ES2550623T3 - Cártamo con ácido gamma linolénico elevado - Google Patents

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ES2550623T3 ES06771043.4T ES06771043T ES2550623T3 ES 2550623 T3 ES2550623 T3 ES 2550623T3 ES 06771043 T ES06771043 T ES 06771043T ES 2550623 T3 ES2550623 T3 ES 2550623T3
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Abstract

Una planta de cártamo transgénica que comprende un promotor recombinante funcional en dicha planta de cártamo en donde dicho promotor está operativamente unido a una secuencia de ADN recombinante que codifica una Δ6-5 desaturasa de Saprolegnia diclina con SEQ ID NO: 10, en donde dicha planta de cártamo produce semillas y en donde el aceite producido de dichas semillas comprende ácido gamma-linolénico (GLA) a un nivel del 45%-50% o mayor en peso.

Description

Cártamo con ácido gamma linolénico elevado
Antecedentes de la invención
El ácido gamma-linolénico (GLA) es un ácido graso esencial en la familia omega-6 que se encuentra principalmente en aceites vegetales. El GLA se sintetiza a partir de ácido linoleico (LA) a través de la acción de la enzima delta-seis desaturasa (A6-desaturasa). Los efectos beneficiosos del GLA derivan del hecho de que el GLA sirve como el precursor a un número de otros ácidos grasos esenciales tales como ácido araquidónico, que es un precursor de prostaglandinas y otras moléculas fisiológicamente importantes.
Los ácidos grasos insaturados tal como los ácidos linoleico (C18 Δ 9, 12) y α-linolénico (C18 Δ 9, 12, 15) son constituyentes alimenticios esenciales que no pueden ser sintetizados por vertebrados porque mientras que las células de vertebrados pueden introduce dobles enlaces en la posición Δ9 de ácidos grasos, no pueden introducir dobles enlaces adicionales entre el doble enlace Δ9 y el extremo metilo de la cadena de ácido graso. Puesto que se requieren para sintetizar otros productos, los ácidos linoleico y α-linolénico son ácidos grasos esenciales, que habitualmente se obtienen de fuentes vegetales. Los mamíferos pueden convertir LA en GLA (C18, Δ 6, 9, 12) que a su vez se puede convertir a ácido araquidónico (20:4), un ácido graso críticamente importante ya que es un precursor esencial de la mayoría de las prostaglandinas.
El suministro en la dieta de LA, en virtud de su conversión enzimática a GLA y después a ácido araquidónico, podría satisfacer la necesidad nutricional para GLA y ácido araquidónico. Sin embargo, el consumo de grasas que están menos altamente insaturadas, tal como LA, se ha correlacionado con riesgos de salud tal como hipercolesterolemia, ateroesclerosis y otros trastornos clínicos que aumentan la susceptibilidad a enfermedad coronaria. En contraste, el consumo de grasas que son más altamente insaturadas se ha asociado con concentración de colesterol en sangre disminuida y riesgo reducido de ateroesclerosis. Se ha mostrado que el consumo del ácido graso insaturado GLA es particularmente beneficioso. Por tanto, el consumo del GLA más insaturado se preferiría sobre el consumo de LA. Por tanto, sería deseable generar fuentes adicionales ricas en GLA para consumo humano.
GLA actúa como un precursor para la formación de eicosanoides incluyendo prostaglandinas. Las prostaglandinas son compuestos de tipo hormonal vitales que refuerzan las membranas celulares y sirven como moléculas de señalización celular. Se han observado efectos beneficiosos de GLA en seres humanos y animales. GLA puede ayudar a regular la presión sanguínea, reducir la inflamación y mejorar la función inmunitaria. El suplemento de GLA puede beneficiar una amplia gama de enfermedades y afecciones incluyendo lupus, cáncer, alergias, artritis y colitis ulcerosa. GLA puede mejorar la eficacia de fármacos usados para tratar cáncer. GLA puede ayudar a reducir los síntomas del síndrome premenstrual y menopausia; a mejorar la salud de la piel y a tratar eczema, acné, rosácea, psoriasis y caspa; a mejorar trastornos psiquiátricos y neurológicos incluyendo enfermedad de Alzheimer, corea de Huntington, esclerosis múltiple, trastorno de hiperactividad con falta de atención, depresión y fenómeno de Raynaud; a bloquear neuropatía diabética; a tratar cirrosis del hígado; a mejorar afecciones de ojos secos tal como el síndrome de Sjogren; y a tratar enfermedades cardiovasculares, osteoporosis, hiperlipidemia y otros síntomas asociados con el envejecimiento. Además, GLA se ha implicado como un estimulador para que el cuerpo queme grasa parda. La grasa parda es la grasa corporal interna que rodea los órganos vitales y actúa fábrica que quema grasa, usando calorías para calor más que almacenarlas como grasa blanca. El quemar la grasa parda es importante para el mantenimiento del peso corporal ideal. El consumo aumentado de GLA puede, por tanto, ayudar a estimular el proceso del metabolismo de la grasa parda.
Los suplementos de GLA existentes típicamente derivan de fuentes vegetales que tienen naturalmente más GLA tal como aceite de onagra, aceite de grosella negra y aceite de borraja. Sin embargo, GLA representa una fracción relativamente pequeña de los ácidos grasos totales en estas fuentes naturales. Solo aproximadamente el 7-10% (onagra), el 14-19% (aceite de grosella negra) y el 20-26% (aceite de borraja) de los ácidos grasos de estas fuentes están disponibles como GLA. A pesar de los amplios beneficios de salud del GLA, su uso está actualmente limitado por el alto coste y la baja concentración de los suplementos de GLA existentes. Un adulto medio necesitaría consumir 10 o más cápsulas de suplementos de GLA existentes para recibir sus beneficios de salud óptimos. Sería útil tener una fuente menos cara, fácilmente disponible de aceite que tuviera más GLA que los aceites de especialidad naturales actualmente usados para suplementos de GLA. Tal fuente permitiría a los consumidores recibir los beneficios de salud óptimos de GLA, mientras se gasta menos dinero en suplementos y se ingiere significativamente menos aceite total y menos calorías. Tal fuente se propuso en el documento WO 98/46763 usando plantas transgénicas que expresan Δ6 desaturasa.
El cártamo es un cultivo agrícola comercialmente importante. El cártamo se cultivó por primera vez en Oriente Próximo hace miles de años como una fuente de colorante y otros productos que podrían derivar de la planta. El cártamo en este siglo se ha utilizado como fuente de aceites comestibles. El cártamo se introdujo por primera vez en los Estados Unidos en la década de 1930 como fuente de aceites comestibles. Desde entonces, se han desarrollado variedades con contenido mejorado en aceite. El aceite de cártamo comprende principalmente los ácidos grasos palmítico, esteárico, oleico y LA. Los ácidos palmítico (C16:0) y esteárico (C18:0) son ácidos graos saturados; oleico
(C18:1) y linoleico (C18:2) son ácidos grasos insaturados. Sin embargo, las plantas de cártamo naturalmente producen solo cantidades despreciables de GLA.
Como tal, las plantas de cártamo transgénicas con semillas que contengan niveles más altos de GLA que las naturales tendrían gran utilidad.
Breve compendio de las formas de realización preferidas de la invención
La presente invención se dirige a plantas de cártamo que producen GLA. En un aspecto, se describen plantas de cártamo que producen semillas que incluyen al menos el 45-50% en peso de GLA, las semillas de tales plantas y el aceite de tales plantas. En formas de realización preferidas, el aceite tendrá aproximadamente el 45-50, 50-55 o el 55-60% o mayor en peso de GLA.
En un aspecto, se describen plantas de cártamo que contienen construcciones genéticas que incluyen secuencias de ácidos nucleicos que dirigen la expresión de una o más enzimas desaturasas. En un aspecto, la A6-desaturasa se usa sola para generar GLA en plantas que producen principalmente LA. Las construcciones incluyen secuencias codificantes para estas enzimas y generalmente incluyen secuencias promotora y de terminación. En una forma de realización ventajosa, el promotor es un promotor específico de semilla.
En una forma de realización, se describe una planta de cártamo transgénica que contiene un promotor recombinante funcional en una planta de cártamo, operativamente unido a una secuencia de ADN recombinante que codifica una Δ6-desaturasa, en la que la planta de cártamo produce semillas que contienen al menos el 45-50% en peso de GLA. La secuencia que codifica Δ6-desaturasa puede derivar de la planta Saprolegnia diclina. El promotor usado puede ser un promotor específico de semilla tal como un promotor de oleosina o un promotor de linina. Esta forma de realización también proporciona una semilla derivada de estas plantas transgénicas en la que los niveles de GLA en la semilla son al menos el 45-50% en peso del contenido total de ácido graso de la semilla. Esta forma de realización también proporciona aceite producido de las semillas de estas plantas transgénicas. Tal aceite puede contener el 45-50% o más en peso de GLA.
En aún otra forma de realización, se proporciona un método para producir GLA en una semilla de cártamo. El método incluye los pasos de cultivar una planta de cártamo que contiene un promotor recombinante funcional en una planta de cártamo, operativamente unido a una secuencia de ADN recombinante que codifica una Δ6-desaturasa, y cultivar la planta de cártamo en condiciones en las que se expresa la secuencia de Δ6-desaturasa. La secuencia que codifica Δ6-desaturasa puede derivar de la planta Saprolegnia diclina. El promotor usado puede ser un promotor específico de semilla tal como un promotor de oleosina o un promotor de linina. Esta forma de realización también proporciona una semilla derivada de estas plantas transgénicas en la que los niveles de GLA en la semilla son al menos el 45-50% en peso del contenido total de ácido graso de la semilla. Esta forma de realización también proporciona aceite producido de las semillas de estas plantas transgénicas. Tal aceite puede contener el 45-50% o más en peso de GLA.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra la ruta para la biosíntesis de GLA desde la conversión de OA en LA, que a su vez se convierte en GLA mediante la acción consecutiva de las enzimas Δ6-y Δ12-desaturasa como se muestra en la figura. El GLA se puede convertir en ácido araquidónico, que es un precursor para un número de prostaglandinas, leucotrienos y otras moléculas fisiológicamente activas.
La figura 2 muestra los alineamientos de secuencia de varias Δ6-desaturasas vegetales (SEQ ID NO: 46) incluyendo una secuencia consenso.
La figura 3 muestra los alineamientos de secuencia de varias Δ6-desaturasas de hongos (SEQ ID NO: 7-11) incluyendo una secuencia consenso.
La figura 4 muestra una representación lineal de regiones conservadas en Δ6-desaturasas.
La figura 5 muestra los alineamientos de secuencia de varias Δ12-desaturasas vegetales (SEQ ID NO: 12-15) incluyendo una secuencia consenso.
La figura 6 muestra los alineamientos de secuencia de varias Δ12-desaturasas de hongos (SEQ ID NO: 16-19) incluyendo una secuencia consenso.
La figura 7 muestra una representación lineal de regiones conservadas en Δ12-desaturasas.
La figura 8 muestra el plásmido pSBS4766 para la expresión de Δ6-y Δ12-desaturasa del organismo M alpina. Se muestran varias características de la construcción de expresión incluyendo promotores, secuencias de terminación y
los genes de resistencia y marcadores. El marcador seleccionable en plantas en este plásmido es pat, la fosfinotricin acetil transferasa de Streptomyces viridochromogenes. El marcador bacteriano es SpecR.
La figura 9 muestra el plásmido pSBS4119 para la expresión de Δ6-desaturasa del organismo S. diclina. Se muestran varias características de la construcción de expresión incluyendo promotores, secuencias de terminación y los genes de resistencia y marcadores. El marcador seleccionable en plantas en este plásmido es pat, la fosfinotricin acetil transferasa de Streptomyces viridochromogenes. El marcador bacteriano es SpecR.
La figura 10 muestra el plásmido pSBS4763 para la expresión de Δ6-desaturasa del organismo M alpina. Se muestran varias características de la construcción de expresión incluyendo promotores, secuencias de terminación y los genes de resistencia y marcadores. El marcador seleccionable en plantas en este plásmido es pat, la fosfinotricin acetil transferasa de Streptomyces viridochromogenes. El marcador bacteriano es SpecR.
Descripción detallada
Para asegurar un entendimiento completo de la invención, se proporcionan las siguientes definiciones no limitantes.
Δ6-desaturasa es una enzima que introduce un doble enlace entre los carbonos 6 y 7 desde el extremo carboxilo de una molécula de ácido graso.
