CN100482797C

CN100482797C - 植物脂肪酸环氧化酶及其用途

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Publication number: CN100482797C
Application number: CNB988054701A
Authority: CN
Inventors: 斯滕·斯蒂姆; 阿伦·格林; 苏林德·辛格; 玛丽特·伦曼
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO; BASF Plant Science GmbH
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO; BASF Plant Science GmbH
Priority date: 1997-04-15
Filing date: 1998-04-09
Publication date: 2009-04-29
Anticipated expiration: 2018-04-09
Also published as: BR9808676A; DK0975765T3; MX224646B; DE69836133D1; KR20010006468A; EP0975765B1; CA2286895A1; KR100711074B1; MX9909476A; NZ500542A; CN1257541A; ATE342361T1; EA004568B1; JP4108765B2; EA199900933A1; US6329518B1; IL132393A; JP2001518797A; EP0975765A4; TR199902583T2

Abstract

本发明总的涉及编码脂肪酸环氧化酶的新遗传序列。具体地，本发明涉及编码脂肪酸Δ12-环氧化酶包括混合功能单加氧酶的遗传序列。更优选地，本发明提供编码植物脂肪酸环氧化酶，特别是Crepispalaestina Δ12-环氧化酶的cDNA序列及其同系物、类似物和衍生物。本发明的遗传序列提供可改变或控制诸如酵母、霉菌、细菌、昆虫、鸟类、哺乳动物或植物的生物中脂肪酸代谢，特别是其中将不饱和脂肪酸转变为环氧化脂肪酸的代谢的方法。本发明延伸至用本遗传序列转化的遗传修饰的油-富集生物和从中生成的油。由此生成的油提供了用于有效生产涂料、树脂、胶、塑料、表面活性剂和润滑剂等的成本有效性原材料。

Description

植物脂肪酸环氧化酶及其用途

发明领域：

本发明总的地涉及编码脂肪酸环氧化酶(epoxygenase)的新遗传序列。具体地，本发明涉及编码如此处所定义的脂肪酸△12-环氧化酶的遗传序列。更具体地，本发明提供编码植物脂肪酸环氧化酶，优选地是Crepis palaestina或Euphorbia lagascae △12-环氧化酶的遗传序列。本发明的遗传序列提供可改变或控制诸如酵母、霉菌、细菌、昆虫、鸟类、哺乳动物和植物的生物中脂肪酸代谢，特别是其中将不饱和脂肪酸转变为环氧化脂肪酸的代谢的方法。本发明延伸至用此遗传序列转化的遗传修饰的油-富集生物和从中生成的油。由此生成的油提供了用于高效生产涂料、树脂、胶、塑料、表面活性剂和润滑剂等成本有效性原材料的方法。

整个说明书及后面的权利要求书中，除非上下文另有需要，词语“包含”或其不同时态的变体应理解为表示包括所称的整体或一组整体但不排除任何其它整体或整体组。

本说明书中由作者提及的公开文献目录细节收集在描述的末尾。说明书中提及的核苷酸和氨基酸序列的序列鉴定号(SEQ ID NO)在目录之后定义。

发明背景：

从可更新的植物来源而不是从不可更新的石油化工制品生产用于工业用途的化学原料如脂肪酸，在世界范围有相当大的重要性。此观念基于保护资源对制造商和消费者有广泛吸引力并提供发展农业上新经济作物的重要机会。

有不同系列的天然稀有脂肪酸并且它们已得到很好鉴定(Badam和Patil，1981；Smith，1970)。许多这些稀有脂肪酸具有工业潜力并且这引起了培育这些物种以进行特定脂肪酸农业生产的兴趣。

特别感兴趣的一类脂肪酸是环氧-脂肪酸，包含其中两个相邻碳键由环氧桥连接的酰基链。由于它们的高反应性，它们在涂料、树脂、胶、塑料、表面活性剂和润滑剂的生产中有大量的应用。这些脂肪酸现在通过植物油，主要是大豆油和亚麻籽油的化学环氧化作用生产，但是此方法会产生多元混合物和同质异能形式并需要高昂的加工费用。

其他人正在尝试培育含有环氧脂肪酸的一些野生植物(如Euphorbia lagauscae，Vernonia galamensis)成为这些油的商业来源。然而，农学适应性和低产量潜力的问题严重限制了传统植物育种和栽培方法的商业应用。

重组DNA技术快速增强的精密性通过在第二种生物或物种中表达从第一种生物或物种分离的基因以赋予其新的表型，大大提高了商业上重要的工业方法的效率。更具体地，传统的工业方法能通过重组DNA技术的应用变得效率更高或更具成本有效性，导致每单位成本的更大产量。

并且，用于表达目的遗传序列的宿主生物的适当选择提供一般不由宿主产生或合成的化合物以高产量和纯度的生产。

但是，尽管重组DNA技术具有一般的有效性，但编码脂肪酸代谢中重要酶的遗传序列，特别是编码负责合成12，13-环氧-9-十八碳烯酸(斑鸠菊酸)和12，13-环氧-9，15-十八碳二烯酸等的脂肪酸△12-环氧化酶的基因的分离，仍然是发展合成这些脂肪酸的遗传工程生物的主要障碍。

在本发明之前，仅有有限的生化数据显示脂肪酸环氧化酶特别是△12-环氧化酶的性质。但是，在Euphorbia lagascae中，从亚油酸形成12，13-环氧-9-十八碳烯酸(斑鸠菊酸)看来由细胞色素P450依赖的△12环氧化酶催化(Bafor等，1993；Blee等，1994)。并且，亚麻籽植物正在发育的种子具有通过内源△15去饱和酶将加入的斑鸠菊酸转变为12，13-环氧-9，15-十八碳二烯酸的能力(Engeseth和Stymne，1996)。环氧脂肪酸还可通过植物组织中过氧化物依赖的过氧化物酶合成(Blee和Schuber，1990)。

在导致本发明的工作中，本发明人设法分离编码对于环氧脂肪酸如12，13-环氧-9-十八碳烯酸(斑鸠菊酸)或12，13-环氧-9，15-十八碳二烯酸的生产重要的基因的遗传序列并将这些遗传序列转入高产的商业含油种子植物和/或其它富含油的生物。

发明概述：

本发明的一个方面提供编码脂肪酸环氧化酶的分离的核酸分子或与其互补的分离的核酸分子。

本发明的第二方面提供在至少低严格条件下与SEQ ID NO：1或3或5或19或20或与其互补序列的至少20个连续核苷酸杂交的分离核酸分子。

本发明进一步的方面提供包含与SEQ ID NO：1或3或5至少65％相同或与SEQ ID NO：19或20或其互补序列中至少200个连续核苷酸至少75％相同的核苷酸序列的分离核酸分子。

本发明进一步的方面提供以正义或反义方向包含与启动子序列可操作连接的上述分离核酸分子的遗传构建体。

本发明进一步的方面提供改变细胞、组织、器官或生物中环氧脂肪酸水平的方法，该方法包括在足以使其中的环氧脂肪酸水平增加或减少的条件下使包含上述分离核酸分子的正义、反义、核酶或共抑制分子在所述细胞中表达一段时间。

本发明进一步的方面提供在细胞中合成重组具酶活性的环氧化酶多肽的方法，该方法包括在足以使其编码的环氧化酶合成的条件下将上述分离的核酸分子在上述细胞中表达一段时间。

本发明进一步的方面提供在细胞中合成重组具酶活性的环氧化酶多肽的方法，该方法包含以下步骤：

(i)制备包含可操作地置于能在上述细胞中赋予遗传序列表达的启动子控制之下的上述分离核酸分子和选择性地表达增强子元件的遗传构建体；

(ii)将上述遗传构建体转化入上述细胞；并且

(iii)选择高水平表达由遗传序列编码的功能性环氧化酶的转化体。

本发明进一步的方面提供在转基因植物中合成重组具酶活性的环氧化酶多肽的方法，包含以下步骤：

(i)制备包含可操作地置于种子特异性启动子控制之下的上述分离核酸分子和选择性地表达增强子元件的遗传构建体，其中所述遗传序列也置于转录终止子序列的上游；

(ii)将该遗传构建体转化入上述植物的细胞或组织；并且

(iii)选择在种子中以高水平表达由遗传序列编码的功能性环氧化酶的转化体。

本发明进一步的方面提供重组的环氧化酶多肽或功能性酶分子。

本发明进一步的方面提供包含在SEQ ID NO：2或4或6中的任意一个中所示的氨基酸序列的重组环氧化酶或与其至少约50％相同的其同系物、类似物或衍生物。

本发明进一步的方面提供在细胞、组织、器官或生物中合成环氧化脂肪酸的方法，该方法包括将表达具酶活性的重组环氧化酶的细胞、组织、器官或生物与脂肪酸底物并优选地不饱和脂肪酸底物在足以使上述底物的至少一个碳键、优选地碳双键转变为环氧基团的条件下一起培养一段时间。

本发明进一步的方面提供与此处所述的重组环氧化酶多肽或其同系物、类似物或衍生物结合的免疫反应活性分子。

附图简述：

图1是包含环氧化酶结构基因的表达质粒的线形表示，该基因可操作地置于截短的napin启动子(FPl；右手阴影盒)控制之下并置于NOS终止子序列(右手点画盒)的上游。环氧化酶遗传序列由右手开放矩形盒表示。该构建体还包含驱动NPTII基因(左手开放盒)表达的NOS启动子(左手阴影盒)并位于NOS终止子(左手点画盒)的上游。还表示了根瘤土壤杆菌Ti质粒的左和右边界序列。

图2是表示Crepis palaestina的环氧化酶多肽(Cpal2；SED IDNO：2)、来自还阳参属种类而不是产生高水平斑鸠菊酸的C.palaestina的其它环氧化酶(CrepX；SED ID NO：4)的氨基酸序列，来自Vernoniagalamensis的环氧化酶多肽的部分氨基酸序列(Vgall；SEQ IDNO：6)，Crepis alpina的△12乙炔化酶(actylenase)(Crepl；SEQ IDNO：8)、拟南芥(L26296；SEQ ID NO：9)、芥菜(X91139；SEQ ID NO：10)、大豆(L43921；SEQ ID NO：11)、Solanum commersonii(X92847；SEQID NO：12)和大豆(L43920；SEQ ID NO：13)的△12去饱和酶和Ricinacommunis(U22378；SEQ ID NO：14)的△12羟化酶的氨基酸序列的比较图示。

图3是表示由SEQ ID NO：1例示的Crepis palaestina环氧化酶基因的种子特异性表达的Northern印迹杂交的摄影图示复印件。Northern印迹分析来自Crepis polaestina叶(泳道1)和正在发育的种子(泳道2)的总RNA。在Northern凝胶中电泳15μg总RNA并按照制造商的说明将其印迹到Amersham公司的Hybond N⁺膜上。印迹与从SEQ ID NO：1的3′未翻译区制备的探针在60℃杂交。印迹于室温在2×SSC(氯化钠—柠檬酸钠缓冲液)中洗两次，每次10分钟，然后于60℃在0.1×SSC中洗20分钟。

图4是表示用于分离在此处所述的Euphorbia lagascae环氧化酶基因的简并PCR引物的核苷酸序列(5′到3′方向)的图示。

图5是表示与不产生斑鸠菊酸的植物相比，SEQ ID NO：3中例示的环氧化酶基因在产生斑鸠菊酸的植物中表达的RNA点印迹杂交的摄影图示复印件。从特定组织中分离1μg总RNA并按照每一制造商的说明将其点印迹至Amersham公司的Hybond N⁺膜上。印迹于42℃与从SEQID NO：3制备的相关³²P标记的探针在50％甲酰胺中杂交16小时。印迹于室温在2×SSC(氯化钠—柠檬酸钠缓冲液)中洗两次，然后于55℃在0.5×SSC中洗20分钟。过夜曝光后获得放射自显影照片。A组表示来自Euphorbia lagascae(1)、柏大戟(Euphorbiacyparissus)(2)、Vernonia galamensis(3)和亚麻(Linumusitatissimum)(4)的正在发育的种子的总RNA。B组表示来自Euphorbia lagascae不同组织包括正在发育的种子(1)、根(2)和叶(3)的总RNA。

图6是表示用于分离如此处所述的Euphorbia lagascae环氧化酶基因的减数杂交方法的图示。+6cDNA库主要由种子贮存蛋白样序列组成。对15个这样的序列库进行生物素化并进一步从+6cDNA中扣除。LH＝长杂交-20小时；SH＝短杂交-3小时。

图7是表示与不产生斑鸠菊酸的植物相比，SEQ ID NO：20中例示的环氧化酶基因在产生斑鸠菊酸的植物中表达的RNA点印迹杂交的摄影图示复印件。从特定组织中分离1μg总RNA并按照每一制造商的说明将其点印迹至Amersham公司的Hybond N⁺膜上。印迹与从SEQIDNO：20制备的相关³²P标记的探针于42℃在50％甲酰胺中杂交16小时。印迹于室温在2×SSC(氯化钠—柠檬酸钠缓冲液)中洗两次，然后于55℃在0.5×SSC中洗20分钟。过夜曝光后获得放射自显影照片。A组表示来自Euphorbia lagascae(1)、柏大戟(2)、Vernoniagalamensis(3)和亚麻(Linum usitatissimum)正在发育的种子的总RNA。B组表示来自Euphorbia lagascae不同组织包括正在发育的种子(1)、根(2)和叶(3)的总RNA。

