JP2009543561A

JP2009543561A - イネの脂肪酸組成の改変

Info

Publication number: JP2009543561A
Application number: JP2009519744A
Authority: JP
Inventors: ホワイトロウ，エラ; ラーマン，サデカー; リー，ゾンギー; リュー，チン; シング，シュリンダー，パル; フェイター，ロバート，チャールズデ
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Priority date: 2006-07-14
Filing date: 2007-07-13
Publication date: 2009-12-10
Also published as: CA2693630C; EP2046108A4; CN101516181B; CN105123532B; EP2046108A1; JP6042791B2; AU2007272316A1; AU2007272316B2; JP2014087347A; CN101516181A; US10260021B2; US9351507B2; US8530724B2; US20140120225A1; US20090308041A1; CN105123532A; WO2008006171A1; BRPI0714711A2; CA2693630A1; US20160272919A1

Abstract

本発明は、オレイン酸、パルミチン酸および／またはリノール酸の変化したレベルを有する米油、米ぬかおよびイネ種子に関する。本発明はまた、生産される米油、米ぬかおよびイネ種子がオレイン酸、パルミチン酸および／またはリノール酸の変化したレベルを有するようにイネ植物を遺伝的に改変するための方法を提供する。特にこれはＦａｄ２および／またはＦａｔＢ発現の調節を通して達成される。

Description

本発明は、オレイン酸、パルミチン酸および／またはリノール酸の変化したレベルを有する米油、米ぬかおよびイネ種子に関する。本発明はまた、生産される米油、米ぬかおよびイネ種子がオレイン酸、パルミチン酸および／またはリノール酸の変化したレベルを有するようにイネ植物を遺伝的に改変するための方法を提供する。

植物油は、ヒトのための食事性脂肪の重要な供給源であり、先進国ではカロリー摂取量の約２５％を占める(Broun et al., 1999)。植物油の現在の世界生産量は年間約１億１千万トンであり、そのうち８６％がヒトの消費のために使用される。これらの油のほとんど全部が脂肪種子作物、例えばダイズ、ナタネ、ヒマワリ、綿実および落花生、または栽培樹木、例えばパーム、オリーブおよびココナツから得られる(Gunstone, 2001; Oil World Annual, 2004)。ヒトの健康の様々な局面に対する食用油の個々の脂肪酸成分の影響についての科学的理解と社会的認識の高まりは、様々な食品適用のための必要な機能性を保持しながら改善された栄養価を有する改変植物油の開発を促している。これらの改変は、植物脂肪酸合成に関する代謝経路およびこれらの経路のための酵素をコードする遺伝子についての知識を必要とする(Liu et al., 2002a; Thelen and Ohlrogge, 2002)。

心臓血管疾患、癌および種々の炎症状態への様々な油脂の栄養的影響、特に油脂の成分の影響には多大の関心が寄せられている。食事中の高レベルのコレステロールおよび飽和脂肪酸は心疾患の危険度を上昇させると考えられ、これは、コレステロールに富む飽和動物性脂肪の消費を抑え、コレステロール不含の不飽和植物油を推奨する栄養上の勧告を導いた(Liu et al., 2002a)。

動物性脂肪中に存在するコレステロールの食事性摂取は血液中の総コレステロールのレベルを有意に上昇させ得るが、同時に、油脂を含む脂肪酸自体が血清コレステロールレベルに有意の作用を及ぼし得ることも認められた。特に興味深いのは、血液中の望ましくない低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）および望ましい高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）形態のコレステロールへの食事性脂肪酸の影響である。一般に、飽和脂肪酸、特に植物油中に存在する主要飽和脂肪酸であるミリスチン酸（１４：０）およびパルミチン酸（１６：０）は、血清中のＬＤＬ−コレステロールを上昇させ、その結果として心臓血管疾患の危険度を上昇させるという望ましくない性質を有する(Zock et al., 1994; Hu et al., 1997)。しかし、植物油中に存在するその他の主要飽和脂肪酸であるステアリン酸（１８：０）が、ＬＤＬ−コレステロールを上昇させず、実際上総コレステロールを低下させ得ることは広く確立されている(Bonanome and Grundy, 1988; Dougherty et al., 1995)。ステアリン酸は、それ故、一般に心臓血管疾患の危険度に関して少なくとも中立とみなされている(Tholstrup, et al., 1994)。他方で、不飽和脂肪酸、例えば一価不飽和オレイン酸（１８：１）および多価不飽和リノール酸（１８：２）およびα−リノレン酸（ＡＬＡ、１８：３）は、ＬＤＬ−コレステロールを低下させ(Mensink and Katan, 1989; Roche and Gibney, 2000)、それによって心臓血管疾患の危険度を低減するという有益な性質を有する。

栄養的には望ましいが、高度不飽和油はあまりに不安定で、多くの食品適用における使用、特にそれらが長期間にわたって高温と酸化条件に曝露される商業的なたっぷりの油による揚げ物のためには使用できない。そのような条件下では、不飽和油中に存在する数多くの炭素二重結合の酸化分解が短鎖アルデヒド、ヒドロペルオキシドおよびケト誘導体の発生を生じさせ、極性化合物のレベルを上昇させることによって不快な風味を与え、油のフライ性能を低下させる(Chang et al., 1978; Williams et al., 1999)。