Δ12-desaturasa es una enzima que introduce un doble enlace entre los carbonos 12 y 13 desde el extremo carboxilo de una molécula de ácido graso.
Como se usa en el presente documento, la abreviatura “GLA” se usa para referirse a ácido gamma-linolénico.
El porcentaje en peso se pretende que indique el contenido de un ácido graso particular en una semilla y/o aceite de la semilla basado en peso. Por tanto, el porcentaje en peso de GLA o “GLA en peso” se calcula basado en el peso de GLA dividido por el peso de ácidos grasos totales multiplicado por 100%. Por ejemplo, “niveles de GLA al 5% en peso” o “el 5% en peso de GLA” se refiere a semillas o aceite de semillas que contiene 5 gramos de GLA y 100 gramos de ácido graso total.
Introducción
Como se muestra en la figura 1, GLA se produce en una ruta bioquímica en donde OA se convierte a LA. LA a su vez se convierte a GLA mediante la acción de ácido graso desaturasas, enzimas que introducen dobles enlaces en sitios específicos en la cadena de carbono del ácido graso. Cuando estas enzimas se transfieren a células que producen OA o LA, se produce GLA.
El cártamo es una planta cultivada comercialmente importante y es una fuente valiosa de aceite vegetal. Puesto que las plantas de cártamo no producen GLA de forma natural en cantidad significativa, no sería un candidato obvio para la producción de este ácido graso. Por ejemplo, puesto que las plantas de cártamo no producen normalmente GLA, se podría esperar que la expresión de altos niveles de este ácido graso no endógeno pudiera ser dañina para la planta porque el GLA exógenamente introducido interferiría con la función de los ácidos grasos endógenos. Se ha encontrado sorprendentemente que GLA se puede expresar en semillas de cártamo y que esta expresión se produce a niveles inesperadamente altos, incluso cuando se compara con otras plantas que expresan transgenes que están libres de las preocupaciones comentadas anteriormente.
Características de las enzimas desaturasas
La reacción catalizada por las desaturasas es:
R1-CH2-CH2-R2 + O2 + 2e + 2H+ + R1-CH=CH-R2 + 2 H2O.
Muchas desaturasas de ácidos grasos son metaloenzimas unidas a la membrana. Se cree que la mayoría contienen dos átomos de hierro en su sitio activo. Como se muestra en las figuras 2, 3, 5 y 6, las Δ6-y Δ12-desaturasas comparten un grado de identidad y similitud de secuencia en cada clase respectiva de enzimas. Como se muestra en las figuras 4 y 7 entre las regiones de conservación en la familia de desaturasas hay tres secuencias ricas en histidina (cajas de His) fuertemente conservadas con los motivos generales HXXXH, HXXHH y HXXHH o QXXHH. Estas cajas se requieren para la actividad enzimática y están separadas por dominios que atraviesan la membrana que se requieren para su correcta orientación en el sitio activo. Muchas enzimas incluyendo las Δ5-y Δ6desaturasas contienen una extensión N-terminal de tipo citocromo b5. Esto con frecuencia va acompañado por un cambio en la secuencia de la tercera caja de His a QXXHH. Los electrones adquiridos de la NADH citocromo b5 reductasa se transfieren al citocromo b5 o al dominio de citocromo b5 de la desaturasa y después al sitio activo de la desaturasa. La reacción oxidación/reducción mixta sigue a través de dos átomos de hierro que están estabilizados por la interacción con las cajas de histidina conservadas. Como se comenta posteriormente, estas características
estructurales y, en particular, los residuos conservados que hacen el sitio de unión a metal, están conservados a través de especies y son responsables para la función enzimática de esta clase de enzimas.
Fuentes de enzimas desaturasas
Para la producción de GLA, se requerirán una o más enzimas desaturasas dependiendo de la célula huésped y la disponibilidad de sustratos. Por ejemplo, en una planta que tiene cantidades abundantes de LA de forma natural, se requiere la Δ6-desaturasa para catalizar la conversión de LA a GLA. En plantas que tienen cantidades abundantes de OA de forma natural, pero no LA, se requiere una combinación de enzimas Δ12-y Δ6-desaturasas para generar GLA.
Las consideraciones para elegir un polipéptido desaturasa específico para usar incluyen la localización correcta y funcionamiento del polipéptido en el compartimento microsómico/retículo endoplásmico de la célula (estas enzimas están unidas a membrana y deben funcionar junto con la maquinaria biosintética de triglicéridos existente de la célula), si el polipéptido es una enzima limitante de la velocidad o un componente de la misma, si la desaturasa usada es esencial para la síntesis de un ácido graso poliinsaturado deseado y/o cofactores requeridos por el polipéptido. El polipéptido expresado preferiblemente tiene parámetros compatibles con el entorno bioquímico de su localización en la célula huésped. Por ejemplo, el polipéptido puede tener que competir por el sustrato con otras enzimas en la célula huésped. Por tanto, se consideran análisis de la Km y actividad específica del polipéptido en cuestión para determinar la idoneidad de un polipéptido determinado para modificar la producción de GLA en una célula huésped determinada. Por tanto, el polipéptido usado en una situación particular es uno que puede funcionar en las condiciones presentes en la célula huésped pretendida pero de otra manera puede ser cualquier polipéptido que tiene actividad desaturasa que tiene las características deseadas de ser capaz de modificar la producción relativa de GLA.
Se conocen un número de Δ6-y Δ12-desaturasas incluyendo las descritas en la patente en EE UU No. 6.635.451, documento WO02/081668, patente en EE UU No. 6.635.451, solicitud de patente en EE UU No. 2003/0167525, patente en EE UU No. 6.459.018, patente en EE UU No. 5.972.644, patente en EE UU No. 6.432.684, patente en EE UU No. 5.968.809, patente en EE UU No. 5.972.664, patente en EE UU No. 6.051.754, patente en EE UU No. 6.075.183, patente en EE UU No. 6.136.574, patente en EE UU No. 5.552.306, patente en EE UU No. 5.614.393, 5.663.068, patente en EE UU No. 5.689.050, patente en EE UU No. 5.789.220, patente en EE UU No. 6.355.861 y patente en EE UU No. 6.492.108. Entre las fuentes de Δ6-y Δ12-desaturasas útiles están las de plantas y hongos. Por ejemplo, las Δ6-y Δ12-desaturasas de los géneros Mucor, Saprolegnia diclina, Mortierella, Mortierella alpina, Conidiobolus, Pythium, Phytophthora, Penicillium, Porphyridium, Coidosporium, Mucor circinelloides, Fusarium, Aspergillus, Candida, Euphorbia, Diinorphoteca, Rhodotorula, Entomophthora, Thraustochytrium, Saprolegnia, Borago y Primula son útiles. También se pueden usar desaturasas de girasol, colza, arroz, musgo y C. elegans. Tales secuencias incluirán cajas ricas en histidina. Estas secuencias se pueden usar así como secuencias que tienen al menos el 80%, 85%, 90% o 95% de identidad basado en varios métodos de alineamiento bien conocidos en la técnica. También son útiles secuencias que hibridan con las secuencias anteriores en rigurosidad de alta a moderada. Las condiciones de hibridación y lavado que permiten la identificación de secuencias adicionales que corresponden a secuencias de desaturasas también se conocen bien en la técnica, algunas de las cuales se describen posteriormente.
Entre los métodos para el alineamiento de secuencias que se conocen bien en la técnica están los programas y algoritmos de alineamiento descritos en: Smith y Waterman, J Mol Biol 147:195, 1981; Needleman y Wunsch, J Mol Biol 48:443, 1970; Pearson y Lipman, PNAS 85:2444, 1988; Higgins y Sharp, Gene 73:237, 1988; Higgins y Sharp, Comput Appl Biosci 5:151, 1989; Corpet, Nucl Acids Res 16:10881, 1988; Huang, Genomics 14:18, 1992; y Pearson, Methods Mol Biol 24:307, 1994. Altschul et al., (Nature Genetics 6:119, 1994) presenta una consideración detallada de métodos de alineamiento de secuencias y cálculos de homología.
La NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J Mol Biol 215:403, 1990) está disponible de varias fuentes, incluyendo el Centro Nacional para Información en Biotecnología (NCBI, Bethesda, MD) y en la Internet, para su uso en relación con los programas de análisis de secuencias blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx. Se puede conseguir en el sitio Web del NCBI. Una descripción de cómo determinar la identidad de secuencia usando este programa está disponible en el sitio web del NCBI.
Se usó el programa AlignX de Vector NTI para generar las figuras 2, 3, 5 y 6. La figura 2 muestra un alineamiento de Δ6-desaturasas de un número de diferentes especies vegetales. La figura 3 muestra un alineamiento de desaturasas de un número de especies de hongos. Las figuras 5 y 6 muestran alineamientos de Δ12-desaturasas de un número de especies vegetales y de hongos, respectivamente. Estas figuras muestran el parentesco estructural y funcional de diferentes Δ6-y Δλ12-desaturasas en sus respectivas clases de enzimas. Cualquiera de las Δ6-o Δ12desaturasas mostradas en estas figuras se puede usar, así como otras que se pueden identificar usando los métodos o disponibles de otra forma en la técnica como correspondientes a Δ6-o Δ12-desaturasas. Esta invención también abarca modificaciones de desaturasas que aún retienen actividad o poseen actividad enzimática aumentada que se pueden obtener mediante mutagénesis al azar o dirigida.
El experto en la materia sabe bien que cualquiera de las secuencias divulgadas en el presente documento, así como otras conocidas en la técnica, y desaturasas previamente desconocidas se pueden aislar usando métodos de clonación convencionales tal como hibridación de ácidos nucleicos o PCR para uso en la presente invención.
Los ejemplos de condiciones de hibridación que se pueden usar para aislar secuencias de desaturasas incluyen los siguientes. Las condiciones rigurosas son dependientes de la secuencia y varían según los parámetros experimentales usados. Generalmente, se seleccionan condiciones rigurosas que sean aproximadamente de 5ºC a 20ºC menor que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (a la fuerza iónica y pH definidos) a la que el 50% de la secuencia diana hibrida con una sonda perfectamente coincidente. Las condiciones para la hibridación de ácidos nucleicos y el cálculo de la rigurosidad se pueden encontrar en Sambrook et al. (Molecular Cloning—A Laboratory Manual 2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, 1989) y Tijssen (Hybridization with Nucleic Acid Probes, Elsevier Science Ltd., Ámsterdam, 1993). Los ejemplos de factores que afectan a la hibridación de ácidos nucleicos incluyen: temperatura, condiciones de sal, la presencia de solventes orgánicos en las mezclas de hibridación, las longitudes y composiciones de bases de las secuencias que se van a hibridar y el grado de mal apareamiento de bases. Un ejemplo de condiciones muy rigurosas para hibridar una sonda a ADN unido a un filtro es SSC 5X, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 2%, ADN monocatenario 100 μg/ml a 55-65ºC durante 20 minutos y lavados en SSC 0,1X con SDS al 0,1% a 60-65ºC durante 20 minutos.
Alternativamente, se pueden diseñar cebadores de PCR para amplificar desaturasas particulares de interés si la secuencia del ADNc de la desaturasa se conoce. Además, se pueden diseñar cebadores de PCR para regiones conservadas de las desaturasas para aislar miembros adicionales de la familia. Los protocolos para realizar reacciones de PCR se conocen bien en la técnica y se describen en manuales tal como PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications por M. Innes et al., Academic Press, 1989.
Una vez que se han identificado secuencias a través de identidad de secuencia, hibridación, identificación de cajas de histidina conservadas, u otros métodos adecuados, se puede ensayar la actividad desaturasa usando varios ensayos diferentes. A modo de ejemplo es el uso de levadura como se describe en la patente en EE UU No.
5.968.809 en los ejemplos 5 a 7 y Knutzon, et al. J. Biol. Chem. 273 (45): 29360-29366 (1998). La levadura puede ser Sacharomyces cerevisiae o una especie oleaginosa. La secuencia de interés se clona en un vector de expresión de levaduras y se transforma en levadura. Las cepas de levaduras recombinantes se cultivan en medio que contienen varios sustratos y el contenido en ácidos grasos de la fracción lipídica se analiza para evaluar la actividad desaturasa. La actividad Δ6-desaturasa se puede seguir usando ácido linoleico como sustrato y detectar ácido gamma-linolénico. La actividad Δ12-desaturasa se puede seguir detectando la conversión de ácido oleico endógeno a ácido linolénico.