图8是含有表达盒的双元质粒载体的图示，表达盒包含截短的napin种子特异性启动子(Napin)和胭脂氨酸合酶终止子(NT)，二者之间带有BamHI克隆位点，以及与胭脂氨酸合酶启动子(NP)和胭脂氨酸合酶终止子(NT)序列可操作连接的卡那霉素抗性基因NPTII。表达盒侧翼是T—DNA左边界(LB)和右边界(RB)序列。

图9是含有表达盒的双元质粒载体的图示，该盒包含可操作地置于截短的napin种子特异性启动子(Napin)控制之下及胭脂氨酸合酶终止子(NT)上游的SEQ ID NO：1，还有与胭脂氨酸启动子(NP)和胭脂氨酸终止子(NT)序列可操作连接的卡那霉素抗性基因NPT II。表达盒侧翼是T—DNA左边界(LB)和右边界(RB)序列。为制备此构建体，将SEQ ID NO：1插入图8中所示的双元载体的BamHI位点。

图10是从未转化的拟南芥植物[(a)组]或已经以SEQ ID NO：1用图9中所示的遗传构建体转化的拟南芥植物[(b)组和(c)组]制备的脂肪酸甲基酯的气相层析轨迹的图示。在(a)和(b)组中，脂肪酸甲基酯用填充柱分离法分离。在(c)组中，脂肪酸甲基酯用毛细管柱分离法分离。斑鸠菊酸的洗脱位置如图所示。

图11是表示如用气相层析测定的，Cpal2转化的拟南芥植物的T₁植物的自交种子中环氧化脂肪酸的联合分布图示。测定并绘制了斑鸠菊酸(x-轴)和12，13-环氧-9，15-十八碳二烯酸(y-轴)彼此相关的水平。数据表明转基因植物中这些脂肪酸水平之间的正相关。

图12是表示在用标记物质供给过程中从亚麻籽子叶脂提取物得到的氯仿相中¹⁴C-标记掺入的图示。所用符号：◆，[¹⁴C]油酸供给；■，[¹⁴C]斑鸠菊酸供给。

图13是表示在用标记物质供给过程中亚麻籽子叶的磷脂酰胆碱中¹⁴C-标记掺入的图示。所用符号：◆[¹⁴C]油酸供给；■，[¹⁴C]斑鸠菊酸供给。

图14是表示在用标记物质饲养过程中亚麻籽子叶的三酰甘油中¹⁴C-标记掺入的图示。所用符号：◆，[¹⁴C]油酸供给；■[¹⁴C]斑鸠菊酸供给。

优选实施方案详述：

本发明的一个方面提供编码脂肪酸环氧化酶的分离核酸分子或与其互补的分离核酸分子。

其中本发明的分离核酸分子编码参与花生四烯酸的直接环氧化作用的酶，特别优选的是此核酸分子来自非哺乳动物来源。

如本文所用的，术语“来自”用来表示特定整体或整体组来源于特定物种，但不必需直接从该特定来源获得。

术语“非哺乳动物来源”是指任何哺乳动物之外的生物或来自该生物的组织或细胞。

在本文中，术语“来自非哺乳动物来源”用来表示特定整体或整体组来自细菌、酵母、鸟类、两栖动物、爬行动物、昆虫、植物、真菌、霉菌和藻类或其它非哺乳动物。

在本发明优选实施方案中，来源生物是任何具有合成环氧脂肪酸遗传能力的生物。更优选地，来源生物是植物，例如但不限于苘蒿属种类、还阳参属种类、大戟属种类和斑鸠菊属种类等。

甚至更优选地，来源生物从包括粗糙还阳参(Crepis biennis)、金黄还阳参(Crepis aurea)、Crepis conyzaefolia、Crepisintermedia、Crepis occidentalis，Crepis palaestina、膀胱还阳参(Crepis vesicaria)、Crepis xacintha、Euphorbia lagascae和Vernonia galamensis的目录中选出，但不排除其它物种。

在本发明特别优选的实施方案中，来源生物是含有高水平斑鸠菊酸的还阳参属种类如Crepis palaestina等或选择性地Vernoniagalamensis或Euphorbia lagascae.

其中本发明的分离核酸分子编码△6-环氧化酶或△9-环氧化酶或△12-环氧化酶或△15-环氧化酶或至少编码不参与花生四烯酸直接环氧化作用的酶，本核酸分子可来自任何产生该酶的来源，包括但不限于酵母、霉菌、细菌、昆虫、鸟类、哺乳动物和植物。

根据任一前述实施方案所述的本发明的核酸分子可以是DNA如基因、cDNA分子、RNA分子或合成的寡核苷酸分子，是单链或双链的并且除非特别指出不考虑任何二级结构特征。

本文所提及的“基因”应理解为其最广义的含义并包括：(i)包含转录和/或转录调控序列和/或编码区和/或非翻译序列(即内含子，5′-和3′-非翻译序列)的典型基因组基因；或(ii)与基因的编码区(即外显子)和5′及3′非翻译序列对应的mRNA或cDNA。

术语“基因”还用于描述编码全部或部分功能产物的合成或融合分子。本发明优选的环氧化酶基因可通过常规重组技术从天然存在的环氧化酶基因得到。一般地，可以对环氧化酶基因进行诱变以产生单个或多个核苷酸替换、缺失和/或添加。

核苷酸插入衍生物包括5′和3′末端融合以及序列内单个或多个核苷酸的插入。插入核苷酸序列变体是那些在核苷酸序列预定位点导入一或多个核苷酸的变体，尽管在对终产物进行适当筛选的情况下随机插入也是可以的。

缺失变体的特征在于从序列中去除一个或更多核苷酸。

替换核苷酸变体是那些在序列中已去除至少一个核苷酸并在其位置插入不同核苷酸的变体。这样的替换可以是“沉默的”，其中替换并未改变密码子所定义的氨基酸。或者，替换设计为将一个氨基酸改为另一个相似作用的氨基酸或具有相似电荷、极性或疏水性的氨基酸。

在本发明的上下文中，术语“脂肪酸环氧化酶”应理解为任何通过将脂肪酸的碳键转变为环氧基团、优选地通过将不饱和脂肪酸的碳双键转变为环氧基团催化环氧化脂肪酸生物合成的酶或其功能相同的或具酶活性的衍生物。尽管不限定本发明，脂肪酸环氧化酶可催化选自12，13-环氧-9-十八碳烯酸(斑鸠菊酸)、12，13-环氧-9，15-十八碳二烯酸、15，16-环氧-9，12-十八碳二烯酸、9，10-环氧-12-十八碳烯酸和9，10-环氧-十八碳烯酸等的环氧脂肪酸生物合成。

术语“环氧”、“环氧基团”和“环氧残基”为本领域技术人员公知是指如下所示的包含通过单键连接的两个碳原子和一个氧原子的三成分环。

因此，术语“环氧化物”是指包含至少一个如此前所定义的环氧基团的化合物。

本领域技术人员知道脂肪酸命名法是基于碳链的长度和碳链内不饱和碳键的位置。因此，脂肪酸用下面简写符号来命名：

碳原子_总数：双键_总数 ^{双键(△)位置}

其中双键除非指出是顺式的。例如，棕榈酸(n-十六烷酸)是饱和的16-碳脂肪酸(即16∶0)，油酸(十八碳烯酸)是在C-9和C-10之间有一个双键的不饱和18-碳脂肪酸(即18∶1^△9)，亚油酸(十八碳二烯酸)是在C-9和C-10及C-12和C-13之间有两个双键的不饱和18-碳脂肪酸(即18∶2^△9，12)。

然而，本文中环氧化酶可催化任何碳键向环氧基团的转化或选择性地不饱和脂肪酸底物中双键向环氧基团的转化。在这方面，本领域技术人员熟知高等生物的大部分单一不饱和脂肪酸是18-碳不饱和脂肪酸(即18∶1^△9)，而来自高等生物的大部分多聚不饱和脂肪酸是其中有至少一个位于C₉与C₁₀之间的双键的18-碳脂肪酸。并且，细菌也包含C₁₆-单一不饱和脂肪酸。此外，本发明的环氧化酶可作用于不只一个脂肪酸底物分子，因此本发明并不受限于本环氧化酶所作用的底物分子性质。

优选地，本发明环氧化酶的底物分子是含有至少一个双键的不饱和脂肪酸。

更进一步地，环氧化酶可作用于任一底物分子的任一号碳原子。例如，它们可称为△6-环氧化酶、△9-环氧化酶、△12-环氧化酶或△15-环氧化酶等。因此，本发明并不限于环氧化酶可作用的底物中碳原子的位置。

如本文所用的，术语“△6-环氧化酶”应理解为是指催化脂肪酸底物的△6碳键转变为△6环氧基团，优选地催化至少一个不饱和脂肪酸的△6双键转变为△6环氧基团的环氧化酶。

如本文所用的，术语“△9-环氧化酶”应理解为是指催化脂肪酸底物的△9碳键转变为△9环氧基团，优选地催化至少一个不饱和脂肪酸的△9双键转变为△9环氧基团的环氧化酶。

如本文所用的，术语“△12-环氧化酶”应理解为是指催化脂肪酸底物的△12碳键转变为△12环氧基团，优选地催化至少一个不饱和脂肪酸的△12双键转变为△12环氧基团的环氧化酶。

如本文所用的，术语“△15-环氧化酶”应理解为是指催化脂肪酸底物的△15碳键转变为△15环氧基团，优选地催化至少一个不饱和脂肪酸的△15双键转变为△15环氧基团的环氧化酶。

本发明显然可延伸至编码所有上述环氧化酶等的遗传序列。

在本发明的一个优选实施方案中，分离的核酸分子编码将棕榈油酸(16∶1^△9)、油酸(18∶1^△9)、亚油酸(18∶2^△9，12)、亚麻酸(18∶3△^9，12，15)或花生四烯酸(20∶4^{△5，8，11，14})中的至少一个碳键转变为环氧基团的脂肪酸环氧化酶。优选地，碳键是碳双键。

更优选地，本发明的分离核酸分子编码至少将亚油酸中的一个或两个双键转变为环氧基团的脂肪酸环氧化酶。根据此实施方案，将亚油酸的△9和△12两个双键转变为环氧基团的环氧化酶可互相独立地催化这样的转化过程，因此该环氧化酶是如前所定义的△9-环氧化酶和/或△12-环氧化酶。

在另一可选的优选实施方案中，本发明的脂肪酸环氧化酶是如前所定义的△12-环氧化酶、△-15环氧化酶或△9-环氧化酶。

更优选地，本发明的脂肪酸环氧化酶是如前所定义的△12-环氧化酶。

在本发明特别优选的实施方案中，提供了编码亚油酸盐△12-环氧化酶的分离的核酸分子，该酶至少将亚油酸中的△12双键转变为△12-环氧基团，从而产生12，13-环氧-9-十八碳烯酸(斑鸠菊酸)。

尽管不限制本发明，但本发明的△12-环氧化酶的优选来源是植物，特别是Crepis palaestina或进一步是不同于C.palaestina但含有高水平斑鸠菊酸的还阳参属种类、Vernonia galamensis或Euphorbia lagascae。

根据此实施方案，△12-环氧化酶可催化棕榈油酸转变为9，10-环氧-棕榈酸和/或油酸转变为9，10-环氧-硬脂酸和/或亚油酸转变为9，10-环氧-12-十八碳烯酸或12，13-环氧-9-十八碳烯酸或9，10，12，13-双环氧-硬脂酸中的任何一个或多个和/或亚麻酸转变为9，10-环氧-12，15-十八碳二烯酸或12，13-环氧-9，15-十八碳二烯酸或15，16-环氧-十八碳二烯酸或9，10，12，13-双环氧-15-十八碳烯酸或9，10，15，16-双环氧-12-十八碳烯酸或12，13，15，16-双环氧-9-十八碳烯酸或9，10，12，13，15，16-三环氧-硬脂酸中的任何一个或多个和/或花生四烯酸转变为5，6-环氧-8，11，14-二十四碳三烯酸或8，9-环氧-5，11，14-二十四碳三烯酸或11，12-环氧-5，8，14-二十四碳三烯酸或14，15-环氧-5，8，11-二十四碳三烯酸或5，6，8，9-双环氧-11，14-二十四碳二烯酸或5，6，11，12-双环氧-8，14-二十四碳二烯酸或5，6，14，15-双环氧-8，11-二十四碳二烯酸或8，9，11，12-双环氧-5，14-二十四碳二烯酸或8，9，14，15-双环氧-5，11-二十四碳二烯酸或11，12，14，15-双环氧-5，8-二十四碳二烯酸或5，6，8，9，11，12-三环氧-14-二十四碳烯酸或5，6，8，9，14，15-三环氧-11-二十四碳烯酸或5，6，11，12，14，15-三环氧-8-二十四碳烯酸或8，9，11，12，14，15-三环氧-5-二十四碳烯酸等中的一个或多个。

本领域技术人员可以知道不是所有上述底物都可来自天然来源，但尽管如此，可通过化学方法得到合成。天然存在和化学合成的不饱和脂肪酸向环氧脂肪酸的转化都在本发明的范围之内，唯一要求是如此处所述的本发明的核酸分子编码能催化该转化的酶或其功能性部分。

根据前面的讨论，本领域技术人员将知道脂肪酸环氧化酶可以是细胞色素p450依赖的单加氧酶或混合功能单加氧酶或选择性地过氧化物依赖的过氧化酶或类似的酶等。然而，本发明特别涉及那些是混合功能加氧酶的环氧化酶和编码该酶的核酸分子及其用途。因此，特别优选的是本发明的核酸分子编码是混合功能单加氧的脂肪酸氧化酶。