油の製造加工業者および食品製造業者は、油中の飽和脂肪酸のレベルを低下させるために伝統的に水素化に頼っており、それによってフライ適用における酸化安定性を上昇させ、同時にマーガリンおよびショートニングにおける使用のための固形脂肪を生成する。水素化は、炭素二重結合を炭素一重結合に変換することによって油の不飽和度を低下させる化学工程である。完全な水素化は十分に飽和した脂肪を生じる。しかし、部分水素化の工程は飽和脂肪酸と一価不飽和脂肪酸の両方の高レベルを生じさせる。部分水素化の間に形成される一価不飽和物の一部は、天然に生じるシス異性体ではなくトランス異性体形態（エライジン酸、オレイン酸のトランス異性体など）である(Sebedio et al., 1994; Fernandez San Juan, 1995)。シス不飽和脂肪酸と異なり、トランス脂肪酸は、現在では、血清ＬＤＬコレステロールレベルを上昇させ(Mensink and Katan, 1990; Noakes and Clifton, 1998)、血清ＨＤＬコレステロールレベルを低下させる(Zock and Katan, 1992)上でパルミチン酸と同程度に強力であることが公知であり、それ故心臓血管疾患の高い危険度に寄与する(Ascherio and Willett, 1997)。トランス脂肪酸の栄養阻害作用についての認識の高まりの結果として、現在食品産業では硬化油の使用を避け、栄養的に有益であり、水素化を必要とせずに必要な機能性を提供し得る油脂、特に液体油が必要とされるオレイン酸若しくは固体または半固体脂肪が好ましいステアリン酸に富むものを支持する傾向が高まりつつある。

植物油はほぼ全面的にトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）分子で構成され、ＴＡＧ分子は、グリセロール骨格にエステル化された３本の脂肪酸（アシル）鎖から成り、オレオソームと呼ばれる特殊な油体構造内に沈着している(Stymne and Stobart, 1987)。これらの貯蔵脂質は、光合成できるようになるまで発芽実生のためのエネルギー源として働く。通常使用される食用植物油は、一般に５つの主要脂肪酸−飽和パルミチン酸およびステアリン酸、一価不飽和オレイン酸、および多価不飽和リノール酸およびα−リノレン酸から成る。脂肪酸に加えて、植物油はまた、いくつかの重要な微量成分、例えばトコフェロール、フィトステロール、テルペンおよび混合イソプレノイドを含む。これらの微量成分は、一部が皮膚の健康、加齢、視力および血中コレステロールに有益な作用を及ぼす、若しくは乳癌または心臓血管疾患を予防することが示されたため、関心が高まりつつある(Theriault et al., 1999; Moghadasian and Frohlich, 1999)。
種子における脂肪酸およびＴＡＧ合成
発育中の種子における脂肪酸合成についての代謝経路の概略図を図１に示す。脂肪酸合成の初期段階は細胞の色素体画分で起こり、そこで脂肪酸炭素鎖の合成がＣ２分子から開始され、段階的な縮合工程を通して伸長されて、それにより付加的なＣ２炭素単位がマロニル−ＡＣＰから伸長アシル鎖に付与される。この連続工程における最初の段階は、マロニル−ＡＣＰとアセチル−ＣｏＡの縮合を含み、β−ケトアシルシンターゼＩＩＩ（ＫＡＳＩＩＩ）酵素によって触媒される。その後の縮合工程はβ−ケトアシルシンターゼＩ（ＫＡＳＩ）によって触媒され、アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）に連結された飽和Ｃ１６アシル鎖、パルミトイル−ＡＣＰの最終的な形成をもたらす。色素体内での最終的な伸長はβ−ケトアシルシンターゼＩＩ（ＫＡＳＩＩ）によって触媒され、飽和Ｃ１８アシル鎖、ステアロイル−ＡＣＰを形成する。不飽和化が起こるとき、最初の二重結合が色素体内の可溶性酵素、ステアロイル−ＡＣＰΔ９−デサチュラーゼによってＣ１８鎖のΔ９位置に導入され、一価不飽和Ｃ１８：１オレオイル−ＡＣＰを生成する。

そのようにして合成された脂肪酸は、さらなる改変および色素体脂質への組込みのために色素体内に保持されるか、またはアシルチオエステラーゼによってそれらのＡＣＰから放出されて遊離脂肪酸を生成し、遊離脂肪酸はさらなる修飾および最終的なＴＡＧ分子への組込みのためにサイトゾルへと輸送される。高等植物は、少なくとも２つの型のアシルチオエステラーゼ、すなわち不飽和アシルＡＣＰであるオレオイルＡＣＰに対して基質特異性を有するＦａｔＡ、および飽和アシルＡＣＰに選択性を有するＦａｔＢを有することが認められた(Jones et al.. 1995; Voelker et al., 1996)。

