PL194095B1 - Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, konstrukt genetyczny, sposób dokonywania zmian poziomu epoksykwasów tłuszczowych, sposób wytwarzania rekombinantowego polipeptydu monooksygenazy w komórce, sposób wytwarzania rekombinantowego polipeptydu monooksygenazy w roślinie transgenicznej, polipeptydrekombinantowy, sposób wytwarzania epoksydowanegokwasu tłuszczowego, roślina transformowana i roślina lub pochodząca z niej komórka - Google Patents

Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, konstrukt genetyczny, sposób dokonywania zmian poziomu epoksykwasów tłuszczowych, sposób wytwarzania rekombinantowego polipeptydu monooksygenazy w komórce, sposób wytwarzania rekombinantowego polipeptydu monooksygenazy w roślinie transgenicznej, polipeptydrekombinantowy, sposób wytwarzania epoksydowanegokwasu tłuszczowego, roślina transformowana i roślina lub pochodząca z niej komórka

Info

Publication number
PL194095B1
PL194095B1 PL98336292A PL33629298A PL194095B1 PL 194095 B1 PL194095 B1 PL 194095B1 PL 98336292 A PL98336292 A PL 98336292A PL 33629298 A PL33629298 A PL 33629298A PL 194095 B1 PL194095 B1 PL 194095B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
plant
epoxygenase
nucleic acid
acid molecule
carbon
Prior art date
Application number
PL98336292A
Other languages
English (en)
Other versions
PL336292A1 (en
Inventor
Sten Stymne
Allan Green
Surinder Singh
Marit Lenman
Original Assignee
Commw Scient Ind Res Org
Sten Stymne
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AUPO6226A external-priority patent/AUPO622697A0/en
Priority claimed from AUPO6223A external-priority patent/AUPO622397A0/en
Application filed by Commw Scient Ind Res Org, Sten Stymne filed Critical Commw Scient Ind Res Org
Publication of PL336292A1 publication Critical patent/PL336292A1/xx
Publication of PL194095B1 publication Critical patent/PL194095B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6463—Glycerides obtained from glyceride producing microorganisms, e.g. single cell oil

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Lubricants (AREA)
  • Food Preservation Except Freezing, Refrigeration, And Drying (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

1. Wyizolowana czasteczka kwasu nukleinowego lub czasteczka do niej komplementarna, ko- dujaca epoksygenaze, bedaca polipeptydem monooksygenazy o funkcji mieszanej zdolnej do katali- zowania epoksydacji wiazania wegiel-wegiel w czasteczce kwasu tluszczowego, znamienna tym, ze obejmuje sekwencje aminokwasów zawierajaca trzy motywy o wysokiej zawartosci histydyny, a mianowicie: (i) His-(Xaa) 3-4 -His; (ii) His-(Xaa) 2-3 -His-His, oraz (iii) His-(Xaa) 2-3 -His-His, PL PL PL

