TW202018084A - 修飾之諾羅病毒vp1蛋白及包含修飾之諾羅病毒vp1蛋白之vlp - Google Patents
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Abstract
提供了編碼經修飾的諾羅病毒VP1蛋白的核酸、以及包含一種或多種經修飾的諾羅病毒VP1蛋白的VLP。還描述了用於在植物、植物的部分、或植物細胞中產生經修飾的諾羅病毒VP1蛋白以及諾羅病毒VLP的方法。
Description
本發明與經修飾的諾羅病毒VP1蛋白、包括經修飾的諾羅病毒VP1蛋白的VLP、及其產生方法有關。
歸因於諾羅病毒感染的全球疾病負擔高，估計與全世界所有腹瀉病例中的20％相關並且每年導致超過200,000例死亡。諾羅病毒是北美地區食媒性疾病暴發的主要原因、並且是老年人間大多數與醫療相關的疾病暴發的致病因素。諾羅病毒品系也被認為是全世界兒科胃腸病的主要原因。
諾羅病毒包括Caliciviridae
科的多個屬中的一個屬。人類諾羅病毒基因體是編碼三個開讀框（ORF）的單股正義RNA分子、並且在其5'端由VPg蛋白封端。ORF1編碼六種非結構性病毒蛋白，包括VPg、依憑RNA的RNA聚合酶以及病毒蛋白酶。ORF2編碼主要結構殼體蛋白（VP1）。ORF3編碼次要殼體蛋白（VP2）。
VP1由2個結構域組成：殼體（S）結構域以及突出（P）結構域。S結構域（例如GI.1品系）包括前225個N-端胺基酸、以及包含殼體組裝以及病毒二十面體形成所必需的結構元件。P結構域包括VP1蛋白的剩餘部分、並且還包括P1亞結構域及P2亞結構域。P2亞結構域被稱為高度變異結構域、並且被認為在受體結合及免疫反應性中扮演重要角色。
VP1蛋白經由P結構域介導的蛋白質相互作用形成二聚體。二聚化增加了病毒粒子殼體的穩定性、並導致從由S結構域形成的諾羅病毒顆粒的基礎核心延伸的突出的形成。當被表現時，諾羅病毒VP1蛋白可自動組裝以形成2個病毒粒子結構：具有T = 3二十面體對稱性及38-40 nm直徑的180-mer殼體結構；以及具有T = 1二十面體對稱性以及23 nm直徑的60-mer殼體結構。
VP2（次要結構蛋白）具有約21-24 kDa的分子量（MW）。研究表明了VP2是高度鹼性的且位於殼體內。VP2的功能尚未完全被了解，但通常認為藉由保護病毒粒子免於分解以及降解而在殼體穩定性中起作用（Bertolotti-Ciarlet A.、Crawford S.E.、Hutson A.M.、Estes M.K. 2003，J. Virol. 77：11603-11615）。VP2在RNA基因體包裹期間也可具有功能。由於1.5至8個複製被摻入成熟的病毒粒子中，病毒粒子中VP2次要結構蛋白的量相對較低。Bertolotti-Ciarlet等人（2003）報導，在昆蟲以及哺乳動物細胞中，由VP1/VP2組成的VLP比僅具有VP1的VLP對蛋白酶剪切更具抗性，並且VP2在順式（cis
）中的表現導致VP1蛋白產生增加。此外，ORF2基因下游3’UTR的存在增加了NV ORF2 mRNA的穩定狀態程度。當位於相同構築體上並且在一個啟動子調控下的ORF2 + ORF3 + 3’UTR被表現時，觀察到VP1表現的最大增加。VP2在反式（trans
）中的表現不導致VP1表現的任何增加，這表明ORF2-ORF2-3’UTR的次基因體組織是觀察到的VP1產生增加所必需的。
根據諾羅病毒對VP1胺基酸序列的譜系聚類對諾羅病毒進行分類。迄今已分類7種基因群（GI至GVII），已知感染人類的僅GI、GII以及GIV基因群。在目前與人類感染相關聯的32種特定基因型中，GII.4諾羅病毒是造成大多數近期諾羅病毒爆發的原因。GII.4的新品系每兩到三年出現一次，由VP1的高度變異P2結構域的表位決定區中的突變驅動的過程演化。此過程允許諾羅病毒避開了先前暴露於早期品系所獲得的體液免疫反應。
雖然面臨快速演化以及遺傳多樣性諾羅病毒品系的困難，但是有效的諾羅病毒疫苗的開發由於額外的挑戰而已劇增。例如，直到最近，人類諾羅病毒不能在細胞培養物中生長，甚至現在，正缺乏針對VLP以及減毒活諾羅病毒的穩健細胞培養系統。
疫苗開發中的另一個挑戰是對諾羅病毒感染的免疫性是品系以及基因型專一性的，具有對其他基因群賦予的最小交叉免疫性。此外，對諾羅病毒品系的免疫性不是終生的、且估計為持續6個月至9年之間。
已經採用各種方法開發抗諾羅病毒感染（包括在昆蟲以及植物表現系統中產生重組諾羅病毒蛋白）的適合的疫苗。
Huo等人（Virus Research ，
2015，204：1-5）證明昆蟲SF9細胞中產生的諾羅病毒VP1 VLP的M27G突變殼體蛋白導致產生38 nm以及21 nm的VLP，包括58 kDa以及55 kDa的蛋白質。與內部起始密碼子的轉譯產物相反，55 kDa蛋白質是全長P1殼體蛋白的降解或剪切的結果。包括VP1蛋白的26或38個缺失胺基酸殘基的N-端缺失突變體導致21 nm VLP的產生。26個胺基酸缺失突變體產生低數量的38 nm VLP，而38個胺基酸缺失突變體不導致38 nm VLP的形成。
US 2013/0273105教導了諾羅病毒製劑的生產，該諾羅病毒製劑包括從基因群I（G1）、基因群II（GII）、或一致的病毒序列得到的VLP、抗原胜肽、或蛋白質。諾羅病毒抗原可包括VLP中表現的殼體蛋白的變異體。
US 2015/0023995提供包括了在昆蟲Sf9細胞中產生的VLP的疫苗製劑，該VLP包括從至少兩種病毒蛋白質序列得到的複合胺基酸序列。例如，描述了包括來自GII.4密涅瓦2006-a（GII.4 Minerva 2006-a）以及GII.4 勞倫斯 2006-b（GII.4 Laurens 2006-b）以及GII.4休士頓2002（GII.4 Houston 2002）諾羅病毒品系的VP1序列的複合GII.4 VP1 VLP。還描述了從GII.1、GII.2雪山（GII.2 Snow Mountain）以及GII.3得到的複合序列、以及從諾沃克（Norwalk）GI.1（Norwalk GI.1）、南安普頓GI.1（Southampton GI.1）以及千葉GI.1（Chiba GI.1）得到的GI複合序列。
Mason等人（Proc Natl Acad Sci U.S.A.
，1996，93(11）：5335-40）教導了使用遺傳工程煙草植物以及馬鈴薯塊莖來表現來自天然VP1蛋白的GI.1諾羅病毒VLP。植物產生的諾羅病毒VLP在形態學上及物理上類似於在昆蟲細胞中產生的38 nm Norwalk VLP（Norwalk VLP）。口服投予來自天然體殼蛋白或表現GI.1殼體蛋白的馬鈴薯塊莖的純化的煙草產生的Norwalk VLP誘導了小鼠以及人中的體液免疫反應（Tacket等人，J. Infect. Dis.
，2000，182(1)：302-5）。
Huang等人（Biotechnol. Bioeng.
，2009，103(4)：706-14）描述了用於在植物中產生GI.1諾羅病毒VLP的雙生病毒衍生的DNA複製子載體。在圓葉煙草中共同遞送菜豆黃矮病毒衍生的載體以及Rep/RepA供應載體導致快速且穩健的蛋白質產生。
本發明與經修飾的諾羅病毒蛋白、包括經修飾的諾羅病毒蛋白的類病毒顆粒（VLP）、以及產生諾羅病毒蛋白以及包括經修飾的諾羅病毒蛋白的類病毒顆粒（VLP）的方法有關。
本發明的目的是產生經修飾的諾羅病毒蛋白、包括經修飾的諾羅病毒蛋白的VLP、以及在植物中產生包括經修飾的諾羅病毒蛋白的VLP。
如本文所述，提供了重組多核苷酸，該重組多核苷酸包括編碼經修飾的諾羅病毒VP1蛋白的核苷酸序列，其中該經修飾的諾羅病毒VP1蛋白在以下處包括一或多於一個取代、修飾或突變：
從與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸43、57、84以及94序列比對的位置中選出的胺基酸，
與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸39-46序列比對的胜肽片段的缺失，
與諾羅病毒VP1基因型GI.1的位置39-46對應的胺基酸突變為序列SSTAVATA，或
其組合，以及
核苷酸序列不是得自基因型GI.1諾羅病毒VP1。
還提供的是如上所述的重組多核苷酸，其中核苷酸序列是得自從由基因型GI.2、GI.3、GI.5、GI.7、GII.2、GII.3、GII.4、GII.6、GII.12以及GII.17組成的群組中選出的諾羅病毒VP1。例如，不應認為是限制性的，該核苷酸序列可以得自包括下列的群組：G1.2/魯汶（Leuven）/2003/BEL（G1.2/Leuven/2003/BEL）、GI.3/S29/2008/利拉艾德/瑞典（GI.3/S29/2008/Lilla Edet/Sweden）、GI.5/夕克洛斯-HUN5407/2013/HUN（GI.5/Siklos-HUN5407/2013/HUN）、GI.7/USA/2014/GA5043、GII.2/CGMH47/2011/TW；GII.3/周靜/2013402/CHN（GII.3/Jingzhou/2013402/CHN）、GII.4/雪梨（Sydney）/NSW0514/2012/AU（GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU）、GII.6/俄亥俄/490/2012/USA（GII.6/Ohio/490/2012/USA）、GII.12/HS206/2010/USA、以及GII.17_Kawa_2014_A0A077KVU6。
上述的重組多核苷酸可包括專一性取代、修飾或突變，其獨立地從下列中選出：
在與VP1基因型GI.1的胺基酸43序列比對的位置處的取代、修飾或突變為纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、蘇胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、離胺酸或組胺酸；
在與VP1基因型GI.1的胺基酸57序列比對的位置處的取代、修飾或突變為異白胺酸、白胺酸、纈胺酸、丙胺酸、甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、離胺酸或組胺酸；
在與VP1基因型GI.1的胺基酸84序列比對的位置處的取代、修飾或突變為絲胺酸、天冬醯胺、半胱胺酸、蘇胺酸、丙胺酸、離胺酸或組胺酸；以及
在與VP1基因型GI.1的胺基酸94序列比對的位置處的取代、修飾或突變為白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、纈胺酸、蘇胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、離胺酸或組胺酸。
上述任何重組多核苷酸還可以針對人類密碼子使用、增加的GC含量或其組合進行最佳化。
本文還描述了由上述任何一種重組多核苷酸編碼的經修飾的諾羅病毒VP1蛋白。此外，還揭露了包括由上述任何一種重組多核苷酸編碼的經修飾的諾羅病毒VP1蛋白的VLP。包括由上述任何一種重組多核苷酸編碼的諾羅病毒VP1蛋白的VLP可以進一步包括諾羅病毒VP2蛋白。
本文還提供了一種用於在植物、植物的部分或植物細胞中產生經修飾的諾羅病毒VP1的方法。經修飾的諾羅病毒VP1可以由上述任何一種重組多核苷酸編碼。該方法包括將一種或多於一種上述的重組多核苷酸引入植物、植物的部分或植物細胞中、以及在允許一種或多於一種經修飾的諾羅病毒VP1蛋白表現的條件下培養植物、植物的部分或植物細胞。本文提供的方法可以進一步包括收穫植物、植物的部分或植物細胞的步驟。此外，該方法可包括從該植物、植物的部分或植物細胞中萃取、純化、或萃取並純化一種或多於一種經修飾的諾羅病毒VP1蛋白的步驟。另外，在引入的步驟中，該方法可以進一步包括將編碼諾羅病毒VP2蛋白的第二核酸序列引入該植物、植物的部分或植物細胞中，並且在培養的步驟中，該些條件允許在該植物、植物的部分或植物細胞中共同表現以及共同產生一種或多於一種經修飾的諾羅病毒VP1蛋白以及諾羅病毒VP2蛋白。
還描述了一種用於在植物、植物的部分或植物細胞中產生諾羅病毒類病毒顆粒（VLP）的方法，其中VLP包括由一種或多於一種上述的重組多核苷酸所編碼的一種或多於一種經修飾的諾羅病毒VP1蛋白。。該方法包括將一種或多於一種上述的重組多核苷酸引入植物、植物的部分或植物細胞中、以及在允許該一種或多於一種經修飾的諾羅病毒VP1蛋白表現的條件下培養該植物、植物的部分或植物細胞，藉以產生該諾羅病毒VLP。本文提供的方法可以進一步包括收穫植物、植物的部分或植物細胞的步驟。此外，該方法可包括從該植物、植物的部分或植物細胞中萃取、純化、或萃取並純化該諾羅病毒VLP的步驟。另外，在引入的步驟中，該方法可以進一步包括將編碼諾羅病毒VP2蛋白的第二核酸序列引入該植物、植物的部分或植物細胞中，並且在培養的步驟中，該些條件允許在該植物、植物的部分或植物細胞中共同表現以及共同產生經修飾的諾羅病毒VP1蛋白以及諾羅病毒VP2蛋白，藉以產生該諾羅病毒VLP。藉由本文描述的方法產生的諾羅病毒VLP可具有約15 nm至50 nm的直徑。或者，VLP可具有約23 nm（對於T=1二十面體對稱）、或約38 nm（對於T=3二十面體對稱）的直徑。
本文提供了一種產生抗體或抗體片段的方法，其中該方法包括將由一種或多於一種上述重組多核苷酸所編碼的一種或多於一種經修飾的諾羅病毒VP1蛋白、或含有一種或多於一種該經修飾的諾羅病毒VP1蛋白的諾羅病毒VLP投予受試者或宿主動物，藉以產生該抗體或該抗體片段。
本文還提供了包括上述重組多核苷酸的植物、植物的部分或植物細胞、由一種或多於一種該重組多核苷酸所編碼的該經修飾的諾羅病毒VP1、或含有一種或多於一種該經修飾的諾羅病毒VP1蛋白的諾羅病毒VLP。
本文還描述了一種用於誘導免疫反應的組成物。該組成物包括有效劑量的由一種或多於一種上述重組多核苷酸所編碼的一種或多於一種經修飾的諾羅病毒VP1蛋白、或含有一種或多於一種該經修飾的諾羅病毒VP1蛋白的諾羅病毒VLP、以及藥學上可接受的載體、佐劑、媒介物或賦形劑。
本揭露內容還提供了一種用於誘導免疫反應的疫苗，其中所述疫苗包含有效劑量的由一種或多於一種上述重組多核苷酸所編碼的一種或多於一種經修飾的諾羅病毒VP1蛋白、或含有一種或多於一種該經修飾的諾羅病毒VP1蛋白的該VLP。
已經表徵了多種諾羅病毒品系，並且諾羅病毒品系可以隨時間演化。因此，本揭露內容還涉及來自諾羅病毒的VP1蛋白以及VP2蛋白，該VP1蛋白及VP2蛋白對第2A圖以及第2B圖中列出的任何諾羅病毒品系的VP1蛋白、VP2蛋白、或VP1蛋白及VP2蛋白兩者表現出約30-100％或其間的任何量的胺基酸序列一致性，條件是：當將VP1蛋白投予受試者時，VP1蛋白可以在植物中表現、且VP1蛋白在受試者中誘導對諾羅病毒的免疫。例如，諾羅病毒品系包括對第2A圖以及第2B圖中列出的任何品系的VP1蛋白、VP2蛋白、或VP1蛋白及VP2蛋白兩者具有30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100%、或其間的任何量的胺基酸序列一致性（序列相似性；百分比一致性；百分比相似性）的品系，條件是：當將VP1蛋白投予受試者時，VP1蛋白可以在植物中表現、且VP1蛋白在受試者中誘導對諾羅病毒的免疫。
本文提供了一種抗體或抗體片段，其中藉由將由一種或多於一種上述重組多核苷酸所編碼的一種或多於一種經修飾的諾羅病毒VP1、或含有一種或多於一種該經修飾的諾羅病毒VP1的諾羅病毒VLP投予受試者或宿主動物來製備該抗體或抗體片段。
本文還描述了一種在受試者中誘導對諾羅病毒感染的免疫性的方法，其中該方法包括投予由一種或多於一種上述重組多核苷酸所編碼的一種或多於一種經修飾的諾羅病毒VP1蛋白、或含有一種或多於一種該經修飾的諾羅病毒VP1蛋白的諾羅病毒VLP。該一種或多於一種經修飾的諾羅病毒VP1蛋白、或該諾羅病毒VLP可以口服、鼻內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、直腸或陰道內投予受試者。
本文還描述了一種經修飾的諾羅病毒VP1，該經修飾的諾羅病毒VP1包括了在與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸43、57、84以及94序列比對的胺基酸選出的一位置處的一個或多於一個取代、與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸39至46序列比對的胜肽片段的缺失、與諾羅病毒VP1基因型GI.1序列比對的胺基酸39至46被修飾為序列SSTAVATA或其組合。VP1蛋白也可以作為類病毒顆粒（VLP）被產生。此外，還提供了一種用於誘導免疫反應的組成物或疫苗，該組成物或疫苗包括有效劑量的如上所述的VLP、以及藥學上可接受的載體、佐劑、媒介物或賦形劑。疫苗可以是單價、二價、三價或四價疫苗。還描述了一種用於在受試者中誘導對諾羅病毒感染的免疫性的方法，該方法包括向受試者投予該組成物或疫苗。
本發明內容不是必須描述本發明的所有特徵。
以下描述是較佳實施方式的描述。
如本文所使用的，用語「包含」、「具有」、「包括」以及「含有」及其語法變化是包含性的或開放式的，並且不排除另外的，未列舉的元件及/或方法步驟。當在本文中與用途或方法結合使用時，用語「基本上由…組成」表示可以存在附加的元件及/或方法步驟，但是這些添加不會實質上影響該方法或用途起作用的方式。當在本文中與用途或方法結合使用時，用語「由…組成」排除了附加元件及/或方法步驟的存在。在某些實施方式中，本文描述的包括某些元件及/或步驟的用途或方法也可以基本上由那些元件及/或步驟組成，並且在其他實施方式中由那些元件及/或步驟組成，無論這些實施方式是否被具體提到。此外，除非另有說明，否則單數的使用包括複數，且「或」表示「及/或」。本文中使用的用語「多個」意指多於一個，例如，兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個等。除非本文另有定義，否則本文使用的所有技術以及科學用語具有與本領域中具有通常知識者通常理解的相同含義。如本文中使用的，用語「約」是指與給定值的約+/-10%的變化。要理解的是，無論是否具體提及，這種變化總是被包括在本文提供的任何給定值中。當在本文中與用語「包括」結合使用時，用語「一(a)」或「一(an)」可以表示「一個（種）」，但其也與「一或多個（種）」、「至少一個（種）」以及「一個（種）或多於一個（種）」的含義一致。
如本文使用的，用語「植物」、「植物的部分」、「植物部分」、「植物物質」、「植物生物質」、「植物材料」、「植物萃取物」或「植物葉子」可以包括能夠提供用於表現本文所述的一種或多於一種核酸、及/或可以從中萃取及純化表現的蛋白質或VLP的轉錄、轉譯及轉譯後機制的整個植物、組織、細胞或其任何部分、細胞內植物成分、細胞外植物成分、植物的液體或固體萃取物、或其組合。植物可包括但不限於農作物，包括例如油菜、十字花科蕓苔屬（Brassica spp.）、玉蜀黍、煙草屬（Nicotiana spp.）（煙草）（例如，圓葉煙草、黃花煙草（Nicotiana rustica
）、紅花煙草（Nicotiana, tabacum
）、花煙草（Nicotiana alata
））、阿拉伯芥（Arabidopsis thaliana
）、苜蓿、馬鈴薯、甘藷（Ipomoea batatus
）、人參、豌豆、燕麥、大米、大豆、小麥、大麥、向日葵、棉花、玉米、黑麥（Secale cereale
）、高粱（Sorghum bicolor
、Sorghum vulgare
）、紅花（Carthamus tinctorius
）。
如本文使用的，用語「植物部分」是指植物的任何部分，包括但不限於葉、莖、根、花、果實、從葉、莖、根、花、果實獲得的植物細胞、從葉、莖、根、花、果實獲得的植物萃取物、或其組合。如本文使用的，用語「植物萃取物」是指在物理地（例如藉由冷凍然後在合適的緩衝液中萃取）、機械地（例如藉由研磨或均質化植物或植物的部分，然後在合適的緩衝液中萃取）、酵素催化地（例如使用細胞壁降解酶）、化學地（例如使用一種或多種螯合劑或緩衝液）、或其組合處理植物、植物的一部分、植物細胞、或其組合之後獲得的植物衍生產物。可以進一步處理植物萃取物以除去不需要的植物成分，例如細胞壁碎片。可以獲得植物萃取物以幫助從植物、植物的部分或植物細胞中回收一種或多種成分，例如來自植物、植物的部分或植物細胞的蛋白質（包括蛋白質複合物、蛋白質超結構及/或VLP）、核酸、脂質、碳水化合物或其組合。如果植物萃取物包括蛋白質，則其可以稱為蛋白質萃取物。蛋白質萃取物可以是粗植物萃取物、部分純化的植物或蛋白質萃取物、或純化產物，其包括來自植物組織的一種或多種蛋白質、蛋白質複合物、蛋白質超結構及/或VLP。如果需要，可以使用本領域中具有通常知識者已知的技術部分地純化蛋白質萃取物或植物萃取物，例如，可以對萃取物進行鹽或pH沉澱、離心、梯度密度離心、過濾、層析法，例如，粒徑篩析層析、離子交換層析、親和層析、或其組合。還可以使用本領域中具有通常知識者已知的技術來純化蛋白質萃取物。
如本文所用的術語「核酸片段」是指編碼所關注的蛋白質的核酸序列。除核酸序列外，核酸片段還包括與核酸序列操作性地連接的調控區以及終止子。調控區可以例如包括啟動子、以及可選地與啟動子操作性地連接的增強子元件。
如本文所用的術語「核酸複合物」是指兩個或多於兩個核酸片段的組合。兩個或兩個以上核酸片段可以存在於單一核酸中，使得核酸複合物包括兩個或多於兩個核酸片段，每一個核酸片段是在調控區以及終止子的控制下。或者，核酸複合物可包括兩種或更多種單獨的核酸，每一種核酸包括一個或多於一個核酸片段，其中每一個核酸片段是在調控區以及終止子的控制下。例如，核酸複合物可包括一種核酸，該核酸包括兩個核酸片段，核酸複合物可包括兩種核酸，每種核酸包括一個核酸片段，或核酸複合物可包括兩種或多於兩種核酸，每種核酸包括一個或多於一個核酸片段。
如本文使用的用語「載體」或「表現載體」是指用於將外源核酸序列轉移到宿主細胞（例如植物細胞）中並引導外源核酸序列在宿主細胞中表現的重組核酸。「表現卡匣」是指包括了在適當的啟動子或其他調控因子的控制下、並與適當的啟動子或其他調控因子可操作地(或操作性地)連接的所關注的核酸的核苷酸序列，以用於在宿主細胞中轉錄所關注的核酸。如本領域中具通常知識者所理解的，表現卡匣可包括終止（終止子）序列，該終止（終止子）序列是在植物宿主中有活性的任何序列。例如，終止序列可以得自二分（bipartit）RNA病毒（例如，豇豆嵌紋病毒）的RNA-2基因體片段，終止序列可以是NOS終止子，或者終止子序列可以從苜蓿色素體藍素基因的3’UTR獲得。
本揭露內容的構築體可以進一步包括3’非轉譯區（UTR）。3’非轉譯區含有多腺苷酸化信號、以及能夠實現mRNA處理或基因表現的任何其他調控信號。多腺苷酸化信號通常藉由使多腺苷酸軌道添加到mRNA前驅物的3’端來表徵。儘管變異並不罕見，多腺苷酸化信號通常藉由與經典形式5’AATAAA-3’同源的存在來辨識。合適的3’ 非轉譯區的非限制性範例是含有農桿菌腫瘤誘導的（Ti）質體基因（例如胭脂鹼合成酶（Nos基因））以及植物基因（例如大豆貯藏蛋白基因）的多腺苷酸化信號、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶基因的小次單元（ssRUBISCO；US 4,962,028；其藉由引用併入本文））、用於調控色素體藍素表現的啟動子的3’轉錄的非轉譯區。
「調控區」、「調控因子」或「啟動子」通常是指核酸的一部分，但不總是在基因（可以由DNA或RNA、或DNA及RNA兩者組成）的蛋白質編碼區的上游。當調控區是啟動的、且與所關注的核苷酸序列操作性地相關聯或操作性地連接時，這可導致所關注的核苷酸序列的表現。調控因子可能能夠介導器官專一性、或控制發育或暫時性基因活化。「調控區」包括啟動子元件、表現出基礎啟動子活性的核心啟動子元件、回應外部刺激而可誘導的元件、介導啟動子活性的元件（例如負調控因子或轉錄增強子）。如本文使用的，「調控區」還包括轉錄後有活性的元件，例如調節基因表現的調控因子（例如轉譯及轉錄增強子、轉譯及轉錄抑制子、上游活化序列以及mRNA不穩定性決定子）。這些後面的元件中的幾個可以位於編碼區的近側。
在本揭露內容的上下文中，用語「調控因子」或「調控區」典型地是指DNA序列，通常但並非總是在結構基因的編碼序列的上游(5’)，其藉由提供在特定位點開始轉錄所需的RNA聚合酶及/或其他因子的識別來控制編碼區域的表現。然而，應理解，位於內含子內或序列3’內的其他核苷酸序列也可有助於調控所關注的編碼區的表現。提供RNA聚合酶或其他轉錄因子的識別以確保在特定位點起始的調控因子的範例是啟動子元件。大多數、但不是全部的真核啟動子元件含有TATA盒（為由腺苷以及胸腺嘧啶核苷核苷酸鹼基對組成的保留核酸序列）通常位於轉錄起始位點上游約25個鹼基對。啟動子元件可包括負責轉錄起始的基礎啟動子元件、以及修飾基因表現的其他調控因子。
存在幾種類型的調控區，包括發育調控的、可誘導的或持續型的那些調控區。發育調控的、或在調控區控制下控制基因的差異表現的該調控區在某些器官或器官的組織內於該器官或組織的發育期間的特定時間被活化。然而，受發育調控的一些調控區可能優先在特定發育階段的某些器官或組織內具有活性，這些調控區也可以在植物內的其他器官或組織中以基礎水準、或以發育調控的方式而為活化的。組織專一性調控區的範例（例如參見專一性調控區）包括napin啟動子以及十字花科蛋白啟動子（cruciferin promoter）（Rask等人，1998，J. Plant Physiol. 152：595-599；Bilodeau等人，1994，Plant Cell 14：125-130）。葉專一性啟動子的範例包括色素體藍素啟動子（參見US 7,125,978，其藉由引用併入本文）。
可誘導的調控區是能夠回應誘導物而直接或間接活化一種或多種DNA序列或基因的轉錄的調控區。在沒有誘導物下，DNA序列或基因將不被轉錄。通常，與可誘導的調控區專一性結合以活化轉錄的蛋白因子可以用不活化形式存在，然後藉由誘導物直接或間接地被轉化為活化形式。然而，蛋白因子也可能不存在。誘導物可以是化學試劑，例如蛋白質、代謝物、生長調節劑、除草劑或酚類化合物、或直接由熱、冷、鹽或有毒元素施加的生理壓力、或經由病原體或致病因子（例如病毒）的作用間接施加的生理壓力。含有可誘導調控區的植物細胞可以例如藉由噴霧、澆水、加熱或類似方法以由外部將誘導物施加於細胞或植物而暴露於誘導物。可誘導的調控因子可以得自植物或非植物基因（例如Gatz, C.以及Lenk，I.R.P.，1998，Trends Plant Sci. 3，352-358）。潛在的可誘導的啟動子的範例包括但不限於四環素可誘導的啟動子（Gatz, C.，1997，Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48，89-108）、類固醇可誘導的啟動子（Aoyama, T.以及Chua, N.H.，1997，Plant J. 2，397-404）以及乙醇可誘導的啟動子（Salter, M.G. 等人，1998，Plant Journal 16，127-132；Caddick, M.X.等人，1998，Nature Biotech. 16，177-180）、細胞分裂素可誘導的IB6以及CKI1基因（Brandstatter, I.以及Kieber, J.J.，1998，Plant Cell 10，1009-1019；Kakimoto, T.，1996，Science 274，982-985）、以及生長素可誘導元件DR5（Ulmasov, T.等人，1997，Plant Cell 9，1963-1971）。
持續型調控區引導基因在植物的各個部分中的表現、並持續引導基因在整個植物發育中的表現。已知的持續型調控因子的範例包括與CaMV 35S轉錄本相關聯的啟動子（p35S；Odell等人，1985，Nature，313：810-812；其藉由引用併入本文）、水稻肌動蛋白1（Zhang等人，1991，Plant Cell，3：1155-1165）、肌動蛋白2（An等人，1996，Plant J
.，10：107-121）、或tms 2（U.S. 5,428,147）、以及磷酸丙糖異構酶1（triosephosphate isomerase 1）（Xu等人，1994，Plant Physiol.，106：459-467）基因、玉蜀黍泛蛋白1基因（Cornejo等人，1993，Plant Mol. Biol. 29：637-646）、阿拉伯芥泛蛋白1及6基因（Holtorf等人，1995，Plant Mol. Biol. 29：637-646）、煙草轉譯起始因子4A基因（Mandel等人，1995 Plant Mol. Biol. 29：995-1004）；木薯葉脈嵌紋病毒啟動子pCAS（Verdaguer等人，1996）；核酮糖二磷酸羧化酶小次單元的啟動子pRbcS：（Outchkourov等人，2003）、（用於單子葉植物以及雙子葉植物的）的pUbi。
本文中使用的用語「持續型」不一定表示在持續型調控區控制下的核苷酸序列在所有細胞類型中以相同水準表現，但是即使經常觀察到豐富的變化，該序列在廣泛的細胞類型中表現。
如上所述的表現構築體可以存在於載體中。載體可包括允許表現卡匣轉移以及整合到生物體或宿主的基因體中的邊緣序列。構築體可以是植物二元載體，例如基於pPZP的二元轉化載體（Hajdukiewicz等人1994）。其他範例性構築體包括pBin19（參見Frisch, D. A., L. W. Harris-Haller等人1995，Plant Molecular Biology
27：405-409）。
本文中使用的用語「天然」、「天然蛋白質」或「天然結構域」是指具有與野生型相同的一級胺基酸序列的蛋白質或結構域。天然蛋白質或結構域可以由對野生型序列具有100％序列相似性的核苷酸序列編碼。當與野生型核苷酸序列比較時，天然胺基酸序列也可以由人類密碼子（hCod）最佳化的核苷酸序列或包括增加的GC含量的核苷酸序列編碼，條件是由hCod-核苷酸序列編碼的胺基酸序列對天然胺基酸序列顯現出100％序列一致性。
關於是「人類密碼子最佳化的」的核苷酸序列、或「hCod」核苷酸序列，其意指選擇合適的DNA核苷酸以用於合成接近通常在人類核苷酸序列的寡核苷酸序列中發現的密碼子使用的寡核苷酸序列或其片段。關於「增加的GC含量」，其意指，當與對應的天然寡核苷酸序列相較時，選擇用於合成寡核苷酸序列或其片段的合適的DNA核苷酸以接近包括增加的GC含量（例如，超出寡核苷酸序列的編碼部分的長度約1%至約30%、或其間的任何量）的密碼子使用。例如，超出寡核苷酸序列的編碼部分的長度大約從1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30%、或其間的任何量。如下所述，當與非人類最佳化的（或較低GC含量）的核苷酸序列的表現相較時，人類密碼子最佳化的核苷酸序列、或包括增加的GC含量的核苷酸序列（當與野生型核苷酸序列相較時）在植物、植物的部分、或植物細胞中呈現出增加的表現。
本文描述了諾羅病毒VP1突變蛋白（也稱為經修飾的VP1蛋白或經修飾的諾羅病毒VP1蛋白）、以及在植物中產生諾羅病毒VP1突變蛋白的方法。幾種經修飾的諾羅病毒VP1蛋白在非GI.1 VP1的S結構域中包括了針對下列的專一性取代、修飾或突變：在GI.1S結構域中發現的對應胺基酸。已經觀察到，在某些諾羅病毒基因型中，將針對GI.1 VP1中發現的對應胺基酸的專一性胺基酸進行突變，與野生型（非GI.1）VP1及/或VLP相較，導致類似或改進的VP1及/或VLP特性。VP1及/或VLP的改進特性的範例包括：
- 與不包括取代、修飾或突變的相同基因型的野生型VP1的產量相較，當在植物細胞中表現時，VP1蛋白產量增加；
- 與包括相同基因型（不包括取代、修飾或突變）的野生型VP1的VLP的密度相較，包括經修飾的VP1蛋白的VLP的密度增加（例如，使用密度梯度分離以及任選的SDS-PAGE及/或Western分析確定）；
- 與包括相同基因型（不包括取代、修飾或突變）的野生型VP1的VLP的完整性、穩定性、或兩者相較，包括經修飾的VP1蛋白的VLP的完整性、穩定性、或完整性及穩定性兩者被改善；
- 與不包括取代、修飾或突變的相同基因型的野生型VLP產生水準相較，當在植物細胞中表現時，VLP產量增加；
- 與包括相同基因型（不包括取代、修飾或突變）的野生型VP1的VLP的累積相較，包括經修飾的VP1蛋白的VLP的累積被改善；
- 與不包括取代、修飾或突變的相同基因型的野生型VP1相較，相對於23 nm VLP，組裝成38 nm VLP的VLP有更大比例；以及
- 其組合。
例如，經修飾的諾羅病毒VP1蛋白以及產生經修飾的諾羅病毒VP1蛋白的方法可包括編碼VP1蛋白的核苷酸序列，該VP1蛋白包括與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1；參見第2C圖）的位置43、57、84以及94序列比對的任何一個或多個胺基酸處的S結構域取代、突變或修飾、或者與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸39至46序列比對的胜肽片段的缺失、或其組合。編碼諾羅病毒VP1突變蛋白的序列可以針對人類密碼子使用、針對增加的GC含量或其組合而被最佳化。
參考第2C圖中所示的序列，使用諾羅病毒GI.1序列（SEQ ID NO：1）作為參考序列，其他諾羅病毒VP1序列可以與其比對。VP1蛋白的「GII」家族的VP1胺基酸序列包括相對於GI.1序列的4個胺基酸缺失，包括位置14-16的3個胺基酸缺失以及位置26的1個胺基酸缺失。因此，GII VP1序列與GI VP1序列之間的比對在胺基酸13後偏移3個胺基酸、在位置26後偏移4個胺基酸。例如，GI.1的胺基酸84與GII.4的胺基酸80比對（參見第2C圖）。因此，提及位置84（GI.1）以及位置80（GII.4）的取代、修飾或突變是指相同的比對胺基酸：品系 胺基酸比對 .