色素体を出ると、遊離脂肪酸は補酵素Ａ（ＣｏＡ）へとエステル化され、その後リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）およびホスファチジルコリン（ＰＣ）を形成するためのグリセロール３−リン酸（Ｇ−３−Ｐ）骨格への転移のために使用可能となる。加えて、一部の植物、特にアブラナ(Brassica)種では、ＣｏＡへとエステル化されたオレイン酸はエイコサン酸（Ｃ２０：１）およびエルカ酸（Ｃ２２：１）を形成するように伸長され得る。ＰＣへとエステル化されたオレイン酸は、ＴＡＧへの組込みの前にさらなる修飾のために使用可能となる。食用油では、ＰＣへの主要な修飾は、それぞれミクロソームΔ１２−デサチュラーゼ（Ｆａｄ２）およびΔ１５−デサチュラーゼ（Ｆａｄ３）酵素による、リノール酸およびα−リノレン酸を形成するオレイン酸の連続的不飽和化である。
既存の脂肪酸生合成酵素の改変
遺伝子不活性化アプローチ、例えば転写後の遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）は、脂肪酸生合成遺伝子を不活性化し、脂肪種子作物において栄養的に改善された植物油を生み出すために適用されて成功を収めた。例えば種子油中に８０％のオレイン酸を含むダイズ系統が、Ｆａｄ２がコードするミクロソームΔ１２−デサチュラーゼの共抑制によって創製された(Kinney, 1996)。これはΔ１２不飽和化のレベルを低下させ、高い量のオレイン酸の蓄積をもたらした。同様のアプローチを用いて、Ｆａｄ２遺伝子の共抑制に基づくサイレンシングがバラシカ・ナパス（Brassica napus）およびＢ．ユンセア（B.juncea）においてオレイン酸レベルを上昇させるために使用された(Stoutjesdijk et al., 2000)。同様に、ナタネから得られるＦａｄ２遺伝子の突然変異型対立遺伝子の綿実におけるトランスジェニック発現は、内因性綿Ｆａｄ２遺伝子の発現を抑制できることが認められ、一次トランスジェニック綿系統の約半数において高いオレイン酸含量を生じさせた(Chapman et al., 2001)。もう１つの変法では、自己切断リボザイムによって終結されるＦａｄ２遺伝子のダイズにおけるトランスジェニック発現は、内因性Ｆａｄ２遺伝子を不活性化することができ、高いオレイン酸レベルを生じさせた(Buhr et al., 2002)。ＲＮＡｉを介した遺伝子サイレンシング手法はまた栄養的に改善された脂肪酸組成を有する脂肪種子を開発するためにも用いられてきた。綿実において、綿Ｆａｄ２遺伝子ファミリーの種子特異的成員である、ｇｈＦａｄ２−１を標的とするヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）遺伝子サイレンシング構築物のトランスジェニック発現は、正常レベルである油中の総脂肪酸の１５％から７７％までオレイン酸の上昇を生じさせた(Liu et al., 2002b)。この上昇は主としてリノール酸を代償とするものであり、リノール酸は正常レベルの６０％〜４％という低レベルまで低下した。
穀物中の脂肪酸
脂肪種子における脂肪酸生合成と改変に関して為されてきた多大の研究に対し、穀物中の油の改変は比較的検討されていない。これはおそらく穀粒中の油のレベルがはるかに低いこと（約１．５〜６重量％）、そしてその結果として認識されているヒトの食事における穀物からの油の重要性がより低いことが原因である。

イネ(Oryza sativa L.)は、発展途上国世界における最も重要な穀物作物であり、特に世界の総生産量の約９０％を生産するアジアにおいて、広く生育されている。世界中のイネの圧倒的大部分は、外側のぬか層と胚芽（胚および胚盤）を除去するための収穫した穀物を摩砕することによって生産される、基本的に米粒の内乳である「白米」として食されている。これは主として、「玄米」が、特に暑い熱帯条件下では、貯蔵時に良好に保存できないために行われる。

穀粒、例えばイネ（４％）の油含量は、油が粒子の重量の６０％までを占めることがある脂肪種子に比べて極めて低い(Ohlrogge and Jaworski, 1997)。しかし、脂質はそれでも穀物胚の乾燥重量の３７％までを構成し得る(Choudhury and Juliano 1980)。米粒の脂質含量の大部分は外側ぬか層に認められる(Resurreccion et al., 1979)が、一部は内乳にも存在し、少なくとも一部はデンプンと結合している（表１および２）。米油中の主たる脂肪酸は、パルミチン酸（１６：０）（ＴＡＧ中の総脂肪酸の約２０％）、オレイン酸（１８：１）（約４０％）およびリノール酸（１８：２）（約３４％）である(Radcliffe et al, 1997)。種々のイネ栽培品種において天然に生じるレベルは多様であり、例えばオレイン酸については３７．９％〜４７．５％、リノール酸（１８：２）については３８．２％〜３０．４％である(Taira et al., 1988)。

ＦａｔＢ遺伝子は、脂肪種子植物および双子葉植物においてはその後パルミトイル−ＣｏＡに変換される、遊離パルミチン酸の生産を触媒することに高親和性を有することが示されたが、イネまたは他の穀物におけるＦａｔＢの役割に関する情報は報告されていない。