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, konstrukt genetyczny, sposób dokonywania zmiany poziomu epoksykwasów tłuszczowych, sposób wytwarzania rekombinantowego polipeptydu monooksygenazy w komórce, sposób wytwarzania rekombinantowego polipeptydu monooksygenazy w roślinie transgenicznej, polipeptyd rekombinantowy, sposób wytwarzania epoksydowanego kwasu tłuszczowego, roślina transformowana oraz roślina lub pochodząca od niej komórka.
Wynalazek niniejszy dotyczy, ogólnie, nowych sekwencji genetycznych kodujących epoksygenazy kwasów tłuszczowych a zwłaszcza sekwencji genetycznych kodujących D12-epoksygenzy kwasów tłuszczowych. Bardziej szczegółowo, wynalazek niniejszy dotyczy cDNA i genomowych sekwencji genowych kodujących epoksygenazy roślinnych kwasów tłuszczowych, korzystnie D12-epoksygenazy Crepis palaestina lub Euphorpbia lagascae.
Sekwencje genetyczne według niniejszego wynalazku stanowią skuteczne narzędzie umożliwiające dokonywanie zmian metabolizmu kwasów tłuszczowych, lub manipulowanie tym metabolizmem, w takich organizmach, jak drożdże, pleśnie, bakterie, owady, ptaki, ssaki i rośliny wyższe, a zwłaszcza dokonywania przekształcania nienasyconych kwasów tłuszczowych w epoksydowane kwasy tłuszczowe. Wynalazek obejmuje swym zakresem genetycznie zmodyfikowane organizmy oleiste, transformowane przedmiotowymi sekwencjami genetycznymi, a także oleje pochodzące z tego źródła. Oleje wytworzone sposobem według wynalazku służą uzyskiwaniu tanich surowców przydatnych do wydajnej produkcji, między innymi, powłok, żywic, klejów, tworzyw sztucznych, środków powierzchniowo czynnych i smarów.
Obecnie istnieje szerokie, zainteresowanie wytwarzaniem produktów zasilających, takich jak kwasy tłuszczowe, przeznaczonych do zastosowaniach przemysłowego raczej z odnawialnych źródeł roślinnych niżeli z nieodnawialnych produktów przemysłu petrochemicznego. Pomysł ten jest bardzo atrakcyjny dla wytwórców i użytkowników z uwagi na ochronę zasobów, a dla rolnictwa stwarza znaczącą okazję rozwinięcia się nowych upraw przemysłowych.
W przyrodzie występuje różnorodność nietypowych kwasów tłuszczowych i zostały one dobrze scharakteryzowane [Radam i Paril (1981); Smith (1970)]. Wiele spośród tych nietypowych kwasów tłuszczowych ma znaczenie przemysłowe, co prowadzi do zainteresowania się możliwością zaaklimatyzowania wytwarzających je gatunków w celu produkowania wspomnianych kwasów w skali agrotechnicznej.
Jedną grupę kwasów tłuszczowych budzącą szczególne zainteresowanie stanowią epoksykwasy tłuszczowe, złożone z łańcucha acylowego, w którym dwa sąsiednie atomy węgla połączone są ze sobą mostkiem epoksydowym. Dzięki swej wysokiej reaktywności, znajdują one szerokie zastosowanie w produkcji powłok, żywic, klejów, tworzyw sztucznych, środków powierzchniowo czynnych i smarów. Kwasy tłuszczowe tego rodzaju wytwarza się obecnie na drodze chemicznej epoksydacji olejów roślinnych, zazwyczaj oleju sojowego i oleju lnianego, jednakże w procesie tym otrzymuje się mieszaniny różnorodnych postaci i form izomerycznych, przy czym jest to proces bardzo kosztowny.
Toteż, czynione są wysiłki zmierzające do odpowiedniego wykorzystania dzikich roślin, które produkują i gromadzą epoksykwasy tłuszczowe (na przykład, Euphorbia lagascae, Vernonia galamensis), dla uzyskania przemysłowych źródeł tych olejów. Jednakże, problemy wynikające z przydatności tych roślin pod względem stosowalności agronomicznej i niskiego potencjału plonowania w poważnym stopniu ograniczają przemysłową użyteczność podejścia opartego na tradycyjnych metod hodowli i uprawy.
Szybko rozwijające się, ciągłe unowocześnianie technologii rekombinantowego DNA bardzo ułatwia osiąganie efektywności procesów przemysłowych ważnych z handlowego punktu widzenia, a to przez dzięki wykorzystaniu ekspresji genów, wyizolowanych z pierwszego organizmu lub gatunku, w drugim organizmie lub gatunku, z nadaniem mu nowego fenotypu. Bardziej szczegółowo, typowe metody przemysłowe można uczynić wydajniejszymi i oszczędniejszymi (w wyniku wyższych wydajności w przeliczeniu na koszt jednostkowy) przez zastosowanie technologii rekombinantowego DNA.
PL 194 095B1
Ponadto, właściwy dobór organizmu-gospodarza dla ekspresji sekwencji genetycznej będącej przedmiotem zainteresowania zapewnia wytworzenie takich związków, które normalnie nie są wytwarzane lub syntetyzowane przez organizm gospodarza, do tego z wysoką wydajnością i o wysokiej czystości.
Jednakże, pomimo ogólnej efektywności technologii rekombinantowego DNA, izolacja sekwencji genetycznych kodujących enzymy ważne w sensie metabolizmu kwasu tłuszczowego, a zwłaszcza genów kodujących D12-epoksygenazy kwasów tłuszczowych odpowiedzialne za wytwarzanie, między innymi, kwasu 12,13-epoksy-9-oktadecenowego (kwasu wernolowego) i kwasu 12,13-epoksy-9,15-oktadekadienowego, ciągle jeszcze pozostaje przeszkodą na drodze opracowania organizmu otrzymanego metodami inżynierii genetycznej wytwarzającego wspomniane kwasy tłuszczowe.
Aż do czasu opracowania niniejszego wynalazku, istniała tylko bardzo ograniczona ilość danych biochemicznych wyjaśniających naturę wspomnianych enzymów typu epoksygenazy, a zwłaszcza D 12-epoksygenaz. Tym niemniej jednak wydaje się, że w Euphorbia lagascae tworzenie się kwasu 12,13-epoksy-9-oktadecenowego (kwasu wernolowego) z kwasu linolowego jest katalizowane przez D12-epoksygenazę zależną od cytochromu P 450 [Bafor i in. (1993); Blee i in. (1994)].
Oprócz tego, rozwijające się nasiona lnu wykazują zdolność przekształcania kwasu wernolowego w kwas 12,13-epoksy-9,15-oktadekadienowy zachodzącego z udziałem endogennej D15-desaturazy [Engeseth i Stymne (1996)]. Epoksykwasy tłuszczowe można wytwarzać także w tkankach roślin z udziałem nadtlenkozależnej peroksygenazy [Blee i Schuber (1990)].
W pracach prowadzących do powstania niniejszego wynalazku twórcy starali się wyodrębnić sekwencje genetyczne kodujące geny ważne z punktu widzenia produkcji epoksykwasów tłuszczowych, takich jak kwas 12,13-epoksy-9-oktadecenowy (kwas wernolowy) i kwas 12,13-epoksy-9,15-oktadekadienowy, i przenieść te sekwencje genetyczne do wysokoprodukcyjnych przemysłowych roślin lnu i/lub innych organizmów gromadzących wytworzony przez siebie olej.
Przedmiotem wynalazku jest wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego lub cząsteczka do niej komplementarna, kodująca epoksygenazę, będącą polipeptydem monooksygenazy o funkcji mieszanej zdolnej do katalizowania epoksydacji wiązania węgiel-węgiel w cząsteczce kwasu tłuszczowego, charakteryzująca się tym, że obejmuje sekwencję aminokwasów zawierającą trzy motywy o wysokiej zawartości histydyny, a mianowicie:
(i) His-(Xaa)3-4-His;
(ii) His-(Xaa)2-3-His-His, oraz (iii) His-(Xaa)2-3-His-His,
Korzystnie w cząsteczce według wynalazku wiązanie węgiel-węgiel jest wiązaniem podwójnym znajdującym się w cząsteczce nienasyconego kwasu tłuszczowego.
Bardziej korzystnie, wspomnianą epoksygenazą jest enzym D6-epoksygenaza, enzym D9-epoksygenaza, enzym D12-epoksygenaza lub enzym 15D-epoksygenaza. Korzystnie cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku pochodzi z rośliny, a bardziej korzystnie, roślina jest wybrana z grupy obejmującej Crepis spp., Euphorbia spp., Chrysanthemum spp. i Vernonia spp. Także korzystnie, wspomnianą rośliną jest roślina wytwarzająca wysoki poziom kwasu wernolowego, ewentualnie wybrana z grupy obejmującej Crepis biennis, Crepis aurea, Crepis conyzaefolia, Crepis intermedia, Crepis occidentalis, Crepis palaestina, Crepis vesicaria i Crepis xancitha i Vernonia galamensis.
Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku korzystnie obejmuje sekwencję nukleotydów identyczną w co najmniej 65% z którąkolwiek z sekwencji SEQ ID NO NO: 1, 3 lub 5, albo z sekwencję komplementarną do niej; i jest zdolna do hybrydyzacji w co najmniej średnich warunkach z sekwencją SEQ ID NO NO: 1, 3 lub 5 albo sekwencją komplementarną do niej.
Także korzystnie wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku obejmuje sekwencję nukleotydów przedstawioną w SEQ ID NO: 1, 3 lub 5, lub sekwencja nukleotydowa komplementarna do niej albo co najmniej około 20 przylegających nukleotydów tej sekwencji.
Przedmiotem wynalazku jest także konstrukt genetyczny, charakteryzujący się tym, że obejmuje wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku, operatywnie połączoną z sekwencją promotorową, przy czym wspomniana cząsteczka kwasu nukleinowego jest zdolna do ulegania transkrypcji w orientacji sensownej lub antysensownej względem naturalnie występującego w przyrodzie kierunku transkrypcji in vivo genu epoksygenazy monooksygenazy o funkcji mieszanej.
PL 194 095B1
Przedmiotem wynalazku jest również sposób dokonywania zmiany poziomu epoksykwasów tłuszczowych w komórce, tkance, narządzie, organizmie nie-człoweka lub drobnoustroju, polegający na tym, że wprowadza się cząsteczkę sensowną, antysensowną, rybozymową lub ko-supresorową, obejmującą wyizolowaną cząsteczkę kwasu według wynalazku do komórki, tkanki, narządu lub organizmu nie-człowieka i inkubuje się wspomnianą komórkę w czasie i w warunkach wystarczających do zajścia ekspresji wspomnianej cząsteczki sensownej, antysensownej, robozomowej lub kosupresorowej.
Korzystnie w sposobie według wynalazku etap wprowadzania sensownej, antysensownej, rybozymowej lub ko-supresorowej cząsteczki obejmuje stabilną transformację komórki, tkanki, narządu lub organizmu nie-człowieka sensowną, antysensowną, rybozomową lub kosupresorową cząsteczką.
Przedmiotem wynalazku jest też sposób wytwarzania w komórce rekombinantowego, enzymatycznie aktywnego polipetydu monooksygenazy o funkcji mieszanej epoksygenazy, polegający na tym, że przeprowadza się hodowlę komórki zawierającej wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku w czasie i w warunkach wystarczających do zajścia ekspresji.
Korzystnie przeprowadza się dodatkowy pierwszy etap transformacji komórki, z udziałem wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego.
Przedmiotem wynalazku jest też sposób wytwarzania w komórce rekombinantowego, enzymatycznie aktywnego polipeptydu monooksygenazy o funkcji mieszanej epoksygenazy, polegający na tym, że:
(i) wytwarza się konstrukt genetyczny obejmujący wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku zlokalizowaną operatywnie pod kontrolą promotora zdolnego do napędzania ekspresji wspomnianej sekwencji genetycznej we wspomnianej komórce, oraz, ewentualnie, wzmacniacza ekspresji:
(ii) transformuje się wspomniany konstrukt genetyczny do wspomnianej komórki; oraz (iii) selekcjonuje się transformanty z wysokim poziomem ekspresji funkcjonalnej epoksygenazy, kodowanej przez tą sekwencję genetyczną.
Następnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania w roślinie transgenicznej rekombinantowego, enzymatycznie aktywnego polipeptydu monooksygenazy o funkcji mieszanej epoksygenazy znamienny tym, że:
(i) wytwarza się konstrukt genetyczny obejmujący wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku, zlokalizowaną operatywnie pod kontrolą specyficznego względem nasion promotora oraz, ewentualnie, elementu wzmacniacza ekspresji, przy czym wspomniana sekwencja genetyczna zlokalizowana jest wgórę od sekwencji terminatora transkrypcji;
(ii) transformuje się wspomniany konstrukt genetyczny do komórki lub tkanki wspomnianej rośliny; oraz (iii) selekcjonuje się transformanty, u których, w nasionach, dochodzi do wysokiego poziomu ekspresji funkcjonalnej epoksygenazy, kodowanej przez sekwencję tą genetyczną.
W sposobie według tym jako roślinę stosuje się gatunki roślin nasionach oleistych, normalnie produkujące wysoki poziom kwasu linolowego, a jako roślinę stosuje się roślinę wybraną z grupy obejmującej: len Linola®, rzepak, słonecznik, krokosz barwierski, soję, siemię lniane, sezam, nasiona bawełny, orzechy ziemne, palmę oliwną lub palmę olejową.
Przedmiotem wynalazku jest również polipeptyd rekombinantowy monooksygenazy o funkcji mieszanej epoksygenazy, który obejmuje sekwencję aminokwasów przedstawioną w sekwencji SEQ ID NO NO: 2, 4 lub 6, lub który jest identyczny z tą sekwencją w co najmniej w 50%.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania epoksydowanego kwasu tłuszczowego w komórce, tkance, narządzie, organizmie nie-człowieka lub drobnoustroju, polegający na tym, że inkubuje się komórkę, tkankę, narząd lub organizm, u których dochodzi do ekspresji rekombinantowego polipeptydu monooksygenazy o funkcji mieszanej epoksygenazy obejmującego sekwencje aminokwasów zidentyfikowaną jako SEQ IDNo 2, 4 lub 6, lub który jest identyczny z ta sekwencją, z kwasem tłuszczowym stanowiącym substrat, w czasie i w warunkach wystarczających do przekształcenia co najmniej jednego wiązania węgiel-węgiel wspomnianego substratu w grupę epoksydową.
PL 194 095B1
Korzystnie w sposobie tym, jako kwas tłuszczowy stanowiący substrat stosuje się nienasycony kwas tłuszczowy, a wiązanie węgiel-węgiel poddawane epoksydowaniu jest podwójnym wiązaniem węgiel-węgiel. Ewentualnie jako kwas tłuszczowy stanowiący substrat stosuje się kwas wybrany z grupy obejmującej kwas palmitolejowy, kwas oleinowy, kwas linolowy, kwas linolenowy, kwas 9,15-oktadekadlenowy i kwas arachidonowy.
Korzystnie epoksydowaniu poddaje się wiązanie węgiel-węgiel D6 lub wiązanie węgiel-węgiel D9, lub wiązanie węgiel-węgiel D12 lub wiązanie węgiel-węgiel D15.
Ogólnie korzystnie, w sposobie tym jako epoksydowany kwas tłuszczowy wytwarza się kwas wernolowy.
W sposobie tym można przeprowadzać dodatkowy pierwszy etap transformacji lub transfekcji komórki, tkanki, narządu lub organizmu nie-człowieka z udziałem cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej rekombinantową monooksygenazę o funkcji mieszanej epoksygenazę.
Komórka, narząd, tkanka organ lub organizm nie-człowieka, w którym zachodzi ekspresja rekombinantowej epoksygenazy, korzystnie może pochodzić z bakterii, drożdży, grzyba, pleśni, owada, rośliny wyższej, ptaka lub ssaka nie-człowieka. Zaś drożdżami, rośliną, grzybem lub pleśnią są korzystnie oleiste drożdże, oleista roślina, oleisty grzyb lub oleista pleśń.
Jako roślinę korzystnie stosuje się roślinę oleistą, w której normalnie nie zachodzi na wysokim poziomie ekspresja rekombinantowej monooksygenazy o funkcji mieszanej epoksygenazy.
Jeszcze bardziej korzystnie jako roślinę oleistą stosuje się roślinę wybraną z grupy obejmującej, między innymi, len Linola®, rzepak, słonecznik, krokosz barwierski, soję, siemię lniane, sezam, nasiona bawełny, orzechy ziemne, palmę oliną lub palmę olejową.
Przedmiotem wynalazku jest także roślina transformowana wyizolowaną cząsteczką kwasu nukleinowego według wynalazku, albo pochodząca od niej komórka, tkanka lub organ, lub potomstwo wspomnianej rośliny, także zawierające wspomnianą cząsteczkę kwasu nukleinowego.
Następnie przedmiotem wynalazku jest roślina transformowana, która charakteryzuje się tym, że jest zdolna do ekspresji rekombinantowego polipeptydu monooksygenazy o funkcji mieszanej epoksygenazy obejmującego sekwencje aminokwasów zidentyfikowaną jako SEQ IDNo 2, 4 lub 6, lub który jest identyczny z ta sekwencją, albo pochodząca od niej komórka, tkanka lub organ, lub potomstwo wspomnianej rośliny, także zdolne do ekspresji wspomnianego polipeptydu rekombinantowego.
Przedmiotem wynalazku jest też roślina lub pochodząca od niej komórka, tkanka lub organ, lub jej potomstwo jak jak zdefiniowano powyżej stanowiąca lub pochodząca od lnu Linola®, rzepaku, słonecznika, krokosza barwierskiego, soji, siemienia lnianego, sezamu, nasion bawełny, orzecha ziemnego, palmy oliwnej lub palmy olejowej.
Wynalazek został zilustrowany na rysunku na którym: fig. 1 stanowi liniowe przedstawienie plazmidu ekspresyjnego obejmującego gen strukturalny epoksygenazy, zlokalizowany operatywnie pod kontrolą skróconego promotora napin (FP1; po prawej stronie, prostokąt zakreskowany) i zlokalizowanej w górę sekwencji terminacyjnej NOS (po prawej stronie, prostokąt zakropkowany). Genetyczna sekwencja epoksygenazy ukazana jest przez znajdujący się po prawej stronie biały prostokąt. Konstrukt ten zawiera także promotora NOS (po lewej stronie, zakreskowany) napędzającego ekspresję genu NPTII (biały prostokąt po lewej stronie) i zlokalizowanego w górę terminatora NOS (po lewej stronie, prostokąt zakropkowany). Wskazano także sekwencje graniczne, lewą i prawą, plazmidu Ti Agrobacterium tumefaciens.
Figura 2 (2A -2H) przedstawia w sposób schematyczny porównawczą analizę podstawowej struktury sekwencji aminokwasów polipetydu epoksygenazy z Crepis palaestina (Cpa12; SEQ ID NO: 2), dalszej epoksygenazy pochodzącej z Crepis sp. innej niż C. palaestina, produkującej duże ilości kwasu wernolowego (CrepX; SEQ ID NO: 4, częściowej sekwencji aminokwasów polipeptydu epoksygenazy pochodzącej z Vernonia galamensis (Vgal1; SEQ IDNO: 6), sekwencji aminokwasów D12-acetylenazy z Crepis alpina (Crep1; SEQ ID NO:8), D12-desaturaz z A. thaliana (L26296; SEQ ID NO: 9), Brassica juncea (K91139; SEQ ID NO:10), Glycine max (L43921; SEQ ID NO: 11), Solanum commersoni (X92847; SEQ ID NO: 12) i Glycine max (LA43920; SEQ ID NO: 13) oraz D12-hydroksylazę z Ricinus communis (U22378; SEQ ID NO:14). Podkreślone są trzy motywy o wysokiej zawartości histydyny zakonserwowane w nie zawierających hemu monooksygenazach o funkcji mieszanej.
PL 194 095B1
Figura 3 jest kopią fotograficznego przedstawienia hybrydyzacji metodą northern blot, pokazującą specyficzną względem nasion ekspresję genu epoksygenazy Crepis palaestina zilustrowanego przykładowo przez sekwencję SEQ ID NO:1.
Analiza metodą Northern blot całkowitego RNA z liści (ścieżka 1) i rozwijających się nasion (ścieżka 2) Crepis palaestina.
Na żelu Northern rozwijano 15 mg całkowitego RNA i blotowano na błonę Hybond N+ z firmy Amersham zgodnie z instrukcją wytwórcy. Otrzymany tak blot hybrydyzowano w temperaturze 60°C z sondą wykonaną z 3' nie uległego translacji rejonu SEQ ID NO:1. Następnie blot przemywano dwukrotnie 2x SSC (bufor NaCl-cytrynian sodu) w temperaturze pokojowej, w ciągu 10 minut, a następnie w 0,1x SSC w temperaturze 60°Cw ciągu 20 minut.
Figura 4 przedstawia w sposób schematyczny sekwencję nukleotydów zdegenerowanego startera PCR (kierunek 5' do 3') stosowanego do izolacji opisanych w niniejszym opisie genów epoksygenazy Euphorbia lagascae.
Figura 5 jest kopią fotograficznego przedstawienia hybrydyzacji dot blot RNA, pokazującą ekspresję genu epoksygenazy, zilustrowanego w sekwencji SEQ ID NO: 3, w roślinach produkujących kwas wernolowy w porównaniu z roślinami nie wytwarzającymi kwasu wernolowego.
Z określonej tkanki wyizolowano 1 m g całkowitego RNA i blotowano dot na błonę Hybond N+ z firmy Amersham zgodnie z instrukcją wytwórcy. Otrzymany tak blot poddano hybrydyzacji w temperaturze 42°C w 50% formamidzie z odpowiednią sondą znakowaną 32P, wykonaną z SEQ ID NO:3, w ciągu 16 godzin. Następnie bloty przemywano dwukrotnie w 2x SSC (bufor NaCl-cytrynian sodu) w temperaturze pokojowej, a następnie w 0,5x SSC w temperaturze 55°Cw ciągu 20 minut. Autoradiogramy otrzymano po całonocnej ekspozycji. Tabela A pokazuje całkowity RNA z rozwijających się nasion Euphorbia lagascae (1), Euphorbia cyparissus (2), Vernonia galamensis (3) i lnu (Linum usitatissimum) (4). Tabela B pokazuje całkowity RNA z różnych tkanek Euphorbia lagascae, w tym z rozwijających się nasion (1), korzenia (2) i liścia (3).
Figura 6 przedstawia w sposób schematyczny metodę hybrydyzacji subtraktywnej stosowaną do izolowania opisywanych w niniejszym opisie genów oksygenazy Euphorbia lagascae. Pula +6cDNA składała się przeważnie z sekwencji podobnych do białka zapasowego nasion. Pulę 15 takich sekwencji poddano obróbce biotyną i w dalszym ciągu subtrakcji z +6cDNA. LH = długa hybrydyzacja, ~ 20 godzin; SH = krótka hybrydyzacja, ~ 3 godziny.
Figura 7 jest kopią fotograficznego przedstawienia hybrydyzacji dot blot RNA, pokazującą ekspresję genu epoksygenazy, zilustrowanego w SEQ ID NO: 20, w roślinach produkujących kwas wernolowy w porównaniu z roślinami nie wytwarzającymi kwasu wernolowego.
Z określonej tkanki wyizolowano 1 m g całkowitego RNA i blotowano dot na błonę Hybond N+ z firmy Amersham zgodnie z instrukcją wytwórcy. Otrzymany tak blot poddano hybrydyzacji w temperaturze 42°C w 50% formamidzie z odpowiednią sondą znakowaną 32P wykonaną z SEQ ID NO:20 w ciągu 16 godzin. Następnie bloty przemywano dwukrotnie w 2x SSC (bufor NaCl-cytrynian sodu) w temperaturze pokojowej, a następnie w 0,5 SSC w temperaturze 55°C w ciągu 20 minut. Autoradiogramy otrzymano po całonocnej ekspozycji. Tabela A pokazuje całkowity RNA z rozwijających się nasion Euphorbia lagascae (1), Euphorbia cyparissus (2), Vernonia galamensis (3) i lnu (Linum usitatissimum) (4). Tabela B pokazuje całkowity RNAS z różnych tkanek Euphorbia lagascae, w tym z rozwijających się nasion (1), korzenia (2) i liścia (3).
Figura 8 przedstawia w sposób schematyczny podwójny wektor plazmidowy obejmujący kasetę ekspresyjną zawierającą skrócony specyficzny względem nasion promotor napin (Napin) i terminator syntazy nopalinowej (NT), ze znajdującym się między nimi miejscem klonowania BamHI, oprócz genu oporności na kanamycynę NPTII operatywnie połączonego z sekwencjami promotora syntazy nopalinowej (NP) i terminatora syntazy nopalinowej (NT). Kaseta ekspresyjna oflankowana jest sekwencjami T-DNA lewej granicy (LB) i prawej granicy (RB).