GI： 39-46 43 57 84 94
GII： 35-42 39 53 80 90
本文還提供了在植物中增加包括經修飾的諾羅病毒VP1蛋白的VLP產生的方法。例如，方法可以包含將編碼如本文所述的諾羅病毒VP1突變蛋白的核酸引入植物、植物的部分或植物細胞中。可以在植物、植物的部分或植物細胞中表現一種或多於一種諾羅病毒突變蛋白，以產生包括一種或多於一種經修飾的諾羅病毒蛋白的VLP。或者，該方法可包括提供植物、植物的部分或植物細胞，該植物、植物的部分或植物細胞包括編碼如本文所述的經修飾的諾羅病毒VP1蛋白的核酸；以及表現編碼該經修飾的諾羅病毒VP1蛋白的核酸以產生包括一種或多於一種經修飾的諾羅病毒蛋白的VLP。
產生包括VP1突變蛋白的VLP的方法還可以包括在植物、植物的部分或植物細胞中共同表現編碼VP2蛋白的核酸序列的步驟。
如本文使用的用語「 單一構築體（single construct）」或「多個單一構築體（single constructs）」是指包括單一核酸序列的核酸載體。 如本文使用的用語「雙重構築體（dual construct）」或「多個雙重構築體（dual constructs）」是指包括兩種核酸序列的核酸載體。
共同表現是指在植物、植物的部分或植物細胞內引入以及表現兩種或更多種核苷酸序列，兩種或更多種核苷酸序列中的每一種核苷酸序列編碼所關注的蛋白質、或所關注的蛋白質的片段。可以在一個載體內將兩個或多個核苷酸序列引入植物、植物的部分或植物細胞中，使得該兩個或多個核苷酸序列中的每一個核苷酸序列在單獨的調控區（例如包括雙重構築體）的控制下。或者，可以在分開的載體（例如包括多個單一構築體）內將兩種或多種核苷酸序列引入植物、植物的部分或植物細胞中，並且每一個載體包括用於表現對應核酸的適當調控區。例如，在真空浸潤之前，可以藉由將各農桿菌（A. tumefaciens
）宿主的懸浮液以所需體積（例如，等體積、或可以改變各農桿菌宿主的比例）混合以共同表現兩個核苷酸序列，每一核苷酸序列在單獨的載體上並被引入分開的農桿菌宿主中。以這種方式，多種農桿菌懸浮液的共浸潤允許多種轉基因的共同表現。
包括編碼如本文所述的諾羅病毒VP1突變蛋白的核酸可以進一步包括增強諾羅病毒VP1突變蛋白在植物、植物的部分或植物細胞中的表現的序列。增強表現的序列可包括與編碼該諾羅病毒VP1突變蛋白的核酸操作關聯的植物衍生的表現增強子、或CPMV增強子元件。編碼該VP1突變蛋白的序列也可以針對人類密碼子使用、增加的GC含量、或其組合而被最佳化。此外，編碼VP2的核酸可以與編碼該VP1突變蛋白的序列共表現。編碼VP2的核酸的共表現可以導致包括一種或多於一種類型的VP1突變蛋白的VLP的產量增加、密度增加、完整性增加、或其組合。
如本文使用的用語「CPMV增強子元件」是指編碼調控豇豆嵌紋病毒（CPMV）RNA2多肽、或本領域已知的經修飾的CPMV序列的5'UTR的核苷酸序列。例如，CPMV增強子元件或CPMV表現增強子包括如於下列中描述的核苷酸序列：WO2015/14367；WO2015/103704；WO2007/135480；WO2009/087391；Sainsbury F.以及Lomonossoff G.P.（2008，Plant Physiol. 148：pp. 1212-1218），其每一者被併入本文作為參考。CPMV增強子序列可以增強其所附著的下游異源開讀框（ORF）的表現。CPMV表現增強子可包括CPMV HT、CPMVX（其中X=160、155、150、114），例如CPMV 160、CPMVX+（其中X=160、155、150、114），例如CPMV 160+、CPMV-HT+、CPMV HT+[WT115]、或CPMV HT+ [511]（WO2015/143567；WO2015/103704，其藉由引用併入本文）。CPMV表現增強子可以被用在植物表現系統中，該植物表現系統包括與所關注的核苷酸序列以及CPMV表現增強子序列操作性地連接的調節區。用語「5’UTR」或「5’非轉譯區」或「5’前導序列」是指未被轉譯的mRNA區域。5’UTR通常在轉錄起始位點開始、並就在編碼區的轉譯起始位點或起始密碼子之前結束。5’UTR可以調節mRNA轉錄本的穩定性及/或轉譯。
如本文中使用的用語「植物衍生的表現增強子」是指從植物獲得的核苷酸序列，該核苷酸序列編碼5'UTR。植物衍生的表現增強子的範例描述於美國臨時專利申請案No. 62/643,053（2018年3月14日申請；其藉由引用併入本文）或於Diamos A.G.等人（2016，Front Plt Sci. 7：1-15；其藉由引用併入本文）中。植物衍生的表現增強子可以從如在US 62/643,053中描述的nbMT78、nbATL75、nbDJ46、nbCHP79、nbEN42、atHSP69、atGRP62、atPK65、atRP46、nb30S72、nbGT61、nbPV55、nbPPI43、nbPM64（SEQ ID NO：14）、以及nbH2A86中選出）。植物衍生的表現增強子可以在植物表現系統中使用，該植物表現系統包括與植物衍生的表現增強子序列以及所關注的核苷酸序列操作性地連接的調控區。
術語「5’UTR」或「5’非轉譯區」或「5’前導序列」是指未轉譯的mRNA區域。5’UTR通常在轉錄起始位點開始、並就在編碼區的轉譯起始位點或起始密碼子之前結束。5’UTR可以調節mRNA轉錄本的穩定性及/或轉譯。
「操作性地連接」是指特定序列直接或間接相互作用以實行預期的功能，例如核酸序列的表現的介導或調節。操作性地連接的序列的相互作用可以例如由與操作性地連接的序列相互作用的蛋白質介導。
當一種或多於一種類型的經修飾的諾羅病毒VP1蛋白在植物、植物的部分、或植物細胞中表現時，該一種或多於一種經修飾的VP1蛋白自動組裝至VLP。在合適的萃取以及純化條件下，可以收穫植物、或植物的部分以維持VLP的完整性，並且可以純化包括一種或多於一種類型的VP1突變體（經修飾的）蛋白的VLP。一種或多於一種VP1突變蛋白也可以與編碼VP2的核苷酸序列共同表現，使得VLP可以包括經修飾的VP1蛋白以及VP2蛋白兩者。本揭露內容還提供在植物、植物的部分或植物細胞內產生如本文所述的一種或多於一種類型的VP1突變蛋白、以及從該植物、該植物的部分或該植物細胞萃取及純化一種或多於一種類型的VP1突變蛋白以產生包括經修飾的（突變的）VP1蛋白的植物物質、植物萃取物或蛋白質萃取物。
還提供了包括如本文所述的諾羅病毒VP1突變蛋白的植物物質、植物萃取物或蛋白質萃取物。植物物質、植物萃取物或蛋白質萃取物可用於在受試者中誘導對諾羅病毒感染的免疫。或者，可以純化或部分純化VP1突變蛋白或包括VP1突變蛋白（以及可選的VP2）的VLP，並且純化或部分純化的製劑可以用於在受試者中誘導對諾羅病毒感染的免疫。
本揭露內容還提供了一種用於誘導免疫反應的包括有效劑量的一種或多於一種類型的經修飾的諾羅病毒VP1蛋白的組成物、或包括一種或多於一種經修飾的諾羅病毒VP1蛋白以及可選的VP2的VLP、以及藥學上可接受的載體、佐劑、賦形劑(vehicle)或賦形劑(excipient)。
本文還提供了在受試者中誘導對諾羅病毒感染的免疫性的方法，包括向受試者以口服、鼻內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、直腸或陰道內投予一種或多於一種類型的突變（經修飾的）諾羅病毒VP1蛋白、或包括一種或多於一種類型的諾羅病毒VP1突變蛋白的VLP。
如本文中所使用的術語「諾羅病毒」是指杯狀病毒（Caliciviridae
）科的諾羅病毒屬的無外套膜病毒品系，其特徵在於具有單股正義RNA。諾羅病毒基因體的長度為7,654個核苷酸。ORF1對被病毒3C樣蛋白酶（包括RNA依賴性RNA聚合酶）剪切為6種蛋白質的非結構性多蛋白進行編碼。ORF2以及ORF3分別編碼主要（VP1）殼體蛋白以及次要（VP2）殼體蛋白（見第1A圖）。
如本文中揭露的諾羅病毒品系包括任何已知的諾羅病毒品系、但也包括對已知隨著時間定期發展的已知諾羅病毒品系的修飾。例如，諾羅病毒品系可以包括（如由其胺基酸序列所描述的）、但不限於Hu/GI.1/United States/Norwalk/1968（GI.1；SEQ ID NO：1；第12A圖）、Hu/GI.2/Leuven/2003/BEL（GI.2；SEQ ID NO：4；第13A圖）、Hu/GI.3/S29/2008/Lilla Edet/Sweden（GI.3；SEQ ID NO：6；第14A圖）、Hu/GI.5/Siklos/Hun5407/2013/HUN（GI.5；SEQ ID NO：12；第15A圖）、Hu/GI.7/USA/2014/GA5043（GI.7；SEQ ID NO：101；第16A圖）、Hu/GII.1/Ascension 208/2010/USA（GII.1；SEQ ID NO：13；第16B圖）、Hu/GII.2/CGMH47/2011/TW（GII.2；SEQ ID NO：14；第17A圖）、Hu/GII.3/Jingzhou/2013402/CHN（GII.3；SEQ ID NO：15；第18A圖）、Hu/GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU（GII.4；SEQ ID NO：16；第19A圖）、US96/GII.4/Dresden174/1997/DE_AY741811（SEQ ID NO：27；第19C圖）、FH02/GII.4/armingtonHills/2002/US_AY502023（SEQ ID NO：28；第19D圖）、Hnt04：GII.4/Hunter-NSW504D/2004/AU_DQ078814（SEQ ID NO：29；第19E圖）、2006b：GII.4/Shellharbour-NSW696T/2006/AU_EF684915（SEQ ID NO：30；第19F圖）、NO09：GII.4/Orange-NSW001P/2008/AU_GQ845367（SEQ ID NO：31；第19G圖）、Hu/GII.5/AlbertaEI390/2013/CA（GII.5；SEQ ID No：17；第20圖）、Hu/GII.6/Ohio/490/2012/USA（GII.6；SEQ ID NO：20；第21A圖）、GII.7/Musa/2010/All73774（GII.7；SEQ ID NO：18；第22圖）、Hu/GII.12/HS206/2010/USA（GII.12；SEQ ID NO：19；第23A圖）、GII.13/VA173/2010/H9AWU4（GII.13；SEQ ID NO：22；第24A圖）、GII.14_Saga_2008_JPN_ADE28701 native VP1（GII.14；SEQ ID NO：32；第25圖）、Hu/GII.17/Kawasaki323/2014/JP（GII.17；SEQ ID NO：24；第26A圖）、以及Hu/GII.21/Salisbury150/2011/USA（GII.21；SEQ ID NO：26；第27圖）。眾所周知，諾羅病毒品系容易逐年發生變異。因此，諾羅病毒品系還包括對下列具有約30-100％或其間任何量的胺基酸序列一致性的品系：具有於上列出的、以及第2A圖以及第2B圖中列出的品系的任何上述諾羅病毒品系的VP1蛋白、VP2蛋白、或VP1蛋白及VP2蛋白兩者，條件是當將VP1蛋白投予受試者時VP1蛋白可以在植物中表現（即產生）、以及VP1蛋白在受試者中誘導對諾羅病毒的免疫。例如，諾羅病毒品系還包括對於上列出的、以及第2A圖以及第2B圖中列出的品系的任何上述諾羅病毒品系的VP1蛋白、VP2蛋白、或VP1蛋白及VP2蛋白兩者具有30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100%、或其間的任何量的胺基酸序列一致性（序列相似性；百分比一致性；百分比相似性），條件是當將VP1蛋白投予受試者時VP1蛋白可以在植物中表現、以及VP1蛋白在受試者中誘導對諾羅病毒的免疫。第2C圖中顯示出幾個諾羅病毒品系的VP1蛋白的S結構域之間的胺基酸序列一致性比較，其不被認為是限制性的。
當提及特定序列時，用語「百分比相似性」、「序列相似性」、「百分比一致性」、或「序列一致性」是例如如威斯康辛大學GCG軟體程式中所述、或者藉由手動比對以及目視檢查（例如參見，Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等人編輯，1995補充）而被使用。用於比較的序列比對方法是本領域熟知的。可以使用例如Smith & Waterman 的演算法（1981，Adv. Appl. Math. 2：482）、藉由Needleman & Wunsch的比對演算法（1970，J. Mol. Biol. 48：443）、藉由Pearson & Lipman的搜尋相似性方法（1988，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：2444）、藉由這些演算法的計算機化實施（例如：Wisconsin Genetics Software Package 中的GAP、BESTFIT、FASTA以及TFASTA，Genetics Computer Group（GCG），575 Science Dr., Madison, Wis.）來進行用於比較的最佳序列比對。
適於確定百分比序列一致性及序列相似性的演算法的實例是於Altschul等人（1977，Nuc. Acids Res. 25：3389-3402）以及Altschul等人（1990，J. Mol. Biol. 215：403-410）中分別描述的BLAST以及BLAST 2.0演算法。BLAST以及BLAST 2.0與本文所述參數一起使用以確定本發明的核酸以及蛋白質的百分比序列一致性。例如，BLASTN程式（用於核苷酸序列）可以使用字長（W）為11、期望值（E）為10、M = 5、N = -4以及兩股的比較作為預設值。對於胺基酸序列，BLASTP程式可以使用字長為3及期望值（E）為10、以及BLOSUM62評分矩陣（參見Henikoff & Henikoff，1989，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：10915）比對（B）為50、期望值（E）為10、M = 5、N = -4、以及兩股的比較作為預設值。用於執行BLAST分析的軟體可經由國家生物技術資訊中心公開獲得（參見URL：ncbi.nlm.nih.gov/）。
如本文使用的用語「VP1」是指諾羅病毒主要殼體蛋白或多肽，其包括與本文所述的一種或多種諾羅病毒品系的ORF2所編碼的蛋白或多肽類似的胺基酸序列。主要殼體蛋白摺疊成兩個主要結構域，即殼體（S）結構域以及突出（P）結構域（參見第1B圖）。當被摻入類病毒顆粒或VLP時，VP1蛋白形成二聚體（第1C圖）。VP1的N-端的第一部分包括S結構域，VP1多肽的其餘部分包括P結構域。例如，在GI.1中，N-端VP1蛋白的前225個胺基酸包括S結構域。當被摺疊時，VP1呈現如第1B圖所示的構形，包括球狀S結構域（帶狀結構的底部）以及P結構域（帶狀結構的頂部）。
如第1C圖所示，VP1蛋白經由P-結構域相互作用以進行二聚化。這些相互作用穩定了諾羅病毒殼體分子的自發組裝。
本文描述了在植物、植物的部分或植物細胞中產生諾羅病毒VP1蛋白以及經修飾的諾羅病毒VP1蛋白的方法，其涉及引入編碼諾羅病毒VP1蛋白或經修飾的VP1蛋白的重組多核苷酸、以及在允許諾羅病毒VP1蛋白或經修飾的諾羅病毒蛋白表現的條件下培養該植物、植物的部分或植物細胞。然而，還應理解，諾羅病毒VP1蛋白可以從包括VP1蛋白的諾羅病毒VLP獲得，如Ausar等人所述（Ausar S.F.，Foubert T.R，Hudson M.H.，Vedvick T.S.，Middaugh C.R.，2006，J. Biol. Chem. 281：19478-19488）。例如，包括諾羅病毒蛋白或經修飾的諾羅病毒蛋白的諾羅病毒VLP可在pH 8及以上、或在高於55℃的溫度下解離成其VP1蛋白成分，從而產生VP1蛋白。
本文使用的用語「類病毒顆粒（virus like particle）」、「VLP」、「類病毒顆粒（virus like particles）」、或「VLP（VLPs）」是指包括一種或多於一種類型的諾羅病毒VP1蛋白、一種或多於一種類型的VP1突變蛋白、或其組合、並自組裝成非複製的、無外套膜、缺乏諾羅病毒基因體所有部分的非感染性病毒殼體結構的諾羅病毒類病毒顆粒。例如，VLP可包括一種類型的如本文所述的經修飾的VP1蛋白，或者VLP可包括兩種或更多種本文所述的經修飾的不同VP1蛋白。此外，VLP可包括VP2蛋白。包括VP1蛋白、VP1 + VP2蛋白、經修飾的VP1蛋白、或經修飾的VP1蛋白+VP2蛋白的VLP的大小為約從15 nm至50 nm、或其間的任何量，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50 nm、或其間的任何量。例如，對於T=1二十面體對稱，VLP可以是約23 nm，或者對於T=3二十面體對稱，VLP可以是從約38至約40 nm。可以組合本發明的VLP以形成包括兩種或兩種以上不同VLP的組成物，各VLP包括一種類型的經修飾的VP1蛋白，或一種VLP包括與如本文所述的一種或多於一種經修飾的VP1蛋白組合的天然VP1。例如，如果組成物包括含有一種類型的VP1蛋白的VLP，則該組成物可以被認為是單價的；如果該組成物包括兩種VLP且各VLP包括不同VP1蛋白、或者一種VLP包括兩種不同的VP1蛋白，則該組成物可以被認為是二價的；如果該組成物包括三種VLP且各VLP包括不同VP1蛋白、或一種VLP包括三種不同VP1蛋白，則該組成物可以被認為是三價的；或者，如果該組成物包括四種VLP且各VLP包括不同VP1蛋白、或一種VLP包括四種不同VP1蛋白，則該組成物可以被認為是四價的。組成物還可包括含有超過四種不同VP1蛋白的VLP。
如第3B圖、第4B圖、第5C圖、第5E圖、第6C圖、第6E圖、第7C圖、第8B圖、第9B圖、第9C圖、第9D圖、第9G圖、第10B圖、第11C圖以及第11D圖的電子顯微照片所示，植物產生的VP1蛋白以及從幾種諾羅病毒品系得到的經修飾的VP1蛋白自組裝成VLP。
植物中的諾羅病毒VP1蛋白產生
VP1蛋白包括含有胺基酸序列的任何VP1蛋白，該胺基酸序列對來自諾羅病毒GI.1（SEQ ID NO：1；第12A圖）、GI.2（SEQ ID NO：4；第13A圖）、GI.3（SEQ ID NO：6；第14A圖）、GI.5（SEQ ID NO：12；第15A圖）、Hu/GI.7/USA/2014/GA5043（GI.7；SEQ ID NO：101；第16A圖）、GII.1（SEQ ID NO：13；第16B圖）、GII.2（SEQ ID NO：14；第17A圖）、GII.3（SEQ ID NO：15；第18A圖）、GII.4/Sydney（SEQ ID NO：16；第19A圖）、GII.4/Dresden（SEQ ID NO：27；第19C圖）、GII.4/armingtonHills（SEQ ID NO：28；第19D圖）、GII.4/Hunter（SEQ ID NO：29；第19E圖）、GII.4/Shellharbour（SEQ ID NO：30；第19F圖）、GII.4/Orange（SEQ ID NO：31；第19G圖）、GII.5（SEQ ID No：17；第20圖）、GII.6（SEQ ID NO：20；第21A圖）、GII. 7（SEQ ID NO：18；第22圖）、GII.12（SEQ ID NO：19；第23A圖）、GII.13（SEQ ID NO：22；第24A圖）、GII.14/Saga（SEQ ID NO：32；第25圖）、GII.17（SEQ ID NO：24；第26A圖）、GII.21（SEQ ID NO：26；第27圖）的VP1胺基酸序列具有從約30至約100％、從約40至約100％、從約50至約100％、從約60至約100％、從約70％至約100％、從約80至約100％、從約85至約100％、從約90至約100％、或從約95至約100％、從約98至約100％、或其間的任何量的序列一致性（也可稱為序列相似性），條件是在植物中表現出VP1蛋白，並且，在被投予受試者時，VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。
如本文中所述的VP1蛋白被修飾並且包括了在與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1，參見第2C圖）的位置43、57、84以及94序列比對的任何一個或多個胺基酸處的S域結構域取代、修飾或突變、或與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸39至46序列比對的胜肽片段的缺失、或其組合。編碼該經修飾的諾羅病毒VP1蛋白的核苷酸序列可以針對人類密碼子使用、增加的GC含量、或其組合而被最佳化。經修飾的VP1蛋白可以在植物、植物的部分、或植物細胞中表現。
如第2C圖所示，相對於高度變異的P結構域，諾羅病毒VP1 S結構域的一級胺基酸序列是非常保留的。例如，第2C圖中所示的諾羅病毒品系的VP1 S結構域序列具有對GI.1VP1的S結構域55.2-98.9％一致性的序列。例如，本文所述的核酸序列可以顯現出從約55％至約99％、或在其間的任何量的對GI.1 VP1的S結構域的序列一致性。例如，本文所述的核酸序列可以顯現出對GI.1 VP1的S結構域約55、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或其間的任何量的序列一致性。
如先前在美國臨時申請案62/475,660（2017年3月23日申請；其藉由引用併入本文）以及PCT/CA2018/050352（2018年3月23日申請，其藉由引用併入本文）中所示，野生型（也稱為天然的）諾羅病毒VP1蛋白可以在植物中產生，並且VLP包括所產生的VP1蛋白。用農桿菌真空浸潤葉子（來自圓葉煙草），該農桿菌包括編碼作為單一核酸構築體的GI.1 VP1、作為單一核酸構築體的GI.1 VP2、具有被引入單獨載體（「VP1+VP2」；雙重構築體）或被引入同一載體（「VP1+VP2」或「VP1/VP2/3’UTR」；單一核酸構築體）的VP1及VP2核酸序列的GI.1 VP1及VP2的表現載體，以允許VP1及/或VP2序列的共表現以及針對VP1及VP2產生調查葉子。在浸潤後6或9天（分別為6 DPI以及9 DPI），從葉勻漿製備總粗蛋白萃取物、藉由SDS-PAGE分離、並用考馬斯亮藍染料染色。用包括對應於編碼VP1蛋白的野生型GI.1 ORF2的核苷酸序列的表現載體浸潤的葉子，產生使用考馬斯染色凝膠所測定低的或不可檢測位準的GI.1 VP1。相反的，在考馬斯染色凝膠中，用含有針對人類表現（hCod）而被密碼子最佳化、或與野生型VP1核酸序列的GC含量相較時針對GC含量是富集的GI.1 VP1核苷酸序列的表現載體浸潤的葉子產生了增加的GI.1 VP1蛋白量。證明當VP1自身表現時，可以在植物中產生hCod GI.1 VP1。
此外，如美國臨時申請案62/475,660以及PCT/CA2018/050352（分別於2017年3月23日；以及2018年3月23日申請，兩者藉由引用併入本文）中所述，在考馬斯染色的凝膠中，用包括野生型GI.1 VP1及VP2、或人類密碼子最佳化的GI.1 VP1及VP2的載體浸潤的葉子產生低位準的GI.1 VP1蛋白，這表明了，使用與病毒基因體中發現的相同組織（使用一種啟動子控制表現），在相同載體上順式共表現時，VP2的存在不會增強VP1的表現。然而，當VP1或人類密碼子最佳化的VP1在反式（在單獨的構築體上）分別與VP2或hCod VP2（hCod VP1+VP2）一起共表現時，觀察到VP1蛋白的增加。VP1以及VP2核酸片段中的每一個包括調控區以及終止子，並且將構築體引入植物中作為核酸複合物，這導致VP1蛋白產量的對應增加。
此觀察與在昆蟲以及哺乳動物細胞中觀察到的相反（Bertolotti-Ciarlet A.，Crawford S.E.，Hutson A.M.，Estes M.K. 2003，J. Virol. 77：11603-11615），其報導了：在VP1以及VP2（或VP1+VP2+3’UTR）以順式存在並且在一個啟動子以及終止子的控制下使用與病毒基因體中發現的組織相同的組織共表現時，僅觀察到VP1表現增加。當VP1以及VP2以反式共表現時，Bertolotti-Ciarlet（2003）在昆蟲或哺乳動物細胞中未觀察到VP1表現的增加。
如下文更詳細描述的，當如本文所述的經修飾的VP1蛋白在植物中表現時，較佳是編碼VP2的ORF3序列是從與用於獲得經修飾的VP1序列的諾羅病毒基因型及品系相同的諾羅病毒基因型及品系獲得。在本文提供的範例中，除非另有說明，經修飾的VP1蛋白以及VP2蛋白是從相同的諾羅病毒基因型以及品系獲得，以及使用例如在單獨的質體上的單獨的表現系統在植物中共表現編碼該經修飾的VP1蛋白以及該VP2蛋白的核苷酸序列，或VP1和VP2可以在相同的載體上表現，但編碼VP1以及VP2的各序列應該在單獨的啟動子以及終止子序列的控制下，使得其具有單獨的表現系統。
在植物中，萃取的諾羅病毒VP1蛋白的產量或量、以及包含諾羅病毒VP1蛋白的VLP的產生取決於表現的諾羅病毒VP1的基因型而不同。例如，如第3A圖所示，野生型GI.1 VP1、GI.5 VP1以及GII.12 VP1的表現是強健的，具有良好的蛋白質產量（使用SDS PAGE測定）。此外，還產生了高密度野生型GI.1VLP，其具有直徑主要為38nm的良好形成的殼體（第3B圖），並且從表現野生型GI.5 VLP、GII.12 VLP（第3C圖）以及GI.2 VLP（第4A圖）的植物產生高密度VLP。相反地，野生型GII.4 VP1在植物中表現差（第3A圖右圖），並且在其他野生型VP1蛋白（例如GII.2 VP1、GII.3 VP1以及GII.6 VP1）在植物中表現後觀察到VP1蛋白的低產量或不可檢測量的VP1蛋白（使用SDS-PAGE）（表5，範例3）。
此外，天然VP1蛋白在植物中的表現可導致特徵為包含更高比例的23 nm VLP而不是38 nm VLP的VLP。例如，野生型GI.3 VP1的表現導致產生大量23 nm VLP（參見第5C圖，左圖）。較大比例的23 nm VLP也導致VLP在密度梯度離心後具有較低密度的特徵（參見第5B圖左圖）。
本揭露內容提供了編碼經修飾的諾羅病毒VP1蛋白的核酸序列，其中經修飾的諾羅病毒VP1包括了：在從與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸43、57、84及94序列比對的胺基酸組成的群組中選出的胺基酸處的一個或多於一個取代、修飾或突變；或者與諾羅病毒基因型VP1 GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸39至46序列比對的胜肽片段的缺失；或其組合。表現編碼經修飾的諾羅病毒VP1蛋白、以及包括了在從與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸43、57、84及94序列比對的胺基酸組成的群組中選出的胺基酸處的一個或多於一個取代、修飾或突變；或者與諾羅病毒基因型VP1 GI.1的胺基酸39至46序列比對的胜肽片段的缺失；或其組合的核酸序列的植物，與不包含該一個或多於一個取代、修飾或突變的野生型VP1及/或VLP相較，表現出類似或改善的VP1及/或VLP特徵。
經修飾的VP1及/或VLP的改進特徵的範例包括，
- 與不包含該一個或多於一個取代、修飾或突變的野生型VP1相較，當在植物細胞中表現時，經修飾的VP1蛋白質產量增加（例如使用考馬斯染色的SDS-PAGE以及Western分析測定）。例如，經修飾的VP1蛋白增加的產量可以是對應的野生型VP1產量的1.5至50倍、或其間的任何量；
- 與不包含該一個或多於一個取代、修飾或突變的野生型VP1的密度梯度分離相較，包含經修飾的VP1蛋白的VLP的密度增加（例如使用蛋白質提取物的碘克沙醇密度梯度分離測定）。例如，可以在密度梯度離心後的相同或更密集的部分中觀察到包含經修飾的VP1蛋白的VLP；
- 與不包含該一個或多於一個取代、修飾或突變的野生型VP1相較，包含該經修飾的VP1蛋白的VLP的完整性被改善。例如，可以使用TEM測定被破壞的或部分組裝的VLP的數量；
- 與不包含該一個或多於一個取代、修飾或突變的相同基因型的野生型VLP產量等級相較，當在植物中表現時，VLP產量增加。可以使用TEM從包含密度梯度離心後的部分的VLP獲得的洗滌樣本中測定VLP產率。 例如，包含經修飾的VP1蛋白的VLP的增加的產量範圍可以是包含野生型VP1蛋白的VLP對應產量的增加的產量的1.5至20倍、或其間的任何量；
- 與包含相同基因型（不包括取代、修飾或突變）的野生型VP1的VLP的累積相較，包含經修飾的VP1蛋白的VLP的累積被改善；
- 與包含野生型VP1（不包括該一個或多於一個取代、修飾或突變）的VLP（使用TEM確定）相較，相對於23 nm VLP，組裝成38 nm VLP的VLP有更大比例；以及
- 這些改進特徵的組合。
不希望受理論束縛，與野生型諾羅病毒VLP相較，在密度梯度離心後的較高密度部分中觀察到的VLP表明了：與包含經修飾的VP1蛋白的VLP相較，包含天然VP1的VLP的組裝在植物中表現或從植物萃取時可能較不穩定。因此，天然VLP可能更容易受到畸形殼體顆粒以及碎裂產物的產生的影響。因此，包含經修飾的VP1蛋白的VLP（其特徵在於具有增加的密度）也可表現出比使用對應野生型VP1產生的VLP更大的結構完整性。
本文所述的核酸序列可以表現出與編碼VP1（如上文所述以及第2A圖至第2C圖中所列，不包括GI）的任何核酸序列約50％至約99％的序列一致性。例如，本文所述的核酸序列可以表現出與編碼諾羅病毒VP1的任何核酸序列的約50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或其間的任何量的序列一致性，諾羅病毒VP1例如來自：Hu/GI.2/Leuven/2003/BEL（GI.2；SEQ ID NO：4；第12A圖）、Hu/GI.3/S29/2008/Lilla Edet/Sweden（GI.3；SEQ ID NO：6；第14A圖）、Hu/GI.5/Siklos/Hun5407/2013/HUN（GI.5；SEQ ID NO：12；第15A圖）、Hu/GI.7/USA/2014/GA5043（GI.7；SEQ ID NO：101；第16A圖）、Hu/GII.1/Ascension 208/2010/USA（GII.1；SEQ ID NO：13；第16B圖）、Hu/GII.2/CGMH47/2011/TW（SEQ ID NO：14；第17A圖）、Hu/GII.3/Jingzhou/2013402/CHN（GII.3；SEQ ID NO：15；第18A圖）；Hu/GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU（GII.4；SEQ ID NO：16；第19A圖）、US96/GII.4/Dresden174/1997/DE_AY741811（SEQ ID NO：27；第19C圖）、FH02/GII.4/armingtonHills/2002/US_AY502023（SEQ ID NO：28；第19D圖）、Hnt04：GII.4/Hunter-NSW504D/2004/AU_DQ078814（SEQ ID NO：29；第19E圖）、2006b：GII.4/Shellharbour-NSW696T/2006/AU_EF684915（SEQ ID NO：30；第19F圖）、NO09：GII.4/Orange-NSW001P/2008/AU_GQ845367（SEQ ID NO：31；第19G圖）、Hu/GII.5/AlbertaEI390/2013/CA（GII.5；SEQ ID No：17；第20圖）、Hu/GII.6/Ohio/490/2012/USA（GII.6；SEQ ID NO：20；第21A圖）、G11.7/Musa/2010/All73774（GII7；SEQ ID NO：18；第22圖）、Hu/GII.12/HS206/2010/USA（GII.12；SEQ ID NO：19；第23A圖）、GII.13/VA173/2010/H9AWU4（SEQ ID NO：22；第24A圖）、GII.14_Saga_2008_JPN_ADE28701 native VP1（SEQ ID NO：32；第25圖）、Hu/GII.17/Kawasaki323/2014/JP（GII.17；SEQ ID NO：24；第26A圖）、Hu/GII.21/Salisbury150/2011/USA（GII.21；SEQ ID NO：26；第27圖），條件是：當向受試者投予VP1蛋白時，VP1蛋白誘導受試者對諾羅病毒的免疫。
類似地，本發明包括表現出與例如下列的任何VP1序列約30％至約99％或其間任何量的序列相似性的胺基酸序列：Hu/GI.2/Leuven/2003/BEL（GI.2；SEQ ID NO：4；第12A圖）、Hu/GI.3/S29/2008/Lilla Edet/Sweden（GI.3；SEQ ID NO：6；第14A圖）、Hu/GI.5/Siklos/Hun5407/2013/HUN（GI.5；SEQ ID NO：12；第15A圖）、Hu/GI.7/USA/2014/GA5043（GI.7；SEQ ID NO：101；第16A圖）、Hu/GII.1/Ascension 208/2010/USA（GII.1；SEQ ID NO：13；第16B圖）、Hu/GII.2/CGMH47/2011/TW（SEQ ID NO：14；第17A圖）、Hu/GII.3/Jingzhou/2013402/CHN（GII.3；SEQ ID NO：15；第18A圖）、Hu/GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU（GII.4；SEQ ID NO：16；第19A圖）、US96/GII.4/Dresden174/1997/DE_AY741811（SEQ ID NO：27；第19C圖）、FH02/GII.4/armingtonHills/2002/US_AY502023（SEQ ID NO：28；第19D圖）、Hnt04：GII.4/Hunter-NSW504D/2004/AU_DQ078814（SEQ ID NO：29；第19E圖）、2006b：GII.4/Shellharbour-NSW696T/2006/AU_EF684915（SEQ ID NO：30；第19F圖）、NO09：GII.4/Orange-NSW001P/2008/AU_GQ845367（SEQ ID NO：31；第19G圖）、Hu/GII.5/AlbertaEI390/2013/CA（GII.5；SEQ ID No：17；第20圖）、Hu/GII.6/Ohio/490/2012/USA（GII.6；SEQ ID NO：20；第21A圖）、G11.7/Musa/2010/All73774（GII7；SEQ ID NO：18；第22圖）、Hu/GII.12/HS206/2010/USA（GII.12；SEQ ID NO：19；第23A圖）、GII.13/VA173/2010/H9AWU4（SEQ ID NO：22；第24A圖）、GII.14_Saga_2008_JPN_ADE28701 native VP1（SEQ ID NO：32；第25圖）、Hu/GII.17/Kawasaki323/2014/JP（GII.17；SEQ ID NO：24；第26A圖）、Hu/GII.21/Salisbury150/2011/USA（GII.21；SEQ ID NO：26；第27圖），條件是：當VP1蛋白被投予至受試者時誘導對諾羅病毒的免疫。例如，本文所述的胺基酸序列可以具有與如上定義的任何VP1胺基酸序列從約30、32、34、36、38. 40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%、或其間的任何量的序列相似性，條件是：當VP1蛋白被投予至受試者時誘導對諾羅病毒的免疫。
「VP1突變蛋白」、「突變VP1蛋白」、「經修飾的VP1蛋白」、「經修飾的諾羅病毒VP1蛋白」等意指包括了在與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1，參見下表1）的胺基酸43、57、84以及94序列比對的位置或胺基酸處的一個或多於一個取代、突變或修飾；或與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸39至46序列比對的胜肽片段的缺失；或其組合的諾羅病毒VP1蛋白。用語「殘基」、「殘基胺基酸」以及「胺基酸」可互換使用、並且通常是指胺基酸序列內特定位置（position）（位置(loation)）處的胺基酸。表 1 ：諾羅病毒基因型（品系）、以及 GI 及 GII 品系的等效胺基酸位置的列表。 
如本文使用的用語「保留取代」或「保留取代」是指GII.4 VP1蛋白序列中存在的胺基酸殘基不同於該取代的胺基酸、但其屬於與該取代的同一類胺基酸。例如，非極性胺基酸可用於取代非極性胺基酸，芳族胺基酸取代芳香族胺基酸，極性不帶電荷的胺基酸取代極性不帶電荷的胺基酸，及/或帶電荷的胺基酸取代帶電荷的胺基酸。此外，保留取代可以包括具有相同符號並且通常具有與取代對應野生型胺基酸的胺基酸相似的量級的界面親水性值的胺基酸。