脂肪酸デサチュラーゼの一部はイネにおいて特性決定されているが、Ｆａｄ２は特性決定されていない。Akagai et al., (1995)は、発育中の種子からステアロイルアシルキャリアータンパク質デサチュラーゼをコードするイネの４番染色体上の遺伝子のヌクレオチド配列を公表した。その遺伝子産物は、ステアロイルＡＣＰからのオレオイルＡＣＰの生産に関与する。Kodama et al. (1997)は、イネにおけるＦａｄ３の構造、染色体位置および発現を報告した。

ダイズＦａｄ３発現を使用することにより、イネ種子油におけるリノレン酸（１８：３）の割合が１０倍上昇した(Anai et al., 2003)。ごく最近、細菌からのリノール酸イソメラーゼ遺伝子の導入による、イネにおける共役リノール酸の生産が報告された(Kohno-Murase et al., 2006)；共役リノール酸は抗癌活性を有することが報告されている。同じように、固定化した微生物酵素を使用して、一部の疾患において食事性脂質利用を改善し得るカプリン酸を組み込むための米ぬか油のインビトロでの改変も報告された(Jennings and Akoh, 2000)。トウモロコシでは、Ｆａｄ２およびＦＡ−６デサチュラーゼ遺伝子が配列決定され、染色体にマップされた(Mikkilinen and Rocheford, 2003)。Ｆａｄ２およびＦａｄ６クローンは、トウモロコシ穀粒中のオレイン酸／リノール酸比に関していかなるＱＴＬにもマップすることができなかった。イネ、トウモロコシまたはコムギから特性決定された他のＦａｄ２またはＦａｔＢ遺伝子について公表された報告はない。
イネの貯蔵
高温での長期間にわたるイネの貯蔵は、ぬか油の加水分解および酸化劣化のために穀物の品質を低下させる。玄米を生産するために収穫の間に外側の殻を除去することは、外側のぬか層を乱し、油を外層に拡散させる。次に内因性および微生物リパーゼがトリグリセリドの遊離脂肪酸（ＦＦＡ）への加水分解を触媒し、その後ＦＦＡは酸化されて異臭を生じる(Yasumatsu et al., 1966, Tsuzuki et al, 2004, Zhou et al, 2002 Champagne and Grimm, 1995)。

ヘキサナールは、高温で貯蔵された生および調理済み玄米の上部空間において増加する主要成分である(Boggs et al., 1964, Shibuya et al., 1974, Tsugita et al., 1983)。しかし、ヘキサナール自体は「異（off）」臭の主原因ではない；劣化した米の好ましくない臭いと風味は、おそらく貯蔵後に増加する揮発性物質の混合物によるものである。これらは、アルカナール、アルケナール、芳香族アルデヒド、ケトン、２−ペンチルフラン、４−ビニルフェノールその他を含む(Tsugita et al., 1983)。それにもかかわらず、貯蔵の間のヘキサナールレベルは玄米中のリノール酸（１８：２）の酸化に関連することが示されており、それ故酸化劣化の良好な指標である(Shin et al., 1986)。

リノール酸からのヘキサナールの産生はリポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）酵素によって触媒され得る(St Angelo et al., 1980)。Suzuki et al. (1999)は、Ｌｏｘ３を欠くイネ品種を同定し、３５℃で８週間の突然変異型穀物の貯蔵時に、生および調理済み玄米粒の両方について上部空間の蒸気中でより少ないヘキサナールが形成されることを認めた。彼らはまた、突然変異型イネがより少ないペンタナールおよびペンタノールを形成することを認めた。

米粒の外層を研磨することを通して得られる栄養素に富む外側米ぬか層は、抗酸化化合物、例えばトコフェロールおよび植物エストロゲンでもあるγ−オリザノールを含有する、優れた食物源である(Rukmini and Raghuram, 1991)。米ぬか油中に存在する生物活性化合物は、ヒトにおいてコレステロールを低下させることが認められた(Most et al., 2005)。これらの生物活性成分はまた、高コレステロール食を給餌したラットにおいて脂質プロフィールを改善することも示されている(Ha et al., 2005)。主としてぬかにおいて認められたもう１つの重要な成分はビタミンＡ前駆体である。しかし、これらの栄養および健康上の恩恵は、米を研磨することおよび白米の消費を通して失われる。

