KR20010006468A - 식물의 지방산 에폭시게나제 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

식물의 지방산 에폭시게나제 유전자 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 지방산 에폭시게나제 효소를 암호화하는 신규의 유전자 서열에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 혼합 작용성 모노옥시게나제 효소를 포함하여 지방산 △12-에폭시게나제 효소를 암호화하는 유전적 서열에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 본 발명은 식물의 지방산 에폭시게나제, 바람직하게는 크레피스 팔라에스티나 (Crepis palaestina) △12-에폭시게나제를 암호화하는 cDNA 서열을 제공한다. 본 발명에서 유전자 서열이란 효모, 곰팡이, 박테리아, 곤충, 조류, 포유류, 및 식물등의 유기체에서 지방산 대사가 변형되거나 유전조작되어, 특히 불포화 지방산을 에폭시 형성된 지방산으로 전환시키는 것을 의미한다. 또한, 본 발명은 대상 유전자 서열에 의해 형질전환되고 유전학적으로 변형되어 오일을 축적하는 유기체 및 이 유기체로부터 유래된 오일까지도 포함한다. 본 발명에 따라 생성된 오일은 여러가지 용도중에서도 코팅, 수지, 접착제, 플라스틱류, 계면활성제 및 윤활제를 생산하는 데 있어서 요구되는 저렴한 비용의 원료 물질로서 사용된다.

Description

식물의 지방산 에폭시게나제 유전자 및 이의 용도{PLANT FATTY ACID EPOXYGENASE GENES AND THEREFOR}
재생불가능한 석유화학물질이 아닌 재생 가능한 식물 공급원으로부터 산업적으로 이용할 수있는 화학적 원료로서 지방산을 생성하려는 아이디어는 전세계적으로 상당한 관심을 끌어왔다. 이러한 개념은 자원보존면에서 제조업자와 소비자들에게 흥미있는 것으로서 농업분야에서 새로운 산업 작물을 개발하는 데 의미있는 기회를 제공한다.
자연에는 비일반적인 다양한 지방산군이 있으며, 이들은 그 특성이 매우 잘 규명되어 있다(Badam ＆ Patil, 1981: Smith, 1970). 이러한 비일반적인 많은 지방산들은 산업적으로 이용할 수 있는 잠재 가능성을 지니므로 이 화합물을 잘 처리하므로써 특정 지방산을 농업적으로 생산가능케하고자 하는 데 많은 관심이 고조되고 있다.
특정 목적의 지방산 한 부류로는 에폭시-지방산을 들수있는데, 이 지방산은 두개의 인접한 탄소 결합이 에폭시 다리로 결합되는 아실 사슬로 구성된 것이다. 이것은 반응성이 높기 때문에 코팅, 수지, 접착제, 플라스틱류, 계면활성제 및 윤활제를 생산하는 데에 널리 사용되고 있다. 또한 이들 지방산은 현재 식물성유(주로 대두유 및 아미인유)를 화학적으로 에폭시화시켜 생성하고 있다. 하지만, 이 생산 방법은 다수의 이성화 형태의 혼합물을 생성하기 때문에 공정 원가를 상당히 증가시킨다.
에폭시 지방산을 함유하는 일부 야생 식물(Euphorbia lagascae, Vernonia galmensis)을 상기 오일의 상업적 공급원으로 개발하려는 시도가 여러사람들에 의해 행해져왔다. 그러나, 경작 적합성 및 저수율 문제로 인하여 통상적인 식물 재배 및 경작법을 상업적으로 이용할 수 없다.
재조합 DNA 기술이 나날이 급속하게 고도화됨으로 인해 제1의 유기체 또는 종으로부터 분리한 유전자를 제2 유기체 또는 종중에서 형질발현하여 거기에 신규의 표현형을 부여하므로써 상업적으로 중요한 산업 공정들의 효율을 크게 개선하고 있다. 특히, 종래의 산업공정을 보다 더 효율적이게 하고, 비용면에서 절감을 가져오게 하므로써 재조합 DNA기술에 의한 유니트 비용당 수율을 높아지게 하였다.
또한, 목적하는 유전자 서열을 발현하는데 숙주 유기체를 적절히 선택하므로써 일반적으로 생성되지 않거나 또는 숙주에 의해 합성되지 않았던 화합물을 고수율 및 고순도로 생성할 수 있다.
하지만, 이러한 재조합 DNA 기술이 가진 일반적인 효율성에도 불구하고, 지방산 대사에서 중요한 효소를 암호화하는 유전자 서열을 분리하는 것, 특히 다른 그 어떤 것중에서도 12, 13-에폭시-9-옥타데센산(베르놀산) 및 12, 13-에폭시-9,15-옥타데카디에노산을 생성하는 데 관여하는 지방산 △12-에폭시게나제 효소를 암호화하는 유전자 서열을 분리하는 것은 이들 지방산을 생성하는 유전공학적으로 변형된 유기체를 개발하는 데 있어서 주된 장애요인으로 남아있다.
본 발명 이전에는 지방산 에폭시게나제 효소, 특히 △12-에폭시게나제의 특성을 나타내는 제한된 생화학적 데이터만이 있었다. 그러나, 유포비아 라가스케중에서 12, 13-에폭시-9-옥타데세논산(베르놀산)의 생성은 시토크롬-P450-의존성 △12 에폭시게나제 효소에 의해 촉진화되는 것으로 추정되었다(Bafor 등, 1993; Blee 등, 1994). 또한, 아마인유 식물의 종자를 개발하면 내인성 △15 탈포화 효소(desaturase)에 의해 첨가된 베르놀산이 12, 13-에폭시-9,15-옥타데카디엔산으로 전환시키는 역량이 높아진다(Engeseth 및 Stymne, 1996). 그리고 에폭시-지방산은 퍼옥시드-의존성 퍼옥시게나제에 의해 식물조직에서 생성될 수있다(Blee 및 Schuber, 1990).
본 발명이 탄생하기 까지의 연구과정에서 본 발명가들은 12,13-에폭시-9-옥타데카세논산(베르놀산) 또는 12, 13-에폭시-9,15-옥타데카디엔산 등의 에폭시 지방산을 생성하는 중요한 유전자를 암호화하는 유전자 서열을 분리한 뒤 이들 유전적 서열을 고도의 생산성을 갖는 상업적 오일 종자 식물 및/또는 다른 오일 축적 유기체내로 이전하는 방법을 모색해왔다.
본 발명은 지방산 에폭시게나제 효소를 암호화하는 신규의 유전자 서열에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 본 명세서를 통해 정의되는 지방산 △12-에폭시게나제 효소를 암호화하는 유전적 서열에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 본 발명은 식물의 지방산 에폭시게나제, 바람직하게는 크레피스 팔라에스티나(Crepis palaestina) 또는 유포비아 라가스케(Euphorbia lagascae) △12-에폭시게나제를 암호화하는 cDNA 및 게놈성 유전자 서열에 관한 것이다. 본 발명에서 유전자 서열이란 효모, 곰팡이, 박테리아, 곤충, 조류, 포유류, 및 식물등의 유기체에서 지방산 대사가 변형되거나 유전조작되어, 특히 불포화 지방산을 에폭시 형성된 지방산으로 전환시키는 것을 의미한다. 또한, 본 발명은 대상 유전자 서열에 의해 형질전환되고 유전학적으로 변형되어 오일을 축적하는 유기체 및 이 유기체로부터 유래된 오일까지도 포함한다. 본 발명에 따라 생성된 오일은 여러가지 용도중에서도 코팅, 수지, 접착제, 플라스틱류, 계면활성제 및 윤활제를 생산하는 데 있어서 요구되는 저렴한 비용의 원료 물질로서 사용된다.
발명의 상세한 설명 및 청구범위를 후술하는 데 있어서, 특별한 언급이 없는 한 "포함한다" 또는 "포함하는" 또는 "포함하여"는 해당부분에서 명시한 것 또는 명시한 그룹의 것 뿐아니라 임의의 다른 것 또는 다른 그룹도 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
본 명세서에서 언급되는 저자들의 문헌에 관한 서지적 사항은 이 명세서의 발명의 상세한 설명 끝부분에 기술하였다. 또한 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열에서의 서열 동정 번호(서열 번호)는 이 서지적 사항 이후에 정의되었다.
도 1은 절두형 내핀 프로모터(FP1; 우측 빗금친 박스)의 조절하에 작동하게 배치되고 NOS 종지인자 서열(우측 점각된 박스)의 상류에 배치된 에폭시게나제 구조 유전자를 포함하는 발현 플라스미드의 선형도이다. 이 에폭시게나제 유전자 서열은 우측의 빈 직사각형 박스로 표시한 것이다. 또한, 이 작제물은 NPTII 유전자(좌측 빈 박스)의 발현을 유도하고 NOS 종지인자(좌측 점각된 박스)의 상류에 배치된 NOS 프로모터(좌측 빗금친 박스)를 포함한다. 또한, 아그로박테리움 튜머페이션스(Agrobacterium tumefaciens)의 좌측 및 우측 경계 서열도 표시되어 있다.
도 2는 크레피스 팔라에스티나(Crepis palaestina)의 에폭시게나제 폴리펩티드의 아미노산 서열(Cpa12; 서열 번호 2), 베르놀산을 다량으로 생성하는 씨. 팔라에스티나 이외의 다른 크레피스 종 유래의 제2 에폭시게나제의 아미노산 서열(CrepX; 서열 번호 4), 베르노니아 갈라멘시스(Vernonia galamensis) 유래의 에폭시게나제 폴리펩티드의 부분 아미노산 서열(Vgal1; 서열 번호 6), 크레피스 알피나 유래의 △12 아세틸레나제의 아미노산 서열(Crep1; 서열 번호 8), 에이. 탈리아의 △12 탈포화 효소의 아미노산 서열(L26296; 서열 번호 9), 브라시카 준세아(Brassica juncea)의 △12 탈포화 효소의 아미노산 서열(X91139; 서열 번호 10), 글리신 막스(Glycine max)의 △12 탈포화 효소의 아미노산 서열(L43921; 서열 번호 11), 솔라넘 컴머소니(Solanum commersonii)의 △12 탈포화 효소의 아미노산 서열(X92847; 서열 번호 12) 및 글리신 막스의 △12 탈포화 효소의 아미노산 서열(L43920; 서열 번호 13), 및 리시너스 콤뮤니스(Ricinus communis)의 △12 히드록실라제의 아미노산 서열(U22378; 서열 번호 14)의 정렬을 나타내는 모식도이다.
도 3은 서열 번호 1에 예시한 크레피스 팔라에스티나 에폭시게나제 유전자의 종자 특이적인 발현을 나타내는 노던 블롯 하이브리드화 사진의 사본이다. 레인 1과 2는 각각 크레피스 팔라에스티나의 잎과 생육 종자에서 얻은 총 RNA의 노던 블롯 분석을 도시한 것이다. 총 RNA 15 ㎍을 노던 겔 상에서 전개시킨 뒤, 아머샴 제조자의 지시에 따라 Hybond N+막 상에 블롯팅하였다. 블롯을 서열 번호 1의 3' 비해독 영역으로부터 만든 프로브와 60 ℃에서 하이브리드하였다. 이 블롯을 2 x SSC(NaCl-구연산 나트륨 완충액)로 실온에서 10 분 동안 2회 세척하고, 그 다음 0.1 x SSC로 60 ℃에서 20 분 동안 세척하였다.
도 4는 본 명세서에 기재된 유포비아 라가스케(Euphorbia lagascae) 에폭시게나제 유전자를 분리하는데 사용된 축퇴성 PCR 프라이머(5'에서 3' 방향)의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 모식도이다.
도 5는 베르놀산을 생성하지 않는 식물과 비교하여 베르놀산을 생성하는 식물에서 나타나는 서열 번호 3에 예시한 에폭시게나제 유전자의 발현을 보여주는 RNA 점 블롯 하이브리드화 사진의 사본이다. 특정 조직에서 총 RNA 1 ㎍을 분리하고 아머샴 제조자의 지시에 따라 Hybond N+막에 점 블롯팅하엿다. 이 블롯을 서열 번호 3의 서열로 만든 관련32P 표지된 프로브와 함께 50% 포름아미드 중에서 42 ℃하에 16 시간 동안 하이브리드하였다. 이 블롯을 2 x SSC(NaCl-구연산 나트륨 완충액)로 실온에서 2회 세척한 다음, 0.5 x SSC로 55 ℃에서 20 분 동안 세척하였다. 하룻밤 동안 노출시킨 후 자동방사선사진을 촬영하였다. 패널 A는 유포비아 라가스케(1), 유포비아 시파리수스(Euphorbia cyparissus)(2), 베르노니아 갈라멘시스(Vernonia galamensis)(3) 및 아마(리넘 유시타티시뮴; Linum usitatissimum)의 생육 종자 유래의 총 RNA를 나타낸다. 패널 B는 유포비아 라가스케의 생육 종자(1), 뿌리(2) 및 잎(3)을 비롯한 각종 조직 유래의 총 RNA를 나타낸 것이다.
도 6은 본 명세서에 기재된 유포비아 라가스케 에폭시게나제 유전자를 분리하는데 사용된 감법성 하이브리드화 방법을 나타내는 모식도이다. +6cDNA 푸울은 주로 종자 저장 단백질 유사 서열로 이루어져 있다. 이러한 15가지 서열의 푸울을 비오티닐화하고, +6cDNA로부터 감하였다. LH = 장시간의 하이브리드화 - 20 시간; SH = 단시간의 하이브리드화 - 3 시간.
도 7은 베르놀산을 생성하지 않는 식물과 비교하여 베르놀산을 생성하는 식물에서 나타나는 서열 번호 20에 예시한 에폭시게나제 유전자의 발현을 보여주는 RNA 점 블롯 하이브리드화 사진의 사본이다. 특정 조직에서 총 RNA 1 ㎍을 분리하고 아머샴 제조자의 지시에 따라 Hybond N+막에 점 블롯팅하엿다. 이 블롯을 서열 번호 20의 서열로 만든 관련32P 표지된 프로브와 함께 50% 포름아미드 중에서 42 ℃하에 16 시간 동안 하이브리드하였다. 이 블롯을 2 x SSC(NaCl-구연산 나트륨 완충액)로 실온에서 2회 세척한 다음, 0.5 x SSC로 55 ℃에서 20 분 동안 세척하였다. 하룻밤 동안 노출시킨 후 자동방사선사진을 촬영하였다. 패널 A는 유포비아 라가스케(1), 유포비아 시파리수스(Euphorbia cyparissus)(2), 베르노니아 갈라멘시스(Vernonia galamensis)(3) 및 아마(리넘 유시타티시뮴; Linum usitatissimum)(4)의 생육 종자 유래의 총 RNA를 나타낸다. 패널 B는 유포비아 라가스케의 생육 종자(1), 뿌리(2) 및 잎(3)을 비롯한 각종 조직 유래의 총 RNA를 나타낸 것이다.
도 8은 절두형 내핀 종자 특이적 프로모터(Napin)와 노팔린 신타제 종지인자(NT) 및 이 사이에 BamHI 클로닝 부위를 포함하고, 이외에도 노팔린 신타제 프로모터(NP) 서열과 노팔린 신타제 종지인자(NT) 서열에 작동가능하게 연결된 카나마이신 내성 유전자 NPTII를 포함하는 발현 카세트 함유의 이중 플라스미드 벡터의 모식도이다. 이 발현 카세트는 T-DNA 좌경계(LB) 및 우경계(RB) 서열에 인접해 있다.
도 9는 절두형 내핀 종자 특이적 프로모터(Napin)의 조절하에 노팔린 신타제 종지인자(NT)의 상류에 작동가능하게 배치된 서열 번호 1과, 이외에도 노팔린 신타제 프로모터(NP) 서열과 노팔린 신타제 종지인자(NT) 서열에 작동가능하게 연결된 카나마이신 내성 유전자 NPTII를 포함하는 발현 카세트 함유의 이중 플라스미드 벡터의 모식도이다. 이 발현 카세트는 T-DNA 좌경계(LB) 및 우경계(RB) 서열에 인접해 있다. 이 작제물을 생성하기 위하여, 서열 번호 1을 상기 도 8에 기재한 이중 벡터의 BamHI 부위에 삽입한다.
도 10은 형질전환되지 않은 아라비돕시스 탈리아나 식물[패널 (a)] 또는 도 9에 도시한 유전자 작제물을 사용하여 서열 번호 1로 형질전환시킨 에이. 탈리아나 식물(돌연변이 주 Cpal-17)[패널 (b) 및 (c)]의 오일 종자로부터 제조한 지방산 메틸 에스테르의 가스크로마토그래피 흔적을 도시한 그래프이다. 패널 (a) 및 (b)에서, 지방산 메틸 에스테르는 충전 컬럼 분리를 사용하여 분리하였다. 패널 (c)에서, 지방산 메틸 에스테르는 모세관 컬럼 분리를 사용하여 분리하였다. 베르놀산의 용출 위치를 표시하였다.
도 11은 가스 크로마토그래피를 사용하여 측정한 Cpal2-형질전환된 아라비돕시스 탈리아나 식물의 T1식물에 있어 자가수분된 종자내 에폭시 지방산의 결합 분포를 나타내는 그래프이다. 베르놀산(x 축) 및 12,13-에폭시-9,15-옥타데카디엔산 (y축)의 농도를 측정하고 서로 상대적으로 플로팅하였다. 이 데이터는 돌연변이 식물내 존재하는 이 지방산 농도의 양성 상호관계를 나타낸다.
도 12는 표지된 기질 주입 동안 아마인 자엽을 지질 추출하여 얻은 클로로포름 상으로14C-표지가 병입된 정도를 나타내는 그래프이다. ◆ : [14C] 올레산 주입; ■: [14C] 베르놀산 주입.
도 13은 표지된 기질 주입 동안 아마인 자엽의 포스파티딜콜린 중으로14C-표지가 병입된 정도를 나타내는 그래프이다. ◆ : [14C] 올레산 주입; ■: [14C] 베르놀산 주입.
도 14는 표지된 기질 주입 동안 아마 자엽의 트리아실글리세롤 중으로14C-표지가 병입된 정도를 나타내는 그래프이다. ◆ : [14C] 올레산 주입; ■: [14C] 베르놀산 주입.
바람직한 양태의 상세한 설명
본 발명의 제1 양태는 지방산 에폭시게나제를 암호화하는 분리된 핵산 분자를 암호화하거나 이에 상보적인 분리된 핵산 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 분리된 핵산 분자는 아라키돈산의 직접적인 에폭시화에 관여하는 효소를 암호화하는데, 특히 시험 핵산 분자는 비포유류원 유래인 것이 바람직하다.
본 명세서에 사용된, "유래"라는 용어는 특정 정수 또는 정수의 군이 특정 종에서 기원된 것으로서, 반드시 특정 종에서 직접 얻어져야할 필요는 없음을 나타내는 것이다.
"비포유류원"이란 용어는 포유류 이외의 기타 다른 유기체 또는 이 유기체 유래의 조직 또는 세포를 의미하는 것이다.
본 명세서에서, "비포유류원 유래"라는 표현은 특정 정수 또는 정수군이 박테리아, 효모, 조류, 양서류, 파충류, 곤충류, 식물, 진균류, 곰팡이류 및 조류 또는 기타 다른 비포유류에서 유래된 것을 나타내는 것이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 유기체원은 에폭시 지방산을 합성하는 유전자 능력을 보유하는 모든 유기체이다. 보다 바람직하게는, 유기체원은 예컨대 크리산테뮴(Chrysanthemum) 종, 크레피스 종, 유포비아 종 및 베르노니아 종 등과 같은 식물을 포함하며, 이것에 국한되는 것은 아니다.
보다 더 바람직하게는, 유기체원은 크레피스 비엔니스(Crepis biennis), 크레피스 아우레아(Crepis aurea), 크레피스 코니자에폴리아(Crepis conyzaefolia), 크레피스 인터메디아(Crepis intermedia), 크레피스 옥시덴탈리스(Crepis occidentalis), 크레피스 팔라에스티나(Crepis palaestina), 크레피스 베시카리아(Crepis vesicaria), 크레피스 크사신타(Crepis xacintha), 유포비아 라가스케 및 베느로니아 갈라멘시스를 포함하는 군 중에서 선택되는 것이다.
그밖의 종들도 배제되지는 않는다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에 있어서, 유기체 공급원으로는 다량의 베르놀산을 함유하는 크레피스 종(Crepis sp.), 예를 들면 대표적인 예로 크레피스 팔라에스티나(Crepis palaestina), 또는 대안으로 베르노니아 갈라멘시스 또는 유포비아 라가스케가 있다(Euphorbia lagascae).
본 발명의 분리된 핵산 분자는 Δ6-에폭시게나제 또는 Δ9-에폭시게나제 효소 또는 Δ12-에폭시게나제 또는 Δ15-에폭시게나제 효소를 암호화하거나, 적어도 아라키돈산의 직접 에폭시화에 관여하지 않는 효소를 암호화하며, 본 발명의 핵산 분자는 효모, 곰팡이, 박테리아, 곤충, 조류, 포유류 및 식물을 비롯한 상기 효소를 생산하는 임의의 공급원으로부터 유도할 수 있는데, 그 공급원이 상기 예로 한정되는 것은 아니다.
전술한 구체예 중 어느 하나에 의한 본 발명의 핵산 분자는 유전자, cDNA 분자, RNA 분자 또는 합성 올리고누클레오티드 분자와 같은 DNA일 수 있는데, 특별한 언급이 없는 한 이들은 1본쇄 또는 2본쇄 어느 것이어도 좋고 어떤 2차 구조 특성을 가져도 상관없다.