在本发明的上下文中，术语“混合功能单加氧酶”应理解为是指任何催化脂肪酸分子中碳键或碳双键的环氧化作用的酶，其中该酶进一步包含含有如下所示的三组氨酸-富集区的氨基酸序列：

(i)His-(Xaa)_3-4-His；

(ii)His-(Xaa)_2-3-His-His；和

(iii)His-(Xaa)_2-3-His-His

其中His代表组氨酸，Xaa代表任何如表1中所列的天然存在的氨基酸残基，整体(Xaa)_3-4是指包含三或四个Xaa重复的氨基酸序列，整体(Xaa)_2-3是指包含两或三个Xaa重复的氨基酸序列。

术语“混合功能单加氧酶样酶”应理解为是指任何包含三个上述的组氨酸-富集区的酶。

在如此处所述的本发明的例证中，本发明人已证明了此处提供的Crepis palaestina氨基酸序列包括包含如此前所定义的混合功能单加氧酶的特征性氨基酸序列基序的△12-环氧化酶。与其它混合功能单加氧酶如去饱和酶和羟化酶的氨基酸序列相比，C.palaes tina △12-环氧化酶(SEQ ID NO：2)与如此处提供的来自未鉴定的还阳参属种类和Vernonia galamensis的多肽氨基酸序列之间的紧密氨基酸相同性表明所述的还阳参属种类和V.galamensis氨基酸序列也是脂肪酸环氧化酶并可能是△12-环氧化酶。在这方面，此处所举例的Vernoniagalamensis氨基酸序列是仅包含一个完整组氨酸-富集基序(即His-Arg-Asn-His-His)和第一个组氨酸-富集基序的部分序列(即它包含His-Glu-Cys-Gly-His-His基序的后两个组氨酸残基)的部分序列，因为使用针对此第一个组氨酸-富集基序的第一引物和设计为针对第三个组氨酸-富集基序(即His-Val-Met-His-His)上游区的第二扩增引物通过聚合酶链式反应扩增到编码相同序列的相应核苷酸序列为部分cDNA序列。并且，用对第一个组氨酸-富集基序特异的引物扩增到V.galamensis序列的事实表明相应的全长序列也包含此基序。

因此，在特别优选的实施方案中，本发明的核酸分子编码来自还阳参属种类包括Crepis palaestina或选择性地来自Vernoniagalamensis的混合功能单加氧酶或类似的酶。根据此实施方案，甚至更优选的是本环氧化酶至少包含含有三个或更多如下所示的组氨酸-富集区的氨基酸序列：

(i)His-Glu-Cys-His-His(SEQ ID NO：15)；

(ii)His-Arg-Asn-His-His(SEQ ID NO：16)；和

(iii)His-Val-Met-His-His(SEQ ID NO：17)，

或其同系物、类似物或衍生物，其中His代表组氨酸，Glu代表谷氨酸，Cys代表半胱氨酸，Gly代表甘氨酸，Arg代表精氨酸，Asn代表天冬酰胺，Val代表缬氨酸，Met代表甲硫氨酸。

本发明明确地延伸至来自其它物种的环氧化酶基因，包括来自苘蒿属种类和Euphorbia lagascae等的环氧化酶基因。

在优选的实施方案中，同时不限制本发明，本发明所包括的其它物种的环氧化酶基因编码混合功能单加氧酶。本发明进一步延伸到由这样的基因编码的分离的或重组的多肽以及所述基因和多肽的用途。

根据此实施方案所述的本发明不包括编码除了如此处所定义的环氧化酶活性之外的酶活性的核酸分子，具体地来自拟南芥、芥菜、欧洲油菜或大豆等已知含有相似组氨酸-富集基序的△12-去饱和酶活性。

在本文中，氨基酸序列的“同系物”是指那些来自本发明的多肽、酶或蛋白的氨基酸序列或多肽序列或选择性地那些尽管有天然存在的氨基酸替换、添加或缺失但仍与上述氨基酸序列基本一致的氨基酸序列或多肽序列。

例如，氨基酸可用具有相似特性如疏水性、亲水性、疏水力矩、抗原性、形成或破坏α-螺旋或β-折叠结构的倾向等的其它氨基酸替换。选择性地或者另外，同源氨基酸序列的氨基酸可用其它具有相似特性如疏水性、亲水性、疏水力矩、电荷或抗原性等的氨基酸替换。

此处所考虑的天然存在的氨基酸残基在表1中描述。

氨基酸序列的同系物可以是通过任何本领域技术人员公知的方法如通过Fmoc化学法制备的合成肽。

选择性地，氨基酸序列的同系物可来自天然来源如与本发明的多肽、酶或蛋白相同的物种或另一物种。上述氨基酸序列同系物的优选来源包括本文考虑的任何来源。

尽管有非天然存在的氨基酸类似物的存在，但是氨基酸序列的“类似物”包括那些与上述氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。

此处所考虑的优选的非天然存在的氨基酸在表2中列出。

涉及氨基酸序列的术语“衍生物”应理解为是指上述氨基酸序列的突变体、部分、片段或多肽融合体。衍生物包括修饰的氨基酸序列或肽，其中配体如碳水化合物、酶、蛋白、多肽或报告分子如放射性核素或荧光化合物与其中所包含的一个或多个氨基酸残基结合。本发明也包括所述肽的糖基化、发荧光、乙酰化或烷基化形式。并且，衍生物可包含此处公开的氯基酸序列的片段或部分并且在本发明范围之内，衍生物也可包括含有所述序列的两个或多个拷贝的同聚体或异聚体并在本发明范围之内。

衍生肽的步骤为本领域技术人员所熟知。

替换包括其中氨基酸替换为不同的天然存在的或非常规的氨基酸残基的氨基酸改变。这样的替换可分为“保守的”，这种情况下氨基酸残基用另一个具相似性质的天然存在的氨基酸替换，例如

或

本发明所包括的替换也可以是“非保守的”，其中阻遏物多肽中存在的氨基酸残基替换为具有不同特性的氨基酸如来自不同组的天然存在的氨基酸(如将带电荷的或疏水的氨基酸替换为丙氨基)，或者选择性地将天然存在的氨基酸替换为非常规氨基酸。

氨基酸替换一般是单个残基，但也可以是聚集的或分散的多个残基。

氨基酸缺失经常是约1-10个氨基酸残基的级别，而插入则可以是任何长度。缺失和插入可以在N-末端、C-末端进行或是内部缺失或插入。一般地，氨基酸中的插入比氨基-或羧基-末端的融合更小并以1-4个氨基酸残基的级别。

本发明明确地延伸至作为环氧化酶基因的内源细胞成分的补充整合入细胞基因组的所述分离核酸分子。选择性地，其中宿主细胞不能正常编码环氧脂肪酸生物合成所需的酶，本发明延伸至作为内源细胞基因组的补充整合入细胞基因组的所述分离核酸分子。

表1

表2

本发明的第二方面提供包含SEQ ID NO：1或3或5或19或20中所示的核苷酸序列或其互补序列的分离的核酸分子或其同系物、类似物或衍生物。

出于命名的目的，SEQ ID NO：1中所示的核苷酸序列来自Crepispalaestina并编码SEQ ID NO：2中所示的混合功能单加氧酶序列或混合功能单加氧酶样序列。如此处所例示的，SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列具有环氧化酶活性，更具体地是△12-环氧化酶活性。

SEQ ID NO：3中所示的核苷酸序列对应于含有高水平斑鸠菊酸来自还阳参属种类而不是C.palaestina的cDNA。SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列对应于SEQ ID NO：3中所提供的还阳参属种类环氧化酶基因的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：5中所示的核苷酸序列对应于使用来自混合功能单加氧酶的保守序列包括本发明还阳参属种类环氧化酶基因序列的扩增引物从Vernonia galamensis得到的扩增DNA。扩增的DNA包含部分环氧化酶基因序列，其中包括能编码作为混合功能单加氧酶的特征的组氨酸-富集基序His-Arg-Asn-His-His的核苷酸序列。SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列对应于SEQ ID NO：5中提供的Vernonia galamensis环氧化酶基因的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：7中所示的核苷酸序列涉及Crepis alpina乙炔化酶基因的部分序列，该序列用作探针以分离包含SEQ ID NO：1中所示核苷酸序列的核酸分子。SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列对应于C.alpina乙炔化酶基团的所述部分序列的推导氨基酸序列。

如本文所用的，术语“乙炔化酶”应理解为是指能催化脂肪酸底物分子中的碳双键转变为碳三键或选择性地能催化脂肪酸分子中碳三键形成的酶。

SEQ ID NO：18中所示的核苷酸序列对应于用于扩增假定的Euphorbia lagascae环氧化酶基因序列的简并扩增引物。在这方面，SEQ ID NO：18中所示的核苷酸残基是那些由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的残基，其中A代表腺嘌呤，C代表胞嘧啶，G代表鸟嘌呤，T代表胸腺嘧啶，Y代表嘧啶残基，R代表嘌呤残基，M代表腺嘌呤或胞嘧啶，K代表鸟嘌呤或胸腺嘧啶，S代表鸟嘌呤或胞嘧啶，W代表腺嘌呤或胸腺嘧啶，H代表鸟嘌呤之外的核苷酸，B代表腺嘌呤之外的核苷酸，V代表胸腺嘧啶之外的核苷酸，D代表胞嘧啶之外的核苷酸以及N代表任何核苷酸残基。

SEQ ID NO：19中所示的核苷酸序列来自Euphorbia lagascae并编码推定的细胞色素P-450依赖的单加氧酶序列或细胞色素P-450依赖的单加氧酶样序列。

SEQ ID NO：20中所示的核苷酸序列来自Euphorbia lagascae并编码推定的细胞色素P-450依赖的单加氧酶序列或细胞色素P-450依赖的单加氧酶样的序列。

本发明明确地延伸至与SEQ ID NO：1，3，5，19或20中任一个所列举的cDNA分子相当的基因组基因。

在最为特别优选的实施方案中，本发明提供包含SEQ ID NO：1，3，5，19或20中所示核苷酸序列的分离的核酸分子或与该核苷酸序列相当的基因组基因或其同系物、类似物或衍生物。

出于此目的，核苷酸序列的“同系物”应理解为是指尽管在该序列中存在一个或多个核苷酸替换、插入、缺失或重排，但与本发明的核酸分子或其互补核苷酸序列基本相同的分离的核酸分子。

此处所提到的核苷酸序列的“类似物”应理解为是指尽管在该分离的核酸分子中存在任何正常不存在的非核苷酸成分如碳水化合物、包括放射性核苷酸的放射性化合物、报告分子(例如但不限于DIG、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶等)，但与本发明的核酸分子或其互补核苷酸序列基本相同的分离的核酸分子。

此处所提到的核苷酸序列的“衍生物”应理解为是指任何含有与所述序列或其部分相似的重要序列的分离的核酸分子。

一般地，本发明核酸分子的同系物、类似物或衍生物通过合成方法制备或选择性从天然存在的来源得到。例如，可对本发明的核苷酸序列进行诱变以产生单个或多个如上所述的核苷酸替换、缺失和/或插入。

在本发明的一个实施方案中，SEQ ID NO：1、3、5、19或20中所示的核苷酸序列或其互补序列的优选同系物、类似物或衍生物编码具免疫活性或酶活性的多肽。

如本文所用的，术语“免疫活性”应理解为是指多肽分子引起哺乳动物中免疫应答，特别是足以产生抗体例如但不限于IgM或IgG分子或含有该抗体分子的全血清的免疫应答的能力。术语“免疫活性”还进一步延伸至多肽引起足以产生单克隆抗体、抗体分子的合成Fab片段、单链抗体分子或其它免疫活性分子的免疫应答的能力。

如本文所用的，术语“酶活性”应理解为是指多肽分子催化酶反应，特别是包含脂肪酸底物分子中碳键的环氧化作用的酶反应的能力。更具体地，而不限制本发明，术语“酶活性”也可以指多肽分子催化脂肪酸底物分子如亚油酸或斑鸠菊酸中△9或△12环氧化作用的能力。

在可选的实施方案中，SEQ ID NO：1或3或5中所示的核苷酸序列或其互补序列的优选同系物、类似物或衍生物包含与其至少20个连续核苷酸、而非编码还阳参属种类乙炔化酶的核苷酸序列有至少65％相同的核苷酸序列。

更优选地，与SEQ ID NO：1或3或5的任一个的相同百分比是至少约85％甚至更优选地，SEQ ID NO：1或3或5的同系物、类似物或衍生物与其至少100或250或500或1000个连续核苷酸有至少约90％、甚至更优选地至少约95％相同。

至少约200个连续核苷酸以上与SEQ ID NO：19或20或其互补序列的相同百分率是至少约75％，更优选地至少约80％，甚至更优选地至少约90％以及进一步更优选地至少约95％，包括至少约99％相同性。至少约400个连续核苷酸以上与SEQ ID NO：19或20有至少65％相同的核苷酸序列也在本发明范围之内。

此处所提到的两个或多个核苷酸或氨基酸序列之间的相同百分率或相似百分率应理解为是指用任何本领域技术人员熟知的标准算法得出的核苷酸和氨基酸序列比较中相同或相似的残基数目。具体地，核苷酸和/或氨基酸序列的相同和相似性可使用利用Needleman和Wunsch(1970)的算法以最大化匹配残基数并最小化序列缺口数的Gap程序来计算。Gap程序是美利坚合众国威斯康星州麦迪逊的University Researeh Park中Computer Genetics Group Inc.的序列和分析软件包的一部分(Devereux等，1984)。