Broun et al., (1999) Annu. Rev. Nutr. 19: 197-216 Gunstone (2001) Inform 11: 1287-1289 Oil World Annual (2004) International Seed Testing Association (ISTA) Mielke GmbH, Hamburg, Germany Liu et al. (2002a). J. Am. Coll. Nutr. 21 : 205S-211S Thelen and Ohlrogge (2002) Metabolic Engineering 4: 12-21 Zock et al. (1994) Arterioscler Thromb. 14: 567-575 Hu et al. (1997). N. Engl. J. Med. 337: 1491-1499 Bonanome and Grundy (1988). N. Engl. Med. 318: 1244-1248 Dougherty et al. (1995). Am. J. Clin. Nutr. 61 :1120-1128 Tholstrup et al. (1994) Am. J. Clin. Nutr. 59: 371-377 Mensink and Katan (1989) Roche and Gibney (2000) Am. J. Clin. Nutr. 71: 232S-237S Chang et al., (1978). J. Am. Oil Chem. Soc. 55: 718-727 Williams et al. (1999) J. Am. Coll. Cardiol. 33:1050-1055 Sebedio et al. (1994) Fett. Wiss. Technol. 96: 235-239 Fenandez San Juan (1995). Alimentaria 33: 93-98 Mensink and Katan (1990). N. Engl. J. Med. 323: 439-445 Noakes and Clifton (1998) Am. J. Clin. Nutr. 98: 242-247 Zock and Katan, 1992 Ascherio and Willett (1997) Am. J. Clin. Nutr. 66: 1006S-1010S Stymne and Stobart (1987) Lipids, Vol. 9: 175-214 Theriault et al. (1999). Clin. Biochem. 32: 309-19 Moghadasian and Frohlich (1999) Am. J. Med. 107: 588-94 Jones et al. (1995) Plant Cell 7: 359-371 Voelker et al. (1996). Plant J. 9: 229-241 Kinney (1996) J. Food Lipids 3 : 273-292 Stoutjesdijk et al., (2000). Biochem. Soc. Trans. 28: 938-940 Chapman et al., (2001). J. Am. Oil Chem. Soc. 78: 941-947 Buhr et al. (2002). Plant J. 30: 155-163 Liu et al. (2002b). Plant Physiol. 129: 1732-1743 Ohlrogge and Jaworski (1997) Annu Rev Plant Physiol Plant MoI Biol. 48:109-136 Choudry et al. (1980) Phytochemistry 19: 1063-1069 Resurreccion et al (1979) Journal of the Science of Food and Agriculture, 30: 475-481 Radcliffe et al (1997) Biochem Arch 13: 87-95 Taira et al. (1988) J. Agric. Food Chem. 34:542-545 Morrison (1988) J Cereal Sci. 8:1-15 Akagi et al. (1995) Plant Physiol. 108, 845-846 Kodama et al. (1997) Plant Molecular Biology 33:493-502 Anai et al. (2003) Plant Cell Rep. 21,988-992 Kohno-Murase et al. (2006). Transgenic Research 15:95-100 Jennings and Akoh (2000) Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48:4439-4443 Mikkilineni and Rocheford (2003) Theor. Applied Genetics, 106, 1326-1332 Yasumatsu et al. (1966) Agric. Biol. Chem. 30:483-486 Tsuzuki et al (2004) Lipids 39:475-480 Zhou et al. (2002) Journal of Cereal Science 35:65-78 Champagne et al. (1995)Cereal Chem 72:255-258 Boggs et al. (1964) J. Food Sci. 29:487-489 Shibuya et al. (1974) Journal of the Japanese Society of Food Science and Technology 21 : 597-603 Tsugita et al (1983) Agricultural and Biological Chemistry 47: 543-549 Shin et al. (1986) J. Food Sci. 51:460-463 St Angelo et al. (1980) J Lipids 1:45-49 Suzuki et al. (1999) J. Agric. Food Chem. 47: 1119-1124 Rukmini et al. (1991). Journal of The American College of Nutrition 10: 593-601 Most et al. (2005) Am J Clin Nutr 81 :64-8 Ha (2005) Nutrition research 25, 597-606.

例えばヒトの食事における玄米のより大きな使用を可能にする、健康上の利益のための改善された油組成を有する穀物を生産し、同時に貯蔵時により安定である穀物品種、例えばイネ品種に対する需要が現在も存在する。

１つの態様では、本発明は、約４８％より多くのオレイン酸、約１７％未満のパルミチン酸、約３０％未満のリノール酸および／またはそれらの任意の組合せを含む脂肪酸組成を有する米油を提供する。

１つの実施形態では、オレイン酸対リノール酸の比率は１．５：１より多く、好ましくは２：１より多く、より好ましくは３：１より多く、さらに一層好ましくは４：１より多い。

もう１つの実施形態では、米油は、約４８％より多くのオレイン酸、約１７％未満のパルミチン酸および約３０％未満のリノール酸を含む脂肪酸組成を有する。

さらなる実施形態では、米油は、約４０％より多くのオレイン酸、好ましくは約５０％より多くのオレイン酸、さらに一層好ましくは約６０％より多くのオレイン酸を含む脂肪酸組成を有する。１つの実施形態では、米油の脂肪酸組成は、４８〜８０％のオレイン酸、６〜１６％のパルミチン酸および１０〜２５％のリノール酸の範囲内である。

さらにもう１つの実施形態では、米油は、約１６％未満のパルミチン酸、好ましくは約１５％未満のパルミチン酸、より好ましくは約１４％未満のパルミチン酸、より好ましくは約１３％未満のパルミチン酸、さらに一層好ましくは約１２％未満のパルミチン酸を含む脂肪酸組成を有する。

もう１つの実施形態では、米油は、約２５％未満のリノール酸、好ましくは約２０％未満のリノール酸、さらに一層好ましくは約１５％未満のリノール酸を含む脂肪酸組成を有する。