如本文使用的用語「非極性胺基酸」是指甘胺酸（G，Gly）、丙胺酸（A，Ala）、纈胺酸（V，Val）、白胺酸（L，Leu）、異白胺酸（I，Ile）、以及脯胺酸（P，Pro）；用語「芳族殘基」（或芳族胺基酸）是指苯丙胺酸（F，Phe）、酪胺酸（Y，Tyr）、以及色胺酸（W，Trp）；用語「極性不帶電荷的胺基酸」是指絲胺酸（S，Ser）、蘇胺酸（T，Thr）、半胱胺酸（C，Cys）、甲硫胺酸（M，Met）、天冬醯胺（N，Asn）以及麩醯胺酸（Q，Gln）；用語「帶電荷的胺基酸」是指帶負電荷的胺基酸（天冬胺酸（D，Asp）以及麩胺酸（E，Glu））、以及帶正電荷的胺基酸（離胺酸（K，Lys）、精胺酸（R，Arg）、以及組胺酸（H，His））。胺基酸的其他分類可以如下：具有疏水側鏈（脂肪族）的胺基酸：丙胺酸（A，Ala）、異白胺酸（I，Ile）、白胺酸（L，Leu）、甲硫胺酸（M，Met）以及纈胺酸（V，Val）；具有疏水側鏈（芳香族）的胺基酸：苯丙胺酸（F，Phe）、色胺酸（W，Trp）、酪胺酸（Y，Tyr）；具有極性中性側鏈的胺基酸：天冬醯胺（N，Asn）、半胱胺酸（C，Cys）、麩醯胺酸（Q，Gln）、絲胺酸（S，Ser）以及蘇胺酸（T，Thr）；具有帶電側鏈的胺基酸（酸性）：天冬胺酸（D，Asp）、麩胺酸（E，Glu）；有帶電側鏈的胺基酸（鹼性）：精胺酸（R，Arg）；組胺酸（H，His）；離胺酸（K，Lys）、甘胺酸 G，Gly）以及脯胺酸（P，Pro）。
保留胺基酸取代可能對所得的經修飾的GII.4 VP1蛋白的活性具有與原始取代或修飾類似的作用。關於保留取代的進一步資訊可以在例如下列中找到：Ben Bassat等人（J. Bacteriol，169：751-757，1987）、O'Regan等人（Gene，77：237-251，1989）、Sahin-Toth等人（Protein ScL，3：240-247，1994）、Hochuli等人（Bio/Technology，6：1321-1325，1988）。
Blosum基質通常用於確定多肽序列的相關性（Henikoff等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，89：10915-10919，1992）。對於BLOSUM90基質的高度保留的目標頻率，使用90％一致性的臨界值。對於BLOSUM65基質，使用65％一致性的臨界值。Blosum基質中零以及以上的分數在所選擇的百分比一致性上被認為是「保留取代」。 下表顯示了保留胺基酸取代的範例：表2。表 2. 範例性保留胺基酸取代。 
對於本文所述的修飾，可以使用如表2中概述的超高度保留取代、高度保留取代或保留取代、以及如上所述的芳香族、極性、極性不帶電荷、極性中性或非極性、帶負電荷的、帶正電荷的疏水胺基酸來取代胺基酸。
如本文所述，包括了在胺基酸43、57、84以及94（在GI品系中，相當於GII品系中的胺基酸39、53、80以及90）處的胺基酸的一個或多於一個取代的經修飾的VP1蛋白導致經修飾的VP1蛋白或使用該經修飾的VP1蛋白產生的VLP的改善的特徵。應當理解，改進的特徵不限於在特定位點取代特定胺基酸，如本領域中具有通常知識者理解的，具有類似性質的胺基酸可以取代所辨識位置的胺基酸。例如，Q84S修飾包括用絲胺酸（特徵為具有極性中性側鏈的胺基酸）取代位置84處的麩醯胺酸。此位置處的麩醯胺酸也可以用特徵為具有極性中性側鏈的替代胺基酸取代，例如天冬醯胺、半胱胺酸、或蘇胺酸，亦即Q84X，其中X=S、N、C或T。類似地，除了用絲胺酸取代天然胺基酸外，E80S包括用絲胺酸或P80S（脯胺酸至絲胺酸取代）取代位置80的麩醯胺酸，該位置的胺基酸也可以被具有極性中性側鏈的胺基酸（例如天冬醯胺、半胱胺酸、或蘇胺酸，即P80X，其中X=S、N、C或T）取代。此外，如本文所述，可以使用另外的P80X變異體來產生VP1，其中X選自S、A、N、K或H。在包括用白胺酸（一種特徵為具有疏水側鏈的胺基酸）取代絲胺酸或丙胺酸的S94L、S90L、A94L或A90L修飾中，可以使用特徵在於具有疏水側鏈的胺基酸取代天然胺基酸，具有疏水側鏈的胺基酸例如是異白胺酸、甲硫胺酸、纈胺酸、或者（在S94X或S90X的情況下）是丙胺酸，即S94X（S90X），其中X = L、I、M、V或A，或A94X（A90X），其中X = L、I、M或V。此外，如本文所述，可以使用另外的S94X變異體來產生VP1，其中X選自V、I、M、T、E、D、N、Q、K或H。A39V修飾包括以纈胺酸（特徵為具有疏水側鏈的胺基酸）取代位置39處的丙胺酸，除了纈胺酸之外，天然胺基酸也可以用特徵為具有疏水側鏈的胺基酸（例如異白胺酸、白胺酸或甲硫胺酸）取代，即A39X，其中X = V、I、L或M。此外，如本文所述，可以使用另外的A39X變異體來產生VP1，其中X選自I、M、G、S、E、D、N、Q、K、或H。包括以脯胺酸取代纈胺酸的V47P修飾還可以包括以甘胺酸取代纈胺酸，即V47X，其中X=P或G。包括在位置53用異白胺酸（特徵為具有疏水性側鏈的胺基酸）取代精胺酸的R53I修飾，除了異白胺酸之外，精胺酸也可以被特徵為具有疏水側鏈的胺基酸（例如白胺酸、纈胺酸、丙胺酸或甲硫胺酸）取代，即R53X，其中X=I、L、V、A或M。包括在位置57處用異白氨酸（特徵為具有疏水側鏈的胺基酸）取代甲硫胺酸的M57I修飾，除了異白胺酸之外，甲硫胺酸也可以用特徵為具有疏水側鏈的胺基酸（例如白胺酸、纈胺酸、或丙胺酸）取代，即M57X，其中X=I、L、V或A。此外，如本文所述，可以使用另外的M57X變異體來產生VP1，其中X選自L、G、S、T、N、Q、K、或H。
VP1突變蛋白（經修飾的VP1蛋白）的範例包括但不限於以下。
- GI.3_Q84S VP1（GI.3_ Q84X，其中X=S、N、C或T VP1）：其中與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸84對應的麩醯胺酸已經突變為例如絲胺酸（GI.3_Q84S；SEQ ID NO：98，第28A圖）、或表現出與GI.3_Q84S VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GI.3 VP1蛋白可具有與GI.3_Q84S VP1蛋白（SEQ ID NO：98，第28A圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸84對應的位置處的取代、修飾或突變維持S、N、C 或T，例如絲胺酸，以及條件是：當被投予受試者時，GI.3 Q84X VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GI.3 VP1的序列可以從任何GI.3品系獲得，例如但不限於GI.3/S29/2008/Lilla Edet/Sweden（SEQ ID NO：6，胺基酸；SEQ ID NO：7，核苷酸；第14A圖、第14B圖）。
- GI.3_S94X VP1，其中X=L、I、A、V、M、T、E、D、N、Q、K、或H，其中與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸94對應的絲胺酸已經突變為例如白胺酸（GI.3_S94L；SEQ ID NO：8，第28C圖）、纈胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、蘇胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、離胺酸、或組胺酸（GI.3_S94X，其中X=V、I、M、T、E、D、N、Q、K、或H；SEQ ID NO：292，第28M圖）、或表現出與GI.3_S94X VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列，其中X=L、V、I、M、T、E、D、N、Q、K、或H。例如，GI.3 VP1蛋白可具有與GI.3_S94X VP1蛋白的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98 、99、100％、或其間的任何量的序列相似性，其中X=L、V、I、M、T、E、D、N、Q、K、或H VP1蛋白（SEQ ID NO：8，第28C圖，SEQ ID NO：292；第28M圖），條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸94對應的位置處的取代、修飾或突變維持L、V、I、M、T、E、D、N、Q、K或H，例如白胺酸、纈胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、蘇胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、離胺酸或組胺酸，以及條件是：當被投予受試者時，GI.3 S94X VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GI.3 VP1的序列可以從任何GI.3品系獲得，例如但不限於GI.3/S29/2008/Lilla Edet/Sweden（SEQ ID NO：6，胺基酸；SEQ ID NO：7，核苷酸；第14A圖、第14B圖）。
- GI.3_ A43X+S94x
VP1，其中X= V、L、I或M、以及x
= L、I、A、V、M、T、E、D、N、Q、K、或H，其中分別與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸43及94對應的丙胺酸以及絲胺酸已經分別被取代或突變為例如但不限於纈胺酸以及白胺酸（GI.3_A43V+S94L；SEQ ID NO：170，第28G圖）、或表現出與GI.3_ A43V+S94L VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GI.3 VP1蛋白可具有與GI.3_A43V+S94L VP1蛋白的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%、或其間的任何量的序列相似性（SEQ ID NO：170，第28G圖），條件分別是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸43及94對應的位置處的取代、修飾或突變維持V、L、I或M（例如纈胺酸）、以及L、I、A、V、M、T、E、D、N、Q、K、或H（例如白胺酸），以及條件是：當被投予受試者時，GI.3_A43X +S94x
VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GI.3 VP1的序列可以從任何GI.3品系獲得，例如但不限於GI.3/S29/2008/Lilla Edet/Sweden（SEQ ID NO：6，胺基酸；SEQ ID NO：7，核苷酸；第14A圖、第14B圖）。
- GI.3_ M57X+S94x
VP1，其中X= I、V、A、L、G、S、T、N、Q、K、或H以及x
= L、I、A、V、M、T、E、D、N、Q、K，其中分別與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸57及94對應的甲硫胺酸以及絲胺酸已經分別突變為例如異白胺酸以及白胺酸（GI.3_M57I+S94L；SEQ ID NO：172，第28I圖）、或表現出與GI.3_M57I+S94L VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GI.3 VP1蛋白可具有與GI.3_M57I+S94L VP1蛋白（SEQ ID NO：172，第28I圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸57及94對應的位置處的取代、修飾或突變分別維持I、V、A、L、G、S、T、N、Q、K、或H（例如異白胺酸）、以及L、I、A、V、M、T、E、D、N、Q、K（例如白胺酸），以及條件是：當被投予受試者時，GI.3_M57X+S94x
VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GI.3 VP1的序列可以從任何GI.3品系獲得，例如但不限於GI.3/S29/2008/Lilla Edet/Sweden（SEQ ID NO：6，胺基酸；SEQ ID NO：7，核苷酸；第14A圖、第14B圖）。
- GI.3_Q84X+S94x
，VP1，其中X=S、N、C或T，以及x
= L、I、A、V、M、T、E、D、N、Q、K、或H，其中分別與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸84及94對應的麩醯胺酸以及絲胺酸已經分別突變為例如絲胺酸以及白胺酸（GI.3_Q84S+S94L；SEQ ID NO：10，第28E圖）、或表現出與GI.3_ Q84S+S94L VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GI.3 VP1蛋白可具有與GI.3_ Q84S+S94L VP1蛋白（SEQ ID NO：10，第28E圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸84及94對應的位置處的取代、修飾或突變分別維持S、N、C或T（例如絲胺酸）、以及L、I、A、V、M、T、E、D、N、Q、K、或H（例如白胺酸），以及條件是：當被投予受試者時，GI.3_Q84X+S94x
VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GI.3 VP1的序列可以從任何GI.3品系獲得，例如但不限於GI.3/S29/2008/Lilla Edet/Sweden（SEQ ID NO：6，胺基酸；SEQ ID NO：7，核苷酸；第14A圖、第14B圖）。
- GI.3_ A43X+M57z
+S94x
VP1，其中X= V、L、I或M，z
= I、V、A、L、G、S、T、N、Q、K、或H，以及x
= L、I、A、V、M、T、E、D、N、Q、K、或H，其中分別與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸43、57及94對應的丙胺酸、甲硫胺酸以及絲胺酸已經分別突變為例如纈胺酸、異白胺酸以及白胺酸（GI.3_A43V+M57I+S94L；SEQ ID NO：174，第28K圖）、或表現出與GI.3_ A43V+M57I+S94L VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GI.3 VP1蛋白可具有與GI.3_A43V+M57I+S94L VP1蛋白（SEQ ID NO：174，第28K圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98 、99、100％、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸43、57及94對應的位置處的取代、修飾或突變分別維持V、L、I或M（例如纈胺酸）、I、V、A、L、G、S、T、N、Q、K、或H（例如異白胺酸）、以及L、I、A、V、M、T、E、D、N、Q、K、或H（例如白胺酸），以及條件是：當被投予受試者時，GI.3_A43X+M57z
+S94x
VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GI.3 VP1的序列可以從任何GI.3品系獲得，例如但不限於GI.3/S29/2008/Lilla Edet/Sweden（SEQ ID NO：6，胺基酸；SEQ ID NO：7，核苷酸；第14A圖、第14B圖）。
- GI.5_Q84S VP1（GI.5_ Q84X，其中X=S、N、C或T、VP1）：其中與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸84對應的麩醯胺酸已經突變為例如絲胺酸（GI.5_Q84S；SEQ ID NO：34，第29A圖）、或表現出與GI.5_Q84S VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GI.5 VP1蛋白可具有與GI.5_Q84S VP1蛋白（SEQ ID NO：34，第29A圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98 、99、100％、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸84對應的位置處的取代、修飾或突變維持S、N、C或T，例如絲胺酸，以及條件是：當被投予受試者時，VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GI.5 VP1的序列可以從任何GI.5品系獲得，例如但不限於GI.5/Siklos/HUN5407/2013/HUN（SEQ ID NO：12，胺基酸；第15A圖）。
- GI.5_A94L VP1（GI.5_ A94X，其中X=L、I、M或V、VP1）：其中與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸94對應的丙胺酸已經突變為例如白胺酸（GI.5_A94L；SEQ ID NO：36，第29C圖）、或表現出與GI.5_A94L VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GI.5 VP1蛋白可具有與GI.5_A94L VP1蛋白（SEQ ID NO：36，第29C圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98 、99、100％、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸94對應的位置處的取代、修飾或突變維持L、I、M或V，例如白胺酸，以及條件是：當被投予受試者時，VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GI.5 VP1的序列可以從任何GI.5品系獲得，例如但不限於GI.5/Siklos/HUN5407/2013/HUN（SEQ ID NO：12，胺基酸；第15A圖）。
- GI.5_Q84S+A94L VP1（GI.5_Q84X，其中X=S、N、C或T + A94X，其中X=L、I、M或V、VP1）：其中分別與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸84及94對應的麩醯胺酸以及丙胺酸已經分別突變為例如絲胺酸以及白胺酸（GI.5_Q84S+A94L；SEQ ID NO：38，第29E圖）、或表現出與GI.5_Q84S+A94L VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GI.5 VP1蛋白可具有與GI.5_Q84S+A94L VP1蛋白（SEQ ID NO：38，第29E圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98 、99、100％、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸84及94對應的位置處的取代、修飾或突變分別維持S、N、C或T（例如絲胺酸）、以及L、I、M或V（例如白胺酸），以及條件是：當被投予受試者時，VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GI.5 VP1的序列可以從任何GI.5品系獲得，例如但不限於GI.5/Siklos/HUN5407/2013/HUN（SEQ ID NO：12，胺基酸；第15A圖）。
- GI.7_M57X VP1，其中X=I、V、A、L、G、S、T、N、Q、K、或H，其中與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸57對應的甲硫胺酸已經突變為例如異白胺酸（GI.7_M57I；SEQ ID NO：179，第29I圖）、纈胺酸、丙胺酸、白胺酸、甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、離胺酸或組胺酸（GI.7_M57X VP1，其中X=I、V、A、L、G、S、T、N、Q、K、或H；SEQ ID NO：290；第29M圖）、或表現出與GI.7_M57X VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列，其中X=I、V、A、L、G、S、T、N、Q、K、或H。例如，GI.7 VP1蛋白可具有與GI.7_M57X VP1蛋白的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98 、99、100％、或其間的任何量的序列相似性，其中X=I、V、A、L、G、S、T、N、Q、K、或H；（SEQ ID NO：179，第29I圖；SEQ ID NO：290；第29M圖），條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸57對應的位置處的取代、修飾或突變維持I、V、A、L、G、S、T、N、Q、K、或H，例如異白胺酸、纈胺酸、丙胺酸、白胺酸、甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、離胺酸或組胺酸，以及條件是：當被投予受試者時，GI.7_M57X VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GI.7 VP1的序列可以從任何GI.7品系獲得，例如但不限於GI.7/GA5043/USA/2014（SEQ ID NO：101，胺基酸；第16A圖）。
- GI.7_R84S VP1（GI.7_R84X，其中X=S、N、C、或T、VP1）：其中與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸84對應的精胺酸已經突變為例如絲胺酸（GI.7_R84S；SEQ ID NO：177，第29G圖）、或表現出與GI.7_R84S VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GI.7 VP1蛋白可具有與GI.7_R84S VP1蛋白（SEQ ID NO：177，第29G圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98 、99、100％、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸84對應的位置處的取代、修飾或突變維持S、N、C或T，例如絲胺酸，以及條件是：當被投予受試者時，VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GI.7 VP1的序列可以從任何GI.7品系獲得，例如但不限於GI.7/GA5043/USA/2014（SEQ ID NO：101，胺基酸；第16A圖）。
- GI.7_M57X+R84x
VP1，其中X= L、I、A、V、M、T、E、D、N、Q、K、或H，以及x
=S、N、C、或T，其中分別與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸57及84對應的甲硫胺酸以及精胺酸已經分別突變為例如異白胺酸以及絲胺酸（GI.7_M57I+R84S；SEQ ID NO：181，第29K圖）、或表現出與GI.7_M57I+R84S VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GI.7 VP1蛋白可具有與GI.7_M57I+R84S VP1蛋白（SEQ ID NO：181，第29K圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98 、99、100％、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸57及84對應的位置處的取代、修飾或突變分別維持L、I、A、V、M、T、E、D、N、Q、K、或H（例如異白胺酸）、以及S、N、C或T（例如絲胺酸），以及條件是：當被投予受試者時，GI.7_M57X+R84x
VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GI.7 VP1的序列可以從任何GI.7品系獲得，例如但不限於GI.7/GA5043/USA/2014（SEQ ID NO：101，胺基酸；第16A圖）。
- GII.2_E80S VP1（GII.2_ E80X，其中X=S、N、C或T、VP1）：其中與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸84對應的麩胺酸已經突變為例如絲胺酸（GII.2_E80S；SEQ ID NO：85，第30A圖）、或表現出與GII.2_E80S VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GII.2 VP1蛋白可具有與GII.2_E80S VP1蛋白（SEQ ID NO：85，第30A圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸84對應的位置處的取代、修飾或突變維持S、N、C或T，例如絲胺酸，以及條件是：當被投予受試者時，VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GII.2 VP1的序列可以從任何GII.2品系獲得，例如但不限於Hu/GII.2/CGMH47/2011/TW（SEQ ID NO：14，胺基酸；第17A圖）。
- GII.2_A90L VP1（GII.2_A90X，其中X=L、I、M或V、VP1）：其中與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸94對應的丙胺酸已經突變為例如白胺酸（GII.2_A90L；SEQ ID NO：41，第30C圖）、或表現出與mut GII.2_A90L VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GII.2 VP1蛋白可具有與GII.2_A90L VP1蛋白（SEQ ID NO：41，第30C圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98 、99、100％、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸94對應的位置處的取代、修飾或突變維持L、I、M或V，例如白胺酸，以及條件是：當被投予受試者時，VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GII.2 VP1的序列可以從任何GII.2品系獲得，例如但不限於Hu/GII.2/CGMH47/2011/TW（SEQ ID NO：14，胺基酸；第17A圖）。
- GII.2_E80S+A90L VP1（GII.2_E80X，其中X=S、N、C或T + A90X，其中X=L、I、M或V、VP1）：其中分別與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸84及94對應的麩胺酸以及丙胺酸已經分別突變為例如絲胺酸以及白胺酸（GII.2_E80S+A90L；SEQ ID NO：43，第30E圖）、或表現出與mut GII.2_E80S+A90L VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GII.2 VP1蛋白可具有與GII.2_E80S+A90L VP1蛋白（SEQ ID NO：43，第30E圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸84及94對應的位置處的取代、修飾或突變分別維持S、N、C或T（例如絲胺酸）、以及L、I、M或V（例如白胺酸），以及條件是：當被投予受試者時，VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GII.2 VP1的序列可以從任何GII.2品系獲得，例如但不限於Hu/GII.2/CGMH47/2011/TW（SEQ ID NO：14，胺基酸；第17A圖）。
- GII.2_A39V+E80S+A90L VP1（GII.2_A39X，其中X=V、L、I或M + E80X，其中X=S、N、C或T + A90X，其中X=L、I、M或V、VP1）：其中分別與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸43、84及94對應的丙胺酸、麩胺酸以及丙胺酸已經分別突變為例如纈胺酸、絲胺酸以及白胺酸（GII.2_A39V+E80S+A90L；SEQ ID NO：182，第30G圖）、或表現出與GII.2_A39V+E80S+A90L VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GII.2 VP1蛋白可具有與GII.2_A39V+E80S+A90L VP1蛋白（SEQ ID NO：182，第30G圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸43、84及94對應的位置處的取代、修飾或突變分別維持V、I、L或M（例如纈胺酸）、S、N、C或T（例如絲胺酸）、以及L、I、M或V（例如白胺酸），以及條件是：當被投予受試者時，VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GII.2 VP1的序列可以從任何GII.2品系獲得，例如但不限於Hu/GII.2/CGMH47/2011/TW（SEQ ID NO：14，胺基酸；第17A圖）。
- GII.2 R53I+E80S+A90L VP1（GII.2_R53X，其中X=I、L、M、V或A + E80X，其中X=S、N、C或T + A90X，其中X=L、I、M或V、VP1）：其中X=L、I、M或V、VP1）：其中分別與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸57、84及94對應的精胺酸、麩胺酸以及丙胺酸已經分別突變為例如異白胺酸、絲胺酸以及白胺酸（GII.2_M53I+E80S+A90L；SEQ ID NO：184，第30I圖）、或表現出與GII.2_M53I+E80S+A90L VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GII.2 VP1蛋白可具有與GII.2_M53I+E80S+A90L VP1蛋白（SEQ ID NO：184，第30I圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸57、84及94對應的位置處的取代、修飾或突變分別維持I、L、M或A（例如異白胺酸）、S、N、C或T（例如絲胺酸）、以及L、I、M或V（例如白胺酸），以及條件是：當被投予受試者時，VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GII.2 VP1的序列可以從任何GII.2品系獲得，例如但不限於Hu/GII.2/CGMH47/2011/TW（SEQ ID NO：14，胺基酸；第17A圖）。
- GII.2 A39V+R53I+E80S+A90L VP1（GII.2_A39X，其中X=V、I、L或、M + R53X，其中X=I、L、M、A或V + E80X，其中X=S、N、C或T + A90X，其中X=L、I、M或V、VP1）：其中分別與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸43、57、84及94對應的麩胺酸以及丙胺酸已經分別突變為例如纈胺酸、異白胺酸、絲胺酸以及白胺酸（GII.2_ A39V+R53I+E80S+A90L；SEQ ID NO：186，第30K圖）、或表現出與GII.2_ A39V+R53I+E80S+A90L VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GII.2 VP1蛋白可具有與GII.2_A39V+R53I+E80S+ A90L VP1蛋白（SEQ ID NO：186，第30K圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸43、57、84及94對應的位置處的取代、修飾或突變分別維持V、I、L或M（例如纈胺酸）、I、L、M、A或V（例如異白胺酸）、S、N、C或T（例如絲胺酸）、以及L、I、M或V（例如白胺酸），以及條件是：當被投予受試者時，VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GII.2 VP1的序列可以從任何GII.2品系獲得，例如但不限於Hu/GII.2/CGMH47/2011/TW（SEQ ID NO：14，胺基酸；第17A圖）。
- GII.3_E80S VP1（GII.3_E80X，其中X=S、N、C或T、VP1）：其中X=S、N、C或T + A90X，其中X=L、I、M或V、VP1）：其中與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸84對應的麩胺酸已經突變為例如絲胺酸（GII.3_E80S；SEQ ID NO：46，第31A圖）、或表現出與mut GII.3_E80S VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GII.3 VP1蛋白可具有與GII.3_E80S VP1蛋白（SEQ ID NO：46，第31A圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸84對應的位置處的取代、修飾或突變維持S、N、C或T，例如絲胺酸，以及條件是：當被投予受試者時，VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GII.3 VP1的序列可以從任何GII.3品系獲得，例如但不限於GII.3/Jingzhou/2013402/CHN（SEQ ID NO：15，胺基酸；第18A圖）。
- GII.3_A90L VP1（GII.3_A90X，其中X=L、I、M或V、VP1）：其中與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸94對應的丙胺酸已經突變為例如白胺酸（GII.3_A90L；SEQ ID NO：48，第31C圖）、或表現出與GII.3_A90L VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GII.3 VP1蛋白可具有與GII.3_A90L VP1蛋白（SEQ ID NO：48，第31C圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸94對應的位置處的取代、修飾或突變維持L、I、M或V（例如白胺酸），以及條件是：當被投予受試者時，VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GII.3 VP1的序列可以從任何GII.3品系獲得，例如但不限於GII.3/Jingzhou/2013402/CHN（SEQ ID NO：15，胺基酸；第18A圖）。
- GII.3_E80S+A90L VP1（GII.3_E80X，其中X=S、N、C或T + A90X，其中X=L、I、M或V、VP1）：其中分別與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸84及94對應的麩胺酸以及丙胺酸已經分別突變為例如絲胺酸以及白胺酸（GII.3_E80S+A90L；SEQ ID NO：50，第31E圖）、或表現出與GII.3_ E80S+A90L VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GII.3 VP1蛋白可具有與GII.3_ E80S+A90L VP1蛋白（SEQ ID NO：50，第31E圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸84及94對應的位置處的取代、修飾或突變分別維持S、N、C或T （例如絲胺酸）、以及L、I、M或V（例如白胺酸），以及條件是：當被投予受試者時，VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GII.3 VP1的序列可以從任何GII.3品系獲得，例如但不限於GII.3/Jingzhou/2013402/CHN（SEQ ID NO：15，胺基酸；第18A圖）。
- GII.4_A39X VP1，其中X=V、I、L、M、G、S、E、D、N、Q、K、或H，其中與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸43對應的丙胺酸已經突變為例如纈胺酸（GII.4_A39V；SEQ ID NO：53，第32A圖）、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、甘胺酸、絲胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、離胺酸、組胺酸、或表現出與GII.4_A39X VP1的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列，其中X=V、I、L、M、G、S、E、D、N、Q、K、或H。例如，不被認為是限制性的，GII.4 VP1蛋白可具有與GII.4_A39V VP1蛋白（SEQ ID NO：53，第32A圖）的胺基酸序列從約0、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸43對應的位置處的取代、修飾或突變維持V、I、L、M、G、S、E、D、N、Q、K、或H ，例如纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、甘胺酸、絲胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、離胺酸、或組胺酸，以及條件是：當被投予受試者時，GII.4_A39X VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GII.4 VP1的序列可以從任何GII.4品系獲得，例如但不限於GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU（SEQ ID NO：16，胺基酸；SEQ ID NO：52，核苷酸；第19A圖以及第19B圖）。