Figura 9 przedstawia w sposób schematyczny podwójny wektor plazmidowy obejmujący kasetę ekspresyjną zawierającą SEQ IDNO: 1 operatywnie zlokalizowaną pod kontrolą skróconego, specyficznego względem nasion promotora napin (Napin) i w górę od terminatora syntazy nopalinowej (NT) oprócz genu oporności na kanamycynę NPTII operatywnie połączonego z sekwencjami promotora syntazy nopalinowej (NP) i terminatora syntazy nopalinowej (NT). Kaseta ekspresyjna oflankowana jest sekwencjami T-DNA lewej granicy (LB) i prawej granicy (RB). Do wytworzenia tego konstruktu, SEQ ID NO: 1 zostaje wstawiona w miejsce BamHI podwójnego wektora przedstawionego na fig. 8.
PL 194 095B1
Figura 10 jest graficznym przedstawieniem wykazanych metodą chromatografii gazowej śladów estrów metylowych kwasów tłuszczowych sporządzonych z udziałem oleistych nasion nietransformowanych roślin Arabidopsis thaliana [tabela (a)] lub roślin A. thaliana (linia transgeniczna Cpal-17), transformowanych przy użyciu SEQ ID NO:1 z zastosowaniem konstruktu genetycznego przedstawionego na fig. 9 [tabele (b) i (c) ]. Na tabelach (a) i (b) estry metylowe kwasu tłuszczowego są rozdzielone z zastosowaniem metody rozdziału na kolumnie upakowanej. Na tablicy (c) estry metylowe kwasu tłuszczowego są rozdzielone z zastosowaniem metody rozdziału na kolumnie kapilarnej. Wskazano pozycje elucji kwasu wernolowego.
Figura 11 jest graficznym przedstawieniem pokazującym rozmieszczenie epoksykwasów tłuszczowych w nasionach linii wsobnej na roślinach Ti z roślin Arabidopsis thaliana transformowanych Cpal2 według oznaczenia metodą chromatografii gazowej. Oznaczono zawartość tak kwasu wernolowego (oś x) jak i kwasu 12,13-epoksy-9,15-oktadekadienowego (oś y) i odpowiednie wartości naniesiono na wykres jedne względem drugich. Dane wskazują na pozytywną korelację między poziomami tych kwasów tłuszczowych w roślinach transgenicznych.
Figura 12 jest graficznym przedstawieniem pokazującym włączanie miana 14C do fazy chloroformowej otrzymywanej w wyniku ekstrakcji lipidów liścieni lnu w trakcie zasilania znakowanym sub14 stratem. Zastosowano symbole: zaczerniony romb: zasilanie kwasem 14C-olejowym; zaczerniony kwa14 drat: zasilanie kwasem 14C-wernolowym.
Figura 13 jest graficznym przedstawieniem pokazującym włączanie miana 14C do fosfatydylocholiny liścieni lnu w trakcie zasilania znakowanym substratem. Zastosowane symbole: zaczerniony 14 14 romb: zasilanie kwasem 14C-olejowym; zaczerniony kwadrat: zasilanie kwasem 14C-wernolowym.
Figura 14 jest graficznym przedstawieniem pokazującym włączanie miana 14C do triacelogliceroli liścieni lnu w trakcie zasilania znakowanym substratem. Zastosowane symbole: zaczerniony romb: 14 14 zasilanie kwasem 14C-olejowym; zaczerniony kwadrat: zasilanie kwasem 14C-wernolowym.
Szczegółowy opis korzystnych sposobów wykonania wynalazku
Jedną z cech znamiennych niniejszego wynalazku stanowi wyizolowana cząsteczka, która koduje epoksygenazę kwasu tłuszczowego lub jest komplementarna do wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej epoksygenazę kwasu tłuszczowego.
Aczkolwiek wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku koduje enzym zaangażowany w bezpośredniej epoksydacji kwasu arachidonowego, szczególnie korzystnie przedmiotowa cząsteczka kwasu nukleinowego pochodzi ze źródła innego niż organizm ssaka.
Stosowany w niniejszym opisie termin pochodząca z należy rozumieć w ten sposób, że wskazuje on na to, że konkretna jednostka strukturalna lub grupa jednostek strukturalnych wywodzi się z wyszczególnionego gatunku, ale niekoniecznie jest otrzymana wprost z wyszczególnionego źródła.
Stosowany w niniejszym opisie termin źródło inne niż organizm ssaka odnosi się do jakiegokolwiek organizmu innego niż organizm ssaka albo jego tkanka lub jego komórka. W tym kontekście, termin źródło inne niż organizm ssaka należy rozumieć w ten sposób, że wskazuje on na to, że konkretna jednostka strukturalna lub grupa jednostek strukturalnych wywodzi się z bakterii, drożdży, ptaków, płazów, gadów, owadów, roślin wyższych, grzybów, pleśni i glonów, albo innych organizmów nie będących ssakami.
W korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku, organizmem stanowiącym źródło jest jakikolwiek organizm obdarzony genetyczną zdolnością syntetyzowania epoksykwasów tłuszczowych.
Korzystniej, takim będącym źródłem organizmem są rośliny takie jak, między innymi, (ale bez ograniczania się tylko do nich) Chrysanthemum spp., Crepis spp., Euphorbia spp. i Vermonia spp.
Jeszcze korzystniej, organizm stanowiący źródło wybiera się z grupy obejmującej Crepis biennis, Crepis aurea, Crepis conyzaefolia, Crepis intermedia, Crepis occidentalis, Crepis palaestina, Crepis vesicaria, Crepis xacintha, Euphorbia lagascae i Vernonia galamensis. Nie wyłączone są inne także gatunki.
Zgodnie ze szczególnie korzystnym sposobem wykonania niniejszego wynalazku, jako organizm stanowiący źródło stosuje się Crepis sp., odznaczające się wysoką zawartością kwasu wernolowego, takie jak, między innymi, Crepis palaestina lub, alternatywnie, Vernonia galamensis lub Euphorbia lagascae.
Aczkolwiek wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku koduje D6-epoksygenazę lub D9-epoksygenazę, lub D12-epoksygenazę lub D15-epoksygenazę, albo co najmniej koduje enzym nie zaangażowany w bezpośredniej epoksydacji kwasu arachidonowego, przedmiotowa cząsteczka kwasu nukleinowego może wywodzić się z jakiegokolwiek źródła wytwarzającego wspo8
PL 194 095B1 mniany enzym, włączając w to, ale bez ograniczania się tylko do nich, drożdże, pleśnie, bakterie, owady, ptaki, ssaki i rośliny.
Cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku, zgodnie z którymkolwiek z poprzednio wspomnianych wykonań, może stanowić DNA, taki jak gen, cząsteczkę cDNA, cząsteczkę RNA lub cząsteczkę syntetycznego oligonukleotydu, czy to jednoniciową czy dwuniciową i niezależną od jakichkolwiek właściwości struktury drugorzędowej, jeżeli tego inaczej nie sprecyzowano.
Występujące w niniejszym opisie odniesienia się do genu należy rozumieć w ich najszerszym kontekście i obejmują one: (i) klasyczny gen genomowy złożony z transkrypcyjnych i/lub translacyjnych sekwencji regulatorowych i/lub regionu kodującego i/lub sekwencji nie ulegających translacji (to znaczy intronów, sekwencji nie ulegających translacji na końcu 5 ' i 3 '); albo (ii) mRNA lub cDNA odpowiadające regionom kodującym (to znaczy eksony) i sekwencje genu nie ulegające translacji na końcu 5'i 3'.
Stosowany w niniejszym opisie termin gen używany jest także do opisania cząsteczek syntetycznych lub fuzyjnych kodujących całość lub część funkcjonalnego produktu. Korzystne geny oksygenazy według niniejszego wynalazku mogą pochodzić od występującego w naturze genu oksygenazy oraz mogą być otrzymywane typowymi metodami rekombinantowymi. Ogólnie, gen epoksygenazy można poddać mutagenezie z uzyskaniem pojedynczego lub wielokrotnego podstawienia, delecji i/lub addycji nukleotydów.
Do nukleotydowych pochodnych insercyjnych, należą produkty fuzji na końcach 5' i 3', jak również wewnątrz sekwencyjnej insercji jednego lub więcej niż jednego nukleotydu. Insercyjne warianty sekwencji nukleotydów są to takie warianty, w przypadku których jeden, lub większa ilość nukleotydów została wprowadzona w przewidziane miejsce w sekwencji nukleotydów, aczkolwiek możliwa jest także insercja przypadkowa, z odpowiednim skriningiem wytworzonego produktu.
Warianty delecyjne charakteryzują się usunięciem z sekwencji jednego, lub więcej niż jednego nukleotydu.
Substytucyjne warianty nukleotydów są to takie warianty, w przypadku których co najmniej jeden nukleotyd w sekwencji został usunięty, a w jego miejsce wstawiony został inny, odmienny nukleotyd. Podstawienie takie może być milczące w tym sensie, że nie zmienia ono aminokwasu zdefiniowanego przez kodon. Alternatywnie, podstawniki przeznaczone są do doprowadzenia do wymiany jednego aminokwasu na inny, podobnie działający aminokwas, lub aminokwas o podobnym ładunku, polarności i hydrofobowości.
W kontekście niniejszego wynalazku, termin oksygenaza kwasów tłuszczowych należy rozumieć w ten sposób, że odnosi się on do jakiegokolwiek enzymu, lub jego funkcjonalnego równoważnika lub jego enzymatycznie aktywnej pochodnej, która katalizuje biosyntezę epoksydowanego kwasu tłuszczowego przez przekształcenie wiązania węgiel-węgiel kwasu tłuszczowego w grupę epoksydową, a korzystnie, przez przekształcenie podwójnego wiązania węgiel-węgiel w nienasyconym kwasie tłuszczowym w grupę epoksydową. Bez ograniczania zakresu wynalazku, epoksygenaza kwasów tłuszczowych może katalizować biosyntezę epoksykwasu tłuszczowego wybranego z wykazu obejmującego, między innymi, kwas 12,13-epoksy-9-oktadecenowy (kwas wernolowy), kwas 12,13-epoksy-9,15-oktadekadienowy, kwas 15,16-epoksy-9,12-oktadekadienowy, kwas 9,10-epoksy-12-oktadecenowy i kwas 9,10-epoksyoktadekanowy.
Terminy epoksy, grupa epoksydowa i reszta epoksydowa, jak wiedzą o tym fachowcy w tej dziedzinie techniki, odnoszą się do trój członowego pierścienia złożonego z dwóch atomów węgla i jednego atomu tlenu, połączonych ze sobą wiązaniami pojedynczymi w sposób następujący:
Zgodnie z tym, termin epoksyd odnosi się do związków zawierających co najmniej jedną grupę epoksydową powyżej zdefiniowaną.
PL 194 095B1
Fachowcy w tej dziedzinie techniki wiedzą, że nomenklatura kwasów tłuszczowych oparta jest na długości łańcucha węglowego i pozycji nienasyconych atomów węgla w obrębie tego łańcucha węglowego. l tak, kwasy tłuszczowe oznacza się w notacji stenograficznej:
Węgielcałość: wiązanie podwójnecałość pozycja wiązania podwójnego (D),
Itak, na przykład, kwas palmitynowy (kwas n-heksanodekanowy) jest nasyconym kwasem o 16 atomach węgla (to znaczy jest to 16:0), kwas oleinowy (kwas oktadecenowy) jest nienasyconym kwasem o 18 atomach węgla i jednym podwójnym wiązaniem między C-9 a C-10 (to znaczy jest to 18:1D 9) a kwas linolenowy (kwas oktadekadienowy) jest nienasyconym kwasem o 18 atomach węgla i dwoma podwójnymi wiązaniami między C-9 a C-10 i między C-12 a C-13 (to znaczy jest to 18:2D9,12).
Jednakże, w kontekście niniejszego wynalazku, epoksygenaza może katalizować przekształcenie jakiegokolwiek wiązania węgiel-węgiel w grupę epoksydową, albo, alternatywnie, przekształcenie jakiegokolwiek wiązania podwójnego w nienasyconym kwasie tłuszczowym będącym substratem w grupę epoksydową. Z tego punktu widzenia, jak wiedzą o tym fachowcy w tej dziedzinie techniki, większość jednonienasyconych kwasów tłuszczowych organizmów wyższych są to nienasycone kwasy tłuszczowe o 18 atomach węgla (są to więc 18:1D9), podczas gdy większość wielonienasyconych kwasów tłuszczowych wywodzących się z organizmów wyższych są to kwasy o 18 atomach węgla z co najmniej jednym wiązaniem podwójnym, mieszczącym się między C-9 a C-10. Poza tym, bakterie także zawierają kwasy tłuszczowe jednonienasycone w pozycji C16.
Ponadto, epoksygenaza według niniejszego wynalazku może przejawiać aktywność w stosunku do więcej niż jednej cząsteczki kwasu tłuszczowego jako substratu, a w konsekwencji, zakres niniejszego wynalazku nie jest ograniczony przez naturę cząsteczki substratu, na którą działa przedmiotowa epoksygenaza.
Korzystnie, cząsteczka będąca substratem dla epoksygenazy według niniejszego wynalazku stanowi cząsteczkę kwasu tłuszczowego zawierającego co najmniej jedno wiązanie podwójne.
Następnie, epoksygenazy mogą wywierać działanie na dowolną liczbę atomów węgla w cząsteczce jakiegokolwiek substratu. Itak, na przykład, można je scharakteryzować jako, między innymi, D6-epoksygenazy, D9-epoksygenazy, D12-epoksygenazy lub D15-epoksygenazy. Zgodnie z tym, zakres niniejszego wynalazku nie jest ograniczony pozycją atomu węgla w substracie na który epoksygenaza może działać.
Stosowany w niniejszym opisie termin D6-epoksygenaza należy rozumieć w taki sposób, że odnosi się on do enzymu, który katalizuje przekształcenie wiązania D6 kwasu tłuszczowego stanowiącego substrat w grupę D6-epoksydową, a, korzystnie, katalizuje przekształcenie wiązania podwójnego D6 co najmniej jednego kwasu nienasyconego w grupę D6-epoksydową.
Stosowany w niniejszym opisie termin D9-epoksygenaza należy rozumieć w taki sposób, że odnosi się on do enzymu, który katalizuje przekształcenie wiązania D9 kwasu tłuszczowego stanowiącego substrat w grupę D9-epoksydową, a, korzystnie, katalizuje przekształcenie wiązania podwójnego D9 co najmniej jednego kwasu nienasyconego w grupę D9-epoksydową.
Stosowany w niniejszym opisie termin D12-epoksygenaza należy rozumieć w taki sposób, że odnosi się on do enzymu, który katalizuje przekształcenie wiązania D12 kwasu tłuszczowego stanowiącego substrat w grupę D12-epoksydową, a korzystnie, katalizuje przekształcenie wiązania podwójnego D12co najmniej jednego kwasu nienasyconego w grupę D12-epoksydową.
Stosowany w niniejszym opisie termin D15-epoksygenaza należy rozumieć w taki sposób, że odnosi się on do enzymu, który katalizuje przekształcenie wiązania D15 kwasu tłuszczowego stanowiącego substrat w grupę D15-epoksydową, a, korzystnie, katalizuje przekształcenie wiązania podwójnego A15 co najmniej jednego kwasu nienasyconego w grupę D15-epoksydową.
Wynalazek niniejszy, oczywiście, obejmuje swym zakresem substancje genetyczne kodujące, między innymi, wszystkie enzymy typu oksygenazy wyszczególnione powyżej.
Zgodnie z jednym z korzystnych sposobów wykonania niniejszego wynalazku, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego koduje epoksygenazę kwasów tłuszczowych, która przekształca co najmniej jedno wiązanie węgiel-węgiel w kwasie palmitolejowym (16:1D9), kwasie oleinowym (18:1D9), kwasie linolowym (18:2D9,12), kwasie linolenowym (18: 3D9,12,15) lub kwasie arachidonowym (20: 4D5,8,11,14), do wiązania epoksydowego. Korzystnie, wiązanie węgiel-węgiel stanowi podwójne wiązanie węgiel-węgiel.
PL 194 095B1
Korzystniej, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku koduje epoksygenazę kwasów tłuszczowych, która co najmniej przekształca jedno lub oba podwójne wiązania w kwasie linolowym w grupę epoksydową.
Zgodnie z tym wykonaniem, epoksygenaza przekształcająca zarówno wiązanie podwójne D9 jak i D12 kwasu linolowego w grupę epoksydową, może katalizować takie przekształcenie niezależnie jedno od drugiego tak, że wspomniana epoksygenaza jest D9-epoksygenazą i/lub D12-epoksygenazą, jak zdefiniowano w powyższej części niniejszego opisu.
Zgodnie z innym korzystnym sposobem wykonania niniejszego wynalazku, epoksygenaza kwasów tłuszczowych według niniejszego wynalazku jest D12-epoksygenaza, D15-epoksygenaza lub D9-epoksygenaza, jak zdefiniowano w powyższej części niniejszego opisu.
Korzystniej, epoksygenazą kwasów tłuszczowych według wynalazku jest blot D12-epoksygnaza, jak zdefiniowano w powyższej części niniejszego opisu.
Zgodnie ze szczególnie korzystnym sposobem wykonania, wynalazek niniejszy dotyczy wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej D12-epoksygenazę będącą enzymem, który co najmniej przekształca wiązanie podwójne D12 kwasu linolowego w grupę D12-epoksydową, w wyniku czego otrzymuje się kwas 12,13-epoksy-9-oktadecenowy (kwas wernolowy).
Korzystnym źródłem D12-epoksygenazy jest, ale bez ograniczania zakresu niniejszego wynalazku, roślina, w szczególności Crepis palaestina, lub inna Crepis sp. różniąca się od C. palaestina i zawierająca dużą ilość kwasu wernolowego, a dalej Vernonia galamnesis lub Euphorbia lagascae.
Zgodnie z tym wykonaniem, D12-epoksygenaza może, katalizować, między innymi, przekształcenie kwasu olejopalmitynowego w kwas 9,10-epoksy-palmitynowy i/lub przekształcenie kwasu olejowego w kwas 9,10-epoksystearynowy i/lub przekształcenie kwasu linolowego w jeden, lub więcej niż jeden kwas 9,10-epoksy-12-oktadecenowy lub kwas 12,13-epoksy-9-oktadecenowy lub kwas 9,10,12,13-diepoksystearynowy i/lub przekształcenie kwasu linolenowego w jeden, lub więcej niż jeden kwas 9,10-epoksy-12,15-oktadekadienowy lub kwas 12,13-epoksy-9,15-oktadekadienowy lub kwas 15,16-epoksy-oktadekadienowy lub kwas 9,10,12,13-diepoksy-15-oktadecenowy lub kwas 9,10,15,16-diepoksy-12-oktadecenowy lub kwas 12,13,15,16-diepoksy-9-oktadecenowy lub kwas 9,10,12,13,15,16-triepoksystearynowy i/lub przekształcenie kwasu arachidonowego w jeden, lub więcej niż jeden kwas 5,6-epoksy-8,11,14 tetrakozatrienowy lub kwas 8,9-epoksy-5,11,14-tetrakozatrienowy lub kwas 11,12-epoksy-5,8,14-tetrakozatrienowy lub kwas 14,15-epoksy-5,8,11-tetrakozatrienowy lub kwas 5,6,8,9-diepoksy-11,14-tetrakozadienowy lub kwas 5,6,11,12-diepoksy-8,14-tetrakozadienowy lub kwas 5,6,14,15-diepoksy-8,11-tetrakozadienowy lub kwas 8,9,11,12-diepoksy-5,14-tetrakozadienowy lub kwas 8,9,14,15-diepoksy-5,11-tetrakozadienowy lub kwas 11,12,14,15-diepoksy-5,8-tetrakozadienowy lub kwas 5,6,8,9,11,12-triepoksy-14-tatrakozenowy lub kwas 5,6,8,9,14,15-triepoksy-11-tetrakozenowy lub kwas 5,6,11,12,14,15-triepoksy-8-tetrakozenowy lub kwas 8,9,11,12,14,15-triepoksy-5-tetrakozenowy
Fachowcy w tej dziedzinie techniki wiedzą, że nie wszystkie substraty wyszczególnione powyżej są osiągalne ze źródeł naturalnych, tym niemniej jednak można je wytworzyć na drodze syntezy chemicznej. Wynalazek niniejszy obejmuje swym zakresem przekształcenie zarówno występujących w przyrodzie jak i zsyntetyzowanych chemicznie nienasyconych kwasów tłuszczowych w epoksykwasy tłuszczowe, przy czym jedynym wymaganiem w tym przypadku jest to, aby cząsteczka kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku, jakto opisano w niniejszym opisie, kodowała enzym, lub jego funkcjonalną część zdolną do katalizowania wspomnianej przemiany.
W zgodności z powyższym omówieniem, fachowcy w tej dziedzinie techniki zdadzą sobie sprawę z tego, że epoksygenaza kwasów tłuszczowych może stanowić, między innymi, enzym monooksygenazę zależną od cytochromu P 450 lub monooksygenazę o funkcji mieszanej, albo, alternatywnie, enzym peroksygenazę zależną od nadtlenku, albo enzym podobny.
Jednakże, wynalazek niniejszy jest w szczególny sposób ukierunkowany na te enzymy typu epoksygenazy, które są monooksygenazami o funkcji mieszanej i na kodujące je cząsteczki kwasu nukleinowego, oraz na ich zastosowanie. Zgodnie z tym, szczególnie korzystnie cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku koduje epoksygenazę kwasów tłuszczowych będącą monooksygenazą o funkcji mieszanej.
PL 194 095B1
W kontekście niniejszego wynalazku, termin monooksydaza o funkcji mieszanej należy rozumieć w ten sposób, że odnosi się on do jakiegokolwiek enzymu katalizującego epoksydację wiązania węgiel-węgiel lub podwójnego wiązania węgiel-węgiel w cząsteczce kwasu tłuszczowego, przy czym wspomniany enzym obejmuje sekwencję aminokwasów zawierającą trzy regiony o wysokiej zawartości histydyny, jak następuje:
(i) His-(Xaa)3-4-His;
(ii) His-(Xaa)2-3-His-His; oraz (iii) His-(Xaa)2-3-His-His, przy czym His oznacza histydynę, Xaa oznacza resztę jakiegokolwiek aminokwasu występującego w przyrodzie jak to przedstawiono w poniższej tabeli 1, składnik (Xaa)3-4 oznacza sekwencję aminokwasów obejmującą trzy lub cztery jednostki powtarzalne Xaa, a składnik (Xaa)2-3 oznacza sekwencję aminokwasów obejmującą dwie lub trzy jednostki powtarzalne Xaa.
Termin enzym podobny do monooksydazy o funkcji mieszanej należy rozumieć w ten sposób, że odnosi się on do jakiegokolwiek enzymu obejmującego dwa lub trzy regiony o wysokiej zawartości histydyny wyszczególnione powyżej.
Dla zilustrowania wynalazku tu opisywanego, jego twórcy zademonstrowali, między innymi, fakt, że sekwencja aminokwasów Crepis palaestina obejmuje D12-epoksygenazę zawierającą charakterystyczne motywy sekwencji aminokwasów monooksygenazy o funkcji mieszanej, jak to opisano w powyższej części niniejszego opisu. Daleko posunięta identyczność sekwencji aminokwasów występująca między D12-epoksygenazą C. palaestina (SEQ ID NO: 2) i sekwencjami polipeptydów pochodzących z niezidentyfikowanych Crepis sp. i Vernonia galamensis (SEQ ISD NO NO: 4 i 6), w porównaniu z sekwencjami aminokwasów innych monooksygenaz o funkcji mieszanej, takich jak desaturazy i hydroksylazy, sugeruje, że wspomniane sekwencje aminokwasów Crepis sp. i V. galamensis także są enzymami typu epoksygenazy kwasów tłuszczowych i że mogą stanowić D12-epoksygenazy.
Pod tym względem, przytoczona to przykładowo sekwencja aminokwasów Vernonia galamensis jest sekwencją częściową, obejmującą jedynie jeden motyw o wysokiej zawartości histydyny (to jest: His-Arg-Asn-His-His) i częściową sekwencję pierwszego motywu o wysokiej zawartości histydyny (to jest, zawiera ona dwie ostatnie reszty histydyny motywu His-Glu-Cys-Gly-His-His), ponieważ kodująca ją odpowiednia sekwencja nukleotydów była amplifikowana metodą PCR jako częściowa sekwencji cDNA, z udziałem pierwszego startera dla wspomnianego motywu o wysokiej zawartości histydyny i drugiego startera amplifikacji przeznaczonego dla regionu w górę od trzeciego motywu o wysokiej zawartości histydyny (to jest: His-Val-Met-His-His). Oprócz tego, fakt amplifikacji sekwencji V. galamensis przy użyciu startera swoistego dla pierwszego motywu o wysokiej zawartości histydyny, wskazuje na to, że odpowiednia sekwencja o pełnej długości będzie także obejmować ten motyw.
Zgodnie z tym, w szczególnie korzystnym wykonaniu wynalazku, cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku koduje monooksygenazę o funkcji mieszanej lub enzym podobny pochodzący z Crepis spp., włącznie z Crepis palaestina, albo, alternatywnie, pochodzący z Vernonia galamensis. Zgodnie z tym wykonaniem, nawet jeszcze bardziej korzystnie przedmiotowa epoksygenaza co najmniej obejmuje sekwencję aminokwasów, zawierającą trzy lub więcej niż trzy regiony o wysokiej zawartości histydyny, jak następuje:
(i) His-Glu-Cys-Gly-His-His (SEQ IDNO: 15);