もう１つの態様では、本発明は、約４８％より多くのオレイン酸、約１７％未満のパルミチン酸、約３０％未満のリノール酸および／またはそれらの任意の組合せを含む脂肪酸組成を有する米ぬかを提供する。

もう１つの実施形態では、米ぬかは、約４８％より多くのオレイン酸、約１７％未満のパルミチン酸および約３０％未満のリノール酸を含む脂肪酸組成を有する。

さらなる実施形態では、米ぬかは、約４０％より多くのオレイン酸、好ましくは約５０％より多くのオレイン酸、さらに一層好ましくは約６０％より多くのオレイン酸を含む脂肪酸組成を有する。１つの実施形態では、米ぬかの脂肪酸組成は、４８〜８０％のオレイン酸、６〜１６％のパルミチン酸および１０〜２５％のリノール酸の範囲内である。

さらにもう１つの実施形態では、米ぬかは、約１６％未満のパルミチン酸、好ましくは約１５％未満のパルミチン酸、より好ましくは約１４％未満のパルミチン酸、より好ましくは約１３％未満のパルミチン酸、さらに一層好ましくは約１２％未満のパルミチン酸を含む脂肪酸組成を有する。

もう１つの実施形態では、米ぬかは、約２５％未満のリノール酸、好ましくは約２０％未満のリノール酸、さらに一層好ましくは約１５％未満のリノール酸を含む脂肪酸組成を有する。

さらなる態様では、本発明は、約４８％より多くのオレイン酸、約１７％未満のパルミチン酸、約３０％未満のリノール酸および／またはそれらの任意の組合せを含む脂肪酸組成を有するイネ種子を提供する。

もう１つの実施形態では、イネ種子は、約４８％より多くのオレイン酸、約１７％未満のパルミチン酸および約３０％未満のリノール酸を含む脂肪酸組成を有する。

さらなる実施形態では、イネ種子は、約４０％より多くのオレイン酸、好ましくは約５０％より多くのオレイン酸、さらに一層好ましくは約６０％より多くのオレイン酸を含む脂肪酸組成（すなわち種子の内部の油の）を有する。１つの実施形態では、イネ種子の脂肪酸組成は、４８〜８０％のオレイン酸、６〜１６％のパルミチン酸および１０〜２５％のリノール酸の範囲内である。

さらにもう１つの実施形態では、イネ種子は、約１６％未満のパルミチン酸、好ましくは約１５％未満のパルミチン酸、より好ましくは約１４％未満のパルミチン酸、より好ましくは約１３％未満のパルミチン酸、さらに一層好ましくは約１２％未満のパルミチン酸を含む脂肪酸組成を有する。

もう１つの実施形態では、イネ種子は、約２５％未満のリノール酸、好ましくは約２０％未満のリノール酸、さらに一層好ましくは約１５％未満のリノール酸を含む脂肪酸組成を有する。

米ぬかまたはイネ種子に関して上述した実施形態のいずれかにおいて、脂肪酸組成は、典型的には実施例１で述べるような油の抽出およびＦＡＭＥ／ＧＣによる分析によって決定される。個々の脂肪酸に関する組成は、油中の総脂肪酸のパーセント（ｗ／ｗ）として表わされる。

さらなる態様では、本発明の米油、本発明の米ぬか、および／または本発明のイネ種子を生産するイネ植物が提供される。

もう１つの態様では、本発明は、イネ植物の細胞内に存在するとき、ポリヌクレオチドを欠く細胞と比較して細胞内のＦａｄ２および／またはＦａｔＢポリペプチドの活性のレベルを下方調節する単離ポリヌクレオチドを提供する。

好ましくは、ポリヌクレオチドは、イネ植物の細胞においてポリヌクレオチドの発現を指令することができるプロモーターに作動可能に連結されている。

１つの実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも１個のＦａｄ２および／またはＦａｔＢ遺伝子から発現されるｍＲＮＡレベルを下方調節する。

適切なポリヌクレオチドの例は、アンチセンスポリヌクレオチド、センスポリヌクレオチド、触媒ポリヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、Ｆａｄ２またはＦａｔＢポリペプチドに結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび二本鎖ＲＮＡから選択されるポリヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。

１つの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５〜８、１１〜１４または１９〜２５として提供されるヌクレオチドの配列の１またはそれ以上を含むポリヌクレオチドに生理的条件下でハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチドである。

さらなる実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５〜８、１１〜１４または１９〜２５として提供されるヌクレオチドの配列の１またはそれ以上を含むポリヌクレオチドを切断することができる触媒ポリヌクレオチドである。

もう１つの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５〜８、１１〜１４または１９〜２５として提供されるヌクレオチドの配列の１またはそれ以上の少なくとも１９個の隣接ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子であり、二本鎖である分子の部分は、少なくとも１９塩基対の長さであり、前記オリゴヌクレオチドを含有する。

好ましくは、ｄｓＲＮＡは、二本鎖部分の鎖が一本鎖部分によって連結されており、１個のプロモーターから発現される。そのようなｄｓＲＮＡ分子を生産するためのベクターの構築の例を実施例５で述べる。