- GII.4_V47P VP1（GII.4_V47X，其中X=P或G、VP1）：其中與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸51對應的纈胺酸已經突變為例如脯胺酸（GII.4_V47P；SEQ ID NO：55，第32C圖）、或表現出與GII.4_V47P VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GII.4 VP1蛋白可具有與GII.4_V47P VP1蛋白（SEQ ID NO：55，第32C圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸51對應的位置處的取代、修飾或突變維持P或G ，例如脯胺酸，以及條件是：當被投予受試者時，VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GII.4 VP1的序列可以從任何GII.4品系獲得，例如但不限於GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU（SEQ ID NO：16，胺基酸；SEQ ID NO：52，核苷酸；第19A圖以及第19B圖）。
- GII.4_R53I VP1（GII.4_R53I，其中X=I、L、V、A或M、VP1）：其中與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸57對應的精胺酸已經突變為例如異白胺酸（GII.4_R53I；SEQ ID NO：57，第32E圖）、或表現出與GII.4_R53I VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GII.4 VP1蛋白可具有與GII.4_R53I VP1蛋白（SEQ ID NO：57，第32E圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸57對應的位置處的取代、修飾或突變維持I、L、V、A或M，例如異白胺酸，以及條件是：當被投予受試者時，VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GII.4 VP1的序列可以從任何GII.4品系獲得，例如但不限於GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU（SEQ ID NO：16，胺基酸；SEQ ID NO：52，核苷酸；第19A圖以及第19B圖）。
- GII.4_P80X VP1，其中X=S、N、C、T、A、K、或H，其中與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸84對應的脯胺酸已經突變為例如絲胺酸（GII.4_P80S；SEQ ID NO：59，第32G圖）、天冬醯胺、半胱胺酸、蘇胺酸、丙胺酸、離胺酸、組胺酸、或表現出與GII.4_P80S VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GII.4 VP1蛋白可具有與GII.4_P80S VP1蛋白（SEQ ID NO：59，第32G圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸84對應的位置處的取代、修飾或突變維持S、N、C、T、A、K、或H，例如絲胺酸、天冬醯胺、半胱胺酸、蘇胺酸、丙胺酸、離胺酸、或組胺酸，以及條件是：當被投予受試者時，GII.4_P80X VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GII.4 VP1的序列可以從任何GII.4品系獲得，例如但不限於GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU（SEQ ID NO：16，胺基酸；SEQ ID NO：52，核苷酸；第19A圖以及第19B圖）。
- GII.4_S90L VP1（GII.4_S90X，其中X=L、I、M、A或V、VP1）：其中與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸94對應的絲胺酸已經突變為例如白胺酸（GII.4_S90L；SEQ ID NO：61，第32I圖）、或表現出與GII.4_S90L VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GII.4 VP1蛋白可具有與GII.4_S90L VP1蛋白（SEQ ID NO：61，第32I圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸94對應的位置處的取代、修飾或突變維持L、I、M、A或V，例如白胺酸，以及條件是：當被投予受試者時，VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GII.4 VP1的序列可以從任何GII.4品系獲得，例如但不限於GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU（SEQ ID NO：16，胺基酸；SEQ ID NO：52，核苷酸；第19A圖以及第19B圖）。
- GII.4_Δ35-42 VP1：其中與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的位置39-46對應的胺基酸已經缺失（GII.4_Δ35-42；SEQ ID NO：63，第32K圖）、或表現出與GII.4_ Δ35-42 VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GII.4 VP1蛋白可具有與GII.4_ Δ35-42 VP1蛋白（SEQ ID NO：63，第32K圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的位置39-46對應的胺基酸維持缺失，以及條件是：當被投予受試者時，VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GII.4 VP1的序列可以從任何GII.4品系獲得，例如但不限於GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU（SEQ ID NO：16，胺基酸；SEQ ID NO：52，核苷酸；第19A圖以及第19B圖）。
- GII.4_SSTAVATA VP1：與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的位置39-46對應的胺基酸已經突變為胜肽序列SSTAVATA（SEQ ID NO：168；GII.4_SSTAVATA；SEQ ID NO：65，第32M圖）、或表現出與mut GII.4_ SSTAVATA VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GII.4 VP1蛋白可具有與GII.4_ SSTAVATA VP1蛋白（SEQ ID NO：65，第32M圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸39-46對應的位置維持胜肽序列SSTAVATA，以及條件是：當被投予受試者時，VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GII.4 VP1的序列可以從任何GII.4品系獲得，例如但不限於GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU（SEQ ID NO：16，胺基酸；SEQ ID NO：52，核苷酸；第19A圖以及第19B圖）。
- GII.4_A39X+R53x
VP1，其中X=V、I、L、M、G、S、E、D、N、Q、K、或H，以及x
=I、L、M、A或V，其中分別與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸43及57對應的丙胺酸以及精胺酸已經分別突變為例如纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、甘胺酸、絲胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、離胺酸或組胺酸以及異白胺酸（例如，GII.4_A39V+R53I；SEQ ID NO：188，第32AA圖）、或表現出與GII.4_A39V+R53I VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GII.4 VP1蛋白可具有與GII.4_A39V+R53I VP1蛋白（SEQ ID NO：188，第32AA圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸43及57對應的位置處的取代、修飾或突變分別維持V、I、L、M、G、S、E、D、N、Q、K、或H（例如纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、甘胺酸、絲胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、離胺酸或組胺酸）、以及I、L、M、V或A（例如異白胺酸），以及條件是：當被投予受試者時，GII.4_A39X+R53x
VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GII.4 VP1的序列可以從任何GII.4品系獲得，例如但不限於GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU（SEQ ID NO：16，胺基酸；SEQ ID NO：52，核苷酸；第19A圖以及第19B圖）。
- GII.4_A39X+P80x
VP1，其中X= V、I、L、M、G、S、E、D、N、Q、K、或H，以及x
= S、N、C、T、A、K、或H、VP1）：其中分別與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸43及84對應的丙胺酸以及脯胺酸已經分別被取代或突變為例如、但不限於纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、甘胺酸、絲胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、離胺酸、或組胺酸、以及絲胺酸、天冬醯胺、半胱胺酸、蘇胺酸、丙胺酸、離胺酸、或組胺酸（例如，GII.4_A39V+P80S；SEQ ID NO：67，第32O圖）、或表現出與GII.4_A39X+P80x
VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GII.4 VP1蛋白可具有與GII.4_ A39V+P80S VP1蛋白（SEQ ID NO：67，第32O圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸43及84對應的位置處的取代、修飾或突變分別維持V、I、L、M、G、S、E、D、N、Q、K、或H（例如纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、甘胺酸、絲胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、離胺酸、或組胺酸）、以及S、N、C、T、A、K、或H（例如絲胺酸、天冬醯胺、半胱胺酸、蘇胺酸、丙胺酸、離胺酸、或組胺酸），以及條件是：當被投予受試者時，GII.4_A39X+P80x
VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GII.4 VP1的序列可以從任何GII.4品系獲得，例如但不限於GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU（SEQ ID NO：16，胺基酸；SEQ ID NO：52，核苷酸；第19A圖以及第19B圖）。
- GII.4_V47P+P80S VP1（GII.4_V47X，其中X=P或G + P80x
，其中x
= S、N、C、T、A、K、或H VP1）：其中分別與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸51及84對應的纈胺酸以及脯胺酸已經分別被取代或突變為例如脯胺酸以及絲胺酸、天冬醯胺、半胱胺酸、蘇胺酸、丙胺酸、離胺酸、或組胺酸（例如，GII.4_V47P+P80S；SEQ ID NO：69，第32Q圖）、或表現出與GII.4_V47P+P80S VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GII.4 VP1蛋白可具有與GII.4_V47P+P80S VP1蛋白（SEQ ID NO：69，第32Q圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸51及84對應的位置處的取代、修飾或突變分別維持P或G（例如脯胺酸）、以及S、N、C、T、A、K、或H（例如絲胺酸、天冬醯胺、半胱胺酸、蘇胺酸、丙胺酸、離胺酸、或組胺酸），以及條件是：當被投予受試者時，GII.4_V47X+P80x
VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GII.4 VP1的序列可以從任何GII.4品系獲得，例如但不限於GII.4/Sydney/NSW0514/2012/（SEQ ID NO：16，胺基酸；SEQ ID NO：52，核苷酸；第19A圖以及第19B圖）。
- GII.4_R53I+P80S VP1（GII.4_R53X，其中X=I、L、V、A或M + P80x
，其中x
= S、N、C、T、A、K、或H、VP1）：其中分別與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸57及84對應的精胺酸以及脯胺酸已經分別突變為例如異白胺酸以及絲胺酸、天冬醯胺、半胱胺酸、蘇胺酸、丙胺酸、離胺酸、或組胺酸（例如，GII.4_R53I+P80S；SEQ ID NO：71，第32S圖）、或表現出與GII.4_R53I+P80S VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GII.4 VP1蛋白可具有與GII.4_R53I+P80S VP1蛋白（SEQ ID NO：71，第32S圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸57及84對應的位置處的取代、修飾或突變分別維持I、L、V、A或M（例如異白胺酸）、以及S、N、C、T、A、K、或H（例如絲胺酸、天冬醯胺、半胱胺酸、蘇胺酸、丙胺酸、離胺酸、組胺酸），以及條件是：當被投予受試者時，GII.4_R53X+P80x
VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GII.4 VP1的序列可以從任何GII.4品系獲得，例如但不限於GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU（SEQ ID NO：16，胺基酸；SEQ ID NO：52，核苷酸；第19A圖以及第19B圖）。
- GII.4_P80S+S90L VP1（GII.4_P80X，其中X= S、N、C、T、A、K、或H + S90x
，其中x
=L、I、M、A或V、VP1）：其中分別與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸84及94對應的脯胺酸以及絲胺酸已經分別突變為例如絲胺酸、天冬醯胺、半胱胺酸、蘇胺酸、丙胺酸、離胺酸、或組胺酸、以及白胺酸（例如，GII.4_P80S+S90L；SEQ ID NO：73，第32U圖）、或表現出與GII.4_ P80S+S90L VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GII.4 VP1蛋白可具有與GII.4_ P80S+S90L VP1蛋白（SEQ ID NO：73，第32U圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸84及94對應的位置處的取代、修飾或突變分別維持S、N、C、T、A、K、或H（例如絲胺酸、天冬醯胺、半胱胺酸、蘇胺酸、丙胺酸、離胺酸、或組胺酸）、以及L、I、M、A或V（例如白胺酸），以及條件是：當被投予受試者時，GII.4_P80X+S90x
VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GII.4 VP1的序列可以從任何GII.4品系獲得，例如但不限於GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU（SEQ ID NO：16，胺基酸；SEQ ID NO：52，核苷酸；第19A圖以及第19B圖）。
- GII.4_A39X+R53x
+P80z
VP1，其中X=V、I、L、M、G、S、E、D、N、Q、K、或H，其中x
=I、L、M、A或V，以及z
= S、N、C、T、A、K、或H，其中分別與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸43、57及84對應的丙胺酸以及精胺酸分別在位置39處已經被取代或突變為例如纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、甘胺酸、絲胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、離胺酸、或組胺酸；在位置53處已經被取代或突變為異白胺酸；以及在位置80處已經被取代或突變為絲胺酸、天冬醯胺、半胱胺酸、蘇胺酸、丙胺酸、離胺酸、或組胺酸（例如，GII.4_A39V+R53I+P80S；SEQ ID NO：190，第32CC圖）、或表現出與GII.4_ A39V+R53I+P80S VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GII.4 VP1蛋白可具有與GII.4_ A39V+R53I+P80S VP1蛋白（SEQ ID NO：190，第32CC圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸43、57及84對應的位置處的取代、修飾或突變分別維持V、I、L、M、G、S、E、D、N、Q、K、或H（例如纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、甘胺酸、絲胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、離胺酸、或組胺酸）、I、L、M、V或A（例如異白胺酸）、以及S、N、C、T、A、K、或H（例如絲胺酸、天冬醯胺、半胱胺酸、蘇胺酸、丙胺酸、離胺酸、或組胺酸），以及條件是：當被投予受試者時，GII.4_A39X+R53x
+P80z
VP蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GII.4 VP1的序列可以從任何GII.4品系獲得，例如但不限於GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU（SEQ ID NO：16，胺基酸；SEQ ID NO：52，核苷酸；第19A圖以及第19B圖）。
- GII.4_P80S+Δ35-42 VP1（GII.4_P80X，其中X= S、N、C、T、A、K、或H，+ Δ35-42，VP1）：其中與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的位置84對應的脯胺酸已經突變為例如絲胺酸、天冬醯胺、半胱胺酸、蘇胺酸、丙胺酸、離胺酸、或組胺酸，以及與諾羅病毒VP1基因型GI.1的位置39-46對應的胺基酸已經缺失（GII.4_P80S+Δ35-42；SEQ ID NO：75，第32W圖）、或表現出與GII.4_P80S+Δ35-42 VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GII.4 VP1蛋白可具有與GII.4_P80S+Δ35-42 VP1蛋白（SEQ ID NO：75，第32W圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸84對應的位置處的取代、修飾或突變維持S、N、C、T、A、K、或H（例如絲胺酸、天冬醯胺、半胱胺酸、蘇胺酸、丙胺酸、離胺酸、或組胺酸）、以及與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸39-46對應的胺基酸維持缺失，以及條件是：當被投予受試者時，GII.4_P80X+Δ35-42 VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GII.4 VP1的序列可以從任何GII.4品系獲得，例如但不限於GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU（SEQ ID NO：16，胺基酸；SEQ ID NO：52，核苷酸；第19A圖以及第19B圖）。
- GII.4_P80S+SSTAVATA VP1（GII.4_P80X，其中X= S、N、C、T、A、K、或H + SSTAVATA、VP1）：其中與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的位置84對應的脯胺酸已經突變為例如絲胺酸、天冬醯胺、半胱胺酸、蘇胺酸、丙胺酸、離胺酸、或組胺酸，以及與諾羅病毒VP1基因型GI.1的位置39-46對應的胺基酸已經突變為胜肽序列SSTAVATA（SEQ ID NO：168；GII.4_P80S+SSTAVATA；SEQ ID NO：77，第32Y圖）、或表現出與mut GII.4_ P80S+SSTAVATA VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GII.4 VP1蛋白可具有與GII.4_ P80S+SSTAVATA VP1蛋白（SEQ ID NO：77，第32Y圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸84對應的位置處的取代、修飾或突變維持S、N、C、T、A、K、或H（例如絲胺酸、天冬醯胺、半胱胺酸、蘇胺酸、丙胺酸、離胺酸、或組胺酸）、以及與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸39-46對應的位置維持胜肽序列SSTAVATA，以及條件是：當被投予受試者時，GII.4_P80X+SSTAVATA VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GII.4 VP1的序列可以從任何GII.4品系獲得，例如但不限於GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU（SEQ ID NO：16，胺基酸；SEQ ID NO：52，核苷酸；第19A圖以及第19B圖）。
- GII.6_E80S VP1（GII.6_E80X，其中X=S、N、C或T、VP1）：其中與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸84對應的麩胺酸已經突變為例如絲胺酸（GII.6_E80S；SEQ ID NO：79，第33A圖）、或表現出與GII.6_E80S VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GII.6 VP1蛋白可具有與GII.6_E80S VP1蛋白（SEQ ID NO：79，第33A圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸84對應的位置處的取代、修飾或突變維持S、N、C或T，例如絲胺酸，以及條件是：當被投予受試者時，VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GII.6 VP1的序列可以從任何GII.6品系獲得，例如但不限於GII.6/Ohio/490/2012/USA（SEQ ID NO：20，胺基酸；SEQ ID NO：21，核苷酸；第21A圖以及第21B圖）。
- GII.6_S90L VP1（GII.6_S90X，其中X=L、I、M、A或V、VP1）：其中與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸94對應的絲胺酸已經突變為例如白胺酸（GII.6_S90L；SEQ ID NO：81，第33C圖）、或表現出與GII.6_S90L VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GII.6 VP1蛋白可具有與GII.6_S90L VP1蛋白（SEQ ID NO：81，第33C圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸94對應的位置處的取代、修飾或突變維持L、I、M或V，例如白胺酸，以及條件是：當被投予受試者時，VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GII.6 VP1的序列可以從任何GII.6品系獲得，例如但不限於GII.6/Ohio/490/2012/USA（SEQ ID NO：20，胺基酸；SEQ ID NO：21，核苷酸；第21A圖以及第21B圖）。
- GII.6_E80S+S90L VP1（GII.6_E80X，其中X=S、N、C或T + S90X，其中X=L、I、M、A或V、VP1）：其中分別與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸84及94對應的麩胺酸以及絲胺酸已經分別突變為例如絲胺酸以及白胺酸（GII.6_E80S+S90L；SEQ ID NO：83，第33E圖）、或表現出與GII.6_ E80S+S90L VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GII.6 VP1蛋白可具有與GII.6_ E80S+S90L VP1蛋白（SEQ ID NO：83，第33E圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸84及94對應的位置處的取代、修飾或突變分別維持S、N、C或T（例如絲胺酸）、以及L、I、M、A或V（例如白胺酸），以及條件是：當被投予受試者時，VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GII.6 VP1的序列可以從任何GII.6品系獲得，例如但不限於GII.6/Ohio/490/2012/USA（SEQ ID NO：20，胺基酸；SEQ ID NO：21，核苷酸；第21A圖以及第21B圖）。
- GII.12_E80S VP1（GII.12_E80X，其中X=S、N、C或T、VP1）：其中與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸84對應的麩胺酸已經突變為例如絲胺酸（GII.12_E80S；SEQ ID NO：88，第34A圖）、或表現出與GII.12_E80S VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GII.12 VP1蛋白可具有與GII.12_E80S VP1蛋白（SEQ ID NO：88，第34A圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸84對應的位置處的取代、修飾或突變維持S、N、C或T，例如絲胺酸，以及條件是：當被投予受試者時，VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GII.12 VP1的序列可以從任何GII.12品系獲得，例如但不限於GII.12/HS206/2010/USA（SEQ ID NO：19，胺基酸；第23A圖）。
- GII.12_A90L VP1（GII.12_A90X，其中X=L、I、M或V、VP1）：其中與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸94對應的丙胺酸已經突變為例如白胺酸（GII.12_A90L；SEQ ID NO：90，第34C圖）、或表現出與GII.12_A90L VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GII.12 VP1蛋白可具有與GII.12_A90L VP1蛋白（SEQ ID NO：90，第34C圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸94對應的位置處的取代、修飾或突變維持L、I、M或V，例如白胺酸，以及條件是：當被投予受試者時，VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GII.12 VP1的序列可以從任何GII.12品系獲得，例如但不限於GII.12/HS206/2010/USA（SEQ ID NO：19，胺基酸；第23A圖）。
- GII.12_E80S+A90L VP1（GII.12_E80X，其中X=S、N、C或T + A90X，其中X=L、I、M或V、VP1）：其中分別與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸84及94對應的麩胺酸以及丙胺酸已經分別突變為例如絲胺酸以及白胺酸（GII.12_E80S+A90L；SEQ ID NO：92，第34E圖）、或表現出與GII.12_ E80S+A90L VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GII.12 VP1蛋白可具有與GII.12_ E80S+A90L VP1蛋白（SEQ ID NO：92，第34E）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸84及94對應的位置處的取代、修飾或突變分別維持S、N、C或T（例如絲胺酸）、以及L、I、M或V（例如白胺酸），以及條件是：當被投予受試者時，VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GII.12 VP1的序列可以從任何GII.12品系獲得，例如但不限於GII.12/HS206/2010/USA（SEQ ID NO：19，胺基酸；第23A圖）。
- GII.17_A39V VP1（GII.17_A39X，其中X=V、I、L或M、VP1）：其中與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸43對應的丙胺酸已經突變為例如纈胺酸（GII.17_A39V；SEQ ID NO：192，第34G圖）、或表現出與GII.17_A39V VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GII.17 VP1蛋白可具有與GII.17_A39V VP1蛋白（SEQ ID NO：192，第34G圖）的胺基酸序列從約0、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸43對應的位置處的取代、修飾或突變維持V、I、L或M，例如纈胺酸，以及條件是：當被投予受試者時，VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GII.17 VP1的序列可以從任何GII.17品系獲得，例如但不限於Hu/GII.17/Kawasaki323/2014/JP（SEQ ID NO：24，胺基酸；SEQ ID NO：25，核苷酸；第26A圖及第26B圖）。
- GII.17 R53I VP1（GII.17_R53I，其中X=I、L、V、A或M、VP1）：其中與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸57對應的精胺酸已經突變為例如異白胺酸（GII.17_R53I；SEQ ID NO：194，第34I圖）、或表現出與GII.17_R53I VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GII.17 VP1蛋白可具有與GII.17_R53I VP1蛋白（SEQ ID NO：194，第34I圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸57對應的位置處的取代、修飾或突變維持I、L、V、A或M，例如異白胺酸，以及條件是：當被投予受試者時，VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GII.17 VP1的序列可以從任何GII.17品系獲得，例如但不限於Hu/GII.17/Kawasaki323/2014/JP（SEQ ID NO：24，胺基酸；SEQ ID NO：25，核苷酸；第26A圖及第26B圖）。
- GII.17_A90L VP1（GII.4_A90X，其中X=L、I、M或V、VP1）：其中與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸94對應的絲胺酸已經突變為例如白胺酸（GII.17_A90L；SEQ ID NO：196，第34K圖）、或表現出與GII.17_A90L VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GII.17 VP1蛋白可具有與GII.17_A90L VP1蛋白（SEQ ID NO：196，第34K圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸94對應的位置處的取代、修飾或突變維持L、I、M或V，例如白胺酸，以及條件是：當被投予受試者時，VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GII.17 VP1的序列可以從任何GII.17品系獲得，例如但不限於Hu/GII.17/Kawasaki323/2014/JP（SEQ ID NO：24，胺基酸；SEQ ID NO：25，核苷酸；第26A圖及第26B圖）。
- GII.17_A39V+R53I VP1（GII.17_A39X，其中X=V、I、L或M + R53X，其中X=I、L、M、A或V、VP1）：其中分別與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸43及57對應的丙胺酸以及精胺酸已經分別突變為例如纈胺酸以及異白胺酸（GII.17_A39V+R53I；SEQ ID NO：198，第34M圖）、或表現出與GII.17_A39V+R53I VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GII.17 VP1蛋白可具有與GII.17_A39V+R53I VP1蛋白（SEQ ID NO：198，第34M圖）的胺基酸序列從約0、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸43及57對應的位置處的取代、修飾或突變分別維持V、I、L或M（例如纈胺酸）、以及I、L、M、V或A（例如異白胺酸），以及條件是：當被投予受試者時，VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GII.17 VP1的序列可以從任何GII.17品系獲得，例如但不限於Hu/GII.17/Kawasaki323/2014/JP（SEQ ID NO：24，胺基酸；SEQ ID NO：25，核苷酸；第26A圖及第26B圖）。
- GII.17_E80S+A90L VP1（GII.4_E80X，其中X=S、N、C或T + A90X，其中X=L、I、M或V、VP1）：其中分別與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸84及94對應的麩胺酸以及丙胺酸已經分別突變為例如絲胺酸以及白胺酸（GII.17_E80S+A90L；SEQ ID NO：200，第34O圖）、或表現出與GII.17_ E80S+A90L VP1蛋白的胺基酸序列從約80-100％或其間任何量的序列相似性的序列。例如，GII.17 VP1蛋白可具有與GII.17_ E80S+A90L VP1蛋白（SEQ ID NO：200，第34O圖）的胺基酸序列從約80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%、或其間的任何量的序列相似性，條件是與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸84及94對應的位置處的取代、修飾或突變分別維持S、N、C或T（例如絲胺酸）、以及L、I、M或V（例如白胺酸），以及條件是：當被投予受試者時，VP1蛋白誘導對諾羅病毒的免疫。編碼GII.17 VP1的序列可以從任何GII.17品系獲得，例如但不限於Hu/GII.17/Kawasaki323/2014/JP（SEQ ID NO：24，胺基酸；SEQ ID NO：25，核苷酸；第26A圖及第26B圖）。VLP 產量