(ii) His-Arg-Asn-His-His (SEQ IDNO: 16); oraz (iii) His-Val-Met-His-His (SEQ IDNO: 17), albo jej homolog, analog lub pochodną, przy czym His oznacza histydynę, Glu oznacza kwas glutaminowy, Cys oznacza cysteinę, Gly oznacza glicynę, Arg oznacza argininę, Asn oznacza asparaginę, Val oznacza walinę i Met oznacza metioninę.
Wynalazek niniejszy, oczywiście, obejmuje swym zakresem geny epoksygenazy pochodzące z innych gatunków, włącznie z genami epoksygenazy pochodzącymi, między innymi, z Chrysanthemum spp. i Euphorbia lagascae.
W korzystnym wykonaniu, ale bez ograniczania zakresu niniejszego wynalazku, geny epoksygenazy z innych gatunków, objęte zakresem niniejszego wynalazku, kodują monooksygenazy o funkcji mieszanej. Wynalazek niniejszy obejmuje swym zakresem wyizolowane lub rekombinantowe polipeptydy kodowane przez geny tego rodzaju oraz zastosowanie wspomnianych genów i polipeptydów.
PL 194 095B1
Opisywany tu wynalazek, zgodnie z tym jego wykonaniem, nie obejmuje swym zakresem cząsteczek kwasu nukleinowego kodujących aktywności enzymatyczne inne niż aktywności epoksygenaz, jak zdefiniowano w niniejszym opisie, a zwłaszcza nie dotyczy D12-desaturaz pochodzących, między innymi, z Arabidopsis thaliana, Brassica juncea, Brassica napus lub Glycine max, które są znane z tego, że zawierają podobne motywy o wysokiej zawartości histydyny.
W kontekście niniejszego wynalazku, termin homologi sekwencji aminokwasów odnosi się do tych sekwencji aminokwasów lub sekwencji peptydów, które wywodzą się z polipeptydów, enzymów lub białek według niniejszego wynalazku, albo, alternatywnie, odpowiadają zasadniczo sekwencjom aminokwasów wyszczególnionych w poniższej części niniejszego opisu, z uwzględnieniem możliwości występowania jakichkolwiek substytucji, addycji lub delecji aminokwasów występujących w przyrodzie.
I tak, na przykład, aminokwasy można zastąpić innymi aminokwasami odznaczającymi się podobnymi właściwościami, na przykład hydrofobowością, hydrofilowością, momentem hydrofobowości, antygenowością, skłonnością do tworzenia lub rozrywania struktury a-heliksu lub struktury b (pofałdowanej kartki) itd. Alternatywnie, względnie dodatkowo, aminokwasy homologicznej sekwencji aminokwasów można zastąpić innymi aminokwasami o podobnych właściwościach, takich jak, na przykład hydrofobowość, hydrofilowość, moment hydrofobowości, ładunek lub antygenowość itd.
Omawiane tu reszty aminokwasów występujących w przyrodzie opisano w poniższej tabeli 1.
Homologiem sekwencji aminokwasów może być peptyd syntetyczny wytworzony jakimkolwiek sposobem znanym fachowcom w tej dziedzinie techniki, takim jak chemia Fmoc.
Alternatywnie, homolog sekwencji aminokwasów może wywodzić się ze źródła naturalnego, takiego jak ten czy inny gatunek polipetydów, enzymów lub białek według niniejszego wynalazku. Do korzystnych źródeł homologów sekwencji aminokwasów wyszczególnionych powyżej należą jakiekolwiek źródła brane pod uwagę w niniejszym opisie.
Termin analogi sekwencji aminokwasów obejmuje te sekwencje aminokwasów, które są zasadniczo identyczne z sekwencjami aminokwasów wyszczególnionymi powyżej, z uwzględnieniem możliwości obecności w nich jakichkolwiek analogów aminokwasów nie występujących w przyrodzie.
Korzystne aminokwasy nie występujące w przyrodzie i brane pod uwagę w niniejszym opisie są wyszczególnione w poniższej tabeli 2.
Termin pochodna w nawiązaniu do sekwencji aminokwasów należy rozumieć w ten sposób, że odnosi się on do mutantów, części, fragmentów lub fuzji polipeptydów sekwencji aminokwasów wyszczególnionych powyżej. Do pochodnych należą zmodyfikowane sekwencje aminokwasów lub peptydów, w których ligandy są przyłączone do jednej, lub większej ilości zawartych w nich reszt aminokwasowych, takich jak węglowodany, enzymy, białka, polipeptydy lub cząsteczki reporterowe, takie jak radionuklidy lub związki fluorescencyjne. Wynalazek obejmuje swym zakresem także glikozylowane, fluorescencyjne, acylowane lub alkilowane postacie przedmiotowych peptydów. Oprócz tego, do pochodnych należeć mogą także fragmenty lub części sekwencji aminokwasów ujawnionej w niniejszym opisie i są one objęte zakresem niniejszego wynalazku, jak również homopolimery i heteropolimery zawierające dwie lub większą ilość kopii przedmiotowych sekwencji.
Sposoby postępowania dotyczące derywatyzacji peptydów są dobrze znane w tej dziedzinie techniki.
Do substytucji należą zamiany aminokwasów, w przypadku których aminokwas zostaje zastąpiony resztą odmiennego występującego w naturze lub nietypowego aminokwasu. Substytucje takie można sklasyfikować jako konserwatywne i w tym przypadku reszta aminokwasu zostaje zastąpiona innym występującym w przyrodzie aminokwasem o podobnym charakterze, na przykład:
Gly « Ala, Val « Ile « Leu, Asp « Glu, Lys « Arg, Asn « Gin lub Phe « Trp « Tyr.
Substytucje objęte zakresem niniejszego wynalazku mogą być także niekonserwatywne. W tym przypadku reszta aminokwasu obecna w polipeptydzie represorowym zostaje zastąpiona aminokwasem o odmiennych właściwościach, takim jak występujący w przyrodzie aminokwas pochodzący z innej grupy (na przykład podstawiony naładowany lub hydrofobowy aminokwas zastąpiony alaniną), albo, alternatywnie, występujący w przyrodzie aminokwas zastąpiony jest aminokwasem nietypowym).
PL 194 095B1
Substytucje aminokwasów są to typowo zamiany pojedynczych reszt, jednakże mogą to być również zamiany wielu reszt, albo skupionych, albo rozproszonych.
Delecje aminokwasów są, na ogół, rzędu 1-10 reszt aminokwasowych, natomiast insercje mogą mieć dowolną długość. Delecje i insercje mogą być wykonane na N-końcu, na C-końcu lub też mogą to być delecje lub insercje wewnętrzne. Ogólnie, insercje w obrębie sekwencji aminokwasów będą mniejsze od fuzji na N-końcu lub na C-końcu i są rzędu 1-4 reszt aminokwasowych.
Wynalazek niniejszy, oczywiście, obejmuje swym zakresem przedmiotową wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zintegrowaną z genomem komórki jako addycja do endogennego kompleksu genów epoksygenazy. Alternatywnie, chociaż komórka-gospodarz normalnie nie koduje enzymów potrzebnych do biosyntezy epoksykwasów tłuszczowych, wynalazek niniejszy obejmuje swym zakresem przedmiotową wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zintegrowaną z genomem wspomnianej komórki jako addycja do endogennego genomu komórkowego.
T a b e l a 1
Aminokwas Skrót trzyliterowy Symbol jednoliterowy
Alanina Ala A
Arginina Arg R
Asparagina Asn N
Kwas asparaginowy Asp D
Cysteina Cys C
Glutamina Gln Q
Kwas glutaminowy Glu E
Glicyna Gly G
Histydyna His H
Izoleucyna Ile I
Leucyna Leu L
Lizyna Lys K
Metionina Met M
Fenyloalanina Phe F
Prolina Pro P
Seryna Ser S
Treonina Thr T
Tryptofan Trp W
Tyrozyna Tyr Y
Walina Val V
Jakikolwiek aminokwas przytoczony powyżej Xaa X
PL 194 095B1
Aminokwas nietypowy Kod Aminokwas nietypowy Kod
kwas a-aminomasłowy Abu L-N-metyloalanina Nmala
a-amino-a-metylomaślan Mgabu L-N-metyloarginina Nmarg
aminocyklopropanokarboksylan Cpro metyloasparagina kwas L-N-metyloasparaginowy Nmasn Nmas
kwas aminoizomasłowy Aib L-N-metylocysteina Nmcys
aminonorbornylokarboksylan Norb L-N-metyloglutamina kwas L-N-metyloglutaminowy NMglu Nmglu
cykloheksyloalanina Chexa L-N-metylohistydyna Nmhis
cyklopentyloalanina Cpen L-N-metyloizoleucyna Nmile
D-alanina Dal L-N-metyloleucyna Nmleu
D-arginina Darg L-N-metylolizyna Nmlys
kwas D-asparaginowy Dasp L-N-metylometionina Nmmet
D-cysteina Dcys L-N-metylonorleucyna Nmnle
D-glutamina Dgln L-N-metylonorwalina Nmnva
kwas D-glutaminowy Dglu L-N-metyloornityna Nmorn
D-histydyna Dhis L-N-metylofenyloalanina Nmphe
D-izoleucyna Dile L-N-metyloprolina Nmpro
D-izoleucyna Dile L-N-metyloprolina Nmpro
D-leucyna Dleu L-N-metyloseryna Nmser
D-lizyna Dlys L-N-metylotreonina Nmthr
D-metionina Dmet L-N-metylotryptofan Nmtrp
D-ornityna Dorn L-N-metylotyrozyna Nmtyr
D-fenyloalanina Dphe L-N-metylowalina Nmval
D-prolina Dpro L-N-metyloetyloglicyna Nmctg
D-seryna Dser L-N-metylo-tert-butyloglicyna Nmtbug
D-treonina Dthr L-norleucyna NIe
D-tryptofan Dtrp L-norwalina Nva
D-tyrozyna Dtyr a-metyloaminoizomaślan Mlb
D-walina Dval a-metylo-g-aminomaślan Mgabu
D-a-metyloalanina Dmala a-metylocykloheksyloalanina Mchexa
D-a-metyloarginina Dmarg a-metylocyklopentyloalanina Mcpen
D-a-metyloasparagina Dmasn a-metylo-a-naftyloalanina Manap
D-a-metyloasparaginian Dmasp a-metylopenicylamina Mpen
D-a-metylocysteina Dmcys N-(4-aminobutylo)glicyna Nglu
D-a-metyloglutamina Dmgln N-(2-aminoetylo)glicyna Naeg
D-a-metylohistydyna Dmhis N-(3-aminopropylo)glicyna Norn
D-a-metyloizoleucyna Dmile N-amino-a-metylomaślan Nmabu
D-a-metyloleucyna Dmleu a-naftyloalanina Anap
D-a-metylolizyna Dmlys N-benzyloglicyna Nphe
PL 194 095B1
D-a-metylometionina Dmmet N-(2-karbamyloetylo)glicyna Ngln
D-a-metyloornityna Dmorn N-(karbamylometylo)glicyna Nasn
D-a-metylofenyloalanina Dmphe N-(2-karboksyetylo)glicyna Nglu
D-a-metyloprolina Dmpro N-(karboksymetylo)glicyna Nasp
D-a-metyloseryna Dmser N-cyklobutyloglicyna Ncbut
D-a-metylotreonina Dmthr N-cykloheptyloglicyna Nchep
D-a-metylotryptofan Dmtrp N-cykloheksyloglicyna Nchex
D-a-metylotyrozyna Dmty N-cyklodecyloglicyna Ncdec
D-a-metylowalina Dmval N-cyklododecyloglicyna Ncdod
D-N-metyloalanina Dnmala N-cyklooktyloglicyna Ncoct
D-N-metyloarginina Dnmarg N-cyklopropyloglicyna Ncpro
D-N-metyloasparagina Dnmasn N-cykloundecyloglicyna Ncund
D-N-metyloasparaginian Dnmasp N-(2,2-difenyloetylo)glicyna Nbhm
D-N-metylocysteina Dnmcys N-(3,3-difenylopropylo)glicyna Nbhe
D-N-metyloglutamina Dnmgln N-(3-guanidynopropylo)glicyna Narg
D-N-metyloglutaminian Dnmglu N-(1 -hydroksyetylo)glicyna Nthr
D-N-metylohistydyna Dnmhis N-(hydroksyetylo)glicyna Nser
D-N-metyloizoleucyna Dnmile N-(imidazoliloetylo)glicyna Nhis
D-N-metyloleucyna Dnmleu N-(3-indoliloetylo)glicyna Nhtrp
D-N-metylolizyna Dnmlys N-metylo-g-amino-maślan Nmgabu
N-metylocykloheksyloalanina Nmchexa D-N-metylometionina Dnmmet
D-N-metyloornityna Dnmorn N-metylocyklopentyloalanina Nmcpen
N-metyloglicyna Nala D-N-metylofenyloalanina Dnmphe
N-metyloaminoizomaślan Nmaib D-N-metyloprolina Dnmpro
N-(1 -metylopropylo)glicyna Nile D-N-metyloseryna Dnmser
N(2-metylopropylo)glicyna Nleu D-N-metylotreonina Dnmthr
D-N-metylotryptofan Dnmtrp N-(1 -metyloetylo)glicyna Nval
D-N-metylotyrozyna Dnmtyr N-metylopenicylamina Nmpen
kwas g-izomasłowy Gabu N-(p-hydroksyfenylo)glicyna Nthyr
L-tert-butyloglicyna Tbug N-(tiometylo)glicyna Ncys
L-etyloglicyna Etg penicylamina Pen
L-homofenyloalanina Hphe L-a-metyloalanina Mala
L-a-metyloarginina Marg L-a-metyloasparagina Masn
L-a-metyloasparaginian Masp L-a-metylo-tert-butylogicyna Mtbug
L-a-metylocysteina Mcys L-metyloetyloglicyna Metg
L-a-metyloglutamina Mgln L-a-metyloglutaminian Mglu
L-a-metylohistydyna Mhis L-a-metylohomofenyloalanina Mhphe
L-a-metyloizoleucyna Mile N-(2-metylotioetylo)glicyna Nmet
L-a-metyloleucyna Mleu L-a-metylolizyna Mlys
L-a-metylometionina Mmet L-a-metylonorleucyna Mnle
L-a-metylonorwalina Mnva L-a-metyloornityna Morn
L-a-metylofenyloalanina Mphe L-a-metyloprolina Mpro
PL 194 095B1
L-a-metyloseryna Mser L-a-metylotreonina Mthr
L-a-metylotryptofan Mtrp L-a-metylotyryzyna Mtyr
L-a-metylowalina M-val L-a-metylohomofenyloalanina Mmhphe
N-(N-(2,2-difenyloetylo)karbamylo- Nnbhm N-(N-(3,3-difenylopropylo)karba- Nnbhe
metylo)glicyna mylometylo)glicyna
1 -karboksy-1-(2,2-dipropanfenylo- Nmbc
etyloamino)cyklopropan
Zgodnie ze swą drugą cechą znamienną, wynalazek niniejszy dotyczy wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego obejmującej sekwencję nukleotydów przedstawioną w którejkolwiek z sekwencji SEQ ID NO NO: 1lub 3 lub 5 lub 19 lub 20, albo sekwencję komplementarną do niej, albo jej homolog, analog lub pochodną.
Dla celów nomenklaturowych, sekwencja nukleotydów przedstawiona w SEQ IDNO: 1 pochodzi z Crepis palaestina i koduje sekwencję monooksygenazy o funkcji mieszanej lub sekwencję podobną do sekwencji monooksygenazy o funkcji mieszanej przedstawioną w SEQ IDNO: 2.
Jak to zilustrowano przykładowo w niniejszym opisie, sekwencja aminokwasów przedstawiona w SEQ IDNO: 2 wykazuje aktywność epoksygenazy, a bardziej szczegółowo, aktywność D12-epoksygenazy.
Sekwencja nukleotydów przedstawiona w SEQ ID NO: 3 odpowiada cDNA pochodzącemu z Crepis sp. innego niż C. palaestina, zawierającego w dużej ilości kwas wernolowy. Sekwencja aminokwasów przedstawiona w SEQ ID NO: 4 odpowiada pochodnej sekwencji aminokwasów genu epoksygenazy z Crepis sp. przedstawionej w SEQ ID NO: 3.
Sekwencja nukleotydów przedstawiona w SEQ ID NO: 5 odpowiada amplifikowanemu DNA pochodzącemu z Vernania galamensis, otrzymanej z udziałem starterów amplifikacji wywodzących się ze zgodnej sekwencji monooksygenaz o funkcji mieszanej, włącznie z sekwencjami genu epoksygenazy z Crepis spp. według wynalazku.
Amplifikowany DNA obejmuje częściową sekwencję genu epoksygenazy, zawierającą sekwencję nukleotydów zdolną do kodowania motywu His-Arg-Asn-His-His o wysokiej zawartości histydyny, charakterystycznego dla enzymów typu monooksygenazy o funkcji mieszanej. Sekwencja aminokwasów przedstawiona w SEQ ID NO: 6 odpowiada pochodnej sekwencji aminokwasów genu epoksygenazy z Vermonia galamensis przedstawionej w SEQ ID NO:5.
Sekwencja nukleotydów przedstawiona w SEQ ID NO: 7 odnosi się do częściowej sekwencji genu acetylenazy z Crepis alpina, użytego jako sonda w celu wyizolowania cząsteczki kwasu nukleinowego zawierającej sekwencję nukleotydów przedstawioną w SEQ ID NO: 1. Sekwencja aminokwasów przedstawiona w SEQ ID NO 8 odpowiada pochodnej sekwencji aminokwasów wspomnianej sekwencji częściowej genu acetylenazy z C. alpina.
Stosowany w niniejszym opisie termin acetylenaza należy rozumieć w taki sposób, że odnosi się on do enzymu, który jest zdolny do katalizowania przekształcenia podwójnego wiązania węgielwęgiel w cząsteczce kwasu tłuszczowego jako substratu, w potrójne wiązanie węgiel-węgiel, albo, alternatywnie, który jest zdolny do katalizowania tworzenia się potrójnego wiązania w cząsteczce kwasu tłuszczowego.
Sekwencja nukleotydów przedstawiona w SEQ IDNO: 18 odpowiada zdegenerowanemu starterowi amplifikacji używanemu do amplifikacji sekwencji domniemanego genu epoksygenazy z Euphorbia lagascae. Z tego punktu widzenia, reszty nukleotydowe pokazane w SEQ ID NO: 18 są to reszty zalecane przez IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission, przy czym A oznacza adeninę, C oznacza cytozynę, G oznacza guaninę, T oznacza tyminę, Y oznacza resztę pirymidyny, R oznacza resztę puryny, M oznacza adeninę lub cytozynę, K oznacza guaninę lub tyminę, S oznacza guaninę lub cytozynę, W oznacza adeninę lub tyminę, H oznacza nukleotyd inny niż guanina, B oznacza nukleotyd inny niż adenina, V oznacza nukleotyd inny niż tymina, D oznacza nukleotyd inny niż cytozyna i N oznacza resztę jakiegokolwiek nukleotydu.
PL 194 095B1
Sekwencja nukleotydów przedstawiona w SEQ IDNO: 19 pochodzi z Euphorbia lagscae i koduje sekwencję monooksygenazy zależnej od cytochromu P 450 lub sekwencję podobną do sekwencji monooksygenazy zależnej od cytochromu P 450.
Sekwencja nukleotydów przedstawiona w SEQ IDNO: 20 pochodzi z Euphorbia lagscae i koduje domniemaną sekwencję monooksygenazy zależnej od cytochromu P 450 lub sekwencję podobną do sekwencji monooksygenazy zależnej od cytochromu P450.
Wynalazek niniejszy, oczywiście, obejmuje swym zakresem genowe genomowe równoważniki cząsteczek cDNA przedstawionych w którejkolwiek s SEQ IDNO NO: 1, 3, 5, 19 lub 20.
W najkorzystniejszym wykonaniu, wynalazek niniejszy dotyczy wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego obejmującej sekwencję nukleotydową przedstawioną w którejkolwiek z SEQ IDNO NO: 1, 3, 5, 19 lub 20, albo genowy genomowy równoważnik wspomnianej sekwencji nukleotydów, albo jej homolog, analog lub pochodną.
Dla celów niniejszego wynalazku, termin homologi sekwencji nukleotydów należy rozumieć w taki sposób, że odnosi się on do wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego, zasadniczo takiej samej jak cząsteczka kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku lub komplementarnej do niej sekwencji nukleotydów, z uwzględnieniem możliwości występowania w obrębie wspomnianej sekwencji jednej, lub więcej niż jednej substytucji, insercji, delecji lub przegrupowań.
Stosowany w niniejszym opisie termin analogi sekwencji nukleotydów należy rozumieć w ten sposób, że odnosi się on do wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego zasadniczo takiej samej, jak cząsteczka kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku lub komplementarnej do niej sekwencji nukleotydów, z uwzględnieniem możliwości występowania w niej składników nienukleotydowych, normalnie nieobecnych we wspomnianej wyizolowanej cząsteczce kwasu nukleinowego, takich jak, na przykład, między innymi, węglowodany, promieniotwórcze związki chemiczne, w tym radionukleotydy, cząsteczki reporterowe, takie jak (ale bez ograniczania się tylko do niej) DIG, fosfataza alkaliczna lub peroksydaza chrzanowa.
Stosowany w niniejszym opisie termin pochodne sekwencji nukleotydów należy rozumieć w taki sposób, że odnosi się on do jakiejkolwiek wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego odznaczającej się wyraźnym podobieństwem do wspomnianej sekwencji lub jej części.
Ogólnie, homologi, analogi lub pochodne cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku wytwarza się na drodze syntezy albo, alternatywnie, pochodzą one ze źródeł naturalnych. I tak, na przykład, sekwencję nukleotydów według niniejszego wynalazku można poddać mutagenezie w celu utworzenia licznych substytucji, delecji i/lub insercji, jak na to wskazano w powyższej części niniejszego opisu.
Zgodnie z jednym z wykonań wynalazku, korzystne homologi, analogi lub pochodne sekwencji nukleotydów przedstawionych w którejkolwiek z sekwencji SEQ ID NO NO: 1, 3, 5, 19 lub 20, albo sekwencje komplementarne do nich, kodują polipeptydy immunologicznie aktywne lub enzymatycznie aktywne.
Stosowany w niniejszym opisie termin immunologicznie aktywna należy rozumieć w taki sposób, że odnosi się on do zdolności danej cząsteczki polipetydu do wywoływania odpowiedzi immunologicznej u ssaka, a w szczególności odpowiedzi immunologicznej wystarczającej do wytworzenia cząsteczki przeciwciała, takiej jak (ale bez ograniczania się tylko do nich) cząsteczka IgM lub IgG, albo pełnej surowicy zawierającej wspomnianą cząsteczkę przeciwciała. Termin immunologicznie aktywna obejmuje swym zakresem także zdolność polipeptydu do wywoływania odpowiedzi immunologicznej wystarczającej do wytworzenia przeciwciał monoklonalnych, syntetycznych fragmentów Fab cząsteczki przeciwciała, jednołańcuchowej cząsteczki przeciwciała lub innej cząsteczki immunologicznie interaktywnej.
Stosowany w niniejszym opisie termin enzymatycznie aktywna należy rozumieć w taki sposób, że odnosi się on do zdolności danej cząsteczki polipeptydu do katalizowania reakcji enzymatycznej, a w szczególności reakcji enzymatycznej obejmującej epoksydację wiązania węgiel-węgiel w cząsteczce kwasu tłuszczowego jako substratu. Bardziej szczegółowo, ale bez ograniczania zakresu wynalazku, termin enzymatycznie aktywna może odnosić się również do zdolności cząsteczki polipeptydu do katalizowania epoksydacji D-9 lub D-12 w cząsteczce kwasu tłuszczowego stanowiącego substrat, takiego jak kwas linolowy lub kwas wernolowy.
PL 194 095B1
Odnośniki literaturowe
1. An i in., EMBO J. 4, 277 - 284 (1985).
2. F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith i K. Struhl w: Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience (ISBN 047150338) (1987).
3. R.C. Badami i K.B. Patil, Progress in Lipid Research, 19, 119 - 153 (1981).
4. M. Bafor, M.A. Smith, L. Jonsson, K. Stobart i S. Stymne, Arch. Biochem. Bipphys., 303, 145 - 151 (1993).
5. M. Bafor, A. Banas, E. Wiberg. M. Lenman. U. Stahl i S. Stymne w: Physiology, biochemistry and molecular biology of plant lipids (red. J.P. Williams, K.U. Mobasher i N.W. Lem), Kluwer Academic Publisher, Dordrecht. w druku, (1997).
6. Blee i Schuber, J. Biol. Chem., 265, 12887 - 12894 (1990).
7. E. Blee, A.L. Wilcox, J.M. Marnett i F. Schuber, J. Biol. Chem., 268, 1798 -1715 (1993).
8. F. Blee, S. Stahl. F. Schuber i S. Stymne, Biochem. Biophus. Res. Comm., 197, 778 -784 (1994).
9. E.G. Bligh i W. J. Dyer, Can. J. Biochem. Physiol., 230, 379 - 288 (1959).
10. K.R. Bozak, H. Yu, R. Sirevag i R.E. Christoffersen, Proc. Natl. Acad. Sci., 87, 3904 -3908 (1990).
11. P. Christou, D.E. McCabe i W.F. Swain, Plant Physiol., 87, 671 - 674 (1988).
12. Crossway i in., Mol. Gen. Genet., 202, 179 - 185 (1986).
13. J. Devereux, P. Haeberli i O. Smithies, Nucl. Acids Res., 12, 387 - 395 (1984).
14. Dolferus i in., Plant Physiol., 105, 1075 - 1087 (1994).
15. N. Engeseth I S. Stymne, Planta, 198, 238 - 245 (1996).
16. Fromm i in., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82, 5824 - 5828 (1085).
17. J. Haseloff i W.L. Gerlach, Nature, 334, 586 - 594 (1988).
18. Herrera-Estella i in., Nature, 303, 209 - 213 (1983a).
19. Herrera-Estella i in., EMBO J. 2, 987 -995 (1983b).
20. Herrera-Estella i in. w: Plant Genetic Engineering, Cambridge University Press,
NY, str. 63 - 93 (1985).
21. G. Kohn, E. Hartmann, S. Stymne i P. Beutelmann. J. Plant Physiol., 144, 265 - 271 (1994).
22. F.A. Krens, L. Molendijk, G. J. Wullems i R.A. Schilperoort, Nature, 296, 77 - 74 (1982).
23. G.J. Lawrence, J.G. Ellis, E.J. Finnegan, E.S. Dennis i W.J. Peacock w :Breeding Rese arch: The Key to Survival of the Earth (red. S. Iyama i G. Takeda). 6th International Congress of SABRAO, str. 535 - 538 (1989).
24. G.R. Lazo, P.A. Stein i R.A. Ludwig, Bio/technology, 9, 963 - 967 (1991).