好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドまたはその鎖は、配列番号５〜８、１１〜１４または１９〜２５として提供されるヌクレオチドの配列の１またはそれ以上を含むポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができる。

さらなる態様では、本発明は、ｉ）細胞内のＦａｄ２および／またはＦａｔＢポリペプチドの活性のレベルを下方調節する候補ポリヌクレオチドの能力を測定すること、および
ｉｉ）細胞内のＦａｄ２および／またはＦａｔＢポリペプチドの活性のレベルを下方調節したポリヌクレオチドを選択すること
を含む、イネ植物の細胞内に存在するとき、該ポリヌクレオチドを欠く細胞と比較して細胞内のＦａｄ２および／またはＦａｔＢポリペプチドの活性のレベルを下方調節するポリヌクレオチドを同定する方法を提供する。

工程ｉ）は、例えば細胞内のＦａｄ２および／またはＦａｔＢポリペプチドの量または酵素活性、若しくは細胞内のＦａｄ２および／またはＦａｔＢポリペプチドをコードするｍＲＮＡの量を分析することに基づき得る。あるいは、工程ｉ）は、細胞、若しくは前記細胞を含む種子または植物の脂肪酸含量を分析することを含み得る。好ましくは、工程ｉ）は、候補ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む候補ポリヌクレオチドまたはキメラＤＮＡの植物細胞への導入、より好ましくはイネ細胞への導入を含み、さらに一層好ましくは、植物細胞からトランスジェニック植物を再生する工程およびトランスジェニック植物からの種子の生産を含む。候補遺伝子は、合計で少なくとも２または３つの、候補遺伝子の収集物の１つであり得る。本発明は、それ故、スクリーニング方法における本発明のポリヌクレオチドの使用を提供する。

ポリヌクレオチドは、アンチセンスポリヌクレオチド、センスポリヌクレオチド、触媒ポリヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、Ｆａｄ２またはＦａｔＢポリペプチドに結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび二本鎖ＲＮＡであり得るが、これらに限定されない。

１つの実施形態では、アンチセンスポリヌクレオチドは、配列番号５〜８、１１〜１４または１９〜２５として提供されるヌクレオチドの配列の１またはそれ以上を含むポリヌクレオチドに生理的条件下でハイブリダイズする。

もう１つの実施形態では、触媒ポリヌクレオチドは、配列番号５〜８、１１〜１４または１９〜２５として提供されるヌクレオチドの配列の１またはそれ以上を含むポリヌクレオチドを切断することができる。

さらなる実施形態では、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子は、配列番号５〜８、１１〜１４または１９〜２５として提供されるヌクレオチドの配列の１またはそれ以上の少なくとも１９個の隣接ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含有し、二本鎖である分子の部分は、少なくとも１９塩基対の長さであり、前記オリゴヌクレオチドを含有する。

また、本発明の方法を使用して同定される単離ポリヌクレオチドが提供される。

さらなる態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むまたはコードするベクターを提供する。

好ましくは、ポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドをコードする配列は、プロモーターに作動可能に連結されている。好ましくは、プロモーターは、イネ植物の少なくとも１つの他の組織または器官と比較してイネ植物の胚、内乳、ぬか層および／または種子において選択的にポリヌクレオチドの発現を与える。

また、本発明のベクターおよび／または本発明のポリヌクレオチドを含む細胞が提供される。

１つの実施形態では、ポリヌクレオチドまたはベクターは、細胞または細胞の前駆体に導入された。

さらなる実施形態では、細胞は、イネ細胞またはアグロバクテリウム細胞である。

好ましくは、ポリヌクレオチドは細胞のゲノムに組み込まれる。

もう１つの態様では、本発明は、本発明の細胞を含むイネ植物を提供する。

さらにもう１つの態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターを細胞に導入する工程を含む、本発明の細胞を生産する方法を提供する。

好ましくは、前記方法は、細胞からトランスジェニック植物を再生する工程をさらに含む。

また、組換え細胞を生産するための本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターの使用が提供される。

さらにもう１つの態様では、本発明は、植物が、対応する非改変植物と比較してＦａｄ２および／またはＦａｔＢ活性を有するポリペプチドの低発現を有する、遺伝的に改変されたイネ植物を提供する。

好ましくは、植物は、本発明のポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドを含むその子孫植物を含むように形質転換されている。

さらなる態様では、本発明は、イネ植物をＦａｄ２またはＦａｔＢポリペプチドのアンタゴニストに曝露することを含む、本発明の米油、本発明の米ぬかおよび／または本発明のイネ種子を生産する方法を提供する。

もう１つの態様では、本発明は、非改変玄米種子を生産する対応植物と比較してイネ種子におけるＦａｄ２および／またはＦａｔＢポリペプチドの活性および／または生産のレベルが低下するように植物を遺伝的に操作することを含む、非改変玄米種子と比較したとき長い貯蔵寿命を有する玄米種子を生産するために使用できる遺伝的に改変されたイネ植物を得る方法を提供する。

好ましくは、Ｆａｄ２および／またはＦａｔＢポリペプチドの活性および／または生産のレベルは、植物の種子においてのみ低下する。

１つの実施形態では、Ｆａｄ２ポリペプチドの活性および／または生産のレベルが低下する。

さらなる実施形態では、トランスジェニック植物は、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターを含む。