본 명세서에서 언급하는 "유전자"는 가장 넓은 개념을 나타내는 것이며, 하기 (i) 또는 (ii)를 포함한다:
(i) 전사 및/또는 번역 조절 서열 및/또는 암호화 영역 및/또는 비번역 서열(즉, 인트론, 5'- 및 3'-비번역 서열)로 이루어지는 고전적인 게놈 유전자; 또는
(ii) 유전자의 암호화 영역(즉, 엑손) 및 5'- 및 3'-비번역 서열에 대응하는 mRNA 또는 cDNA.
용어 "유전자"는 또한 작용성 생성물의 전부 또는 일부를 암호화하는 합성 또는 융합 분자를 나타내는 데 사용된다. 본 발명의 바람직한 에폭시게나제 유전자는 표준 재합성 기술에 의해 자연 발생 에폭시게나제 유전자로부터 유도될 수 있다. 일반적으로, 에폭시게나제 유전자는 돌연 변이를 유발시켜서 단일 또는 다중 누클레오티드 치환, 결실 및/또는 첨가를 일어나게 할 수 있다.
뉴클레오티드 삽입 유도체에는 5' 및 3' 말단 융합은 물론 서열간 삽입이 일어난 단일 또는 다중 누클레오티드가 포함된다. 누클레오티드 서열 삽입 변종에는 하나 이상의 누클레오티드가 누클레오티드 서열의 소정 부위에 도입된 것들이 있는데, 생성물을 적당히 선별하면서 무작위 삽입하는 것도 가능하다.
결실 변종은 서열로부터 하나 이상의 누클레오티드를 제거한 것을 특징으로 한다.
치환 누클레오티드 변종은 서열에서 하나 이상의 누클레오티드가 제거되고 그 위치에 다른 누클레오티드가 삽입된 것을 말한다. 그러한 치환은 코돈에 의해 규정된 아미노산을 변성시키지 않는 "사일런트(silent)" 치환일 수 있다. 한편, 치환은 하나의 아미노산을 유사한 작용을 가진 다른 아미노산, 또는 유사한 하전성, 극성 또는 소수성을 가진 아미노산으로 변형시킬 수도 있다.
본 발명의 개념에 있어서, 용어 "지방산 에폭시게나제"는 지방산의 탄소 결합을 에폭시기로 전환시키거나, 바람직하게는 불포화 지방산의 탄소 이중 결합을 에폭시기로 전환시켜서 에폭시 형성된 지방산의 생합성을 촉진할 수 있는 임의의 효소 또는 그들의 작용성 등가물 또는 효소적 활성 유도체를 나타내는 것으로 이해해야 한다. 본 발명을 한정하는 것은 아니지만, 지방산 에폭시게나제는 대표적인 예로 12,13-에폭시-9-옥타데센산(베르놀산), 12,13-에폭시-9,15-옥타데카디엔산, 15,16-에폭시-9,12-옥타데카디엔산, 9,10-에폭시-12-옥타데센산 및 9,10-에폭시-옥타데칸산으로 이루어지는 에폭시 지방산의 생합성을 촉진할 수 있다.
용어 "에폭시", "에폭시기" 및 "에폭시 잔기"는 하기 식과 같이 단일 결합에 의해 결합된 2개의 탄소 원자와 1개의 산소 원자를 포함하는 3원 고리를 나타내는 것으로 당업자들에게 알려져 있다:
따라서, 용어 "에폭시드"는 전술한 바와 같은 에폭시기를 하나 이상 포함하는 화합물을 나타내는 것이다.
지방산 명명법이 탄소 사슬의 길이와 그 탄소 사슬 내의 불포화 탄소 원자의 위치를 근거로 한다는 사실은 당업자들에게 알려져 있다. 즉 지방산은 다음 표시법을 이용하여 나타낸다:
탄소총수: 이중 결합총수 이중 결합(Δ)위치
여기서, 이중 결합은 특별한 표시가 없는 한 시스 형태이다. 예를 들면, 팔미트산(n-헥사데칸산)은 16-탄소 포화 지방산(즉, 16:0)이며, 올레산(옥타데센산)은 C-9 및 C-10 사이에 하나의 이중 결합을 가진 18-탄소 불포화 지방산(즉, 18:1Δ9)이고, 리놀레산(옥타데카디엔산)은 C-9 및 C-10 사이와 C-12 및 C-13 사이에 2개의 이중 결합을 가진 18-탄소 불포화 지방산(즉, 18:2Δ9,12)이다.
그러나, 본 발명의 개념에 있어서, 에폭시게나제 효소는 임의의 탄소 결합이 에폭시기로 전환하는 것을 촉진할 수 있거나, 또는 불포화 지방산 기질 내의 임의의 이중 결합이 에폭시기로 전환하는 것을 촉진할 수 있다. 이와 관련하여, 고등 유기체에서 유래한 대부분의 단일 불포화 지방산은 18-탄소 불포화 지방산(즉, 18:1Δ9)인 한편, 고등 유기체에서 유래한 대부분의 다중 불포화 지방산은 하나 이상의 이중 결합이 C-9 및 C-10 사이에 위치한 18-탄소 지방산이다. 또한, 박테리아는 C16-단일 불포화 지방산을 포함한다. 더욱이, 본 발명의 에폭시게나제는 하나 이상의 지방산 기질 분자에 작용할 수 있으므로, 본 발명은 에폭시게나제 효소가 작용하는 기질 분자의 성질에 의해 제한되지 않는다.
본 발명의 에폭시게나제의 기질 분자는 하나 이상의 이중 결합을 함유하는 불포화 지방산이 바람직하다.
또한, 에폭시게나제 효소는 어느 한 기질 분자 내에 있는 어떤 수의 탄소 원자에도 작용할 수 있다. 예를 들면, 이들은 대표적인 예로 Δ6-에폭시게나제, Δ9-에폭시게나제, Δ12-에폭시게나제 또는 Δ15-에폭시게나제 효소로서 특정할 수 있다. 따라서, 본 발명은 에폭시게나제 효소가 작용하는 기질 내의 탄소 원자의 위치에 의해 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용된 용어 "Δ6 에폭시게나제"는 지방산 기질의 Δ6 탄소 결합이 Δ6 에폭시기로 전환하는 것을 촉진하는, 바람직하게는 하나 이상의 불포화 지방산의 Δ6 이중 결합이 Δ6 에폭시기로 전환하는 것을 촉진하는 에폭시게나제 효소를 나타낸다.
본 명세서에 사용된 용어 "Δ9-에폭시게나제"는 지방산 기질의 Δ9 탄소 결합이 Δ9 에폭시기로 전환하는 것을 촉진하는, 바람직하게는 하나 이상의 불포화 지방산의 Δ9 이중 결합이 Δ9 에폭시기로 전환하는 것을 촉진하는 에폭시게나제 효소를 나타낸다.
본 명세서에 사용된 용어 "Δ12-에폭시게나제"는 지방산 기질의 Δ12 탄소 결합이 Δ12 에폭시기로 전환하는 것을 촉진하는, 바람직하게는 하나 이상의 불포화 지방산의 Δ12 이중 결합이 Δ12 에폭시기로 전환하는 것을 촉진하는 에폭시게나제 효소를 나타낸다.
본 명세서에 사용된 용어 "Δ15-에폭시게나제"는 지방산 기질의 Δ15 탄소 결합이 Δ15 에폭시기로 전환하는 것을 촉진하는, 바람직하게는 하나 이상의 불포화 지방산의 Δ15 이중 결합이 Δ15 에폭시기로 전환하는 것을 촉진하는 에폭시게나제 효소를 나타낸다.
본 발명은 대표적인 예로 앞에서 예시한 모든 에폭시게나제 효소를 암호화하는 유전자 서열에 명백히 적용된다.
본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 분리된 핵산 분자는 팔미톨산(16:1Δ9), 올레산(18:1Δ9), 리놀레산(18:2Δ9,12), 리놀렌산(18:3Δ9,12,15),또는 아라키돈산(20:4Δ5,8,11,14)에 있는 하나 이상의 탄소 결합을 에폭시 결합으로 전화시키는 지방산 에폭시게나제 효소를 암호화한다. 탄소 결합은 탄소 이중 결합이 바람직하다.
더욱 바람직한 것은, 본 발명의 분리된 핵산 분자는 적어도 리놀레산에 있는 하나 또는 2개 모두의 이중 결합을 에폭시기로 전환시키는 지방산 에폭시게나제 효소를 암호화한다. 이 구체예에 의하면, 리놀레산의 Δ9 및 Δ12 이중 결합 모두를 에폭시기로 전환시키는 에폭시게나제는 그러한 전환을 서로 독립적으로 촉진할 수 있으며, 따라서 상기 에폭시게나제는 전술한 바와 같은 Δ9-에폭시게나제 및/또는 Δ12-에폭시게나제이다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 지방산 에폭시게나제는 전술한 바와 같은 Δ12-에폭시게나제, Δ15-에폭시게나제 또는 Δ9-에폭시게나제이다.
본 발명의 지방산 에폭시게나제는 전술한 바와 같은 Δ12-에폭시게나제가 더욱 바람직하다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에 있어서, 리놀레이트 Δ12-에폭시게나제를 암호화하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 여기서 상기 리놀레이트 Δ12-에폭시게나제는 적어도 리놀레산의 Δ12 이중 결합을 Δ12-에폭시기로 전환시켜서 12,13-에폭시-9-옥타데센산(베르놀산)을 생산하는 효소이다.
본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니나, 본 발명의 Δ12-에폭시게나아제의 바람직한 공급원은 식물, 특히 크레피스 팔라에스티나(Crepis palaestina), 또는 씨. 팔라에스티나와는 구별되나 다량의 배르놀산을 함유하는 크레피스종, 베르니아 갈라멘시스(Vernonia galamensis)또는 유포비아 라가스케(Euphorbia lagascae)이다.
이 구체예에 따르면, Δ12-에폭시게나아제는 특히 팔미톨레산의 9,10-에폭시-팔미틴산으로의 전환 반응 및/또는 올레산의 9,10-에폭시-스테아르산으로의 전환 반응 및/또는 리놀레산의 9,10-에폭시-12-옥타데켄산 또는 12,13-에폭시-9-옥타데켄산 또는 9,10,12,13-디에폭시-스테아르산 중 하나 이상으로의 전환 반응 및/또는 리놀렌산의 9,10-에폭시-12,15-옥타데카디엔산 또는 12,13-에폭시-9,15-옥타데카디엔산 또는 15,16-에폭시-옥타데카디엔산 또는 9,10,12,13-디에폭시-15-옥타데센산 또는 9,10,15,16-디에폭시-12-옥타데센산 또는 12,13,15,16-디에폭시-9-옥타데센산 또는 9,10,12,13,15,16-트리에폭시-스테아르산 중 어느 하나 이상으로의 전환 반응 및/또는 아라키돈산의 5,6-에폭시-8,11,14-테트라코사트리엔산 또는 8,9-에폭시-5,11,14-테트라코사트리엔산 또는 11,12-에폭시-5,8,14-테트라코사트리엔산 또는 14,15-에폭시-5,8,11-테트라코사트리엔산 또는 5,6,8,9-디에폭시-11,14-테트라코사디엔산 또는 5,6,11,12-디에폭시-8,14-테트라코사디엔산 또는 5,6,14,15-디에폭시-8,11-테트라코사디엔산 또는 8,9,11,12-디에폭시-5,14-테트라코사디엔산 또는 8,9,14,15-디에폭시-5,11-테트라코사디엔산 또는 11,12,14,15-디에폭시-5,8-테트라코사디엔산 또는 5,6,8,9,11,12-트리에폭시-14-테트라코센산 또는 5,6,8,9,14,15-트리에폭시-11-테트라코센산 또는 5,6,11,12,14,15-트리에폭시-8-테트라코센산 또는 8,9,11,12,14,15-트리에폭시-5-테트라코센산 중 어느 하나 이상으로의 전환 반응을 촉진할 수도 있다.
당업자들은, 상기 나열한 모든 기재가 천연 공급원로부터 유도될 수 있는 것은 아니나, 화학적 합성 방법을 통해 제조될 수도 있는 것임을 알 것이다. 천연 지방산 및 화학적 합성 지방산의 에폭시 지방산으로의 전환 반응은 본 발명의 영역 내에 포함되며, 이때 유일한 요건은 본 명세서에 기재된 본 발명의 핵산 분자가 상기 전환 반응을 촉진할 수 있는 효소 또는 이것의 작용부를 암호화해야 한다는 것이다.
전술한 내용에 따르면, 당업자들은, 지방산 에폭시게나아제가 특히 시토크롬-P450 의존성 모노옥시게나아제 효소 또는 혼합 작용성 모노옥시게나아제 효소, 또는 대안적으로 과산화수소 의존성 시게나아제 효소, 또는 유사 효소일 수도 있음을 알 것이다. 그러나, 본 발명은 구체적으로 혼합 작용성 모노옥시게나아제 효소인 상기 에폭시게나아제 효소, 이 효소를 암호화하는 핵산 분자 및 이것의 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 핵산은 혼합 작용성 모노옥시게나아제 효소인 지방산 에폭시게나아제를 암호화하는 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 명세서에 기재된 용어 "혼합 작용성 모노옥시게나아제 효소"란, 지방산 분자 중의 탄소 결합 또는 탄소 이중 결합의 에폭시화 반응을 촉진하는 임의의 효소를 칭하는 것으로, 상기 효소는 하기 나열한 (i) 내지 (iii)의 3개의 히스티딘이 풍부한 부위를 포함하는 아미노산 서열을 더 포함한다.
(i) His-(Xaa)3-4-His
(ii) His-(Xaa)2-3-His-His
(iii) His-(Xaa)2-3-His-His
상기 식 중, His는 히스티딘을 칭하는 것이고, Xaa는 표 1에 제시한 임의의 자연 아미노산 잔기를 칭하는 것이며, 정수(Xaa)3-4는 Xaa의 반복 단위를 3개 또는 4개 포함하는 아미노산 서열을 칭하는 것이고, 정수(Xaa)2-3는 Xaa의 반복 단위를 2개 또는 3개 포함하는 아미노산 서열을 칭하는 것이다.
용어 "혼합 작용성 모노옥시게나아제 유사 효소"는, 상기 나열한 히스티딘이 풍부한 부위 중 3개를 포함하는 임의의 효소를 칭하는 것이다.
본 명세서에 기재한 본 발명의 실험부에서, 본 발명자들은, 본 명세서에 제공된 크레피스 팔라에스티나 아미노산 서열이 전술한 혼합 작용성 모노옥시게나아제 효소의 특징적인 아미노산 서열 모티프를 함유하는 Δ12-에폭시게나아제 효소를 포함한다는 것을 입증하였다. 다른 혼합 작용성 모노옥시게나아제, 예를 들어 탈포화 효소 및 히드록실라아제의 아미노산 서열과 비교하여, 씨. 팔라에스티나 Δ12-에폭시게나아제 효소(서열 번호: 2)와 비동정된 크레피스 종과 베르노니아 갈라멘시 로부터 유도된 폴리펩티드의 아미노산 서열(서열 번호: 4 및 6) 간의 아미노산 서열을 면밀히 동정한 결과, 상기 크레피스 종 및 베르노니아 갈라멘시스의 아미노산 서열 또한 지방산 에폭시게나아제 효소이며 Δ12-에폭시게나아제 효소일 수 있음을 시사해준다. 이러한 점에서, 본 명세서에서 실험한 베르노니아 갈라멘시스 아미노산 서열은, 단 하나의 완전 히스티딘이 풍부한 모티프를 포함하는 부분 서열(즉, His-Arg-Asn-His-His) 및 제1 히스티딘이 풍부한 모티프의 부분 서열(즉, His-Glu-Cys-Gly-His-His 모티프의 마지막 2개 히스티딘 잔기를 포함하는 서열)인데, 이는 상기 서열을 암호화하는 상응하는 누클레오티드 서열이, 제1 히스티딘이 풍부한 모티프에 제1 프라이머를 그리고 제3 히스티딘이 풍부한 모티프(즉, His-Val-Met-His-His)의 상부에 지정된 제2 증폭 프라이머를 사용하여 부분 cDNA 서열로서 폴리머라아제 쇄 반응에 의해 증폭된 것이기 때문이다. 또한, 베르노니아 갈라멘시스 서열을 제1 히스티딘이 풍부한 모티프에 특이적인 프라이머를 사용하여 증폭시켰다는 사실은, 상응하는 전체 길이 서열 역시 이 모티프를 포함한다는 것을 지시해준다.
따라서, 특히 바람직한 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 크레피스 팔라에스티나를 비롯한 크레피스 종으로부터 유도되거나 또는 대안적으로 베르노니아 갈라멘시스로부터 유도된 혼합 작용성 모노옥시게나아제 에폭시게나아제 효소 또는 이와 유사한 효소를 암호화한다. 이 구체예에 따르면, 상기 에폭시게나아제가 적어도 하기 (i) 내지 (iii) 히스티딘이 풍부한 부위 중 3개 이상을 포함하는 아미노산 서열, 또는 이의 상동체, 유사체 또는 유도체를 포함하는 것이 더욱 바람직하다.
(i) His-Glu-Cys-Gly-His-His (서열 번호: 15)
(ii) His-Arg-Asn-His-His (서열 번호: 16)
(iii) His-Val-Met-His-His (서열 번호: 17)
상기 식 중, His는 히스티딘을, Glu는 글루타메이트를, Cys는 시스테인을, Gly는 글리신을, Arg는 아르기닌을, Asn은 아스파라긴을, Val은 발린을, Met은 메티오닌을 칭하는 것이다.
본 발명은 크리산테뮴(Chrysanthemum) 종 및 유포비아 라가스케(Euphorbia lagascae)로부터 유도된 에폭시게나아제를 비롯하여 다른 종으로부터 유도된 에폭시게나아제 유전자에도 명백히 적용된다.
바람직한 구체예에서는, 본 발명에 포함되는 다른 종의 에폭시게나아제 유전자가 혼합 작용성 모노옥시게나아제 효소를 암호화하나, 이것에 의해 본 발명이 국한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명은 그러한 유전자에 의해 암호화되는 분리된 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드와, 상기 유전자 및 폴리펩티드의 용도까지도 포함한다.
상기 구체예에 따라 설명한 본 발명은, 본 명세서에 정의된 에폭시게나아제 활성 이외의 효소 활성, 특히 유사한 히스티딘이 풍부한 모티프를 함유하는 것으로 공지된 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 브라시카 준세아(Brassica juncea), 브라시카 나푸스(Brassica napus) 또는 글리신 막스(Glycine max)로부터 유도된 Δ12-탈포화 효소의 활성을 암호화하는 핵산 분자는 포함하지 않는다.
본 명세서에서 아미노산 서열의 "상동체"는, 본 발명의 폴리펩티드, 효소 또는 단백질로부터 유도된 아미노산 서열 또는 펩티드 서열을 의미하는 것이거나, 또는 대안적으로 상기 나열한 아미노산 서열과 비교하여 임의의 자연 아미노산 치환, 첨가 또는 결실이 있긴 하나 상기 아미노산 서열에 실질적으로 상응하는 것이다.
예를 들어, 아미노산은 유사한 특성, 예를 들어 소수성, 친수성, 소수적 모멘트, 항원성, α-나선형 구조 또는 β-시트형 구조를 형성하거나 또는 파괴시키는 경향 등을 가진 다른 아미노산으로 치환시킬 수도 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 상동체 아미노산 서열의 아미노산은 유사한 특성, 예를 들어 소수성, 친수성, 소수적 모멘트, 하전성 또는 항원성 등을 가진 다른 아미노산으로 치환시킬 수도 있다.
본 발명에 포함되는 자연 아미노산 잔기는 하기 표 1에 기재한다.
아미노산 서열 잔기의 상동체는 Fmoc 화학 기법을 사용하는 등의 당업자들에게 공지된 방법을 통해 제조한 합성 펩티드일 수 있다.
대안적으로, 아미노산 서열의 상동체는 천연 원료, 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드, 효소 또는 단백질과 동일하거나 또는 다른 종으로부터 유도될 수도 있다. 상기 나열한 아미노산 서열 상동체의 바람직한 공급원으로는 본 명세서에 기재된 공급원 중 어떤 것도 사용할 수 있다.
아미노산 서열의 "유사체"는, 비자연 아미노산 유사체 내부에 존재하는 것을 제외하고는 상기 나열한 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 의미한다.
본 발명에 포함되는 바람직한 비자연 아미노산은 하기 표 2에 기재한다.
아미노산 서열과 관련된 용어 "유도체"는, 상기 나열한 아미노산 서열의 돌연변이, 일부, 단편 또는 폴리펩티드 융합체를 칭하는 것이다. 유도체로는, 그 중에 함유된 하나 이상의 아미노산 잔기에 리간드가 결합된 변성 아미노산 서열 또는 펩티드가 있으며, 그 예로는 탄수화물, 효소, 단백질, 폴리펩티드 또는 리포터 분자(예, 방사성 핵종 또는 형광성 화합물)이 있다. 상기 펩티드의 글리코실화 형태, 형광 형태, 아실화 형태 또는 알킬화 형태 역시 본 발명에 포함된다. 또한, 유도체는 본 명세서에 개시된 아미노산 서열의 단편 또는 일부를 포함할 수도 있으며, 이것은 상기 서열의 2개 이상의 카피를 포함하는 동종 중합체 또는 이종 중합체와 마찬가지로 본 발명의 영역 내에 포함된다.
펩티드를 유도하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.
치환은 아미노산이 다른 천연 또는 비통상적인 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 변경을 포함하는 것이다. 아미노산 잔기가 유사한 특성을 가진 또다른 자연 아미노산으로 치환되는 경우, 예를 들어 Gly ↔Ala, Val ↔Ile ↔Leu, Asp ↔Glu, Lys ↔Arg, Asn ↔Gln 또는 Phe ↔Trp ↔Tyr로 치환되는 경우, 그러한 치환은 "보존 치환"으로 분류할 수도 있다.