La actividad desaturasa también se puede ensayar usando Arabidopsis. Las secuencias de interés se clonan en vectores apropiados, se transforman en Arabidopsis, y la actividad se detecta evaluando el fenotipo de las plantas transgénicas. Alternativamente, los vectores que contienen las putativas secuencias de desaturasas se pueden expresar en hojas o usarse para generar agallas de la corona transgénicas.
Las secuencias de desaturasas resultantes identificadas y aisladas usando métodos tal como los divulgados anteriormente se clonan después en vectores de expresión y transformación en plantas tal como los divulgados posteriormente usando métodos bien conocidos en biología molecular tal como los divulgados en Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición (1989) o Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds. (1987).
Expresión de genes de desaturasas
Para la expresión de un polipéptido desaturasa, regiones de inicio y terminación transcripcional y traduccional funcionales se unen operativamente al ADN que codifica el polipéptido desaturasa. Las regiones de inicio y terminación transcripcional y traduccional derivan de una variedad de fuentes, incluyendo el ADN que se va a expresar, genes que se sabe o sospecha que son capaces de expresión en el sistema deseado, vectores de expresión, síntesis química o de un locus endógeno en una célula huésped. La expresión en un tejido vegetal y/o parte de la planta proporciona ciertas ventajas, particularmente donde el tejido o parte es uno que se recoge fácilmente, tal como semilla, hojas, frutos, flores, raíces, etc. La expresión se puede dirigir a esa localización en la planta usando secuencias reguladoras específicas, tal como las de la patente en EE UU No. 5.463.174, patente en EE UU No. 4.943.674, patente en EE UU No. 5.106.739, patente en EE UU No. 5.175.095, patente en EE UU No. 5.420.034, patente en EE UU No. 5.188.958 y patente en EE UU No. 5.589.379.
Una localización particularmente útil del GLA producido por esta invención es en el tejido de la semilla de células vegetales huéspedes. Para dirigir la expresión en la semilla, se pueden usar promotores específicos de semilla para dirigir la expresión de las desaturasas apropiadas. Los ejemplos de tales promotores específicos de semilla incluyen los divulgados en la patente en EE UU No. 5.623.067, patente en EE UU No. 6.342.657 y patente en EE UU No.
6.642.437.
La expresión en una célula huésped se puede lograr de manera transitoria o estable. La expresión transitoria se puede producir de construcciones introducidas que contienen señales de expresión funcionales en la célula huésped, pero donde las construcciones no se replican y raramente se integran en la célula huésped o donde la célula huésped no prolifera. La expresión transitoria también se puede lograr induciendo la actividad de un promotor regulable operativamente unido al gen de interés, aunque tales sistemas inducibles con frecuencia muestran un bajo nivel basal de expresión. La expresión estable se puede lograr mediante la introducción de una construcción que se puede integrar en el genoma del huésped o que se replica autónomamente en la célula huésped. Los marcadores de selección adecuados incluyen resistencia al herbicida Basta proporcionado por el gen pat (fosfotricin acetil transferasa) y resistencia a kanamicina proporcionada por el gen nptll (neomicina fosfotransferasa), entre otros genes conocidos en la técnica. La expresión estable del gen de interés se puede seleccionar mediante el uso de un marcador seleccionable localizado en o transfectado con la construcción de expresión, seguido por selección de las células que expresan el marcador. Cuando se produce la expresión estable a partir de la integración, la integración se construcciones se puede producir al azar en el genoma del huésped o se puede dirigir mediante el uso de construcciones que contienen regiones de homología con el genoma del huésped suficiente para dirigir la recombinación con el locus del huésped. Donde las construcciones se dirigen a un locus endógeno, se pueden proporcionar todas o algunas de las regiones reguladoras transcripcionales y traduccionales por el locus endógeno.
Para la expresión del polipéptido desaturasa en semillas se puede emplear un promotor específico de semillas. Los ejemplos de tales promotores incluyen los promotores de oleosina y linina. El promotor de oleosina se divulga en la patente en EE UU No. 5.792.922 y el promotor de linina se divulga en la patente en EE UU No. 6.777.591.
Cuando es deseable expresar más de un gen distinto, los genes pueden estar contenidos en una única construcción
o los genes pueden estar en vectores separados. En cualquiera caso, el experto en la materia ejercería una elección juiciosa al elegir regiones reguladoras, medios de selección y métodos de propagación de la(s) construcción(es) introducida(s) para proporcionar niveles de expresión óptimos de todas las enzimas requeridas para la síntesis de los productos deseados.
Las construcciones que comprenden el gen de interés se pueden introducir en una célula huésped por técnicas estándar. Estas técnicas incluyen transfección, infección, impacto biolístico, electroporación, microinyección, raspado o cualquier otro método que introduce el gen de interés en la célula huésped (véase la patente en EE UU No. 4.743.548, patente en EE UU No. 4.795.855, patente en EE UU No. 5.068.193, patente en EE UU No. 5.188.958, patente en EE UU No. 5.463.174, patente en EE UU No. 5.565.346 y patente en EE UU No. 5.565.347. Por conveniencia, una célula huésped que se ha manipulado por cualquier método para captar una secuencia o construcción de ADN se denominará “transformada” o “recombinante” en el presente documento. El sujeto huésped tendrá al menos una copia de la construcción de expresión y puede tener dos o más, dependiendo de si el gen se integra en más de un sitio en el genoma, con múltiples copias en un locus, se amplifica y/o está presente en un elemento extracromosómico que tiene múltiples números de copia.
Se conocen una variedad de métodos de transformación de plantas. Los genes de las Δ6-y Δ12-desaturasa se pueden introducir en plantas a través de cocultivo con Agrobacterium mediante un procedimiento de transformaciónregeneración en disco de hoja descrito por Horsch et al., Science 227: 1229, 1985. Otros métodos de transformación mediada por Agrobacterium, tal como cocultivo protoplastos (Horsch et al., Science 223:496, 1984; DeBlock et al., EMBO J. 2:2143, 1984), cultivo en suspensión de células transformadas (Barton et al., Cell 32:1033, 1983) o infiltración al vacío de flores (Bechtold et al., CR Acad Scie III, Sci Vie 316:1194, 1993; Wang et al., Plant Cell Rep 22:274, 2003), también se pueden usar y están en el ámbito de esta invención. En un aspecto preferido, las plantas se transforman con vectores derivados de Agrobacterium o inmovilizados a Agrobacterium tales como los descritos en Klee et al., Annu Rev Plant Physiol 38: 467, 1987. Sin embargo, otros métodos están disponibles para insertar los genes de Δ6-y Δ12-desaturasa de la presente invención en células vegetales. Tales métodos alternativos incluyen, pero no se limitan a, enfoques biolísticos (Klein et al., Nature 327:70, 1987), enfoques de protoplastos (Shillito y Potrykus, Recombinant DNA Methodology 687, 1989; Davey et al., Plant Mol Biol 13:273, 1989) captación de ADN químicamente inducida (Topfer et al., Plant Cell 1:133, 1989) y el uso de virus o polen (Ohta, PNAS 83:715, 1986) como vectores.
Cuando sea necesario para el método de transformación, los genes de Δ6-y Δ12-desaturasa de la presente invención se pueden insertar en un vector de transformación vegetal, por ejemplo, el vector binario descrito por Bevan (1984) Nucleic Acids Res. 12, 8111. Los vectores de transformación vegetales se pueden derivar modificando el sistema de transferencia génica natural de Agrobacterium tumefacians. El sistema natural comprende plásmidos Ti (inductor de tumores) grandes que contienen un segmento grande, conocido como T-ADN, que se transfiere a plantas transformadas. Otro segmento de plásmido Ti, la región vir, es responsable de la transferencia de T-ADN. La región T-ADN está bordeada por repeticiones terminales. En los vectores binarios modificados los genes inductores de tumores se han delecionado y las funciones de la región vir se utilizan para transferir ADN exógeno rodeado por las secuencias límites del T-ADN. La región T también contiene un marcador seleccionable para resistencia a antibióticos y sitio de clonación múltiple para insertar secuencias para la transferencia. Tales cepas manipuladas se conocen como cepas de A. tumefacians “desarmadas” y permiten la transformación eficaz de secuencias limitadas por la región T en los genomas nucleares de plantas.
Se inoculan discos de hojas esterilizados en la superficie con el A. tumefacians “desarmado” que contiene el ADN exógeno, se cultivan durante dos días y después se transfieren a medio que contiene antibiótico. Los brotes transformados se eligen después de echar raíces en medio que contiene el antibiótico apropiado, se transfieren a tierra y se regeneran.
Una célula huésped transformada se puede identificar por selección para un marcador contenido en la construcción introducida. Alternativamente, se puede introducir una construcción de marcador separada con la construcción deseada, como muchas técnicas de transformación introducen muchas moléculas de ADN en células huésped. Típicamente, los huéspedes transformados se seleccionan por su capacidad de crecer en medio selectivo. El medio selectivo puede incorporar un antibiótico o carecer de un factor necesario para el crecimiento del huésped sin transformar, tal como un nutriente o factor de crecimiento. Por tanto, un gen marcador introducido puede conferir resistencia a un antibiótico o codificar un factor de crecimiento o enzima esencial y permitir el crecimiento en medio selectivo cuando se expresa en la célula huésped transformada. Deseablemente, la resistencia a kanamicina y el aminoglucósido G418 son de interés (véase la patente en EE UU No. 5.034.322). La selección de un huésped transformado también se puede producir cuando la proteína marcadora expresada se puede detectar, sea directa o indirectamente. La proteína marcadora se puede expresar sola o como una fusión a otra proteína. La proteína marcadora se puede detectar por su actividad enzimática; por ejemplo, β-galactosidasa puede convertir el sustrato X-gal a un producto coloreado y la luciferasa puede convertir luciferina a un producto emisor de luz. La proteína marcadora se puede detectar por sus características productoras o modificadoras de luz, por ejemplo, la proteína fluorescente verde de Aequorea victoria fluorece cuando se ilumina con luz azul. Se pueden usar anticuerpos para detectar la proteína marcadora o una etiqueta molecular en, por ejemplo, una proteína de interés. Las células que expresan la proteína marcadora o etiqueta se pueden seleccionar, por ejemplo, visualmente o por técnicas tal como FACS o adsorción usando anticuerpos.
Transformación de cártamo
Al menos existen dos métodos básicos distintos para la transformación de plantas de cártamo: (1) regeneración de brotes de un callo, que se induce de cotiledones cocultivados y (2) regeneración de brotes múltiples directamente de meristemos cortados cocultivados.
El método 1 implica la inducción de un callo de explantes cotiledónicos posterior al cocultivo con Agrobacterium (Ying et al., Plant Cell Rep 11:581, 1992); Orlikowska et al., PCTOC 40:85, 1995). El método consiste en cocultivar cotiledones cortados durante 3 días en medio de inducción de callos (sales MS con vitaminas B5). Los explantes se transfieren a medio de formación de brotes (sales MS, vitaminas B5 y carbenicilina) y cultivar durante 2 días y después transferir al mismo medio que contiene kanamicina. Después de 2 a 3 semanas, las estructuras frondosas regenerantes se transfieren junto con el tejido de explante subyacente a medio de elongación de brotes (sales V2MS y vitaminas MS) que contiene Geneticin®. Después de 2 a 3 semanas adicionales, los brotes en elongación se separan del tejido de explante original y se transfieren al mismo medio, punto en el que los extremos cortados de brotes no transformados o quiméricos se vuelven rápidamente marrones mientras que los brotes transgénicos permanecen sanos. Los brotes sanos se transfieren a medio de enraizamiento (sales Y2MS y vitaminas MS) cuando tienen al menos 10 mm de longitud. Una media de 2-3 brotes se regeneran de un explante.
Con el método 2, múltiples brotes se inducen brevemente de meristemos cortados antes del cocultivo con Agrobacterium (Rao y Rohini, Plant Biotechnol 16:201, 1999); Rohini y Rao, Annals Bot 86:1043, 2000). Implica usar una aguja para pinchar el eje del embrión de semillas en germinación a las que se ha eliminado uno de los cotiledones en el nódulo cotiledónico. El embrión se sumerge después y se agita suavemente a 28-30ºC en una suspensión de Agrobacterium en medio AB de Winans durante 10 minutos. Después del cocultivo en medio basal MS semisólido durante 24 horas, los ejes del embrión se lavan por completo con 50014 ml de de cefotaxima en medio basal MS líquido con agitación suave (80 rpm) durante 1 hora y se colocan en Soilrite (equivalente a vermiculita) autoclavado (Chowgule Industries Ltd. Bangalore, India) humedecido con agua para la germinación en condiciones asépticas en una habitación de crecimiento. Después de 5 a 6 días, los germinados se transfieren a Soilrite en macetas y se dejan crecer en condiciones ambiente de crecimiento durante al menos 10 días antes de transferirlos al invernadero. Las macetas se cubren inicialmente con bolsas de politeno para mantener la humedad. La cámara de crecimiento se mantiene a 26-28ºC con un fotoperiodo de 14 horas con una luz fluorescente. En contraste al método 1, la mayoría de los brotes producidos con este método generalmente no muestran vitrificación. Las plántulas en desarrollo podrían ser quiméricas y, en ese caso, la transformación con éxito depende de si el T-ADN se integra en la capa celular meristemática que genera los futuros órganos reproductores. Este método requiere sustancialmente más material de partida (semilla madura) y espacio de cámara de crecimiento que el método 1.