25. Needleman i Wunsch, J. Mol. Biol., 48, 443 - 453 (1970).
26. Pazkowski i in., Embo J., 3, 2717 - 2722 (1984).
27. M. Pietrzak, R.D. Shilito, T. Hohn i I. Potrykus, Nucl. Acids Res., 14, 5857 - 5868 (1986).
28. F. Sanger, S. Nicklin i A.R. Coulson, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 72, 5463 - 5467 (1977).
29. J. Shanklin, E. White i B.G. Fox, Biochemistry, 33, 12787 - 12794 (1994).
30. Valvekens i in., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 85, 5536- 5540 (1988).
PL 194 095B1
Wykaz sekwencji (1) Informacja ogólna:
(i) Zgłaszający: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation
AND Sten Stynme (ii) Tytuł wynalazku: Geny epoksygenazy roślinnych kwasów tłuszczowych i ich zastosowanie (iii) Liczba sekwencji: 20 (iv) Adres dla korespondencji:
(A) Adres: DAVIES COLLISON CAVE (B) Ulica: 1 LITTLE COLLINS STREET (C) Miasto: Melbourne (D) Stan: Wiktoria (E) Kraj: Australia (F) ZIP: 3000 (v) Postać czytelna dla komputera:
(A) Typ nośnika: dyskietka (B) Komputer: zgodny z IBM PC (C) System operacyjny: PC-DOS/M5-DOs (D) Oprogramowanie: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (vi) Dane dotyczące niniejszego zgłoszenia:
(A) Numer zgłoszenia (B) Data złożenia:
(vii) Dane dotyczące zgłoszenia poprzedzającego:
(A) Numer zgłoszenia: AU P06223 (B) Data złożenia: 15 kwietnia 1997 (vii) Dane dotyczące zgłoszenia poprzedzającego:
(A) Numer zgłoszenia: AU P06223 (B) Data złożenia: 15 kwietnia 1997 (vii) Dane dotyczące zgłoszenia poprzedzającego:
(A) Numer zgłoszenia: US 60/043706 (B) Data złożenia: 16 kwietnia 1997
PL 194 095B1 (vii) Dane dotyczące zgłoszenia poprzedzającego:
(A) Numer zgłoszenia: US 60/050403 (B) Data złożenia: 20 czerwca 1997 (viii) Dane dotyczące rzecznika patentowego:
(A) Nazwisko : Dr E.John L. Hughes (C) Numer sprawy/akt: MRO/EJH/JMC (ix) Informacje dotyczące telekomunikacji:
(A) Telefon: +61 3 9Z54 2777 (B) Telefax; +6z 3 9254 2770 CC) TELEX: AA 31787 (2) Informacja dotycząca sekwencji SEQ ID N0:l (i) Charakterystyka sekwencji::
(A) Długość: 1358 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia; liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (ix) Cecha znamienna:
(A) Nazwa/Klucz: CDS (B) Pozycja: 30..1151 <xi) Opis sekwencji : SEQ ID N0:l:
GAGAAGGTTGA CCATAAATCA TTTATCAAC ATG GGT GCC GGC GGT CGT GGT CGG 53
Met Gly Ala Gly Gly Arg Gly Arg 1 5
ACA Thr TCG Ser 10 GAA Glu AAA Lys TCG GTC ATG Met 15 GAA CGT GTC TCA GTT GAT Aap CCA Pro GTA Val ACC Thr 101
Ser Val Glu Arg Val Ser Val 20
TTC TCA CTG AGT GAA TTG AAG CAA GCA ATC CCT CCC CAT TGC TTC CAG 149
Phe Ser Leu Ser Glu Leu Lys Gin Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Gin
25 30 35 40
AGA TCT GTA ATC CGC TCA TCT TAC TAT GTT GTT CAA GAT CTC ATT ATT 197
Arg Ser Val Ile Arg Ser Ser Tyr Tyr Val Val Gin Asp Leu Ile Ile
45 50 55
GCC TAC ATC TTC TAC TTC CTT GCC AAC ACA TAT ATC CCT ACT CTT CCT 245
Ala Tyr Ile Phe Tyr Phe Leu Ala Asn Thr Tyr Ile Pro Thr Leu Pro
60 65 70
ACT AGT CTA GCC TAC TTA GCT TGG CCC GTT TAC TGG TTC TGT CAA GCT 293
Thx Ser Leu Ala Tyr Leu Ala Trp Pro Val Tyr Trp Phe Cys Gin Ala
75 80 85
AGC GTC CTC ACT GGC TTA TGG ATC CTC GGC CAC GAA TGT GGT CAC CAT 341
Ser Val Leu Thr Gly Leu Trp Ile Leu Gly His Glu Cys Gly His His
90 95 100
GCC TTT AGC AGC TAC ACA TGG TTT GAC GAC ACT GTG GGC TTC ATC CTC 389
Ala Phe Ser Asn Tyr Thr Trp Phe Asp Asp Thr Val Gly Phe Ile Leu
105 110 115 120
CAC TCA TTT CrC CTC ACC CCG TAT TTC TCT TGG JOp TTC AGT CAC CGG 437
His Ser Phe Leu Leu Thr Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Phe Ser His Arg
□ 125 130 135
PL 194 095B1
AAT CAC CAT TCC AAC ACA AGT TCG ATT GAT AAC GAT GAA GTT TAC ATT 485
Asn His His Ser Asn Thr Ser Ser Ile Asp Asn Asp Glu Val Tyr Ile
140 145 150
CCG AAA AGC AAG TCC AAA CTC GCG CGT ATC TAT AAA CTT CTT AAC AAC 533
Pro Lys Ser Lys Ser Lys Leu Ala Arg Ile Tyr Lys Leu Leu Asn Asn
155 160 165
CCA CCT GGT CGG CTG TTG GTT TTG ATT ATC ATG TTC ACC CTA GGA TTT 581
Pro Pro siy Arg Leu Leu Val Leu Ile Ile Met Phe Thr Leu Gly Phe
170 175 180
CCT TTA TAC CTC TTG ACA AAT ATT TCC GGC AAG AAA TAC GAC AGG TTT 629
Pro Leu Tyr Leu Leu Thr Asn Ile Ser Gly Lys Lys Tyr Asp Arg Phe
185 190 195 200
GCC AAC CAC TTC GAC CCC ATG AGT CCA ATT TTC AAA GAA CGT GAG CGG 677
Ala Asn His Phe Asp Pro Met Ser Pro Ile Phe Lys Glu Arg Glu Arg
205 210 215
TTT CAG GTC TTC CTT TCG GAT CTT GGT CTT CTT GCC GTG TTT TAT GGA 725
Phe Gin Val Phe Leu Ser Asp Leu Gly Leu Leu Ala Val Phe Tyr Gly
220 225 230
ATT AAA GTT GCT GTA GGA AAT AAA GGA GCT GCT TGG GTA GCG TGC ATG 773
Ile Lys Val Ala Val Ala Asn Lys Gly Ala Ala Trp Val Ala Cys Met
235 240 245
TAT GGA GTT CCG GTA TTA GGC GTA TTT ACC TTT TTC GAT GTG ATC ACC 821
Tyr Gly Val Pro Val Leu Gly Val Phe Thr Phe Phe Asp Val Ile Thr
250 255 260
TTC TTG CAC CAC ACC CAT CAG TCG TCG CCT CAT TAT GAT TCA ACT GAA 869
Phe Leu His His Thr His Gin Ser Ser Pro His Tyr Asp Ser Thr Glu
265 270 275 280
TGG AAC TGG ATC AGA GGG GCC TTG TCA GCA ATC GAT AGG GAC TTT GGA 917
Trp Asn Trp Ile Arg Gly Ala Leu Ser Ala Ile Asp Arg Asp Phe Gly
285 290 295 TCC
CTG AAT AGT GTT TTC GAT GAT GTT ACA CAC ACT CAT GTC ATG CAT 965
Phe Leu Asn Ser Val Phe His Asp Val Thr His Thr His Val Met His
300 305 310
CAT TTG TTT TCA TAC ATT CCA CAC TAT CAT GCA AAG GAG GCA AGG GAT 1013
His Leu Phe Ser Tyr Ile Pro His Tyr His Ala Lys Glu Ala Arg Asp
315 320 325
GCA ATC AAG CCA ATC TTG GGC GAC TTT TAT ATG ATC GAC AGG ACi CCA 1061
Ala Ile Lys Pro Ile Leu Gly Asp Phe Tyr Met Ile Asp Arg Thr Pro
330 335 34o
ATT TTA AAA GCA ATG TGG AGA GAG GGC AGG GAG TGC ATG TAC ATC GAG 1109
Ile Leu Lys Ala Met Trp Arg Glu dy Arg Glu Cys Met Tyr Ile Glu
345 350 355 360
CCT GAT AGC AAG CTC AAA GGT GTT TAT TGG TAT CAT AAA TTG 1151
Pro Asp Ser Lys Leu Lys Gly Val Tyr Trp Tyr His Lys Leu
365 370
TGATCATATG CAAATGCAC ATGCATTTTC AAACCCTCTA GTTACGTTTG TTCTATGTAT 1211
AATAAACCGC CGCTCCTTTG GTTGACTATG CCTAAGCCAG GCGAAACAGT TAAATAATAT 1271
CCGTATGATG TGTAATCAAA GTATGTGGTT GTCTGGTTTT GTTGCTATGA AAGAAAGTAT 1331
GTGGTTGTCG GTCAAAAAAA AAAAAAA 1358
(2) I]Informacja dotytcząca sekwencji SEQ ID N0:2; (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 374 aminokwasów (B) Tp: aminokwasowa (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko
PL 194 095B1 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID N0:2:
5 Met 1 Arg Gly Ala Gly Gly Arg Gly
5 Val
Val Ser Val 20 Asp Pro
10 Ala Ile Pro 35 Pro His Cys Phe
Tyr Val 50 Val Gin Asp Leu Ile 55
15
Asn Thr 65 Tyr Ile Pro Thr 70 Leu
20
Pro Val Tyr Trp Phe 85 Cys Gin
25 Leu Gly His Glu 100 Cys Gly His
30 Asp Asp Thr 115 Val Gly Phe Ile
Phe Ser 130 Trp Lys Phe Ser His 135
35
Ile 145 Asp Asn Asp Glu Val 150 Tyr
40 Arg Ile Tyr Lys Leu 165 Leu Asn
45 Ile Ile Met Phe 180 Thr Leu Gly
Ser Gly Lys 195 Lys Tyr Asp Arg
50
Pro Ile 210 Phe Lys Glu Arg Glu 215
55 Gly 225 Leu Leu Ala Val Phe 230 Tyr
60 Gly Ala Ala Trp Val 245 Ala Cys
Arg Thr Ser Glu Lys Ser Val Met Glu 10 15
Thr Phe Ser Leu Ser Glu Leu lys Gin 25 30
Gin Arg Ser Val Ile Arg Ser Ser Tyr 40 45
Ile Ala Tyr Ile Phe Tyr Phe Leu Ala 60
Pro Thr Ser Leu Ala Tyr Leu Ala Trp 75 80
Ala Ser Val Leu Thr Gly Leu Trp Ile 90 95
His Ala Phe Ser Asn Tyr Thr Trp Phe 105 110
Leu His Ser Phe Leu Leu Thr Pro Tyr 120 125
Arg Asn His His Ser Asn Thr Ser Ser 140
Ile Pro Lys Ser Lys Ser Lys Leu Ala 155 160
Asn Pro Pro Gly Arg Leu Leu Val Leu 170 175
Phe Pro Leu Tyr Leu Leu Thr Asn Ile 185 190
Phe Ala Asn His Phe Asp Pro Met Ser 200 205
Arg Phe Gin Val Phe Leu Ser Asp Leu 220
Gly Ile Lys Val Ala Val Ala Asn Lys 235 240
Met Tyr Gly Val Pro Val Leu Gly Val 250 255
PL 194 095B1
Phe Thr Phe Phe 260 Asp Val Ile Thr Phe 265 Leu His His Thr His 270 Gin Ser
Ser Pro His 275 Tyr Asp Ser Thr Glu 280 Trp Asn Trp Ile Arg 285 Gly Ala Leu
Ser Ala 290 Ile Asp Arg Asp Phe 295 Gly Phe Leu Asn Ser 300 Val Phe His Asp
Val 305 Thr His THr His Val 310 Met His His Leu Phe 315 Ser Tyr Ile Pro His 320
Tyr His Ala Lys 325 Glu Ala Arg Asp Ala Ile 330 Lys Pro Ile Leu Gly Asp 335
Phe Tyr Met Ile 340 Asp Arg Thr Pro Ile 345 Leu Lys Ala Met Trp 350 Arg Glu
Gly Arg Glu 355 Cys Met Tyr Ile Glu 360 Pro Asp Ser Lys Leu 365 Lys Gly Val
Tyr Trp 370 Tyr His Lys Leu
(2) Informacja dotycząca SEQ ID NO: 3:
(i) Charakterystyka sekwencji
(A) Długość: 1312 par zasad
(B) Typ: kwas nukleinowy
(D) Topologia: liniowa
(ii) Typ cząsteczki: cDNA
(iii) Źródło pierwotne: Crepis sp,
(ix) Cexcha znamienna:
(A) Nazwa/Klucz: CDS
(B) Pozycja: 26 1147
(xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:3:
TGTTGACCAT AAATCATCTA TCAAC ATG GGT GCC GGC GGC CGT GGT CGG ACA 52
Met Gly Ala Gly Gly Arg Gly Arg Thr
TCG GAA AAG TCG GTC ATG GAA CGT GTC TCA GTT GAT CCA GTA ACC TTC 100
Ser Glu Lys Ser Val Met Glu Arg Val Ser Val Asp Pro Val Thr Phe
10 15 20 25
TCA CTG AGT GAT TTG AAG CAA GCA ATC CCT CCA CAT TGC TTC CAG CGA 148
Ser Leu Ser Asp Leu Lys Gin Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Gin Arg
30 35 40
TCT GTC ATC CGT TCA TCT TAT TAC GTP GTT CAG GAT CTC ATA ATT GCC 196
Ser Val Ile Arg Ser Ser Tyr Tyr Val Val Gin Asp Leu Ile Ile Ala
45 50 55
TAC ATC TTC TAC TTC CTi GCC AAC ACA TAT ATC CCT AAT CTC Ccd’ CAT 244
Tyr Ile Phe Tyr Phe Leu Ala Asn Thr Tyr Ile Pro Asn Leu Pro His
60 65 70
CCT CTA GCC TAC TTA GCT TGG CCG CTT TAC TGG TTC TGT CAA GCT AGC 292
Pro Leu Ala Tyr Leu Ala Trp Pro Leu Tyr Trp Phe Cys Gin Ala Ser
PL 194 095B1
80 85
GTC Val 90 CTC Leu ACT Thr GGG Gly TTA Leu TGG ATC CTC GGC Gly CAT His GAA Glu 100 TGT Cys GGT Gly CAC Hi5 CAT His GCC Ala 340
Trp 95 Ile Leu
TAT AGC AAC TAC ACA TGG GTT GAC GAC ACT GTG GGC TTC ATC ATC CAT 388
Tyr Ser Asn Tyr Thr 110 Trp Val Asp Asp Thr Val 115 Gly Phe Ile Ile 120 His
TCA TTT CTC CTC ACC CCG TAT TTC TCT TGG AAA TAC AGT CAC CGG AAT 436
Ser Phe Leu Leu 125 Thr Pro Tyr Phe Ser 130 Trp Lys Tyr Ser His 135 Arg Asn
CAC CAT TCC AAC ACA AGT TCG ATT GAT AAC GAT GAA GTT TAC ATT CCG 484
His His Ser 140 Asn Thr Ser Ser Ile 145 Asp Asn Asp Glu Val 150 Tyr Ile Pro
AAA AGC AAG TCC AAA CTC AAG CGT ATC TAT AAA CTT CTT AAC AAC CCA 532
Lys Ser Lys Ser Lys Leu Lys Arg Ile Tyr Lys Leu Leu Asn Asn Pro
155 160 165
CCT Pro 170 GGT Gly CGA Arg CTG Leu TTG Leu GTT Val 175 TTG GTT ATC ATG TTC ACC Phe Thr 180 CTA Leu GGA Gly TTT Phe CCT Pro 185 5B0
Leu Val Ile Met
TTA TAC CTC TTG ACA AAT AAT TCC GGC AAG AAA TAC GAT AGG TTT GCC 628
Leu Tyr Leu Leu Thr Asn Ile Ser Gly Lys Lys Tyr Asp Arg Phe Ala
190 1 195 200
AAC CAC TTC GAC CCC ATG AGT CCA ATT TTC AAA GAA CGT GAG CGG TTT 676
Asn His Phe Asp Pro Met Ser Pro Ile Phe Lys Glu Arg Glu Arg Phe
205 210 215
CAG GTC TTC CTT TCG GAT CTT GGT CTT CTT GCT GTG TTT TAT GGA ATT 724
Gin Val Phe Leu Ser Asp Leu Gly Leu Leu Ala Val Phe Tyr Gly Ile
220 225 230
AAA GTT GCT GTA GCA AAT AAA GGA GCT GCT TGG GTG GCG TGC ATG TAT 772
Lys Val Ala Val Ala Asn Lys Gly Ala Ala Trp Val Ala Cys Met Tyr
235 240 245
GGA GTT CCG GTG CTA GGC GTA TTT ACC TTT TTC GAT GTG ATC ACG TTC 820
Gly Val Pro Val Leu Gly Val Phe Thr Phe Phe Aep Val Ile Thr Phe
250 255 260 265
TTA CAC CAC ACC CAT CAG TCG TCG CCT CAT TAT GAT TCA ACT GAA TGG 868
Leu His His Thr His Gin Ser Ser Pro His Tyr Asp Ser Thr Glu Trp
Z70 275 280
AAC TGC ATC AGA GCG GCT TTG TCA GCT ATC GAT AGN GAC TTT GGG TTC 916
Asn Trp Ile Arg Gly Ala Leu Ser Ala Ile Asp Arg Asp Phe Gly Phe
285 290 295
CTG AAT AGT GTT TTC CAT GAT GTN ACA CAC ACT CAC GTC ATG CAT CAT 969
Leu Asn Ser Val Phe His Asp Val Thr His Thr His Val Met His His
300 305 310
PL 194 095B1
TTG Leu TTT TCA TAC ATT Ile CCA Pro CAC His 320 TAT CAT GCA AAG Ala Lys GAA GCA AGG GAT Asp GCA Ala 1012
Phe 315 Ser Tyr Tyr His Glu 325 Aln Arg
ATC AAA CCG ATC TTG GGC GAC TTT TAT ATG ATC GAT AGG ACT CCA ATT 1060
Ile Lys Pro Ile Leu Gly Asp Phe Tyr Met Ile Asp Arg Thr Pro Ile
330 338 340 345
TTA AAA GCA ATG TGG AGA GAG GGC AGG GAA TGC ATC TAC ATC GAG CCT 1108
Leu Lys Ala Met Trp Arg Glu Gly Arg Glu Cys Met Tyr Ile Glu Pro
350 355 360
GAT AGC AAG CTC AAA GGT GTT TAT TGG TAT CAT AAA TTG TGATCATATG 1157
Asp Ser Lys Leu Lys Gly Val Tyr Trp Tyr His Lys Leu
365 370
CAAAATGCAC ATGCATTTTC AAACCCTCTA GTTACCTTTG TTCTATGTAT AATAAGACCG 1217
CCGGTCCTAT GGTTTTCTAT GCCTAAGCCA GGCGAAATAG TTAAATAATA TCDGTATGAT 1277
GTAATGAAAG TATGTGGTTG TCTAAAAAAA AAAAA 1312
(2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:4:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 374 aminokwasów (B) Typ: aminokwasowa (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 4
Met Gly Ala Gly Gly Arg Gly Arg Thr Ser Glu Lys Ser Val Met Glu I 5 10 15
Arg Val Ser Val Asp Pro Val Thr Phe Ser Leu Ser Asp Leu Lys Gin 20 25 30
Ma Ile Pro Pro His Cys Phe Gin Arg Ser Val Ile Arg Ser Ser Tyr 35 40 45
Tyr Val Val Gin Asp Leu Ile Ile Ala Tyr Ile Phe Tyr Phe Leu Ala 50 55 60
Asn Thr Tyr Ile Pro Asn Leu Pro His Pro Leu Ala Tyr Leu Ala Trp
70 75 60
Pro Leu Tyr Trp Phe Cys Gin Ala Ser Val Leu Thr Gly Leu Trp Ile
90 95
Leu Gly His Glu Cys Gly His His Ala Tyr Ser Asn Tyr Thr Trp Val 100 105 110
Asp Asp Thr Val Gly Phe Ile Ile His Ser Phe Leu Leu Thr Pro Tyr 115 120 125
PL 194 095B1
Phe Ser 130 Trp Lys Tyr Ser His 135 Arg Asn His His Ser 140 Asn Thr Ser Ser
Ile Asp Asn Asp Glu Val Tyr Ile Pro Lys Ser Lys Ser Lys Leu Lys
145 150 155 160
Arg Ile Tyr Lys Leu Leu Asn Asn Pro Pro Gly Arg Leu Leu Val Leu
165 170 175
Val Ile Met Phe Thr Leu Gly Phe Pro Leu Tyr Leu Leu Thr Asn Ile
180 185 190
Ser Gly Lys Lys Tyr Asp Arg Phe Ala Asn His Phe Asp Pro Met Ser
195 200 205
Pro Ile Phe Lys Glu Arg Glu Arg Phe Gin Val Phe Leu Ser Asp Leu
210 215 2Z0
Gly Leu Leu Ala Val Phe Tyr Gly Ile Lys Val Ala Val Ala Asn Lys
225 230 235 240
Gly Ala Ala Trp Val Ala Cys Met Tyr Gly Val Pro Val Leu Gly Val
245 250 25S
Phe Thr Phe Phe Asp Val Ile Thr Phe Leu His His Thr His Gin Ser
260 265 270
Ser Pro His Tyr Asp Ser Thr Giy Trp Asn Trp Ile Arg Gly Ala Leu
275 280 285
Ser Aia Ile Asp Arg Asp Phe Gly Phe Leu Asn Ser Val Phe His Asp
290 295 300
Val Thr His Thr His Val Met His His Leu Phe Ser Tyr Ile Pro His
305 310 315 320
Tyr His Ala Lys Glu Ala Arg Asp Ala Ile Lys Pro Ile Leu Gly Asp
325 330 335
Phe Tyr Met Ile Asp Arg Thr Pro Ile Leu Lys Ala Met Trp Arg Glu
340 345 350
Gly Arg Glu Cys Met Tyr Ile Glu Pro Asp Ser Lys Leu Lys Gly Val
355 360 365
Tyr Trp Tyr His Lys Leu
370 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:5:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość : 55o par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (vi) Źródło pierwotne: Vernonia galamenzis
PL 194 095B1 (A) Organizm: Vernonia galamensis (ix) Cecha znamienna:
(A) Nazwa/Klucz: CDS (B) Pozycja: 1..549 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID N0:5:
CAT His 1 CAC His GCC Ala TTC Phe AGT Ser 5 GAC Asp TAT Tyr CAA Gin TGG ATA GAC Asp GAC Asp ACT Thr GTG Val GGC Gly 15 TTC Phe 48
Trp Ile 10
ATC CTT CAC TTT GCA CTC TTC ACC CCT TAT TTC TCT TGG AAA TAC ACT 96
Ile Leu His Phe 20 Ala Leu Phe Tyr Pro 25 Tyr Phe Ser Trp Lys 30 Tyr Ser
CAC CGT AAT CAC CAT GCC AAC ACA AAC TCT CTT GTA ACC GAT GAA GTA 144
His Arg Asn 35 His His Ala Asn Thr 40 Asn Ser Leu Val Thr 45 Asp Glu Val
TAC ATC CCT AAA GTT AAA TCC AAG GTC AAG ATT TAT TCC AAA ATC CTT 192
Tyr Ile 50 Pro Lys Val Lys Ser 55 Lys Val Lys Ile Tyr 60 Ser Lys Ile Leu
AAC AAC CCT CCT GGT CGC GTT TTC ACC TTG GCT TTC AGA TTG ATC GTG 240
Asn 65 Asn Pro Pro Gly Arg 70 Val Phe Thr Leu Ala 75 Phe Arg Leu Ile Val 80
GGT TTT CCT TTA TAC CTT TTC ACC AAT GTT TCA GGC AAG AAA TAC GAA 288
Gly Phe Pro Leu Tyr 85 Leu Phe Thr Asn Val 90 Ser Gly Lys Lys Tyr 95 Glu
CGT TTT GCC AAC CAT TTT GAT CCC ATG AGT CCC ATT TTC ACC GAG CGT 335
Arg Phe Ala Asn 100 His Phe Asp Pro Met 105 Ser Pro Ile Phe Thr 110 Glu Arg
GAG CAT GTA CAA GTC TTG CTT TCT GAT TTT GGT CTC ATA GCA GTT GCT 384
Glu His Val 115 Gin Val Leu Leu Ser 120 Asp Phe Gly Leu Ile 125 Ala Val Ala
TAC GTG GTT CGT CAA GCT GTA CTG GCT AAA GGA GGA GCT TGG GTG ATG 432
Tyr Val 130 Val Arg Gin Ala Val 135 Leu Ala Lys Gly Gly 140 Ala Trp Val Met
TGC ATT TAC GGA GTT CCT GTG CTG GCC GTA AAC GCA TTC TTT GTT TTA 480
Cys Ile Tyr Gly Val Pro Val Leu Ala Val Asn Ala Phe Phe Val Leu
145 150 155 160
ATC ACT TAT CTT CAC CAC ACG CAT CTC TCA CTG CCC CAC TAT GAT AGC 528 Ile Thr Tyr Leu His His Thr His Leu Ser Leu Pro His Tyr Asp Ser
165 170 175
TCA GAA TGG GAC TCG CTA CGA G 550
Ser Glu Trp Asp Trp Leu Arg
180 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:6 (i) Charakterystyka sekwencji
PL 194 095B1 (A) Długość: 183 aminokwasów (B) Typ: aminokwasowa □ (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:D6
His 1 His Ala Phe Ser 5 Asp Tyr Gin Trp Ile Asp 10 Asp Thr Val Gly 15 Phe
Ile Leu His Phe Ala Leu Phr Thr Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Yyr Ser
20 25 30
His Arg Asn His His Ala Asn Thr Asn Ser Leu Val Thr Asp Glu Val
35 40 45
Tyr Ile Pro Lys Val Lys Ser Lys Val Lys Ile Tyr Ser Lys Ile Leu
50 55 60
Asn Asn Pro Pro Gly Arg Val The Thr Leu Ala Phe Arg Leu Ile Val
65 70 75 80
Gly Phe Pro Leu Tyr Leu Phe Thr Asn Val Ser Gly Lys Lys Tyr Glu
85 90 95
Arg Phe Ala Asn His Phe Asp Pro Met Ser Pro Ile Phe Thr Glu Arg
100 105 110
Glu His Val Gin Val Leu Leu Ser Asp Phe Gly Leu Ile Ala Val Ala
115 120 125
Tyr Val Val Arg Gin Ala Val Leu Ala Lys Gly Gly Ala Trp Val Met
130 135 140
Cys Ile Tyr Gly Val Pro Val Leu Ala Val Asn Ala Phe Phe Val Leu
145 150 155 160
Ile Thr Tyr Leu His His Thr His Leu Ser Leu Tro His Tyr Asp Ser
165 170 175
Ser Glu Trp Asp Trp Leu Arg
180 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:7:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 177 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (vi) Źródło pierwotne::
(A) Organizm; Crepis alpina
PL 194 095B1 (ix) Cecha znamienna:
(A) Nazwa/Klucz: CDS (B) Pozycja: 1..177 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:7
GAA TGC GGT Gly CAC His CAT His 5 GCC TTC AGC Ser GAC Asp TAC Tyr 10 CAG TGG GTT GAC GAC AAT 48
Glu 1 Cys Ala Phe Gin Trp Val Asp Asp 15 Asn
GTG GGC TTC ATC CTC CAC TCG TTT CTC ATG ACC CCG TAT TTC TCC TGG 96
Val Gly Phe Ile Leu His Ser Phe Leu Met Thr Pro Tyr Phe Ser Trp
20 25 30
AAA TAC ACC CAC CGG AAC CAC CAT GCC AAC ACA AAT TCG CTT GAC AAC
Lys Tyr Ser His Arg Asn His His Ala Asn Thr Asn Ser Leu Asp Asn
35 40 45
GAT GAA GTT TAC ATC CCC AAA AGC AAG GCC AAA 177
Asp Glu Val Tyr Ile Pro Lys Ser Lys Ala Lys
50 55
(2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:8 (i) charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 59 aminokwasów (B) Typ: aminokwasowa (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:8:
Glu Cys Gly His His Ala Phe Ser Asp Tyr Gin Trp Val Asp Asp Asn
1 5 10 15
Val Gly Phe Ile Leu His Sr : Phe : Leu Met Thr ' Pro Tyr Phe Ser Trp
20 25 30
Lys Tyr Ser His Arg Asn His His Ala Asn Thr Asn Ser Leu Asp Asn
35 40 45
Asp Glu Val Tyr Ile Pro Lys Ser Lys Ala Lys
50 55
(2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:9:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 383 aminokwasów (B) Typ: aminokwasowa (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa
PL 194 095B1 (ii) Typ cząsteczki: białko (vi) Źródło pierwotne:
(A) Organicm: Arabidopsis thaliana
(xi) Opis sekwencji: SEQ ID N0:9:
Met 1 Gly Ala Gly Gly Arg Met 5 Pro 10 Val Pro Thr Ser Ser Lys Lys Ser 15
Glu Thr Asp Thr 20 Thr Lys Arg Val Pro Cys Glu Lys Pro Pro Phe 5er 25 30
Val Gly Asp 35 Leu Lys Lys Ala Ile 40 Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser 45
Ile Pro Arg 50 Ser Phe Ser Tyr 55 Leu Ile Ser Asp Ile Ile Ile Ala Ser 60
Cys 65 Phe Tyr Tyr Val Ala Thr 70 Asn Tyr Phe Ser Leu Leu Pro Gin Pro 75 80
Leu Ser Tyr Leu Ala Trp Pro 85 Leu Tyr Trp Ala Cys Gin Gly Cys Val 90 95
Leu Thr Gly Ile 100 Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe 105 110
Ser Asp Tyr 115 Gin Trp Leu Asp Asp 120 Thr Val Gly Leu Ile Phe His Ser 125
Phe Leu Leu 130 Val Pro Tyr Phe 135 Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Arg His 140
His Ser Asn Thr Gly Ser Leu 150 Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys 155 160
Gin Lys Ser Ala Ile Lys Trp 165 Tyr Gly Lys Tyr Leu Asn Asn Pro Leu 170 275
Gly Arg Ile Met Met Leu Thr 180 Val Gin Phe Val Leu Gly Trp Pro Leu 185 190
Tyr Leu Ala 195 Phe Asn Val Ser Gly Arg Pro Tyr Asp GlyDPhe Ala Cys 200 205
His Phe Phe 210 Pro Asn Ala Pro 215 Ile Tyr Asn Asp Arg Glu Arg Leu Gin 220
Ile 225 Tyr Leu Ser Asp Ala Gly 230 Ile Leu Aln Val Cys Phe Gly Leu Tyr 235 240
Arg Tyr Ala Ala Ala Gin Gly 245 Met Ala Ser Met Ile Cys Leu Tyr Gly 250 255
Val Pro Leu Leu 260 Ile Val Asn Ala Phe Leu Val Leu Ile Thr Tyr Leu 265 270
Gin His Thr His Pro Ser Leu Pro His Tyr Asp Ser Ser Glu Trp Asp
PL 194 095B1
275 280 285
Trp Leu Arg Gly Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Ile Leu
290 295 300
Asn Lys Val Phe HiS Asn Ile Thr Asp Thr His Val Ala His His Leu
305 310 315 320
Phe Ser Thr Met Pro His Tyr Asn Ala Met Glu Ala Thr Lys Ala Ile
325 330 335
Lys Pro Ile Leu Gly Asp Tyr Tyr Gin Phe Asp Gly Thr Pro Trp Tyr
340 345 350
Val Ala Met Tyr Arg Glu Ala Lys Glu Cys Ile Tyr Val Glu Pro Asp
355 360 365
Arg Glu Gly Acp Lys Lys Gly Val Tyr Trp Tyr Asn Asn Lys Leu
370 375 380
(2) Informacja dotycząca ; SEQ ID NO:10:
(i) Charakterystyka sekwencji
□ (A) (B) (C) (D) Długość: 384 aminokwasów Typ: aminokwasowa Sruktura niciowa: nić pojedyncza Topologia: liniowa
(ii) ‘ (vi) : (A) (xi) < Typ cząsteczki: białko Źrodło pierwotne: Organizm: Brassica juncea Opis sekwencji: SEQ ID NO:10:
Met Gly 1 Ala Gly Gly Arg Met Gin Val Ser Pro Ser Pro Lys Lys Ser 5 10 5
Glu Thr Asp Thr Leu Lys Arg Val Pro Cys Glu Thr Pro Pro Phe Thr 20 25 30
Val Gly Glu 35 Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Lys Arg Ser 40 45
Ile Pro 50 Arg Sar Phe Ser Tyr Leu Ile Trp Asp Ile Ile Val Ala Ser 55 60
Cys Phe 65 Tyr Tyr Val Ala Thr Thr Tyr Phe Pro Leu Leu Pro His Pro 70 75 80
Leu Ser Tyr Val Ala Trp Pro Leu Tyr Trp Ala Cys Gin Gly Val Val 85 90 95
Leu Thr Gly Val Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe 100 105 110