레프레서(repressor)억제자 폴리펩티드 중에 존재하는 아미노산 잔기가 다른 특성을 가진 아미노산, 예를 들어 다른 군에서 선택된 자연 아미노산으로 치환된 경우(예, 치환된 하전성 또는 소수성 아미노산이 알라닌으로 치환된 경우)의 본 발명의 치환, 또는 대안적으로 자연 아미노산이 비통상의 아미노산으로 치환된 경우의 본 발명의 치환은 "비보존 치환"일 수도 있다.
아미노산 치환은 통상 단일 잔기를 가지나, 다수개의 잔기를 응집 형태 또는 분산 형태로 가질 수도 있다.
아미노산 결실체는 통상 약 1개 내지 10개의 아미노산 잔기를 가지는 한편, 삽입체는 그 길이가 제한되지 않는다. 결실체 및 삽입체는 N-말단, C-말단 또는 중간 결실체 또는 삽입체로 제조될 수도 있다. 통상, 아미노산 서열 내의 삽입체는 약 1개 내지 4개의 아미노산 잔기를 가진 아미노 말단 융합부 또는 카르복실 말단 융합부보다 작다.
에폭시게나아제 유전자의 내인성 세포 보체에 대한 부가물로서 상기 분리된 핵산 분자를 세포의 게놈 내에 혼입시키면, 이 분리된 핵산 분자도 명백히 본 발명에 포함된다. 대안적으로, 숙주 세포는 대개 에폭시 지방산 생합성에 필요한 효소를 암호화하지 않으며, 상기 분리된 핵산 분자를 숙주 세포의 게놈 내로 내인성 세포 게놈에 대한 부가물로서 첨가하는 경우에는 이 분리된 핵산 분자도 본 발명에 포함된다.
아미노산 3자 약어 1자 기호
알라닌 Ala A
아르기닌 Arg R
아스파라긴 Asn N
아스파르트산 Asp D
시스테인 Cys C
글루타민 Gln Q
글루탐산 Glu E
글리신 Gly G
히스티딘 His H
이소루신 Ile I
루신 Leu L
리신 Lys K
메티오닌 Met M
페닐알라닌 Phe F
프롤린 Pro P
세린 Ser S
트레오닌 Thr T
트립토판 Trp W
티로신 Tyr Y
발린 Val V
전술한 임의의 아미노산 Xaa X
비통상적인 아미노산 코드 비통상적인 아미노산 코드
α-아미노부티르산 Abu L-N-메틸알라인 Nmala
α-아미노-α-메틸부티레이트 Mgabu L-N-메틸아르기닌 Nmarg
아미노시클로프로판 카르복실레이트 Cpro L-N-메틸아스파라긴L-N-메틸아스파르트산 NmasnNmasp
아미노이소부티르산 Aib L-N-메틸시스테인 Nmcys
아미노노르보르닐 카르복실레이트 Norb L-N-메틸글루타민L-N-메틸글루탐산 NmglnNmglu
시클로헥실알라닌 Chexa L-N-메틸히스티딘 Nmhis
시클로펜틸알라닌 Cpen L-N-메틸이소루신 Nmile
D-알라닌 Dal L-N-메틸루신 Nmleu
D-아르기닌 Darg L-N-메틸리신 Nmlys
D-아스파르트산 Dasp L-N-메틸메티오닌 Nmmet
D-시스테인 Dcys L-N-메틸노르루신 Nmnle
D-글루타민 Dgln L-N-메틸노르발린 Nmnva
D-글루탐산 Dglu L-N-메틸오르니틴 Nmorn
D-히스티딘 Dhis L-N-메틸페닐알라인 Nmphe
D-이소루신 Dile L-N-메틸프롤린 Nmpro
D-루신 Dleu L-N-메틸세린 Nmser
D-리신 Dlys L-N-메틸트레오닌 Nmthr
D-메티오닌 Dmet L-N-메틸트립토판 Nmtrp
D-오르니틴 Dorn L-N-메틸티로신 Nmtyr
D-페닐알라닌 Dphe L-N-메틸발린 Nmval
D-프롤린 Dpro L-N-메틸에틸글리신 Nmetg
D-세린 Dser L-N-메틸-t-부틸글리신 Nmtbug
D-트레오닌 Dthr L-노르루신 Nle
비통상적인 아미노산 코드 비통상적인 아미노산 코드
D-트립토판 Dtrp L-노르발린 Nva
D-티로신 Dtyr α-메틸-아미노이소부티레이트 Maib
D-발린 Dval α-메틸-γ-아미노부티레이트 Mgabu
D-α-메틸알라닌 Dmala α-메틸시클로헥실알라닌 Mchexa
D-α-메틸아르기닌 Dmarg α-메틸시클로펜틸알라닌 Mcpen
D-α-메틸아스파라긴 Dmasn α-메틸-α-나프틸알라닌 Manap
D-α-메틸아스파르테이트 Dmasp α-메틸페니실라민 Mpen
D-α-메틸시스테인 Dmcys N-(4-아미노부틸)글리신 Nglu
D-α-메틸글루타민 Dmgln N-(2-아미노에틸)글리신 Naeg
D-α-메틸히스티딘 Dmhis N-(3-아미노프로필)글리신 Norn
D-α-메틸이소루신 Dmile N-아미노-α-메틸부티레이트 Nmaabu
D-α-메틸루신 Dmleu α-나프틸알라닌 Anap
D-α-메틸리신 Dmlys N-벤질글리신 Nphe
D-α-메틸메티오닌 Dmmet N-(2-카르바밀에틸)글리신 Ngln
D-α-메틸오르니틴 Dmorn N-(카르바밀메틸)글리신 Nasn
D-α-메틸페닐알라닌 Dmphe N-(2-카르복시에틸)글리신 Nglu
D-α-메틸프롤린 Dmpro N-(카르복시메틸)글리신 Nasp
D-α-메틸세린 Dmser N-시클로부틸글리신 Ncbut
D-α-메틸트레오닌 Dmthr N-시클로헵틸글리신 Nchep
D-α-메틸트립토판 Dmtrp N-시클로헥실글리신 Nchex
D-α-메틸티로신 Dmty N-시클로데실글리신 Ncdec
D-α-메틸발린 Dmval N-시클로도데실글리신 Ncdod
D-N-메틸알라닌 Dnmala N-시클로옥틸글리신 Ncoct
D-N-메틸아르기닌 Dnmarg N-시클로프로필글리신 Ncpro
D-N-메틸아스파라긴 Dnmasn N-시클로운데실글리신 Ncund
D-N-메틸아스파르테이트 Dnmsp N-(2,2-디페닐에틸)글리신 Nbhm
D-N-메틸시스테인 Dnmcys N-(3,3-디페닐프로필)글리신 Nbhe
비통상적인 아미노산 코드 비통상적인 아미노산 코드
D-N-메틸글루타민 Dnmgln N-(3-구아니디노프로필)글리신 Narg
D-N-메틸글루타메이트 Dmnglu N-(1-히드록시에틸)글리신 Nthr
D-N-메틸히스티딘 Dnmhis N-(히드록시에틸)글리신 Nser
D-N-메틸이소루신 Dnmile N-(이미다졸릴에틸)글리신 Nhis
D-N-메틸루신 Dnmleu N-(3-인돌릴에틸)글리신 Nhtrp
D-N-메틸리신 Dnmlys N-메틸-γ-아미노부티레이트 Nmgabu
N-메틸시클로헥실알라닌 Nmchexa D-N-메틸메티오닌 Dnmmet
D-N-메틸오르니틴 Dnmorn N-메틸시클로펜틸알라닌 Nmcpen
N-메틸글리신 Nala D-N-메틸페닐알라닌 Dnmphe
N-메틸아미노이소부티레이트 Nmaib D-N-메틸프롤린 Dnmpro
N-(1-메틸프로필)글리신 Nile D-N-메틸세린 Dnmser
N-(2-메틸프로필)글리신 Nleu D-N-메틸트레오닌 Dnmthr
D-N-메틸트립토판 Dnmtrp N-(1-메틸에틸)글리신 Nval
D-N-메틸티로신 Dnmtyr N-메틸-α-나프틸알라닌 Nmanap
D-N-메틸발린 Dnmval N-메틸페니실라민 Nmpen
γ-아미노부티르산 Gabu N-(p-히드록시페닐)글리신 Nhtyr
L-t-부틸글리신 Tbug N-(티오메틸)글리신 Ncys
L-에틸글리신 Etg 페니실라민 Pen
L-호모페닐알라닌 Hphe L-α-메틸알라닌 Mala
L-α-메틸아르기닌 Marg L-α-메틸아스파라긴 Masn
L-α-메틸아스파르테이트 Masp L-α-메틸-t-부틸글리신 Mtbug
L-α-메틸시스테인 Mcys L-메틸에틸글리신 Metg
L-α-메틸글루타민 Mgln L-α-메틸글루타메이트 Mglu
L-α-메틸히스티딘 Mhis L-α-메틸호모페닐알라닌 Mhphe
L-α-메틸이소루신 Mile N-(2-메틸티오에틸)글리신 Nmet
비통상적인 아미노산 코드 비통상적인 아미노산 코드
L-α-메틸루신 Mleu L-α-메틸리신 Mlys
L-α-메틸메티오닌 Mmet L-α-메틸노르루신 Mnle
L-α-메틸노르발린 Mnva L-α-메틸오르니틴 Morn
L-α-메틸페닐알라닌 Mphe L-α-메틸프롤린 Mpro
L-α-메틸세린 Mser L-α-메틸트레오닌 Mthr
L-α-메틸트립토판 Mtrp L-α-메틸티로신 Mtyr
L-α-메틸발린 Mval L-N-메틸호모페닐알라닌 Nmhphe
N-(N-2,2-디페닐에틸)카르바밀메틸)글리신 Nnbhm N-(N-(3,3-디페닐프로필)카르바밀메틸)글리신 Nnbhe
1-카르복시-1-(2,2-디페닐에틸아미노)시클로프로판 Nmbc
본 발명의 제2 양태는 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 19 또는 서열 번호 20 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열 또는 이들에 상보적인 서열, 또는 그 상동체, 유사체 또는 유도체의 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.
명명을 위해, 서열 1에 개시된 뉴클레오티드 서열은 크레피스 팔라에스테나(Crepis palaestina)로부터 유도되며, 서열 2로 표시되는 혼합 기능의 모노옥시게나아제 서열 또는 혼합 기능의 모노옥시게나아제 유사 서열을 암호화한다. 본 명세서에 예시한 바와 같이, 서열 번호 2로 표시된 아미노산 서열은 에폭시게나아제 활성, 특히12-에폭시게나아제 활성을 갖는다.
서열 3으로 표시된 뉴클레오티드 서열은 베르놀산을 다량 함유하는 크레피스 팔라에스티나 이외의 크레피스 종으로부터 유도된 cDNA에 해당한다. 서열 번호 4로 표시된 아미노산 서열은 서열 3으로 제공된 크레피스 종 에폭시게나아제 유전자의 유도된 아미노산 서열에 해당한다.
서열 번호 5로 표시된 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 크레피스 종 에폭시게나아제 유전자 서열을 비롯한, 혼합 기능의 모노옥시게나아제의 공동 서열로부터 유도된 증폭 프라이머를 사용하여 베르노니아 갈라멘시스(Vernonia galamensis)로부터 유도된 증폭 DNA에 해당한다. 증폭된 DNA는 부분적인 에폭시게나아제 유전자 서열을 포함하는데, 이는 혼합 기능의 모노옥시게나아제 효소에 특징이 있는 히스티딘이 풍부한 모티프인 His-Arg-Asn-His-His를 암호화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 서열 6으로 표시된 아미노산 서열은 서열 5로 제공된 베르노니아 갈라멘시스 에폭시게나아제 유전자의 유도된 아미노산 서열에 해당한다.
서열 7로 표시된 뉴클레오티드 서열은 서열 1로 표시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 분리하는 탐침으로서 사용되는 크레피스 알피나(Crepis alpina) 아세틸레나아제 유전자의 부분적인 서열에 관한 것이다. 서열 8로 표시된 아미노산 서열은 씨. 알피나 아세틸레나아제 유전자의 상기 부분적인 서열의 유도된 아미노산 서열에 해당한다.
본 명세서에 사용된 "아세틸레나아제"란 용어는 지방산 기질 분자 중의 탄소 이중 결합을 탄소 삼중 결합으로 전환시키는 반응을 촉진할 수 있거나 또는 대안적으로 지방산 분자 중의 탄소 삼중 결합의 형성 반응을 촉진할 수 있는 효소를 말한다.
서열 번호 18로 표시된 뉴클레오티드 서열은 추정 유포비아 라가스케(Euphorbia lagascae) 에폭시게나아제 유전자 서열을 증폭시키는 데 사용된 변성 증폭 프라이머에 해당한다. 이 점에서, 서열 번호 18로 표시된 뉴클레오티드 잔기는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에 의해 추천된 것들이다. 여기서 A는 아데닌을 표시하며, C는 시토신을 표시하고, G는 구아닌을 표시하며, T는 티민을 표시하고, Y는 피리딘 잔기를 표시하며, R은 퓨린 잔기를 표시하고, M은 아데닌 또는 시토신을 표시하며, K는 구아닌 또는 티민을 표시하고, S는 구아닌 또는 시토신을 표시하며, W는 아데닌 또는 티민을 표시하고, H는 구아닌이외의 뉴클레오티드를 표시하며, B는 아데닌이외의 뉴클레오티드를 표시하고, V는 티민이외의 뉴클레오티드를 표시하며, D는 시토신이외의 뉴클레오티드를 표시하고, N은 임의의 뉴클레오티드 잔기를 표시한다.
서열 번호 19로 표시된 뉴클레오티드 서열은 유포비아 라가스케로부터 유도되며, 추정 시토크롬 P-450 의존성 모노옥시게나아제 서열 또는 시토크롬 P-450 의존성 모노옥시게나아제 유사 서열을 암호화한다.
서열 번호 20으로 표시된 뉴클레오티드 서열은 유포비아 라가스케로부터 유도되며, 추정 시토크롬 P-450 의존성 모노옥시게나아제 서열 또는 시토크롬 P-450 의존성 모노옥시게나아제 유사 서열을 암호화한다.
본 발명은 서열 1, 3, 5, 19 또는 20 중 어느 하나로 예시된 cDNA 분자의 게놈 유전자 등가물에까지 확실하게 연장된다.
가장 바람직한 구체예에서, 본 발명은 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 19 또는 서열 번호 20으로 표시된 뉴클레오티드 서열 또는 상기 뉴클레오티드 서열의 게놈 유전자 등가물 또는 이들의 상동체, 유사체 또는 유도체를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.
본 발명에서, 뉴클레오티드 서열의 "상동체"란 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 삽입, 결실 또는 재배열의 본 발명의 핵산 분자 또는 그것의 상보적인 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 동일한(비록 상기 서열 내에서 일어난다 하더라도) 분리된 핵산 분자를 말하는 것이다.
본 명세서에 수록된 뉴클레오티드 서열의 "유사체"란 상기 분리된 핵산 분자, 예를 들면 탄수화물, 방사선 뉴클레오티드를 비롯한 방사선 화학물질, 리포터 분자(DIG를 예로 들 수 있으나 이에 국한하는 것은 아님), 알칼리성 포스파타아제 또는 양고추냉이 퍼옥시다아제 등 내에 특별하게 존재하는 임의의 비뉴클레오티드 성분들의 출현에도 불구하고 본 발명의 핵산 분자 또는 그것의 상보적인 뉴클레오티드 서열의 핵산 분자와 거의 동일한 분리된 핵산 분자를 말하는 것이다.
본 명세서에 제시된 뉴클레오티드 서열의 "유도체"는 상기 서열 또는 그 일부와 상당히 유사한 서열을 포함하는 임의의 분리된 핵산을 의미한다.
일반적으로, 본 발명의 핵산 분자의 상동체, 유사체 또는 유도체를 합성 방법으로 제조하거나 또는 대안으로서 자연 발생적인 공급원에서 유도시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 제시한 단일 또는 다중 핵산 치환체, 결실체 및/또는 삽입체를 생성하기 위해 본 발명의 핵산을 돌연변이화시킬 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 19 또는 서열 번호 20 또는 그 상보성 서열 중의 하나에 제시된 뉴클레오티드 서열의 바람직한 상동체, 유사체 또는 유도체는 면역학적 활성화 또는 효소적 활성인 폴리펩티드를 암호한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "면역학적 활성"이라는 용어는 포유류에서 면역 반응, 특히 이에 제한되는 것은 아니지만, IgM 또는 IgG 분자 또는 상기 항체 분자를 포함하는 전체 혈청과 같은 항체를 생성하기에 충분한 면역 반응을 유발하는 폴리펩티드 분자의 능력을 가리키는 것으로 볼 수 있다. 또한 "면역학적 활성"이라는 용어는 모노클로날 항체, 항체 분자의 합성 Fab 단편, 단일쇄 항체 분자 또는 다른 면역상호작용성 분자를 생성하기 위한 충분한 면역 반응을 유도하는 폴리펩티드의 능력에까지 확장된다.
본 명세서에서 사용된 "효소적 활성"이라는 용어는 효소 반응, 특히 지방산 기질 분자에서 탄소 결합의 에폭시 형성을 포함하는 효소 반응을 촉진하는 폴리펩티드 분자의 능력을 말한다. 또한, 보다 구체적으로, 본 발명을 제한하는 것은 아니지만, "효소적 활성"이라는 용어는 리놀레산 또는 베르놀산과 같은 지방산 기질 분자에서 △-9 또는 △-12의 에폭시 형성을 촉진하는 폴리펩티드 분자의 능력에 관한 것이다.
또 다른 구체예에서, 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 서열 번호 5 또는 그 상보성 서열 중의 하나에 제시된 뉴클레오티드 서열의 바람직한 상동체, 유사체 또는 유도체는 크레피스 종 아세틸레나제 효소를 암호화하는 핵산 서열이외에 그 안에 20개 이상의 인접 뉴클레오티드와 65% 이상 동일한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다.
서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 서열 번호 5 중 하나와 동일성 비율이 약 85% 이상인 것이 보다 바람직하다. 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 서열 번호 5의 상동체, 유사체 또는 유도체는 약 90% 이상인 것이 더욱 바람직하며 그 안의 100 또는 250 또는 500 또는 1000 이상의 인접 뉴클레오티드와 약 95% 이상 동일한 것이 더욱 바람직하다.
서열 번호 19 또는 서열 번호 20 또는 그 상보성 서열에 대한 동일성 비율은 약 200 이상의 인접 뉴클레오티드에 대해 약 75% 이상이며, 약 80% 이상이 더욱 바람직하고, 약 90%이상이 더욱더 바람직하며, 약 99% 이상의 동일성을 포함해서 약 95% 이상이 보다 바람직하다. 또한 서열 번호 19 또는 서열 번호 20에서 약 400 이상의 인접 뉴클레오티드에 대해 약 65% 이상인 뉴클레오티드 서열도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 명세서에서 언급된 2 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 동일성 비율 또는 유사성 비율은 당업자에 의해 공지된 임의의 포준 알고리즘을 사용하여 결정된 것과 같이, 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 배열에서 동일 또는 유사한 잔기의 수를 가리키는 것으로 볼 수 있다. 특히, 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 동일성 및 유사성은 정합 잔기의 수를 최대화시키고 서열 갭의 수를 최소화 시키는 니들맨(Needleman)과 운슈(Wunsch) (1970)의 알고리즘을 이용하는 갭(Gap) 프로그램을 사용하여 계산할 수 있다. 이 갭 프로그램은 미국 위스콘신주 매디슨 유니버시티 리서치 파크의 컴퓨터 제네틱스 그룹 인코포레이티드의 시퀀스 앤드 어낼리시스 소프트웨어 팩키지의 일부이다(Devereux 등, 1984).
또 다른 구체예에서, 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 19 또는 서열 번호 20 또는 그 상보성 서열 중의 하나에 제시된 뉴클레오티드 서열의 바람직한 상동체, 유사체 또는 유도체는 상기 서열에서 유래된 약 20개 이상의 인접 뉴클레오티드에 대해 최소한 낮은 엄중도 이상의 조건하에서 하이브리드화한다.
보다 구체적으로 하이브리드화의 엄중도는 중간 엄중도 이상이 보다 바람직하고 적어도 높은 엄중도가 더욱 바람직하다.
엄중도의 레벨을 한정하기 위해서, 당업자는 여러 다른 하이브리드화 조건을 사용할 수 있다는 사실을 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 낮은 엄중도는 28℃에서 0.1%(w/v) SDS, 6xSSC 완충액에서 수행되는 하이브리드화 및/또는 세척을 포함할 수 있다. 중간 엄중도는 45℃ 내지 65℃ 범위의 온도에서 0.1%(w/v) SDS, 2xSSC 완충액에서 수행되는 하이브리드화 및/또는 세척을 포함할 수 있다. 높은 엄중도는 65℃ 이상의 온도에서 0.1%(w/v) SDS, 0.1xSSC 완충액에서 수행되는 하이브리드화 및/또는 세척을 포함할 수 있다.
일반적으로, SSC 완충액의 농도를 감소시키거나/또는 하이브리드화 완충액 또는 세척 완충액에서 SDS의 농도를 증가시키거나/또는 하이브리드화 및/또는 세척이 수행되는 온도를 증가시켜 엄중도를 증가시킨다. 하이브리드화 및 세척의 조건은 당업자에게 잘 이해된다. 핵산 분자들 사이의 하이브리드화에 영향을 미치는 변수를 명확히 하기 위해, 통상적으로 아우수벨(Ausubel) 등의 2.10.8 내지 2.10.16 페이지를 참고할 수 있으며, 이것은 본 명세서에 참고로 인용된다.
당업자에게 공지된 방법들 중 하나를 사용하여 다른 세포, 조직 또는 기관 타입으로부터 또는 또 다른 종의 세포, 조직 또는 기관으로부터 상동체, 유사체 또는 유도체를 분리시키거나 확인하는데 본 명세서에 개시된 분리된 핵산 분자를 사용할 수 있다.