Un aspecto preferido de la presente divulgación proporciona plantas transgénicas de cártamo o progenie de estas plantas que expresan ADN que codifica desaturasas que sobreproducen GLA. El cártamo es una planta huésped ventajosa porque se usa ampliamente como una fuente de aceites vegetales. Las células de la planta de cártamo se transforman con el ADN aislado que codifica Δ6-desaturasa o Δ6-desaturasa y Δ12-desaturasa por cualquiera de los métodos de transformación de plantas descritos anteriormente. La célula de planta de cártamo transformada, habitualmente en un cultivo de callo o disco de hoja, se regenera a una planta transgénica completa por métodos
que conoce bien el experto en la materia (por ejemplo, Horsch et al., Science 227:1129, 1985). Puesto que la progenie de plantas de cártamo transformadas heredan el ADN que codifica los genes de desaturasas, las semillas
o esquejes de las plantas transformadas se usan para mantener la línea de planta transgénica.
En un aspecto específico, el método comprende introducir ADN que codifica i6-desaturasa en plantas de cártamo que carecen de GLA o tienen niveles bajos de GLA pero producen LA. En otro aspecto, el método comprende introducir uno o más vectores de expresión que comprenden ADN que codifica Δ12-desaturasa y Δ6-desaturasa en plantas de cártamo que son deficientes tanto en GLA como LA. Según esto, se induce que plantas de cártamo deficientes tanto en LA como GLA produzcan LA por la expresión de Δ12-desaturasa y se genera después GLA debido a la expresión de Δ6-desaturasa. Los vectores de expresión que comprenden el ADN que codifica Δ12desaturasa o Δ12-desaturasa y Δ6-desaturasa se pueden construir por métodos de tecnología recombinante conocidos para el experto en la materia (Sambrook et al., 1989) y la secuencia publicada de Δ12-desaturase (Wada et al., Nature (London) 347:200, 1990). Ejemplos de tales vectores se definen aquí.
Aceite que contiene GLA
El GLA resultante en plantas de cártamo se puede extraer de varias partes de la planta de cártamo, particularmente las semillas, utilizando métodos bien conocidos en la técnica como se ha descrito anteriormente. En particular, las semillas se recogen y el aceite de la semilla de cártamo se puede extraer típicamente aplastando la semilla, y después refinar usando cualquier método convencional. Los métodos para extraer aceite de semillas de cártamo se conocen bien en la técnica y se presentan en fuentes tal como Smith, J.R., Safflower, AOCS Press, pp. 185-212 (1996).
El GLA producido usando los métodos y composiciones objeto se puede encontrar en el tejido de la planta huésped y/o parte de la planta como ácidos grasos libres o en formas esterificadas, tal como acilgliceroles, fosfolípidos, sulfolípidos o glucolípidos, y se puede extraer de la célula huésped a través de una variedad de medios bien conocidos en la técnica. Tales medios pueden incluir la extracción con solventes orgánicos, sonicación, extracción con fluidos supercríticos usando por ejemplo dióxido de carbono y medios físicos tal como prensas o combinaciones de los mismos. De particular interés es la extracción con hexano, propano, acetona o etanol.
El GLA descrito en el presente documento se puede incluir en composiciones nutricionales y de cuidado personal. Los ejemplos de composiciones nutricionales incluyen pero no están limitados a leches maternizadas, suplementos alimenticios, sustitutos de la dieta y composiciones de rehidratación. Por ejemplo, la composición se puede añadir a alimentos de cualquier tipo incluyendo, pero no limitado a, margarinas, mantequillas modificadas, quesos, leche, yogur, chocolate, caramelos, aperitivos, aceites de ensalada, aceites de cocinar, grasas de cocinar, carnes, pescado y bebidas. Los ejemplos de composiciones de cuidado personal incluyen cremas, bálsamos y lociones para la piel, hidratantes, productos bronceadores y para después del bronceado, champús, acondicionadores capilares y pintalabios. Los ejemplos de usos a los que se puede aplicar el GLA de esta invención se describe, por ejemplo, en las patentes en EE UU No. 6.635.451 y 5.709.888.
Se proporcionan ejemplos a modo de ilustración y no se pretende que limiten el ámbito de la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1: Plásmido pSBS4766 y plantas transgénicas que expresan este plásmido
La figura 8 muestra el mapa de una construcción usada para coexpresar la Δ6-desaturasa y la Δ12-desaturasa de Mortierella alpina. El marcador seleccionable vegetal usado en esta construcción era pat que corresponde al gen de fosfinotricin acetil transferasa de Streptomyces viridochromogenes. El marcador bacteriano usado en esta construcción era SpecR. El vector binario base usado para construir este vector es un derivado de pPZP200. Véase, Hajdukiewicz et al. Plant Mol Biol 25: 989, 1994. La secuencia del inserto contenido dentro de los límites del plásmido pPZP200 se muestra a continuación.
pSBS4766 (casete de expresión doble de Δ6-y Δ12-desaturasa de M. alpina con selección PAT) (SEQ ID NO: 1)
La transformación de cártamo con esta construcción fue realizada por SemBioSys Genetics Inc. (Calgary, Canadá). Las técnicas utilizadas por SemBioSys Genetics Inc. incluyen las descritas en el documento WO 2004/111244. Las 5 plantas transgénicas se cultivaron y las semillas se recogieron.
La medida de los niveles de ácidos grasos se realizó en semillas de plantas transgénicas. Las semillas se recogieron de plantas transgénicas y la composición de ácidos grasos se determinó por cromatografía de gases usando una modificación del método descrito en "Official Methods and Recommended Practices of the AOCS", 5ª Ed., Method
10 Ce 1-62, American Oil Chemists Society: Champaign, Illinois (1997). En este método, el aceite se extrae con hexano de la semilla, se hidroliza con ácido clorhídrico y se hace reaccionar con metanol para formar ésteres metílicos. Los ésteres metílicos se cuantifican después contra un estándar interno por cromatografía de gases.
La composición de ácidos grasos en grupos de 10 semillas de semilla T1 de plantas transgénicas que expresan la
15 construcción pSBS4766 se muestran en la tabla 1 a continuación. La actividad del gen M-desaturasa se evidencia claramente por la presencia de GLA en las líneas transgénicas. Mientras GLA varía del 0,03% al 0,04% en los controles S317 en la tabla 1, varía del 0,5% al 30,8% en las semillas reunidas de T1. Esto es más de un aumento de cincuenta veces en la concentración de GLA. Se ven aumentos pequeños pero significativos en el 18:4 en las líneas con el mayor GLA. Esto se espera, ya que el gen de la Δ6-desaturasa puede actuar tanto sobre 18:2 para producir
20 GLA como 18:3 (ALA) para producir 18:3. La actividad de la Δ12-desaturasa se evidencia por la disminución en ácidos grasos 18:1. En los controles S317 en la tabla 1, el OA varía desde 73,76% al 75,8% mientras que en las líneas transgénicas varía del 3,68% al 73,51%. En conjunto, los datos muestran un amplio intervalo de concentraciones de GLA que se pueden alcanzar en cártamo a través de esta invención.
25 Tabla 1: Ejemplos de composición de ácidos grasos (expresados como porcentajes) en grupos de 10 semillas de semillas T1 de construcción expresada en S317
Tabla 1 Número de línea
C16:0 (palmítico) C18:0 (Esteárico) C18:1n9 (Oleico) C18:2 Otros C18:2n6 (Linoleico) C18:3n6 (gammalinolénico) C18:3n3 (alfalinolénico) C18:4n3 (Octadecatetraenoico)
47766-24
7,40 1,87 3,68 53,00 30,80 0,66 0,17
47766-12
6,77 1,78 3,69 54,22 30,48 0,68 0,16
47766-27
6,71 1,78 18,73 46,82 23,18 0,60 0,13
47766-1
6,52 1,64 20,06 45,88 22,35 0,99 0,13
47766-30
6,44 1,63 17,51 56,99 15,16 0,34 0,02
47766-21
5,91 1,64 17,04 58,00 15,11 0,52 0,03
47766-11
6,06 1,56 14,38 60,75 14,99 0,44 0,04
47766-26
6,34 1,66 15,64 61,66 12,48 0,39
47766-13
5,83 1,67 27,48 49,92 12,30 0,72 0,04
47766-19
5,94 1,74 23,34 55,54 11,08 0,44 0,02
47766-10
5,70 1,53 24,56 57,28 8,68 0,40 0,01
47766-5
5,31 1,73 33,82 48,63 8,24 0,38 0,01
47766-31
5,27 1,51 46,85 36,17 7,77 0,30 0,01
47766-4
4,50 1,34 73,51 1,89 11,14 5,08 0,32 0,01
47766-14
5,40 1,66 11,74 74,16 4,93 0,37 0,01
47766-41
4,74 1,58 54,76 0,66 33,36 2,66 0,16
47766-22
5,13 1,5 58,60 31,92 0,50 0,21
Centennial
6,94 1,88 11,31 76,74 0,07 0,38
S317
4,92 2,25 73,76 16,34 0,04 0,28
S317
4,72 2,31 74,73 15,76 0,04 0,07
S317
4,57 2,25 75,80 14,96 0,03 0,07
La composición en muestras de semillas individuales de la línea control S317 se muestra en la tabla 2 a 30 continuación. Se corrieron cuatro replicados (S0-1, S0-2, S0-3, S0-4). Los datos de semillas individuales son paralelos a los datos de los grupos de 10 semillas.
Tabla 2: La composición de ácidos grasos en cuatro muestras de semillas individuales de la líneas control (S317, indicados S0).
Tabla 2 -Ácidos grasos S0-1 S0-2 S0-3 S0-4 C10:0 Cáprico 0,7% 0,3% 0,5% 0,5% C11:0 0,3% 0,1% 0,3% 0,2% C12:0 Laurico 0,2% 0,1% 0,2% 0,1% C13:0 Tridecanoico 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% C14:0 Mirístico 0,3% 0,2% 0,2% 0,2% C14:1w5 Miristoleico 0,2% 0,0% 0,1% 0,1% C15:0 Pentadecanoico 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% C15:1w5cis 10-Pentadecenoico 0,0% 0,0% 0,1% 0,0% C16:0 Palmítico 6,0% 6,2% 5,7% 5,7% C16:1w7c Palmitoleico 0,2% 0,1% 0,1% 0,2% C17:0 Heptadecanoico 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% C17:1w7 0,0% 0,0% 0,0% 0,1% C18:0 Esteárico 3,2% 1,8% 3,4% 1,7% C18:1w9t 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% C18:1w9c 73,0% 74,2% 74,3% 75,6%ESTÁNDAR INTERNO C18:2w6t 0,1% 0,0% 0,1% 0,0% C18:2w6c Linoleico (LA) 13,6% 14,8% 12,9% 13,5% C20:0 Araquidónico 0,4% 0,5% 0,5% 0,5% C18:3w6 γ-linolénico (GLA) 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% C20:1w9 0,3% 0,3% 0,3% 0,3% C18:3w3, α-linolénico (ALA) 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% C21:0 Heneicosanoico 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% C20:2w6 Eicosadienoico 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% C22:0 Behénico 0,3% 0,3% 0,3% 0,3% C20:3w6 Dihomo-γ-linolénico (DGLA) 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% C22:1w9 Erúcico 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% C20:3w3 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% C20:4w6 Araquidónico (AA) 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% C23:0 Tricosanoico 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% C22:2w6 0,1% 0,0% 0,1% 0,1% C24:0 Lignocérico 0,2% 0,2% 0,2% 0,2% C20:5w3 Eicosapentanoico (EPA) 0,1% 0,0% 0,0% 0,0% C24:1w9c 0,1% 0,2% 0,1% 0,1% C22:6w3 Docosahexanoico (DHA) 0,3% 0,1% 0,1% 0,1%
Ácidos grasos totales 100,0% 100,0% 100,0% 100,0%
Ácidos grasos saturados 11,8% 9,8% 11,5% 9,6% W7 & W5 totales 0,4% 0,3% 0,4% 0,4% W9 totales 73,4% 74,6% 74,6% 76,0% W6 totales 13,8% 14,9% 13,1% 13,7% W3 totales 0,5% 0,2% 0,2% 0,2%Ácidos grasos monoinsaturados totales73,7% 74,9% 75,0% 76,4%Ácidos grasos trans totales0,2% 0,1% 0,2% 0,1%Ácidos grasos poliinsaturados 14,2% 15,1% 13,3% 13,9%
Proporciones: Poliinsaturados/saturados 1,2 1,5 1,2 1,5 Omega 6/Omega 3 30,1 72,5 61,6 60,8
AA/EPA 0,2 0,1 1,0 0,8 AA/DHA 0,0 0,1 0,4 0,4
La composición de ácidos grasos en semillas individuales de 5 líneas (S1, S4, S5, S24, S27) de plantas transgénicas que expresan la construcción pSBS4766 se muestran en las tablas 3-7 a continuación. Se proporcionan datos de 8 a 9 semillas replicadas. Cuando están disponibles, se proporcionan valores para semillas individuales de una línea control NULO para cada línea transgénica para comparación.