參考第5B圖（參見範例3），可以觀察到，與含有GI.3 VP1蛋白的VLP產量相較下改善的VP1特性的範例。在植物中，與野生型GI.3 VP1的產量相較，經修飾的諾羅病毒VP1蛋白GI.3_S94X（其中X = L、V、I、M、T、E、D、N、Q、K或H）（參見第5F圖）、GI.3_M57I+S94L（參見第5D圖）、以及GI.3_Q84S+S94L（參見第5B圖）的表現導致類似或更高的VLP產量。此外，與野生型GI.7 VP1的產量相較，在植物中，經修飾的諾羅病毒VP1蛋白GI.7_M57X（其中X = I、L、G、S、T、N、Q、K、或H）（參見第6F圖）的表現導致類似或更高的VLP產量。
參考第9A圖至第9E圖、以及第9H圖，顯示出增加的VLP產量的類似改善特性。與含有野生型GII.4 VP1的VLP相較，含有諾羅病毒經修飾的VP1蛋白GII.4_R53I（第9D圖）、GII.4_P80X，其中X=S、A、N、K、或H（第9B圖以及第9H圖）、GII.4_ P80S +R53I（第9D圖）、GII.4_ P80S +A39X，其中X=V、I、M、T、E、D、N、Q、K、或H（第9C圖以及第9I圖）、GII.4_P80S+S90L（第9B圖）、GII.4_P80S+Δ35-42（第9C圖）、GII.4_ P80S +SSTAVATA（第9F圖）、以及GII.4_A39V+R53I_P80S（第9G圖）的VLP在植物中表現出增強的VLP產量，而GII.4_A39V以及GII.4_V47P在蛋白質產量方面表現出輕微增加。
在表現GII.6_S90L VP1的植物萃取物中也觀察到與野生型相較下增加的VLP產量（第10A圖以及第10B圖）。
當與含有對應的野生型（天然）VP1蛋白的VLP的產量相較時，含有經修飾的VP1蛋白（帶有位置84（GI品系）或位置80（GII品系，對應於GI.1 VP1的位置84或與GI.1 VP1的位置84比對）處的胺基酸的取代）的VLP表現出相同的（GI.3_Q84S；GI.5_Q84S，亦參見第6B圖；GII.3_E80S，亦參見第8A圖）、或增加的（GI.7_R84S；GI.7_M57I+R84S；亦參見第6D圖；GII.4_P80S，亦參見第9B圖至第9F圖；GII.12_E80S）VLP產量。
對於所檢查的所有經修飾的VP1蛋白（GI.3_S94X，其中X=L、V、I、M、T、E、D、N、Q、K、或H（第5B圖以及第5F圖）；GI.5_A94L（參見第6B圖）；GII.2_A90L（參見第7B圖）；GII.4_S90L（參見第9B圖）；GII.6_S90L（參見第10A圖）；GII.12_A90L（參見第11B圖）；以及GII.17_A90L（參見第11D圖），當與含有對應的野生型、或天然VP1蛋白的VLP的產量相較時，含有經修飾的VP1蛋白（帶有位置94（GI品系）或位置90（GII品系，對應於GI.1 VP1的位置94或與GI.1 VP1的位置94比對）處的胺基酸的取代）的VLP表現出相同的VLP產量或增加的VLP產量。
類似地，對於所檢查的所有經修飾的VP1蛋白（GI.3_Q84S+S94L，亦參見第5B圖；GI.5_Q84S+A94L，亦參見第6B圖；GII.2_E80S+A90L，亦參見第7B圖以及第7C圖；GII.4_P80S+S90L，亦參見第9B圖；以及GII.12_E80S+A90L，亦參見第11B圖），當與含有對應的野生型、或天然VP1蛋白的VLP的產量相較時，含有經修飾的VP1蛋白（帶有位置84及94（GI品系）或位置80及90（GII品系，對應於GI.1 VP1的位置84及94或與GI.1 VP1的位置84及94比對）處的胺基酸的取代）的VLP表現出增加的VLP產量。
還觀察到另外的修飾以增加VLP產量。這些修飾包括GI.3_M57I+S94L（第5D圖）、GI.7_M57I（第6D圖）、GI.7_M57I+R84S（第6D圖）、GII.2_A39V+E80S+A90L（第7C圖）、GII.2_R53I+E80S+A90L（第7C圖）、GII.4_R53I（第9D圖）、GII.4_A39V +P80X，其中X=S、A、N、K、或H（第9C圖以及第9I圖）；GII.4_R53I+ P80S（第9D圖）；GII.4_V47P+ P80S（第9E圖）；GII.4_Δ35-42+ P80S（第9C圖）、以及GII.4_A39V+R53I+P80S（第9G圖）。VLP 的大小、密度、穩定性以及品質
如第5B圖所示，突變型諾羅病毒VP1蛋白GI.3_S94L以及GI.3_Q84S+S94L表現出具有更大密度的VLP（藉由蛋白質萃取物的碘克沙醇密度梯度部分的考馬斯染色的SDS PAGE測定）的改善特性，使得在部分1（F1）中觀察到VLP，以及，在部分F2-F6中達到峰值（與野生型諾羅病毒GI.3 VP1相較）。這些結果表明天然GI.3 VLP的組裝可能不如GI.3_S94L VLP穩定，並且天然GI.3 VLP可能更容易受到畸形殼體顆粒以及碎裂產物的產生。因此，含有GI.3_S94L VP1、GI.3_M57I+S94L以及GI.3_Q84S+S94L VP1的VLP表現出比野生型GI.3 VP1更大的結構完整性。還觀察到，如使用穿透式電子顯微鏡（TEM）測定的，相較於野生型，包括GI.3_S94L VP1、GI.3_M57I+S94L以及GI.3_Q84S+S94L VP1的VLP包括了直徑38 nm的VLP對直徑23 nm的VLP的更大相對比例（第5C圖以及第5E圖）。
含有GI.5_Q84S VP1、GI.5_A94L VP1、或GI.5_Q84S+A94L VP1蛋白的VLP表現出產量增加，並且GI.5_Q84S+A94L VP1與野生型諾羅病毒GI.5 VP1相較下也表現出更大的密度、穩定性以及結構完整性（以與上述用於使用經修飾的GI.3 VP1產生的VLP類似的方式）（第6B圖）。如第6C圖所示，與野生型相較，所得的VLP具有更少的受損VLP顆粒、以及直徑38 nm的顆粒對直徑23 nm的VLP的更大相對比例。
還觀察到，與野生型諾羅病毒GI.7 VP1相較，含有GI.7_R84S、GI.7_M57I、GI.7_M57I+R84S VP1蛋白的VLP表現出相同或更大的密度（第6D圖）。如第6E圖所示，與野生型相較，經修飾的VLP具有更少的受損VLP顆粒、以及直徑38 nm的顆粒對直徑23 nm的VLP的更大相對比例。
與野生型諾羅病毒GII.2 VP1相較，含有GII.2_E80S+A90L、GII.2_A39V+E80S+A90L VP1蛋白的VLP表現出更大的密度、穩定性以及結構完整性（以與上述類似的方式）(第7C圖)。如第7C圖所示，與野生型相較，經修飾的VLP具有更少的受損VLP顆粒、以及直徑38 nm的顆粒對直徑23 nm的VLP的更大相對比例。
GII.3_E80S在植物中的表現產生直徑38 nm的顆粒的VLP（第8B圖）。然而，VP1蛋白的產量（經由SDS-PAGE測定）仍然很低。
如第9B圖、第9C圖、第9D圖以及第9G圖所示，相較於含有野生型GII.4 VP1蛋白的VLP，經修飾的VP1蛋白GII.4_A39V、GII.4_V47P、GII.4_R53I、GII.4_P80S、GII.4_S90L、GII.4_A39V+P80S、GII.4_R53I+P80S、GII.4_P80S+S90L、GII.4_P80S+Δ35-42以及GII.4_A39V+R53I+P80S所有都表現出具有更高密度、穩定性以及結構完整性的VLP。此外，如藉由TEM觀察到的，含有GII.4_A39V+P80S、GII.4_R53I+P80S、GII.4_P80S+S90L、GII.4_P80S+Δ35-42以及GII.4_A39V+R53I+P80S的所有VLP已改善了病毒殼體完整性並減少了受損顆粒（第9B圖、第9C圖、第9D圖以及第9E圖）。也觀察到，含有GII.4_A39V+P80S以及GII.4_P80S+Δ35-42的VLP與野生型GII.4 VLP相較下具有相對於23nm直徑顆粒的更大比例的38 nm直徑顆粒（第9B圖以及第9C圖）。VLP也從GII.4_V47P；GII.4_V47P+P80S、GII.4_SSTAVATA；GII.4_P80S+SSTAVATA（第9E圖以及第9F圖）產生。
如第10A圖以及第10B圖所示，經修飾的諾羅病毒VP1蛋白GII.6_S90L的表現產生直徑38 nm的VLP（使用穿透式電子顯微鏡（TEM）測定）。
如使用穿透式電子顯微鏡（TEM）測定的，相較於含有野生型GII.12 VP1（第11C圖）的VLP，含有GII.12_E80S、GII.12_A90L以及GII.12_E80S+A90L的VLP也表現出具有直徑38 nm VLP的更大密度的改善特性。
如使用穿透式電子顯微鏡（TEM）測定的，相較於含有野生型GII.17 VP1（第11D圖）的VLP，含有GII.17_A39V、GII.17_A90L以及GII.17_R53I的VLP也表現出具有直徑38 nm VLP的更大密度的改善特性。
抗諾羅病毒感染的免疫誘導
「免疫反應」通常是指受試者的適應性免疫系統的反應。適應性免疫系統通常包括體液反應以及細胞介導的反應。體液反應是由B淋巴細胞譜系（B細胞）的細胞中產生的分泌抗體介導的免疫方面。分泌的抗體與入侵微生物（例如病毒或細菌）表面上的抗原結合，這標記它們以進行破壞。體液免疫通常用於指抗體產生及其伴隨的過程、以及抗體的效應子功能，包括Th2細胞活化以及細胞介素產生、記憶細胞產生、吞噬作用的調理素促進、病原體消除等。術語「調節(modulate)」或「調節(modulation)」等是指如藉由通常已知或使用的幾種測定中的任一種測定所確定的特定反應或參數的增加或減少，這些反應或參數中的一些在本文中舉例說明。
細胞介導的反應是免疫反應，其不涉及抗體，而是涉及巨噬細胞、天然殺手細胞（NK）、抗原專一性細胞毒性T淋巴細胞的活化、以及回應於抗原的各種細胞介素的釋放。細胞介導的免疫通常用於指一些Th細胞活化、Tc細胞活化以及T細胞介導的反應。細胞介導的免疫在回應病毒感染中可能特別重要。
例如，可以使用ELISPOT測定法測量抗原專一性CD8陽性T淋巴細胞的誘導；可以使用增殖測定法測量CD4陽性T淋巴細胞的刺激。抗諾羅病毒抗體力價可以使用ELISA測定而被定量；抗原專一性或交叉反應性抗體的同型也可以使用抗同型抗體（例如抗-IgG、IgA、IgE或IgM）而被測量。用於進行此類測定的方法以及技術是本領域熟知的。
細胞介素存在性或位準也可以被量化。例如，T輔助細胞反應（Th1/Th2）將藉由使用ELISA（例如BD Biosciences OptEIA套組）測量IFN-γ以及IL-4分泌細胞而被表徵。可以培養從受試者獲得的末梢血液單核細胞（PBMC）或脾細胞，並分析上澄液。也可以使用本領域已知的標記專一性螢光標定以及方法以藉由螢光活化的細胞分選（FACS）來定量T淋巴細胞。
還可以進行微中和測定（microneutralization assay）以表徵受試者中的免疫反應，參見例如1973年Rowe等人的方法。病毒中和滴定量可以用多種方式被定量，包括：在細胞的結晶紫固定/著色後的裂解溶菌斑的計數（溶菌斑測定）；體外培養中細胞裂解的顯微鏡觀察；以及2）諾羅病毒的ELISA以及分光光度檢測。
如本文所使用的術語「表位（epitope）」或「多個表位（epitopes）」是指抗體專一性結合至的抗原的結構部分。
使用BALB/c小鼠（範例4）進行對植物產生的野生型諾羅病毒天然GI.1（SEQ ID NO：1）VLP投予的免疫反應。植物產生的經修飾VP1蛋白、或包括例如使用下列產生的經修飾VP1蛋白的VLP也可以被投予需要其的受試者：GI.3_Q84S（構築體4140；SEQ ID NO：167）、GI.3_S94L（構築體4141；SEQ ID NO：9）、GI.3_A43V+S94L（構築體4179；SEQID NO：169）、GI.3_M57I+S94L（構築體4180；SEQ ID NO：171）、GI.3_P84S+S94L（構築體4142；SEQ ID NO：11）、GI.3_A43V+M57I+S94L（構築體4181；SEQ ID NO：173）、GI.5_Q84S（構築體4130；SEQ ID NO：35）、GI.5_ A94L（構築體4131；SEQ ID NO：37）、GI.5_Q84S+A94L（構築體4132；SEQ ID NO：39）、GI.7_R84S（構築體4210；SEQ ID NO：176）、GI.7_M57I（構築體4217；SEQ ID NO：178）、GI.7_M57I+R84S（構築體4218；SEQ ID NO：180）、GII.2_E80S（構築體4143；SEQ ID NO：86）、GII.2_A90L（構築體4144；SEQ ID NO：42）、GII.2_Q80S+A90L（構築體4145；SEQ ID NO：44）、GII.2_A39V+Q80S+A90L（構築體4182；SEQ ID NO：183）、GII.2_R53I+Q80S+A90L（構築體4183；SEQ ID NO：185）、GII.2_A39V+R53I+Q80S+A90L（構築體4184；SEQ ID NO：187）、GII.3_E80S（構築體4146；SEQ ID NO：47）、GII.3_A90L（構築體4147；SEQ ID NO：49）、GII.3_E80S+A90L（構築體4148；SEQ ID NO：51）、GII.4_A39V（構築體4155；SEQ ID NO：54）、GII.4_V47P（構築體4156；SEQ ID NO：56）、GII.4_R53I（構築體4157；SEQ ID NO：58）、GII.4_P80S（構築體4133；SEQ ID NO：60）、GII.4_S90L（構築體4134；SEQ ID NO：62）、GII.4_ Δ35-42（構築體4158；SEQ ID NO：64）、GII.4_SSTAVATA（構築體4159；SEQ ID NO：66）。GII.4_A39V+R53I（構築體4185；SEQ ID NO：189）、GII.4_A39V+P80S（構築體4165；SEQ ID NO：68）、GII.4_V47P+P80S（構築體4166；SEQ ID NO：70）、GII.4_R53I+P80S（構築體4167；SEQ ID NO：72）、GII.4_P80S+S90L（構築體4135；SEQ ID NO：74）、GII.4_ Δ35-42+ P80S（構築體4168；SEQ ID NO：76）、GII.4_P80S+SSTAVATA（構築體4169；SEQ ID NO：78）、GII.4_A39V+R53I+P80S（構築體4186；SEQ ID NO：191）、GII.6_E80S（構築體4149；SEQ ID NO：80）、GII.6_S90L（構築體4150；SEQ ID NO：82）、GII.6_E80S+S90L（構築體4151；SEQ ID NO：84）、GII.12_E80S（構築體4136；SEQ ID NO：89）、GII.12_A90L（構築體4137；SEQ ID NO：91）、GII.12_E80S+A90L（構築體4138；SEQ ID NO：93）、GII.17_A39V（構築體4234；SEQ ID NO：193）、GII.17_R53I（構築體4235；SEQ ID NO：195）、GII.17_A90L（構築體4232；SEQ ID NO：197）、GII.17_A39V+R53I（構築體4236；SEQ ID NO：199）、GII.17_E80S+A90L（構築體4233；SEQ ID NO：201）、或其組合。例如，可以組合本發明的VLP以形成包括兩種或兩種以上不同VLP的組成物，每一種VLP包括一種類型的經修飾的VP1蛋白、或者包括與如本文所述的一種或多於一種經修飾的VP1蛋白組合的天然VP1的一種VLP。如果組成物包括了含有一種類型VP1蛋白的VLP，則組成物可以被認為是單價的，如果組成物包括兩種VLP（每種VLP含有不同的VP1蛋白、或者一種VLP含有兩種不同的VP1蛋白），則組成物可以被認為是雙價的，如果組成物包括三種VLP（每一種VLP含有不同的VP1蛋白、或者一種VLP含有三種不同的VP1蛋白），則組成物可以被認為是三價的，或者，如果組成物包括四種VLP（每一種VLP含有不同的VP1蛋白、或者一種VLP含有四種不同的VP1蛋白），則組成物可以被認為是四價的。組成物也可包括含有超過四種不同VP1蛋白的VLP。
使用GI.1VLP塗覆的盤、藉由ELISA就GI.1 VLP專一性的總IgG以及IgA抗體分析從動物收集的血液的血清樣本。參考第3D圖，用來自GI.1基因型的植物諾羅病毒天然VP1 VLP免疫的小鼠在每個處理組的血清中顯示GI.1 VLP專一性的IgG抗體力價。每次處理誘導的IgG力價位準在統計學上高於針對安慰劑組所定量的力價（p >0.05）。IgG力價位準以劑量依賴性方式增加（在用或不用Alhydrogel配製的1 μg治療與10 μg治療之間檢測到顯著差異；p >0.05）。在第21天與第42天之間，也檢測到每個處理組的IgG力價位準的顯著增加（p >0.05）。這些結果共同證明了植物產生的諾羅病毒天然VP1 VLP在小鼠中引發強烈免疫反應的能力。
因此，本文提供了一種產生抗體或抗體片段的方法，其包括向受試者或宿主動物投予經修飾的諾羅病毒VP1蛋白、或含有一種或多於一種經修飾的VP1蛋白的諾羅病毒VLP，從而產生抗體或抗體片段。經修飾的諾羅病毒VP1蛋白（GI VP1蛋白或GII VP1蛋白）包括了在與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸43、57、84以及94序列比對的位置選出的胺基酸殘基處的一個或多於一個取代、修飾或突變；與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸39至46序列比對的胜肽片段的缺失；與諾羅病毒VP1基因型GI.1的胺基酸殘基39-46對應的胺基酸突變為序列SSTAVATA或其組合、並且核苷酸序列不是從基因型GI.1諾羅病毒VP1得到。VLP可進一步含有諾羅病毒VP2蛋白。
還提供了一種用於誘導免疫反應的組成物，其包括有效劑量的VLP，該VLP含有經修飾的諾羅病毒VP1蛋白，以及藥學上可接受的載體、佐劑、媒介物或賦形劑。
植物表現
可以使用Ti質體、Ri質體、植物病毒載體，直接DNA轉形、顯微注射、電穿孔等將本發明的構築體引入植物細胞中。對於這些技術的綜述，參見例如Weissbach及Weissbach，植物分子生物學方法
/Methods for Plant Molecular Biology
，學術出版社/Academy Press，紐約VIII，第421-463頁（1988）；Geierson及Corey，植物分子生物學
/Plant Molecular Biology
，第2版（1988）；以及Miki及Iyer，Fundamentals of Gene Transfer in Plants。在Plant Metabolism
，第2版，編者 DT. Dennis、DH Turpin、DD Lefebrvre、DB Layzell（編輯），Addison Wesly，Langmans有限公司，倫敦，第561-579頁（1997）中。其他方法包括直接DNA攝取、脂質體的使用、電穿孔，例如使用原生質體、顯微注射、粒子槍或晶鬚以及真空浸潤。參見，例如Bilang等人（1991，Gene
100：247-250）、Scheid等人（1991，Mol. Gen. Genet
. 228：104-112）、Guerche等人（1987，Plant Science
52：111-116）、Neuhause等人（1987，Theor. Appl Genet
. 75：30-36）、Klein等人（2987、Nature
327：70-73）；Freeman等人（1984，Plant Cell Physiol
. 29：1353）、Howell等人（1980，Science
208：1265）、Horsch等人（1985，Science
227：1229-1231）、DeBlock等人（1989，Plant Physiology
91：694-701），植物分子生物學方法/Methods for Plant Molecular Biology（Weissbach及Weissbach編輯，學術出版社/Academic Press，1988）、植物分子生物學方法/Methods in Plant Molecular Biology（Schuler及Zielinski編輯，學術出版社/Academic Press，1989）、WO 92/09696、WO 94/00583、EP 331083、EP 175966、Liu及Lomonossoff（2002，J Virol Meth ，
105 ：343-348）、EP 290395；WO 8706614；U.S.專利號4,945,050；5,036,006；及5,100,792、1995年5月10日申請的U.S.專利申請案序號08/438,666、以及1992年9月25日申請的U.S. 07/951,715（所有皆藉由引用併入本文）。
暫時表現方法可用於表現本發明的構築體（參見D’Aoust等人，2009，分子生物學方法 /Methods in molecular biology
，第483卷第41-50頁；Liu及Lomonossoff，2002，病毒學方法期刊
/Journal of Virological Methods
，105：343-348；上述藉由引用併入本文）。或者，可以使用如Kapila等人（1997，Plant Sci.
122，101-108；其藉由引用併入本文）所述的基於真空的暫時表現方法、或WO 00/063400、WO 00/037663（其藉由引用併入本文）。這些方法可包括例如、但不限於農桿菌接種或農桿菌浸潤的方法、注射器浸潤，然而，如上所述，也可使用其他暫時方法。利用農桿菌接種、農桿菌浸潤或注射器浸潤，包括所需核酸的農桿菌混合物進入組織（例如葉、植物的地上部分（包括莖、葉以及花）、植物的其他部分（莖、根、花）、或整個植物）的細胞間隙。在穿過表皮後，農桿菌感染並將t-DNA複本轉移到細胞中。t-DNA被游離轉錄並且mRNA被轉譯，導致感染細胞中所關注的蛋白質的產生，然而，細胞核內t-DNA的傳遞是暫時的。
也認為本發明的一部分是含有本發明基因構築體的轉基因植物、植物細胞或種子，其可以用作適於本文所述暫時蛋白質表現的平台植物。從植物細胞再生完整植物的方法也是本領域已知的（例如參見Guerineau及Mullineaux（1993，在：Plant Molecular Biology Labfax（Croy RRD 編輯）牛津，BIOS 科學出版社/BIOS Scientific Publishers，第121-148頁中的「植物轉化以及表現載體/Plant transformation and expression vectors」）。一般而言，轉化的植物細胞在可含有選擇性試劑（例如抗生素）的適當培養基中培養，其中可選擇標記用於促進轉化植物細胞的鑑定。一旦癒合組織形成，可以藉由根據已知方法使用適當的植物荷爾蒙來促進枝條形成，並將枝條轉移到發根培養基中以再生植物。然後可以使用植物從種子或使用營養繁殖技術建立重複世代。也可以在不使用組織培養下產生轉基因植物。用於穩定轉化以及再生這些有機體的方法在本領域中已經確立並且是本領域中具有通常知識者已知的。Vasil等人（植物的細胞培養及體細胞遺傳學/Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants，第 I、Il及III卷，實驗室程序及其應用/Laboratory Procedures and Their Applications，學術出版社/Academic Press，1984）、以及Weissbach及Weissbach（植物分子生物學方法/Methods for Plant Molecular Biology，學術出版社/Academic Press，1989）綜述了可用的技術。獲得轉化及再生植物的方法對本發明並不重要。
如果植物、植物部分、或植物細胞要由兩種或多種核酸構築體轉化或共轉化，該核酸構築體可以在單次轉染事件中被引入農桿菌中，使得核酸被匯集，且細菌細胞被轉染。或者，構築體可以被連續引入。在這種情況下，第一構築體被引入所述的農桿菌中，細胞在選擇性條件下（例如在抗生素存在下）生長，其中只有單一轉化的細菌可以生長。在此第一選擇步驟之後，第二核酸構築體被引入所述的農桿菌中，並且細胞在雙重選擇性條件下生長，其中只有雙重轉化的細菌可以生長。然後，雙重轉化的細菌可以用於轉化如本文所述的植物、植物部分或植物細胞、或者可以進行進一步的轉化步驟以適應第三核酸構築體。
或者，如果植物、植物部分、或植物細胞要由兩種或多種核酸構築體轉化或共轉化，該核酸構築體可以藉由將農桿菌細胞的混合物與植物、植物部分、或植物細胞共浸潤而被引入植物中，每一個農桿菌細胞可包括要被引入植物內的一種或多種構築體。為了改變構築體內所關注的核苷酸序列在植物、植物部分或植物細胞內的相對表現等級，在浸潤步驟期間，包括期望的構築體的各種農桿菌群體的濃度可以變化。
因此，本文提供植物、植物的一部分、植物細胞、或植物萃取物，該植物、植物的一部分、植物細胞、或植物萃取物包括一種或多於一種經修飾的諾羅病毒VP1蛋白、或諾羅病毒VLP，該諾羅病毒VLP含有一種或多於一種經修飾的VP1蛋白。該一種或多於一種經修飾的諾羅病毒VP1蛋白包括：在從與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸43、57、84以及94序列比對的多個胺基酸殘基中選出的一位置處的一個或多於一個取代、修飾或突變；與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸39至46序列比對的胜肽片段的缺失；或其組合，以及該核苷酸序列不是從基因型GI.1諾羅病毒VP1取得。該VLP可進一步含有諾羅病毒VP2蛋白。
本文還提供了植物、植物的部分、植物細胞、或植物萃取物，該植物、植物的部分、植物細胞、或植物萃取物包括編碼一種或多於一種經修飾的諾羅病毒VP1蛋白的多核苷酸序列。該一種或多於一種經修飾的諾羅病毒VP1蛋白包括：在從與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸43、57、84以及94序列比對的多個胺基酸殘基中選出的一位置處的一個或多於一個取代、修飾或突變；與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸39至46序列比對的胜肽片段的缺失；或其組合，以及該核苷酸序列不是從基因型GI.1諾羅病毒VP1取得。
表3中提供了諾羅病毒品系以及構築體的列表。
在以下範例中將進一步說明本發明。
範例 1：諾羅病毒VP1構築體
VP1以及VP2的候選序列可在Genbank中獲得（參見第2A圖以及第2B圖）。這些序列的非限制性範例是：
Hu/GI.2/Leuven/2003/BEL（GI.2；SEQ ID NO：4；第13A圖）；
Hu/GI.3/S29/2008/Lilla Edet/Sweden（GI.3；SEQ ID NO：6；第14A圖）；
Hu/GI.5/Siklos/Hun5407/2013/HUN（GI.5；SEQ ID NO：12；第15A圖）；
Hu/GI.7/USA/2014/GA5043（GI.7，SEQ ID NO：101，第16A圖）
Hu/GII.1/Ascension 208/2010/USA（GII.1；SEQ ID NO：13；第16C圖）；
Hu/GII.2/CGMH47/2011/TW（GII.2；SEQ ID NO：14；第17A圖）；
Hu/GII.3/Jingzhou/2013402/CHN（GII.3；SEQ ID NO：15；第18A圖）；
Hu/GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU（GII.4；SEQ ID NO：16；第19A圖）；
US96/GII.4/Dresden174/1997/DE_AY741811（GII.4；SEQ ID NO：27；第19C圖）；
FH02/GII.4/armingtonHills/2002/US_AY502023（GII.4；SEQ ID NO：28；第19D圖）；
Hnt04：GII.4/Hunter-NSW504D/2004/AU_DQ078814（GII.4；SEQ ID NO：29；第19E圖）；
2006b：GII.4/Shellharbour-NSW696T/2006/AU_EF684915（GII.4；SEQ ID NO：30；第19F圖）；
NO09：GII.4/Orange-NSW001P/2008/AU_GQ845367（GII.4；SEQ ID NO：31；第19G圖）；
GII.14_ Saga _2008_JPN_ADE28701 native VP1（GII.14；SEQ ID NO：32；第25圖）；
Hu/GII.5/AlbertaEI390/2013/CA（GII.5；SEQ ID No：17；第20圖）；
Hu/GII.6/Ohio/490/2012/USA（GII.6；SEQ ID NO：20；第21A圖）；
G11.7/Musa/2010/All73774（GII.7；SEQ ID NO：18；第22圖）；
Hu/GII.12/HS206/2010/USA（GII.12；SEQ ID NO：19；第23A圖）；
GII.13/VA173/2010/H9AWU4（GII.13；SEQ ID NO：22；第24A圖）；
Hu/GII.17/Kawasaki323/2014/JP（GII.17；SEQ ID NO：24；第26A圖）；
Hu/GII.21/Salisbury150/2011/USA（GII.21；SEQ ID NO：26；第27圖）。
表4中列出的引子用於製備下述構築體。表 4 用於製備本文定義的構築體的引子。 
WT GI.1 諾羅病毒VP1：A2X35S/CPMV 160/ wt VP1 GI.1/ NOS（構築體編號2724）
使用以下基於PCR的方法將編碼來自諾羅病毒品系GI.1/Norwalk/1968/US的VP1的人類密碼子最佳化序列選殖至2X35S/CPMV 160/NOS表現系統中。使用人類密碼子最佳化的GI.1 VP1基因序列（SEQ ID NO：3）作為模板以使用引子IF-NoV(US68)VP1(ORF2)(hCod).c（SEQ ID NO：102)以及IF-NoV(US68)VP1(ORF2)(hCod).r（SEQ ID NO：103)來擴增含有GI.1 VP1編碼序列的片段。對於序列最佳化，GI.1/Norwalk/1968/US VP1蛋白質序列（Genbank登錄號NP_056821）是針對人類密碼子使用、GC含量以及mRNA結構而被反向轉譯及最佳化。使用In-Fusion選殖系統（Clontech，Mountain View，CA）將PCR產物選殖至2X35S/CPMV 160/NOS表現系統中。用SacII以及StuI限制酶分解構築體編號1190（SEQ ID NO：162；第38A圖以及第48圖），以及線性化質體是用於In-Fusion組裝反應。構築體編號1190是受體質體，用於在基於2X35S/CPMV 160/NOS的表現匣中的所關注基因的“In Fusion”選殖。其也併入基因構築體，以用於在苜蓿質體藍色素基因啟動子以及終止子下沉默的TBSV P19抑制子的共同表現。骨架是pCAMBIA二元質體，且從左到右t-DNA邊界的序列顯示在SEQ ID NO：162中。得到的構築體的編號為2724（第38B圖；SEQ ID NO：163）。來自諾羅病毒品系GI.1/Norwalk/1968/US的天然VP1的胺基酸序列示於SEQ ID NO：1中。質體2724的表示示於第39A圖中。
2X35S/CPMV 160/ GII.4_P80S (hCod)/ NOS + MAR（構築體編號 4133）
使用以下基於PCR的方法將編碼來自GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU的VP1（包含S結構域中的P80S取代）的人類密碼子最佳化序列選殖至2X35S/CPMV 160/NOS+MAR表現系統中。在第一輪PCR中，使用人密碼子最佳化的GII.4 VP1基因序列（SEQ ID NO：52）作為模板以使用引子IF-GII.4Syd12VP1.c (SEQ ID NO：130)以及GII.4(P80S).r (SEQ ID NO：138)擴增含有具有突變的P80S胺基酸的S結構域的片段。使用人密碼子最佳化的GII.4 VP1基因序列（SEQ ID NO：52）作為模板以使用GII.4(P80S).c (SEQ ID NO:139)以及IF-GII.4Syd12VP1.r (SEQ ID NO:131)擴增含有P80S取代以及剩餘S及P結構域的第二片段。對於序列最佳化，將GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU VP1蛋白質序列（Genbank登錄號AFV08795）進行反向轉譯及最佳化以用於人類密碼子使用、GC含量以及mRNA結構。然後將來自兩種擴增的PCR產物混合並用作模板以用於使用作為引子的IF-GII.4Syd12VP1.c (SEQ ID NO:130)以及IF-GII.4Syd12VP1.r (SEQ ID NO:131)的第二輪擴增。使用In-Fusion選殖系統(Clontech，Mountain View，CA)將最終的PCR產物選殖至2X35S/CPMV 160/NOS+MAR表現系統中。用SacII以及StuI限制酶分解構築體編號 3677（SEQ ID NO：164；第38C圖以及第49圖），並將線性化質體用於In-Fusion組裝反應。構築體編號3677是受體質體，用於在2X35S/CPMV 160/NOS+MAR-基礎表現卡匣中「In Fusion」選殖所關注的基因。其還包含基因構築體，用於在苜蓿色素體藍素基因啟動子及終止子下共表現沉默的TBSV P19抑制子。骨架是pCAMBIA二元質體，且從左到右t-DNA邊界的序列顯示在SEQ ID NO：164中。得到的構築體的編號為4133（第38D圖；SEQ ID NO：165）。突變的GII.4_P80S的胺基酸序列示於SEQ ID NO：59中。質體4133的表示示於第44E圖中。
2X35S/CPMV 160/GII.4_P80S+S90L (hCod)/NOS+MAR（構築體編號 4135）
使用以下基於PCR的方法將編碼來自GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU的VP1（包含S結構域中的P80S以及S90L取代）的人類密碼子最佳化序列選殖至2X35S/CPMV 160/NOS+MAR表現系統中。在第一輪PCR中，使用人密碼子最佳化的GII.4_P80S VP1基因序列（SEQ ID NO：60）作為模板以使用引子IF-GII.4Syd12VP1.c (SEQ ID NO：130)以及GII.4(S90L).r (SEQ ID NO:140)擴增含有具有突變的P80S及S90L胺基酸的S結構域的片段。使用人密碼子最佳化的GII.4_P80S VP1基因序列（SEQ ID NO：60）作為模板以使用GII.4(S90L).c (SEQ ID NO:141)以及IF-GII.4Syd12VP1.r (SEQ ID NO:131)擴增含有S90L取代以及剩餘S及P結構域的第二片段。對於序列最佳化，將GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU VP1蛋白質序列（Genbank登錄號AFV08795）進行反向轉譯及最佳化以用於人類密碼子使用、GC含量以及mRNA結構。然後將來自兩種擴增的PCR產物混合並用作模板以用於使用作為引子的IF-GII.4Syd12VP1.c (SEQ ID NO:130)以及IF-GII.4Syd12VP1.r (SEQ ID NO:131)的第二輪擴增。使用In-Fusion選殖系統(Clontech，Mountain View，CA)將最終的PCR產物選殖至2X35S/CPMV 160/NOS+MAR表現系統中。用SacII以及StuI限制酶分解構築體編號 3677（SEQ ID NO：164；第38C圖以及第49圖），並將線性化質體用於In-Fusion組裝反應。構築體編號3677是受體質體，用於在2X35S/CPMV 160/NOS+MAR-基礎表現卡匣中「In Fusion」選殖所關注的基因。其還包含基因構築體，用於在苜蓿色素體藍素基因啟動子及終止子下共表現沉默的TBSV P19抑制子。骨架是pCAMBIA二元質體，且從左到右t-DNA邊界的序列顯示在SEQ ID NO：164中。得到的構築體的編號為4135（SEQ ID NO：166）。突變的GII.4_P80S+S90L的胺基酸序列示於SEQ ID NO：73中。質體4135的表示示於第44L圖中。
表3以及表4中提供了野生型以及突變的VP1及VP2蛋白、引子、模板以及產物的概述。參考單一修飾的構築體＃4133以及雙重、三重及四重修飾的構築體＃4135，使用上述相同的方法，構築具有單、雙、三以及四重修飾、取代或突變的VP1蛋白。使用為構築體＃2724所述方法基本相同的方法組裝VP2蛋白。
範例 2：方法農桿菌
（Agrobacterium tumefaciens
）轉染
使用D'Aoust等人2008（Plant Biotech. J.
