物用疫苗，其包含有一如請求項15的嵌合型竹嵌紋病毒粒子。
19. 一種用於預防口蹄疫的藥學組成物，其包含有一如請求項15的嵌合型竹嵌紋病毒粒子。
20. 如請求項19的藥學組成物，其進一步包含有一藥學上可接受的載劑。
21. 如請求項19的藥學組成物，它是呈一供非經腸道投藥的劑型。
22. 如請求項19的藥學組成物，它是呈一供口服投藥的劑型。
23. 一如請求項15的嵌合型竹嵌紋病毒粒子供應用於製備一用來預防口蹄疫之醫藥品的用途。
24. 如請求項23的用途，其中該醫藥品進一步包含有一藥學上可接受的載劑。
25. 如請求項23的用途，其中該醫藥品是呈一供非經腸道投藥的劑型。
26. 如請求項23的用途，其中該醫藥品是呈一供口服投藥 的劑型。