Tabla 3 Muestras de semillas individuales de la línea transgénica S1
Ácidos grasos C10:0 Cáprico
NULO 0,6% S1-1 0,6% S1-2 0,4% S1-3 0,6% S1-4 0,5% S1-5 0,4% S1-6 0,4% S1-7 0,1% S1-8 0,6%
C11:0
0,2% 0,2% 0,2% 0,3% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,2%
C12:0 Laurico
0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1%
Tabla 3 Ácidos grasos C13:0 Tridecanoico
NULO 0,0% Muestras de semillas individuales de la línea transgénica S1 S1-1 S1-2 S1-3 S1-4 S1-5 S1-6 S1-7 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% S1-8 0,0%
C14:0 Mirístico
0,1% 0,3% 0,3% 0,3% 0,2% 0,3% 0,2% 0,2% 0,2%
C14:1w5 Miristoleico
0,1% 0,1% 0,1% 0,2% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1%
C15:0 Pentadecanoico
0,0% 0,0% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1%
C15:1w5cis 10-Pentadecenoico
0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0%
C16:0 Palmítico
5,4% 6,1% 8,7% 8,9% 8,5% 8,0% 8,6% 8,9% 8,2%
C16:1w7c Palmitoleico
0,2% 0,3% 0,1% 0,1% 0,1% 0,2% 0,2% 0,1% 0,2%
C17:0 Heptadecanoico
0,1% 0,2% 0,2% 0,2% 0,2% 0,2% 0,2% 0,1% 0,1%
C17:1w7
0,1% 0,1% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0%
C18:0 Esteárico
2,2% 1,6% 3,2% 2,5% 1,4% 3,6% 2,9% 1,4% 2,1%
C18:1w9t
0,1% 0,1% 0,0% 0,1% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0%
C18:1w9c ESTÁNDAR INTERNO
74,9% 59,8% 0,7% 0,8% 0,8% 0,7% 0,7% 0,7% 0,7%
C18:2w6t
0,0% 0,0% 0,0% 0,1% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0%
C18:2w6c Linoleico (LA)
14,0% 27,3% 37,8% 33,7% 48,9% 47,7% 41,4% 39,3% 41,0%
C20:0 Araquidónico
0,3% 0,3% 0,3% 0,4% 0,3% 0,3% 0,2% 0,3% 0,3%
C18:3w6 γ-Linolénico (GLA)
0,0% 1,4% 46,1% 49,7% 37,0% 36,7% 43,4% 46,8% 44,5%
C20:1w9
0,3% 0,2% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1%
C18:3w3, α-linolénico (ALA)
0,1% 0,1% 0,5% 0,6% 0,5% 0,6% 0,5% 0,8% 0,6%
C21:0 Heneicosanoico
0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,0% 0,0% 0,1%
C20:2w6 Eicosadienoico
0,0% 0,0% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1%
C22:0 Behénico
0,2% 0,2% 0,2% 0,3% 0,2% 0,1% 0,2% 0,2% 0,1%
C20:3w6 Dihomo-γ-linolénico (DGLA)
0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0%
C22:1w9 Erúcico
0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0%
C20:3w3
0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0%
C20:4w6 Araquidónico (AA)
0,0% 0,0% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1%
C23:0 Tricosanoico
0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0%
C22:2w6
0,0% 0,1% 0,1% 0,1% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0%
C24:0 Lignocérico
0,2% 0,2% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1%
C20:5w3 Eicosapentanoico (EPA)
0,0% 0,0% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1%
C24:1w9c
0,2% 0,2% 0,1% 0,2% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1%
C22:6w3 Docosahexanoico (DHA)
0,2% 0,2% 0,2% 0,1% 0,1% 0,2% 0,2% 0,2% 0,0%
Ácidos grasos totales
100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0%
Ácidos grasos saturados
9,6% 9,9% 13,9% 13,9% 11,8% 13,3% 13,1% 11,6% 12,3%
W7 & W5 totales
0,3% 0,5% 0,3% 0,3% 0,3% 0,3% 0,3% 0,2% 0,4%
W9 totales
75,4% 60,3% 0,9% 1,1% 1,0% 0,9% 0,9% 0,9% 0,9%
W6 totales
14,1% 28,8% 84,1% 83,7% 86,0% 84,6% 84,9% 86,3% 85,7%
W3 totales Ácidos grasos monoinsaturados tot.Ácidos grasos trans totalesÁcidos grasos poliinsaturados
0,4% 75,7% 0,1% 14,5% 0,4% 60,7% 0,2% 29,2% 0,8% 1,2% 0,0% 84,9% 0,8% 1,4% 0,2% 84,5% 0,8% 1,3% 0,0% 86,8% 0,8% 1,1% 0,1% 85,5% 0,8% 1,2% 0,0% 85,7% 1,0% 1,1% 0,0% 87,3% 0,7% 1,3% 0,0% 86,4%
Proporciones:
Poliinsaturados/saturados
1,5 3,0 6,1 6,1 7,3 6,4 6,6 7,5 7,0
Omega 6/Omega 3
35,3 75,7 109,0 99,3 108,2 100,1 105,3 83,6 127,4
AA/EPA
0,4 0,4 0,6 0,5 0,4 0,7 0,7 1,2 0,6
AA/DHA
0,1 0,1 0,3 0,5 0,3 0,3 0,3 0,4 4,2
Tabla 4 Ácidos grasos C10:0 Cáprico
NULO 0,6% Muestras de semillas individuales de la línea transgénica S4 S4-1 S4-2 S4-3 S4-4 S4-5 S4-6 S4-7 S4-8 0,7% 0,7% 0,6% 0,5% 0,8% 0,4% 0,5% 1,0% S4-9 0,6%
C11:0
0,1% 0,2% 0,2% 0,2% 0,2% 0,2% 0,1% 0,2% 0,3% 0,2%
C12:0 Laurico
0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,2% 0,1%
C13:0 Tridecanoico
0,0% 0,1% 0,1% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,1% 0,2% 0,3%
C14:0 Mirístico
0,2% 0,2% 0,2% 0,4% 0,3% 0,2% 0,2% 0,2% 0,3% 0,1% 0,2%
C14:1w5 Miristoleico
0,1% 0,0% 0,0% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,0% 0,1% 0,0% 0,1%
C15:0 Pentadecanoico
0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,0% 0,1% 0,1% 0,0%
C15:1w5cis 10-Pentadecenoico
0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 5,8% 5,4% 5,3% 6,0% 6,4%
C16:0 Palmítico
6,5% 5,2% 5,5% 5,7% 5,9% 0,3% 0,3% 0,3% 0,2% 0,2% 0,2%
C16:1w7c Palmitoleico
0,3% 0,2% 0,3% 0,3% 0,2% 0,1% 0,1% 0,2% 0,2% 0,2% 0,2%
C17:0 Heptadecanoico
0,2% 0,1% 0,2% 0,1% 0,1% 0,0% 0,1% 0,0% 0,1% 0,0% 0,0%
C17:1w7
0,1% 0,1% 2,6% 1,2% 1,5% 1,7% 4,9% 2,4% 1,5% 1,5% 1,1%
C18:0 Esteárico
2,5% 0,0% 0,2% 0,0% 0,0% 0,1% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,1%
C18:1w9t
75,0% 76,8% 63,0% 75,4% 72,2% 71,0% 74,5% 74,7% 73,7%
C18:1w9c ESTÁNDAR INTERNO
73,6%
C18:2w6t
0,0% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1%
C18:2w6c Linoleico (LA)
12,8% 6,0% 12,5% 4,2% 3,6% 7,7% 5,4% 4,7% 7,4% 4,3%
Tabla 4 Ácidos grasos C20:0 Araquidónico
NULO 0,3% Muestras de semillas individuales de la línea transgénica S4 S4-1 S4-2 S4-3 S4-4 S4-5 S4-6 S4-7 S4-8 0,3% 0,3% 0,4% 0,4% 0,4% 0,3% 0,4% 0,3% S4-9 0,4%
C18:3w6 γ-linolénico (GLA)
0,0% 6,9% 13,7% 9,5% 8,9% 8,2% 10,4% 10,3% 8,0% 9,9%
C20:1w9
0,3% 0,3% 0,4% 0,3% 0,3% 0,3% 0,3% 0,3% 0,3% 0,3%
C18:3w3, α-linolénico (ALA)
0,1% 0,1% 0,2% 0,1% 0,0% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1%
C21:0 Heneicosanoico
0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,0% 0,1% 0,1% 0,0%
C20:2w6 Eicosadienoico
0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,1% 0,1% 0,0% 0,0% 0,1% 0,1%
C22:0 Behénico
0,2% 0,2% 0,3% 0,2% 0,2% 0,3% 0,2% 0,3% 0,3% 0,3%
C20:3w6 Dihomo-γ-linolénico (DGLA)
0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0%
C22:1w9 Erúcico
0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0%
C20:3w3
0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0%
C20:4w6 Araquidónico (AA)
0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0%
C23:0 Tricosanoico
0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0%
C22:2w6
0,0% 0,1% 0,1% 0,0% 0,1% 0,0% 0,0% 0,0% 0,1% 0,0%
C24:0 Lignocérico
0,2% 0,1% 0,2% 0,2% 0,2% 0,2% 0,1% 0,2% 0,2% 0,2%
C20:5w3 Eicosapentanoico (EPA)
0,0% 0,1% 0,0% 0,0% 0,0% 0,1% 0,0% 0,0% 0,1% 0,0%
C24:1w9c
0,2% 0,2% 0,3% 0,2% 0,1% 0,2% 0,2% 0,2% 0,2% 0,2%
C22:6w3 Docosahexanoico (DHA)
0,2% 0,0% 0,1% 0,2% 0,4% 0,2% 0,1% 0,1% 0,0% 0,2%
Ácidos grasos totales
100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0%
Ácidos grasos saturados
10,7% 8,8% 9,1% 9,7% 13,8% 11,6% 8,5% 9,1% 9,6% 10,8% 0,5%
W7 & W5 totales
0,6% 0,5% 0,3% 0,3% 0,4% 0,4% 0,3% 0,5% 0,4% 75,5% 77,2%
W9 totales
63,7% 75,9% 72,6% 71,5% 74,9% 75,2% 74,2% 74,1% 12,9%
W6 totales
13,0% 26,2% 13,8% 12,7% 16,0% 15,9% 15,1% 15,5% 14,3% 0,4%
W3 totales Ácidos grasos monoinsaturados tot.Ácidos grasos trans totalesÁcidos grasos poliinsaturados
0,2% 64,2% 0,1% 14,0% 0,4% 0,3% 0,5% 0,4% 0,2% 0,1% 0,2% 76,1% 72,9% 71,9% 75,3% 75,6% 74,7% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,0% 0,1% 13,1% 16,4% 16,1% 15,2% 15,7% 14,5% 0,3% 75,9% 74,5% 0,1% 13,3% 13,1% 77,8% 0,2% 26,6%
Proporciones:
Poliinsaturados/saturados
1,2 1,5 2,9 1,4 1,0 1,4 1,9 1,7 1,6 1,3
Omega 6/Omega 3
35,3 76,9 69,1 50,9 27,1 42,6 85,3 104,7 79,0 55,2
AA/EPA
0,3 0,3 0,3 0,5 0,6 0,3 0,5 0,1 0,1 0,1
AA/DHA
0,1 0,4 0,1 0,1 0,0 0,1 0,1 0,0 0,2 0,0
Tabla 5 Ácidos grasos C10:0 Cáprico
NULO 0,5% Muestras de semillas individuales de la línea transgénica S5 S5-1 S5-2 S5-3 S5-4 S5-5 S5-6 S5-7 S5-8 0,3% 2,6% 0,6% 0,6% 0,4% 0,4% 0,5% 0,2% S5-9 0,6%
C11:0
0,1% 0,1% 0,1% 0,2% 0,2% 0,1% 0,1% 0,2% 0,6% 0,2%
C12:0 Laurico
0,2% 0,1% 0,6% 0,2% 0,2% 0,1% 0,1% 0,2% 0,3% 0,2%
C13:0 Tridecanoico
0,0% 0,0% 0,1% 0,1% 0,1% 0,0% 0,0% 0,0% 0,1% 0,1%
C14:0 Mirístico
0,3% 0,2% 0,2% 0,2% 0,2% 0,3% 0,2% 0,3% 1,0% 0,2%
C14:1w5 Miristoleico
0,1% 0,0% 0,2% 0,1% 0,1% 0,0% 0,0% 0,0% 0,2% 0,1%
C15:0 Pentadecanoico
0,1% 0,1% 0,3% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,3% 0,1%
C15:1w5cis 10-Pentadecenoico
0,0% 0,0% 0,3% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,2% 0,0%
C16:0 Palmítico
5,5% 7,4% 8,3% 6,8% 7,4% 7,9% 7,2% 7,7% 12,9% 8,0%
C16:1w7c Palmitoleico
0,2% 0,2% 0,1% 0,1% 0,2% 0,2% 0,1% 0,2% 0,4% 0,3%
C17:0 Heptadecanoico