在另一可选的实施方案中，SEQ ID NO：1、3、5、19或20中所示的核苷酸序列或其互补序列的优选同系物、类似物或衍生物在至少低严格条件下与来自上述序列的至少20个连续核苷酸杂交。

更优选地，杂交的严谨性是至少中度严谨性，甚至更优选地至少高度严谨性。

为定义严谨性的水平，本领域技术人员知道可使用几种不同的杂交条件。例如，低严谨性可包含在6×SSS缓冲液、0.1％(W/V)SDS中于28℃进行的杂交和/或洗涤。中度严谨性可包含在2×SSC缓冲液、0.1％(W/V)SDS中于45℃到65℃温度范围内进行的杂交和/或洗涤。高严谨性可包含在0.1×SSC缓冲液、0.1％(W/V)SDS中于至少65℃温度下进行的杂交和/或洗涤。

一般地，严谨性可通过降低SSC缓冲液的浓度和/或增加杂交缓冲液或洗涤缓冲液中SDS的浓度和/或增加杂交和/或洗进行的温度而提高。杂交和洗涤的条件为本领域普通技术人员所熟知。为阐明影响核酸分子间杂交的参数，可以方便地参考Ausubel等(1987)的第2.10.8到2.10.16页，此处引用作为参考。

此处公开的分离的核酸分子可使用本领域技术人员所知的大量方法之一用于分离或鉴定来自其它细胞、组织或器官类型或来自另一物种的细胞、组织或器官的其同系物、类似物或衍生物。

例如，基因组DNA或mRNA或cDNA可在至少低严格杂交条件或相同条件下，与杂交有效量的包含SEQ ID NO：1、3、5、19或20中所示的核苷酸序列或其互补序列的分离的核酸分子或其功能性部分相接触，并且使用检测方法来检测杂交。

检测方法可以是与本发明的分离核酸分子共价连接后能给出可鉴定信号的报告分子(例如诸如³²P或³⁵S的放射性同位素或生物素化分子)。

在可选的方法中，检测方法是聚合酶链式反应(PCR)的任何已知形式。根据此方法，长约15-50个核苷酸的核酸“引物分子”简并库是基于SEQ ID NO：1、3、5、19或20中公开的核苷酸序列或其互补序列设计的。同系物、类似物或衍生物(即“模板分子”)与两个上述引物分子杂交，使得第一个引物与模板分子的一条链的区域杂交同时第二个引物与其互补序列杂交，其中第一和第二个引物不在模板分子相同或重叠的区域内杂交，并且其中每一个引物定位于相对于另一引物在相反链上杂交的位置的5′-到3′-方向。模板分子的特异核酸分子拷贝在本领域技术人员熟知的技术聚合酶链式反应中酶促扩增得到。

引物分子可包含任何天然存在的核苷酸残基(即腺嘌呤、胞嘧啶核苷、鸟嘌呤、胸腺嘧啶核苷)和/或包含能掺入多聚核苷酸分子的肌苷或其功能性类似物或其衍生物。核酸引物分子也可以包含在其它核酸引物分子的水溶液混合物中或是基本上纯的形式。

受检测的序列可以重组形式、在病毒颗粒、噬菌体颗粒、酵母细胞、动物细胞或植物细胞中。优选地，相关的遗传序列来自另一植物种类。

本发明的第三个方面提供编码SEQ ID NO：2或4或6中所示的氨基酸序列或其同系物、类似物或衍生物的分离的核酸分子。

在此处所考虑的一个实施方案中，SEQ ID NO：2、4或6中所示的氨基酸序列的优选同系物、类似物或衍生物是如上所定义的具免疫活性或酶活性的多肽。

在本发明的可选实施方案中，SEQ ID NOs：2、4或6中所示的氨基酸序列的优选同系物、类似物或衍生物包含与其而非还阳参属种类乙炔化酶多肽有至少60％相同的氨基酸序列。更优选地，本发明所包括的SEQ ID NO：2或4或6的同系物、类似物或衍生物与其至少约85％相同，更优选地至少约90％相同，甚至更优选地至少约95％相同，并且进一步更优选地至少约99％-100％相同。

SEQ ID NO：2或4或6的同系物、类似物或衍生物可进一步包含如上所定义的组氨酸-富集区域。甚至更优选地，所述环氧化酶至少包含含有三个或更多如下所示的组氨酸富集区域的氨基酸序列：

(i)His-Glu-Cys-Gly-His-His(SEQ ID NO：15)；

(ii)His-Arg-Asn-His-His(SEQ ID NO：16)；和

(iii)His-Val-Met-His-His(SEQ ID NO：17)

或其同系物、类似物或衍生物。

根据此可选的实施方案所述的本发明不包括来自拟南芥、芥菜、欧洲油菜或大豆等的△12-去饱和酶。

本发明的分离的核酸分子对于发展包含正义分子的遗传构建体有用，其中所述遗传构建体设计为在正常不表达该核酸分子的细胞中表达或在正常表达该核酸分子的细胞中过量表达。

因此，本发明进一步的方面提供包含与启动子序列可操作连接的正义分子的遗传构建体。

如本文所用的，术语“正义分子”应理解为是指编码脂肪酸环氧化酶的分离的核酸分子或与其互补的分离的核酸分子，其中所述核酸分子在所述正义分子通过转染或转化导入宿主细胞时以适于其表达以产生重组多肽的形式提供。

本领域技术人员知道遗传构建体可用于“转染”细胞，在这种情况下它被导入上述细胞中但并不整合入细胞的基因组。选择性地，遗传构建体可用于“转化”细胞，在这种情况下它稳定地整合入该细胞的基因组中。

对应于脂肪酸环氧化酶基因序列或其同系物、类似物或衍生物的正义分子可用任何已知转染或转化所述细胞的方法导入细胞中。其中细胞用本发明的遗传构建体进行转化，完整生物可使用本领域技术人员知晓的任何方法从单个转化细胞中再生。

因此，此处所述的环氧化酶基因可用于发展合成属于与转染或转化的细胞来源的属或种相同的属或种的野生或天然存在的生物不能正常合成的环氧脂肪酸的单个细胞或完整生物，或用于使这样的脂肪酸水平增加高于在这样的野生或天然存在的生物中正常存在的水平。

在可选择的优选实施方案中，本发明的分离的核酸分子在适当的启动子序列的控制下以反义方向或作为核酶或共抑制分子在细胞中表达时，能降低环氧脂肪酸的水平。

共抑制是当一个或多个内源基因的拷贝或一个或多个基本相似基因的拷贝导入细胞中时发生的内源基因表达的减弱。本发明还延伸至使用共抑制来进行如此处所述的环氧化酶基因表达的抑制。

在本发明的上下文中，反义分子是从与正常转录产生能翻译成多肽的“正义”mRNA分子的核基因链互补的核基因链转录而来的RNA分子。反义分子因此与正义mRNA或其部分相互补。尽管本发明反义分子的作用方式并不限于任何特定机制，反义RNA分子具有通过与正义mRNA碱基配对而形成双链mRNA的能力，可阻碍正义mRNA的翻译及随后多肽基因产物的合成。

核酶是包含与靶正义mRNA中两个至少5个连续核苷酸碱基的区域互补的杂交区域的合成RNA分子。并且，核酶具有高度特异性内切核糖核酸酶活性，能自催化切割靶正义mRNA。核酶功能的完整描述由Haseloff和Gerlach(1988)提供并包含在国际专利申请号WO89/05852中。本发明延伸至靶向如此处所述的编码环氧化酶多肽的正义mRNA的核酶，由此与该正义mRNA杂交并切割它，使它不再能翻译合成功能性多肽产物。

根据此实施方案，本发明提供包含能与此处所述的编码环氧化酶的正义mRNA形成氢键连接的复合物以减弱该mRNA翻译的连续核苷酸碱基序列的核酶或反义分子。尽管优选的反义和/或核酶分子与靶分子的至少约10到20个核苷酸杂交，但本发明延伸至能与至少长约50-100个核苷酸碱基杂交的分子或能与全长或基本上全长的环氧化酶mRNA杂交的分子。

应当理解本领域中可以对本发明的反义和/或核酶分子进行包括核苷酸替换等在内的特定修饰，而不破坏该分子抑制环氧化酶基因表达的功效。因此包括任何编码同样产物的该基因的核苷酸序列变体、同系物、类似物或片段均在本发明范围之内，唯一的需要是该核苷酸序列变体在转录时产生能与所述正义mRNA分子杂交的反义和/或核酶分子。

本发明延伸至设计为能促进正义分子表达的遗传构建体，能改变细胞中环氧脂肪酸水平的反义分子、核酶分子或共抑制分子。

在特别优选的实施方案中，能改变细胞中环氧脂肪酸组成的正义分子、反义分子、核酶分子、共抑制分子或基因靶向分子来自包含SEQID NOs：1、3、5、19或20所述的以及更优选地SEQ ID NOs：1或3或5所述的以及进一步更优选地SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列或其互补链、同系物、类似物或衍生物的植物或生物。

本领域技术人员也知道正义、反义、核酶或共-抑制分子的表达需要发明的核酸分子位于与启动子序列可操作的连接处。基于本目的的启动子的选择依赖于所需正义分子的表达水平和/或宿主细胞所来源的物种和/或所需正义分子表达的组织特异性或发育特异性而有所不同。

这里所涉及的“启动子”应理解为其最广泛的含义并包括经典原核基因组基因的转录调控序列，其中有精确转录起始所需的TATA盒，有或没有(CAAT盒序列以及能作为对发育的和/或外部的刺激的应答或以组织特异性的模式改变基因表达的其它调控元件(即上游活化序列、增强子和沉默子)。在本发明的上下文中，术语“启动子”还包括经典原核基因的转录调控序列，在此情况下包括-35盒序列和/或-10盒转录调控序列。

在此上下文中，术语“启动子”还用于描述可引起、活化或增强细胞中所述正义分子表达的合成或融合的分子。优选的启动子可含有一个或多个特异性调控元件的更多拷贝，从而进一步增强正义分子的表达和/或改变该正义分子的空间表达和/或时间表达。例如，铜-应答调控元件可位于异源启动子序列的相邻处，驱动正义分子的表达从而引起那里铜诱导的表达。

将正义、反义、核酶或共抑制分子置于启动子序列可调节的控制之下意味着定位上述分子，从而表达受控于启动子序列。启动子经常但不必需位于它所调节的核酸分子的上游或5′端。并且，包含启动子的调控元件常位于正义、反义、核酶或共-抑制分子或包含相同成分的嵌合基因的转录起始位点的2kb之内。在构建异源启动子/结构基因结合体的过程中，一般优选的是使启动子位于相距基因转录起始点大致与启动子到它在其天然位置所调控的基因，即该启动子所来源的基因的距离相等的位置。如本领域所知道的，该距离的一些改变可在不丢失启动子功能的情况下得到适应。相类似地，优选的关于位于其控制之下的异源基因的调控序列的位置由在其天然位置，即该元件所来源的基因，的元件的定位来确定。并且如本领域所知的，可在上述距离中发生一些改变。

启动子的实施例包括CaMV 35S启动子、NOS启动子、章鱼氨酸合成酶(OCS)启动子、拟南芥SSV基因启动子、napin种子特异性启动子、P₃₂启动子、BK5-T imm启动子、lac启动子、tac启动子、噬菌体λ λ_L或λ_R启动子、CMV启动子(美国专利号为5,168,062的专利)、T₇启动子、lac UV5启动子、SV40早期启动子(美国专利号为5,118，627的专利)、SV40晚期启动子(美国专利号为5,118,627的专利)、腺病毒启动子、杆状病毒P10或多角体蛋白启动子(美国专利号为5，243,041、5,242,687、5,266,317、4,745,051和5,169,784的专利)等等。

根据此实施方案优选的启动子是那些能在酵母、霉菌或植物细胞中发挥功能的启动子。更优选地，根据此实施方案适于使用的启动子能在来自含油酵母、含油霉菌或含油种子作物植物如在

商标下销售的亚麻(以下称作亚麻”)、向日葵、红花、大豆、亚麻籽、芝麻、棉籽、花生、橄榄或油棕等的细胞中发挥功能。

是澳大利亚联邦科学和工业研究组织(CSIRO)注册的商标。

在更优选的实施方案中，启动子可来自编码环氧化酶的基因组克隆，优选地来自此处提及的来自苘蒿属种类、还阳参属种类包括C.palaestina或其它还阳参属种类、Euphorbia lagascae或Vernoniagalamensis的环氧化酶基因的基因组基因相等物。

在更优选的实施方案中，启动子可来自如napin基因等的高表达的种子基因。

本发明的基因结构可进一步包含终止子序列并导入到适当的在其中能表达产生重组多肽基因产物或者核酶或反义分子的宿主细胞。

术语“终止子”是指位于转录单位末端标志转录终止的DNA序列。终止子是包含促进初级转录物3′-末端多聚腺苷酸序列的添加的多聚腺苷酸化信号的3′-非翻译DNA序列。在来自病毒、酵母、霉菌、细菌、昆虫、鸟类、哺乳动物和植物的细胞中活化的终正子为本文所知并加以描述。它们可以细菌、真菌、病毒、动物和/或植物中分离。

特别适合在本发明的遗传构建体中使用的终止子的实施例包括根瘤土壤杆菌的胭脂氨酸合酶(NOS)基因终止子。花椰菜花叶病毒(CaMV)35S基因的终止子、来自玉米的Zein基因终止子、核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚单位(SSU)基因终止子序列、亚三叶草矮化病毒(SCSV)基因序列终止子、任何rho非依赖的大肠杆菌终止子等。