6：930-40）描述的方法，用天然諾羅病毒VP1、天然諾羅病毒VP2或諾羅病毒VP1突變蛋白表現載體以藉由電穿孔轉染農桿菌
AGL1品系。經轉染的農桿菌在補充有10 mM 2-（N-嗎啉代）乙磺酸（MES）、20 μM乙醯丁香酮、50 μg/ml康黴素以及25 μg/ml卡本西林pH5.6的YEB培養基中生長至OD600
在0.6與1.6之間。在使用前將農桿菌懸浮液離心並重懸於滲透培養基（10 mM MgCl2
以及10 mM MES pH 5.6）中。
植物生物量、接種原以及農桿菌浸潤的製備
從填充有商業泥炭蘚基質的平板中的種子生長圓葉煙草植物。使植物於16/8光週期以及白天25℃/夜間20℃的溫度範圍內的溫室中生長。播種後3週，挑出單獨的小植株、移植到盆中、以及在相同的環境條件下在溫室中再生長3週。
用每種天然諾羅病毒VP1、天然諾羅病毒VP2或諾羅病毒VP1突變體表現載體轉染的農桿菌在補充有10 mM 2-(N-嗎啉基)乙磺酸（MES）、20 μM乙醯丁香酮、50 μg/ml康黴素以及25 μg/ml卡本西林的YEB培養基、pH5.6中生長，直至其達到0.6與1.6之間的OD600
。在使用前將農桿菌懸浮液離心並重懸於浸潤培養基（10 mM MgCl2
以及10 mM MES pH 5.6）中並在4℃下儲存過夜。在浸潤當天，將培養物批次以2.5培養體積稀釋並在使用前加熱。將圓葉煙草的整個植株倒置在氣密的不銹鋼罐中的細菌懸浮液中，在20-40托的真空下2分鐘。將植物放回溫室中培養6或9天直至收穫。
葉片收穫以及總蛋白質萃取
培養後，收穫植物的地上部分、在−80℃冷凍並壓碎成碎片。藉由在2體積的冷的100 mM磷酸鹽緩衝液pH 7.2 + 150 mM NaCl、0.4 μg/ ml偏酸式亞硫酸鹽以及1 mM苯基甲磺醯氟中均質化（Polytron）冷凍壓碎的植物材料的每個樣本來萃取總可溶性蛋白質。均質化後，將漿液在4℃下以10,000 g離心10分鐘，並保持這些澄清的粗萃取物（上澄液）以用於分析。
使用牛血清白蛋白作為參考標準，藉由Bradford測定法（Bio-Rad，Hercules，California）測定澄清的粗萃取物的總蛋白質含量。使用Criterion™ TGX Stain-Free™預製凝膠（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA）以在還原條件下藉由SDS-PAGE分離蛋白質。用考馬斯亮藍染色凝膠以使蛋白質可視化。或者，用Gel Doc™ EZ成像系統（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA）使蛋白質可視化、並電轉移到聚二氟伸乙烯（PVDF）膜（Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，Indiana）上進行免疫檢測。在免疫印漬之前，將膜在Tris緩衝生理食鹽水（TBS-T）中以5％脫脂乳以及0.1％Tween-20在4℃下阻斷16-18小時。
蛋白質分析以及免疫印漬
首先以與來自GI以及GII基因型的VP1專一性的一級mAb 242P抗體（用在TBS-Tween 20 0.1％中的2％脫脂乳稀釋1/500）第一次培養以進行免疫印漬。將1/10000稀釋（用在TBS-Tween 20 0.1%中的2％脫脂乳稀釋）的過氧化酶共軛的山羊抗小鼠（Jackson Immunoresearch，目錄號115-035-146）用作化學發光檢測的二級抗體。藉由使用發光胺作為基質的化學發光（Roche Diagnostics Corporation）來檢測免疫反應性複合物。使用EZ-Link Plus®活化過氧化酶共軛套組（Pierce，Rockford，Ill）進行人類IgG抗體的山葵過氧化酶-酵素共軛化。
VLP形成/碘克沙醇梯度的分析
藉由以2體積的萃取緩衝液（100 mM磷酸鹽緩衝液pH 7.2 + 150 mM NaCl）在混合器中的機械萃取，從冷凍生物質中萃取蛋白質。通過大孔尼龍過濾器過濾漿液以除去大的碎片並在4℃下以5000 g離心5分鐘。收集上澄液並以5000 g再次離心30分鐘（4 ℃）以除去另外的碎片。然後將上澄液裝載到不連續的碘克沙醇密度梯度上。如下進行分析密度梯度離心：製備在乙酸鹽緩衝液中含有不連續碘克沙醇密度梯度（碘克沙醇45％ 1 ml、35％ 2 ml、33％ 2 ml、31％ 2ml、29％ 2 ml、25％ 5 ml）的38 ml管並用含有類病毒顆粒的萃取物25 ml覆蓋。以175000 g離心該梯度4小時（4 ℃）。離心後，從底部到頂部收集1 ml部分，藉由SDS-PAGE結合蛋白質染色或西方墨點轉漬法分析部分。
電子顯微鏡
如上所述，在不連續的碘克沙醇密度梯度上離心部分澄清的植物萃取物後，混合含有樣本的部分（1ml /部分）與100 mM PBS pH 7.2 + 150 mM NaCl緩衝液以完全填充管並以100000 g離心120分鐘。取決於VP1的量，將沉澱重新懸浮在300-1000 µl緩衝液中。
藉由將碳側面朝上放在培養皿中的Whatman紙上並在4℃下溫育過夜，使具有200 nm篩孔尺寸的碳塗覆的銅格網成為親水的。將要藉由穿透式電子顯微鏡（TEM）觀察的來自密度梯度離心的20 µl匯集的部分沉積在封口膜（Parafilm）上，並使網格以碳側面朝下漂浮、並在室溫下溫育5分鐘。然後以20 µl水滴洗滌格網4次，並藉由觸摸具有格網側面的Whatman紙來排出來自最後一次洗滌的多餘水。然後將格網在20 µl液滴的2％乙酸氧鈾水溶液中溫育1分鐘。在Whatman紙上使格網乾燥5分鐘。在穿透式電子顯微鏡下以10,000X至150,000X的放大倍數進行觀察。
範例3：植物中VP1蛋白以及VLP產生
如範例2中所述，用包含編碼野生型諾羅病毒VP1或突變諾羅病毒VP1構築體的表現載體（以允許VP1序列的表現）的農桿菌真空浸潤圓葉煙草葉，並檢查葉子的VP1蛋白及/或VLP生產。在浸潤後9天（DPI），從葉均質物製備的總粗蛋白萃取物是藉由SDS-PAGE而被分離、並用考馬斯染色（VP1產生）、或使用如上文範例2中所述的不連續碘克沙醇密度梯度分離（VLP產生）。使用考馬斯染色的SDS-PAGE檢查來自密度梯度的部分。諾羅病毒VP1蛋白出現在約55-60 kDa的條帶。在密度梯度的部分內VP1蛋白的出現表明在密度梯度離心期間VLP平衡的部分。還測定了在密度梯度離心後從峰值部分獲得的VLP的產率。
從植物的萃取的野生型諾羅病毒VP1蛋白的產量或量取決於表現的諾羅病毒VP1的基因型而不同。如使用SDS PAGE測定的，野生型GI.1 VP1、GI.5 VP1以及GII.12 VP1表現出易於檢測的蛋白質產量（第3A圖）。相反地，野生型GII.4 VP1在植物中表現差（第3A圖右圖），並且在表現後也觀察到低產量的VP1蛋白或不可檢測量的VP1蛋白（使用SDS-PAGE），例如野生型GII.2 VP1、GII.3 VP1以及GII.6 VP1（表5）。表 5 ：植物中產生的幾種野生型（天然）諾羅病毒品系的 VP1 產量（在粗萃取物中測定）。 
包含經修飾的 GI.3 VP1 蛋白的 VLP 以及 GI.3 VLP
具有在位置84處的麩醯胺酸至絲胺酸取代（Q84S）的諾羅病毒GI.3 VP1構築體導致與野生型GI.3 VP1類似的產量，而與包含野生型GI.3 VP1的VLP相較下，具有在位置94處的絲胺酸至白胺酸取代（S94L）、或包括S94L取代的取代的組合的諾羅病毒GI.3 VP1構築體表現出增加1.9至3.8倍（S94L）、增加4.2倍（A43V+S94L）、增加1.8倍（Q84S+S94L）、以及增加10.2倍（A34V+M57I+Q84S+S94L）的包含VP1蛋白的VLP的更大產量。此外，具有在位置94處的絲胺酸至白胺酸、纈胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、離胺酸、或組胺酸取代（GI.3_S94X，其中X= L、V、I、M、T、E、D、N、Q、K、or H）的構築體與包含野生型GI.3 VP1蛋白的VLP相較表現出約1.2至約2.75倍的更大產量（第5F圖）。
如第5B圖以及第5D圖中所示，與包括野生型GI.3 VP1的VLP（主要分離成較低密度的部分（F8-F11：25-29％碘克沙醇））相較，具有在位置94處的絲胺酸至白胺酸取代（S94L）、或包括了在位置84處的麩醯胺酸至絲胺酸取代（Q84S）以及在位置94處的絲胺酸至白胺酸取代（Q84S+S94L）、或在位置57處的甲硫胺酸至異白胺酸取代（M57I+S94L）的組合的諾羅病毒GI.3構築體的表現導致VLP轉變為更高密度部分（F2-F6；31-35% 碘克沙醇）。
當與野生型GI.3 VLP比較時，包含具有S94L取代、Q84S+S94L的組合、或M57I+S94L的組合的經修飾的GI.3 VP1蛋白的VLP具有較少的受損病毒顆粒以及高於23 nm顆粒的更大比例的38 nm顆粒（第5C圖以及第5E圖）。包含
經修飾的 GI.5 VP1 蛋白的 VLP 以及 GI.5 VLP
當與在植物中表現的野生型GI.5 VP1蛋白的產量相較時，具有在位置84處的絲胺酸至脯胺酸取代（Q84S）、在位置94處的丙胺酸至白胺酸取代（A94L）、或這些取代的組合（Q84S+A94L）的諾羅病毒GI.5 VP1構築體在植物萃取物中表現出類似的VP1蛋白產量（第6A圖）。在梯度純化、離心以及再懸浮後，當與野生型GI.5 VP1相較時，具有在位置94處的丙胺酸至白胺酸取代（A94L）的諾羅病毒GI.5構築體表現出更高的產量（增加1.5倍）。
如第6B圖中所示，與野生型GI.5 VP1（主要在25-29%碘克沙醇部分中發現）相較，具有在位置84處的麩醯胺酸至絲胺酸取代與在位置94處的丙胺酸至白胺酸取代（Q84S+A94L）的組合的GI.5 VP1構築體導致表現出轉變為更高密度碘克沙醇部分（29-31%）的VP1蛋白。當與野生型GI.5 VLP相較時，VLP製劑還包含較少的受損病毒顆粒（第6C圖）。包含
經修飾的 GI.7 VP1 蛋白的 VLP 以及 GI.7 VLP
與野生型GI.7 VP1相較時，在位置84處具有精胺酸至絲胺酸取代（R84S）、在位置57處具有甲硫胺酸至異白胺酸取代（M57I）、或這些取代的組合（M57I+R84S）的諾羅病毒GI.7 VP1構築體在梯度純化、離心以及再懸浮後表現出增加的VP1蛋白產量。此外，在位置57處具有甲硫胺酸至異白胺酸、白胺酸、甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、離胺酸，或組胺酸取代的GI.7構築體（GI.7_M57X，其中X=I、L、G、S、T、N、Q、K、或H）表現出更高的產量，包含野生型GI.7 VP1蛋白的VLP的約1.1至約1.95倍（第6F圖）。
如第6D圖所示，與野生型GI.7 VP1相較，具有M57I、R84S或M57I + R84S取代的GI.7 VP1構築體導致表現出轉變為更高密度碘克沙醇部分（31-35％）的VP1蛋白質。與野生型GI.7 VLP相較，具有M57I、R84S或M57I+R84S取代的GI.7 VLP製劑還包含相同或更少的受損病毒顆粒（第6E圖）。包含經修飾的 GII.2 VP1 蛋白的 VLP 以及 GII.2 VLP
與野生型GII.2 VP1的產量相較，在植物中經修飾的諾羅病毒VP1蛋白GII.2_A90L以及GII.2_E80S+A90L的表現導致更高的VP1蛋白產量（參見第7A圖）。
當與野生型GII.2 VP1相較時，具有在位置84處的麩胺酸至絲胺酸取代以及在位置90處的丙胺酸至白胺酸取代（E84S+A90L）、在位置39處的丙胺酸至纈胺酸取代、在位置84處的麩胺酸至絲胺酸取代以及在位置90處的丙胺酸至白胺酸取代（A39S+E84S+A90L）、在位置53處的精胺酸至異白胺酸取代、在位置84處的麩胺酸至絲胺酸取代以及在位置90處的丙胺酸至白胺酸取代（R53I+E84S+A90L）、在位置39處的丙胺酸至纈胺酸取代、在位置53處的精胺酸至異白胺酸取代、在位置84處的麩胺酸至絲胺酸取代以及在位置90處的丙胺酸至白胺酸取代（A39V+R53I+E84S+A90L）的諾羅病毒GII.2 VP1構築體在梯度純化、離心以及再懸浮後都表現出增加的VP1蛋白產量。
具有在位置80處的麩胺酸至絲胺酸取代（E80S）、在位置90處的丙胺酸至白胺酸取代（A90L）、或在位置80處的麩胺酸至絲胺取代及在位置80及90處的丙胺酸至白胺酸取代（E80S+A90L）的GII.2 VP1構築體的表現導致與野生型GII.2的VLP產生類似的VLP產生（第7B圖）。與野生型GII.2VLP相較，具有E80S+A90L、或A39V+ E80S+A90L取代的GII.2 VLP製劑也包含相同或更少的受損病毒顆粒（第7C圖）。包含經修飾的 GII.3 VP1 蛋白的 VLP 以及 GII.3 VLP
當與在植物中表現的野生型GII.3 VP1蛋白的產量相較時，具有在位置80處的以絲胺酸取代麩胺酸（E80S）的諾羅病毒GII.3 VP1構築體在植物萃取物中表現出類似的VP1蛋白產量。包含野生型或經修飾的VP1蛋白的VLP的產率通常較低。
野生型GII.3相較，具有在位置80處的麩胺酸至絲胺酸取代（E80S）的GII.3 VP1構築體的表現導致存在於類似的密度碘克沙醇部分（35％）中的類似的VLP產生（第8B圖）。包含經修飾的 GII.4 VP1 蛋白的 VLP 以及 GII.4 VLP
參考第9A圖、第9H圖以及第9I圖，與使用野生型GI.4的VP1產量相較，在植物萃取後，具有下列的諾羅病毒GII.4 VP1構築體導致更高VP1蛋白質產量：在位置53處的精胺酸至異白胺酸取代（R53I）；在位置80處的脯胺酸至絲胺酸、丙胺酸、天冬醯胺、離胺酸、或組胺酸取代（P80X，其中X=S、A、N、K、或H）；在位置90處的絲胺酸至白胺酸取代（S90L）；在位置39處的丙胺酸至纈胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、蘇胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、離胺酸、或組胺酸取代（A39X，其中X=V、I、M、T、E、D、N、Q、K、或H）與在位置80處的脯胺酸至絲胺酸取代的組合（A39V+P80S）；在位置53處的精胺酸至異白胺酸取代與在位置80處的脯胺酸至絲胺酸取代的組合（R53I+P80S）；在位置90處的絲胺酸至白胺酸取代與在位置80處的脯胺酸至絲胺酸取代的組合（P80S+S90L）；以及位置35-42處的缺失（Δ35-42）與在位置80處的脯胺酸至絲胺酸取代的組合（Δ35-42+P80S）。
對於每種受測的經修飾的GII.4 VP1蛋白，包含各種經修飾的GII.4 VP1蛋白的VLP產量大於包含野生型GII.4 VP1蛋白的VLP的產量。在包含GII.4_A39V VP1的VLP中觀察到VLP產量增加10倍；在包含GII.4_P80X的VLP中觀察到VLP產量增加約1.4至約2.7倍，其中X=S、A、N、K、H，在包含GII.4_S90L VP1或GII.4_Δ35-42+P80S VP1的VLP中觀察到VLP產量增加超過8倍；在包含GII.4_P80S+P90L VP1的VLP中觀察到VLP產量增加14倍；在包含GII.4_A39X+P80S VP1的VLP中觀察到VLP產量增加約1.3至約3.4倍，其中X=V、I、M、T、E、D、N、Q、K、或H，GII.4_R53I+P80S（增加21倍）、或GII.4_A39V+P80S+A90L VP1（增加38.5倍）；在包含GII.4_A39V+R53I VP1的VLP中觀察到VLP產量增加5倍；在包含GII.4_V47P+P80S VP1的VLP中觀察到VLP產量增加4倍；以及在包含GII.4_R53I VP1的VLP中觀察到VLP產量增加1.5倍。
包含經修飾的GII.4蛋白的VLP的結果顯示在第9B圖至第9D圖以及第9G圖中。包括了具有下列取代的GII.4 VP1的構築體導致產生的VLP存在較高密度的碘克沙醇部分（29-33％）：在位置80處的脯胺酸至絲胺酸取代（P80S；第9B圖、第9C圖、第9D圖）；在位置90處的絲胺酸至白胺酸取代（S90L；第9B圖）；在位置39處的丙胺酸至纈胺酸取代與在位置80處的脯胺酸至絲胺酸取代（A39V+P80S；第9C圖）的組合；在位置53處的精胺酸至異白胺酸取代與在位置80處的脯胺酸至絲胺酸取代的組合（R53I+P80S；第9D圖）；在位置80處的脯胺酸至絲胺酸取代與在位置90處的絲胺酸至白胺酸取代的組合（P80S+S90L；第9B圖）；在位置80處的脯胺酸至絲胺酸取代與位置35-42處的缺失（P80S+Δ35-42；第9C圖）、以及在位置39處的丙胺酸至纈胺酸取代與在位置80處的脯胺酸至絲胺酸取代以及在位置90處的絲胺酸至白胺酸取代的組合（GII.4_A39V+P80S+A90L；第9G圖）。
與野生型GII.4 VLP相較，包含了具有下列取代的GII.4 VP1蛋白的VLP具有更少的受損病毒顆粒及/或更大比例的38 nm顆粒：23 nm顆粒：P80S取代與S90L取代的組合（P80S+S90L；第9B圖）；A39V取代與P80S取代的組合（A39V+P80S；第9C圖）；P80S取代與位置35-42處的缺失的組合（Δ35-42+P80S；第9C圖）；R53I取代與P80S取代的組合（R53I+P80S；第9D圖）；以及在位置39處的丙胺酸至纈胺酸取代與在位置80處的脯胺酸至絲胺酸取代以及在位置90處的絲胺酸至白胺酸取代的組合（GII.4_A39V+P80S+A90L；第9G圖）。包含經修飾的 GII.6 VP1 蛋白的 VLP 以及 GII.6 VLP
與野生型相比，在表現GII.6_S90L VP1的植物萃取物中也觀察到超過2.2倍的增加的VLP產量（在梯度純化、離心以及再懸浮後測定）。含有經修飾的 GII.12 VP1 蛋白的 VLP 以及 GII.12 VLP
與野生型相較，經修飾的GII.12（例如，包括位置80處的麩胺酸至絲胺酸取代（E80S）、位置90處的精胺酸至白胺酸取代（A90L）、或這些取代的組合（E80S+A90L）的GII.12）的產量導致增加約1.2-1.4倍（在梯度純化、離心以及再懸浮後測定：第11A圖）。
GII.12構築體（具有：位置80處的麩胺酸至絲胺酸取代（E80S）；位置90處的丙胺酸至白胺酸取代（A90L）；以及其組合（E80S+A90L））導致存在於更高密度的碘克沙醇部分（33-35％）（與野生型GII.12 VP1（31-33％）相比）中的GII.12 VP1蛋白的表現。含有經修飾的 GII.17 VP1 蛋白的 VLP 以及 GII.17 VLP
與野生型相較，經修飾的GII.17（例如，包括位置39處的丙胺酸至纈胺酸取代（A39V）、位置53處的精胺酸至異白胺酸取代（R53I）、或位置90處的丙胺酸至白胺酸取代（A90L）的GII.17）的產量導致增加約1.1-3.4倍（在梯度純化、離心以及再懸浮後測定）。
GII.17構築體（具有：位置39處的丙胺酸至纈胺酸取代（A39V）、位置53處的精胺酸至異白胺酸取代（R53I）、或位置90處的丙胺酸至白胺酸取代（A90L））導致存在於更高密度的碘克沙醇部分（33-35％）（與野生型GII.12 VP1（31-33％）相比）中的GII.17 VP1蛋白的表現。
整體來說，上述結果證明來自高密度碘克沙醇梯度部分的蛋白質成分展現出發現諾羅病毒VP1蛋白以及經修飾的諾羅病毒VP1蛋白在植物中自組裝成VLP。包括突變VP1蛋白的分離的VLP表現出與野生型諾羅病毒病毒顆粒的結構構形類似的結構構形。
範例4：使用VP1的免疫反應
用6-8週齡雌性BALB/c小鼠（Charles River Laboratories）進行對諾羅病毒天然GI.1（SEQ ID NO：1）VLP投予的免疫反應的研究。將37隻小鼠隨機分成用於諾羅病毒VLP疫苗的4組8隻小鼠、以及用於安慰劑的1組5隻動物。使用肌內免疫注射所有組。所有組均以雙劑量方案免疫，在第一次免疫後3週施用加強免疫。
對於後腿肌肉內投予，用來自諾羅病毒GI.1基因型疫苗（1或10 µg）的植物製備的VLP天然VP1免疫兩組（8隻動物）未麻醉的小鼠。使用疫苗緩衝液（pH 6.0的PBS）、使用與候選疫苗相同的途徑以及方案進行免疫安慰劑組（5隻動物）。
為了測量佐劑的潛在益處，藉由在未麻醉的小鼠上用植物製備的VLP諾羅病毒疫苗1或10 µg加上1體積的Alhydrogel 2％（明礬，Cedarlane Laboratories Ltd.，Burlington，Ontario，Canada）在後腿中肌內投予來免疫兩組動物（8隻動物）。根據初免-加強方案免疫所有組，在第一次免疫後3週進行加強免疫。
在生命期內經由臨床觀察評估小鼠如下：每日監測死亡率以及臨床症狀、每週詳細檢查、注射部位觀察以及體重測量。觀察所有動物並在第42天處死以進行粗略檢查。在第0天、第21天以及第42天（每次免疫後21天）給藥之前從所有動物收集血液。處理樣本以分離血清用於專一性抗體反應分析。
使用GI.1 VLP塗覆的盤，藉由ELISA以針對GI.1 VLP專一性的總IgG及IgA抗體分別分析來自所有動物的第21天以及第42天收集的血液的血清樣本。由處理組合併從所有動物收集的免疫前血清樣本（第0天 - 先前給藥），並分析每個合併以確保它們是陰性的（或低於分析測試的截止值）。
使用GraphPad Prism軟體（版本6.05；GraphPad Software，La Jolla，CA，USA）進行敘述性統計。每組測得的抗體力價被描述為具有95％信賴區間（CI）的幾何平均力度（GMT）。檢測限制值的一半歸因於低於對受測抗體專一的方法的檢測限制的抗體力價。因此，在本研究中，如果：針對測定條件，動物的GMT值等於或高於該方法的檢測限制（LOQ = 100），則認為該動物是陽性反應者。使用單向ANOVA、接著對log10轉換的資料進行塔基檢定（Tukey’s test）來進行處理組IgG力價之間的統計比較。也使用單向ANOVA、接著對log10轉換的資料進行事後Dunnett檢定來進行安慰劑組與每個處理組之間的比較。
在用1個劑量（第21天）以及2個劑量（第42天）的每種製劑1 μg或10 μg進行IM免疫後，在來自所有動物的血清樣本中測量的GI.1 VLP專一性總IgG力價。使用GI.1 VLP塗覆的盤（LOQ = 100）、用ELISA測量總IgG力價。結果呈現於第3D圖中。每處理組（n = 8隻動物/組）的總IgG力價用幾何平均力價（GMT）表示，信賴區間為95％。使用單向ANOVA、接著對log10轉換的資料進行塔基檢定以進行處理組IgG力價之間的統計比較。安慰劑組與每個處理組之間的比較也使用單向ANOVA、接著對log10轉換的資料進行事後Dunnett檢定來進行。顯著差異在第3D圖中被註釋為字母（相同的字母表示在處理組之間未檢測到顯著差異；p> 0.05）。
以類似的方式，如本文所述的植物產生的經修飾的VP1蛋白可以按照與此範例中所述的相同操作流程投予小鼠，經修飾的VP1蛋白包括例如：使用GI.3_Q84S（構築體4140；SEQ ID NO：167）、GI.3_S94L（構築體4141；SEQ ID NO：9）、GI.3_A43V+S94L（構築體4179；SEQ ID NO：169）、GI.3_M57I+S94L（構築體4180；SEQ ID NO：171）、GI.3_P84S+S94L（構築體4142；SEQ ID NO：11）、GI.3_A43V+M57I+S94L（構築體4181；SEQ ID NO：173）、GI.5_Q84S（構築體4130；SEQ ID NO：35）、GI.5_ A94L（構築體4131；SEQ ID NO：37）、GI.5_Q84S+A94L（構築體4132；SEQ ID NO：39）、GI.7_R84S（構築體4210；SEQ ID NO：176）、GI.7_M57I（構築體4217；SEQ ID NO：178）、GI.7_M57I+R84S（構築體4218；SEQ ID NO：180）、GII.2_E80S（構築體4143；SEQ ID NO：86）、GII.2_A90L（構築體4144；SEQ ID NO：42）、GII.2_E80S+A90L（構築體4145；SEQ ID NO：44）、GII.2_A39V+E80S+A90L（構築體4182；SEQ ID NO：183）、GII.2_R53I+E80S+A90L（構築體4183；SEQ ID NO：185）、GII.2_A39V+R53I+E80S+A90L（構築體4184；SEQ ID NO：187）、GII.3_E80S（構築體4146；SEQ ID NO：47）、GII.3_A90L（構築體4147；SEQ ID NO：49）、GII.3_E80S+A90L（構築體4148；SEQ ID NO：51）、GII.4_A39V（構築體4155；SEQ ID NO：54）、GII.4_V47P（構築體4156；SEQ ID NO：56）、GII.4_R53I（構築體4157；SEQ ID NO：58）、GII.4_P80S（構築體4133；SEQ ID NO：60）、GII.4_S90L（構築體4134；SEQ ID NO：62）、GII.4_ Δ35-42（構築體4158；SEQ ID NO：64）、GII.4_SSTAVATA（構築體4159；SEQ ID NO：66）。GII.4_A39V+R53I（構築體4185；SEQ ID NO：189）、GII.4_A39V+P80S（構築體4165；SEQ ID NO：68）、GII.4_V47P+P80S（構築體4166；SEQ ID NO：70）、GII.4_R53I+P80S（構築體4167；SEQ ID NO：72）、GII.4_P80S+S90L（構築體4135；SEQ ID NO：74）、GII.4_ Δ35-42+ P80S（構築體4168；SEQ ID NO：76）、GII.4_P80S+SSTAVATA（構築體4169；SEQ ID NO：78）、GII.4_A39V+R53I+P80S（構築體4186；SEQ ID NO：191）、GII.6_E80S（構築體4149；SEQ ID NO：80）、GII.6_S90L（構築體4150；SEQ ID NO：82）、GII.6_E80S+S90L（構築體4151；SEQ ID NO：84）、GII.12_E80S（構築體4136；SEQ ID NO：89）、GII.12_A90L（構築體4137；SEQ ID NO：91）、GII.12_E80S+A90L（構築體4138；SEQ ID NO：93）、GII.17_A39V（構築體4234；SEQ ID NO：193）、GII.17_R53I（構築體4235；SEQ ID NO：195）、GII.17_A90L（構築體4232；SEQ ID NO：197）、GII.17_A39V+R53I（構築體4236；SEQ ID NO：199）、GII.17_E80S+A90L（構築體4233；SEQ ID NO：201）、或其組合所產生的。
對諾羅病毒天然VP1 VLP的小鼠免疫反應
如第3D圖所示，用來自GI.1基因型的植物製諾羅病毒天然VP1 VLP免疫的小鼠在血清中已顯示出GI.1 VLP-專一性的IgG抗體力價、並且在第21天以及第42天對於每一處理組都被檢測到。在第21天和第42天，每次處理誘導的IgG力價位準在統計上高於針對安慰劑組所定量的力價（p >0.05）。在每一天，IgG力價位準以劑量依賴性方式增加，如藉由用或不用Alhydrogel配製的1 μg與10 μg處理之間檢測到的顯著差異（p >0.05）、以及向NoV VLP疫苗添加Alhydrogel顯著增強在1 μg以及10 μg劑量下誘導的免疫反應（p >0.05）所證明的。在第21天與第42天之間，對於每一個處理組也檢測到IgG力價位準的顯著增加（p >0.05）。這些結果共同證明了植物產生的諾羅病毒天然VP1 VLP在小鼠中引發強烈免疫反應的能力。
由於含有經修飾的VP1蛋白的VLP的投予，也可觀察到類似的結果，經修飾的VP1蛋白包括例如：按照與此範例中所述的相同操作流程，使用下列所產生的：GI.3_Q84S（構築體4140；SEQ ID NO：167）、GI.3_S94L（構築體4141；SEQ ID NO：9）、GI.3_A43V+S94L（構築體4179；SEQ ID NO：169）、GI.3_M57I+S94L（構築體4180；SEQ ID NO：171）、GI.3_P84S+S94L（構築體4142；SEQ ID NO：11）、GI.3_A43V+M57I+S94L（構築體4181；SEQ ID NO：173）、GI.5_Q84S（構築體4130；SEQ ID NO：35）、GI.5_ A94L（構築體4131；SEQ ID NO：37）、GI.5_Q84S+A94L（構築體4132；SEQ ID NO：39）、GI.7_R84S（構築體4210；SEQ ID NO：176）、GI.7_M57I（構築體4217；SEQ ID NO：178）、GI.7_M57I+R84S（構築體4218；SEQ ID NO：180）、GII.2_E80S（構築體4143；SEQ ID NO：86）、GII.2_A90L（構築體4144；SEQ ID NO：42）、GII.2_E80S+A90L（構築體4145；SEQ ID NO：44）、GII.2_A39V+E80S+A90L（構築體4182；SEQ ID NO：183）、GII.2_R53I+E80S+A90L（構築體4183；SEQ ID NO：185）、GII.2_A39V+R53I+E80S+A90L（構築體4184；SEQ ID NO：187）、GII.3_E80S（構築體4146；SEQ ID NO：47）、GII.3_A90L（構築體4147；SEQ ID NO：49）、GII.3_E80S+A90L（構築體4148；SEQ ID NO：51）、GII.4_A39V（構築體4155；SEQ ID NO：54）、GII.4_V47P（構築體4156；SEQ ID NO：56）、GII.4_R53I（構築體4157；SEQ ID NO：58）、GII.4_P80S（構築體4133；SEQ ID NO：60）、GII.4_S90L（構築體4134；SEQ ID NO：62）、GII.4_ Δ35-42（構築體4158；SEQ ID NO：64）、GII.4_SSTAVATA（構築體4159；SEQ ID NO：66）、GII.4_A39V+R53I（構築體4185；SEQ ID NO：189）、GII.4_A39V+P80S（構築體4165；SEQ ID NO：68）、GII.4_V47P+P80S（構築體4166；SEQ ID NO：70）、GII.4_R53I+P80S（構築體4167；SEQ ID NO：72）、GII.4_P80S+S90L（構築體4135；SEQ ID NO：74）、GII.4_ Δ35-42+ P80S（構築體4168；SEQ ID NO：76）、GII.4_P80S+SSTAVATA（構築體4169；SEQ ID NO：78）、GII.4_A39V+R53I+P80S（構築體4186；SEQ ID NO：191）、GII.6_E80S（構築體4149；SEQ ID NO：80）、GII.6_S90L（構築體4150；SEQ ID NO：82）、GII.6_E80S+S90L（構築體4151；SEQ ID NO：84）、GII.12_E80S（構築體4136；SEQ ID NO：89）、GII.12_A90L（構築體4137；SEQ ID NO：91）、GII.12_E80S+A90L（構築體4138；SEQ ID NO：93）、GII.17_A39V（構築體4234；SEQ ID NO：193）、GII.17_R53I（構築體4235；SEQ ID NO：195）、GII.17_A90L（構築體4232；SEQ ID NO：197）、GII.17_A39V+R53I（構築體4236；SEQ ID NO：199）、GII.17_E80S+A90L（構築體4233；SEQ ID NO：201）、或其組合。
所有引文在此併入作為參考。
已經關於一個或多個實施方式描述了本發明。然而，對於本領域中具有通常知識者顯而易見的是，可以對所描述的主題進行多種變化及修飾。申請專利範圍的範圍不應受範例中所提出的較佳實施方式的限制，而應給出與整個說明一致的最廣泛的詮釋。
ORF:開讀框
P:突出
S:殼體
UTR:非轉譯區
VP1、VP2:殼體蛋白
本發明的這些以及其他特徵將從參考附圖的以下描述中變得更加清楚，其中：第 1A 圖
顯示諾羅病毒基因體的線性結構以及從其轉譯的多蛋白以及蛋白的示意圖。第 1B 圖
顯示了諾羅病毒VP1蛋白的三維結構的帶狀圖表示，其包括殼體（S）結構域、P1亞結構域（P1）以及P2亞結構域（P2）。第 1C 圖
顯示包括兩個S結構域（S）、兩個P1亞結構域（P1）、以及兩個P2亞結構域（P2）的諾羅病毒VP1蛋白二聚體的三維結構的帶狀圖表示。第 2A 圖
顯示了幾種諾羅病毒VP1（上部）以及VP2（下部）蛋白的Uniprot以及NCBI參考資料。第 2B 圖
顯示了幾種諾羅病毒VP1（上部）以及VP2（下部）核酸序列的NCBI參考資料。第 2C 圖
顯示諾羅病毒VP1蛋白的幾個S結構域的比對。諾羅病毒GI.1序列（SEQ ID NO：1）用作參考序列，其他諾羅病毒VP1序列（GI.2，SEQ ID NO：4；GI.3，SEQ ID NO：6；GI.5，SEQ ID NO：12；GI.7 SEQ ID NO：101；GII.1. SEQ ID NO：13；GII.2. SEQ ID NO：14；GII.3，SEQ ID NO：15；GII.4，SEQ ID NO：16；GII.5,SEQ ID NO：17；GII.6，SEQ ID NO：20；GII.7,SEQ ID NO：18；GII.12，SEQ ID NO：19；GII.13，SEQ ID NO：22；GII.14、SEQ ID NO：32；GII.17、SEQ ID NO：24；以及GII.21，SEQ ID NO：26）與其比對。VP1蛋白的「GII」族的VP1胺基酸序列包括了在胺基酸14-16處的3個胺基酸缺失、以及在位置26處的1個胺基酸缺失，這導致GII VP1序列與GI VP1序列之間的4個胺基酸的比對偏移。第 3A 圖
顯示了浸潤後9天（DPI）從農桿菌浸潤的圓葉煙草（Nicotiana benthamiana
）葉製備的粗蛋白萃取物的考馬斯（Coomassie）染色的SDS-PAGE，左圖：野生型(wt)人類密碼子最佳化的(hCod) GI.1/United States/Norwalk/1968 VP1（構築體#：2724；SEQ ID NO：3（核苷酸）；SEQ ID NO：1（胺基酸））以及hCod GI.5 VP1（構築體#：3980；SEQ ID NO：33（核苷酸）；SEQ ID NO：12（胺基酸）；中間圖：野生型GI.1以及wt hCod GII.12/United States/HS206/2010 VP1（構築體#：3995；SEQ ID NO：87（核苷酸）；SEQ ID NO：19（胺基酸））；以及右圖：野生型GI.1以及wt hCod GII.4/Sydney/NSW0514/2012 VP1（構築體#：3760；SEQ ID NO：52（核苷酸）；SEQ ID NO：16（胺基酸））。箭頭：VP1諾羅病毒蛋白。在每一圖中的第一泳道是從擬滲透的圓葉煙草葉中製備的粗蛋白萃取物。第 3B 圖
上部顯示了使用考馬斯染色的SDS-PAGE分析來自從表現wt hCod VP1 GI.1/United States/Norwalk/1968 VP1（構築體#2724）或wt hCod VP1（構築體#2724）、且與wt hCod VP2（構築體#2725）共同表現的圓葉煙草葉片製備的粗蛋白萃取物的碘克沙醇（iodixanol）密度梯度分離的部分的諾羅病毒蛋白表現以及VLP組裝。下部顯示了從VP1、或VP1蛋白及VP2蛋白的共同表現的33％碘克沙醇梯度部分純化的諾羅病毒VLP的電子顯微照片。顯示了天然諾羅病毒VLP的電子顯微照片以用於比較。第 3C 圖