0,1% 0,1% 0,3% 0,1% 0,2% 0,2% 0,1% 0,2% 0,7% 0,2%
C17:1w7
0,1% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,1%
C18:0 Esteárico
1,6% 1,7% 2,8% 1,6% 1,6% 4,4% 1,5% 2,2% 10,5% 1,5%
C18:1w9t
0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0%
C18:1w9c ESTÁNDAR INTERNO
75,9% 0,7% 1,0% 0,7% 0,7% 0,8% 0,7% 0,7% 0,8% 0,9%
C18:2w6t
0,1% 0,0% 0,6% 0,1% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,1% 0,0%
C18:2w6c Linoleico (LA)
13,5% 67,2% 69,9% 76,5% 67,2% 70,9% 67,1% 64,7% 52,0% 74,2%
C20:0 Araquidónico
0,4% 0,3% 0,4% 0,2% 0,3% 0,3% 0,2% 0,2% 0,5% 0,3%
C18:3w6 γ-linolénico (GLA)
0,0% 20,4% 10,6% 11,2% 19,9% 12,9% 21,1% 21,4% 16,3% 11,7%
C20:1w9
0,2% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,0% 0,1% 0,0% 0,1%
C18:3w3, α-linolénico (ALA)
0,1% 0,2% 0,2% 0,2% 0,2% 0,1% 0,2% 0,2% 0,7% 0,3%
C21:0 Heneicosanoico
0,0% 0,0% 0,0% 0,1% 0,0% 0,1% 0,0% 0,1% 0,1% 0,0%
C20:2w6 Eicosadienoico
0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,0% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1%
C22:0 Behénico
0,3% 0,2% 0,2% 0,2% OA% 0,2% OA% 0,2% 0,2% 0,2%
C20:3w6 Dihomo-γ-linolénico (DGLA)
0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0%
C22:1w9 Erúcico
0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0%
C20:3w3
0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0%
C20:4w6 Araquidónico (AA)
0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0%
C23:0 Tricosanoico
0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0%
C22:2w6
0,0% 0,0% 0,2% 0,1% 0,0% 0,0% 0,0% 0,1% 0,1% 0,0%
C24:0 Lignocérico
0,2% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,2% 0,2%
C20:5w3 Eicosapentanoico (EPA)
0,0% 0,1% 0,2% 0,1% 0,1% 0,0% 0,0% 0,0% 0,1% 0,1%
C24:1w9c
0,2% 0,2% 0,1% 0,2% 0,1% 0,1% 0,2% 0,2% 0,3% 0,2%
Tabla 5 Ácidos grasos C22:6w3 Docosahexanoico (DHA)
NULO 0,2% Muestras de semillas individuales de la línea transgénica S5 S5-1 S5-2 S5-3 S5-4 S5-5 S5-6 S5-7 S5-8 0,1% 0,1% 0,0% 0,0% 0,3% 0,1% 0,1% 0,7% S5-9 0,1%
Ácidos grasos totales
100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0%
Ácidos grasos saturados
9,3% 10,6% 16,0% 10,4% 11,1% 14,1% 10,2% 12,0% 27,8% 11,8%
W7 & W5 totales
0,3% 0,3% 0,7% 0,2% 0,3% 0,3% 0,2% 0,3% 0,8% 0,5%
W9 totales
76,3% 1,0% 1,3% 1,1% 1,0% 1,1% 0,9% 1,0% 1,2% 1,3%
W6 totales
13,6% 87,7% 81,0% 87,9% 87,2% 84,0% 88,3% 86,3% 68,6% 86,0%
W3 totales Ácidos grasos monoinsaturados tot.Ácidos grasos trans totalesÁcidos grasos poliinsaturados
0,3% 76,7% 0,1% 13,9% 0,3% 1,3% 0,0% 88,1% 0,4% 1,9% 0,6% 81,4% 0,3% 1,3% 0,1% 88,2% 0,3% 1,3% 0,1% 87,5% 0,5% 1,4% 0,0% 84,4% 0,3% 1,1% 0,0% 88,6% 0,3% 1,3% 0,1% 86,6% 1,5% 1,9% 0,1% 70,2% 0,4% 1,7% 0,1% 86,4%
Proporciones:
Poliinsaturados/saturados
1,5 8,3 5,1 8,5 7,9 6,0 8,7 7,2 2,5 7,3
Omega 6/Omega 3
44,5 260,6 180,6 293,7 299,0 183,9 258,7 276,3 44,4 207,7
AA/EPA
0,1 0,1 0,2 0,3 0,3 0,1 0,1 0,2 0,1 0,4
AA/DHA
0,0 0,1 0,3 0,6 0,4 0,0 0,1 0,1 0,0 0,4
Tabla 6 Ácidos grasos
S24-1 Muestras de semillas individuales de la línea transgénica S24 S24-2 S24-3 S24-4 S24-5 S24-6 S24-7 S24-8 S24-9 S2410
C10:0 Cáprico
0,3% 0,5% 0,5% 0,7% 0,4% 0,5% 0,3% 0,4% 0,3% 0,5%
C11:0
0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0%
C12:0 Laurico
0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,2% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1%
C13:0 Tridecanoico
0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0%
C14:0 Mirístico
0,3% 0,3% 0,2% 0,5% 0,3% 0,5% 0,3% 0,2% 0,3% 0,2%
C14:1w5 Miristoleico
0,0% 0,0% 0,0% 0,1% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,1%
C15:0 Pentadecanoico
0,1% 0,1% 0,0% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,0% 0,1%
C15:1w5cis 10-Pentadecenoico
0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0%
C16:0 Palmítico
7,3% 6,7% 7,1% 8,4% 8,2% 9,8% 7,3% 6,5% 7,9% 5,4%
C16:1w7c Palmitoleico
0,1% 0,1% 0,2% 0,3% 0,1% 0,2% 0,1% 0,1% 0,1% 0,2%
C17:0 Heptadecanoico
0,2% 0,2% 0,1% 0,3% 0,2% 0,3% 0,1% 0,2% 0,2% 0,2%
C17:1w7
0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,1% 0,0% 0,1% 0,1% 0,5% 0,5%
C18:0 Esteárico
3,0% 2,7% 2,9% 4,9% 3,9% 5,3% 3,4% 1,7% 3,6% 2,1%
C18:1w9t
0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0%
C18:1w9c ESTÁNDAR INTERNO
3,7% 4,2% 4,7% 2,5% 3,7% 2,0% 5,3% 3,3% 3,4% 73,9%
C18:2w6t
0,0% 0,0% 0,0% 0,1% 0,0% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1%
C18:2w6c Linoleico (LA)
50,8% 53,1% 57,3% 35,3% 47,1% 35,6% 51,8% 54,9% 50,0% 8,4%
C20:0 Araquidónico
0,2% 0,2% 0,2% 0,3% 0,3% 0,3% 0,3% 0,2% 0,2% 0,3%
C18:3w6 γ-linolénico (GLA)
32,1% 30,4% 25,3% 43,7% 34,0% 43,3% 29,3% 30,7% 31,7% 6,4%
C20:1w9
0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,3%
C18:3w3, α-linolénico (ALA)
0,3% 0,3% 0,3% 0,5% 0,3% 0,5% 0,3% 0,4% 0,4% 0,1%
C21:0 Heneicosanoico
0,1% 0,1% 0,1% 0,2% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1%
C20:2w6 Eicosadienoico
0,1% 0,1% 0,1% 0,2% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1%
C22:0 Behénico
0,2% 0,2% 0,1% 0,3% 0,2% 0,2% 0,2% 0,1% 0,1% 0,3%
C20:3w6 Dihomo-γ-linolénico (DGLA)
0,0% 0,0% 0,0% 0,1% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0%
C22:1w9 Erúcico
0,0% 0,0% 0,0% 0,1% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0%
C20:3w3
0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0%
C20:4w6 Araquidónico (AA)
0,1% 0,0% 0,0% 0,1% 0,0% 0,1% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0%
C23:0 Tricosanoico
0,0% 0,0% 0,0% 0,1% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0%
C22:2w6
0,1% 0,0% 0,0% 0,1% 0,0% 0,1% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0%
C24:0 Lignocérico
0,1% 0,1% 0,1% 0,2% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,2%
C20:5w3 Eicosapentanoico (EPA)
0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,0%
C24:1w9c
0,1% 0,1% 0,1% 0,3% 0,1% 0,2% 0,2% 0,1% 0,2% 0,2%
C22:6w3 Docosahexanoico (DHA)
0,3% 0,1% 0,2% 0,4% 0,2% 0,2% 0,2% 0,0% 0,2% 0,3%
Ácidos grasos totales
100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0%
Ácidos grasos saturados
11,9% 11,1% 11,5% 16,0% 13,9% 17,5% 12,1% 9,7% 13,0% 9,5%
W7 & W5 totales
0,1% 0,2% 0,2% 0,4% 0,3% 0,2% 0,3% 0,2% 0,6% 0,8%
W9 totales
4,0% 4,5% 4,9% 3,0% 4,0% 2,2% 5,6% 3,6% 3,6% 74,3%
W6 totales
83,2% 83,7% 82,8% 79,4% 81,2% 79,2% 81,3% 85,8% 81,9% 14,9%
W3 totales Ácidos grasos monoinsaturados tot.Ácidos grasos trans totalesÁcidos grasos poliinsaturados
0,7% 4,2% 0,1% 83,9% 0,5% 4,6% 0,1% 84,2% 0,5% 5,2% 0,1% 83,3% 1,1% 3,4% 0,1% 80,5% 0,6% 4,2% 0,1% 81,9% 0,8% 2,5% 0,1% 79,9% 0,5% 6,0% 0,1% 81,8% 0,6% 3,8% 0,1% 86,4% 0,7% 4,3% 0,1% 82,6% 0,4% 75,1% 0,1% 15,3%
Proporciones:
Poliinsaturados/saturados
7,1 7,6 7,2 5,0 5,9 4,6 6,7 8,9 6,4 1,6
Tabla 6 Muestras de semillas individuales de la línea transgénica S24 Ácidos grasos S24-1 S24-2 S24-3 S24-4 S24-5 S24-6 S24-7 S24-8 S24-9 S2410
Omega 6/Omega 3 111,6 162,9 162,1 73,1 128,9 102,1 169,0 149,7 112,7 37,8
AA/EPA 0,5 0,4 0,6 0,6 0,7 1,0 0,7 0,4 0,4 0,3 AA/DHA 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,3 0,8 0,2 0,0
Tabla 7 Muestras de semillas individuales de la línea transgénica S27 Ácidos grasos NULO S27-1 S27-2 S27-3 S27-4 S27-5 S27-6 S27-7 S27-8
C10:0 Cáprico 0,6% 0,6% 0,4% 0,4% 0,6% 0,4% 0,5% 0,3% 0,4% C11:0 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% C12:0 Laurico 0,2% 0,2% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% C13:0 Tridecanoico 0,1% 0,0% 0,0% 0,1% 0,1% 0,0% 0,1% 0,0% 0,0% C14:0 Mirístico 0,4% 0,4% 0,3% 0,3% 0,4% 0,2% 0,3% 0,3% 0,3% C14:1w5 Miristoleico 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,0% 0,2% 0,1% C15:0 Pentadecanoico 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% C15:1w5cis 10-Pentadecenoico 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% C16:0 Palmítico 7,4% 8,0% 8,7% 10,6% 8,6% 7,6% 9,0% 8,9% 8,1% C16:1w7c Palmitoleico 0,3% 0,3% 0,2% 0,2% 0,2% 0,1% 0,2% 0,1% 0,2% C17:0 Heptadecanoico 0,3% 0,2% 0,2% 0,2% 0,2% 0,2% 0,1% 0,1% 0,3% C17:1w7 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,4% 0,4% 0,6% 0,3% 0,1% C18:0 Esteárico 5,0% 3,6% 3,6% 3,7% 5,1% 3,0% 4,1% 2,7% 3,7% C18:1w9t 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% C18:1w9c 66,9% 2,8% 1,8% 3,2% 3,4% 3,7% 3,4% 1,6% 3,4% ESTÁNDAR INTERNO C18:2w6t 0,1% 0,1% 0,0% 0,0% 0,1% 0,0% 0,0% 0,0% 0,2% C18:2w6c Linoleico (LA) 16,2% 46,6% 31,5% 48,8% 45,4% 55,7% 50,8% 35,7% 53,3% C20:0 Araquidónico 0,5% 0,3% 0,4% 0,5% 0,4% 0,2% 0,5% 0,3% 0,3% C18:3w6 γ-linolénico (GLA) 0,0% 34,4% 50,7% 29,8% 33,1% 26,8% 28,1% 47,7% 27,8% C20:1w9 0,3% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% C18:3w3, α-linolénico (ALA) 0,2% 0,6% 0,6% 0,5% 0,5% 0,5% 0,7% 0,7% 0,4% C21:0 Heneicosanoico 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,0% 0,1% 0,1% 0,1% C20:2w6 Eicosadienoico 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% C22:0 Behénico 0,2% 0,2% 0,2% 0,3% 0,2% 0,1% 0,2% 0,2% 0,2% C20:3w6 Dihomo-γ-linolénico (DGLA) 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% C22:1w9 Erúcico 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% C20:3w3 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% C20:4w6 Araquidónico (AA) 0,0% 0,0% 0,1% 0,0% 0,1% 0,1% 0,0% 0,1% 0,1% C23:0 Tricosanoico 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% C22:2w6 0,0% 0,1% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% C24:0 Lignocérico 0,2% 0,2% 0,1% 0,3% 0,1% 0,1% 0,2% 0,1% 0,1% C20:5w3 Eicosapentanoico (EPA) 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,1% 0,0% 0,1% 0,1% 0,1% C24:1w9c 0,3% 0,2% 0,1% 0,2% 0,1% 0,1% 0,2% 0,1% 0,2% C22:6w3 Docosahexanoico (DHA) 0,3% 0,3% 0,1% 0,3% 0,4% 0,1% 0,0% 0,0% 0,3%