本领域技术人员知道在实施本发明的过程中适于使用的其它启动子序列和终止子序列。这些序列不需任何过多的实验而可轻易使用。

本发明的遗传构建体可进一步包括当该遗传构建体需要作为附加遗传元件(如质粒或粘粒分子)在特异性细胞中得以保持时，在特异性细胞类型如细菌细胞中复制所需要的复制序列起点。

优选的复制起点包括，或不限于复制的fl-起点和colEl起点。

遗传构建体可进一步包含可选择标记基因或在导入该遗传构建体的细胞中的功能性基因。

如本文所用的，术语“可选择标记基因”包括任何给予细胞表型的基因，它在细胞中的表达有利于鉴定和/或筛选转染或转化了本发明遗传构建体或其衍生物的细胞。

这里所考虑的适当的可选择标记基因包括氨苄青霉素抗性(Amp^r)、四环素抗性基因(Tc^r)、细菌卡那霉素抗性基因(Kan^r)、膦丝菌素抗性基因、新霉素磷酸转移酶基因(npt II)、潮霉素抗性基因、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因、氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因和荧光素酶基因等。

本发明进一步的方面提供表达如这里所述的重组环氧化多肽或核酶、反义或共抑制分子或其同系物、类似物或衍生物的转染或转化的细胞、组织、器官或完整生物。

优选地，分离的核酸分子包含在如此处所述的遗传构建体之内。本发明的遗传构建体可通过多种为本领域技术人员所知的技术导入细胞中。所用的技术依赖于针对特别的生物的已知的成功技术而有所不同。

将重组DNA导入细菌细胞、酵母细胞或植物、昆虫、真菌(包括霉菌)、鸟类或哺乳动物组织或细胞的方法包括但不限于用CaCl₂转化及其变化而来的，特别是由Hanahan描述的方法(1983)；直接DNA摄入原生质体(Krens等，1982；Paszkowski等，1984)；PEG介导的摄入原生质体(Armstrong等，1990)；微粒轰击；电穿孔(Fromm等，1985)；DNA的微注射(Crossway等，1986)；组织外植体或细胞的微粒轰击(Christou等，1988；Sanford，1988)；核酸的组织真空渗透；或者对于植物如主要由Au等(1985)、Herrera-Estrella等(1983a、1983b、1985)所描述的T-DNA介导的从土壤杆菌到植物组织的转移。

对于细胞的微粒轰击，是将微粒推进细胞中以产生转化细胞。任何适当的发射细胞转化方法学和设备可用于实施本发明。典型的设备和步骤由Stomp等(美国专利号为5,122,466的专利)和Sanford和Wolf(美国专利号为4,945,050的专利)提供。当使用发射转化步骤时，遗传构建体可包含能在转化细胞中复制的质粒。适合用于该系统的微粒的例子包括1到5μm的金粒。DNA结构可通过任何适当的技术，如通过沉淀置于微粒上。

在特别优选的实施方案中，其中遗传构建体包含正义分子，特别优选的是从它所产生的重组环氧化酶多肽是具酶活性的。

或者，其中细胞来自多细胞生物并且相关技术是有效的，根据本领域所熟知的步骤，完整生物可从转化细胞中再生。

本领域技术人员也知道用于转化、再生和繁殖其它类型细胞如真菌的方法。

在植物中，通过器官发生或胚胎发生而能进行次生克隆繁殖的植物组织，可用本发明的遗传构建体和从它再生的全植物进行转化。所选的特别的组织将依赖于可用于并最适于转化的特别的物种的克隆繁殖系统而变化。典型的靶组织包括叶片、花粉、胚、子叶、下胚轴、雌配子体、愈伤组织、现有分生组织(如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。

如本文所用的，术语“器官发生”意味着茎和根顺序从分生组织中心发育的方法。

如本文所用的，术语“胚胎发生”意味着茎和根从体细胞或配子以协同模式(而非顺序地)一起发育的方法。

再生的转化植物可通过多种方法如通过克隆繁殖或经典的育种技术进行繁殖。例如，第一代(或T₁)转化植物可自交产生纯合的第二代(或T₂)转化体，并且T₂植物进一步通过经典的育种技术进行繁殖。

此处所考虑的再生的转化生物可含有多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的异源嵌合体；克隆转化体(如所有转化细胞含有表达盒)；转化和未转化组织的嫁接(如植物中转化的根的砧木与未转化的接穗嫁接。

本发明进一步的方面提供改变细胞、组织、器官或生物中环氧脂肪酸水平的方法，该方法包含在细胞中表达如这里所述的正义、反义、核酶或共抑制分子一段时间并在足以使那里的环氧脂肪酸水平增强或减弱的条件下进行。

在优选的实施方案中，所述方法包含用正义、反义、核酶或共抑制分子转化细胞、组织、器官的额外的第一步。

如上面所讨论的，分离的核酸分子可包含在遗传构建体中。

根据此实施方案，在其中表达所述正义、反义、核酶或共抑制分子的细胞、器官、组织或生物可来自细菌、酵母、真菌(包括霉菌)、昆虫、植物、鸟类或哺乳动物。

因为重组环氧化酶多肽可在再生的转化体中合成以及离体合成，因此本发明可选的优选实施方案提供在细胞中合成具酶活性的重组环氧化酶多肽的方法，该方法包含以下步骤：

(i)制备包含可操作地置于能引起上述遗传构建体在上述细胞中表达的启动子控制之下的本发明的cDNA或基因组环氧化酶遗传序列并选择地包含表达增强子元件的遗传构建体；

(ii)将上述遗传构建体转化入上述细胞；并且

(iii)选择以高水平表达由遗传序列编码的环氧化酶的转化体。

本发明特别优选的实施方案提供在转基因植物中合成具酶活性的重组环氧化酶多肽的方法，包含以下步骤：

(i)制备包含可操作地置于种子特异性启动子控制之下的本发明的环氧化酶cDNA或基因组遗传序列并选择性地包含表达增强子元件的遗传构建体，其中所述遗传序列也位于转录终止子序列的上游。

(ii)将所述遗传序列转化入上述植物的细胞或组织中；并且

(iii)选择在种子中以高水平表达由遗传序列编码的环氧化酶的转化体。

在更加特别优选的实施方案中，植物是正常产生高水平亚油酸的含油种子物种，例如

亚麻、油籽油菜、向日葵、红花、大豆、亚麻籽、芝麻、棉籽、花生、橄榄或油棕等。

在进一步更加特别优选的实施方案中，植物是正常产生高水平亚油酸的含油种子物种，例如亚麻、向日葵或红花等。

此处所述的具酶活性的重组环氧化酶对于从不饱和脂肪酸底物产生环氧化脂肪酸特别有用。本发明特别考虑在不正常产生特异性环氧化脂肪酸的细胞或再生的转化生物中产生特异性环氧化脂肪酸。

因此，本发明进一步的方面提供在细胞、组织、器官或生物中产生环氧化脂肪酸的方法，该方法包含将表达本发明的具酶活性的重组环氧化酶的细胞、组织、器官或生物与脂肪酸底物分子，优选地是不饱和脂肪酸底物分子培养一段时间并在足以使上述底物的至少一个碳键转变为环氧基团的条件下实施该方法。

在可选实施方案中，试验的方法进一步包含用如此前所述的编码上述重组环氧化酶的核酸分子或其同系物、类似物或衍生物转化或转染细胞、组织、器官或生物的额外的第一步。如上面所讨论的，分离的核酸分子可包含在遗传构建体中。

根据此实施方案，表达试验的环氧化酶的细胞、器官、组织或生物来自细菌、酵母、真菌(包括霉菌)、昆虫、植物、鸟类或哺乳动物。更优选地，细胞、器官、组织或生物来自酵母、植物或真菌，进一步更优选地来自含油的酵母或植物或真菌，或来自不正常表达本发明的重组环氧化酶的含油种子植物。

在此处所考虑的主要经济含油种子植物中，亚麻、向日葵、玉米和红花的高亚油酸基因型是优选的靶植物。大豆和油菜籽是另外的靶植物但对于最大环氧脂肪酸的合成是次适合的，这是因为它们的亚油酸底物水平较低并存在活化的△15-去饱和酶与环氧化酶竞争亚油酸底物。

可选实施方案是用本发明的环氧化酶转化

(＝低亚麻酸亚麻)。

亚麻正常含有70％左右的亚油酸，其中很少一部分(<2％)最终通过△15-去饱和酶转变为亚麻酸(Green，1986)。

此处所考虑的优选的不饱和脂肪酸的底物包括但不限于棕榈油酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸等。

在天然含有高水平斑鸠菊酸的植物物种中，其中的△12-环氧化酶可非常有效地环氧化亚油酸。作为结果，本发明特别考虑在转基因含油种子里在种子油合成的过程中以高水平表达来自Euphorbialagascae、斑鸠菊属种类和还阳参属种类的重组△12-环氧化酶，从而在其中产生高水平的斑鸠菊酸。

因此，根据发明的此实施方案，亚油酸是特别优选的底物。并不排除其它底物。

上述底物分子的产物可由本领域技术人员容易地测定，不需过多实验。根据本发明产生的特别优选的环氧脂肪酸包括12，13-环氧-9-十八碳烯酸(斑鸠菊酸)和12，13-环氧-9，15-十八碳二烯酸等。

在底物分子存在下培养表达重组环氧化酶的细胞、器官、组织或生物的条件有所不同，这至少依赖于细胞、组织、器官或生物对底物的吸收，以及在特别选择的环境中环氧化酶对底物分子的亲和力。最佳条件可由相关领域技术人员轻易测出。

本发明明确延伸至分离的含油环氧脂肪酸和/或如这里所述的产生的分离的环氧脂肪酸本身以及任何由此衍生的产物，例如涂料、树脂、胶、塑料、表面活性剂和润滑剂等。

本发明人进一步显示出行使催化功能如去饱和、乙炔化、羟化和/或环氧化作用的混合功能单加氧酶(MMO)，形成有大量核苷酸和氨基酸序列相似性的基因家族。例如，作用于具有相似链长度和任一碳双键(如果存在)的位置的底物分子的去饱和酶、乙炔化酶、羟化酶和/或环氧化酶与作用于其它底物的酶相比彼此更加密切相关，并可认为是“家族”。

任何基因家因成员间的序列相似性不受限于任何理论或作用模式，在相关底物的性质和修饰反应过程中发生在靶碳键上的反应事件的生化相似性中有其基础，显示了家族中的不同序列可包含有助于实现家族成员的特异性催化特性的催化决定子或至少其功能性部分。

家族的一个实施例是分别催化亚油酸△12位进行去饱和、乙炔化、羟化和/或环氧化作用的去饱和酶、乙炔化酶、羟化酶和/或环氧化酶(以下称之为“C18△12-MMO家族”)。本发明已比较了C18△12-MMO家族成员的核苷酸和氨基酸序列从而测定其在△12位可能包含有其它催化功能的决定子的不同区域(以下称之为“推定的催化决定子”)。

更进一步地，着眼于其它脂肪酸链长度和双键位置，该脂肪酸修饰MMO家族的存在受到考虑。例如，C18△15-去饱和酶认为是属于能在C18脂肪酸底物中△15位上进行去饱和、乙炔化、羟化和/或环氧化作用的相关酶的家族，C18△15-MMO家族。

通过产生这些催化决定子已经过交换(称为“区域交换”)的合成基因，编码一个催化功能的基因可能会转变为编码另一个催化功能的基因。例如，本发明的△12环氧化酶可通过用来自Crepis alpina的△12乙炔化酶的相同区域替换其C-末端和N-末端序列的一部分而转变为△12乙炔化酶。相类似地，相反的区域交换也能够实行。

作为进一步的改进，上述催化功能中的改变可相类似地通过仅针对那些每一个区域之中对决定相关催化功能重要的氨基酸制造特异性改变(如添加、替换或缺失)而发挥效应。

因此，本发明进一步的方面考虑到包含来自如这里所述的环氧化酶基因的核苷酸序列的合成脂肪酸基因，其中该合成脂肪酸基因编码具有环氧化酶或乙炔化酶或羟化酶或去饱和酶活性的多肽，其中该多肽或者包含不同于天然存在的环氧化酶或乙炔化酶或羟化酶或去饱和酶氨基酸序列的氨基酸序列，或者该多肽表现出不同于天然存在的环氧化酶或乙炔化酶或羟化酶或去饱和酶的催化特性或者该多肽包含与SEQ ID NO为2或4或6的序列的部分或该部分的同系物、类似物或衍生物至少有约60％相同的氨基酸序列。

发明中合成的脂肪酸基因优选地来自△12环氧化酶基因。

在一个实施方案中，发明中合成的脂肪酸基因编码融合的多肽，其中SEQ ID NO为2或4或6的序列的N-末端和/或C-末端氨基酸由相同家族不同成员的氨基酸序列按阅读框架替换。

在特别优选的实施方案中，SEQ ID NO为2或4或6的序列的N-末端和/或C-末端氨基酸由图2中所述的乙炔化酶、去饱和酶或羟化酶多肽的相应区域替换。更优选地，来自SEQ ID NO为2或4或6的N-末端和/或C-末端区域的至少约30个氨基酸残基由图2中所述的乙炔化酶、去饱和酶或羟化酶多肽的相应区域替换。

在另一个实施方案中，发明中合成的脂肪酸基因编码融合多肽，其中脂肪酸乙炔化酶或脂肪酸羟化酶或脂肪酸去饱和酶的N-末端和/或C-末端氨基酸由SEQ ID NO为2或4或6的N-末端和/或C-末端区域按阅读框架替换。