顯示了從表現左部：wt hCod GI.5/Hungary/Siklos/HUN5407/2013 VP1（構築體#：3980；SEQ ID NO：33（核苷酸）；SEQ ID NO：12（胺基酸））；右部：GII.12/United States/HS206/2010 VP1（構築體#：3995；SEQ ID NO：87（核苷酸）；SEQ ID NO：19（胺基酸）的圓葉煙草葉片製備的粗蛋白萃取物的碘克沙醇密度梯度部分的考馬斯染色的SDS-PAGE分析。第 3D 圖
顯示了在用1個劑量（第21天）以及2個劑量（第42天）的每種製劑1 μg或10 μg進行IM免疫後於來自動物的血清樣本中測得的GI.1 VLP專一性總IgG力價。使用GI.1 VLP塗覆的盤（LOQ = 100）藉由ELISA測量總IgG力價。每處理組（n=8隻動物/組）的總IgG力價用幾何平均力價（GMT）表示，信賴區間為95％。相同的字母（A、B、C、D）：在處理組之間沒有檢測到顯著差異（p> 0.05）。第 4A 圖
顯示了從表現wt hCod GI.2 VP1（構築體#：3300；SEQ ID NO：5（核苷酸）；SEQ ID NO：4（胺基酸）的圓葉煙草葉片製備的粗蛋白萃取物的碘克沙醇密度梯度部分的考馬斯染色的SDS-PAGE分析。第 4B 圖
顯示了從VP1的29-35％碘克沙醇梯度部分純化的諾羅病毒VLP的電子顯微照片。第 5A 圖
顯示了：在有及無wt hCod GI.3/S29/2008/Lila Edet/Sweden VP2（構築體#：3303；SEQ ID NO：95（核苷酸）；SEQ ID NO：94（胺基酸））下，以wt hCod GI.3/S29/2008/Lila Edet/Sweden VP1（構築體#：3979；SEQ ID NO：7（核苷酸）；SEQ ID NO：6（胺基酸））、mut hCod GI.3/S29/2008/Lila Edet/Sweden_S94L VP1（構築體#：4141；SEQ ID NO：9 （核苷酸）；SEQ ID NO：8（胺基酸））、或mut hCod GI.3/S29/2008/Lila Edet/Sweden_Q84S+S94L VP1（構築體#：4142；SEQ ID NO：11（核苷酸）；SEQ ID NO：10（胺基酸））浸潤後9天（DPI），從農桿菌浸潤的圓葉煙草葉製備的粗蛋白萃取物的考馬斯染色的SDS-PAGE。第一泳道：從擬滲透的圓葉煙草葉中製備的粗蛋白萃取物。第 5B 圖
顯示從表現wt hCod GI.3/S29/2008/Lila Edet/Sweden VP1（構築體#：3979，左圖）、mut hCod GI.3/S29/2008/Lila Edet/Sweden VP1_S94L（構築體#：4141，中間圖）、或mut hCod GI.3/S29/2008/Lila Edet/Sweden VP1_Q84S+S94L（構築體#：4142，右圖）的圓葉煙草葉片製備的粗蛋白萃取物的碘克沙醇密度梯度部分的考馬斯染色的SDS-PAGE分析。第 5C 圖
顯示了從表現wt hCod GI.3/S29/2008/Lila Edet/Sweden VP1（構築體#：3979，左圖；第5B圖的部分F2+F3，F6+F7）、mut hCod GI.3/S29/2008/Lila Edet/Sweden VP1_S94L（構築體#：4141，中間圖；第5B圖的部分F2-F6）、或mut hCod GI.3/S29/2008/Lila Edet/Sweden VP1_Q84S+S94L（構築體#：4142，右圖；第5B圖的部分F2-F6）的圓葉煙草葉製備的粗蛋白萃取物的31-35％碘克沙醇梯度部分純化的類病毒顆粒（VLP）的穿透式電子顯微照片（TEM）；放大15,000X；比例尺= 500 nm。第 5D 圖
顯示了：以mut hCod GI.3/S29/2008/Lila Edet/Sweden_M57I+S94L VP1（構築體#：4180；SEQ ID NO：171（核苷酸）；SEQ ID NO：172（胺基酸））浸潤後9天（DPI），從農桿菌浸潤的圓葉煙草葉製備的粗蛋白萃取物的考馬斯染色的SDS-PAGE。第 5E 圖
顯示了從表現mut hCod GI.3/S29/2008/Lila Edet/Sweden_M57I+S94L VP1（構築體#：4180）的圓葉煙草葉製備的粗蛋白萃取物的31-35％碘克沙醇梯度部分純化的類病毒顆粒（VLP）的穿透式電子顯微照片（TEM）；放大15,000X；比例尺 = 500 nm。第 5F 圖
顯示了與野生型GI.3（GI.3 S94；設定為1的「倍數變化」）的VLP產量相較下的包括非天然VP1 GI.3（具有在胺基酸位置94處的取代）的VLP的相對產量：C＃：構築體編號。第 6A 圖
顯示：以wt hCod GI.1/United States/Norwalk/1968 VP1（構築體#：2724；SEQ ID NO：3（核苷酸）；SEQ ID NO：1（胺基酸））、wt hCod GI.5/Siklos/HUN5407/2013/HUN VP1（構築體#：3980；SEQ ID NO：33（核苷酸）；SEQ ID NO：12（胺基酸））、mut hCod GI.5/Siklos/HUN5407/2013/HUN_Q84S VP1（構築體#：4130；SEQ ID NO：35（核苷酸）；SEQ ID NO：34（胺基酸））、mut hCod GI.5/Siklos/HUN5407/2013/HUN_A94L VP1（構築體#：4131；SEQ ID NO：37（核苷酸）；SEQ ID NO：36（胺基酸））或mut hCod GI.5/Siklos/HUN5407/2013/HUN_Q84S+A94L VP1（構築體#：4132；SEQ ID NO：39（核苷酸）；SEQ ID NO：38（胺基酸））浸潤後9天（DPI），從農桿菌浸潤的圓葉煙草葉製備的粗蛋白萃取物的考馬斯染色的SDS-PAGE。箭頭：VP1諾羅病毒蛋白；第一泳道 = 從擬浸潤的圓葉煙草葉製備的粗蛋白萃取物。第 6B 圖
顯示了從圓葉煙草葉（從左至右：表現wt hCod GI.5/Siklos/HUN5407/2013/HUN VP1（構築體# 3980）、mut hCod GI.5/Siklos/HUN5407/2013/HUN_Q84S VP1（構築體#：4130，左圖）、mut hCod GI.5/Siklos/HUN5407/2013/HUN_A94L VP1（構築體#：4131，中間圖）、或mut HCod GI.5/Siklos/HUN5407/2013/HUN_Q84S+A94L VP1（構築體#：4132，右圖））製備的粗蛋白萃取物的碘克沙醇密度梯度部分的考馬斯染色的SDS-PAGE分析。第 6C 圖
顯示了從表現（從左至右）wt hCod GI.5/Siklos/HUN5407/2013/HUN VP1（構築體# 3980）、wt hCod GI.5/Siklos/HUN5407/2013/HUN_Q84S VP1（構築體#：4130，左圖）、mut hCod GI.5/Siklos/HUN5407/2013/HUN_A94L VP1（構築體#：4131，中間圖）、或mut hCod GI.5/Siklos/HUN5407/2013/HUN_Q84S+A94L VP1（構築體#：4132，右圖）的圓葉煙草葉製備的粗蛋白萃取物的31-35％碘克沙醇梯度部分純化的類病毒顆粒（VLP）的穿透式電子顯微照片（TEM）；放大15,000X；比例尺= 200 nm。第 6D 圖
顯示了從表現（從左到右）wt hCod GI.7/GA5043/USA/2014 VP1（構築體# 4209；SEQ ID NO：101（核苷酸）；SEQ ID NO：204（胺基酸））、mut hCod GI.7/GA5043/USA/2014_R84S（構築體#4210；SEQ ID NO：176（核苷酸）；SEQ ID NO：177（胺基酸））、mut hCod GI.7/GA5043/USA/2014_M57I（構築體4217；SEQ ID NO：178（核苷酸）；SEQ ID NO：179（胺基酸））、mut hCod GI.7/GA5043/USA/2014_M57I+R84S（構築體# 4218；SEQ ID NO：180（核苷酸）；SEQ ID NO：181（胺基酸））的原葉煙草葉製備的粗蛋白質萃取物的碘克沙醇密度梯度部分的考馬斯染色SDS-PAGE分析。*所獲得用於TEM分析的樣本（參見第6E圖）。第 6E 圖
顯示了從表現左上：wt hCod GI.7/GA5043/USA/2014 VP1（構築體# 4209）、右上：mut hCod GI.7/GA5043/USA/2014_R84S（構築體#4210）；左下：mut hCod GI.7/GA5043/USA/2014_M57I（構築體4217）；右下：mut hCod GI.7/GA5043/USA/2014_M57I+R84S Contract # 4218）的圓葉煙草葉製備的粗蛋白萃取物的31-35％碘克沙醇梯度部分純化的類病毒顆粒（VLP）的穿透式電子顯微照片（TEM）；放大15,000X；比例尺 = 500 nm。第 6F 圖
顯示了與野生型GI.7（GI.7 M57；設定為1的「倍數變化」）的VLP產量相較下的包括非天然VP1 GI.7（具有在胺基酸位置57處的取代）的VLP的相對產量：C＃：構築體編號。第 7A 圖
顯示了：以wt hCod GII.2/CGMH47/2011/TW VP1（構築體#：3982；SEQ ID NO：40（核苷酸）；SEQ ID NO：14（胺基酸））、mut hCod GII.2/CGMH47/2011/TW_E80S VP1（構築體#：4143；SEQ ID NO：86（核苷酸）；SEQ ID NO：85（胺基酸））、mut hCod GII.2/CGMH47/2011/TW_A90L VP1（構築體#：4144；SEQ ID NO：42（核苷酸）；SEQ ID NO：41（胺基酸））或mut hCod GII.2/CGMH47/2011/TW_E80S+A90L VP1（構築體#：4145；SEQ ID NO：44（核苷酸）；SEQ ID NO：43（胺基酸））浸潤後9天（DPI），從農桿菌浸潤的圓葉煙草葉製備的粗蛋白萃取物的考馬斯染色的SDS-PAGE。箭頭：VP1諾羅病毒蛋白；第一泳道=從擬浸潤的圓葉菸草葉製備的粗蛋白萃取物。第 7B 圖
顯示了從圓葉煙草葉（從左至右：表現wt hCod GII.2/CGMH47/2011/TW VP1（構築體# 3982）、mut hCod GII.2/CGMH47/2011/TW_E80S VP1（構築體#4143）、mut hCod GII.2/CGMH47/2011/TW_A90L（構築體#：4144）、或mut hCod GII.2/CGMH47/2011/TW_E80S+A90L VP1（構築體#：4145））製備的粗蛋白萃取物的碘克沙醇密度梯度部分的考馬斯染色的SDS-PAGE分析。第 7C 圖
顯示了從圓葉煙草葉製備的粗蛋白萃取物的碘克沙醇密度梯度部分的考馬斯染色的SDS-PAGE分析（各圖的上部）、以及從表現：左上圖：wt hCod GII.2/CGMH47/2011/TW VP1（構築體# 3982）；右上圖：mut hCod GII.2/CGMH47/2011/TW_E80S+A90L VP1（構築體#4145）；左下圖：mut hCod GII.2/CGMH47/2011/TW_A39V+E80S+A90L VP1（構築體# 4182；SEQ ID NO：183（核苷酸）；SEQ ID NO：182（胺基酸））；右下圖：mut hCod GII.2/CGMH47/2011/TW_M53I+E80S+A90L VP1（構築體# 4183 SEQ ID NO：185（核苷酸）；SEQ ID NO：184（胺基酸））的圓葉煙草葉製備的粗蛋白萃取物的29-35 ％碘克沙醇梯度部分純化的類病毒顆粒（VLP）的穿透式電子顯微照片（TEM）（各圖的下部）；放大15,000X；比例尺= 500 nm。第 8A 圖
顯示了從圓葉煙草葉（從左至右：表現wt hCod GII.3/Jingzhou/2013402/CHN VP1（構築體#：3983；SEQ ID NO：45（核苷酸）；SEQ ID NO：15（胺基酸；第1膠圖））、mut hCod GII.3/Jingzhou/2013402/CHN_E80S VP1（構築體#：4146；SEQ ID NO：47（核苷酸）；SEQ ID NO：46（胺基酸；第2膠圖））、mut hCod GII.3/Jingzhou/2013402/CHN_A90L VP1（構築體#：4147；SEQ ID NO：49（核苷酸）；SEQ ID NO：48（胺基酸；第3膠圖））、或mut hCod GII.3/Jingzhou/2013402/CHN_E80S+A90L VP1（構築體#：4148；SEQ ID NO：51（核苷酸）；SEQ ID NO：50（胺基酸；第4膠圖））製備的粗蛋白萃取物的碘克沙醇密度梯度部分的考馬斯染色的SDS-PAGE分析。第 8B 圖
顯示了從表現wt hCod GII.3/Jingzhou/2013402/CHN VP1（構築體#3983、第1膠圖）、或mut hCod GII.3/Jingzhou/2013402/CHN_E80S VP1（構築體#：4146、第2膠圖）的圓葉煙草葉製備的粗蛋白萃取物的31-35％碘克沙醇梯度部分純化的類病毒顆粒（VLP）的穿透式電子顯微照片（TEM）；放大15,000X；比例尺 = 500 nm。第 9A 圖
顯示了以下列浸潤後9天（DPI）從農桿菌浸潤的圓葉煙草葉製備的粗蛋白萃取物的考馬斯（Coomassie）染色的SDS-PAGE：wt GI.1/United States/Norwalk/1968 VP1（構築體#：2724；SEQ ID NO：3（核苷酸）；SEQ ID NO：1（胺基酸））、wt hCod GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU VP1（構築體#：3760；SEQ ID NO：52（核苷酸）；SEQ ID NO：16（胺基酸））、mut hCod GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU _A39V VP1（構築體#：4155；SEQ ID NO：54（核苷酸）；SEQ ID NO：53（胺基酸））、mut hCod GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU_V47P VP1（構築體#：4156；SEQ ID NO：56（核苷酸）；SEQ ID NO：55（胺基酸））、mut hCod GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU_R53I VP1（構築體#：4157；SEQ ID NO：58（核苷酸）；SEQ ID NO：57（胺基酸））、mut hCod GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU_P80S VP1（構築體#：4133；SEQ ID NO：60（核苷酸）；SEQ ID NO：59（胺基酸））、mut hCod GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU_S90L VP1（構築體#：4134；SEQ ID NO：62（核苷酸）；SEQ ID NO：61（胺基酸））、mut hCod GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU_Δ35-42 VP1（構築體#：4158；SEQ ID NO：64（核苷酸）；SEQ ID NO：63（胺基酸））、mut hCod GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU_SSTAVATA VP1（構築體#：4159；SEQ ID NO：66（核苷酸）；SEQ ID NO：65（胺基酸））、mut hCod GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU_P80S+A39V（構築體 #：4165；SEQ ID NO：68（核苷酸）；SEQ ID NO：67（胺基酸））、mut hCod GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU_P80S+V47P VP1（構築體#：4166；SEQ ID NO：70 （核苷酸）；SEQ ID NO：69（胺基酸））、mut hCod GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU_ P80S+R53I VP1（構築體#：4167；SEQ ID NO：72（核苷酸）；SEQ ID NO：71（胺基酸））、mut hCod GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU_P80S+S90L VP1（構築體#：4135；SEQ ID NO：74（核苷酸）；SEQ ID NO：73（胺基酸））、mut hCod GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU_P80S+Δ35-42 VP1（構築體#：4168；SEQ ID NO：76（核苷酸）；SEQ ID NO：75（胺基酸））、或mut hCod GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU_P80S+SSTAVATA VP1（構築體#：4169；SEQ ID NO：78（核苷酸）；SEQ ID NO：77（胺基酸））。箭頭：VP1諾羅病毒蛋白；第一泳道 = 從擬滲透的圓葉煙草葉中製備的粗蛋白萃取物。第 9B 圖
顯示了從圓葉煙草葉製備的粗蛋白萃取物的碘克沙醇密度梯度部分純化的類病毒顆粒（VLP）的考馬斯染色的SDS-PAGE分析（上圖）、以及穿透式電子顯微照片（TEM；下圖；放大15,000X；比例尺 = 200 nm），該圓葉煙草葉表現wt hCod GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU VP1（構築體#：3760）、mut hCod GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU_P80S VP1（構築體#：4133）、mut hCod GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU_S90L VP1（構築體#：4134）、GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU_P80S+S90L VP1（構築體#：4135）。第 9C 圖
顯示了從圓葉煙草葉製備的粗蛋白萃取物的碘克沙醇密度梯度部分純化的類病毒顆粒（VLP）的考馬斯染色的SDS-PAGE分析（上圖）、以及穿透式電子顯微照片（TEM；下圖；放大15,000X；比例尺 = 200 nm），該圓葉煙草葉表現wt hCod GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU VP1（構築體#：3760）、mut hCod GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU_P80S VP1（構築體#：4133）、mut hCod GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU _A39V VP1（構築體#：4155）、mut hCod GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU_ P80S+A39V（構築體#：4165）、mut hCod GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU_Δ35-42 VP1（構築體#：4158）、mut hCod GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU_P80S+Δ35-42 VP1（構築體#：4168）。第 9D 圖
顯示了從圓葉煙草葉製備的粗蛋白萃取物的碘克沙醇密度梯度部分純化的類病毒顆粒（VLP）的考馬斯染色的SDS-PAGE分析（上圖）、以及穿透式電子顯微照片（TEM；下圖；放大15,000X；比例尺 = 200 nm），該圓葉煙草葉表現 wt hCod GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU VP1（構築體#：3760）、mut hCod GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU_P80S VP1（構築體#：4133）、mut hCod GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU_R53I VP1（構築體#：4157）、mut hCod GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU_R53I+P80S VP1（構築體#：4167）。第 9E 圖
顯示了從圓葉煙草葉製備的粗蛋白萃取物的碘克沙醇密度梯度部分純化的類病毒顆粒（VLP）的考馬斯染色的SDS-PAGE分析，該圓葉煙草葉表現wt hCod GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU VP1（構築體#：3760）、mut hCod GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU_P80S VP1（構築體#：4133）、mut hCod GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU_V47P VP1（構築體#：4156）、mut hCod GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU_P80S+V47P VP1（構築體#：4166）。第 9F 圖
顯示了從圓葉煙草葉製備的粗蛋白萃取物的碘克沙醇密度梯度部分純化的類病毒顆粒（VLP）的考馬斯染色的SDS-PAGE分析，該圓葉煙草葉表現wt hCod GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU VP1（構築體#：3760）、mut hCod GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU_P80S VP1（構築體#：4133）、mut hCod GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU_SSTAVATA VP1（構築體#：4159）、mut hCod GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU_SSTAVATA+P80S VP1（構築體#：4169）。第 9G 圖
顯示了從圓葉煙草葉製備的粗蛋白萃取物的碘克沙醇密度梯度部分的考馬斯染色的SDS-PAGE分析（上圖）、以及從圓葉煙草葉製備的粗蛋白萃取物的31-35％碘克沙醇梯度部分純化的類病毒顆粒（VLP）的穿透式電子顯微照片（TEM）（下圖），該圓葉煙草葉表現：左圖：mut hCod GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU_R53I+P80S VP1（構築體# 4167）；右圖：mut hCod GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU_A39V+R53I+ P80S VP1（構築體#4186；SEQ ID NO：191（核苷酸）；SEQ ID NO：190（胺基酸））；放大15,000X；比例尺 = 500 nm。第 9H 圖
顯示了與野生型（天然）GII.4/2012（GII.4/2012 P80被設定為1的「倍數變化」）的VLP產量相較下的包括非天然VP1 GII.4/2012（具有在胺基酸位置80處的取代）的VLP的相對產量；C＃：構築體編號。第 9I 圖
顯示了與包括A39的GII.4/2012 (P80S)（GII.4/2012 (P80S) A39設定為1的「倍數變化」）的VLP產量相較下的包括VP1 GII.4/2012 (P80S)（具有在胺基酸位置39處的附加取代）的VLP的相對產量；C＃：構築體編號。第 10A 圖
顯示了從圓葉煙草葉片製備的粗蛋白萃取物的碘克沙醇（iodixanol）密度梯度部分的考馬斯染色的SDS-PAGE分析，圓葉煙草葉片表現出wt hCod GII.6/Ohio/490/2012/USA VP1（構築體#：3993；SEQ ID NO：21（核苷酸）；SEQ ID NO：20（胺基酸））以及wt hCod GII.6/HS245/2010/USA VP2（構築體#：3307；SEQ ID NO：97（核苷酸）；SEQ ID NO：96（胺基酸））、mut hCod GII.6/Ohio/490/2012/USA_E80S VP1（構築體#：4149；SEQ ID NO：80（核苷酸）；SEQ ID NO：79（胺基酸））以及wt hCod GII.6/HS245/2010/USA VP2（構築體#：3307）、mut hCod GII.6/Ohio/490/2012/USA_S90L VP1（構築體#：4150；SEQ ID NO：82（核苷酸）；SEQ ID NO：81（胺基酸））以及wt hCod GII.6/HS245/2010/USA VP2（構築體#3307）、或mut hCod GII.6/Ohio/490/2012/USA_E80S+S90L VP1（構築體#：4151；SEQ ID NO：84（核苷酸）；SEQ ID NO：83（胺基酸））以及wt hCod GII.6/HS245/2010/USA VP2（構築體#：3307）。第 10B 圖
顯示了從表現wt hCod GII.6/Ohio/490/2012/USA VP1（構築體#：3993）以及wt hCod GII.6/HS245/2010/USA VP2（構築體#：3307）、mut hCod GII.6/Ohio/490/2012/USA_S90L VP1（構築體#：4150）以及wt hCod GII.6/HS245/2010/USA VP2（構築體#：3307）的圓葉煙草葉製備的粗蛋白萃取物的31-35％碘克沙醇梯度部分純化的類病毒顆粒（VLP）的穿透式電子顯微照片（TEM）；放大15,000X；比例尺 = 200 nm。第 11A 圖
顯示了以下列浸潤後9天（DPI）從農桿菌浸潤的圓葉煙草葉製備的粗蛋白萃取物的考馬斯染色的SDS-PAGE：wt hCod GI.1/United States/Norwalk/1968 VP1（構築體#：2724；SEQ ID NO：3（核苷酸）；SEQ ID NO：1（胺基酸））、wt hCod GII.12/HS206/2010/USA VP1（構築體#：3995；SEQ ID NO：87（核苷酸）；SEQ ID NO：19（胺基酸））、mut hCod GII.12/HS206/2010/USA_E80S VP1（構築體#：4136；SEQ ID NO：89（核苷酸）；SEQ ID NO：88（胺基酸））、mut hCod GII.12/HS206/2010/USA_A90L VP1（構築體#：4137；SEQ ID NO：91（核苷酸）；SEQ ID NO：90（胺基酸））、或mut hCod GII.12/HS206/2010/USA_E80S+A90L VP1（構築體#：4138；SEQ ID NO：93（核苷酸）；SEQ ID NO：92（胺基酸））。第一泳道 = 從擬滲透的圓葉煙草葉中製備的粗蛋白萃取物。第 11B 圖
顯示了從圓葉煙草葉製備的粗蛋白萃取物的碘克沙醇密度梯度部分的考馬斯染色的SDS-PAGE分析，該圓葉煙草葉表現wt GII.12/HS206/2010/USA VP1（構築體#：3995）、GII.12/HS206/2010/USA_E80S VP1（構築體#：4136）、GII.12/HS206/2010/USA_A90L VP1（構築體#：4137）、或GII.12/HS206/2010/USA_E80S+A90L VP1（構築體#：4138）。第 11C 圖
顯示了從表現 wt GII.12/HS206/2010/USA VP1（構築體#：3995，第1膠圖）、GII.12/HS206/2010/USA_P80S VP1（構築體#：4136，第2膠圖）、GII.12/HS206/2010/USA_S90L VP1（構築體#：4137，第3膠圖）、或GII.12/HS206/2010/USA_P80S+S90L VP1（構築體#：4138，第4膠圖）的圓葉煙草葉製備的粗蛋白萃取物的31-35％碘克沙醇梯度部分純化的類病毒顆粒（VLP）的穿透式電子顯微照片（TEM）；放大15,000X；比例尺= 500 nm。第 11D 圖
顯示了從圓葉煙草葉製備的粗蛋白萃取物的碘克沙醇密度梯度部分的考馬斯染色的SDS-PAGE分析（各圖的上部）、以及從表現：左上圖：wt hCod GII.17 Kawa 2014 A0A077KVU6VP1（構築體# 3998；SEQ ID NO：25（核苷酸）；SEQ ID NO：24（胺基酸））；右上圖：mut hCod GII.17 Kawa 2014 A0A077KVU6_A90L VP1（構築體#4232；SEQ ID NO：197（核苷酸）；SEQ ID NO：196（胺基酸））；左下圖：mut hCod GII.17 Kawa 2014 A0A077KVU6_A39V VP1（構築體# 4234；SEQ ID NO：193（核苷酸）；SEQ ID NO：192（胺基酸））；右下圖：mut hCod GII.17 Kawa 2014 A0A077KVU6_R53I VP1（構築體# 4235；SEQ ID NO：195（核苷酸）；SEQ ID NO：194（胺基酸））的圓葉煙草葉製備的粗蛋白萃取物的31-35 ％碘克沙醇梯度部分純化的類病毒顆粒（VLP）的穿透式電子顯微照片（TEM）（各圖的下部）；放大15,000X；比例尺= 500 nm。第 12A 圖
顯示VP1 GI.1 United States Norwalk 1968的胺基酸序列（SEQ ID NO：1）；第 12B 圖
顯示野生型VP1 GI.1 United States Norwalk 1968的核酸序列（SEQ ID NO：2）；第 12C 圖
顯示hCod VP1 GI.1 United States Norwalk 1968的核酸序列（SEQ ID NO：3）。第 13A 圖
顯示VP1 G1.2 Leuven 2003 D2DEL3的胺基酸序列（SEQ ID NO：4）；第 13B 圖
顯示hCod VP1 G1.2 Leuven 2003 D2DEL3的核酸序列（SEQ ID NO：5）。第 14A 圖
顯示VP1 GI.3 LillaEdet 2008 H2DG70的胺基酸序列（SEQ ID NO：6）；第 14B 圖
顯示hCod GI.3 LillaEdet 2008 H2DG70的核酸序列（SEQ ID NO：7）。第 15A 圖
顯示VP1 GI.5 Siklos HUN5407 2013 HUN AHW99832的胺基酸序列（SEQ ID NO：12）。第 15B 圖
顯示hCod VP1 GI.5 Siklos HUN5407 2013 HUN AHW99832的核酸序列（SEQ ID NO：33）。第 16A 圖
顯示GI.7/GA5043/USA/2014 VP1的胺基酸序列（SEQ ID NO：101）。第 16B 圖
顯示GI.7/GA5043/USA/2014 VP1的核酸序列（SEQ ID NO：175）。第 16C 圖
顯示VP1 GII.1 Ascension 208 2010 USA AFA55174的胺基酸序列（SEQ ID NO：13）。第 17A 圖
顯示VP1 GII.2 CGMH47 2011 TW AGT39206的胺基酸序列（SEQ ID NO：14）。第 17B 圖
顯示hCod VP1 GII.2 CGMH47 2011 TW AGT39206的核酸序列（SEQ ID NO：40）。第 18A 圖
顯示VP1 GII.3 Jingzhou 2013402 CHN AGX01095的胺基酸序列（SEQ ID NO：15）。第 18B 圖
顯示hCod VP1 GII.3 Jingzhou 2013402 CHN AGX01095的核酸序列（SEQ ID NO：45）。第 19A 圖
顯示VP1 GII.4 Sydney NSW0514 2012的胺基酸序列（SEQ ID NO：16）。第 19B 圖
顯示hCod VP1 GII.4 Sydney NSW0514 2012的核酸序列（SEQ ID NO：52）。第 19C 圖
顯示VP1 US96：GII.4 Dresden 174 1997 DE AY741811的胺基酸序列（SEQ ID NO：27）。第 19D 圖
顯示VP1 FH02：GII.4 FarmingtonHills 2002 US AY502023的胺基酸序列（SEQ ID NO：28）。第 19E 圖
顯示VP1 Hnt04：GII.4 Hunter-NSW504D 2004 AU DQ078814的胺基酸序列（SEQ ID NO：29）。第 19F 圖
顯示VP1 2006b：GII.4 Shellharbour-NSW696T 2006 AU EF684915（GII.4 Shellharbour-NSW696T 2006 AU EF684915）的胺基酸序列（SEQ ID NO：30）。第 19G 圖
顯示VP1NO09：GII.4 Orange-NSW001P 2008 AU GQ845367的胺基酸序列（SEQ ID NO：31）。第 20 圖
顯示VP1 GII.5 Alberta 2013 CA ALT54485的胺基酸序列（SEQ ID NO：17）。第 21A 圖
顯示VP1 GII.6 Ohio 2012 M9T020的胺基酸序列（SEQ ID NO：20）。第 21B 圖
顯示hCod-最佳化的 VP1 GII.6 Ohio 2012 M9T020（SEQ ID NO：21）的核酸序列。第 22 圖
顯示VP1 GII.7 Musa 2010 AII73774的胺基酸序列（SEQ ID NO：18）。第 23A 圖
顯示VP1 GII.12_HS206_2010_USA_AEI29586的胺基酸序列（SEQ ID NO：19）；第 23B 圖
顯示hCod VP1 GII.12_HS206_2010_USA AEI29586（SEQ ID NO：87）的核酸序列。第 24A 圖
顯示VP1 GII.13 VA173 2010 H9AWU4的胺基酸序列（SEQ ID NO：22）。第 24B 圖
顯示人類密碼子最佳化的VP1 GII.13 VA173 2010 H9AWU4的核酸序列（SEQ ID NO：23）。第 25 圖
顯示VP1 GII.14 Saga 2008 JPN ADE28701的胺基酸序列（SEQ ID NO：32）。第 26A 圖
顯示VP1 GII.17 Kawa 2014 A0A077KVU6的胺基酸序列（SEQ ID NO：24）。第 26B 圖
顯示人類密碼子最佳化的VP1 GII.17 Kawa 2014 A0A077KVU6的核酸序列（SEQ ID NO：25）。第 27 圖