Ser Asp Tyr 115 Gin Trp Leu Asp Asp Thr Val Gly Leu Ile Phe His Ser 120 125
PL 194 095B1
Phe Leu 130 Leu Val Pro Tyr Phe 135 Ser Trp Lys Tyr Ser 140 His Arg Arg His
His 145 □ Lys Ser Asn Thr Gly Ser 150 Leu Glu Arg Asp Glu 155 Val Phe Val Pro Lys 160
Lys Ser Asp Ile 165 Lys Trp Tyr Gly Lys 170 Tyr Leu Asn Asn Pro 175 Leu
Gly □ Arg Thr Val 180 Met Leu Thr Val Gin 185 Phe Thr Leu Gly Trp 190 Pro Leu
Tyr Trp Ala 195 Phe Asn Val Ser Gly 200 Arg Pro Tyr Pro Glu 205 Gly Phe Ala
Cys His 210 Phe His Pro Asn Ala Pro 215 Ile Tyr Asn Asp 220 Arg Glu Arg Leu
Gin 225 Ile Tyr Val Ser Asp 230 Ala Gly Ile Leu Ala 235 Val Cys Tyr Gly Leu 240
Tyr Arg Tyr Ala Ala 245 Ala Gin Gly Val Ala 250 Ser Met Val Cys Leu 255 Tyr
Gly Val Pro Leu 260 Leu Ile Val Asn Ala 2 65 Phe Leu Val Leu Ile 270 Thr Tyr
Leu Gin His 275 Thr His Pro Ser Leu 280 Pro His Tyr Asp Ser 285 Ser Glu Trp
Asp Trp 290 Leu Arg Gly Ala Leu 295 Ala Thr Val Asp Arg 300 Asp Tyr Gly Ile
Leu 305 Asn Lys Val Phe His 310 Asn Ile Thr Asp Thr 315 His Val Ala His His 320
Leu Phe Ser Thr Met 325 Pro His Tyr His Ala 330 Met Glu Val Thr Lys 335 Ala
Ile Lys Pro Ile 340 Leu Gly Asp Tyr 345 Tyr Gin Phe Asp Gly Thr 350 Pro Trp
Val Lys Ala 355 Met Trp Arg Glu Ala 360 Lys Glu Cys Ile Tyr 365 Val Glu Pro
Asp Arg Gin Gly Glu Lys Lys Gly Val Phe Trp Tyr Asn Asn Lys Leu
370 375 380 (a) Informacja dotycząca SEQ ID NO:11:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 383 aminokwasy (B) Typ: aminokwasowa (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (vi) Źródło pierwotne:
PL 194 095B1 (A) Organizm: Glycine max
(xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:11:
Met Gly Ala Gly Gly Arg Thr Asp Val Pro Pro Ala Asn Arg Lys Ser
1 5 10 15
Glu Val Asp Pro Leu Lys Arg Val Pro Phe Glu Lys Pro Gin The Ser
20 25 30
Leu Ser Gin Ile Lys Lys Ala Ile Pro Pro His Cys Phe Gin Arg Ser
35 40 45
Val Leu Arg Ser Phe Ser Tyr Val Val Tyr Asp Leu Thr Ile Ala Phe
50 55 60
Cys Leu Tyr Tyr Val Ala Thr His Tyr Phe His Leu Leu Pro Gly Pro
65 70 75 80
Leu Ser Phe Arg Gly Met Ala Ile Tyr Trp Ala Val Gin Gly Cys Ile
85 90 95
Leu Thr Gly Val Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly His His Ala Phe
100 105 110
Ser Asp Tyr Gin Leu Leu Asp Asp Ile Val Gly Leu Ile Leu His Ser
115 120 125
Ala Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Arg His
130 135 140
His Ser Asn Thr Gly Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys
145 150 155 160
Gin Lys Ser Cys Ile Lys Trp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asn Asn Pro Pro
165 170 175
Gly Arg Val Leu Thr Leu Ala Val Thr Leu Thr Leu Gly Trp Pro Leu
180 185 190
Tyr Leu Ala Leu Asn Val Ser Gly Arg Pro Tyr Asp Arg Phe Ala Cys
195 200 205
His Tyr Asp Pro Tyr Gly Pro Ile Tyr Ser Asp Arg Glu Arg Leu Gin
210 215 220
Ile Tyr Ile Ser Asp Ala Gly Val Leu Ala Val Val Tyr Gly Leu Phe
225 230 235 240
Arg Leu Ala Met Ala Lys Gly Leu Ala Trp Val Val Cys Val Tyr Gly
245 250 255
Val Pro Leu Leu Val Val Asn Gly Phe Leu Val Leu Ile Thr Phe Leu
260 265 270
Gin His Thr His Pro Ala Leu Pro His Tyr Thr Ser Ser Glu Trp Asp
275 280 285
Trp Leu Arg Gly Ala Leu Ala Thr Val Asp Arg Asp Tyr Gly Ile Leu
290 295 300
PL 194 095B1
Asn 305 Lys Val Phe His Asn 310 Ile Thr Asp Thr His 315 Val Ala His His Leu 320
Phe Ser Thr Met Pro 325 His Tyr His Ala Met 330 Glu Ala Thr Lys Ala 335 Ile
Lys □ Pro Ile Leu 340 Gly Glu Tyr Tyr Arg 345 fhe Asp Glu Thr Pro 350 Phe Val
Lys Ala Met 355 Trp Arg Glu Ala Arg 360 Glu Cys Ile Tyr Val 365 Glu Pro Asp
Gin Ser 370 Thr Glu Ser Lys Gly 375 Val Phe Trp Tyr Asn 380 Asn Lys Leu
(2) Informacja dotycząca SEQ id : NO:12:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 383 aminokwasy (B) Typ: aminokwasowa (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (vi) Źródło pierwotne:
□ (A) Organizm: Solanum commersoni (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:12
Met 1 Gly Ala Gly Gly Arg 5 Met Ser Ala Pro Asn Gly Glu Thr Glu Val
10 15
Lys Arg Asn Pro 20 Leu Cln Lys Val Pro 25 Thr Ser Lys Pro Pro Phe Thr 30
Val Gly Asp 35 Ile Lys Lys Ala Ile Pro 40 Pro His Cys Phe Gin Arg Ser 45
Leu Ile 50 Asp Ser Phe Ser Tyr 55 Val Val Tyr Asp Leu Ile Leu Val Ser 60
Ile 65 Met Tyr Tyr Val Ala 70 Asn Thr Tyr Phe His Leu Leu Pro Ser Pro 75 80
Tyr Cys Tyr Ile Ala Trp 85 Pro Ile Tyr Trp 90 Ile Cys Gin Gly Cys Val 95
Cys Thr Gly Ile 100 Trp Val Asn Ala His 105 Glu Cys Gly His His Ala Phe 110
Ser Asp Tyr 115 Gin Trp Val Asp Asp Thr 120 Val Gly Leu Ile Leu His Ser 125
Ala Leu 130 Leu Val Pro Tyr Phe 135 Ser Trp Lys Tyr Ser His Arg Arg His 140
His Ser Asn Thr Gly Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val Phe Val Pro Lys
PL 194 095B1
145 150 155 160
Pro Lys Ser Gin Leu 165 Gly Trp Tyr Ser Lys lyO Tyr Leu Asn Asn Pro 175 Pra
Gly Arg Val Leu 180 Ser Leu Thr Ile Thr 185 Leu Thr Leu Gly Trp 190 Pro Leu
Tyr Leu Ala 195 Phe Asn Val Ser Gly 200 Arg Pro Tyr Asp Arg 205 Phe Ala Cys
His Tyr 210 Asp Pro Tyr Gly Pro 215 Ile Tyr Asn Asn Arg 220 Glu Arg Leu Gin
Ile 225 Phe Ile Ser Asp Ala 230 Gly Val Leu Gly Val 235 Cys Tyr Leu Leu Tyr 240
Arg Ile Ala Leu Val 245 Lys Gly Leu Ala Trp 250 Leu Val Cys Val Tyr 255 Gly
Val Pro Leu Leu 260 Val Val Asn Gly Phe 265 Leu Val Leu Ile Thr Z70 Tyr Leu
Gin His Thr 275 His Pro Ser Leu Pro 280 His Tyr Asp Ser Thr 285 Glu Trp Asp
Trp Leu 290 Arg Gly Ala Leu Ala 295 Thr Cys Asp Arg Asp 300 Tyr Gly Val Leu
Agn 305 Lys Val Phe His Asn 310 Ile Thr Asp Thr His 315 Val Val His His Leu 320
Phe Ser Thr Met Pro 325 His Tyx Asn Ala Met 330 Glu Ala Thr Lys Ala 335 Val
Lys Pro Leu Leu 340 Gly Asp Tyr Tyr Gin 345 Phe Asp Gly Thr Pro 350 Ile Tyr
Lys Glu Met 355 Trp Arg Glu Aia Lys 360 Glu Cys Leu Tyr Val 365 Glu Lys Aap
Glu 5er 370 Ser Gin Gly Lys Gly 375 Val Phe Trp Tyr Lys 380 Asn Lys Leu
(2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:13:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 387 aminokwasów (B) Typ: aminokwasowa (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko.
(vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) Organizm: Glycine max (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:13:
PL 194 095B1
Met Gly Leu Ala Lys Glu Thr Thr Met Gly Gly Arg Gly Arg Val Ala 15 10 15
Lys Val Glu Val Gin Gly Lys Lys Pro Leu Ser Arg Val Pro Asn Thr 20 25 30
Lys Pro Pro Phe Thr Val Gly Gin Leu Lys Lys Ala Ile Pro Pro His 35 40 45
Cys Phe Gin Arg 5er Leu Leu Thr 5er Phe Ser Tyr Val Val Tyr Asp 50 55 60
Leu Ser Phe Ala Phe Ile Phe Tyr Ile Ala Thr Thr Tyr Phe His Leu 65 70 75 80
Leu Pro Gin Pro Phe Ser Leu Ile Ala Trp Pro Ile Tyr Trp Val Leu 85 90 95
Gin Gly Cys Leu Leu Thr Gly Val Trp Val Ile Ala His Glu Cys Gly 100 105 110
His His Ala Phe Ser Lys Tyr Gin Trp Val Asp Asp Val Val Gly Leu 115 120 125
Thr Leu His Ser Thr Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Ile Ser 130 135 140
His Arg Arq Hia His Ser Asn Thr Gly Ser Leu Asp Arg Asp Glu Val
145 150 155 160
Phe Val Pro Lys Pro Lys Ser Lys Val Ala Trp Phe Ser Lys Tyr Leu
165 170 175
Asn Asn Pro Leu Gly Arg Ala Val Ser Leu Leu Val Thr Leu Thr Ile 180 185 190
Gly Trp Pro Met Tyr 195
Ser Phe Ala Ser His 210
Glu Arg Leu Leu Ile 225
Tyr Ser Leu Tyr Arg 245
Cys Val Tyr Gly Val 260
Ile Thr Tyr Leu Gin 275
Ser Glu Trp Asp Trp 290
Tyr Gly Ile Leu Asn
Leu Ala Phe Asn Val Ser 200
Tyr His Pro Tyr Ala Pro 215
Tyr Val Ser Asp Val Ala 230 235
Val Ala Thr Leu Lys Gly 250
Pro Leu Leu Ile Val Asn 265
His Thr His Phe Ala Leu 280
Leu Lys Gly Ala Leu Ala 295
Lys Val Phe His His Ile
Gly Arg Pro Tyr Asp 205
Ile Tyr Ser Asn Arg 220
Leu Phe Ser Val Thr 240
Leu Val Trp Leu Leu 255
Gly Phe Leu Val Thr 270
Pro His Tyr Asp Ser 285
Thr Met Asp Arg Asp 300
Thr Asp Thr His Val
PL 194 095B1
305 310 315 320
Ala His His Leu Phe Ser Thr Met Pro His Tyr His Ala Met Glu Ala 325 330 335
Thr Asn Ala Ile 340 Lys Pro Ile Leu Gly 345 Glu Tyr Tyr Gin Phe 350 Asp Asp
Thr Pro Phe Tyr Lys Ala Leu Trp Arg Glu Ala Arg Glu Cys Leu Tyr
355 360 365
Val Glu Pro Asp Glu Gly Thr Ser Glu Lys Gly Val Tyr Trp Tyr Arg 370 375 380
Asn Lys Tyr
385 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO;14;
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 387 aminokwasów (B) Typ: aminokwasowa (C) Sruktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (vi) Źródło pierwotne;
(A) Organizm: Ricinus communis
(xi) Opis sekwencji: SEQ ID 1 NO:14:
Met ' 5 Gly Gly Gly Gly Arg Met ! 10 5er Thr ' Val Ile Thr Ser Asn Asn Ser 1 15
Giu : Lys Lys Gly Gly Ser 5er His Leu : 20 25 Lys Arg Ala Pro His Thr Lys 30
Pro Pro Phe 35 Thr Leu Gly Asp Leu 40 Lys Arg Ala Ile Pro Pro His Cys 45
Phe Glu Arg 50 Ser Phe Val Arg 55 Ser Phe Ser Tyr Val Ala Tyr Asp Val 60
Cys 65 Leu Ser Phe Leu Phe Tyr 70 Ser Ile Ala Thr Asn Phe Phe Pro Tyr 75 80
Ile Ser Ser Pro Leu Ser Tyr 85 Val Ala Trp Leu Val Tyr Trp Leu Phe 90 95
Gin Gly Cys Ile 100 Leu Thr Gly Leu Trp 105 Val Ile Gly His Glu Cys Gly 110
His His Ala 115 Phe Ser Glu Tyr Gin 120 Leu Ala Asp Asp Ile Val GlyD Leu 125
PL 194 095B1
Ile Vał His Ser Ala Leu Leu Val Pro Tyr Phe Ser Trp Lys Tyr Ser □ 130 135 140
His Arg Arg His His Ser Asn Ile Gly Ser Leu Glu Arg Asp Glu Val
145 150 155 160
Phe Val Pro Lys Ser Lys 5er Lys Ile Ser Trp Tyr Ser Lys Tyr Ser
165 170 175
Asn Asn Pro Pro Gly Arg Val Leu Thr Leu Ala Ala Thr Leu Leu Leu 180 185 190
Gly Trp Pro Leu Tyr Leu Ala Phe Asn Val Ser Gly Arg Pro Tyr Asp 195 200 205
Arg Phe Ala Cys His Tyr Asp Pro Tyr Gly Pro Ile Phe Ser Glu Arg 210 215 220
Glu Arg Leu Gin Ile Tyr Ile Ala Asp Leu Gly Ile Phe Ala Thr Thr
225 230 235 240
Phe Val Leu Tyr Gin Ala Thr Met Ala Lys Gly Leu Ala Trp Val Met
245 250 255
Arg Tle Tyr Gly Val Pro Leu Leu Ile Val Asn Cys Phe Leu Val Mee 260 265 270
Ile Thr Tyr Leu Gin His Thr His Pro Ala Ile Pro Arg Tyr Gly Ser 275 280 285
Ser Glu Trp Asp Trp Leu Arg Gly Ala Met Val Thr Val Asp Arg Asp 290 295 300
Tyr Gly Val Leu Asn Lys Val Phe His Asn Ile Ala Asp Thr His Val
305 310 315 320
Ala His His Leu Phe Ala Thr Val Pro His Tyr His Ala Met Glu Ala
325 330 335
Thr Lys Ala Ile Lys Pro Ile Met Gly Glu Tyr Tyr Arg Tyr Asp Gly 340 345 350
Thr Pro Phe Tyr Lys Ala Leu Trp Arg Glu Ala Lys Glu Cys Leu Phe 355 360 365
Val Glu Pro Asp Glu Gly Ala Pro Thr Gin Gly Val Phe Trp Tyr Arg 370 375 380
Asn Lys Tyr
385 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:15D (ii Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 6 aminokwasów (B) Typ: aminokwasowa (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd
PL 194 095B1 (ν) Typ fragmentu: wewnętrzny (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:15:
His Glu Cys Gly His His
5 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:160 (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 5 aminokwasów (B) Typ: aminokwasowa (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (v) Typ fragmentu: wewnętrzny (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:16:
His Arg Asn His His
5 (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:17D (i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 5 aminokwasów (B) Typ: aminokwasowa (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (v) Typ fragmentu: wewnętrzny (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:17:
His Val Met His His
5 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:18:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 29 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: oligonukleotyd (xi) Opis sekwencji; SEQ ID NO:18:
TGGAATTCCY TBMGNNNNYT SGGNHTBGG
PL 194 095B1 (2) Informacja dotycząca SEQ ID N0:19:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 1610 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: cDNA (vi) Źródło pierwotne:
(A) Organizm Euphorbia lagascae (ix) Cecha znamienna:
(A) Nazwa/Klucz: CDS (B) Pozycja: 8..1545 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:19:
AGTAACA ATG AAC ACT Met Asn Thr AAG Lys GAG AAG AAG AAG AAG AAC Asn 10 AGG GTT TCT AAC 49
Glu 5 Lys Lys Lys Lys Arg Val Ser Asn
1
ATC TCT ATT CTT CTT TGC TTC CTT TGC CTT CTT CCA GTT TTC CTT GTT 97
Met Ser Ile Leu Leu 15 Cys 20 Phe Leu Cys Leu Leu 25 Pro Val Phe Leu Val 30
TCT CTT TCT ATT CTT TCT AAC AGG CTT AAG CCA TCT AAG TGG AAC CTT 145
Ser Leu Ser Ile Leu 35 Ser Lys Arg Leu Lys 40 Pro Ser Lys Trp Lys Leu 45
CCA CCA GGA CCA AAG ACT CTT CCA ATT ATT GGA AAC CTT CAA GAT GAG 193
Pro Pro Gly Pro Lys 50 Thr Leu pro Ile 55 Ile Gly Asn Leu Gin 60 Asp Glu
AGG CAA GAT CCA GAG GCT TCT CTT TCT CAA GGA GAT ATT GCT AGG GGA 241
Arg Gin Asp Pro Glu 65 Ala Ser Leu 70 Ser Gin Gly His Ile Ala 75 Arg Gly
CCA GTT GTT CAT TGC GAG AAG CTT GAG TCT TTC GGA ACT CAA CCA ACT 289
Pro Val Val His Cys 80 Glu Lys 85 Leu Glu Ser Phe Gly 90 Thr Gin Pro Thr
ATT AAG GTT GGA CAT TAT GAT AAG AAC TGC GCT CTT CTT CAT GGA GCT 337
Ile 95 Lys Val Gly His Tyr 100 Asp Lys Asn Cys Ala 105 Leu Leu His Gly Ala 110
GGA GAT GAG CTT CTT GGA AAG CCA TCT CCA CCA AAC GAT GCT TGG GAT 385
Gly Asp Glu Leu Leu 115 Gly Lys Pro Ser Pro 120 Pro Asn Asp Ala Trp Asp 125
ACT GGA GGA TAT GGA CTT GAG AGG TCT AAG AAC GAG AGG TGG SAG GAG 433
Thr Gly Gly Tyr Gly 130 Leu Glu Arg Ser 135 Lys Asn Glu Arg Trp 140 Lys Glu
AAG GAG ACT TCG TCT GCT TTC AGG CA11 TAT AGG ACT CTT AGC GCT TTC 481
Lys Glu Thr Trp Ser 145 Ala Phe Arg 150 Gin Tyr Arg Thr Leu Arg Ala Phe 155
PL 194 095B1
GGA ATG GGA GGA AGG TCT TTC GAG CTT Leu ATG AGG TGG CAA GAG Glu GCT Ala CAT His 525
Gly Met 160 Gly Gly Arg Ser Phe 165 Glu Met Arg Trp 170 Gin
TGC CTT GTT GAT GGA TAT GTT TCT AGG AAG GCT TCT CGA ACT GAT CCA 577
Cys Leu Val Asp Gly Tyr Val Ser Arg Lys Ala Ser Gly Thr Asp Pro
175 ISO 185 190
ACT AAG GAT CTT GAG GAT TCT AGG TTC AAC ATT ATT ATG GGA GCT ACT 625
Thr Lys Asp Leu Glu Asp Ser Arg Phe Asn Ile Ile Met Gly Ala Thr
195 200 205
TTC AAC CAA GGA CTT GAT TAT AAG ATT AAG ACT TTC CTT GAT AGG CAT 673
Phe Asn Gin Gly Leu Asp Tyr Lys Ile Lys Thr Phe Leu Asp Arg His
210 215 220
GAG AGG AGG AAC TTC CAA TTC AAC AAC GTT GAT GCT GTT TAT CAT CAA 721
Glu Arg Arg Asn Phe Gin Phe Asn Asn Val Asp Ala Val Tyr His Gin
225 230 235
ATG AAG GAT GCT GAG AGG GGA TTC GTT GAT TCT AGG GGA TGG CAA GAT 769
Met Lys Asp Ala Glu Arg Gly Phe Val Asp Ser Arg Gly Trp Gin Asp
240 245 250
GAG TTC GGA ATT GCT CTT CAA CAA GTT GTT GCT CAA ATT CTT GAT AAG 817
Glu Phe Gly Ile Ala Leu Gin Gin Val Val Ala Gin Ile Leu Asp Lys
255 260 265 270
CCA CTT GAT CAT CAA AAG GCT CTT GAG AGG TGG CAA CAA AGG GAT TCT 865
Pro Leu Asp His Gin Lys Ala Leu Glu Arg Trp Gin Pro Arg Asp Ser
275 280 285
CTT AAC CAT TTC ATT GGA GCT AGG GAT GAT GAG ATG GTT CAA ATT AAG 913
Leu Asn His Phe Ile Gly Ala Arg Asp Asp Glu Met Val Gin Ile Lys
290 295 300
TAT GAT TTC TGC AAG GAT GCT CTT AGG ATG TTC GAT ACT GGA ATT CTT 961
Tyr Asp Phe Cys Lys Asp Ala Leu Arg Met Phe Asp Thr θίγ Ile Leu
305 310 315
GCT GCT GAT CTT CAA TCT TCT ACT TCT TCT ATT ACG TGG GAG CCA ATT 1009
Ala Ala Asp Leu Gin Ser Ser Thr Ser Ser Ile Arg Trp Glu Pro Ile
320 325 330
GTT GTT ATG CTT CAA GCT GAG GTT AAG GGA GAG ATT TGC GAG GAG CTT 1057
Val Val Met Leu Gin Ala Glu Val Lys Gly Glu Ile Cys Glu Glu Leu
335 340 345 350
GAT AGG GTT ATT GCT AGG CAT CAA AGG CCA TCT ATG AAG GAT AAG ATG 1105
Asp Arg Val Ile Ala Arg His Gin Arg Pro Ser Met Lys Asp Lys Met
355 360 365
GTT AAG AGG TAT ACT GCT GCT GTT GTT TGC GAG CTT GAT AGG TAT GCT 1153
Val Lys Arg Tyr Thr Ala Ala Val Val Cys Glu Leu Asp Arg TyrDAla
370 375 380
AAG CTT CTT CCA TCT TCT CTT AGG TGC GTT GCT GCT GAT GAG TGG AAG 1201
Lys Leu Leu Pro Ser Ser Leu Arg Cys Val Ala Ala Asp Glu TrpDLys
PL 194 095B1
385 390 395
TTC AGG GAG TAT CTT ATT CCA Pro 405 GTT Val GGA ATG ACT GTT Val 410 GGA AAC Gly Asn CTT JAG 1249
Phe Arg 400 Glu Tyr Leu Ile Gly Met Thr Leu Lys
ACT ACT GTT ATG CTT GAT CAA AAG GAT CCA GTT GAT CCA GAG CTT TTC 1297 '
Thr Val Met Leu Asp Gin Lys Asp Pro Val Asp Pro Glu Leu Phe
415 420 425 430
GAT GGA ATG TAT GGA CTT GAT GCT GAG GTT CAT TTC GAT AAG ACT GAT 1345
Asp Gly Met Tyr Gly Leu Asp Ala Glu Val His Phe Asp Lys Thr Asp
435 440 445
AGG TTC ATG CCA CCA TTC TCT GCTOGGG AGG ATT GCC TGC GCT GGA CAA 1393
Arg Phe Met Pro Pro Phe Ser Ala Gly Arg Ile Aia Cys Ala Giy Gin
450 455 □ 460
CTT CTT GCT GCT TAT GAG CTY TTC CTT TTC TTC TGG ACT ACT GCT GAT 1441
Leu Leu Ala Ala Tyr Glu Leu Phe Leu Phe Phe Trp Thr Ile Ala Asp
465 470 475
GTT TTC CAA ATT TTC TCT CTT GCT CAA TTC AAG GAG GGA CAT TGC ACT 1489
Val Phe Gin Ile Phe Ser Leu Ala Gin Phe Lys Glu Gly His rys Thr
480 485 490
GCT GTT ACT CTT ATT ATT GAT TGC CTT GCT GTT AGG TAT GAT CTT TGC 1537
Ala Val The Leu Ile Ile Asp Cys Leu Ala Val Arg Tyr Asp Leu Cys
495 500 505 510
CTT CCT AGG TAGGGACCTT TACCGTTTGT GTGACCGTGT CAATGCTTGC 1586
Leu Ala Arg
AATGGGCTTT TAATAATATT ATTA 1610 (2) Informacja dotycząca SEQ ID NO:20:
(i) Charakterystyka sekwencji:
(A) Długość: 1698 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Struktura niciowa: nić pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: DNA (ix) Cecha znamienna:
(A) Nazwa/Klucz: CDS (B) Pozycja: 8..1504 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO:20:
GAGAACA ATG GCA CAA TTC GGC ACG AGG GAA ATT CTA GTC TCA CTC TTT 49
Met Ala Gin Phe Gly Thr Arg Glu Ile Leu Val Ser Leu Phe
PL 194 095B1
10
CTC Leu 15 TCT Phe CTA Leu ATA Ile CTA ATA AAG TTC ACA Thr TTT TTA AAA CTC AAA ACC CCC Pro 30 97
Leu Ile 20 Lys Phe Phe Leu 25 Lys Leu Lys Thr
CAA AAC CCC CCC CCA TCA CCA CCA TCT TTT CCA ATC ACC GGC CAT CTC 145
Gin Asn Leu Pro Pro 35 Ser Pro Pro 5er Phe 40 Pro Ile Thr Gly His 45 Leu
CAT CTC CTA AAA CAA CCA ATC CAC AGA ACT CTC CAC CAA ATC GCC ACC 193
His Leu Leu Lys 50 Gin Pro Ile His Arg 55 Thr Leu His Gin Ile 60 Ala Thr
AAG TAC GGG GAC ATC TTA TTC CTC CGA TTC GGA ACA CGA AAA GTC CTA 741
Lys Tyr Gly 65 Asp Ile Leu Phe Leu 70 Arg Phe Gly Thr Arg 75 Lys Val Leu
GTC ATC TCC Ser TCT Ser CTC Leu CCC fi CC Pro Ala 85 GTA Val CAA Gin GAA Glu TGT Cys TTC ACT ATA AAC GAC Asp 289
Val Ile Θ0 Phe 90 Thr Ile Asn
ATC ATT TTC GCT AAC CGC CCA ACA ATT CTC GCC GGG AAG CAC CTC AAT 337
Ile 95 Ile ^he Ala Asn Arg Pro 100 Thr Ile Leu Ala 105 Gly Lys His Leu Asn 110
TAC AAT TCC ACC ACC ATG GGA TTC GCC TCC TAT GGC GAT CAC TGG CGT 385
Tyr Asn Ser 20 Thr Thr Met Gly 115 Phe Ala Ser Tyr 120 Gly Asp His Trp 125 Arg
CAT CTC CGA CGA CTC ACA ACA ATT GAG CTC TTC TCT GCA AAT CGT GTT 433
His Leu Arg Arg 130 Leu Thr Thr Ile Glu 135 Leu Phe Ser Ala Asn 140 Arg Val
GCC Ala ATG Met TTT Phe 145 TCC Ser GGG TTC CGG Arg GCC Ala 150 GAT Asp GAA Glu AGT ACA GCT TTT Phe TAT Tyr CAA Gin 4B1
Gly Phe Ser Thr Ala 155
ACA GTT GTT CCA GGA AAT CGG GAT TCG GGA AAG ATA GTA ACT TTG ACA 529
Thr Val Val Pro Gly Asn Arg Asp Ser Gly Lys Ile Val Thr Leu Thr
160 165 170
TCG AAA CTG ATG GAG CTT ACA CTG AAT AAC ATA ATG AGA ATC GCT GCC 577
Ser Lys Leu Met Glu Leu Thr Leu Asn Asn Ile Met Arg Met Ala Ala
175 180 185 190
GGA AAA CGG TTT TAC GGG AAA GAA GTG AAG GAT GAA GAA GGT GAG TTG 625
Gly Lys Arg Phe Tyr Gly Lys Glu Val Lys Asp Glu Glu Gly Glu Leu
195 200 205
TTG CAG GAT CTT ATG AAG ΛΛΆ. ATG GAG GCG CTC CGG GGG AAT TCA ACG 673
Leu Gin Asp Leu Met Lys Lys Met Glu Ala Leu Arg Gly Asn Ser Thr
210 215 220
GTG AAA CGA GAT TAT TTT CCA GTA TTG CAG TGG ATT GAT TAT CAG GGA 721
Val Lys Arg Asp Tyr Phe Pro Val Leu Gin Trp Ile Asp Tyr Gin Gly
225 230 235
PL 194 095B1
GTA AAG AAG Lys AAG ATG AGG AAC CTG ATG AAG AAA ATG GAC GGG TTC Gly Phe TTG Leu 763
Val Lys 240 Lys Met Arg Asn 245 Leu Met Lys Lys Met 250 Asp
CAA AAT CTC ATT GAT GAA CAC GGA AAC ACG ACG TTG TGG ATC AAT CAA 817
Gin Asn Leu Ile Asp Glu His Arg Asn Thr Thr Leu Trp Ile Asn Gin
255 260 265 270
GTT CGA GCA ACT CGG ACA AAA AGApGGA ACT TGG ACA CTG GTA GAT GTT 865
Val Arg Ala Thr Arg Thr Lys Arg Gly Thr Trp Thr Leu Val Asp Val
275 280 285
ATG TTG AAT CTT AAA AAG ACA CAA CCT GAC TTC TAC ACT GAT CTA ACT 913
Met Leu Asn Leu Lye Lys Thr Gin Pro Asp Phe Tyr Thr Asp Leu Thr
290 295 300
ATC AAA GGT GTC ATT CAG ACA ACA CTG ACT GCA GGA TCT CAA ACG TCA 9
Ile Lys Gly Val Ile Gin Thr Thr Leu Thr Ala Gly Ser Gin Thr Ser
305 310 315
GCA GTT ACA CTA GAA TGG GCG CTG TCA CTT CTT CTC AAC CAT CCT CAA 1009
Ala Val Thr Leu Glu Trp Ala Leu Ser Leu Leu Leu Agn His Pro Gin
320 325 330
GTA ATG CAC AAA GCT TAT GCC GAA ATA GAG GCG ATT GTC GGG ACC AAC 1057
Val Met His Lys Ala Tyr Ala Glu Ile Glu Ala Ile Val Gly Thr Asn
335 340 345 350
CGC TTA TTA PAC GAA GCC GAC TTA CCA CAT CTA AGC TAT TTA CAA AAC 1105
Arg Leu Leu Asn Glu Ala Asp Leu Pro His Leu Ser Tyr Leu Gin Asn
355 360 365
ATA ATC ACC GAG ACA TTT CGA CTC TTC CCA CCA GTA CCA CTT TTA CTA 1153
Ile Ile Thr Glu Thr Phe Arg Leu Phe Pro Pro Val Pro Leu Leu Leu
370 375 380
CCC CAT AAA TCA TCA GCA GAT TGC ATA GTT TCC GGG TTT CAC ATA CCA 1201
Pro His Lys Ser Ser Ala Asp Cys Ile Val Ser Gly Phe His Ile Pro
38S 390 395
CGG GGC ACA ATG TTG CTA GTG AAC ACA TGC AGC ATG AAT AGA AAT CCA 1249
Arg Gly Thr Met Leu Leu Val Asn Thr Trp Ser Met Asn Arg Asn Pro
400 405 410
AGA TTA TGG AAC GAA CCA GAG AAA TTC ATA CCA GAA AGA TTT G11A GGA
Leu Trp Lys Glu Pro Glu Lys Phe Ile Pro Glu Arg Phe Glu Gly
415 420 425 430
GGA GAA AAT ACT GAA GGG TGT AAC TAT AAA TTG CCT CCT TTC GGT GCA 1345
Gly Glu Asn Thr Glu Gly Cys Asn Tyr Lys Leu Leu Pro Phe Gly Ala
435 440 445
GGA AGG CGG GCT TGT CCG GGG GCC GGT GTG GCG ARA CGA ATG GTA GGA 1393
Gly Arg Arg Ala Gys Pro Gly Ala Gly Val Ala Lys Arg Met Val Gly
450 455 460
PL 194 095B1
CTC ACT TTA GGT GCA TTG ATT CAG TGT TTT GAG TGG GAA AGA ATT GGC 1441
Leu Thr Leu 465 Gly Ala Leu Ile Gin 470 Cys Phe Glu Trp Glu 475 Arg Ile Gly
GAA GAA GAA ATA GAT TTG AGT GAA GGA ACA GGT CTT ACT ATG CCA AAA 1489
Glu Glu 480 Glu Ile Asp Leu Ser 485 Glu Gly Thr Gly Leu 490 Thr Met Pro Lys
GAT TTC CTT TGG AAG TAATATGCAA ACCTCGGCAA AACATGATTAA ACTTTCTTTC 1544
Asp Phe Leu Trp Lys
495
TACATTGTTA TAAAAGGTTG GTTTCTTTGC AGGTGCCAAC CCTAATTCAA ATATCGCATT 1604 TTTTCCCTGC AACCCAGCTG CTAACCAAAT ATCACTGTTT CTCATTATTC CTTATATAAA 1664 ACCTTAAAGC ACTATTTGCC TCCTAAAAAA AAAA 1698