在特别优选的实施方案中，脂肪酸乙炔化酶或脂肪酸羟化酶或脂肪酸去饱和酶的N-末端和/或C-末端氨基酸由SEQ ID NO为2或4或6的N-末端和/或C-末端区域按阅读框架替换。进一步更优选地，脂肪酸乙炔化酶或脂肪酸羟化酶或脂肪酸去饱和酶选自图2所提供的表中。

再进一步更优选地，来自脂肪酸乙炔化酶或脂肪酸羟化酶或脂肪酸去饱和酶N-末端和/或C-末端区域的至少约30个氨基酸残基由SEQID NO为2或4或6的N-末端和/或C-末端区域按阅读框架替换。

因此，本发明延伸至这里所涉及的环氧化酶的变体，其中该变体来自此处所述的环氧化酶多肽并表现出可证明的乙炔化酶或羟化酶或去饱和酶活性，并且或者包含不同于天然存在的乙炔化酶或羟化酶或去饱和酶的氨基酸序列，或者表现出不同于天然存在的乙炔化酶或羟化酶或去饱和酶的催化特性，或者包含与SEQ ID NO为2或4或6中任一个至少有60％相同的氨基酸序列。

作为发明的其它方面，此处所述的变体一旦所述合成基因导入适当宿主细胞中并在其中表达，可作为重组多肽或在转基因生物中产生。

此处所述的重组多肽或其同系物、类似物或衍生物也可以是具有免疫活性的分子。

本发明进一步的方面提供能与发明中重组环氧化酶多肽结合的具免疫活性的分子。

优选地，能与免疫活性分子结合的重组环氧化酶多肽包含SEQ IDNO为2、4或6中所述的氨基酸序列或其同系物、类似物或衍生物。

在一个实施方案中，免疫活性分子是抗体分子。抗体分子可以是单克隆或多克隆的。单克隆或多克隆抗体可选自天然存在的针对来自重组基因产物的抗原决定基或肽片段或合成的环氧化酶肽的抗体或者可针对重组环氧化酶或其同系物、类似物或衍生物特异产生。

多克隆和单克隆抗体是通过用适当的基因产物、或抗原决定基、或基因产物的肽片段免疫而获得的。或者，抗体片段可用作如Fab片段。本发明延伸至重组的和合成的抗体以及抗体杂种。“合成抗体”在这里认为是包括抗体的片段和杂种。

这里所考虑的抗体可用于鉴定表达此处所述的实施方案所包括的相关环氧化酶多肽的遗传序列。成功检测相关环氧化酶遗传序列的唯一需要是该遗传序列表达产生至少一个由抗体分子识别的抗原决定基。优选地，为达到获得表达利于检测的目的，相关遗传序列可操作地置于启动子序列如细菌的1ac启动子之后。根据此优选的实施方案，抗体用于检测表达相关环氧化酶的质粒或噬菌体的存在。相应地，抗体分子在表达相关环氧化酶的质粒或噬菌体的纯化中也是有用的。

试验的抗体分子也可用于纯化发明中的重组环氧化酶或其天然存在的相等物或同系物、类似物或衍生物。

本发明参照下列非限定的实施例进一步得到描述。

实施例1 Euphorbia lagascae和还阳参属种类中环氧脂肪酸的特性

来自野生物种Euphorbia lagascae和不同还阳参属物种的种子通过气液层析筛选环氧脂肪酸的存在。

如表3中所示，Euphorbia lagascae在其种子油中含有非常高水平的环氧脂肪酸斑鸠菊酸。来自Crepis palaestina的种子显示出含有占总脂肪酸重量百分比61.4％的斑鸠菊酸和0.71％的乙炔脂肪酸还阳参油酸(表3)。

表3来自Crepis alpina、Crepis palaestina和Euphorbia lagascae的脂中的脂肪酸组成

^a从种子脂类的甲酯衍生物的气液层析测定中的总峰面积的面积百分比计算而来

实施例2 Euphorbia lagascae和Crepis palaestina中亚油酸盐△12-环氧化酶的生化特征鉴定

亚油酸盐的△12-环氧化酶从豆油酸合成斑鸠菊酸。亚油酸盐△12-环氧化酶来自Euphorbia lagascae和Crepis palaestina并定位于微粒体。来自这些物种的酶至少能在从正在发育的种子制备的膜(微粒体的)部分保持活性。

除非表4中另有说明，来自Euphorbia lagascae的膜的制备和它们的环氧化酶活性的分析按Bafor等(1993)描述的进行，与含NADPH的物质进行温育。如GLC和放射性GLC的分离一样，脂提取、分离和甲基化基本按照Kohn等(1994)和Bafor等(1993)所描述的进行。

来自Crepis alpina和Crepis palaestina的膜的制备通过下面所述的步骤获得。Crepis alpina和Crepis palaestina植物在温室中生长并在发育的中期(开花后17-20天)收获种子。子叶从种子包被中挤出并用研钵和研杵在0.1M pH7.2含有0.33M蔗糖、4mM NADH、2mMCoASH、1mg牛血清白蛋白/ml和4,000单位过氧化氢酶/ml的磷酸缓冲液中搅匀。匀浆在18,000xg离心10分钟，产生的上清在150,000xg离心60分钟获得微粒体沉淀。

标准的去饱和酶、乙炔化酶和环氧化酶分析通过来自Crepis物种的微粒体膜在25℃进行，微粒体制备或重新悬浮于新鲜的匀浆缓冲液和占总体积360μl中10nmol的[1-¹⁴C]18∶1 CoA或[1-¹⁴C]18：2-CoA(特异性活性85,000d.p.m./nmol)的0.2mg微粒体蛋白。当NADPH用作共还原剂时，膜重新悬浮于NADH替换为NADPH的匀浆缓冲液中。

对来自Euphorbia lagascae和Crepis palaestina的微粒体亚油酸盐△12-环氧化酶的生化特性进行了测定并且数据通过与来自Crepis alpina的微粒体制备物的油酸盐△12-去饱和酶和亚油酸盐△12-乙炔化酶的生化特性相比较而获得(表4)。

如表4中所示，Crepis palaestina的亚油酸盐△12-环氧化酶表现出与来自Crepis alpina的亚油酸盐△12-乙炔化酶和油酸盐△12-去饱和酶相似的生化特征，就三种酶而言它们都需要O₂，无论NAOH或NAPDH作为共还原剂都同样发挥作用，可被氰化物而不被一氧化碳抑制。并且，这些酶都不受抗细胞色素P450还原酶的单克隆抗体的抑制。

表4的数据显示Crepis palaestina的亚油酸盐△12-环氧化酶与Crepis alpina的微粒体油酸盐△12-去饱和酶和亚油酸盐△12-乙炔化酶属于同一组的酶。

相反，Euphorbia lagascae的亚油酸盐△12-环氧化酶需要NADPH作为共还原剂，不受氰化物抑制，但受一氧化碳的抑制(表4)。并且，本发明人发现Euphorbia lagascae的亚油酸盐△12-环氧化酶受到抗细胞色素P450还原酶抗体的抑制。这些数据显示出Euphorbialagascae亚油酸盐△12-环氧化酶属于细胞色素P450组的蛋白并因此与Crepis palaestina的亚油酸盐△12-环氧化酶在生化上不相关。

表4来自还阳参属种类和Euphorbia lagascae的环氧化酶、乙炔化酶和去饱和酶的生化特性的比较

实施例3 克隆Crepis palaestina环氧化酶基因的策略

Crepis palaestina环氧化酶基因的克隆依赖于前面实施例中所描述的C.palaestina和C.alpina的酶的特性。

具体地，多聚腺苷酸+RNA用QuickPrep Micro mRNA纯化试剂盒(Pharmacia生物技术公司)从Crepis palaestina正在发育的种子分离并用于合成寡脱氧胸苷酸-引发的双链cDNA。将双链cDNA与EcoRI/NotI多接头(Pharmacia生物技术公司)连接并用ZAP-cDNAGipapack克隆试剂盒(Stratagene公司)构建cDNA文库。

用标准方法，从来自Crepis alpina正在发育的种子的RNA制备单链cDNA。使用来自植物混合功能单加氧酶的推测氨基酸序列的引物扩增单链cDNA，获得称为D12V(SEQ ID NO：7)的PCR片段。

然后D12V片段经随机标记并如制造商所指定的用标准杂交条件在Amersham公司的HybondN+膜过滤器上进行Crepis palaestinacDNA文库筛选。此方法导致称为Cpal2的重组噬菌体的纯化。

Cpal2 cDNA的核苷酸序列得到测定并在SEQ ID NO：1中列出。

Cpal2 cDNA看来是全长。包含Cpal2 cDNA的表达载体的图示在图1中提供。这里所述的遗传构建体设计用来导入植物材料中以产生表达试验的环氧化酶的转基因植物。本领域技术人员知道不需过多实验，可产生相似的表达载体并通过用另一个结构基因序列代替Cpal2cDNA将其用于产生表达任何本发明的遗传序列的转基因植物。

如图2中所示，Crep1 cDNA的核苷酸序列编码至少与C.alpina的乙炔化酶在氨基酸水平密切相关的多肽(Bafor等1997；国际专利申请号PCT/SE97/00247)。

对来自pCpal2的1.4Kb插入片段进行测序(SEQ ID NO.1)并表明包含编码374个氨基酸长的多肽的开放阅读框。由Cpal2推断的氨基酸序列显示出与来自Crepis alpina的△12-乙炔化酶有81％相同性和92％相似性并与植物微粒体△12-去饱和酶蛋白有大约60％相同性和80％相似性(图2)。然而，由Cpal2编码的多肽与非-环氧化酶的酶相比在氨基酸序列上包含显著差异。特别地，与所有微粒体△12去饱和酶相比Cpal2在5′末端区域缺失6个相邻的氨基酸，并且与Crep1△12乙炔化酶相比在3′末端区域缺失两个相邻的氨基酸(图2)。

尽管膜结合的脂肪酸去饱和酶基因显示出有限的序列同源性，但它们全都含有如下所示的保守的组氨酸富集基序的三个区域：

(i)His-(Xaa)_3-4-His；

(ii)His-(Xaa)_2-3-His-His；和

(iii)His-(Xaa)_2-3-His-His

其中His代表组氨酸，Xaa代表如这里表1中所述的任何天然存在的氨基酸残基，整个(Xaa)_3-4是指包含三或四个Xaa重复的氨基酸序列，以及整个(Xaa)_2-3是指包含两或三个Xaa重复的氨基酸序列。这些组氨酸富集区域认为是酶的活性中心的一部分(Shanklin等，1994)。

由Cpal2 cDNA编码的氨基酸序列包含三个与△12去饱和酶组氨酸富集基序相似，但不相同的组氨酸富集基序。这些数据显示出Cpal2cDNA编码属于混合功能单加氧酶组的酶。

上面实施例中给出的脂肪酸的分析显示出斑鸠菊酸至少存在于Crepis palaestina的种子中。此酶事实上可能仅存在于C.palaestina的种子中。用Cpal2 cDNA克隆的3′非翻译区作为杂交探针与来自C.palaestina发育的种子和叶的mRNA进行Northern印迹，以检测Cpal2基因的表达。如图3中所示，Cpal2基因在发育的种子中高表达但在叶中检测不到表达。这些数据与C.palaestina亚油酸盐△12-环氧化酶在这些组织中的酶活性概况是一致的。

实施例4 克隆Euphorbia lagascae环氧化酶基因的策略

Euphorbia lagascae环氧化酶基因的克隆依赖于上面实施例中所描述的E.lagascae的酶的特性。

在一个用来克隆Euphorbia lagascae环氧化酶基因的方法中，RNA从Euphorbia lagascae未成熟的胚中在有活性的斑鸠菊酸合成的时期进行收集并用于构建cDNA文库。cDNA文库如前面实施例中所述构建于Lambda Zap II载体(Stratagene公司)上，不同的是cDNA插入片段以直接的方式克隆到包埋于λ载体的质粒载体的EcoRI/XhoI位点。

图4中所述的(SEQ ID NO：18)简并PCR引物经合成并用于扩增来自Euphorbia lagascae cDNA文库的编码P450酶序列的核苷酸序列。为进行PCR扩增反应，用酚∶氯仿[1∶1(v/v]提取cDNA文库的100μ1等分试样并加工体积的乙醇沉淀DNA再将其最终重新悬浮于100μl水中。重新悬浮DNA的等分试样(1μl)用作PCR扩增反应的模板。PCR反应在包含200μM每一种dNTP、10pmol简并引物、1pmol T₇聚合酶启动子引物和0.4单位TaqI聚合酶的10μl TaqI聚合酶缓冲液中进行。

扩增条件是94℃ 2分钟；然后5个循环，每个循环包含48℃ 1分钟接着72℃ 2分钟然后93℃ 30秒；接下来进行28个循环，每个循环包含55℃ 30秒接着72℃ 90秒然后93℃ 30秒；以及最后一个循环包含55℃ 30秒接着72℃ 10分钟然后于25℃反应1分钟。

PCR产物用EcoRI和XhoI纯化和消化，然后亚克隆到用于测序特性的Bluescript载体中。发现PCR克隆中的一个编码P450序列并将其用作探针来分离全长cDNA克隆。该核苷酸序列在SEQ ID NO：19中陈述。SEQ ID NO：19与P450基因2C家族的其它成员具有相似性。特别地，应用BLAST程序SEQ ID NO：19表现出与人和鼠和花生四烯环氧化酶序列具有平均40％的相同性。