Ácidos grasos totales 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0%
Ácidos grasos saturados 15,1% 14,0% 14,4% 16,6% 15,9% 12,2% 15,4% 13,2% 13,7% W7 & W5 totales 0,4% 0,5% 0,3% 0,3% 0,7% 0,6% 1,0% 0,5% 0,3% W9 totales 67,4% 3,1% 2,1% 3,4% 3,6% 3,9% 3,7% 1,8% 3,7% W6 totales 16,4% 81,2% 82,5% 78,8% 78,7% 82,7% 79,0% 83,6% 81,3% W3 totales 0,6% 1,0% 0,7% 0,8% 0,9% 0,6% 0,8% 0,8% 0,8% Ácidos grasos monoinsaturados tot.67,9% 3,6% 2,4% 3,7% 4,3% 4,5% 4,7% 2,3% 4,0% Ácidos grasos trans totales0,1% 0,1% 0,1% 0,0% 0,1% 0,0% 0,1% 0,1% 0,2% Ácidos grasos poliinsaturados 17,0% 82,2% 83,2% 79,6% 79,6% 83,3% 79,8% 84,4% 82,1%
Proporciones: Poliinsaturados/saturados 1,1 5,9 5,8 4,8 5,0 6,8 5,2 6,4 6,0 Omega 6/Omega 3 29,3 78,7 113,9 95,8 83,3 139,2 102,0 109,9 107,0
AA/EPA 0,3 0,3 1,1 0,5 0,9 1,2 0,6 1,0 1,0 AA/DHA 0,1 0,1 0,8 0,2 0,1 0,7 2,6 1,3 0,2
Los datos de semillas individuales siguen la tendencia vista en los datos de las semillas agrupadas. Puesto que las líneas T1 todavía están segregando, puede estar presente alguna variabilidad en las muestras de semillas
5 individuales debido a inserciones nulas, heterocigóticas y homocigóticas. Se observan concentraciones de GLA que varían del 1,4% (tabla 3: semilla 1 en la línea 1, S1-1) al 50,8% (tabla 7: semilla 2 línea 27, S27-2). Se pueden obtener líneas con perfiles de aceite en semillas similares a los datos de semillas individuales o datos de semillas agrupadas. Ciertas líneas no produjeron semillas. Las que produjeron semillas se seleccionaron para el estudio.
10 La composición de ácidos grasos de semillas de las generaciones Ti y T2 de líneas que expresan la construcción pSB4776 se muestra a continuación en la tabla 8.
Tabla 8: Ejemplos de composición de ácidos grasos en semillas individuales (expresadas como porcentajes) en líneas individuales T1 y T2 de construcción pSBS4766 expresada en S317
Tabla 8 C18:3n6
C16:0
C18:0 C18:1n9 C18:2n6Generación (gamma
(Palmítico)
(Esteárico) (Oleico) (Linoleico)Número de línea
linolénico) 4766-12-4 T1 25,60 6,78 1,90 5,38 59,12
4766-12-4-6 T2 23,38 8,54 3,57 7,66 56,27
4766-21-25 T1 26,10 7,83 1,91 5,36 58,53
4766-21-25-2 T2 24,41 8,45 3,56 9,92 53,67
4766-21-10 Ti 15,35 7,15 1,71 9,37 65,53
4766-21-10-7 T2 25,31 7,00 2,73
7,94 55,17 4766-70-43
T1 17,68 4,87 2,05
10,88 64,52 4766-70-43-9
T2 16,75 4,80 2,33 10,58 64,80
4766-110-10
Ti 23,37 6,65 2,00
5,77 61,26
4766-110-10-25 T2 29,84 8,27 3,66 6,51 50,59
4766-110-11
Ti 19,65 6,66 2,06
7,48 63,85
4766-110-11-32 T2 29,89 8,43 2,25 5,11 52,26
4766-95-4 T1 10,22 6,20 2,00
15,52 65,06 4766-95-4-1
T2 18,05 6,72 2,24 11,13 61
S 3 1 7 VAR 0,00 5,29 2,32 74,81 12
S317 VAR 0,00 5,44 1,64 74,61 16. 10
La composición de ácidos grasos de la semilla T2 es consistente con la medida en la semilla T1. Estos datos muestran que el transgén es estable y heredable, produciendo elevaciones consistentes en GLA a través de generaciones.
Ejemplo 2: Plásmido pSBS4119 y plantas transgénicas que expresan este plásmido
La figura 9 muestra el mapa de una construcción usada para expresar la Δ6-desaturasa de Saprolegnia diclina. El marcador seleccionable vegetal usado en esta construcción era pat que corresponde al gen de fosfinotricin acetil transferasa de Streptomyces viridochromogenes. El marcador bacteriano usado en esta construcción era SpecR. El vector binario base usado para construir este vector es un derivado de pPZP200. Véase, Hajdukiewicz et al. Plant Mol Biol 25: 989, 1994. La secuencia del inserto contenido dentro de los límites del plásmido pPZP200 se muestra a continuación.
pSBS4119 (Casete de expresión de Δ6-desaturasa de S. diclina con selección de PAT) (SEQ ID NO: 2)
La transformación de cártamo con esta construcción fue realizada por SemBioSys Genetics Inc. (Calgary, Canadá). Las técnicas utilizadas por SemBioSys Genetics Inc. incluyen las descritas en el documento WO 2004/111244. Las 5 plantas transgénicas se cultivarán y las semillas se recogerán.
Las semillas se recogieron de plantas transgénicas y la composición de ácidos grasos se realizó usando una modificación del método de cromatografía de gases descrito en "Official Methods and Recommended Practices of the AOCS", 5ª Ed., Method Ce 1-62, American Oil Chemists Society: Champaign, Illinois (1997).
10 Como se muestra a continuación en la tabla 9, los niveles de GLA variaban desde el 11,41% (línea 4119-23-1) al 72,89% (línea 4119-21-3) en semillas T1 de líneas transgénicas que expresaban la Δ6-desaturasa de S. diclina en la
construcción pSBS4119. Se obtuvieron niveles de GLA de más del 60% en varias líneas transgénicas. Puesto que las líneas T1 aún están segregando, las medidas de muestras de semillas individuales pueden variar debido a inserciones nulas, heterocigóticas y homocigóticas. Los niveles de GLA en los controles Centennial y líneas control Nulas no fueron detectables. La variedad Centennial es naturalmente alta en LA y la expresión transgénica de Δ6desaturasa sola es suficiente para aumentar los niveles de GLA.
Tabla 9: Ejemplos de composición de ácidos grasos en semilla única (expresados como porcentajes) en semillas T1 de la construcción pSBS4119 expresada en Centennial
Tabla 9 Número de línea
Tipo C18:3n6 (gammaLinolénico) C16:0 (Palmítico) C18:0 (Esteárico) C18:1n9 (Oleico) C18:2n6 (linoleico)
4119-13-1
Transgénica 46,47 7,11 1,55 7,98 35,87
4119-13-11
Transgénica 51,73 7,07 1,57 6,66 32,00
4119-15-10
Transgénica 61,93 8,02 1,69 6,38 19,68
4119-15-7
Transgénica 69,59 8,03 1,43 5,70 13,33
4119-17-1
Transgénica 69,13 9,58 1,35 5,37 12,06
4119-17-3
Transgénica 67,13 9,33 1,54 6,76 12,29
4119-19-1
NULA 0,00 6,54 1,35 10,23 80,86
4119-19-10
Transgénica 69,85 8,13 1,35 5,42 13,70
4119-20-10
Transgénica 63,22 7,69 1,53 5,88 20,24
4119-21-1
Transgénica 71,06 8,94 1,43 5,02 11,44
4119-21-3
Transgénica 72,89 9,68 1,21 4,12 8,59
4119-2-29
Transgénica 52,33 7,46 1,59 7,00 30,46
4119-2-31
Transgénica 61,23 8,52 1,48 7,38 19,40
4119-23-1
Transgénica 11,41 6,34 1,41 9,28 71,57
4119-23-2
Transgénica 11,99 6,51 1,48 9,07 70,95
4119-24-1
NULA 0,00 6,62 1,35 10,12 80,69
4119-24-2
Transgénica 65,39 8,04 1,46 6,47 16,90
4119-29-2
Transgénica 62,91 7,68 1,30 6,82 19,44
4119-29-4
Transgénica 62,72 7,42 1,31 6,95 19,74
4119-30-1
Transgénica 66,46 7,75 1,41 6,53 16,16
4119-30-10
Transgénica 28,28 5,97 1,59 6,46 56,93
4119-33-15
Transgénica 72,85 8,33 1,32 4,92 10,17
4119-33-18
Transgénica 69,73 7,53 1,33 5,90 13,29
4119-35-1
Transgénica 59,55 7,63 1,56 10,82 17,91
4119-35-3
Transgénica 63,11 7,27 1,29 5,93 20,63
4119-36-14
Transgénica 64,90 8,19 1,41 5,85 17,98
4119-36-15
Transgénica 61,10 8,30 1,39 8,22 19,07
4119-39-17
Transgénica 63,54 7,72 1,65 5,79 19,38
4119-39-18
Transgénica 64,79 7,66 1,57 5,11 18,68
Centannial-4
Control 0,00 6,63 2,22 25,36 65,80
Centennial-6
Control 0,00 6,59 2,03 13,53 76,80
Ejemplo 3: Plásmido pSBS4763 y plantas transgénicas que expresan este plásmido
La figura 10 muestra el mapa de una construcción usada para expresar la Δ6-desaturasa de Mortierella alpina. El marcador seleccionable vegetal usado en esta construcción era pat que corresponde al gen de fosfinotricin acetil
15 transferasa de Streptomyces viridochromogenes. El marcador bacteriano usado en esta construcción era SpecR. El vector binario base usado para construir este vector es un derivado de pPZP200. Véase, Hajdukiewicz et al. Plant Mol Biol 25: 989, 1994. La secuencia del inserto contenido dentro de los límites del plásmido pPZP200 se muestra a continuación.