Claims (33)

1. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego lub cząsteczka do niej komplementarna, kodująca epoksygenazę, będącą polipeptydem monooksygenazy o funkcji mieszanej zdolnej do katalizowania epoksydacji wiązania węgiel-węgiel w cząsteczce kwasu tłuszczowego, znamienna tym, że obejmuje sekwencję aminokwasów zawierającą trzy motywy o wysokiej zawartości histydyny, a mianowicie:
(i) His-(Xaa)3-4-His;
(ii) His-(Xaa)2-3-His-His, oraz (iii) His-(Xaa)2-3-His-His,
2. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1, znamienna tym, że wiązanie węgiel-węgiel jest wiązaniem podwójnym znajdującym się w cząsteczce nienasyconego kwasu tłuszczowego.
3. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że wspomnianą epoksygenazą jest enzym D6-epoksygenaza, enzym D9-epoksygenaza, enzym D12-epoksygenaza lub enzym 15D-epoksygenaza.
4. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1, znamienna tym, że pochodzi z rośliny.
5. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1, znamienna tym, że roślina jest wybrana z grupy obejmującej Crepis spp., Euphorbia spp., Chrysanthemum spp. i Vernonia spp.
6. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 4, znamienna tym, że wspomnianą rośliną jest roślina wytwarzająca wysoki poziom kwasu wernolowego.
7. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 5, znamienna tym, że roślina jest wybrana z grupy obejmującej Crepis biennis, Crepis aurea, Crepis conyzaefolia, Crepis intermedia, Crepis occidentalis, Crepis palaestina, Crepis vesicaria i Crepis xancitha i Vernonia galamensis.
8. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1, znamienna tym, że obejmuje sekwencję nukleotydów identyczną w co najmniej 65% z którąkolwiek z sekwencji SEQ ID NO NO: 1, 3 lub 5, albo z sekwencję komplementarną do niej.
9. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1, znamienna tym, że jest zdolna do hybrydyzacji w co najmniej średnich warunkach z sekwencją SEQ ID NO NO: 1, 3 lub 5 albo sekwencją komplementarną do niej.
10. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1, znamienna tym, że obejmuje sekwencję nukleotydów przedstawioną w SEQ ID NO: 1, 3 lub 5, lub sekwencja nukleotydowa komplementarna do niej albo co najmniej około 20 przylegających nukleotydów tej sekwencji.
PL 194 095B1
11. Konstrukt genetyczny, znamienny tym, że obejmuje wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zdefiniowaną w zastrz. 1, operatywnie połączoną z sekwencją promotorową, przy czym wspomniana cząsteczka kwasu nukleinowego jest zdolna do ulegania transkrypcji w orientacji sensownej lub antysensownej względem naturalnie występującego w przyrodzie kierunku transkrypcji in vivo genu epoksygenazy monooksygenazy o funkcji mieszanej.
12. Sposób dokonywania zmiany poziomu epoksykwasów tłuszczowych w komórce, tkance, narządzie, organizmie nie-człoweka lub drobnoustroju, znamienny tym, że wprowadza się cząsteczkę sensowną, antysensowną, rybozymową lub ko-supresorową, obejmującą wyizolowaną cząsteczkę kwasu jak zdefiniowano w zastrz. 1, do komórki, tkanki, narządu lub organizmu nie-człowieka i inkubuje się wspomnianą komórkę w czasie i w warunkach wystarczających do zajścia ekspresji wspomnianej cząsteczki sensownej, antysensownej, robozomowej lub ko-supresorowej.
13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że etap wprowadzania sensownej, antysensownej, rybozymowej lub ko-supresorowej cząsteczki obejmuje stabilną transformację komórki, tkanki, narządu lub organizmu nie-człowieka sensowną, antysensowną, rybozomową lub kosupresorową cząsteczką.
14. Sposób wytwarzania w komórce rekombinantowego, enzymatycznie aktywnego polipetydu monooksygenazy o funkcji mieszanej epoksygenazy, znamienny tym, że przeprowadza się hodowlę komórki zawierającej wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego zdefiniowaną w zastrz. 1, w czasiei w warunkach wystarczających do zajścia ekspresji.
15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że przeprowadza się dodatkowy pierwszy etap transformacji komórki, z udziałem wyizolowanej cząsteczki kwasu nukleinowego.
16. Sposób wytwarzania w komórce rekombinantowego, enzymatycznie aktywnego polipeptydu monooksygenazy o funkcji mieszanej epoksygenazy, znamienny tym, że:
(i) wytwarza się konstrukt genetyczny obejmujący wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego jak zdefiniowano w zastrz. 1, zlokalizowaną operatywnie pod kontrolą promotora zdolnego do napędzania ekspresji wspomnianej sekwencji genetycznej we wspomnianej komórce, oraz, ewentualnie, wzmacniacza ekspresji:
(ii) transformuje się wspomniany konstrukt genetyczny do wspomnianej komórki; oraz (iii) selekcjonuje się transformanty z wysokim poziomem ekspresji funkcjonalnej epoksygenazy, kodowanej przez tą sekwencję genetyczną.
17. Sposób wytwarzania w roślinie transgenicznej rekombinantowego, enzymatycznie aktywnego polipeptydu monooksygenazy o funkcji mieszanej epoksygenazy, znamienny tym, że:
(i) wytwarza się konstrukt genetyczny obejmujący wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego jak zdefiniowano w zastrz. 1, zlokalizowaną operatywnie pod kontrolą specyficznego względem nasion promotora oraz, ewentualnie, elementu wzmacniacza ekspresji, przy czym wspomniana sekwencja genetyczna zlokalizowana jest w górę od sekwencji terminatora transkrypcji;
(ii) transformuje się wspomniany konstrukt genetyczny do komórki lub tkanki wspomnianej rośliny; oraz (iii) selekcjonuje się transformanty, u których, w nasionach, dochodzi do wysokiego poziomu ekspresji funkcjonalnej epoksygenazy, kodowanej przez sekwencję tą genetyczną.
18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że jako roślinę stosuje się gatunki roślin nasionach oleistych, normalnie produkujące wysoki poziom kwasu linolowego.
19. Sposób według zastrz. 17 lub 18, znamienny tym, że jako roślinę stosuje się roślinę wybraną z grupy obejmującej: len Linola®, rzepak, słonecznik, krokosz barwierski, soję, siemię lniane, sezam, nasiona bawełny, orzechyziemne,palmęoliwnąlubpalmę olejową.
20. Polipeptyd rekombinantowy monooksygenazy o funkcji mieszanej epoksygenazy, znamienny tym, że obejmuje sekwencję aminokwasówprzedstawioną w sekwencji SEQ IDNO NO: 2, 4 lub6,lubktóryjestidentycznyztąsekwencjąwco najmniejw50%.
21. Sposób wytwarzania epoksydowanego kwasu tłuszczowego w komórce, tkance, narządzie, organizmienie-człowiekalubdrobnoustroju, znamienny tym, że inkubuje się komórkę, tkankę, narząd lub organizm, u których dochodzi do ekspresji rekombinantowego polipeptydu jak zdefiniowano w zastrz. 20, z kwasem tłuszczowym stanowiącym substrat, w czasie i w warunkach wystarczających do przekształcenia co najmniej jednego wiązania węgiel-węgiel wspomnianego substratu w grupę epoksydową.
PL 194 095B1
22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że jako kwas tłuszczowy stanowiący substrat stosuje się nienasycony kwas tłuszczowy, a wiązanie węgiel-węgiel poddawane epoksydowaniu jest podwójnymwiązaniem węgiel-węgiel.
23. Sposób według zastrz. 21 albo 22, znamienny tym, że jako kwas tłuszczowy stanowiący substrat stosuje się kwas wybrany z grupy obejmującej kwas palmitolejowy, kwas oleinowy, kwas linolowy, kwaslinolenowy, kwas9,15- oktadekadienowy i kwas arachidonowy.
24. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że epoksydowaniu poddaje się wiązanie węgiel-węgiel D6 lub wiązanie węgiel-węgiel D9, lub wiązanie węgiel-węgiel D12 lub wiązanie węgielwęgiel D15.
25. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 21, znamienny tym, że jako epoksydowany kwas tłuszczowy wytwarza się kwas wernolowy.
26. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że przeprowadza się dodatkowy pierwszy etap transformacji lub transfekcji komórki, tkanki, narządu lub organizmu nie człowieka z udziałem cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej rekombinantową monooksygenazę o funkcji mieszanej epoksygenazę.
27. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że komórka, narząd, tkanka organ lub organizm nie-człowieka, wktórymzachodzi ekspresjarekombinantowej epoksygenazy, pochodzi z bakterii, drożdży, grzyba, pleśni, owada, rośliny wyższej, ptaka lub ssaka nie-człowieka.
28. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że drożdżami, rośliną, grzybem lub pleśnią są oleiste drożdże, oleista roślina, oleisty grzyb lub oleistapleśń.
29. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że jako roślinę stosuje się roślinę oleistą, w której normalnie nie zachodzi na wysokim poziomie ekspresja rekombinantowej monooksygenazy o funkcji mieszanej epoksygenazy.
30. Sposób według zastrz. 29, znamienny tym, że jako roślinę oleistą, stosuje się roślinę wybraną z grupy obejmującej, między innymi, len Linola®, rzepak, słonecznik, krokosz barwierski, soję, siemięlniane,sezam,nasionabawełny, orzechyziemne, palmęolinąlubpalmęolejową.
31. Roślina transformowana wyizolowaną cząsteczką kwasu nukleinowego jak zdefiniowano w zastrz. 1, albo pochodząca od niej komórka, tkanka lub organ, lub potomstwo wspomnianej rośliny, które także zawierające wspomnianą cząsteczkę kwasu nukleinowego.
32. Roślina transformowana, znamienna tym, że jest zdolna do ekspresji rekombinantowego polipeptydu jak zdefiniowano w zastrz. 20 albo pochodząca od niej komórka, tkanka lub organ, lub potomstwo wspomnianej rośliny, także zdolne do ekspresji wspomnianego polipeptydu rekombinantowego.
33. Roślina lub pochodząca od niej komórka, tkanka lub organ, lub jej potomstwo jak zdefiniowano w zastrz. 32 stanowiąca lub pochodząca od lnu Linola®, rzepaku, słonecznika, krokosza barwierskiego, soi, siemienia lnianego, sezamu, nasion bawełny, orzecha ziemnego, palmy oliwnej lub palmy olejowej.
PL98336292A 1997-04-15 1998-04-09 Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, konstrukt genetyczny, sposób dokonywania zmian poziomu epoksykwasów tłuszczowych, sposób wytwarzania rekombinantowego polipeptydu monooksygenazy w komórce, sposób wytwarzania rekombinantowego polipeptydu monooksygenazy w roślinie transgenicznej, polipeptydrekombinantowy, sposób wytwarzania epoksydowanegokwasu tłuszczowego, roślina transformowana i roślina lub pochodząca z niej komórka PL194095B1 (pl)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AUPO6226A AUPO622697A0 (en) 1997-04-15 1997-04-15 Plant fatty acid epoxygenase genes and uses therefor IIa
AUPO6223A AUPO622397A0 (en) 1997-04-15 1997-04-15 Plant fatty acid epoxygenase genes and uses therefor Ia
US4370697P 1997-04-16 1997-04-16
US5040397P 1997-06-20 1997-06-20
PCT/AU1998/000246 WO1998046762A1 (en) 1997-04-15 1998-04-09 Plant fatty acid epoxygenase genes and uses therefor