并且，SEQ ID NO：19的转录本显示出在Euphorbia lagascae的种子中表达而不在根和叶中表达(图5B)。在Vernoniaga lamensis发育的种子中检测在SEQ ID NO：19的转录本但在柏大戟或亚麻，两个不产生环氧脂肪酸的物种中未检测到该转录本(图5A和5B)。

在另一个用于克隆Euphorbia lagascae环氧化酶基因的方法中，减数杂交策略用来分离在产生高水平环氧脂肪酸的生物中特异性表达的基因。

特别地，图6中所描述的减数杂交方法用来分离在产生高水平的环氧脂肪酸，斑鸠菊酸的Euphorbia lagascae中特异性表达(图1)，而在不产生斑鸠菊酸的密切相关的物种柏大戟中不表达的环氧化酶基因。

相应地，从Euphorbia lagascae发育的胚中在mRNA活跃合成斑鸠菊酸的阶段分离mRNA并将其用于产生所谓的“试验者(tester)”cDNA。并且，从柏大戟发育的胚中(在与E.lagascae相似的发育阶段)分离mRNA并将其用于产生所谓的“驱动者(driver)”cDNA。

减数杂交步骤导向富含专门在Euphorbia lagascae中表达的序列的文库。来自此文库的克隆经测序并在数据库中与其它P450序列的相似性的基础上鉴定出至少两个序列编码P450蛋白。这两个P450 PCR克隆用作探针来分离来自前面所提及的cDNA文库的相应全长cDNA克隆。

包含SEQ ID NO：20所述的核苷酸序列的分离的P450 cDNA之一看来似乎在Euphorbia lagascae的组织中表达并且在柏大戟或亚麻，两个不产生环氧脂肪酸的物种的种子组织中未检测到同源转录本。由SEQ ID NO：20推断的氨基酸序列显示出cDNA克隆是全长的并编码P450酶。这些数据显示出SEQ ID NO：20所举例的cDNA可编码环氧化酶，如能将亚油酸转变为斑鸠菊酸的亚油酸盐△12-环氧化酶。

实施例5 环氧化酶活性的证明

作为本发明例证的cDNA克隆编码环氧化酶活性的确证通过用每一个单独的候选克隆转化不产生环氧脂肪酸，特别是斑鸠菊酸的拟南芥，并检测转化组织中原先所不能产生的环氧化脂肪酸的存在，或可能通过内源环氧化物水解酶由环氧化脂肪酸的代谢形成的羟基脂肪酸的存在来获得(Blee和Schuber，1990)。

将包含SEQ ID NO：1的环氧化酶cDNA克隆到图8中所述的双元载体结构中。简单地说，cDNA通过用EcoRI消化pCpal2并用T₄ DNA聚合酶末端补平限制性片段从pCpal2质粒(图1)亚克隆到双元质粒中。双元质粒(图8)用BamHI进行线性化并也用T4DNA聚化酶进行末端补平。为进行末端补平反应，将1μg cDNA插入片段或线性化的双元载体DNA重新悬浮于补充以100mM每一种dNTP和0.1mg/ml BSA以及3单位T₄ DNA聚合酶的50μl T₄ DNA聚合酶缓冲液(33mM Tris-乙酸pH7.9，66mM乙酸钾，10mM乙酸镁和5mM DTT)中，并在37℃温育6分钟。反应通过在75℃加热10分钟而终止。用T₄ DNA连接酶和Promega公司推荐的常规连接条件连接平端cDNA和双元载体DNA。选择那些SEQID NO：1序列以正义方向插入到napin启动子后面并因此能表达环氧化酶多肽的克隆。包含以正义方向、可操作地处于载短的napin启动子控制之下的SEQ ID NO：1的双元质粒在图9中以图例表示。

图9中所述的双元质粒用电穿孔转化到土壤杆菌菌株AGLI中并用来转化拟南芥。转基因的拟南芥植物按照Valvekens等(1988)和Dolferus等(1994)所述的方法获得。

使转基因植物和未转化的(即对照)植物生长到成熟。用常规技术分析每一植物成熟种子的脂肪酸组成。建成初级转化体(T₀)植物并从每一植物中收获T₁种子以及通过气相层析分析脂肪酸组成。12株T₀植物显示出在其T₁种子脂中含有浓度在总脂肪酸中为0.9％到15.8％的斑鸠菊酸，而未转化的对照植物不含斑鸠菊酸(表5)。

最高表达的植物株系是Cpal-17，其GLC洗脱分布图(来自填充粒和毛细管柱分析)在图10中表示。未转化的对照来自填充柱的GLC洗脱分布图也在图10中表示。

表5表达SEQ ID NO：1的转基因拟南芥株系中的斑鸠菊酸水平

T<sub>0</sub>植物号	斑鸠菊酸(总种子脂肪酸的重量百分比％)
T<sub>0</sub>植物号	斑鸠菊酸(总种子脂肪酸的重量百分比％)	Cpal-4	1.4
Cpal-5	1.1	Cpal-4	1.4
Cpal-5	1.1	Cpal-8	2.7
Cpal-9	0.9	Cpal-8	2.7
Cpal-9	0.9	Cpal-13	0.9
Cpal-15	1.1	Cpal-13	0.9
Cpal-15	1.1	Cpal-17	15.8
Cpal-21	1.3	Cpal-17	15.8
Cpal-21	1.3	Cpal-23	1.4
Cpal-24	1.0	Cpal-23	1.4
Cpal-24	1.0	Cpal-25	1.2
Cpal-26	1.1	Cpal-25	1.2
Cpal-26	1.1	未转化的对照株系	0.0

选择性地或者另外，此处所述的每一个推定的脂肪酸环氧化酶序列在napin种子特异性启动子控制之下转化进入Linumusitatissimum(亚麻)和拟南芥中。检测转基因的亚麻和拟南芥植物发育的种子的油中环氧脂肪酸的存在。以往的工作显示出如果环氧脂肪酸用来供给发育的亚麻胚，它们就形成三酰甘油(实施例10)。

或者，酵母也可用发明中的环氧化酶克隆进行转化并分析其环氧脂肪酸的产生。

实施例6 初级T₀转基因植物上结出的T₁拟南芥种子中环氧脂肪酸的质谱分析确定

从Cpal2转化的拟南芥植物(实施例5)的T₁种子的种子脂类制备的甲基酯的气相层析与未转化的对照相比显示出存在两个附加的脂肪酸。这些化合物中的第一个具有与斑鸠菊酸标准相同的滞留时间。第二个化合物具有较长的滞留时间并推定为12，13-环氧-9，15-十八碳二烯酸，即通过内源的拟南芥的△15-去饱和酶在△15位的去饱和作用形成的斑鸠菊酸预期的衍生物。

两个峰的确切性质的确定通过从来自Cpal2-转化的植物的环氧脂肪酸部分制备的二醇的质谱分析获得。二醇可进一步转变为三甲基硅烷乙醚并通过融合硅毛细管柱上的GC-MS DB23(Howlett-Packard5890II GC耦联到Hewlett Packard 5989MS上，在70eV15电子冲击下工作)进行分析。总离子层析谱显示出如下两个峰：

(i)第一个洗脱峰具有突出的质量为73、172、275和299的离子，显示出环氧基团位于C18脂肪酸的C-12位以及双键位于环氧基团和羧基末端之间。该质量谱与从纯的斑鸠菊酸(12，13-环氧-9-十八碳烯酸)制备的二醇的三甲基硅烷乙醚衍生物的谱相一致；以及

(ii)第二个洗脱峰具有突出的质量为73、171、273和299的离子，显示出两个双键和位于C18脂肪酸的C-12位的环氧基团的存在，与12，13-环氧-9，15-十八碳二烯酸的质谱相一致。

实施例7 Cpal2转基因拟南芥植物的脂肪酸分析

使来自转化的拟南芥植物在napin启动子控制下表达Cpal2cDNA克隆的T₁种子发芽并从五个T₀株系(表5中株系号码为4、8、13、17和21的株系)建立T₁植物。从每一株T₁植物中收获T₂种子并分析脂肪酸组成。由斑鸠菊酸的存在按预期分离转化体4、8、13和21(表5)的后代，那些植物含有的斑鸠菊酸最高达到3.1％(表6)。

所有含有斑鸠菊酸(即表6中的环氧18∶1)的T₁植物也含有12，13-环氧-9，15-十八碳二烯酸(即表6中的环氧18∶2；也见于图11)，显示出由Cpal2环氧化酶合成的一些斑鸠菊酸继续由内源的△15-去饱和酶进行去饱和作用。

表6来自拟南芥的五个初级cpal2转化体的T₁植物所结的自交种子的脂肪酸组成

实施例8 Cpal2转基因Linela植物的脂肪酸分析

上面所描述的包含Cpal2 cDNA克隆(图9)的双元质粒结构用电穿孔转化到根瘤土壤杆菌菌株AGL1中。转化的根瘤土壤杆菌通过Lawrence等(1989)描述的方法用于感染亚麻Eyre变种外植体，除了将MS培养基用作基本培养基以诱导再生茎材料上根的生成。

两个命名为AP20和AP21的初级Linola转化体(T₀植物)用直接针对于Cpal2基因的引物通过PCR以及通过显示这些植物是卡那霉素抗性的证实它们是转基因的。用常规技术单独分析来自每一株植物的十枚T₁种子的脂肪酸组成。

如表7中所示，来自AP20的种子分为三组，其中三枚种子不含斑鸠菊酸，二枚含超过0.7％的斑鸠菊酸，以及五枚含有中等水平(0.13-0.47％)的斑鸠菊酸。

相类似地，来自AP21的种子也分为三组，其中五枚种子不含斑鸠菊酸，二枚含有超过0.25％的斑鸠菊酸以及三枚含有中等水平(0.09-0.14％)的斑鸠菊酸(表8)。

因此，总共获得12枚含有斑鸠菊酸的种子。十二枚AP20和AP21种子中的八枚含有斑鸠菊酸也含有12，13-环氧-9，15-十八碳二烯酸。

表7来自Linola Cpal2初级转化体AP20的10枚单独T₁种子的脂肪酸组成

表8来自Linola Cpal2初级转化体AP21的10枚单独T₁种子的脂肪酸组成

四株T₁植物来自卡那霉素抗性的AP20幼苗。接下来所有四株植物显示出在其T₂种子中产生斑鸠菊酸(表9)。这些T₂种子中的18∶2环氧脂肪酸水平未进行分析。

表9来自AP20的Linola Cpal2 T₁后代的T₂种子的脂肪酸组成

na＝未分析

实施例9 在转基因生物中合成环氧脂肪酸

产生富含斑鸠菊酸的油通过将此处所述的环氧化酶基因，特别是SEQ ID NO：1转化到前面实施例中所描述的拟南芥中实现。如表5中所示，表达SEQ ID NO：1的转基因的拟南芥株系在其种子中产生相对于其它脂肪酸的高水平的斑鸠菊酸。特别地，在一个转基因株系中，产生的斑鸠菊酸多达总的种子脂肪酸含量的15.2％(w/w)。

富含斑鸠菊酸的油的产生还可通过将此处所述的SEQ ID NO：1、3、5、19或20中任一环氧化酶基因并优选地是SEQ ID NO：1或3或5中任意一项转化到任何一般有很高水平的亚油酸以及最小的能利用亚油酸作为底物的竞争性酶活性的油富集生物中而实现。发明中的遗传序列可操作地置于在含油种子中产生高水平表达的启动子的控制之下，例如napin种子特异性启动子。

在另一个转化拟南芥的方法中，用发明中的环氧化酶转化亚麻、向日葵、玉米或红花的高亚油酸基因型。当环氧化酶基因以高水平表达时，高水平的斑鸠菊酸通过转基因植物在种子油合成过程中产生。

或者，用发明中的环氧化酶转化

(＝低亚油酸)亚麻。当环氧化酶基因以高水平表达时，高水平的斑鸠菊酸通过转基因的亚麻植物在种子油合成过程中产生。

并且，本发明人已显示出给予发育的亚麻种子的标记的斑鸠菊酸没有降解但在三酰甘油分子的全部三个位置整合到贮存的脂中(见实施例10)。与这些数据相一致的是，通过导入的环氧化酶合成的高水平的斑鸠菊酸易于贮存于此物种的种子油三酰甘油中。

实施例10 油酸和斑鸠菊酸整合到发育的亚麻籽子叶的脂中

于种子发育的中期(开花后20天)脱离的发育的亚麻籽子叶(每次培养中的6对，重复培养)与10nmol[1-¹⁴C]斑鸠菊酸(特异性活性3000d.p.m./nmol)或[1-¹⁴C]油酸(特异性活性5000d.p.m./nmol)的铵盐在0.2ml pH7.2的磷酸盐缓冲液中于30℃温育30分钟。然后将子叶用1ml蒸馏水洗三次并根据Bligh和Dyer(1959)的方法在UltraTurrax中立即提取或在提取前将其在0.5ml pH7.2的磷酸盐缓冲液中继续温育90或270分钟。将氯仿相中脂的等分试样进行甲基化并在n-己烷/二乙基乙醚/乙酸(85∶15∶1)中的硅胶TLC板中分离。每一样品氯仿相中的剩余的脂用在两个分离的硅胶TLC板上并且将板置于氯仿/甲醇/乙酸/水(85∶15∶10∶3.5按体积)中用于极性脂的分离以及置于n-己烷/二乙基乙醚/乙酸(60∶40∶1.5)中用于中性脂的分离。去除对应真正标准迁移的脂面积并通过液体闪烁计数测定每一个脂的放射性。