예를 들어, 낮은 스트린전트 하이브리드화 조건 이상 또는 그와 등가의 조건하에서 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 19 또는 서열 번호 20 또는 그 상보성 서열 또는 그 작용부 중의 하나에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자의 하이브리드화 유효량과 게놈성 DNA, 또는 mRNA, 또는 cDNA를 접촉시킬 수 있다.
검출 방법은 본 발명의 분리된 핵산 분자와 공유 결합적으로 결합된 확인가능한 신호(예를 들어,32P 또는35S 또는 비오티닐화된 분자와 같은 방사성 동위원소)를 나타낼 수 있는 리포터 분자일 수 있다.
또 다른 방법으로, 검출 방법은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)의 임의의 공지된 포맷이다. 이 방법에 따르면, 길이 약 15-50개의 뉴클레오티드의 핵산 "프라이머 분자"의 변성 푸울은 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 19 또는 서열 번호 20 또는 그 상보성 서열에 개시된 뉴클레오티드 서열을 기초로 고안된다. 이 상동체, 유사체 또는 유도체(즉, "주형 분자")는 2개의 상기 프라이머 분자로 하이브리드화되어 제1프라이머는 주형 분자의 한 가닥상의 부위로 하이브리드화되고 제2프라이머는 그 상보성 서열로 하이브리드화되며, 상기 제1프라이머 및 제2프라이머는 주형 분자의 동일 부위 또는 오버랩핑 부위에서 하이브리드화되지 않으며 상기 각 프라이머는 다른 한 프라이머가 마주보는 가닥상에서 하이브리드화되는 위치에 대해 5'- 내지 3'- 방향에서 위치된다. 주형 분자의 특정 핵산 분자의 복제는 폴리머라제 연쇄 반응에서 효소적으로 증폭되며, 그 기술은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
프라이머 분자는 자연 발생적 뉴클레오티드 잔기(즉, 아데닌, 시티딘, 구아닌, 티미딘)를 포함하고/또는 폴리뉴클레오티드 분자 중으로 혼입될 수 있는 이노신 또는 그것의 기능성 유사체 또는 유도체을 포함할 수 있다. 또한 핵산 프라이머 분자는 다른 핵산 프라이머 분자 또는 실질적으로 순수한 형태 중에 포함될 수 있다.
검출된 서열은 바이러스 입자, 박테리오파지 입자, 효모 세포, 동물 세포 또는 식물 세포 중에 재조합 형태로 존재할 수 있다. 관련 유전 서열은 다른 식물 종에서 기원하는 것이 바람직하다.
본 발명의 제3 양태는 서열 번호 1, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6 또는 그 상동체, 유사체 또는 유도체 중 하나에 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.
본 명세서의 한 구체예에서, 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에서 제시된 아미노산 서열의 상동체, 유사체 또는 유도체는 상기 개시된 바와 같이 면역적 활성 또는 효소적 활성 폴리펩티드이다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에서 제시된 아미노산 서열의 상동체, 유사체 또는 유도체는 크레피스 종의 아세틸레나제 폴리펩티드 이외에 그것과 60% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명에 포함되는 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에서 제시된 아미노산 서열의 상동체, 유사체 또는 유도체는 약 85% 이상 동일한 것이 바람직하며, 약 90% 이상 동일한 것이 더욱 바람직하고 약 95% 이상 동일한 것이 더욱더 바람직하며 약 99%∼100% 동일한 것이 그보다 더 바람직하다.
또한 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6 중 하나의 상동체, 유사체 또는 유도체는 전술한 바와 같이 히스티딘이 풍부한 부위를 포함할 수 있다. 적어도 에폭시제나아제는 하기와 같은 히스티딘이 풍부한 3 이상의 부위를 포함하는 아미노산 서열 또는 그 상동체, 유사체 또는 유도체를 포함하는 것이 보다 바람직하다:
(i) His-Glu-Cys-Gly-His-His (서열 번호 15);
(ii) His-Arg-Asn-His-His (서열 번호 16); 및
(iii) His-Val-Met-His-His (서열 번호 17).
이와 다른 구체예에 따라 기재된 발명은 아라비돕시스 탈리아나, 브라시카 준세아, 브라시카 나푸스 또는 글리신 막스, 기타로부터 유래된 △12-탈포화 효소를 포함하지 않는다.
본 발명의 분리된 핵산 분자는 센스 분자를 포함하는 유전자 작제물을 발생시키는데 유용하며, 상기 유전자 작제물은 상기 핵산 분자를 정상적으로 발현시키지 않는 세포에서의 발현 또는 상기 핵산 분자를 정상적으로 발현시키는 세포에서의 상기 핵산 분자의 과발현을 위해 고안된 것이다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 프로모터 서열과 실시가능하게 연결된 센스 분자를 포함하는 유전자 작제물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 "센스 분자"라는 용어는 지방산 에폭시게나제를 암호화하는 분리된 핵산 분자와 상보적이거나 또는 이를 암호화하는 분리된 핵산 분자를 가리키는 것으로 간주할 수 있는데, 상기 핵산 분자는 상기 센스 분자가 형질감염 또는 형질전환에 의해 숙주 세포 중으로 도입되는 경우 재조합 폴리펩티드를 생성하기 위한 발현에 적합한 포맷으로 제공된다.
당업자는 유전자 작제물을 사용하여 세포를 "형질감염"시키는데, 이 경우 세포 게놈내로 통합되지 않고 상기 세포내로 도입된다. 또 다른 방법으로, 유전자 작제물을 사용하여 세포를 "형질전환"시키는데, 이 경우 상기 세포의 게놈 중으로 안정하게 통합된다.
세포를 형질감염 또는 형질전환시키는 임의의 공지된 방법을 사용하여 지방산 에폭시게나제 유전자 서열 또는 그 상동체, 유사체 또는 유도체에 상응하는 센스 분자를 세포 중에 도입시킬 수 있다. 세포가 본 발명의 작제물에 의해 형질전환되는 경우, 당업자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 단일 형질전환된 세포로부터 전체 유기체를 재생시킬 수 있다.
따라서, 트랜스펙트 또는 형질전환된 세포가 유래된 것과 동일한 속 또는 종에 속하는 야생 또는 자연 발생적 유기체에 의해 정상적으로 생성되지 않는 에폭시 지방산을 합성하는 전체 유기체 또는 단일 세포를 발생시키기 위해, 또는 그런 야생 또는 자연 발생적 유기체에서 정상적으로 발견되는 레벨 이상의 지방산의 레벨을 증가시키기 위해 본 명세서에 기재된 에폭시게나제 유전자를 사용할 수 있다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 분리된 핵산 분자는 세포중에서, 그곳에서 발현될 때, 안티센스 방향에서 또는 적합한 프로모터 서열하에서 리보자임 또는 공동억제 분자로서 에폭시 지방산의 레벨을 감소시킬 수 있다.
공동억제는 상기 유전자 하나 이상의 카피 또는 실질적으로 유사한 유전자의 하나 이상의 카피가 세포내로 도입될 경우 발생하는 내인성 유전자의 발현에서의 감소이다. 또한 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 에폭시게나제 유전자의 발현을 억제하기 위한 공동억제의 사용까지 확장된다.
본 발명의 내용에서, 안티센스 분자는 핵 유전자의 상보성 가닥으로부터 폴리펩티드내로 번역될 수 있는 "센스" mRNA 분자를 생성하기 위해 정상적으로 전사되는 것으로 전사되는 RNA 분자이다. 따라서 안티센스 분자는 센스 mRNA, 또는 그 일부와 상보적이다. 본 발명의 안티센스 분자의 작용 방식이 임의의 특정 매카니즘에 제한되는 것은 아니지만, 안티센스 RNA 분자는 센스 mRNA와 염기 쌍을 이룸으로서 2중 가닥 mRNA를 형성하기 위한 부분을 포함하며, 센스 mRNA의 번역과 후속되는 폴리펩티드 유전자 생성물의 합성을 방해할 수 있다.
리보자임은 각각 표적 센스 mRNA에서 5 이상의 인접 뉴클레오티드 염기인 두 부위에 상보적인 하이브리드화부를 포함하는 합성 RNA 분자이다. 또한, 리보자임은 표적 센스 mRNA를 자동촉진작용으로 절단하는 고도의 특이성 엔도리보뉴클레아제를 포함한다. 리보자임의 작용의 완전한 설명은 하셀로프(Haseloff) 및 게라흐(Gerlach) (1988)에 의해 제시되었으며 국제 특허 출원 WO89/05852호에 포함되어 있다. 본 발명은 본 명세서에 기재된 에폭시게나제 폴리펩티드를 암호화하는 센스 mRNA를 표적화하여 상기 센스 mRNA로 하이브리드화되고 그것을 절단시켜 더이상 기능성 폴리펩티드 생성물을 합성하기 위해 번역될 수 없는 리보자임에까지 확장된다.
이 구체예에 따르면, 본 발명은 본 명세서에 기재된 에폭시게나제를 암호하하는 센스 mRNA와 수소 결합 복합체를 형성할 수 있는 인접 뉴클레오티드 염기 서열을 포함하는 안티센스 분자 또는 리보자임을 제공하여 상기 mRNA의 번역을 감소시킨다. 바람직한 안티센스 및/또는 리보자임 분자는 표적 분자의 약 10 내지 20 이상의 뉴클레오티드에 하이브리드화되지만, 본 발명은 길이 약 50∼100 뉴클레오티드 염기로 하이브리드화시킬 수 있는 분자 또는 전체 길이 또는 거의 전체 길이인 에폭시게나제 mRNA에 하이브리드화시킬 수 있는 분자에까지 확장된다.
에폭시게나제 유전자의 발현을 억제하는데 상기 분자의 효능을 해치지 않으면서, 뉴클레오티드 치환을 포함하여 다른 것들 중에서 본 발명의 안티센스 및/또는 리보자임 분자로의 임의의 변형이 가능하다는 것이 당업계에서는 이해될 수 있다. 따라서 임의의 뉴클레오티드 서열 변이체, 상동체, 유사체, 또는 동일한 것을 암호화하는 상기 유전자의 단편이 본 발명의 범위내에서 포함되는데, 단, 상기 뉴클레오티드 서열 변이체가 번역될 때, 상기 센스 mRNA 분자로 하이브리드화될 수 있는 안티센스 및/또는 리보자임 분자를 생성해야 한다는 것이 요구된다.
본 발명은 세포중에 에폭시 지방산의 레벨을 변화시킬 수 있는 센스 분자, 안티센스 분자, 리보자임 분자, 또는 공동억제 분자의 발현을 용이하게 하기 위해 고안된 유전 작제물까지 확장된다.
특히 바람직한 구체예에서, 식물 또는 다른 유기체에서 유래된 세포의 에폭시 지방산 조성물을 변화시킬 수 있는 센스 분자, 안티센스 분자, 리보자임 분자, 공동억제 분자 또는 유전자 표적화 분자는 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 19 또는 서열 번호 20 중의 하나 및 보다 바람직하게는 서열 번호 1, 서열 번호 3 서열 번호 5, 더욱 바람직하게는 서열 번호 1 또는 그 상보성 가닥, 상동체, 유사체 또는 유도체 중에 제시된 뉴클레오티드의 서열을 포함한다.
또한 당업자는 센스, 안티센스, 리보자임 또는 공동억제 분자의 발현이 프로모터 서열과 작동가능하게 연결되어 위치되기 위해서 본 발명의 핵산 분자를 필요로한다는 것을 알 수 있을 것이다. 본 목적을 위한 프로모터의 선택은 숙주 세포가 유래된 종 및/또는 필요한 센스 분자의 발현 레벨 및/또는 필요한 센스 분자의 발현의 조직-특이성 또는 발생-특이성에 따라 달라질 수 있다.
본 명세서에서 언급된 "프로모터"는 가장 광범위한 의미로 간주되며, CCAAT 박스 서열의 유무하에, 정확한 전사 개시를 위해 필요한 TATA 박스와 조직-특이적 방식으로 또는 발생적 자극 및/또는 외부 자극에 대한 반응에서 유전자 발현을 달리하는 추가 조절 요소(즉, 상류 활성화 서열, 인헨서 및 사이렌서)를 포함하여 고전적인 진핵 게놈성 유전자의 전사적 조절 서열을 포함한다. 또한, 본 발명의 내용에서, "프로모터"라는 용어는 -35 박스 서열 및/또는 -10 박스 전사 조절성 서열을 포함하는 경우에, 고전적인 원핵 유전자의 전사적 조절 서열을 포함한다.
또한 본 발명의 내용에서, "프로모터"라는 용어는 세포중의 상기 센스 분자의 발현을 부여하고, 활성화시키거나 또는 증진시키는 합성 또는 융합 분자 또는 유도체를 설명하는데 사용된다. 바람직한 프로모터는 추가로 센스 분자의 발현을 증진시키고/또는 상기 센스 분자의 공간 발현 및/또는 임시 발현을 변화시키기 위해 하나 이상의 특이적 조절 요소의 추가 복제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 구리 유도성 발현을 부여하는 센스 분자의 발현을 유도하는 이종 프로모터 서열에 인접하게 구리 반응성 조절 성분을 위치시킬 수 있다.
프로모터 서열의 조절적 제어하에 센스, 안티센스, 리보자임 또는 공동억제성 분자를 위치시키는 것은 발현이 프로모터 서열에 의해 제어되도록 상기 분자를 위치시키는 것을 의미한다. 프로모터는 통상 그것이 조절하는 핵산 분자의 상류 또는 5′에 위치하지만, 반드시 그런 것은 아니다. 또한, 프로모터를 포함하는 조절 인자는 일반적으로 센스, 안티센스, 리보자임 또는 공동억제 분자, 또는 동일한 것을 포함하는 키메라 유전자의 전사 시작 부위의 2 kb내에 위치한다. 이종 프로모터/구조 유전자의 조합의 구조내에서, 프로모터와 그것이 본연의 상태에서 조절하는 유전자(즉, 프로모터가 유래된 유전자)의 거리와 거의 동일한, 유전자 전사 시작 부위로부터의 거리에 프로모터를 위치시키는 것이 일반적으로 바람직하다. 당업계에 공지된 바와 같이 이 거리에서의 약간의 변화는 프로모터 기능의 손실없이 조정될 수 있다. 유사하게, 그것의 조절하에 위치한 이종 유전자에 대한 조절 서열 인자의 바람직한 위치는 본연의 인자(즉, 그것이 유래된 유전자)의 위치에 의해 규정된다. 또한, 당업자에게 알려진 바와 같이, 거리에 있어 약간의 변화는 또한 일어날 수 있다.
본 발명의 유전자 작제물에 사용하기 적합한 프로모터의 예는 분리된 세포 또는 그것으로부터 재생된 전 유기체내에서 작용할 수 있는 바이러스, 효모, 곰팡이, 박테리아, 곤충, 조류, 포유류 및 식물로부터 유래된 프로모터를 포함한다. 프로모터는 발현이 일어나는 조직 또는 발현이 일어나는 발달 단계에 대해, 또는 생리학적인 스트레스, 병원체, 또는 금속 이온 등과 같은 외부 자극에 대한 응답으로 센스, 안티센스, 리보자임 또는 공동억제 분자의 발현을 구조적으로 또는 개별적으로 조절할 수도 있다.
프로모터의 예로서 CaMV 35S 프로모터, NOS 프로모터, 옥토핀 신타아제(OCS) 프로모터, 아라비돕시스 탈리아나 SSU 유전자 프로모터, 내핀(napin) 종자-특이성 프로모터, P32프로모터, BK5-T imm 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, 파지 람다 λL또는 λR프로모터, CMV 프로모터(미국 특허 번호 제 5,168,062호), T7 프로모터, lacUV 프로모터, SV40 초기 프로모터(미국 특허 번호 제 5,118,627호), SV40 후기 프로모터(미국 특허 번호 제 5,118,627호), 아데노바이러스 프로모터, 바쿨로바이러스 P10 또는 폴리헤드린 프로모터(미국 특허 번호 제 5,243,041호, 5,242,687호, 5,266,317호, 4,745,051호 및 5,169,784호) 등이 포함된다. 본원에 확인된 특정 프로모터 외에, 소위 하우스키핑(housekeeping) 유전자에 대한 세포성 프로모터가 유용하다.
본 구체예에 따른 바람직한 프로모터는 효모, 곰팡이 또는 식물 세포에서 작용할 수 있는 프로모터이다. 본 구체예에 따라 사용하기에 적합한 프로모터는 유성 효모, 유성 곰팡이 또는 종유 농작물, 예를 들어 리놀라(등록상표)(본원에서는 "리놀라(등록상표)아마"로 언급됨)라는 상표명으로 시판되는 아마, 해바라기, 홍화, 대두, 아마인, 참깨, 목화씨, 땅콩, 올리브 또는 야자 등에서 유래된 세포내에서 작용할 수 있다면 더 바람직하다.
리놀라(등록상표)는 오스트레일리아의 커먼웰스 사이언티픽 앤드 인더스트리얼 리서치 오거니제이션(CSIRO)의 등록상표이다.
더 바람직한 구체예에서, 프로모터는 에폭시게나아제 효소를 암호화하는 게놈성 클론, 바람직하게는 본원에 언급된 크리산테뭄 종, 크레피스 종(크레피스 팔라에스티나 또는 기타 크레피스종을 포함), 유포비아 라가스케 또는 베르노니아 갈라멘시스에서 유래된 에폭시게나아제 유전자의 게놈성 유전자 등가물로부터 유래될 수 있다.
더 바람직한 구체예에서, 프로모터는 고도로 발현된 종자 유전자, 예를 들어 내핀 유전자 등으로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 유전자 작제물은 종지인자 서열을 추가로 포함할 수 있고, 재조합 폴리펩티드 유전자 생성물 또는 대안적으로 리보자임 또는 안티센스 분자를 생산하기 위해 그것이 발현될 수 있는 적합한 숙주 세포내로 도입될 수 있다.
"종지인자"라는 용어는 전사의 종료를 신호하는 전사 단위의 말단에 있는 DNA 서열을 의미한다. 종지인자는 폴리아데닐화 시그날을 함유하는 3′-비번역 DNA 서열로서, 1차 전사의 3′-말단으로의 폴리아데닐레이트 서열 첨가를 촉진한다. 바이러스, 효모, 곰팡이, 박테리아, 곤충, 조류, 포유류 및 식물에서 유래된 세포에서 활성인 종지인자가 알려져 있으며, 문헌에 기재되어 있다. 이들은 박테리아, 진균류, 바이러스, 동물 및/또는 식물에서 분리될 수 있다.
본 발명의 유전자 작제물에 사용하기 특히 적합한 종지인자의 예로서 아그로박테리움 투메파시엔스의 노팔린 신타아제 (NOS) 유전자 종지인자, 컬리플라워 모자이크 바이러스(CaMN) 35S 유전자의 종지인자, 제아 마이즈(Zea mays)의 Zein 유전자 종지인자, 루비스코 소 단위(SSU) 유전자 종지인자 서열, 서브클로버 스턴트 바이러스(SCSV) 유전자 서열 종지인자, 임의의 rho-독립적인 대장균 종지인자 등이 있다.
당업자는 본 발명의 수행에 사용하기 적합할 수 있는 추가의 프로모터 서열과 종지인자 서열을 알 수 있을 것이다. 이러한 서열은 임의의 부당한 실험없이 용이하게 사용될 수 있다.
본 발명의 유전자 작제물은 그것이 특정한 형태의 세포(예를 들어 박테리아 세포)내에 에피솜의 유전 인자(예, 플라스미드 또는 코스미드 분자)로서 유지될 필요성이 있는 경우, 상기 세포에서 복제하는데 필요한 복제 서열의 기원을 추가로 포함할 수 있다.
바람직한 복제점(origin of replication)은 f1-ori 및 colE1 복제점을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
유전자 작제물은 유전자 작제물이 도입된 세포내에서 작용성인 선택가능한 마커 유전자(들)을 추가로 포함할 수도 있다.
본원에 기재된 것과 같이, 용어 "선택가능한 마커 유전자"는 이것이 발현되어 본 발명의 유전자 작제물 또는 그것의 유도체로 형질감염 또는 형질전환된 세포의 확인 및/또는 선별을 촉진시키는 세포상에 표현형을 부여하는 임의의 유전자를 포함한다.
본원에서 고려된 적합한 선택가능한 마커 유전자로는 암피실린 내성 유전자 (Ampr), 테트라사이클린 내성 유전자 (Tcr), 박테리아 카나마이신 내성 유전자 (Kanr), 포스피노트리신 내성 유전자, 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자(nptⅡ), 하이그로마이신 내성 유전자, β-글루쿠로니다아제 (GUS) 유전자, 클로람페니콜 아세틸트랜스페라아제 (CAT) 유전자 및 루시퍼라아제 유전자 등을 포함한다.
본 발명의 다른 양태는 본원에 기재된 것과 같은 재조합 에폭시게나아제 폴리펩티드 또는 리보자임, 안티센스 또는 공동억제 분자, 또는 이것의 상동체, 유사체 또는 유도체를 발현하는 형질감염되거나 형질전환된 세포, 조직, 기관 또는 전 유기체를 포함한다.
분리된 핵산 분자는 본원에 기재된 것과 같은 유전자 작제물 내에 포함되는 것이 바람직하다. 본 발명의 유전자 작제물은 당업자에게 알려진 다양한 기법이 의해 세포내로 도입될 수도 있다. 사용된 기법은 특정 유기체에 대해 알려진 성공적인 기법에 따라 달라질 수 있다.