20 pSBS4763 (Casete de expresión de Δ6-desaturasa de M. alpina con selección de PAT) (SEQ ID NO: 3)
La transformación de cártamo con esta construcción fue realizada por SemBioSys Genetics Inc. (Calgary, Canadá). Las técnicas utilizadas por SemBioSys Genetics Inc. incluyen las descritas en el documento WO 2004/111244. Las 5 plantas transgénicas se cultivarán y las semillas se recogerán.
Las semillas se recogieron de plantas transgénicas y la composición de ácidos grasos se realizó usando una modificación de un método de cromatografía de gases descrito en "Official Methods and Recommended Practices of the AOCS", 5ª Ed., Method Ce 1-62, American Oil Chemists Society: Champaign, Illinois (1997).
10 Como se muestra a continuación en la tabla 10, los niveles de GLA variaron del 7,8% (línea 4763-13-2) al 50,19% (línea 4763-28-1) en semillas T1 de líneas transgénicas que expresan M-desaturasa de M. alpina en la construcción pSBS4763. Puesto que las líneas T1 están aún segregando, las medidas de muestras de semillas únicas pueden variar debido a inserciones nulas, heterocigóticas u homocigóticas. Los niveles de GLA en los controles Centennial y
15 líneas control Nula fueron 0,05 o por debajo. Los niveles de LA en Centennial son naturalmente altos y los niveles de GLA en Centennial se pueden aumentar con la expresión de Δ6-desaturasa solo.
Tabla 10: Ejemplos de composición de ácidos grasos en semilla única de semillas T1 de la construcción pSBS4763 expresada en Centennial 20
Tabla 10 Número de línea
Tipo C18:3n6 (gamma Linolénico) C16:0 (Palmítico) C18:0 (Esteárico) C18:1n9 (Oleico) C18:2n6 (linoleico)
4763-1-1
Transgénica 8,36 6,41 1,50 7,70 74,82
4763-1-2
Transgénica 14,28 6,26 1,56 9,01 67,69
4763-2-1
Transgénica 16,29 6,56 1,53 8,19 66,38
4763-2-2
Transgénica 11,31 6,46 1,59 9,12 70,23
4763-13-2
Transgénica 7,80 6,54 1,53 8,69 74,06
4763-13-3
NULA 0,05 6,27 1,33 8,16 82,98
4763-15-1
Transgénica 11,22 6,24 1,26 7,91 70,36
4763-15-2
Transgénica 19,40 6,56 2,43 7,65 62,65
4763-16-1
Transgénica 17,94 6,22 1,42 7,29 66,36
4763-16-2
Transgénica 11,79 6,08 1,86 7,97 70,78
4763-17-2
NULA 0,04 6,33 1,37 9,19 81,84
4763-17-3
Transgénica 8,43 6,52 1,53 9,56 72,75
4763-18-2
Transgénica 8,73 6,81 2,00 9,33 70,68
4763-18-3
NULA 0,00 6,68 1,88 9,38 80,91
Tabla 10 Número de línea
Tipo C18:3n6 (gamma Linolénico) C16:0 (Palmítico) C18:0 (Esteárico) C18:1n9 (Oleico) C18:2n6 (linoleico)
4763-19-4
Transgénica 12,71 6,72 1,87 7,16 68,74
4763-19-1 5
Transgénica 14,55 6,46 1,75 7,41 67,84
4763-21-2
Transgénica 20,62 6,89 2,37 5,51 59,73
4763-21-11
Transgénica 20,99 6,93 1,77 6,12 61,40
4763-22-4
Transgénica 10,55 6,45 1,53 7,47 173,23
4763-22-5
Transgénica 16,32 6,71 1,47 8,05 66,28
4763-23-12
Transgénica 34,02 6,92 2,06 5,21 49,27
4763-23-14
Transgénica 36,92 7,58 1,60 7,20 45,69
4763-24-6
Transgénica 17,67 8,80 3,89 7,22 56,06
4763-24-7
Transgénica 14,42 8,78 5,30 9,12 57,06
4763-25-2
Transgénica 18,05 8,68 4,35 7,01 54,70
4763-25-3
Transgénica 26,62 10,06 7,29 6,10 38,93
4763-27-3
Transgénica 40,91 8,92 3,40 5,04 24,89
4763-27-9
Transgénica 19,61 14,67 15,70 3,95 19,56
4763-28-1
Transgénica 50,19 9,71 1,88 6,14 30,45
4763-28-2
Transgénica 37,35 7,78 1,61 6,18 46,12
4763-30-12
Transgénica 8,04 7,22 2,11 7,87 73,03
4763-30-13
Transgénica 9,08 7,55 2,17 9,44 69,75
Centennial-1
Control 0,00 6,33 2,18 15,74 74,86
Centennial-3
Control 0,00 6,97 2,13 13,92 76,18
Estos datos muestran que se pueden usar Δ6-desaturasas de una variedad de fuentes para aumentar la producción de GLA en cártamo. La expresión transgénica de Δ6-desaturasa en una variedad de planta que naturalmente alta en LA, como el variedad Centennial, es eficaz en aumentar el contenido de GLA.
5 Se pretende que las siguientes declaraciones de la invención caractericen los posibles elementos de la invención según la descripción anterior dada en la especificación.
Lista de secuencias
<110> KNAUFF, CIC C. SHEWMAKER, CHRISTINE FLIDER, FRANK J. EMLAY, DONALD
15 REY, ERIC
<120> CÁRTAMO CON ÁCIDO GAMMA-LINOLÉNICO ELEVADO
<130> 595792000840 20
<150> US 60/684.134
<151>
<150> US 60/735.984 25 <151>
<160> 19
<170> FastSEQ para Windows versión 4.0 30
<210> 1
<211> 7803
<212> ADN
<213> Secuencia artificial 35
<220>
<223> Plásmido pSBS4766
<400> 1
<210> 2
<211> 5003 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Plásmido pSBS4119 10
<400> 2
<210> 3
<211> 5013 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Plásmido pSBS4763 10
<400> 3
<210> 4
<211> 448
<212> PRT
<213> Borago officinalis
<400> 4
<210> 5
<211> 453
<212> PRT
<213> Primula farinosa
<400> 5
<210> 6
<211> 453
<212> PRT
<213> Primula vialli
<400> 6
<210> 7
<211> 457
<212> PRT
<213> Mortierella alpina
<400> 7
<210> 8
<211> 523
<212> PRT
<213> Mucor circinielloides
<400> 8
<210> 9
<211> 456
<212> PRT
<213> Thraustochytrium aureum
<400> 9
<210> 10
<211> 453
<212> PRT
<213> Saprolegnia diclina
<400> 10
<210> 11
<211> 467
<212> PRT
<213> Mucor circinelloides
<400> 11
<210> 12
<211> 383
<212> PRT
<213> Borago officinalis
<400> 12
<210> 13
<211> 382
<212> PRT
<213> Helianthus annuus
<400> 13
<210> 14
<211> 384
<212> PRT
<213> Brassica napus
<400> 14
<210> 15
<211> 388
<212> PRT
<213> Oriza sativa
<400> 15
<210> 16
<211> 399
<212> PRT
<213> Mortierella alpina
<400> 16
<210> 17
<211> 424
<212> PRT
<213> Aspergillus furnigatus
<400> 17
<210> 18
<211> 436
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 18
<210> 19
<211> 433
<212> PRT
<213> Candida albicans
<400> 19

Claims (8)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una planta de cártamo transgénica que comprende un promotor recombinante funcional en dicha planta de cártamo en donde dicho promotor está operativamente unido a una secuencia de ADN recombinante que
    5 codifica una Δ6-desaturasa de Saprolegnia diclina con SEQ ID NO: 10, en donde dicha planta de cártamo produce semillas y en donde el aceite producido de dichas semillas comprende ácido gamma-linolénico (GLA) a un nivel del 45%-50% o mayor en peso.
  2. 2. La planta de cártamo transgénica de la reivindicación 1, en donde dicho promotor es un promotor específico 10 de semilla.
  3. 3. La planta de cártamo transgénica de la reivindicación 2, en donde el promotor específico de semilla es un promotor de oleosina o un promotor de linina.
    15 4. Semilla derivada de la planta transgénica de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende un promotor recombinante funcional en dicha planta de cártamo en donde dicho promotor está operativamente unido a una secuencia de ADN recombinante que codifica una Δ6-desaturasa de Saprolegnia diclina con SEQ ID NO: 10, en donde el aceite producido de dichas semillas comprende ácido gamma-linolénico (GLA) a un nivel del 45%-50% o mayor en peso.
  4. 5. Un método para producir ácido gamma-linolénico (GLA) en una semilla de cártamo, dicho método comprende cultivar una planta de cártamo que comprende un promotor recombinante funcional en dicha planta de cártamo en donde dicho promotor está operativamente unido a una secuencia de ADN recombinante que codifica una Δ6-desaturasa de Saprolegnia diclina con SEQ ID NO: 10, en donde dicha planta de cártamo se
    25 cultiva en condiciones en las cuales se expresa dicha Δ6-desaturasa, y en donde dicha planta de cártamo produce semillas y en donde el aceite producido de dichas semillas comprende ácido gamma-linolénico (GLA) a un nivel del 45%-50% o mayor en peso.
  5. 6.
    El método según la reivindicación 5, en donde dicho promotor es un promotor específico de semilla. 30
  6. 7. El método según la reivindicación 6, en donde el promotor específico de semilla es un promotor de oleosina o uno de linina.
  7. 8.
    El método según cualquiera de las reivindicaciones 5, 6 o 7 en donde dicho método comprende además aislar 35 semillas de dicha planta de cártamo.
  8. 9. El método según la reivindicación 8, en donde dicho método comprende además extraer aceite de dichas semillas de la planta de cártamo.
    Ruta para la biosíntesis de GLA
    Figura 1
    Alineamiento de aminoácidos de delta-6 desaturasas vegetales
    Similitud: 99,1%; Identidad: 62,7%
    AAC49700 -Borago officinalis (448) AAP23034 -Primula farinosa (453) AAP23036 -Primula vialli (453)
    Figura 2
    Alineamiento de aminoácidos de delta-6 desaturasas de hongos
    Figura 3
    Similitud : 53,7%; Identidad: 7,1%
    AAF08685 Mortierella alpina D6 (457) BAB6905 Mucor circinelloides D6 (467) BAC57562 Mucor circinelloides D6 (532) Thraustochytrium aureum D6 (456) (SEQ ID NO: 33 del documento WO02081668 Saprolegnia diclina D6 (453) (SEQ ID NO: 14 del documento US 6.635.451)
    Regiones conservadas en las delta-6 desaturasas
    Figura 4
    Alineamiento de aminoácidos de delta-12 desaturasas vegetales
    Similitud: 95,4%; Identidad: 57,7%
    AAT02411 -Brassica napus (384) AAC31698 -Borago officinalis (383) AAL68983 -Helianthus annuus (382) BAD12887 -Oriza sativa (388)
    Figura 5
    Alineamiento de aminoácidos de delta-12 desaturasas de hongos
    Similitud: 83,2%; Identidad: 23,9%
    CAE47978 -Aspergillus furnigatus (424)
    Figura 6 EAK94955 -Candida albicans (436) EAL03493 -Candida albicans (433) AAF08684 -Mortierella alpina (399)
    Regiones conservadas en las delta-12 desaturasas
    Figura 7
    Plásmido pSBS4766 para la expresión de delta-6 y delta-12 desaturasas de M. alpina
    Figura 8
    Plásmido pSBS4119 para la expresión de delta-6 desaturasa de S. diclina
    Figura 9
    Plásmido pSBS4763 para la expresión de delta-6 desaturasa de M. alpina
    Figura 10
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