氯仿相中¹⁴C-标记的回收在图12中描述。多少超过一半的加入的来自[¹⁴C]油酸和[¹⁴C]斑鸠菊酸的放射性由子叶吸收并在脉冲标记30分钟后作为亲脂性底物回收。这个量在进一步与两个底物温育270分钟的过程中实际上保持不变。脂的放射性甲基酯的分离显示出大部分来自[¹⁴C]斑鸠菊酸施放实验的放射性(92％)存在于与甲基-斑鸠菊酸盐有相同迁移的化合物中并说明环氧基团在整个270分钟的温育过程中于亚麻籽子叶里保持完整。

30分钟后来自[¹⁴C]斑鸠菊酸施放存在于氯仿相中的约28％的活性存在于磷脂酰胆碱中并且在温育300分钟时放射性下降到只有5％(图13)。

30分钟后来自[¹⁴C]油酸施放存在于氯仿相中的约22％的活性存在于磷脂酰胆碱中并且在温育300分钟时放射性下降到大约11％(图13)。

30分钟后来自[¹⁴C]斑鸠菊酸施放的存在于氯仿相中的约32％的活性存在于三酰甘油中并且在温育300分钟时放射性上升到超过60％(图14)。在[¹⁴C]斑鸠菊酸施放实验中双酰甘油含有大约24％的活性并且这个量在温育期间保持不变。

30分钟后来自[¹⁴C]油酸施放的存在于氯仿相中的约5％的活性存在于三酰甘油中并且在温育300分钟时放射性上升到18％(图18)。在[¹⁴C]油酸施放实验的30分钟之后双酰甘油含有大约18％的活性并且这个量在温育期间保持不变。

上面的实验显示出亚麻籽子叶不在任何程度上代谢斑鸠菊酸的环氧基团。它进一步显示出亚麻籽子叶具有能从膜脂上有效去除斑鸠菊酸并将其整合到三酰甘油中的代谢。

实施例11 从其它含环氧酸的物种克隆△12-环氧化酶基因

Cpal2 △12-环氧化酶基因的同系物通过克隆在发育种子中高表达的△12混合功能单加氧酶基因家族成员并将其氨基酸序列与已知的△12-去饱和酶和△12-环氧化酶序列相比较而从其它富含环氧脂肪酸的物种中获得。这些基因或者通过用基于Cpal2基因(SEQ ID NO：1)或D12V片段(SEQ ID NO：7)的引物筛选发育种子的cDNA文库，或者通过用针对这里所述的植物△12混合功能单加氧酶的保守序列设计的引物扩增PCR片段而进行克隆。推定的△12-环氧化酶序列与已知的△12-去饱和酶序列相比表现出针对这里所包括的△12-环氧化酶序列有更大的总体序列相同性。

在此方法的一个实施例中，全长的△12-环氧化酶样的序列从在种子油中含有高水平斑鸠菊酸的未鉴定的还阳参属种类中获得并已知不是Crepis palaestina。Poly(A)+RNA用QuickPrep Micro mRNA纯化试剂盒(Pharmacia生物技术公司)从此还阳参属种类发育的种子中分离并用于合成Oligo d(T)-引物双链cDNA。然后将因此而获得的双链cDNA连接到EcoRI/NotI接头上(Pharmacia生物技术公司)并用ZAP-cDNA Gigapack克隆试剂盒(Stratagene公司)构建cDNA文库。

用来自Crepis alpina由制造商所规定的随机标记的DRV片段(SEQ ID NO：7)，用常规杂交条件筛选Hybond N+膜过滤器(Amersham公司)上的cDNA文库。这导致了命名为CrepX的重组噬菌体的纯化。

CrepX cDNA的核苷酸序列经测定并在SEQ ID NO：3中陈述。由CrepX(SEQ ID NO：4)推断的氨基酸序列包含与Cpal2 △12环氧化酶序列有97％相同性的374个氨基酸的蛋白，但与拟南芥L26296的△12-去饱和酶序列仅有57％的相同性。这明确证明了在另一个有高斑鸠菊酸含量的还阳参属种类中基因的存在，该基因与Cpal2 △12-环氧化酶基因高度同源并明确地不是去饱和酶基因。

在此方法的第二个实施例中，从含有斑鸠菊酸的物种Vernoniagalamensis中获得部分△12-环氧化酶样的序列。由从V.galamensis发育的种子中分离的总RNA用常规步骤制备第一链cDNA模板。

用来自由植物混合功能单加氧酶推断的氨基酸序列的引物通过扩增单链cDNA获得命名为Vgall的PCR片段(长度为550个核苷酸)。扩增DNA的核苷酸序列用常规步骤测定并在SEQ ID NO：5中陈述。

由Vgall PCR片段(SEQ ID NO：6)推断的氨基酸序列与Cpal2△12-环氧化酶和拟南芥L26296的△12-去饱和酶的全序列的比较证明了扩增的Vgall序列编码与Cpal2多肽的跨越103-285氨基酸残基的区域相一致的氨基酸序列。在此区域内，Vgall序列与Cpal2 △l2-环氧化酶序列的氨基酸相同性(67％)比与拟南芥△12-去饱和酶序列的相同性(60％)更大，说明扩增的DNA与环氧化酶比与去饱和酶序列更为一致。

本领域技术人员知道本发明提出非这里所特定描述的变化和修饰。应当理解本发明包括所有这样的变化和修饰。发明还包括所有单独或联合地在本说明书中涉及或说明的这样的步骤、特征、组合物和化合物，以及任何和所有上述步骤或特征的任意二者或更多的结合。

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30.Valvekens等(1988)美国国家科学院院报85，5536-5540.

序列表

(1)基本信息：

(i)申请人：Commonwealth Scientific and Industrial ResearchOrganisation AND Sten Stymne

(ii)发明名称：植物脂肪酸环氧化酶及其用途

(iii)序列数：20

(iv)联系地址：

(A)名称：Davis Collison Cave

(B)街道：1 Little Collins street

(C)城市：Melbourne

(D)州名：Victoria

(E)国家：澳大利亚

(F)邮政编号：3000

(v)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release #1.0，版本#1.25

(vi)目前申请资料：

(A)申请号：

(B)递交日：

(vii)在先申请资料：

(A)申请号：AU PO6223

(B)递交日：1997年4月15日

(vii)在先申请资料：

(A)申请号：AU PO6226

(B)递交日：1997年4月15日

(vii)在先申请资料：

(A)申请号：US 60/043706

(B)递交日：1997年4月16日

(vii)在先申请资料：

(A)申请号：US 60/050403

(B)递交日：1997年6月20日

(viii)律师/代理人信息：

(A)名称：Hughes DR，E John L

(C)参考/著录号：MRO/ELH/JMC

(ix)电信信息：

(A)电话：+61 3 9254 2777

(B)传真：+61 3 9254 2770

(C)电传：AA 31787

(2)关于SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征

(A)长度：1358个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：DNA

(ix)特征：

(A)名称/关键：CDS

(B)位置：30..1151

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

(2)关于SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征

(A)长度：374个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

(2)关于SEQ ID NO：3的信息：

(i)序列特征

(A)长度：1312个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：cDNA

(vi)原始来源：

(A)生物：还阳参属种类

(ix)特征：

(A)名称/关键：CDS

(B)位置：26..1147

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

(2)关于SEQ ID NO：4的信息：

(A)长度：374个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：

(2)关于SEQ ID NO：5的信息：

(i)序列特征

(A)长度：550个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：cDNA

(vi)原始来源：

(A)生物：Vernonia galamensis

(ix)特征：

(A)名称/关键：CDS

(B)位置：1..549

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：

(2)关于SEQ ID NO：6的信息：

(i)序列特征

(A)长度：183个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：

(2)关于SEQ ID NO：7的信息：

(i)序列特征

(A)长度：177个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：cDNA

(vi)原始来源：

(A)生物：Crepis alpina

(ix)特征：

(A)名称/关键：CDS

(B)位置：1..177

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：

(2)关于SEQ ID NO：8的信息：

(i)序列特征

(A)长度：59个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：

(2)关于SEQ ID NO：9的信息：

(i)序列特征

(A)长度：383个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)原始来源：

(A)生物：拟南芥

(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：

(2)关于SEQ ID NO：10的信息：

(i)序列特征

(A)长度：384个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)原始来源：

(A)生物：芥菜

(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：

(2)关于SEQ ID NO：11的信息：

(i)序列特征

(A)长度：383个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)原始来源：

(A)生物：大豆

(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：

(2)关于SEQ ID NO：12的信息：

(i)序列特征

(A)长度：383个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)原始来源：

(A)生物：Solanum commersonii

(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：

(2)关于SEQ ID NO：13的信息：

(i)序列特征

(A)长度：387个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)原始来源：

(A)生物：大豆

(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：

(2)关于SEQ ID NO：14的信息：

(i)序列特征

(A)长度：387个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：蛋白质

(vi)原始来源：

(A)生物：Ricinus communis

(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：

(2)关于SEQ ID NO：15的信息：

(i)序列特征

(A)长度：6个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：内部的

(xi)序列描述：SEQ ID NO：i5：

(2)关于SEQ ID NO：16的信息：

(i)序列特征

(A)长度：5个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：内部的

(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：

(2)关于SEQ ID NO：17的信息：

(i)序列特征

(A)长度：5个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：内部的

(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：

(2)关于SEQ ID NO：18的信息：

(i)序列特征

(A)长度：29个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：

(2)关于SEQ ID NO：19的信息

(i)序列特征

(A)长度：1610个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：cDNA

(vi)原始来源：

(A)生物：Euphorbia lagascae

(ix)特征：

(A)名称/关键：CDS

(B)位置：8..1546

(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：

(2)关于SEQ ID NO：20的信息

(i)序列特征

(A)长度：1698个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型

(ii)分子类型：DNA

(ix)特征：

(A)名称/关键：CDS

(B)位置：8..1504

(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：

Claims

1.分离的核酸分子，其编码环氧化酶或互补于编码环氧化酶的分离的核酸分子，其中所述环氧化酶的氨基酸序列是SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的分离核酸分子，其来自Crepis palaestina。

3.根据权利要求1所述的分离核酸分子，其核苷酸序列是SEQ IDNO：1中所示的核苷酸序列。

4.遗传构建体，包含与启动子序列可操作连接的根据权利要求1所述的分离核酸分子。

5.在细胞中生成重组具酶活性的环氧化酶多肽的方法，该方法包含在足以使所述核酸分子产生表达的条件下培养包含根据权利要求1所述的分离核酸分子的细胞一段时间。

6.根据权利要求5所述的方法，包括用所述分离的核酸分子转化细胞的额外的第一步。

7.在细胞中生成重组具酶活性的环氧化酶多肽的方法，该方法包含以下步骤：

(i)制备包含可操作地置于能引起所述核酸分子在所述细胞中表达的启动子控制之下的根据权利要求1所述的分离核酸分子的遗传构建体；

(ii)将上述遗传构建体转化入所述细胞中；并且

(iii)选择以高水平表达由所述核酸分子编码的功能性环氧化酶的转化体。

8.权利要求7的方法，其中所述的遗传构建体进一步包含表达增强元件。

9.在转基因植物中产生重组具酶活性的环氧化酶多肽的方法，包含以下步骤：

(i)制备包含可操作地置于种子特异性启动子控制之下的根据权利要求1所述的分离的核酸分子的遗传构建体，其中所述核酸分子也置于转录终止子序列的上游；

(ii)将上述遗传构建体转化入所述植物的细胞或组织中；并且

(iii)选择在种子中以高水平表达由所述核酸分子编码的功能性环氧化酶的转化体。

10.权利要求9的方法，其中所述的遗传构建体进一步包含表达增强元件。

11.根据权利要求9所述的方法，其中植物是通常产生高水平亚油酸的油料种子物种。

12.根据权利要求9所述的方法，其中植物选自

亚麻、油籽油菜、向日葵、红花、大豆、亚麻籽、芝麻、棉籽、花生、橄榄或油棕。

13.按照根据权利要求5到12中任意一项所述的方法制备的重组脂肪酸环氧化酶多肽。

14.重组脂肪酸环氧化酶多肽，其由权利要求1中的核酸分子所编码。

15.在细胞中产生环氧化脂肪酸的方法，该方法包含将表达根据权利要求13所述的重组多肽的细胞与脂肪酸底物一起在足以使上述底物的至少一个碳键转变为环氧基团的条件下培养一段时间。

16.根据权利要求15所述的方法，其中脂肪酸底物是不饱和脂肪酸并且所述底物中被环氧化的碳键是碳双键。

17.根据权利要求15或16所述的方法，其中脂肪酸底物选自棕榈油酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、9，15-十八碳二烯酸和花生四烯酸。

18.根据权利要求16所述的方法，其中被环氧化的碳键是△12碳键。

19.根据权利要求15所述的方法，其中产生的环氧化脂肪酸是斑鸠菊酸。

20.根据权利要求15所述的方法，包含用编码重组环氧化酶的核酸分子转化或转染细胞的额外的第一步。

21.根据权利要求15所述的方法，其中细胞是酵母、真菌或霉菌细胞。

22.根据权利要求15所述的方法，其中所述细胞来自植物。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述植物选自

24.用根据权利要求1所述的分离核酸分子转化的植物细胞。

25.植物细胞，其能表达根据权利要求13所述的重组多肽。

26.根据权利要求24或25所述的植物细胞，选自

亚麻细胞、油籽油菜细胞、向日葵细胞、红花细胞、大豆细胞、亚麻籽细胞、芝麻细胞、棉籽细胞、花生细胞、橄榄细胞或油棕细胞。

27.根据权利要求24或25所述的植物细胞，其是拟南芥细胞。

28.根据权利要求24或25所述的植物细胞，其是亚麻细胞。