박테리아 세포, 효모 세포 또는 식물, 곤충, 진균류(곰팡이 포함), 조류 또는 포유류의 조직 또는 세포내로 재조합 DNA를 도입하기 위한 방법으로는 CaCl2및 그것의 변형체를 사용한 형질전환[특히, Hanahan (1983)에 의해 기재된 방법], 원형질로의 직접적인 DNA의 섭취(Krens et al, 1982; Paszkowski et al, 1984), 원형질로의 PEG-매개 섭취(Armstrong et al, 1990), 미소입자 충격, 일렉트로포레이션(electroporation; Fromm et al, 1985), DNA의 미소주입(Crossway et al., 1986), 조직 외식편 또는 세포의 미소입자 충격(Christou et al, 1988; Sanford, 1988), 핵산을 사용한 조직의 진공-침투, 또는 식물의 경우에 문헌[An et al.(1985), Herrera-Estrella et al. (1983a, 1983b, 1985)]에 기재된 것과 동일하게 아그로박테리움에서 식물 조직으로의 T-DNA 매개 이동이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
세포의 미소입자 충격에 있어서, 미소입자는 세포내로 주입되어 형질전환된 세포를 생성한다. 임의의 적합한 비행 세포 형질전환법 및 기구가 본 발명을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 기구 및 방법은 미국 특허 번호 제 5,122,466호(tomp 등) 및 미국 특허 번호 제 4,945,050호(Sanford 및 Wolf)에 개시되어 있다. 비행 형질전환법을 사용할 경우, 유전자 작제물은 형질전환될 세포내에 복제가능한 플라스미드를 포함할 수도 있다.
이러한 시스템에 사용하기 적합한 미소입자의 예는 1 내지 5 ㎛의 금구를 포함한다. 임의의 적합한 기법, 예를 들어 침강에 의해 DNA 작제물은 미소입자 상에 침착될 수 있다.
유전자 작제물 "센스" 분자를 포함하는 특정한 바람직한 구체예에서, 그것으로부터 생성된 재조합 에폭시게나아제 폴리펩티드가 효소적으로 활성인 것이 특히 바람직하다.
대안적으로, 세포가 다세포 유기체로부터 유래되고, 관련 기법이 유용한 경우, 전 유기체가 당업계에 알려진 방법에 따라 형질전환된 세포로부터 재생성될 수 있다.
당업자는 다른 유형의 세포, 예를 들어 진균을 형질전환, 재생성 및 증식시키는 방법에 대해 또한 알고 있을 것이다.
식물의 경우, 기관형성 또는 배형성에 의해 차후의 클로날 증식이 가능한 식물 조직은 본 발명의 유전자 작제물 및 그로부터 재생된 전 식물로 형질전환될 수 있다. 선택된 특정 조직은 형질전환될 특정한 종류에 유용하고 가장 적합한 클로날 증식 시스템에 따라 달라질 것이다. 예시적인 조직 표적은 엽 화반, 화분, 배, 자엽, 배축, 메가배우체(megagametophytes), 유합 조직, 기존의 분열조직(예: 정상의 분열조직, 엽액의 분열조직 및 뿌리의 분열조직) 및 유도된 분열조직(예: 자엽 분열조직 및 배축 분열조직)을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "기관형성"은 새순 및 뿌리가 분열조직 중심으로부터 순차적으로 발달하는 방법을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "배형성"은 새순 및 뿌리가 체세포 또는 생식체로부터 일치된 방식으로(순차적이 아님) 함께 발육하는 방법을 의미한다.
재생된 형질전환 식물은 다양한 수단, 예를 들어 클로날 증식 또는 통상의 번식 기법에 의해 증식될 수 있다. 예를 들어 제1 세대(또는 T1) 형질전환된 식물은 자가수분되어 동질 접합체의 제2 세대(또는 T2) 형질전환체, 및 통상의 번식 기법을 통해 추가로 증식된 T2 식물을 생성한다.
본원에서 고려한 재생된 형질전환 유기체는 다양한 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 이들은 형질전환된 세포 및 비형질전환된 세포의 키메라; 클로날 형질전환체(예: 발현 카세트를 함유하도록 형질전환된 모든 세포); 형질전환 및 비형질전환된 조직의 이식편(예: 식물에서, 형질전환되지 않은 접순(scion)에 이식된 형질전환된 뿌리 줄기)일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 세포, 조직, 기관 또는 유기체에서 에폭시 지방산의 레벨을 변화시키는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 일정한 시간동안 에폭시 지방산의 레벨을 증가시키거나 감소시키기에 충분한 조건하에서 센스, 안티센스, 리보자임 또는 공동억제성 분자를 발현시키는 것을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 이 방법은 세포, 조직, 기관 또는 유기체를 센스, 안티센스, 리보자임 또는 공동억제성 분자로 형질전환시키는 추가의 제1단계를 포함한다.
전술한 것과 같이, 분리된 핵산 분자는 유전자 작제물 내에 포함될 수도 있다.
본 구체예에 따르면, 센스, 안티센스, 리보자임 또는 공동억제성 분자가 발현되는 세포, 기관, 조직 또는 유기체는 박테리아, 효모, 진균류(곰팡이 포함), 곤충, 식물, 조류 또는 포유류에서 유래될 수 있다.
재조합 에폭시게나아제 폴리펩티드가 재생된 형질전환체 및 생체외에서 생성되므로, 본 발명의 바람직한 대안적인 구체예는 세포내에서 효소적으로 활성인 재조합 에폭시게나아제 폴리펩티드를 생성하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
(ⅰ) 세포내에서 유전자 서열상에 발현을 제공할 수 있는 프로모터, 임의적으로 발현 인헨서 성분의 조절하에 작동 가능하게 위치한 본 발명의 cDNA 또는 게놈성 에폭시게나아제 유전자 서열을 포함하는 유전자 작제물을 제공하는 단계;
(ⅱ) 상기 유전자 작제물을 상기 세포내로 형질전환시키는 단계; 및
(ⅲ) 유전자 서열에 의해 높은 레벨로 암호화된 에폭시게나아제를 다량 발현시키는 형질전환체를 선택하는 단계.
본 발명의 특정한 바람직한 구체예는 하기 단계를 포함하는 돌연변이 식물내에서 효소적으로 활성인 재조합 에폭시게나아제 폴리펩티드를 생성하는 방법을 제공한다:
(ⅰ) 종자-특이성 프로모터, 임의적으로 발현 인헨서 성분의 조절하에서 작 가능하게 위치한 본 발명의 cDNA 또는 게놈성 에폭시게나아제 유전자 서열을 포함하는 유전자 작제물을 제공하는 단계로서, 상기 유전자 서열이 또한 전사 종지인자 서열의 상류에 위치하는 단계;
(ⅱ) 상기 유전자 작제물을 상기 식물의 세포 또는 조직내로 형질전환시키는 단계; 및
(ⅲ) 유전자 서열에 의해 암호화된 에폭시게나아제를 종자내에서 다량 발현하는 형질전환체를 선별하는 단계.
특히 더 바람직한 구체예에서, 식물은 유의 수준의 리놀렌산, 예를 들어 리놀라(등록상표) 아마, 종유 평지, 해바라기, 홍화, 대두, 아마인, 참깨, 목화씨, 땅콩, 올리브 또는 야자 등을 정상적으로 생성하는 종유 종류이다.
특히 더 바람직한 구체예에서, 식물은 유의 수준의 리놀렌산, 예를 들어 리놀라(등록상표) 아마, 해바라기 또는 홍화 등을 정상적으로 생성하는 종유 종이다.
본원에 기재된 효소적으로 활성인 재조합 에폭시게나아제는 불포화 지방산 기질로부터 에폭시 형성된 지방산을 생성하는 데 특히 유용하다. 본 발명은 특이적인 에폭시형성 지방산을 정상적으로 생성하지 않는 세포 또는 재생된 형진변환된 유기체내에서 특이적인 에폭시 형성된 지방산을 생성하는 것을 특히 고려하고 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 세포, 조직, 기관 또는 유기체내에서 에폭시겐화 지방산을 생성하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 본 발명의 효소적으로 활성인 재조합 에폭시게나아제를 발현하는 세포, 조직, 기관 또는 유기체를 지방산 기질 분자, 바람직하게는 불포화 지방신 기질 분자와 함께 상기 기질의 하나 이상의 탄소 결합이 에폭시기로 전환되기에 충분한 조건하에서 일정 시간동안 배양하는 것을 포함한다.
대안적인 방법에서, 상기 방법은 상기 재조합 에폭시게나아제 또는 그것의 상동체, 유사체 또는 유도체를 암호화하는 핵산 분자로 세포, 조직, 기관 또는 유기체를 형질전환 또는 형질감염시키는 부가적인 제1단계를 추가로 포함한다. 전술한 바와 같이, 분리된 핵산 분자는 유전자 작제물 내에 포함될 수 있다.
본 구체예에 따라서, 상기 에폭시게나아제가 발현되는 세포, 기관, 조직 또는 유기체는 박테리아, 효모, 진균류(곰팡이 포함), 곤충, 식물, 조류 또는 포유류에서 유래된다. 세포, 기관, 조직 또는 유기체가 효모, 식물 또는 진균뒤에서 유래되는 것이 더 바람직히며, 유성 효모 또는 식물 또는 진균류, 또는 본 발명의 재조합 에폭시게나아제를 정상적으로 발현하지 않는 종유 식물에서 유래된 것이 더욱 바람직하다.
본원에서 고려되었던 주된 경제적인 종유 식물 가운데, 아마, 해바라기, 옥수수 및 홍화의 리놀레인을 다량 발현하는 유전형이 바람직한 표적이다. 대두 및 평지는 대안적인 표적이나, 이들의 저수준의 리놀렌산 기질이 소량이고 디놀레산 기질에 대해 에폭시게나아제와 경쟁하는 활성15-탈포화 효소(desaturase)의 존재에 기인하여 최적의 에폭시 지방산이 될 수 없다.
대안적인 구체예는 본 발명의 에폭시게나아제를 사용한 리놀라(등록상표)(=저 리놀렌산 아마)의 형질전환이다. 리놀라(등록상표)아마는 정상적으로15-탈포화 효소에 의해 리놀렌산으로 차후에 전환되는 극소량(＜ 2%)의 이것과 함께 리놀렌산의 70% 가량을 함유한다(Green, 1986).
본원에서 고려된 바람직한 불포화 지방산은 팔미톨산, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산 및 아리키돈산 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
자연적으로 다량의 베르놀산을 함유하는 식물 종에서,12-에폭시게나아제는 리놀렌산을 에폭시화하는 데 매우 유효할 수 있다. 결과로서, 본 발명은 돌연변이 종유에서 종자 오일 합성동안에 유포비아 라가스케, 베르노니아 종 및 크레피스 종으부터 유래된 재조합12-에폭시게나아제를 다량 발현하여 높은 레벨의 베르놀산을 생성하는 것을 특히 고려하고 있다.
따라서, 리놀렌산은 본 발명의 구체예에 따른 특히 바람직한 기질이다. 다른 기질을 제외하는 것은 아니다.
전술한 기질의 생성물은 과도한 실험없이 당업자에 의해 용이하게 측정될 것이다. 본 발명에 따라 생성된 특히 바람직한 에폭시 지방산은 12,13-에폭시-9-옥타데센산(베르놀산) 및 12,13-에폭시-9,15-옥타데카디엔산 등을 포함한다.
기질 분자의 존재하에서 재조합 에폭시게나아제를 발현하는 세포, 기관, 조직, 또는 유기체를 배양하기 위한 조건은 세포, 조직, 기관 또는 유기체내로의 기질의 섭취 및 특히 선택된 환경에서 기질 분자에 대한 에폭시게나아제의 친화성에 따라 달라질 것이다. 최적의 조적은 관련 분야의 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명은 전술한 것과 같은 에폭시 지방산 및/또는 분리된 에폭시 지방산 자체를 함유하는 분리된 오일 및 그로부터 유래된 임의의 생성물, 예를 들어 코팅, 수지, 접착제, 플라스틱, 계면활성제 및 윤활제 등으로 확대되는 것은 분명하다.
본 발명자들은 탈포화, 아세틸렌화, 히드록실화 및/또는 에폭시 형성을 수행하는 혼합 작용성 모노옥시게나아제(MMO)가 상당한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 유사성을 공유하는 한 계열의 유전자를 형성하는 것을 추가로 밝혀내었다. 예를 들어, 유사한 쇄의 길이 및 임의의 탄소 이중 결합(존재하는 경우)의 위치를 가진 기질 분자상에 작용하는 탈포화 효소, 아세틸레나아제, 히드록실라아제 및/또는 에폭시게나아제 효소는 다른 기질상에서 작용하는 효소에 비해 서로 더 밀접하게 관련되어 있으므로 "한 계열"로 생각될 수 있다.
작용의 임의의 이론이나 양식에 의해 구애되지 않더라도, 임의의 유전자 계열 사이의 서열 유사성은 변형 반응동안에 표적 탄소 결합에서 일어나는 반응 과정의 생화학적 유사성 및 관여하는 기질의 동일성에 기초하는데, 이는 한 계열내의 다양한 서열은 하나의 계열의 일원의 특이적인 촉매적 성질에 기여하는 촉매 결정원 또는 하나 이상의 작용부를 포함할 것이라는 사실을 암시한다.
한 계열의 일례로는 탈포화 효소, 아세틸레나제, 히드록실라제 및/또는 에폭시게나제 효소가 있으며, 이들은 각기 리놀레산의 Δ12 위치의 탈포화, 아세틸렌화, 히드록실화 및/또는 에폭시 형성을 촉진한다(이하, "C18 Δ12-MMO 계열"이라고 함). 본 발명자들은 C18 Δ12-MMO 계열의 구성원의 뉴클레오티드 서열과 아미노산 서열을 비교하여 가능하게는 Δ12 위치에서 또 다른 촉매 기능의 결정 인자(이하 "추정적 촉매 결정 인자"라고 함)를 포함하는 이들의 분기 영역을 결정하였다.
더욱이, 이러한 지방산 변성 MMO 계열의 존재는 다른 지방산 사슬 길이와 이중 결합 위치에 대해서 고려된다. 예를 들면, C18 Δ12-탈포화 효소는 C18 지방산 기질 내 Δ15 위치의 탈포화, 아세틸렌화, 히드록실화 및/또는 에폭시화를 할 수 있는 관련 효소의 계열, 즉 C18 Δ15-MMO 계열에 속하는 것으로 생각된다.
이들 촉매 결정 인자를 상호 교환("도메인 교환"이라고 함)한 합성 유전자를 생성하기 위하여, 한 촉매 기능을 암호화하는 유전자를 또 다른 촉매 작용을 암호화하는 유전자로 전환시킬 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 Δ12 에폭시게나제는 그것의 C 말단 및 N 말단 서열 부분을 크레피스 알피나 Δ12 아세틸레나제로부터의 등가 도메인으로 대체함으로써 Δ12 아세틸레나제로 전환시킬 수 있다. 유사하게, 도메인 역교환도 실행할 수 있다.
더 정밀한 방법으로서, 이러한 촉매 기능 변화는, 관련 촉매 기능을 결정하는 데(예를 들면, 부위 지향된 돌연변이 유발에 의하여) 중요한 각각의 도메인 내의 단지 이들 아미노산에 특이적인 변화(예를 들면, 첨가, 치환 또는 결실)를 일으킴으로써 유사하게 실행될 수 있다.
따라서, 본 발명의 또다른 양태는 본 명세서에 기재된 바와 같은 에폭시게나제 유전자로부터 유도된 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 합성 지방산 유전자에 관한 것이며, 상기 합성 지방산 유전자는 에폭시게나제 또는 아세틸레나제 또는 히드록실라제 또는 탈포화 효소 활성을 가진 폴리펩티드를 암호화하고, 상기 폴리펩티드는 자연 발생적 에폭시게나제, 아세틸레나제, 히드록실라제 또는 탈포화 효소 효소와는 다른 아미노산 서열을 포함하거나, 상기 폴리펩티드는 자연 발생적 에폭시게나제, 아세틸레나제, 히드록실라제 또는 탈포화 효소 효소와는 다른 촉매 성질을 나타내거나, 또는 상기 폴리펩티드는 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6의 일부와 적어도 약 60%가 동일하거나, 상기 부분의 상동체, 유사체 또는 유도체인 아미노산의 서열을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 합성 지방산 유전자는 Δ12 에폭시게나제 유전자로부터 유도된다.
한 가지 구체예에서, 본 발명의 합성 지방산 유전자는 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6 중 어느 하나의 N 말단 및/또는 C 말단 아미노산이 동 계열의 상이한 구성원의 아미노산 서열에 의해 프레임 내에서 대체된다.
특히 바람직한 구체예에서, 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6의 N 말단 및/또는 C 말단 아미노산은 도 2에 도시한 아세틸레나제, 탈포화 효소 또는 히드록실라제 폴리펩티드의 해당 영역으로 대체된다. 보다 바람직하게는, 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6 중 어느 하나의 N 말단 및/또는 C 말단 영역으로부터 약 30 개 이상의 아미노산 잔기는 도 2에 도시한 아세틸레나제, 탈포화 효소 또는 히드록실라제 폴리펩티드의 해당 영역으로 대체된다.
다른 구체예에서, 본 발명의 합성 지방산 유전자는 지방산 아세틸레나제, 지방산 히드록실라제 또는 지방산 탈포화 효소의 N 말단 및/또는 C 말단 아미노산이 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6 중 어느 하나의 N 말단 및/또는 C 말단 영역으로 프레임 내에서 대체된 융합 폴리펩티드를 암호화한다.
특히 바람직한 구체예예서, 지방산 아세틸레나제, 지방산 히드록실라제 또는 지방산 탈포화 효소의 N 말단 및/또는 C 말단 아미노산은 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6 중 어느 하나의 N 말단 및/또는 C 말단 영역으로 프레임 내에서 대체된다. 더욱더 바람직하게는, 지방산 아세틸레나제, 지방산 히드록실라제 또는 지방산 탈포화 효소는 도 2에 도시된 리스트로부터 선택된다.
보다 더 바람직하게는, 지방산 아세틸레나제, 지방산 히드록실라제 또는 지방산 탈포화 효소의 N 말단 및/또는 C 말단 영역으로부터의 약 30 개 이상의 아미노산 잔기는 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6 중 어느 하나의 N 말단 및/또는 C 말단 영역으로 프레임 내에서 대체된다.
따라서, 본 발명은 본 발명에 관련된 에폭시게나제 효소의 어떠한 변이체에 관한 것이며, 상기 변이체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 에폭시게나제 폴리펩티드로부터 유도되며, 명백한 아세틸레나제, 히드록실라제 또는 탈포화 효소 활성을 나타내고, 자연 발생적 아세틸레나제, 히드록실라제 또는 탈포화 효소 효소와는 다른 아미노산 서열을 포함하거나, 자연 발생적 아세틸레나제, 히드록실라제 또는 탈포화 효소 효소와는 다른 촉매 성질을 나타내거나, 또는 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6 중 어느 하나에 약 60% 이상이 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 명세서에 기재된 변이체는 본 발명의 합성 유전자가 적당한 숙주 세포로 도입되어 발현하기만 하면 재조합 폴리펩티드로서, 또는 돌연변이 유기체 내에서 생성될 수 있다.
본 명세서에 기재된 재조합 폴리펩티드, 또는 그것의 상동체, 유사체 또는 유도체도 면역학적 활성 분자일 수도 있다.
본 발명의 또다른 양태는 본 발명의 재조합 에폭시게나제 폴리펩티드에 결합할 수 있는 면역학적 상호 활성 분자를 제공한다.
바람직하게는, 면역학적 상호 활성 분자가 결합할 수 있는 재조합 에폭시게나제 폴리펩티드는 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6 중 어느 하나에 도시된 아미노산 서열, 또는 이것의 상동체, 유사체 또는 유도체를 포함한다.
한 가지 구체예에서, 면역학적 상호활성 분자는 항체 분자이다. 항체 분자는 모노클론 또는 폴리클론일 수 있다. 모노클론 또는 폴리클론 항체는 에피토프, 또는 재조합 유전자 생성물로부터 유도된 펩티드 단편 또는 합성 에폭시게나제 펩티드에 대한 자연 발생적 항체 중에서 선택할 수 있거나, 특히 재조합 에폭시게나제 또는 그것의 상동체, 유사체 또는 유도체에 대해 발생할 수 있다.
폴리클론 항체와 모노클론 항체는 모두 적당한 유전자 생성물, 또는 에피토프, 또는 유전자 생성물의 펩티드 단편으로 면역화하여 얻을 수 있다. 대안으로, Fab 단편과 같은 항체의 단편을 사용할 수 있다. 본 발명은 재조합 항체 및 합성 항체와 항체 하이브리드에 관한 것이다. 본 명세서에서 "합성 항체"는 항체의 단편 또는 하이브리드를 포함하는 것으로 간주한다.
본 발명에서 고려되는 항체는 본 명세서에 기재된 구체예에 포함되는 관련 에폭시게나제 폴리펩티드를 발현하는 유전자 서열을 동정하는 데 사용할 수 있다.
관련 에폭시게나제 유전자 서열의 성공적인 검출을 위한 유일한 필요 조건은 상기 유전자 서열이 발현하여 항체 분자에 의해 인식되는 하나 이상의 에피토프를 생성하는 것이다. 바람직하게는, 검출을 촉진하는 발현을 얻기 위하여, 관련 유전자 서열은 프로모터 서열, 예를 들면 박테리아 lac 프로모터 뒤에 작동적으로 배치한다. 이 바람직한 구체예에 따르면, 항체는 관련 에폭시게나제를 발현하는 플라스미드 또는 박테리오파지의 존재를 검출하는 데 사용된다. 따라서, 항체 분자는 관련 에폭시게나제를 발현하는 플라스미드 또는 박테리오파지를 정제하는 데에도 유용하다.
본 발명의 항체 분자는 본 발명의 재조합 에폭시게나제, 자연 발생적 등가물 또는 이들의 상동체, 유사체 또는 유도체를 정제하는 데 사용할 수 있다.