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL336292A1 PL336292A1 (en) 2000-06-19
PL194095B1 true PL194095B1 (pl) 2007-04-30

Family

ID=27424435

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL98336292A PL194095B1 (pl) 1997-04-15 1998-04-09 Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, konstrukt genetyczny, sposób dokonywania zmian poziomu epoksykwasów tłuszczowych, sposób wytwarzania rekombinantowego polipeptydu monooksygenazy w komórce, sposób wytwarzania rekombinantowego polipeptydu monooksygenazy w roślinie transgenicznej, polipeptydrekombinantowy, sposób wytwarzania epoksydowanegokwasu tłuszczowego, roślina transformowana i roślina lub pochodząca z niej komórka

Country Status (18)

Country Link
US (1) US6329518B1 (pl)
EP (1) EP0975765B1 (pl)
JP (1) JP4108765B2 (pl)
KR (1) KR100711074B1 (pl)
CN (1) CN100482797C (pl)
AT (1) ATE342361T1 (pl)
BR (1) BR9808676B1 (pl)
CA (1) CA2286895C (pl)
DE (1) DE69836133T2 (pl)
DK (1) DK0975765T3 (pl)
EA (1) EA004568B1 (pl)
ES (1) ES2275301T3 (pl)
IL (2) IL132393A0 (pl)
MX (1) MX224646B (pl)
NZ (1) NZ500542A (pl)
PL (1) PL194095B1 (pl)
TR (1) TR199902583T2 (pl)
WO (1) WO1998046762A1 (pl)

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06240940A (ja) * 1993-02-22 1994-08-30 Takigen Seizo Kk 掛金装置
US6310194B1 (en) 1994-09-26 2001-10-30 Carnegie Institution Of Washington Plant fatty acid hydroxylases
US7589253B2 (en) * 1997-04-15 2009-09-15 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Fatty acid epoxygenase genes from plants and uses therefor in modifying fatty acid metabolism
BR9910125A (pt) * 1998-04-16 2003-02-25 Pierre Broun Interconversão de dessaturases e hidroxilases de ácido graxo de plantas
DE19941609A1 (de) * 1999-09-01 2001-03-08 Inst Pflanzenbiochemie Ipb Fettsäure-Desaturase-Gen aus Pflanzen
CA2408357A1 (en) * 2000-05-09 2001-11-15 Bioriginal Food & Science Corp. Production of conjugated linoleic and linolenic acids in plants
US7214520B2 (en) 2000-07-18 2007-05-08 National Research Council Of Canada Cloning, sequencing and expression of a comamonas cyclopentanone 1,2-monooxygenase-encoding gene in Escherichia coli
MXPA03000507A (es) * 2000-07-21 2003-10-06 Du Pont Enzima de citocromo p450 asociada con la sintesis de grupos delta12-epoxi en acidos grasos de plantas..
US6485949B1 (en) * 2001-01-29 2002-11-26 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Epoxidation of carbon-carbon double bond with membrane bound peroxygenase
EP1578987A2 (en) * 2001-08-03 2005-09-28 Diversa Corporation Epoxide hydrolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US20040157803A1 (en) * 2002-03-04 2004-08-12 Williams Deryck J. Nematicidal fatty acid and fatty acid ester related compounds
US6887900B2 (en) 2002-03-04 2005-05-03 Divergence, Inc. Nematicidal compositions and methods
US7364901B2 (en) 2002-07-15 2008-04-29 University Of Kentucky Research Foundation Recombinant Stokesia epoxygenase gene
US7365240B2 (en) 2003-02-05 2008-04-29 Divergence, Inc. Nucleic acids encoding anthelmintic agents and plants made therefrom
CN1310674C (zh) * 2003-04-30 2007-04-18 比奥滕普特公司 治疗重症急性呼吸综合征的药物组合物
WO2005014834A1 (en) * 2003-07-31 2005-02-17 The University Of York Fatty acid biosynthesis 3
WO2005014832A1 (en) * 2003-07-31 2005-02-17 The University Of York Fatty acid biosynthesis 4
AU2003255742A1 (en) * 2003-07-31 2005-02-25 The Universtiy Of York Fatty acid biosynthesis 1
US7368629B2 (en) * 2004-02-04 2008-05-06 Divergence, Inc. Nucleic acids encoding anthelmintic agents and plants made therefrom
AU2005323136A1 (en) * 2004-12-20 2006-07-13 Basf Plant Science Gmbh Nucleic acid molecules encoding fatty acid desaturase genes from plants and methods of use
ES2550623T3 (es) * 2005-05-23 2015-11-11 Blue Horse Labs, Inc. Cártamo con ácido gamma linolénico elevado
AU2009240794A1 (en) * 2008-04-25 2009-10-29 Commonwealth Scientific Industrial Research Organisation Polypeptides and methods for producing triacylglycerols comprising modified fatty acids
US8431772B1 (en) * 2008-11-19 2013-04-30 University Of Kentucky Research Foundation Diacylglycerol acyltransferase sequences and related methods
US9249082B2 (en) 2010-02-09 2016-02-02 King Abdulaziz City for Science and Technology (KACST) Synthesis of dimethyl carbonate from carbon dioxide and methanol
AU2012324024B2 (en) 2011-12-27 2016-06-16 Nuseed Global Innovation Ltd Processes for producing lipids
SG11201604871VA (en) 2013-12-18 2016-07-28 Commw Scient Ind Res Org Lipid comprising long chain polyunsaturated fatty acids
KR102527795B1 (ko) 2014-06-27 2023-05-02 커먼웰쓰 사이언티픽 앤 인더스트리알 리서치 오거니제이션 도코사펜타에노산을 포함하는 지질
MX2017000109A (es) 2014-07-07 2017-05-23 Commw Scient Ind Res Org Procesos para producir productos industriales de lipidos vegetales.
US11913006B2 (en) 2018-03-16 2024-02-27 Nuseed Global Innovation Ltd. Plants producing modified levels of medium chain fatty acids
EP3543323A1 (de) * 2018-03-21 2019-09-25 Bergolin GmbH & Co. KG Verwendung eines insektenöls in harzen für beschichtungs- und klebstoffzusammensetzungen
CN116212948B (zh) * 2023-02-14 2024-07-09 四川九天五洋新材料有限责任公司 一种丙烯气相环氧化成型催化剂及其制备方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE115999T1 (de) 1987-12-15 1995-01-15 Gene Shears Pty Ltd Ribozyme.
PH31293A (en) * 1991-10-10 1998-07-06 Rhone Poulenc Agrochimie Production of y-linolenic acid by a delta6-desaturage.
US5668292A (en) * 1994-09-26 1997-09-16 Carnegie Institution Of Washington Use of plant fatty acyl hydroxylases to produce hydroxylated fatty acids and derivatives in plants
US5834293A (en) * 1994-09-28 1998-11-10 Vanderbilt University Cytochrome P450 arachidonic acid epoxygenase genetic mutation associated with hypertension
SE9601236D0 (sv) 1996-03-29 1996-03-29 Sten Stymne Novel plant enzyme and use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
JP2001518797A (ja) 2001-10-16
EP0975765A1 (en) 2000-02-02
IL132393A (en) 2010-11-30
EA004568B1 (ru) 2004-06-24
WO1998046762A1 (en) 1998-10-22
BR9808676A (pt) 2000-07-11
CA2286895C (en) 2010-07-13
DE69836133T2 (de) 2007-08-16
EP0975765B1 (en) 2006-10-11
DK0975765T3 (da) 2007-02-19
CA2286895A1 (en) 1998-10-22
CN100482797C (zh) 2009-04-29
BR9808676B1 (pt) 2010-10-05
PL336292A1 (en) 2000-06-19
US6329518B1 (en) 2001-12-11
EP0975765A4 (en) 2002-09-25
EA199900933A1 (ru) 2000-04-24
DE69836133D1 (de) 2006-11-23
MX9909476A (es) 2000-04-30
TR199902583T2 (xx) 2000-05-22
IL132393A0 (en) 2001-03-19
KR100711074B1 (ko) 2007-04-26
ES2275301T3 (es) 2007-06-01
KR20010006468A (ko) 2001-01-26
NZ500542A (en) 2000-11-24
JP4108765B2 (ja) 2008-06-25
CN1257541A (zh) 2000-06-21
MX224646B (es) 2004-12-03
ATE342361T1 (de) 2006-11-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL194095B1 (pl) Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, konstrukt genetyczny, sposób dokonywania zmian poziomu epoksykwasów tłuszczowych, sposób wytwarzania rekombinantowego polipeptydu monooksygenazy w komórce, sposób wytwarzania rekombinantowego polipeptydu monooksygenazy w roślinie transgenicznej, polipeptydrekombinantowy, sposób wytwarzania epoksydowanegokwasu tłuszczowego, roślina transformowana i roślina lub pochodząca z niej komórka
US7834248B2 (en) Plant seed comprising vernolic acid
MXPA99009476A (en) Plant fatty acid epoxygenase genes and uses therefor
US7154026B2 (en) Manipulation of cellulose and/or β-1,4,-glucan
EP1390381B1 (en) Lipid metabolism regulators in plants
Wang et al. The soybean Dof‐type transcription factor genes, GmDof4 and GmDof11, enhance lipid content in the seeds of transgenic Arabidopsis plants
AU2003245878B2 (en) Methods for increasing oil content in plants
CA2522618A1 (en) Use of genes for increasing the oil content in plants
EP0977866B1 (en) Fatty acid modifying enzymes from developing seeds of vernonia galamenensis
KR100854607B1 (ko) 식물 스테롤 아실전달효소
AU2003219899A1 (en) Process for the production of unsaturated fatty acids
US20060078973A1 (en) Process for the production of unsaturated fatty acids
AU734232B2 (en) Plant fatty acid epoxygenase genes and uses therefor
US20050170478A1 (en) Expression of phospholipid:diacylglycerine acyltranssferase (pdat) for the production of plant storage lipids with polyunsaturated fatty acids
PT975765E (pt) Genes de apoxigenase de ácido gordo vegetal e suas utilizações
WO2000003006A1 (en) Sucrose biosynthesis genes and uses therefor
AU4762499A (en) Sucrose biosynthesis genes and uses therefor

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20100409