顯示VP1 GII.21 Sali 2011 USA AFC89665的胺基酸序列（SEQ ID NO：26）。第 28A 圖
顯示經修飾的VP1 GI.3_ Lil08_Q84S的胺基酸序列（SEQ ID NO：98）。第 28B 圖
顯示VP1 GI.3_Lil08_Q84S的核酸序列（SEQ ID NO：167）。第 28C 圖
顯示VP1 GI.3 Lil08_S94L的胺基酸序列（SEQ ID NO：8）。第 28D 圖
顯示hCod VP1 GI.3 Lil08_S94L的核酸序列（SEQ ID NO：9）。第 28E 圖
顯示VP1 GI.3 Lil08_Q84S+S94L的胺基酸序列（SEQ ID NO：10）。第 28F 圖
顯示hCod VP1 GI.3 Lil08_Q84S+S94L的核酸序列（SEQ ID NO：11）。第 28G 圖
顯示VP1 GI.3 Lil08_A43V+S94L的胺基酸序列（SEQ ID NO：170）。第 28H 圖
顯示hCod VP1 GI.3 Lil08_A43V+S94L的核酸序列（SEQ ID NO：169）。第 28I 圖
顯示VP1 GI.3 Lil08_M57I+S94L的胺基酸序列（SEQ ID NO：172）。第 28J 圖
顯示hCod VP1 GI.3 Lil08_M57I+S94L的核酸序列（SEQ ID NO：171）。第 28K 圖
顯示VP1 GI.3 Lil08_A43V+M57I+S94L的胺基酸序列（SEQ ID NO：174）。第 28L 圖
顯示hCod VP1 GI.3 Lil08_A43V+M57I+S94L的核酸序列（SEQ ID NO：173）。第 28M 圖
顯示VP1_GI.3_Lil08_S94X
的胺基酸序列（SEQ ID NO：292）；其中 X
是從V、I、M、T、E、D、N、Q、K、或H中選出。第 28N 圖
顯示人類密碼子最佳化的序列VP1_GI.3_Lil08_S94X（SEQ ID NO：293）；其中 X
是從編碼V（例如 XXX
=GTG）、I（例如 XXX
=ATC）、M（例如 XXX
=ATG）、T（例如 XXX
=ACC）、E（例如 XXX
=GAG）、D（例如 XXX
=GAC）、N（例如 XXX
=AAC）、Q（例如 XXX
=CAG）、K（例如 XXX
=AAG）、或H（例如 XXX
=CAC）的密碼子中選出。第 29A 圖
顯示經修飾的VP1 GI.5 Siklos Q84S的胺基酸序列（SEQ ID NO：34）。第 29B 圖
顯示經修飾的VP1 GI.5 Siklos Q84S的核酸序列（SEQ ID NO：35）。第 29C 圖
顯示VP1 GI.5 Siklos A94L的胺基酸序列（SEQ ID NO：36）。第 29D 圖
顯示hCod VP1 GI.5 Siklos A94L的核酸序列（SEQ ID NO：37）。第 29E 圖
顯示VP1 GI.5 Siklos Q84S+A94L的胺基酸序列（SEQ ID NO：38）。第 29F 圖
顯示hCod VP1 GI.5 Siklos Q84S+A94L的核酸序列（SEQ ID NO：39）。第 29G 圖
顯示經修飾的VP1 GI.7/GA5043/USA/2014_R84S的胺基酸序列（SEQ ID NO：177）。第 29H 圖
顯示經修飾的VP1 hCod GI.7/GA5043/USA/2014_R84S的核酸序列（SEQ ID NO：176）。第 29I 圖
顯示經修飾的VP1 GI.7/GA5043/USA/2014_M57I的胺基酸序列（SEQ ID NO：179）。第 29J 圖
顯示經修飾的VP1 hCod GI.7/GA5043/USA/2014_M57I的核酸序列（SEQ ID NO：178）。第 29K 圖
顯示經修飾的VP1GI.7/GA5043/USA/2014_M57I+R84S的胺基酸序列（SEQ ID NO：181）。第 29L 圖
顯示經修飾的VP1 hCod GI.7/GA5043/USA/2014_M57I+R84S的核酸序列（SEQ ID NO：180）。第 29M 圖
顯示VP1_GI.7/GA5043/USA/2014_M57X
的胺基酸序列（SEQ ID NO：290）；其中 X
是從 L、G、S、T、N、Q、K或H中選出。第 29N 圖
顯示人類密碼子最佳化的VP1_GI.7/GA5043/USA/2014_M57X（SEQ ID NO：291）；其中 X
是從編碼L（例如 XXX
=CTG）、G（例如 XXX
=GGC）、S（例如 XXX
=AGC）、T（例如 XXX
=ACC）、N（例如 XXX
=AAC）、Q（例如 XXX
=CAG）、K（例如 XXX
=AAG）、或H（例如 XXX
=CAC）的密碼子中選出。第 30A 圖
顯示VP1 GII.2 CGMH47 E80S的胺基酸序列（SEQ ID NO：85）。第 30B 圖
顯示hCod VP1 GII.2 CGMH47 E80S的核酸序列（SEQ ID NO：86）。第 30C 圖
顯示VP1 GII.2 CGMH47 A90L的胺基酸序列（SEQ ID NO：41）；第 30D 圖
顯示hCod VP1 GII.2 CGMH47 A90L的核酸序列（SEQ ID NO：42）。第 30E 圖
顯示VP1_GII.2_CGMH47_E80S+A90L的胺基酸序列（SEQ ID NO：43）。第 30F 圖
顯示hCod VP1_GII.2_CGMH47_E80S+A90L的核酸序列（SEQ ID NO：44）。第 30G 圖
顯示 VP1_GII.2_CGMH47_A39V+E80S+A90L的胺基酸序列（SEQ ID NO：182）。第 30H 圖
顯示hCod VP1_GII.2_CGMH47_ A39V+E80S+A90L的核酸序列（SEQ ID NO：183）。第 30I 圖
顯示VP1_GII.2_CGMH47_R53I+E80S+A90L的胺基酸序列（SEQ ID NO：184）。第 30J 圖
顯示hCod VP1_GII.2_CGMH47_ R53I+E80S+A90L的核酸序列（SEQ ID NO：185）。第 30K 圖
顯示VP1_GII.2_CGMH47_ A39V+R53I+E80S+A90L的胺基酸序列（SEQ ID NO：186）。第 30L 圖
顯示hCod VP1_GII.2_CGMH47_ A39V+R53I+E80S+A90L的核酸序列（SEQ ID NO：187）。第 31A 圖
顯示VP1 GII.3_Jing_E80S的胺基酸序列（SEQ ID NO：46）。第 31B 圖
顯示hCod VP1 GII.3_Jing_E80S的核酸序列（SEQ ID NO：47）。第 31C 圖
顯示VP1 GII.3_Jing_A90L的胺基酸序列（SEQ ID NO：48）。第 31D 圖
顯示hCod VP1 GII.3_Jing_A90L的核酸序列（SEQ ID NO：49）。第 31E 圖
顯示VP1 GII.3_Jing_E80S+A90L的胺基酸序列（SEQ ID NO：50）。第 31F 圖
顯示hCod VP1 GII.3_Jing_E80S+A90L的核酸序列（SEQ ID NO：51）。第 32A 圖
顯示VP1 GII.4 Syd12 A39V的胺基酸序列（SEQ ID NO：53）。第 32B 圖
顯示hCod VP1 GII.4_Syd12_A39V的核酸序列（SEQ ID NO：54）。第 32C 圖
顯示VP1 GII.4_Syd12_V47P的胺基酸序列（SEQ ID NO：55）。第 32D 圖
顯示hCod VP1 GII.4_Syd12_V47P的核酸序列（SEQ ID NO：56）。第 32E 圖
顯示VP1 GII.4_Syd12_R53I的胺基酸序列（SEQ ID NO：57）。第 32F 圖
顯示hCod VP1 GII.4_Syd12_R53I的核酸序列（SEQ ID NO：58）。第 32G 圖
顯示VP1 GII.4_Syd12_P80S的胺基酸序列（SEQ ID NO：59）。第 32H 圖
顯示hCod VP1 GII.4_Syd12_P80S的核酸序列（SEQ IDNO：60）。第 32I 圖
顯示VP1 GII.4_Syd12_S90L的胺基酸序列（SEQ ID NO：61）。第 32J 圖
顯示hCod VP1 GII.4_Syd12_S90L的核酸序列（SEQ IDNO：62）。第 32K 圖
顯示VP1GII.4_Syd12_Δ35-42的胺基酸序列（SEQ ID NO：63）。第 32L 圖
顯示hCod VP1GII.4_Syd12_Δ35-42的核酸序列（SEQ IDNO：64）。第 32M 圖
顯示VP1 GII.4_Syd12_SSTAVATA的胺基酸序列（SEQ ID NO：65）。第 32N 圖
顯示hCodVP1 GII.4_Syd12_SSTAVATA的核酸序列（SEQ ID NO：66）。第 32O 圖
顯示VP1GII.4_Syd12_P80S+A39V的胺基酸序列（SEQ ID NO：67）。第 32P 圖
顯示hCod VP1 GII.4_Syd12_P80S+A39V的核酸序列（SEQ ID NO：68）。第 32Q 圖
顯示VP1 GII.4_Syd12_P80S+V47P的胺基酸序列（SEQ ID NO：69）。第 32R 圖
顯示hCod VP1 GII.4_Syd12_P80S+V47P的核酸序列（SEQ ID NO：70）。第 32S 圖
顯示VP1GII.4_Syd12_P80S+R53I的胺基酸序列（SEQ ID NO：71）。第 32T 圖
顯示hCod VP1 GII.4_Syd12_P80S+R53I的核酸序列（SEQ ID NO：72）。第 32U 圖
顯示VP1 GII.4_Syd12_P80S+S90L的胺基酸序列（SEQ ID NO：73）。第 32V 圖
顯示hCod VP1 GII.4_Syd12_P80S+S90L的核酸序列（SEQ ID NO：74）。第 32W 圖
顯示VP1 GII.4_Syd12_P80S+Δ35-42的胺基酸序列（SEQ ID NO：75）。第 32X 圖
顯示hCod VP1 GII.4_Syd12_P80S+Δ35-42的核酸序列（SEQ ID NO：76）。第 32Y 圖
顯示VP1 GII.4_Syd12_P80S+SSTAVATA的胺基酸序列（SEQ ID NO：77）。第 32Z 圖
顯示hCod VP1 GII.4_Syd12_P80S+SSTAVATA的核酸序列（SEQ ID NO：78）。第 32AA 圖
顯示VP1 GII.4 Syd12 A39V+R53I的胺基酸序列（SEQ ID NO：188）。第 32BB 圖
顯示hCod VP1 GII.4_Syd12_A39V+R53I的核酸序列（SEQ ID NO：189）。第 32CC 圖
顯示VP1 GII.4 Syd12 A39V+R53I+P80S的胺基酸序列（SEQ ID NO：190）。第 32DD 圖
顯示hCod VP1 GII.4_Syd12_A39V+R53I+P80S的核酸序列（SEQ ID NO：191）。第 32EE 圖
顯示人類密碼子最佳化的VP1 GII.4_Syd12_P80X
的核酸序列（SEQ ID NO：287）；其中X
是從編碼A（例如 XXX
=GCC）、N（例如 XXX
=AAC）、K（例如 XXX
=AAG）、或H（例如 XXX
=CAC）的密碼子中選出。第 32FF 圖
顯示VP1_GII.4_Syd12_P80X
的胺基酸序列（SEQ ID NO：286）；其中 X
是從A、N、K、或H中選出。第 32GG 圖
顯示人類密碼子最佳化序列VP1 GII.4_Syd12_P80S+A39X
的核酸序列（SEQ ID NO：289）；其中X
是從編碼I（例如 XXX
=ATC）、M（例如 XXX
=ATG）、G（例如 XXX
=GGC）、S（例如 XXX
=AGC）、E（例如 XXX
=GAG）、D（例如 XXX
=GAC）、N（例如 XXX
=AAC）、Q（例如 XXX
=CAG）、K（例如 XXX
=AAG）、或H（例如 XXX
=CAC）的密碼子中選出。第 32HH 圖
顯示VP1_GII.4_Syd12_P80S+A39X
的胺基酸序列（SEQ ID NO：288）；其中 X
是從I、M、G、S、E、D、N、Q、K、或H中選出。第 33A 圖
顯示VP1 GII.6_Ohio_E80S的胺基酸序列（SEQ ID NO：79）。第 33
B圖
顯示hCod VP1 GII.6_Ohio_E80S的核酸序列（SEQ ID NO：80）。第 33C 圖
顯示VP1 GII.6_Ohio_S90L的胺基酸序列（SEQ ID NO：81）。第 33D 圖
顯示hCod VP1 GII.6_Ohio_S90L的核酸序列（SEQ ID NO：82）。第 33E 圖
顯示VP1 GII.6_Ohio_E80S+S90L的胺基酸序列（SEQ ID NO：83）。第 33F 圖
顯示hCod VP1 GII.6_Ohio_E80S+S90L的核酸序列（SEQ ID NO：84）。第 34A 圖
顯示VP1 GII.12_HS10_E80S的胺基酸序列（SEQ ID NO：88）。第 34B 圖
顯示hCod VP1 GII.12_HS10_E80S的核酸序列（SEQ ID NO：89）。第 34C 圖
顯示VP1 GII.12_HS10_A90L的胺基酸序列（SEQ ID NO：90）。第 34D 圖
顯示hCod VP1 GII.12_HS10_A90L的核酸序列（SEQ ID NO：91）。第 34E 圖
顯示VP1 GII.12_HS10_E80S+A90L的胺基酸序列（SEQ ID NO：92）；第 34F 圖
顯示hCod VP1 GII.12_HS10_E80S+A90L的核酸序列（SEQ ID NO：93）。第 34G 圖
顯示VP1 GII.17 Kawa 2014 A0A077KVU6_A39V的胺基酸序列（SEQ ID NO：192）。第 34H 圖
顯示VP1 hCod GII.17 Kawa 2014 A0A077KVU6_A39V的核酸序列（SEQ ID NO：193）。第 34I 圖
顯示VP1GII.17 Kawa 2014 A0A077KVU6_R53I的胺基酸序列（SEQ ID NO：194）。第 34J 圖
顯示VP1 hCod GII.17 Kawa 2014 A0A077KVU6_R53I的核酸序列（SEQ ID NO：195）。第 34K 圖
顯示VP1GII.17 Kawa 2014 A0A077KVU6_A90L的胺基酸序列（SEQ ID NO：196）。第 34L 圖
顯示VP1 hCod GII.17 Kawa 2014 A0A077KVU6_A90L的核酸序列（SEQ ID NO：197）。第 34M 圖
顯示VP1GII.17 Kawa 2014 A0A077KVU6_A39V+M53I的胺基酸序列（SEQ ID NO：198）。第 34N 圖
顯示VP1 hCod GII.17 Kawa 2014 A0A077KVU6_A39V+M53I的核酸序列（SEQ ID NO：199）。第 34O 圖
顯示VP1GII.17 Kawa 2014 A0A077KVU6_E80S+A90L的胺基酸序列（SEQ ID NO：200）。第 34P 圖
顯示VP1 hCod GII.17 Kawa 2014 A0A077KVU6_E80S+A90L的核酸序列（SEQ ID NO：201）。第 35A 圖
顯示VP2_GI.1_Norwalk的胺基酸序列（SEQ ID NO：99）。第 35B 圖
顯示人類密碼子最佳化的VP.2_GI1_Norwalk的核酸序列（SEQ ID NO：100）。第 36A 圖
顯示VP2_GI.3_Lil08的胺基酸序列（SEQ ID NO：94）。第 36B 圖
顯示人類密碼子最佳化的VP2_GI.3_Lil08的核酸序列（SEQ ID NO：95）。第 37A 圖
顯示VP2_GII.6_HS10的胺基酸序列（SEQ ID NO：96）。第 37B 圖
顯示人類密碼子最佳化的VP2_GII6_HS10的核酸序列（SEQ ID NO：97）。第 38A 圖
顯示了從左至右T-DNA的選殖載體1190（SEQ ID NO：162）。第 38B 圖
顯示了從2X35S啟動子至NOS終止子的構築體2724（SEQ ID NO：163）。第 38C 圖
顯示了從左至右T-DNA的選殖載體3677（SEQ ID NO：164）。第 38D 圖
顯示了從2X35S啟動子至NOS終止子的構築體4133（SEQ ID NO：165）。第 38E 圖
顯示了從2X35S啟動子至NOS終止子的構築體4135（SEQ ID NO：166）。第 39A 圖
顯示構築體2724（VP1 Wt GI.1 hCod）的示意圖。第 39B 圖
顯示構築體3300（VP1 Wt GI.2 hCod）的示意圖。第 39C 圖
顯示構築體3979（VP1 Wt GI.3 hCod）的示意圖。第 40A 圖
顯示構築體4140 （VP1 GI.3_Q84S hCod）的示意圖。第 40B 圖
顯示構築體4141（VP1 GI.3_S94L hCod）的示意圖。第 40C 圖
顯示構築體4142（VP1 GI.3_P84S+S94L hCod）的示意圖。第 40D 圖
顯示構築體4179（VP1 GI.3_A43V+S94L hCod）的示意圖。第 40E 圖
顯示構築體4180（VP1 GI.3_M57I+S94L hCod）的示意圖。第 40F 圖
顯示構築體4181（VP1 GI.3_A43V+M57I+S94L hCod）的示意圖。第 41A 圖
顯示構築體3980（VP1 Wt GI.5 hCod（Wt GI.5 hCod））的示意圖。第 41B 圖
顯示構築體4130（VP1 GI.5_Q84S）的示意圖。第 41C 圖
顯示構築體4131（VP1 GI.5_A94L hCod）的示意圖。第 41D 圖
顯示構築體4132（VP1 GI.5_Q84S+A94L hCod）的示意圖。第 41E 圖
顯示構築體4210（VP1 GI.7_R84S hCod）的示意圖。第 41F 圖
顯示構築體4217（VP1 GI.7_M57I hCod）的示意圖。第 41G 圖
顯示構築體4218（VP1 GI.7_M57I+R84S hCod）的示意圖。第 42A 圖
顯示構築體3982（Wt VP1 GII.2 hCod）的示意圖。第 42B 圖
顯示構築體4143（VP1 GII.2_E80S）的示意圖。第 42C 圖
顯示構築體4144（VP1 GII.2_A90L hCod）的示意圖。第 42D 圖
顯示構築體4145（VP1 GII.2_E80S+A90L hCod）的示意圖。第 42E 圖
顯示構築體4182（VP1 GII.2_A39V+E80S+A90L hCod）的示意圖。第 42F 圖
顯示構築體4183（VP1 GII.2_R53I+E80S+A90L hCod）的示意圖。第 42G 圖
顯示構築體4184（VP1 GII.2_A39V+R53I+E80S+A90L hCod）的示意圖。第 43A 圖
顯示構築體3983（Wt VP1 GII.3 hCod）的示意圖。第 43B 圖
顯示構築體4146（VP1 GII.3_E80S hCod）的示意圖。第 43C 圖
顯示構築體4147（VP1 GII.3_A90L hCod）的示意圖。第 43D 圖
顯示構築體4148（VP1 GII.3_E80S+A90L）的示意圖。第 44A 圖
顯示構築體3760（Wt VP1 GII.4 hCod）的示意圖。第 44B 圖
顯示構築體4155（VP1 GII.4_A39V hCod）的示意圖。第 44C 圖
顯示構築體4156（VP1 GII.4_V47P hCod）的示意圖。第 44D 圖
顯示構築體4157（VP1 GII.4_R53I hCod）的示意圖。第 44E 圖
顯示構築體4133（VP1 GII.4_P80S hCod）的示意圖。第 44F 圖
顯示構築體4134（VP1 GII.4_S90L hCod）的示意圖。第 44G 圖
顯示構築體4158（VP1 GII.4_ Δ35-42 hCod）的示意圖。第 44H 圖
顯示構築體4159（VP1 GII.4_SSTAVATA hCod）的示意圖。第 44I 圖
顯示構築體4165（VP1 GII.4_A39V+P80S hCod）的示意圖。第 44J 圖
顯示構築體4166（VP1 GII.4_V47P+P80S hCod）的示意圖。第 44K 圖
顯示構築體4167（VP1 GII.4_R53I+P80S hCod）的示意圖。第 44L 圖
顯示構築體4135（VP1 GII.4_P80S+S90L hCod）的示意圖。第 44M 圖
顯示構築體4168（GII.4_ P80S+Δ35-42 hCod）的示意圖。第 44N 圖
顯示構築體4169（VP1 GII.4_P80S+SSTAVATA hCod）的示意圖。第 44O 圖
顯示構築體4185（VP1 GII.4_A39V+R53I hCod）的示意圖。第 44P 圖
顯示構築體4186（VP1 GII.4_A39V+R53I+P80S hCod）的示意圖。第 45A 圖
顯示構築體3993（Wt VP1 GII.6 hCod）的示意圖。第 45B 圖
顯示構築體4149（VP1 GII.6_E80S hCod）的示意圖。第 45C 圖
顯示構築體4150（VP1 GII.6_S90L hCod）的示意圖。第 45D 圖
顯示構築體4151（VP1 GII.6_E80S+S90L）的示意圖。第 46A 圖
顯示構築體3995（Wt VP1 GII.12 hCod）的示意圖。第 46B 圖
顯示構築體4136（VP1 GII.12_E80S hCod。第 46C 圖
顯示構築體4137（VP1 GII.12_A90L hCod）的示意圖。第 46D 圖
顯示構築體4138（VP1 GII.12_E80S+A90L）的示意圖。第 46E 圖
顯示構築體4234（VP1 GII.17_A39V）的示意圖。第 46F 圖
顯示構築體4235（VP1 GII.17_R53I）的示意圖。第 46G 圖
顯示構築體4232（VP1 GII.17_ A90L）的示意圖。第 46H 圖
顯示構築體4236（VP1 GII.17_A39V+R53I）的示意圖。第 46I 圖
顯示構築體4233（VP1 GII.17_E80S+A90L）的示意圖。第 47A 圖
顯示構築體2725（Wt VP2 GI.1）的示意圖。第 47B 圖
顯示構築體3303（Wt VP2 GI.3 hCod）的示意圖。第 47C 圖
顯示構築體3307（Wt VP2 GII.6）的示意圖。第 48 圖
顯示構築體1190（選殖載體1190）的示意圖。第 49 圖
顯示構築體3677（選殖載體3677）的示意圖。第 50A 圖
顯示GII.4 P80X構築體（選殖載體）的示意圖，其中X是選自：A（構築體4281）；N（構築體4285）；K（構築體4286）；或H（構築體4287）。第 50B 圖
顯示GII.4 P80s+A39X 構築體（選殖載體）的示意圖，其中X是選自I（構築體4256）；M（構築體4257）；G（構築體4258）；S（構築體4259）；E（構築體4260）；D（構築體4261）；N（構築體4262）；Q（構築體4263）；K（構築體4264）；或H（構築體4265）。第 51 圖
顯示GI.7 M57X構築體（選殖載體）的示意圖，其中X是選自：L（構築體4266）；G（構築體4268）；S（構築體4269）；T（構築體4270；N（構築體4273）；Q（構築體4274）；K（構築體4275）；or H（構築體4276）。第 52 圖
顯示GI.3 S94X構築體（選殖載體）的示意圖，其中X是選自：V（構築體4288）；I（構築體4289）；M（構築體4290）；T（構築體4292）；E（構築體4293）；D（構築體4294）；N（構築體4295）；Q（構築體4296）；K（構築體4297）；或H（構築體4298）。
ORF:開讀框
UTR:非轉譯區
VP1、VP2:殼體蛋白
Claims (76)
- 一種重組多核苷酸，包括編碼一諾羅病毒VP1的一核苷酸序列，該諾羅病毒VP1包括， 在從與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸43、57、84以及94序列比對的多個胺基酸中選出的一位置處的一個或多於一個取代， 與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸39至46序列比對的一胜肽片段的一缺失， 與諾羅病毒VP1基因型GI.1序列比對的胺基酸39至46被修飾為一序列SSTAVATA，或 其組合，以及 該核苷酸序列不是從一基因型GI.1諾羅病毒VP1取得。
- 如請求項1所述的重組多核苷酸，其中該核苷酸序列得自從由基因型GI.3、GI.5、GI.7、GII.2、GII.3、GII.4、GII.6、GII.12以及GII.17組成的一群組選出的一諾羅病毒VP1。
- 如請求項1所述的重組多核苷酸，其中在與胺基酸43序列比對的該位置處的該一個或多於一個取代為纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、蘇胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、離胺酸、或組胺酸。
- 如請求項1所述的重組多核苷酸，其中在與胺基酸57序列比對的該位置處的該一個或多於一個取代為異白胺酸、白胺酸、纈胺酸、丙胺酸、甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、離胺酸、或組胺酸。
- 如請求項1所述的重組多核苷酸，其中在與胺基酸84序列比對的該位置處的該一個或多於一個取代為絲胺酸、天冬醯胺、半胱胺酸、蘇胺酸、丙胺酸、離胺酸、或組胺酸。
- 如請求項1所述的重組多核苷酸，其中在與胺基酸94序列比對的該位置處的該一個或多於一個取代為白胺酸、異白胺酸、甲硫胺酸、纈胺酸、蘇胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、離胺酸、組胺酸。
- 如請求項1所述的重組多核苷酸，其中該核苷酸序列的該密碼子使用是針對人類密碼子使用、一增加的GC含量或其組合而被最佳化。
- 如請求項1所述的重組多核苷酸，其中該多核苷酸包括一載體。
- 一種由如請求項1至8中任一所述的重組多核苷酸編碼的諾羅病毒VP1蛋白。
- 一種類病毒顆粒（VLP），其包括如請求項9所述的諾羅病毒VP1。
- 如請求項10所述的類病毒顆粒（VLP），更包括一諾羅病毒VP2蛋白。
- 一種在一植物、一植物的部分、或一植物細胞中產生一諾羅病毒VP1蛋白的方法，包括： 引入如請求項1至8中任一所述的重組多核苷酸；以及 在允許該諾羅病毒VP1蛋白的表現的條件下培養該植物、該植物的部分、或該植物細胞。
- 如請求項12所述的方法，其中該方法更包括收穫該植物、該植物的部分、或該植物細胞的一步驟。
- 如請求項13所述的方法，其中該方法更包括從該植物、該植物的部分或該植物細胞中萃取、純化、或萃取並純化該諾羅病毒VP1蛋白的一步驟。
- 一種由如請求項13或14所述的方法產生的諾羅病毒VP1蛋白。
- 如請求項12所述的方法，其中，在引入的步驟中，編碼一諾羅病毒VP2蛋白的一第二多核苷酸被引入該植物、該植物的部分或該植物細胞中，以及在培養的步驟中，該條件允許在該植物、該植物的部分或該植物細胞中該諾羅病毒VP1蛋白以及該諾羅病毒VP2蛋白兩者的共同表現以及共同產生。
- 如請求項16所述的方法，其中該方法更包括收穫該植物、該植物的該部分、或該植物細胞的一步驟。
- 如請求項17所述的方法，其中該方法更包括萃取、純化、或萃取並純化該諾羅病毒VP1蛋白以及該諾羅病毒VP2蛋白的一步驟。
- 一種在一植物、一植物的部分、或一植物細胞中產生一諾羅病毒類病毒顆粒（VLP）的方法，包括： 引入如請求項1至8中任一所述的重組多核苷酸；以及 在允許該諾羅病毒VLP的表現的條件下培養該植物、該植物的部分、或該植物細胞。
- 如請求項19所述的方法，其中該方法更包括收穫該植物、該植物的部分、或該植物細胞的一步驟。
- 如請求項20所述的方法，其中該方法更包括從該植物、該植物的該部分或該植物細胞中萃取、純化、或萃取並純化該諾羅病毒VLP的一步驟。
- 一種由如請求項21所述的方法產生的諾羅病毒VLP。
- 如請求項19所述的方法，其中，在引入的步驟中，編碼一諾羅病毒VP2蛋白的一第二多核苷酸被引入該植物、該植物的該部分或該植物細胞中，以及在培養的步驟中，該條件允許在該植物、該植物的部分或該植物細胞中該諾羅病毒VP1蛋白以及該諾羅病毒VP2蛋白兩者的共同表現以及共同產生。
- 如請求項23所述的方法，其中該方法更包括收穫該植物、該植物的該部分、或該植物細胞的一步驟。
- 如請求項24所述的方法，其中該方法更包括從該植物、該植物的該部分、或該植物細胞中萃取、純化、或萃取並純化一類病毒顆粒（VLP）的一步驟，其中該VLP包括該諾羅病毒VP1蛋白以及該諾羅病毒VP2蛋白。
- 一種類病毒顆粒（VLP），其包括由如請求項25所述的方法產生的該諾羅病毒VP1蛋白以及該諾羅病毒VP2蛋白。
- 一種產生一抗體或一抗體片段的方法，包括將如請求項9所述的諾羅病毒VP1蛋白投予一受試者或一宿主動物，藉以產生該抗體或該抗體片段。
- 一種產生一抗體或一抗體片段的方法，包括將如請求項15所述的諾羅病毒VP1蛋白投予一受試者或一宿主動物，藉以產生該抗體或該抗體片段。
- 一種產生一抗體或一抗體片段的方法，包括將如請求項10所述的VLP投予一受試者或一宿主動物，藉以產生該抗體或該抗體片段。
- 一種產生一抗體或一抗體片段的方法，包括將如請求項11所述的VLP投予一受試者或一宿主動物，藉以產生該抗體或該抗體片段。
- 一種產生一抗體或一抗體片段的方法，包括將如請求項22所述的VLP投予一受試者或一宿主動物，藉以產生該抗體或該抗體片段。
- 一種產生一抗體或一抗體片段的方法，包括將如請求項26所述的VLP投予一受試者或一宿主動物，藉以產生該抗體或該抗體片段。
- 該植物的部分、或植物細胞，包括如請求項9所述的諾羅病毒VP1蛋白。
- 該植物的部分、或植物細胞，包括如請求項14或15所述的諾羅病毒VP1蛋白。
- 該植物的部分、或植物細胞，包括如請求項10所述的VLP。
- 該植物的部分、或植物細胞，包括如請求項11所述的VLP。
- 該植物的部分、或植物細胞，包括如請求項19或20所述的VLP。
- 該植物的部分、或植物細胞，包括如請求項23或24所述的VLP。
- 該植物的部分、或植物細胞，包括如請求項1所述的重組多核甘酸。
- 一種植物萃取物，包括由如請求項14所述的方法產生的該諾羅病毒VP1蛋白。
- 一種植物萃取物，包括由如請求項18所述的方法產生的該諾羅病毒VP1。
- 一種植物萃取物，包括由如請求項21所述的方法產生的該諾羅病毒VLP。
- 一種植物萃取物，包括由如請求項25所述的方法產生的該諾羅病毒VLP。
- 一種用於誘導一免疫反應的組成物，該組成物包括一有效劑量的如請求項9所述的VLP、以及一藥學上可接受的載體、佐劑、媒介物或賦形劑。
- 一種用於誘導一免疫反應的組成物，該組成物包括一有效劑量的如請求項10所述的VLP、以及一藥學上可接受的載體、佐劑、媒介物或賦形劑。
- 一種用於誘導一免疫反應的組成物，該組成物包括一有效劑量的如請求項11所述的VLP、以及一藥學上可接受的載體、佐劑、媒介物或賦形劑。
- 一種用於誘導一免疫反應的組成物，該組成物包括一有效劑量的如請求項15所述的VLP、以及一藥學上可接受的載體、佐劑、媒介物或賦形劑。
- 一種用於誘導一免疫反應的組成物，該組成物包括一有效劑量的如請求項22所述的VLP、以及一藥學上可接受的載體、佐劑、媒介物或賦形劑。
- 一種用於誘導一免疫反應的組成物，該組成物包括一有效劑量的如請求項26所述的VLP、以及一藥學上可接受的載體、佐劑、媒介物或賦形劑。
- 一種用於誘導一免疫反應的疫苗，該疫苗包括一有效劑量的如請求項9所述的諾羅病毒VP1蛋白。
- 一種用於誘導一免疫反應的疫苗，該疫苗包括一有效劑量的如請求項10所述的VLP。
- 一種用於誘導一免疫反應的疫苗，該疫苗包括一有效劑量的如請求項11所述的VLP。
- 一種用於誘導一免疫反應的疫苗，該疫苗包括一有效劑量的如請求項15所述的諾羅病毒VP1蛋白。
- 一種用於誘導一免疫反應的疫苗，該疫苗包括一有效劑量的如請求項22所述的VLP。
- 一種用於誘導一免疫反應的疫苗，該疫苗包括一有效劑量的如請求項26所述的VLP。
- 一種藉由將如請求項9所述的諾羅病毒VP1蛋白投予一受試者或一宿主動物所製備的抗體或抗體片段。
- 一種藉由將如請求項15所述的諾羅病毒VP1蛋白投予一受試者或一宿主動物所製備的抗體或抗體片段。
- 一種藉由將如請求項10所述的VLP投予一受試者或一宿主動物所製備的抗體或抗體片段。
- 一種藉由將如請求項22所述的VLP投予一受試者或一宿主動物所製備的抗體或抗體片段。
- 一種藉由將如請求項22所述的VLP投予一受試者或一宿主動物所製備的抗體或抗體片段。
- 一種藉由將如請求項26所述的VLP投予一受試者或一宿主動物所製備的抗體或抗體片段。
- 一種用於在一受試者中誘導對一諾羅病毒感染的免疫性的方法，該方法包括向該受試者投予如請求項10所述的VLP。
- 一種用於在一受試者中誘導對一諾羅病毒感染的免疫性的方法，該方法包括向該受試者投予如請求項11所述的VLP。
- 一種用於在一受試者中誘導對一諾羅病毒感染的免疫性的方法，該方法包括向該受試者投予如請求項22所述的VLP。
- 一種用於在一受試者中誘導對一諾羅病毒感染的免疫性的方法，該方法包括向該受試者投予如請求項26所述的VLP。
- 如請求項62所述的方法，其中該VLP是以口服、鼻內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、直腸或陰道內地被投予該受試者。
- 如請求項63所述的方法，其中該VLP是以口服、鼻內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、直腸或陰道內地被投予該受試者。
- 如請求項64所述的方法，其中該VLP是以口服、鼻內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、直腸或陰道內地被投予該受試者。
- 如請求項65所述的方法，其中該VLP是以口服、鼻內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、直腸或陰道內地被投予該受試者。
- 一種經修飾的諾羅病毒VP1，包括： 在從與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸43、57、84以及94序列比對的多個胺基酸中選出的一位置處的一個或多於一個取代， 與諾羅病毒VP1基因型GI.1（SEQ ID NO：1）的胺基酸39至46序列比對的一胜肽片段的一缺失， 與諾羅病毒VP1基因型GI.1序列比對的胺基酸39至46被修飾為一序列SSTAVATA，或 其組合。
- 一種類病毒顆粒（VLP），其包括如請求項70所述的諾羅病毒VP1。
- 一種用於誘導一免疫反應的組成物，該組成物包括一有效劑量的如請求項71所述的VLP、以及一藥學上可接受的載體、佐劑、媒介物或賦形劑。
- 一種用於誘導一免疫反應的疫苗，該疫苗包括一有效劑量的如請求項72所述的組成物。
- 如請求項73所述的疫苗，其中該疫苗是一種單價疫苗、一種二價疫苗、一種三價疫苗、或一種四價疫苗。
- 一種用於在一受試者中誘導對一諾羅病毒感染的免疫性的方法，該方法包括向該受試者投予如請求項72所述的組成物。
- 一種用於在一受試者中誘導對一諾羅病毒感染的免疫性的方法，該方法包括向該受試者投予如請求項74所述的組成物。
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