본 발명은 다음 실시예를 참조하여 더 기술하며, 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 제1 양태는 지방산 에폭시게나제를 암호화하는 분리된 핵산 분자에 상보적이거나 또는 이 핵산 분자를 암호화하는 분리된 핵산분자를 제공한다.
본 발명의 2 양태는 최소한 엄중도가 낮은 조건하에서 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 19 또는 서열 번호 20의 적어도 20개의 인접한 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보적 서열에 하이브리드화하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 제3 양태는 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 서열 번호 5와 65% 이상 동일하거나 또는 서열 번호 19 또는 20에서 적어도 200 개의 인접 뉴클레오티드 서열에 75% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 상보적 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 제4 양태는 프로모터 서열과 작동가능하게 연결되는 센스 방향 또는 안티센스 방향의 상기 분리된 핵산 분자를 포함하는 유전자 작제물을 제공한다.
본 발명의 제5 양태는 세포, 조직, 기관, 또는 유기체에서 에폭시 지방산 농도를 변형시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 분리된 핵산 분자를 함유하는 센스, 안티센스, 리보자임 또는 공동억제 분자를 에폭시 지방산 농도가 감소 또는 증가되기에 충분한 조건 및 시간하에서 상기 세포내에서 발현하는 것을 포함한다.
본 발명의 제6 양태는 효소 활성이 있는 재조합 에폭시게나제 펩티드를 세포내에서 생성하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 암호된 에폭시게나제가 생성되기에 충분한 시간 및 조건하에서 상기 세포내에서 분리된 핵산 분자를 발현하는 것을 포함한다.
본 발명의 제7 양태는 효소 활성이 있는 재조합 에폭시게나제 폴리펩티드를 상기 세포내에서 생성하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
(i) 상기 세포중에서, 상기 유전자 서열에 형질발현을 부여할 수 있는 프로모터의 조절하에 작동가능하게 위치한 상기 분리된 핵산 분자 및 임의의 형질발현 증진제를 포함하는 유전자 작제물을 생산하는 단계,
(ii) 상기 유전자 작제물을 세포내로 형질전환시키는 단계,
(iii) 유전자 서열에 의해 암호화된 기능성 에폭시게나제를 다량 발현하는 형질전환체를 선별하는 단계.
본 발명의 제8 양태는 본 발명은 형질전환 식물에서 효소 활성이 있는 재조합 에폭시게나제 폴리펩티드를 생성하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음의 단계를 포함한다.
(i) 종자 특이적 프로모터의 조절하에 작동가능하게 위치한 분리된 핵산 분자및 임의의 발현 증진제를 포함하는 유전자 작제물을 생산하는 단계로서, 이때 상기 유전적 서열은 또한 전사 종지 서열의 상부에 위치하고,
(ii) 상기 유전자 작제물을 상기 식물의 세포 또는 조직내로 형질전환시키는 단계,
(iii) 유전자 서열에 의해 암호화되는 기능성 에폭시게나제를 종자중에서 다량 발현하는 형질전환체를 선별하는 단계.
본 발명의 제9 양태는 재조합 에폭시게나제 폴리펩티드 또는 기능성 효소분자를 제공한다.
본 발명의 제10 양태는 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6에 개시된 아미노산 서열, 또는 약 50% 이상 동일한 이의 상동체, 또는 유도체를 포함하는 재조합 에폭시게나제를 제공한다.
본 발명의 제11 양태는 세포, 조직, 기관 또는 유기체에서 에폭시 형성된 지방산을 생산하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 지방산 기질, 바람직하게는 불포화 지방산 기질과 함께 그 기질의 적어도 하나의 탄소결합, 바람직하게는 탄소 이중결합이 에폭시기로 전환되기에 충분한 조건 및 시간하에서 효소 활성이 있는 재조합 에폭시게나제를 발현하는 세포, 조직, 기관 또는 유기체를 배양하는 것을 포함한다.
본 발명의 제12 양태는 상기 기술한 재조합 에폭시게나제 폴리펩티드 또는 이의 상동체, 유사체 또는 유도체에 결합하는 면역학적으로 상호활성인 분자를 제공한다.
실시예 1
유포비아 라가스케 및 크레피스 종내 에폭시 지방산의 특성
야생종 유포비아 라가스케 및 여러 가지 크레피스 종의 종자를 에폭시 지방산의 존재에 대하여 기체 액체 크로마토그래피에 의하여 스크리닝하였다.
표 3에 나타낸 바와 같이, 유포비아 라가스케는 그 종자유 중에 에폭시 지방산 베르놀산을 다량 함유한다. 크레피스 팔라에스티나의 종자는 총 지방산 중 베르놀산 61.4 중량% 및 아세틸렌계 지방산 크레페닌산 0.71 중량%를 함유하는 것으로 나타났다.
크레피스 알피나, 그레피스 팔라에스티나 및 유포비아 라가스케의 종자로부터 유도된 지질의 지방산 조성
지방산 상대 분포(중량%)a
크레피스 알피나 그레피스 팔라에스티나 유포비아 라가스케
팔미트산 3.9 5.1 4.3
스테아르산 1.3 2.3 1.8
올레산 1.8 6.3 22.0
리놀레산 14.0 23.0 10.0
크레피닌산 75.0 0.7 0
베르놀산 0 61.4 58.0
기타 4.0 1.2 3.9
a종자 지질의 메틸 에스테르 유도체의 기체 액체 크로마토그래피내 총 적분 피크 면적의 면적%로 계산함.
실시예 2
유포비아 라가스케 및 크레피스 팔라에스티나 내 리놀레에이트 Δ12-에폭시게나제의 생화학적 특성
효소 리놀레에이트 Δ12-에폭시게나제는 리놀레산으로부터 베르놀산을 합성한다. 유포비아 라가스케 및 크레피스 팔라에스티나로부터 유도된 리놀레에이트 Δ12-에폭시게나제는 마이크로솜 내에 정위된다. 적어도 이들 종으로부터의 효소는 발육하는 종자로부터 제조된 막(마이크로솜) 단편 내에서 활성을 유지할 수 있다.
유포비아 라가스케부터의 막 제조와 이들 에폭시게나제의 분석은 표 4에 나타낸 것 이외에는 Bafor 등(1993)이 기술한 바와 같이 NADPH를 함유하는 배양물로 실행하였다. 지질 추출, 분리 및 메틸화, 뿐만 아니라 GLC 및 라디오-GLC 분리는 본질적으로 Kohn 등(1994) 및 Bafor 등(1993)이 기술한 바와 같이 실행하였다.
크레피스 알피나 및 크레피스 팔라에스티나로부터의 막은 다음과 같이 제조하였다. 크레피스 알피나 및 크레피스 팔라에스티나 식물을 온실에서 재배하고 발육 중간 단계(개화후 17 내지 20일)에서 종자를 수확하였다. 이들 종자 껍질로부터 자엽을 짜내고 0.33 M 수크로스, 4 mM NADH, 2 mM CoASH, 소 혈청 알부민 1 mg/ml 및 카탈라제 4,000 유니트/ml를 함유하는 pH 7.2의 0.1 M 인산염 완충제 중에서 막자 사발로 균질화하였다. 균질물을 10 분 동안 18,000 x g로 원심 분리하고 얻어진 상청액을 60 분 동안 150,000 x g로 원심 분리하여 마이크로솜 펠렛을 얻었다.
크레피스 종으로부터의 마이크로솜 막을 사용한 표준 탈포화 효소, 아세틸레나제 및 에폭시게나제 분석은, 360 ㎕의 총 부피로 신선한 균질 완충제 및 10 nmol의 [1-14C]18:1-CoA 또는 [1-14C]18:2-CoA(비방사능 85,000 d.p.m/nmol) 중에 재현탁한 0.2 mg 마이크로솜 단백질에 상응하는 마이크로솜 제제로 25℃에서 실행하였다. NADPH를 공환원제로 사용하였을 때, 막은 NADH를 NADPH로 대체한 균질화 완충제에 재현탁하였다.
유포비아 라가스케 및 크레피스 팔라에스티나로부터 유도된 마이크로솜 리놀레에이트 Δ12-에폭시게나제의 생화학적 특성을 실행하였으며, 얻어진 데이타는 크레피스 알피나의 마이크로솜 제제로부터 유도된 리놀레에이트 Δ12-탈포화 효소 및 리놀레에이트 Δ12-아세틸레나제 효소의 생물학적 특성과 비교하였다(표 4).
표 4에 나타낸 바와 같이, 크레피스 팔라에스티나 리놀레에이트 Δ12-에폭시게나제는 세 효소 모두가 O2를 필요로 하고, 공환원제로서 NADH 또는 NADPH와 동일하게 잘 작동하는 한, 크레피스 알피나로부터의 리놀레에이트 Δ12-아세틸레나제와 올레에이트 Δ12-탈포화 효소와 유사한 생화학적 양태를 나타내며, 시안화물에 의해서는 저해되지만 일산화탄소에 의해서는 저해되지 않는다. 또한, 이들 효소들은 어느 것도 시토크롬 P450 리덕타제에 대한 모노클론 항체에 의해 저해되지 않는다.
표 4의 데이타는 크레피스 팔라에스티나 리놀레에이트 Δ12-에폭시게나제가 크레피스 알피나 마이크로솜 올레에이트 Δ12-탈포화 효소 및 리놀레에이트 Δ12-아세틸레나제와 동일한 효소 부류에 속한다는 것을 시사한다.
대조적으로, 유포비아 라가스케 리놀레에이트 Δ12-에폭시게나제는 공환원제로서 NADPH를 필요로 하며, 시안화물에 의해서 저해되지는 않지만 일산화탄소에 의해서는 저해된다(표 4). 또한, 본 발명자들은 유포비아 라가스케 리놀레에이트 Δ12-에폭시게나제가 시토크롬 P450 리덕타제 효소에 대해 발생하는 모노클론 항체에 의해 저해된다는 것을 발견하였다. 이들 데이타는 유포비아 라가스케 리놀레에이트 Δ12-에폭시게나제가 단백질의 시토크롬 P450 부류에 속하며, 따라서 크레피스 팔라에스티나 리놀레에이트 Δ12-에폭시게나제와는 생화학적으로 관련이 없다는 것을 시사한다.
크레피스 종 및 유포비아 라가스케로부터 유도된 에폭시게나제, 아세틸레나제 및 탈포화 효소의 생화학적 특성의 비교
처리 효소 활성(대조군의 %)
크레피스 알피나 올레에이트 Δ12-탈포화 효소 크레피스 알피나 리놀레에이트 Δ12-아세틸레나제 크레피스 팔라에스티나 리놀레에이트 Δ12-에폭시게나제 유포비아 라가스케 리놀레에이트 Δ12-에폭시게나제
일산화탄소 85 84 88 3
Anti-P450 리덕타제 항체(C5A5) 96 91 94 33
KCN 16 0 35 92
NADH 부재NADPH 존재 95 73 94 100(대조군)
NADPH 부재NADH 존재 100(대조군) 100(대조군) 100(대조군) 11
실시예 3
크레피스 팔라에스티나(Crepis palaestina) 에폭시게나아제 유전자를 클로닝하기 위한 방법
크레피스 팔라에스트리나 에폭시게나아제 유전자는 전술한 실시예에서 설명한 씨. 팔라에스트리나 및 씨.알피나 효소의 특성에 의존한다.
특히, 폴리(A) + RNA를, QuickPrep Micro mRNA 정제 키트(파마시아 바이오테크날러지 제품)을 사용하여 크레피스 팔라에스트리나의 발육 종자로부터 분리하여올리고사카라이드 d(T)-프마이머 처리된 이중 가닥 cDNA를 합성하는데 사용하였다. 이 이중 가닥 cDNA를 EcoRI/NotI 어댑터(파마시아 바이오테크날로지 제품)에 결찰시키고, ZAP-cDNA Gigapack 클로닝 키트(스트라타젠 제품)를 사용하여 cDNA 라이브어리를 작제하였다.
단일 가닥 cDNA를, 표준적인 절차를 사용하여 크레피스 알피나의 발육 종자로부터 유도된 RNA로부터 제조하였다. D12V(서열 번호 7)로 표시되는 PCR 단편을, 식물의 혼합 기능성 모노옥시게나아제의 추론 아미노산 서열로부터 유도한 프라이머를 사용하여 단일 가닥 cDNA를 증폭시킴으로써 얻었다.
D12V 단편을 연속적으로 랜덤하게 표지화하고, 표준 하이브라이드화 조건을 사용하는 제조자가 규정하는 바와 같이, 상기 크레피스 팔라에스티나 cDNA 라이브어리를 Hybond N+막 여과기(아머샴 제품) 상에서 스크린닝하는데 사용하였다. 이러한 방법은 Cpa12로 명명한 재조합 박테리오파아지를 정제하는데 사용하였다.
Cpa12 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 결정하고, 서열 번호 1로 하였다.
Cpa12 cDNA는 전체 길이를 나타내는 것으로 보인다. Cpa12 cDNA를 포함하는 발현 벡터의 개략적 설명을 도 1에 도시하였다. 여기에 설명된 유전자 작제물은 에폭시게나아제를 발현시키는 돌연변이 식물을 제조하기 위해 식물 물질 내로 도입되도록 고안된 것이다. 당업자들은, 과도한 실험을 하지 않고도 유사한 발현 벡터를 제조하여, Cpa12 cDNA를 또다른 구조 유전자 서열과 치환시킴으로써 본 발명의 유전자 서열 중 어느 하나를 발현시키는 돌연변이 식물을 제조하는데 사용할 수 있다는 것을 알 것이다.
도 2에 도시되어 있는 바와 같이, Crep1 cDNA의 뉴클레오티드 서열은, 아미노산 수준에서 적어도 씨. 알피나의 아세틸레나아제 효소와 아주 밀접하게 관련 있는 폴리펩티드를 암호화하였다(Bafar 등, 1997; 국제 특히 출원 PCT/SE97/00247).
pCpa12의 1.4 kb 삽입체를 서열 결정하고(서열 번호 1), 길이가 374개의 아미노산으로 된 폴리펩티드를 암호화하는 개방 해독틀을 포함하는 것으로 나타났다. Cpal2의 추론된 아미노산 서열은 크레피스 알피나 유래의 Δ12-아세틸레나아제와 81% 동일성 및 92% 유사성을 나타내었고, 식물 마이크로좀의 Δ12-탈포화 효소 단백질에 대략 60% 동일성 및 80% 유사성을 나타내었다(도 2). 그러나, Cpal2에 의해 암호화된 폴리펩티드는 비에폭시게나아제 효소와 비교하여 아미노산 서열 상에 현저한 차이를 나타내었다. 특히, Cpa12는 모든 마이크로좀 Δ12 탈포화 효소와 비교하여 5' 말단 영역에서 6개의 인접한 아미노산의 결실과, Crepl Δ12 아세틸레나아제와 비교하여 3' 말단 영역에서 2개의 인접한 아미노산의 결실을 가지고 있었다(도 2).
비록 막 결합된 지방산 탈포화 효소 유전자가 제한된 서열 상동성을 나타내지만, 이들은 모두 (i) His-(Xaa)3-4-His, (ii) His-(Xaa)2-3-His-His, 및 (iii) His-(Xaa)2-3-His-His과 같은 보존된 히스티딘이 풍부한 모티프의 3 영역을 포함한다. 여기서, His는 히스티딘을 지시하고, Xaa는 본 명세서 표 1에 설명한 바와 같은 임의의 자연 아미노산 잔기를 지시하며, (Xaa)3-4의 정수는 Xaa 반복 단위를 3개 또는 4개 포함하는 아미노산 서열을 의미하고, (Xaa)2-3의 정수는 Xaa 반복 단위를 3개 또는 4개 포함하는 아미노산 서열을 의미한다. 이들 히스티딘이 풍부한 영역은 효소의 활성 중심의 일부인 것으로 제안된 바 있다(Shanklin 등, 1994).
Cpa12 cDNA에 의해 암호화된 아미노산 서열은 Δ12-데사투라아제 효소의 히스티딘이 풍부한 모티프와 동일하지는 않지만 유사한 히스티딘 풍부한 모티프를 포함한다. 이들 데이타에 의하면, Cpa12 cDNA는 효소의 혼합 기능성 모노옥시게나아제 부류에 속하는 효소를 암호화하였다.
상기 실시예 1에서 제시한 지방산 분석에 의하면, 베르놀산은 크레피스 팔라에스티나의 종자 속에 적어도 일부 이상 존재하였다. 사실상, 이러한 효소는 씨. 팔라에스티나의 종자에 예외없이 존재할 수 있다. Cpa12 유전자의 발현은, 씨.팔라에스티나의 발육 종자 및 잎으로부터 유도된 mRNA의 노던 블롯에 하이브라이드화 프로브로서 Cpa12 cDNA 클론의 3' 미번역된 영역을 사용하여 검사하였다. 도 3에 도시되어 있는 바와 같이, Cpa12 유전자는 발육 종자에서 다량 발현되었지만, 잎에서는 발현이 전혀 검출되지 않았다. 이들 데이타는 이들 조직 내의 씨.팔라에스티나 리놀레에이트 Δ12-에폭시게나아제의 효소 활성 프로필과 일치한다.
실시예 4
유포비아 라가스케(Euphorbia lagascae) 에폭시게나아제 유전자를 클로닝하기 위한 방법
유포비아 라가스케 에폭시게나아제 유전자의 클로닝은 전술한 실시예에서 개시한 바와 같은 이. 라카스케(E. lagascae) 효소의 특성에 의존한다.
유포비아 라가스케 에폭시나아제 유전자를 클로닝하기 위해 취한 한 방법에있어서, RNA를 활성 베르놀산 합성 단계에서 취한 유포비아 라가스케의 미성숙 배로부터 수집하여 cDNA 라이브어리를 작제하는데 사용하였다. 이 cDNA 라이브어리는, 전술한 실시예에서 설명한 바와 같이 Lambda Zap II 벡터(스트라타젠 제품)에서 구조화시켰는데, 단 예외로 cDNA 삽입체를 람다 벡터에 함입된 플라스미드 벡터의 EcoRI-XhoI 부위로 직접 방식에 의해 클로닝시켰다.
도 4(서열 번호 18)에 설명된 변성 PCR 프라이머를 합성하여 유포비아 라가스케 cDNA 라이브어리로부터 P450 효소 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 증폭시키는데 사용하였다. PCR 증폭 반응의 경우, cDNA 라이브어리의 분액 100 ㎕을 페놀:클로로포름[1:1(v/v)]으로 추출시키고, DNA를 에탄올 2 부피를 첨가함으로써 침전시킨 다음, 최종적으로 물 100 ㎕ 중에 재현탁시켰다. 재현탁된 DNA의 분액(1 ㎕)을 PCR 증폭 반응에서 주형으로 사용하였다. PCR 반응은, 각각의 dNTP 200 μM, 변성 프라이머 10 pmol, T7 폴리머라제 프로모터 프라이머 1 pmol 및 TaqI 폴리머라제 0.4 유니트를 함유하는 TaqI 폴리머라제 완충제 10 ㎕에서 수행하였다.
증폭 조건은 94℃에서 2 분이고, 48℃에서 1분, 72℃에서 2분 및 93℃에서 30 초로 5 사이클, 55℃에서 30 초, 72℃에서 90 초 및 93℃에서 30 초로 28 사이클, 그리고 마지막으로 55℃에서 30 초, 72℃에서 10 분 및 25℃에서 1 분으로 1 사이클을 수행한다.
PCR 생성물을 정제하고, EcoR1 및 XhoI를 이용하여 분해한 후, 서열 결정을 위해 블루스크립트 벡터 내로 서브 클로닝시켰다. PCR 클론 중 하나가 P450 서열을 암호화할 수 있다는 것을 밝혀 내고, 전체 길이의 cDNA 클론을 분리하는 프로브로서 사용하였다. 이 뉴클레오티드 서열을 서열 번호 19로 표시한다. 서열 번호 19는 P450 유전자의 2C 계열 중 다른 구성원과 유사성을 가졌다. 특히, 서열 번호 19는 BLAST 프로그램을 이용할 경우 사람 및 래트의 아라키돈산 에폭시게나아제 서열과 평균적으로 40% 동일성을 나타낸다.
또한, 서열 번호 19 전사체는 유포비아 라가스케의 종자에서 발현되지만, 뿌리 또는 잎에서 발현되지 않았다(도 5B). 서열 번호 19 전사체는 베르노미아 갈라멘시스의 발육 종자에서 검출되었으나, 이.시파리서스 또는 아마에 속하는 것들에서 검출되지 않았는데, 이들 2종은 에폭시 지방산을 생산하지 않는 것이었다(도 5A 와 도 5B).
유포비아 라가스케 에폭시게나아제 유전자를 클로닝시키기 위한 대안적인 방법에 있어서, 감법 하이브라이드화 방법을 사용하여 에폭시 지방산을 다량 생산하는 유기체에서 특이적으로 발현되는 유전자를 분리하였다.
특히, 도 6에 상세하게 설명된 감법 하이브라이드화법을 사용하여 에폭시 지방산, 베르놀산을 다량 생산하는 유포비아 라가스케에서 특이적으로 발현되지만(실시예 1), 베르놀산을 전혀 생산하지 않은 유사 관련 종 유포비아 시파라서스(Euphorbia cyparissus)에서 발현되지 않는 에폭시게나아제 유전자를 분리하였다.
따라서, 활성적으로 베르놀산을 합성하는 단계에서 유포비아 라가스케의 발육 배로부터 mRNA를 분리하여 일명 "시험자(tester)" cDNA를 생성시키는데 사용하였다. 또한, mRNA를 이.시파리서스의 발아 배(E. lagascae와 유사한 성장 단계에 존재함)로부터 분리하여 일명 "유도자(driver)" cDNA를 생성시키는데 사용할 수 있다.
감법 하이브라이드화 절차는 예외적으로 유포비아 라가스케에 발현되는 서열에 대하여 풍부한 라이브러리를 유도한다. 이 라이브러리로부터 취한 클론을 서열 결정하고, 적어도 2 개 이상의 서열은 데이타베이스 내 다른 P450 서열에 유사하다는 것에 근거하는 P450 단백질을 암호화하여 동정하였다. 이들 2개의 P450 PCR 클론을 프로브로서 사용하여 전술한 cDNA 라이브어리로부터 상응하는 전체 길이의 cDNA 클론을 분리하였다.
서열 번호 20에서 설명하고 있는 뉴클레오티드의 서열을 포함하고 있는 분리된 P450 cDNA 중 하나는 유포비아 라가스케의 조직에서 발현되는 것으로 나타났지만(도 7B), 이. 시파리서스 또는 아마의 종자 조직에서 상동 전사체가 전혀 탐지되지 않았는데, 이들 2 종은 에폭시 지방산을 생산하지 않는 것이었다. 서열 번호 20의 추정 아미노산 서열에 의하면, cDNA 클론은 전체 길이를 나타내었고, P450 효소를 암호화한다. 이들 데이타에 의하면, 서열 번호 20에 의해 증폭된 cDNA는 에폭시게나아제, 예를 들면 리놀레산을 베르놀산으로 전환시키는 리놀레에이트 Δ12-에폭시게나아제를 암호화할 수 있다.
실시예 5
에폭시게나제 활성의 증명
에폭시 지방산, 구체적으로 베르놀산을 생산하지 않는 아라비돕시스 탈리아나를 각각의 피험 클론으로 형질전환시키고, 이들이 생산하지 않았던 에폭시화된 지방산의 존재에 대해 또는 내생성 에폭사이드 히드롤라제의 작용에 의해 에폭시 형성된 지방산의 대사로부터 형성될 수 있는 히드록시 지방산에 대해 형질전환된 조직을 검사함으로써, 본 발명을 예시하는 cDNA 클론이 에폭시게나제 활성을 암호화한다는 것을 확인하였다(Blee and Schuber, 1990).
서열 번호 1을 포함하는 에폭시게나제 cDNA를 도 8에 제시한 2원 벡터 작제물내로 클로닝하였다. 간략히 언급하면, cDNA 서열은 pCpal2를 EcoRI으로 처리하고, T4 DNA 폴리머라제 효소를 사용하여 제한 단편을 말단에서 합성함으로써, pCpal2 플라스미드(도 1)로부터 2원 플라스미드내로 서브 클로닝하였다. 2원 벡터(도 8)는 BamHI을 사용하여 선형화하고, 마찬가지로 T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 말단을 합성하였다. 말단 합성 반응의 경우, cDNA 삽입체 또는 선형화된 2원 벡터 DNA 1 ㎍을 각각의 dNTP 100 mM 및 BSA 0.1 ㎎/㎖와 T4 DNA 폴리머라제 3 유닛으로 보충한 T4 DNA 폴리머라제 완충액(33 mM 트리스-아세테이트 pH 7.9, 66 mM 아세트산칼륨, 10 mM 아세트산마그네슘 및 5 mM DDT) 50 ㎕에서 재현탁시키고, 37℃에서 6분 동안 항온 배양하였다. 반응은 75℃에서 10분 동안 가열하여 정지시켰다. T4 DNA 리가제 및 프로메가에서 추천하는 표준 결찰 조건을 사용하여 평활 말단 cDNA 및 2원 벡터 DNA를 결찰시켰다. 서열 번호 1의 서열이 내핀 프로모터 뒤에 센스 방향으로 삽입되어 에폭시게나제 폴리펩티드를 발현시키는 클론을 선별하였다. 서열 번호 1을 센스 방향으로 보유하는 2원 플라스미드는 절두된 내핀 프로모터의 제어하에 작동되는 것으로서 도 9에 개략적으로 나타냈다.
도 9에 제시된 2원 플라스미드는 전기 사출법을 사용하여 아그로박테리움 균주내로 형질전환시키고, 이를 사용하여 아라비돕시스 탈리아나를 형질전환시켰다. 돌연변이된 에이. 탈리아나 식물은 문헌[Valvekens 등(1988) and Dolferus 등(1994)]에 기재된 방법에 따라 얻었다.
돌연변이 식물 및 비형질전환된(즉, 대조군) 식물은 성숙 상태까지 성장시켰다. 각 식물의 성숙 종자를 표준 기법으로 지방산 조성에 대해 분석하였다. 1차 형질전환체(T0) 식물이 확립되었고, T1 종자를 각 식물로부터 수확하고, 기체 크로마토그래피에 의해 지방산 조성에 대해 분석하였다. 12종의 T0식물이 그 T1 종자 지질에 총 지방산의 0.9 내지 15.8%의 농도로 베르놀산을 함유하는 것으로 나타난 반면에, 형질전환되지 않은 대조군 식물은 베르놀산을 함유하지 않았다(표 5). 최대로 발현되는 식물주는 Cpal-17인데, 이에 대한 GLC 용출 프로필(충전된 칼럼 및 모세관 칼럼 분석으로부터)을 도 10에 제시한다. 형질전환시키지 않은 대조군에 대한 충전된 칼럼으로부터의 GLC 용출 프로필 역시 도 10에 제시한다.
서열 번호 1을 발현시키는 돌연변이된 에이.탈리아나주에서의 베르놀산 레벨
Tg식물 번호 베르놀산(총 종자 지방산중의 중량%)
Cpal-4 1.4
Cpal-5 1.1
Cpal-8 2.7
Cpal-9 0.9
Cpal-13 0.9
Cpal-15 1.1
Cpal-17 15.8
Cpal-21 1.3
Cpal-23 1.4
Cpal-24 1.0
Cpal-25 1.2
Cpal-26 1.1
형질전환되지 않은 대조군 0.0
한편, 본원에 기술하는 추정 지방산 에폭시게나제 서열을 내핀 종자 특이 프로모터의 제어하에 리눔 우시타티시뮴(아마) 및 아라비돕시스 탈리아나내로 각각 형질전환시켰다. 돌연변이된 아마 및 아라비돕시스 탈리아나 식물은 발육중인 종자유중의 에폭시 지방산의 존재에 대해 검사하였다. 종래의 연구에서는 에폭시 지방산을 발육중인 아마 배에 공급하면 이들 지방산이 트리글리세라이드내로 혼입된다는 것을 밝혀냈다(실시예 10).
한편, 효모를 본 발명의 에폭시게나제 클론으로 형질전환시키고 에폭시 지방산의 생성에 대해 분석하였다.
실시예 6
1차 T0돌연변이 식물상에 보유된 T1아라비돕시스 종자에서의 에폭시 지방산의 질량 분광분석법에 의한 확인
Cpal2에 의해 형질전환된 아라비돕시스 탈리아나 식물(실시예 5)의 T1 종자의 종자 지질로부터 제조한 메틸 에스테르의 기체 크로마토그래피는 형질전환시키지 않은 대조군에 비해 두 개의 추가 지방산의 존재를 나타냈다. 이들 화합물중 제1 화합물은 베르놀산 표준의 체류 시간과 동등한 체류 시간을 가졌다. 제2 화합물은 보다 긴 체류 시간을 가졌고, 베르놀산의 예상된 유도체인 12,13-에폭시-9,15-옥타데카디엔산으로 추정적으로 확인되었는데, 이는 내생성 아라비돕시스 탈리아나 Δ15-탈포화 효소에 의해 Δ15 위치에서의 탈포화에서 기인하는 것이다.
두 개 피크의 정확한 동일성은 Cpal2-형질전환된 식물로부터 유래한 에폭시 지방산 분획으로부터 제조된 디올의 질량 분광 분석법으로 확인하였다. 이 디올은 추가로 트리메틸실릴 에테르로 전환시키고, 융합된 실리카 모세관 칼럼(전자 충격량 70eV15에서 작동하는 휴렛 패커드 5989A MS에 커플링된 휴렛-패커드 5890 II GC)상에서 GC-MS DB23에 의해 분석하였다. 전체 이온 크로마토그램은 다음과 같은 두 개의 피크를 나타냈다:
(i) 첫번째 용출 피크는 질량 73, 172, 275 및 299의 현저한 이온을 가졌는데, 이것은 에폭시기가 C18 지방산의 C-12에 위치하고 에폭시기와 카르복실 말단 사이에 이중 결합이 형성되었음을 나타내는 것이다. 이 질량 스펙트럼은 순수한 베르놀산(12,13-에폭시-9-옥타데카논산)으로부터 제조한 디올의 트리메틸실릴 에테르 유도체의 스펙트럼과 동일하였고;
(ii) 두번째 용출 피크는 질량 73, 171, 273 및 299의 현저한 이온을 가졌는데, 이것은 12,13-에폭시-9,15-옥타데카디엔산에 대한 질량 스펙트럼과 일치되는, C18 지방산의 C-12에 위치한 에폭시기 및 두 개의 이중 결합의 존재를 나타내는 것이다.
실시예 7
Cpal2 돌연변이된 아라비돕시스 탈리아나의 지방산 분석
내핀 프로모터의 제어하에 Cpal2 cDNA 클론을 발현시키는 형질전환된 아라비돕시스 탈리아나 식물로부터 유래한 T1 종자를 발아시키고, T1 식물을 5개의 T0주(표 5에서 번호 4, 8, 13, 17 및 21)로부터 확립하였다. T2 종자를 각각의 T1 식물로부터 수집하고, 지방산 조성물에 대해 분석하였다. 형질전환체 번호 4, 8, 13 및 21(표 5)의 자손이 베르놀산의 존재에 대한 예상대로 분리되었는데, 이들 식물은 베르놀산을 3.1%에 이르는 범위까지 함유하였다(표 6).
베르놀산(즉, 표 6의 에폭시 18:1)을 함유한 모든 T1 식물 역시 12,13-에폭시-9,15-옥타데카디엔산(즉, 표 6의 에폭시 18:2; 도 11 역시 참조)을 함유하였는데, 이것은 Cpal2 에폭시게나제에 의해 합성된 베르놀산의 일부가 후속적으로 내생성 Δ15-탈포화 효소에 의해 탈포화되었음을 나타냈다.
실시예 8
Cpal2 돌연변이 리놀라 식물의 지방산 분석
Cpal2 cDNA 클론(도 9)을 포함하는 전술한 2원 플라스미드 작제물를, 전기 사출법을 사용하여 아그로박테리움 튜메파시엔스 균주 AGL1내로 형질전환시켰다. MS 배지를 재생된 새순 재료상에서 뿌리의 유도를 위한 기본 배지로 사용한 것을 제외하고는, Lawrence 등의 문헌(1989)에 기재된 대로, 형질전환된 에이.튜메파시엔스를 사용하여 리눔 우시타티시뮴 변종 아이어(Eyre) 외식편을 감염시켰다.
AP20 및 AP21로 명명된 두 개의 1차 리놀라 형질전환체(T0 식물)는 Cpal2 유전자에 대해 유도된 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 및 이들 식물이 카나마이신 내성을 갖는다는 것을 나타냄으로써 돌연변이된 것으로 확인되었다. 각 식물로부터 10개의 T1 종자를 표준 기법을 사용하여 지방산 조성물에 대해 개별적으로 분석하였다.
표 7에 나타낸 바와 같이, AP20에서 유래한 종자는 3개 부류로 분리되었는데, 3개는 베르놀산이 없는 종자, 2개는 0.7% 이상의 베르놀산을 가진 종자 및 5개는 베르놀산의 중간 레벨(0.13 내지 0.47%)을 갖는 종자로 구성되었다.
유사하게, AP21에서 유래한 종자는 3개 부류로 분리되었는데, 5개는 베르놀산이 없는 종자, 2개는 0.25% 이상의 베르놀산을 가진 종자 및 3개는 베르놀산의 중간 레벨(0.09 내지 0.14%)을 갖는 종자로 구성되었다(표 8).
따라서, 베르놀산을 함유한 총 12개의 종자를 얻었다. 베르놀산을 함유하는 12개 AP20 및 AP21 종자중 8개는 또한 12,13-에폭시-9,15-옥타데카디엔산을 함유하였다.
AP20의 카나마이신 내성 묘목으로부터 4개의 T1 식물을 확립하였다. 이어서, 4개의 식물은 모두 그 T2 종자에 베르놀산을 생성시키는 것으로 나타났다(표 9). 18:2 에폭시 지방산 레벨은 이들 T2 종자에서는 분석하지 않았다.
AP20의 리놀라 Cpal2 T1 자손에서 유래한 T2 종자의 지방산 조성
T2종자 비에폭시 지방산 에폭시 지방산
16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 20:0 20:1 22:0 22:1 18:1
A 3.4 3.0 27.4 65.5 0.6 na na na na 0.06
B 3.5 3.1 30.2 62.6 0.6 na na na na 0.07
C 3.6 2.7 33.3 59.8 0.6 na na na na 0.07
D 3.4 3.1 28.2 64.6 0.6 na na na na 0.11
na= 분석하지 않음
실시예 9
돌연변이 유기체에서의 지방산을 생성하는 방법.
본 명세서에 기재되어 있는 에폭시게나제 유전자, 특히 서열 번호 1을 상기의 실시예에 기재되어 있는 바와 같은 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로 형질전환시켜 베르놀산이 풍부한 오일을 생성한다. 하기 표 5에 기재되어 있는 바와 같이, 서열 번호 1을 발현하는 변이 에어. 탈리아나주는 다른 지방산에 비해서 베르놀산을 다량 생산한다. 특히, 하나의 변이주(Cpal-17)에서, 생성된 베르놀산의 함량은 종자내 지방산 총량의 15.2 %(w/w)가 된다.
또한, 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 19 또는 서열 번호 20 중 하나 및 바람직하게는 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 서열 번호 5 중 하나에서의 에폭시게나제 유전자를 통상적으로 리놀레산의 함량이 높고 기질로서 리놀레산을 사용할 수 있는 기타의 경쟁적 효소 활성이 최소인 임의의 오일 축적 유기체로 형질전환시켜 베르놀산이 풍부한 오일을 생성한다. 본 발명의 유전자 서열은 내핀(napin) 종자 특이성 프로모터와 같이 종유내에서 다량 발현하는 프로모터의 제어하에 작용하도록 배치된다.
아라비돕시스 탈리아나의 형질전환에 대한 또다른 접근으로서, 아마, 해바라기, 옥수수 또는 홍화의 고 농도의 리놀레산 유전자형을 본 발명의 에폭시게나제를 사용하여 형질전환시킨다. 고 농도의 베르놀산은 에폭시게나제 유전자가 고농도로 발현되는 경우 종자유 합성시에 변이 식물에 의해 생성된다.
또한, 등록상표 Linola(낮은 리놀렌산) 아마를 본 발명의 에폭시게나제를 사용하여 형질전환시킨다. 에폭시게나제 유전자가 다량 발현되는 경우 변이 등록상표 Linola 아마 식물에 의해 종유합성 과정에서 다량의 베르놀산이 생성된다.
또한, 본 발명자들은 발육하고 있는 아마 종자에 공급된 표지 베르놀산이 분해되지는 않았지만, 트리글리세리드 분자의 3개의 위치 모두에서 저장 지질로 혼입되었다는 것을 알아냈다. (실시예 10 참조). 이러한 데이타와 일치하게, 투입된 에폭시게나제에 의해 합성된 고 농도의 베르놀산은 이러한 종의 종자유 트리글리세리드로 쉽게 침착된다.
실시예 10
발육중인 아마인 자엽 지질로의 올레산 및 베르놀산 혼입
종자 발육의 중간 단계(개화후 20일째)에서 분리된 발육중인 아마인 자엽(각 배양에서 6쌍 이중 배양)을 30 분 동안 30℃에서 pH 7.2의 인산염 완충액 0.2 ㎖ 중의 [1-14C] 베르놀산(특이 활성 3000 d.p.m./nmol) 또는 [1-14C]올레산(특이 활성 5000 d.p.m./nmol)의 암모늄 염 10 nmol를 사용하여 배양하였다. 그후, 자엽을 증류수 1 ㎖로 3회 세척하고, Bligh 및 Dyer(1959)에 의한 Ultra Turrax중에서 즉시 추출하거나 또는 추출전에 90 또는 270 분 동안 pH 7.2의 0.1 M의 인산염 완충액 0.5 ㎖에서 배양하였다. 클로로포름 상 중의 지질의 분액을 메틸화시키고, 이를 n-헥산/디에틸에테르/아세트산(85:15:1) 중에서 실리카 겔 TLC상에서 분리하였다. 각 시료의 클로로포름 상 중의 나머지 지질을 2 개의 별도의 실리카 겔 TLC 플레이트에 가하고, 이 플레이트를 극성의 지질 분리에 대해서는 클로로포름/메탄올/아세트산/물(85:15:10:3.5 부피) 중에서 또는 중성 지질 분리에 대해서는 n-헥산/디에틸에테르/아세트산(60:40:1.5) 중에서 전개시킨다. 고유한 표준물질에 해당하는 이동을 갖는 지질 부위가 제거되었으며, 각 지질에서의 방사능은 액체 신틸레이션 계수법에 의해 정량화하였다.
클로로포름 상 중의14C-표지의 회수를 도 12에 도시하였다. [14C] 올레산 및 [14C] 베르놀산 모두로부터의 첨가된 방사능의 절반 이상은 자엽에 의해 흡수되었으며, 30 분의 파동 표지화 이후 친유성 물질로서 회수되었다. 이 함량은 두 기질을 사용한 추가의 270 분의 배양동안 거의 불변하였다. 지질의 방사능 메틸에스테르의 분리는 [14C] 베르놀산 공급 실험으로부터의 방사능(92%) 대부분이 메틸-베르놀레이트와 동일한 이동을 갖는 화합물에 존재하며, 이는 270 분 동안의 배양으로 아마인 자엽 내에서 에폭시기가 완전한 상태로 잔존한다는 것을 나타낸다.
클로로포름 상 중에 존재하는 [14C] 베르놀산 공급물로부터의 활성의 약 28%는 30 분 후의 포스파티딜콜린에 존재하며, 방사능은 300 분 동안의 배양에서 약 5%만이 감소되었다(도 13 참조).
클로로포름 상 중에 존재하는 [14C] 올레산 공급물로부터의 활성의 약 22%는 30 분 후의 포스파티딜콜린에 존재하며, 방사능은 300 분 동안의 배양에서 약 11%만이 감소되었다(도 13 참조).
클로로포름 상 중에 존재하는 [14C] 베르놀산 공급물로부터의 활성의 약 32%는 30 분 후의 트리아실글리세롤에 존재하며, 방사능은 300 분 동안의 배양에서 약 60% 이상으로 중가되었다(도 14 참조). 디아실글리세롤은 [14C] 베르놀산 공급 실험에서 24%의 활성을 포함하며, 이 양은 배양 기간 동안 다소 일정하게 유지되었다.
클로로포름 상 중에 존재하는 [14C] 올레산 공급물로부터의 활성의 약 5%는 30 분 후의 트리아실글리세롤에 존재하며, 방사능은 300 분 동안의 배양에서 18%로 증가하였다. (도 14 참조). 디아실글리세롤은 [14C] 올레산 공급 실험에서 30 분 이후 19%의 활성을 포함하며, 이 양은 배양 기간 동안 다소 일정하게 유지되었다.
이 실험으로부터 아마인 자엽은 베르놀산의 에폭시기로 대부분 대사되지 않는다는 것을 알 수 있다. 또한, 아마인 자엽은 막 지질로부터 베르놀산을 효과적으로 제거하고 트리아실글리세롤로 이를 혼입시키는 메카니즘을 지닌다는 것을 알 수 있다.
실시예 11
기타의 에폭시 산 함유 종으로부터의 Δ12-에폭시게나제 유전자의 클로닝
발육중인 종자내에서 고도로 발현된 Δ12 혼합 작용 모노옥시게나제의 유전자계의 구성원을 클로닝하고, 이의 아미노산 서열을 공지의 Δ12-탈포화 효소 및 Δ12-옥시게나제 서열의 것과 비교하여 에폭시 지방산이 풍부한 기타의 종으로부터 Cpal2 Δ12-에폭시게나제 유전자의 상동체를 얻었다. Cpal2 유전자(서열 번호 1) 또는 D12V 단편(서열 번호 7)을 기준으로 하여 유전자 프로브를 사용하여 발육중인 종자 cDNA 라이브러리를 스크리닝하거나 또는, 본 명세서에 기재한 바와 같이 식물 Δ12 혼합 작용 모노옥시게나제의 보존 서열에 대해 설계된 프라이머를 사용하여 PCR 단편을 증폭시키므로써 상기 유전자를 클로닝시킬 수 있다. 추정되는 Δ12-에폭시게나제 서열은 공지된 Δ12-데사투라제 서열보다는 본 명세서에서 개시된 Δ12-에폭시게나제 서열과 동일하다는 것을 알 수 있다.
이러한 접근 방법의 한 예로서, 전체 길이의 Δ12-에폭시게나제 유사 서열은 종자유 중에 베르놀산을 다량 함유하고 크레피스 팔라에스티나가 아닌 것으로 알려진 비동정 크레피스 종로부터 얻었다. QuickPrep Micro mRNA 정제 키트(파마시아 바이오테크놀러지)를 사용하여 이 크레피스 종의 발육중인 종자로부터 폴리(A)+RNA를 분리하고, 이를 올리고사카라이드 d(T)-프라이머 처리된 이중 가닥 cDNA를 합성하는데 사용하였다. 이렇게 얻은 이중 가닥 cDNA를 EcoR1/NotI 어댑터(파마시아 바이오테크놀러지)에 결찰시키고, cDNA 라이브러리를 ZAP-cDNA Gigapack 클로닝 키트(스트라타진)를 사용하여 형성하였다. Hybond N+막 필터(에머샴)상에서의 cDNA 라이브러리를 표준 하이브리드화 조건을 사용하여 제조업자에 의해 기재되어 있는 바와 같은 크레피스 알피나로부터 유도된 무작위 표지된 D12V 단편을 사용하여 스크리닝하였다. 그리하여 CrepX로 표시되는 재조합 박테리오파지를 정제하였다.
CrepX cDNA의 뉴클레오티드 서열을 측정하고, 서열 번호 3으로 하였다. CrepX의 추론 아미노산 서열(서열 번호 4)은 Cpal2 Δ12-에폭시게나제 서열에 대해 97% 동일성이 있지만 아라비돕시스 탈리아나 L26296 Δ12-탈보호 효소 서열에 대해서 57%만 동일성이 있는 374 아미노산 단백질을 포함한다. 이는 베르놀산 함량이 높은 또다른 크리피스 종내의 유전자의 존재를 예시하며, 이 유전자가 Cpal2 Δ12-에폭시게나제 유전자에 매우 상동성이고 탈포화 효소 유전자가 아니라는 것을 입증한다.
이러한 접근 방법의 두번째 예로서, 일부의 Δ12-에폭시게나제 유사 서열은 베르놀산 함유 종 베르노니아 갈라멘시스로부터 얻었다. 첫번째 가닥 cDNA 주형을 표준 방법을 사용하여 베르노니아 갈라멘시스의 발육중인 종자에서 분리한 총 RNA로부터 제조하였다.
Vgal1으로 명명한 PCR 단편(길이가 550 뉴클레오티드)은 식물 혼합 작용 모노옥시게나제의 추론 아미노산 서열로부터 유도한 프라이머를 사용하여 단일 가닥 cDNA를 증폭시켜 얻었다. 증폭된 DNA의 뉴클레오티드 서열은 표준의 방법을 사용하여 결정하였으며, 이를 서열 번호 5로 하였다.
Cpal2 Δ12-에폭시게나제 및 아라비도프시스 탈리아나 L26296 Δ12-탈포화 효소의 전체 서열을 갖는 Vgal1 PCR 분절(서열 번호 6)의 추론 아미노산 서열 정렬은 증폭된 Vgal1 서열이 Cpal2 폴리펩티드의 아미노산 잔기 103-285가 걸쳐있는 부위에 해당하는 아미노산 서열을 암호화한다는 것을 입증한다. 이러한 부위내에서, Vgal1 서열은 아라비돕시스 탈리아나 Δ12-데사투라제 서열(60%)보다 Cpal2 Δ12-에폭시게나제 서열(67%)과 아미노산 동일성이 더 크며, 이는 증폭된 DNA가 데사투라제 서열보다는 에폭시게나제라는 것을 제시한다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 것 이외의 변형예 및 수정예로 변형될 수 있는 것으로 당업자라면 숙지하고 있을 것이다. 본 발명은 이러한 변형예 및 수정예를 포함하는 것으로 이해한다. 또한, 본 발명은 본 명세서에 언급되어 있거나 또는 제시되어 있는 이러한 단계, 특징, 조성물 및 화합물을 각각 또는 총체적으로 포함하며, 임의의 2 이상의 이러한 단계 또는 특징의 모든 조합도 포함한다.
참고문헌
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서열 목록
(1) 일반 정보 :
(i) 출원인 : 커먼웰쓰 사이언티픽 앤드 인더스트리얼 리서치 오거니제이 션 및 스팀 스텐
(ii) 발명의 명칭 : 식물의 지방산 에폭시게나제 유전자 및 이의 용도
(iii) 서열의 수: 20
(iv) 해당 주소
(A) 수신인 : 데이비스 콜리즌 케이브
(B) 스트리트 : 리틀 콜리즌 스트리트 1
(C) 도시 : 멜보른
(D) 주 : 빅토리아
(E) 국가 : 오스트레일리아
(F) 우편번호(ZIP) : 3000
(v) 컴퓨터 판독 형태 :
(A) 매체 유형 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환기종
(C) 작동 체계 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : PatentIn Release #1.0, Version #1.25
(vi) 현 출원 자료
(A) 출원 번호:
(B) 출원인:
(C) 분류:
(vii) 전 출원 자료:
(A) 출원 번호: AU PO6223
(B) 출원일: 1997년 4월 15일
(vii) 전 출원 자료:
(A) 출원 번호: AU PO6226
(B) 출원일: 1997년 4월 15일
(vii) 전 출원 자료:
(A) 출원 번호: US 60/043706
(B) 출원일: 1997년 4월 16일
(vii) 전 출원 자료:
(A) 출원 번호: US 60/050403
(B) 출원일: 1997년 6월 20일
(viii) 대리인 정보:
(A) 성명: 휴거스, 닥터 이 존 엘
(C) 참조 번호: MRO/EJH/JMC
(ix) 통신 정보:
(A) 전화: +61 3 9254 2777
(B) 팩스: +61 3 9254 2770
(C) 텔렉스 : AA 31787
(2) 서열 번호 1 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 1358 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : DNA
(ix) 서열의 특징
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 존재위치 : 30..1151
(xi) 서열 번호 1:
[서열 1a]
[서열 1b]
[서열 1c]
[서열 1d]
(2) 서열 번호 2 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 374 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : 단백질
(xi) 서열 번호 2:
[서열 2a]
[서열 2b]
[서열 2c]
3)열 번호 3 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 1312 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : DNA
(vi) 기원
(A)유기체 : 크레피스(Crepis) 종
(ix) 서열의 특징
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 존재위치 : 26..1147
(xi) 서열 번호 3:
[서열 3a]
[서열 3b]
[서열 3c]
(2) 서열 번호 4 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 374 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : 단백질
(xi) 서열 번호 4:
[서열 4a]
[서열 4b]
(2) 서열 번호 5 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 550 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : cDNA
(vi) 기원
(A) 유기체 : 베르노니아 갈라멘시스(Vernonia galamensis)
(ix) 서열의 특징
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 존재위치 : 1..549
(xi) 서열 번호 5:
[서열 5a]
[서열 5b]
(2) 서열 번호 6 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 183 염기쌍
(B) 타입 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : 단백질
(xi) 서열 번호 6:
[서열 6a]
[서열 6b]
(2) 서열 번호 7 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 177 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : cDNA
(vi) 기원
(A) 유기체 : 크레피스 알피나(Crepis alpina)
(ix) 서열의 특징
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 존재위치 : 1..177
(xi) 서열 번호 7:
[서열 7]
(2) 서열 번호 8 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 59 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : 단백질
(xi) 서열 번호 8:
[서열 8]
(2) 서열 번호 9 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 383 염기쌍
(B) 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : 단백질
(vi) 기원 : 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)
(xi) 서열 번호 9:
[서열 9a]
[서열 9b]
[서열 9c]
(2) 서열 번호 10 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 384 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : 단백질
(vi) 기원
(A) 유기체 : 브라시카 준세아(Barssica juncea)
(xi) 서열 번호 10:
[서열 10a]
[서열 10b]
[서열 10c]
(2) 서열 번호 11 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 383 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : 단백질
(vi) 기원
(A) 유기체 : 글리신 막스(Glycine max)
(xi) 서열 번호 11:
[서열 11a]
[서열 11b]
(2) 서열 번호 12 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 383 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : 단백질
(vi) 기원
(A) 유기체 : 솔라늄 컴머소니(Solanum commersonii)
(xi) 서열 번호 12:
[서열 12a]
[서열 12b]
(2) 서열 번호 13 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 387 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : 단백질
(vi) 기원
(A) 유기체 : 글리신 막스(Glycine max)
(xi) 서열 번호 13:
[서열 13a]
[서열 13b]
[서열 13c]
(2) 서열 번호 14 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 387 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : 단백질
(vi) 기원
(A) 유기체 : 리시너스 컴뮤니스(Ricinus communis)
(xi) 서열 번호 14:
[서열 14a]
[서열 14b]
[서열 14c]
(2) 서열 번호 15 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 6 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : 펩티드
(v) 단편의 타입 : 중간 단편
(xi) 서열 번호 15:
[서열 15]
(2) 서열 번호 16 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 5 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : 펩티드
(v) 단편의 타입 : 중간 단편
(xi) 서열 번호 16:
[서열 16]
(2) 서열 번호 17 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 5 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : 펩티드
(v) 단편의 타입 : 중간 단편
(xi) 서열 번호 17:
[서열 17]
(2) 서열 번호 18 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 29 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : 올리고뉴클레오티드
(xi) 서열 번호 18:
[서열 18]
(2) 서열 번호 19 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 1610 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : cDNA
(vi) 기원 :
(A) 유기체: 유포비아 라가스케(Euphorbia lagascae)
(xi) 서열 번호 19:
[서열 19a]
[서열 19b]
[서열 19c]
[서열 19d]
(2) 서열 번호 20 에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 1698 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 분자의 타입 : DNA
(ix) 서열의 특징
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 존재위치 : 8..1504
(xi) 서열 번호 20:
[서열 20a]
[서열 20b]
[서열 20c]

Claims (50)

  1. 포유류 아라키돈산 에폭시게나제 효소외에 지방산 에폭시게나제 효소를 암호화하는 분리된 핵산 분자를 암호화하거나 또는 이 분자에 상보적인 분리된 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 에폭시게나제가 지방산 분자에서 탄소 결합의 에폭시 형성을 촉진할(catalyze) 수 있는 혼합 작용성 모노옥시게나제 효소인 것이 특징인 분리된 핵산 분자.
  3. 제2항에 있어서, 탄소 결합이 불포화 지방산 분자내 이중 결합인 것이 특징인 분리된 핵산 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 에폭시게나제가 Δ6-에폭시게나제 효소, Δ9-에폭시게나제 효소, Δ12-에폭시게나제 효소 또는 Δ15-에폭시게나제 효소인 것이 특징인 분리된 핵산 분자.
  5. 제4항에 있어서, 에폭시게나제가 Δ12-에폭시게나제 효소인 것이 특징인 분리된 핵산 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 식물에서 유래된 것이 특징인 분리된 핵산 분자.
  7. 제6항에 있어서, 식물이 크레피스(Crepis) 종, 유포비아(Euphorbia) 종, 크리산테뮴(Chrysanthemum) 종 및 베르노니아(Vernonia) 종에서 선택되는 것이 특징인 분리된 핵산 분자.
  8. 제6항에 있어서, 식물이 베르놀산을 다량 생성하는 것이 특징인 분리된 핵산 분자.
  9. 제7항에 있어서, 식물이 크레피스 비엔니스(Crepis biennis), 크레피스 아우레아(Crepis aurea), 크레피스 코니자에폴리아(Crepis conyzaefolia), 크레피스 인터메디아(Crepis intermedia), 크레피스 옥시덴탈리스(Crepis occidentalis), 크레피스 팔라에스티나(Crepis palaestina), 크레피스 베시카리아(Crepis vesicaria) 및 크레피스 크사신타(Crepis xacintha)를 포함하는 군에서 선택된 크레피스 (Crepis) 종인 것이 특징인 분리된 핵산 분자.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 식물이 크레피스 팔라에스티나인 것이 특징인 분리된 핵산 분자.
  11. 제7항에 있어서, 식물이 베르노니아 갈라멘시스(Vernonia galamensis)인 것이 특징인 분리된 핵산 분자.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 서열 번호 5 또는 이의 상보적인 서열 중 어느 하나에 약 65% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 상동체, 유사체 또는 유도체를 포함하는 것이 특징인 분리된 핵산 분자.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 최소한 낮은 엄중 조건하에 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 서열 번호 5 또는 이의 상보적인 서열 중 어느 하나내에 포함된 20개 이상의 인접 뉴클레오티드에 하이브리드화시킬 수 있는 분리된 핵산 분자.
  14. 서열 번호 1, 서열 번호 3 또는 서열 번호 5 또는 이의 상보적인 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나의 서열에 65% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산.
  15. 제14항에 있어서, 서열 번호 1에 개시된 뉴클레오티드 서열 또는 이의 약 20개 이상의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 것이 특징인 분리된 핵산 분자.
  16. 제14항에 있어서, 서열 번호 3에 개시된 뉴클레오티드 서열 또는 이의 약 20개 이상의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 것이 특징인 분리된 핵산 분자.
  17. 제14항에 있어서, 서열 번호 5에 개시된 뉴클레오티드 서열 또는 이의 약 20개 이상의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 것이 특징인 분리된 핵산 분자.
  18. 서열 번호 19 또는 서열 번호 20이나 또는 이에 상보적인 서열 중 어느 하나내의 약 200개 이상의 인접 뉴클레오티드에 75% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  19. 핵산 분자가 자연 발생적인 에폭시게나제 유전자의 생체내 전사 방향에 대해 센스 또는 안티센스 방향으로 전사될 수 있는 것이 특징인 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 기재된 분리된 핵산 분자를 포함하는 유전자 작제물.
  20. 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 기재된 분리된 핵산 분자를 포함하는 센스, 안티센스, 리보자임 또는 공동억제 분자를 세포, 조직, 기관 또는 유기체에 도입하는 단계, 및 센스, 안티센스, 리보자임 또는 공동억제 분자가 발현하기에 충분한 조건하에 일정 시간 동안 세포를 항온처리하는 단계를 포함하여 세포, 조직, 기관 또는 유기체내에 에폭시 지방산의 양을 변경하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 센스, 안티센스, 리보자임 또는 공동억제 분자를 도입하는 단계가 센스, 안티센스, 리보자임 또는 공동억제 분자로 세포, 조직, 기관 또는 유기체를 안정하게 형질전환시키는 것을 포함하는 것이 특징인 세포, 조직, 기관 또는 유기체내에 에폭시 지방산의 양을 변경하는 방법.
  22. 발현할 수 있는 충분한 조건하에 일정 시간 동안 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 기재된 분리된 핵산 분자를 포함하는 세포를 배양하는 단계를 포함하여, 세포내에서 효소적 활성인 재조합 에폭시게나제 폴리펩티드를 생성하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 분리된 핵산 분자로 세포를 형질전환시키는 추가의 제1 단계를 포함하는 것이 특징인 세포내에서 효소적 활성인 재조합 에폭시게나제 폴리펩티드를 생성하는 방법.
  24. (i) 세포내에 유전자 서열을 발현하게 할 수 있는 프로모터, 및 임의적으로 발현 인헨서 성분의 존재하에 작동가능하게 배치된 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 기재된 분리된 핵산 분자를 포함하는 유전자 작제물을 제조하는 단계,
    (ii) 세포내로 유전자 작제물을 형질전환시키는 단계,
    (iii) 유전자 서열에 의해 암호화되는 작용성 에폭시게나아제를 다량 발현하는 형질전환체를 선별하는 단계를 포함하여, 세포내에서 효소적 활성인 재조합 에폭시게나제 폴리펩티드를 생성하는 방법.
  25. (i) 전사 종지 서열의 상부에 배치된 종자 특이적 프로모터 및 임의적으로 발현 인헨서 성분의 제어하에 작동가능하게 배치된 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 기재된 분리된 핵산 분자를 포함하는 유전자 작제물을 제조하는 단계,
    (ii) 유전자 작제물을 식물의 세포 또는 조직내로 형질전환시키는 단계,
    (iii) 유전자 서열에 의해 암호화되는 작용성 에폭시게나제를 종자내에서 다량으로 발현하는 형질전환체를 선별하는 단계를 포함하여 돌연변이 식물내에 효소적 활성인 재조합 에폭시게나제 폴리펩티드를 제조하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 식물이 정상적으로 리놀레산을 다량으로 생성하는 종유(oilseed; 種油)종인 것이 특징인 돌연변이 식물내에 효소적 활성인 재조합 에폭시게나제 폴리펩티드를 제조하는 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 식물이 리놀라(등록상표) 아마, 종유 평지(oilseed rape), 해바라기, 홍화, 대두, 아마씨, 참깨, 목화씨, 땅콩, 올리브나 팜유로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 돌연변이 식물내에 효소적 활성인 재조합 에폭시게나제 폴리펩티드를 제조하는 방법.
  28. 제22항 내지 제27항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법으로 제조한 재조합 폴리펩티드.
  29. 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6 중 어느 하나의 아미노산 서열, 이에 대해 약 50% 이상 동일한 이의 상동체, 유사체 또는 유도체를 포함하는 재조합 폴리펩티드.
  30. 서열 번호 2, 서열 번호 4 또는 서열 번호 6 중 어느 하나의 아미노산 서열의 일부와 상이한 혼합 작용성 모노옥시게나제 효소로부터 유도된 아미노산 서열간의 융합 폴리펩티드인 재조합 폴리펩티드.
  31. 제30항에 있어서, 상이한 혼합 작용성 모노옥시게나제 효소가 탈포화 효소(desaturase), 아세틸레나제 또는 히드록실라제 효소인 것이 특징인 재조합 폴리펩티드.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 이것이 유도된 폴리펩티드의 촉매 활성과 다른 촉매 활성을 나타내는 것이 특징인 재조합 폴리펩티드.
  33. 기질의 하나 이상의 탄소 결합을 에폭시기로 전환시키기에 충분한 조건하에 일정 시간 동안 지방산 기질과 제28항 내지 제32항 중 어느 하나의 항에 개시된 재조합 폴리펩티드를 발현하는 세포, 조직, 기관 또는 유기체를 배양하는 단계를 포함하여 세포, 조직, 기관 또는 유기체내에서 에폭시 형성된 지방산을 생성하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 지방산 기질이 불포화 지방산이고, 에폭시 형성된 기질의 탄소 결합이 탄소 이중 결합인 것이 특징인 세포, 조직, 기관 또는 유기체내에서 에폭시 형성된 지방산을 생성하는 방법.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 지방산 기질이 팔미톨산, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 9,15-옥타데카디엔산 및 아라키돈산으로 구성된 군에서 선택된 것이 특징인 세포, 조직, 기관 또는 유기체내에서 에폭시 형성된 지방산을 생성하는 방법.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 하나의 항에 있어서, 에폭시 형성된 탄소 결합이 Δ6 탄소 결합, Δ9 탄소 결합, Δ12 탄소 결합 또는 Δ15 탄소 결합인 것이 특징인 세포, 조직, 기관 또는 유기체내에서 에폭시 형성된 지방산을 생성하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 에폭시 형성된 탄소 결합이 Δ12 탄소 결합인 것이 특징인 세포, 조직, 기관 또는 유기체내에서 에폭시 형성된 지방산을 생성하는 방법.
  38. 제33항 내지 제37항 중 어느 하나의 항에 있어서, 생성된 에폭시 형성된 지방산이 베르놀산인 것이 특징인 세포, 조직, 기관 또는 유기체내에서 에폭시 형성된 지방산을 생성하는 방법.
  39. 제33항 내지 제38항 중 어느 하나의 항에 있어서, 재조합 에폭시게나제를 암호화하는 핵산 분자, 또는 이의 상동체, 유사체 또는 유도체로 세포, 조직, 기관 또는 유기체를 형질전환 또는 형질감염시키는 추가의 제1 단계를 포함하는 것이 특징인 세포, 조직, 기관 또는 유기체내에서 에폭시 형성된 지방산을 생성하는 방법.
  40. 제33항 내지 제39항 중 어느 하나의 항에 있어서, 재조합 에폭시게나제가 발현되는 세포, 기관, 조직 또는 유기체가 박테리아, 효모, 진균류, 곰팡이, 곤충, 식물, 조류 또는 포유류에서 유래한 것이 특징인 세포, 조직, 기관 또는 유기체내에서 에폭시 형성된 지방산을 생성하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 세포, 기관, 조직 또는 유기체가 효모, 식물, 진균류 또는 곰팡이에서 유래하는 것이 특징인 세포, 조직, 기관 또는 유기체내에서 에폭시 형성된 지방산을 생성하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 효모, 식물, 진균류 또는 곰팡이가 유성의 효모, 식물, 진균류 또는 곰팡이인 것이 특징인 세포, 조직, 기관 또는 유기체내에서 에폭시, 형성된 지방산을 생성하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 식물이 정상적으로 재조합 에폭시게나제를 다량 발현하지 않는 종유 식물인 것이 특징인 세포, 조직, 기관 또는 유기체내에서 에폭시 형성된 지방산을 생성하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 종유 식물이 리놀라(등록상표) 아마, 종유 평지(oilseed rape), 해바라기, 홍화, 대두, 아마인, 참깨, 목화씨, 땅콩, 올리브나 팜유로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 세포, 조직, 기관 또는 유기체내에서 에폭시 형성된 지방산을 생성하는 방법.
  45. 제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 기재된 분리된 핵산 분자로 형질전환된 식물, 또는 이로부터 유래한 세포, 조직이나 기관, 또는 상기 핵산 분자를 포함하는 식물의 후대.
  46. 제28항 내지 제32항 중 어느 하나의 항에 기재된 재조합 폴리펩티드를 발현할 수 있는 형질전환된 식물, 또는 이로부터 유래한 세포, 조직이나 기관, 또는 상기 재조합 폴리펩티드를 발현할 수 있는 식물의 후대.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 리놀라(등록상표) 아마, 종유 평지(oilseed rape), 해바라기, 홍화, 대두, 아마인, 참깨, 목화씨, 땅콩, 올리브나 팜유에서 유래하거나 이를 포함하는 것이 특징인 식물, 또는 이로부터 유래한 세포, 조직이나 기관, 또는 식물의 후대.
  48. 제45항 또는 제46항에 있어서, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)에서 유래하거나 또는 이를 포함하는 것이 특징인 식물, 또는 이로부터 유래한 세포, 조직이나 기관, 또는 식물의 후대.
  49. 제45항 또는 제46항에 있어서, 리눔 우시타티시뮴(Linum usitatissimum)에서 유래하거나 또는 이를 포함하는 것이 특징인 식물, 또는 이로부터 유래한 세포, 조직이나 기관, 또는 식물의 후대.
  50. 혼합 작용 에폭시게나제 폴리펩티드 또는 이의 에피토프에 결합할 수 있는 항체 분자.
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