さらなる態様では、本発明は、本発明の方法を用いて生産される遺伝的に改変されたイネ植物またはその子孫を提供する。

さらなる態様では、本発明は、
ｉ）イネ種子またはイネ植物の突然変異誘発された集団をスクリーニングすること、および
ｉｉ）本発明の米油、本発明の米ぬかおよび／または本発明のイネ種子を生産することができる種子または植物を選択すること
を含む、本発明の米油、本発明に従った米ぬかおよび／または本発明のイネ種子を生産するために使用できるイネ植物を選択する方法を提供する。

１つの実施形態では、工程ｉ）は、突然変異誘発された種子および／または植物をＦａｄ２またはＦａｔＢ活性を有するポリペプチドに関して分析することを含む。

もう１つの実施形態では、工程ｉ）は、突然変異誘発された種子および／または植物のＦａｄ２またはＦａｔＢ遺伝子の配列および／または発現レベルを分析することを含む。

さらなる実施形態では、工程ｉ）は、突然変異誘発された種子および／または植物の油、ぬかおよび／または種子の脂肪酸組成を分析することを含む。

さらなる態様では、本発明は、
ｉ）候補イネ植物から得られた米油、米ぬかおよび／または種子の脂肪酸含量を分析すること、および
ｉｉ）本発明の米油、本発明の米ぬかおよび／または本発明のイネ種子を生産するために使用できるイネ植物を選択すること
を含む、本発明の米油、本発明の米ぬかおよび／または本発明のイネ種子を生産するために使用できるイネ植物を選択する方法を提供する。

さらなる態様では、本発明は、
ｉ）候補植物からの試料をＦａｄ２またはＦａｔＢ活性を有するポリペプチドに関して分析すること、および
ｉｉ）前記ポリペプチドの配列、生産のレベルおよび／または活性に基づき、本発明の米油、本発明の米ぬかおよび／または本発明のイネ種子を生産するために使用できるイネ植物を選択すること
を含む、本発明の米油、本発明の米ぬかおよび／または本発明のイネ種子を生産するために使用できるイネ植物を選択する方法を提供する。

もう１つの態様では、本発明は、
ｉ）候補植物のＦａｄ２またはＦａｔＢ遺伝子の配列および／または発現レベルを分析すること、および
ｉｉ）前記遺伝子の配列および／または発現レベルに基づき、本発明の米油、本発明の米ぬかおよび／または本発明のイネ種子を生産するために使用できるイネ植物を選択すること
を含む、本発明の米油、本発明の米ぬかおよび／または本発明のイネ種子を生産するために使用できるイネ植物を選択する方法を提供する。

さらにもう１つの実施形態では、本発明は、植物の核酸分子を検出することを含み、核酸分子が、植物においてＦａｄ２遺伝子および／またはＦａｔＢ遺伝子に連結されているおよび／またはＦａｄ２遺伝子および／またはＦａｔＢ遺伝子の少なくとも一部を含有する、本発明の米油、本発明の米ぬかおよび／または本発明のイネ種子を生産するために使用できるイネ植物を同定する方法を提供する。

さらなる態様では、本発明は、植物の核酸分子を検出することを含み、核酸分子が、植物においてＦａｄ２遺伝子および／またはＦａｔＢ遺伝子に連結されているおよび／またはＦａｄ２遺伝子および／またはＦａｔＢ遺伝子の少なくとも一部を含有する、長い貯蔵寿命を有する玄米種子を生産するために使用できるイネ植物を同定する方法を提供する。

１つの実施形態では、上記の２つの方法は、
ｉ）前記植物から得られる前記核酸分子に２番目の核酸分子をハイブリダイズすること、
ｉｉ）場合により前記植物から得られる前記核酸分子に少なくとも１つの他の核酸分子をハイブリダイズすること、および
ｉｉｉ）前記ハイブリダイズ工程の産物または前記ハイブリダイズ工程からの産物の不在を検出すること
を含む。

１つの実施形態では、２番目の核酸分子は、前記核酸分子の少なくとも一部を逆転写するまたは複製するためのプライマーとして使用される。

核酸は、制限断片長多型分析、増幅断片長多型分析、マイクロサテライト増幅および／または核酸配列決定などの、しかしこれらに限定されない任意の手法を用いて検出することができる。

１つの実施形態では、前記方法は核酸増幅を含む。もう１つの実施形態では、前記方法は遺伝子の発現レベルを分析する。

また、
ｉ）植物の穀粒の油においてオレイン酸の高い比率を与えるＦａｄ２対立遺伝子を含む１番目の親イネ植物を、植物の穀粒の油においてパルミチン酸の低い比率を与えるＦａｔＢ対立遺伝子を含む２番目の親イネ植物と交配すること、
ｉｉ）交配からの子孫植物または穀粒を両方の対立遺伝子の存在に関してスクリーニングすること、および
ｉｖ）両方の対立遺伝子を含み、植物の穀粒の油においてオレイン酸の高い比率およびパルミチン酸の低い比率を有する子孫植物または穀粒を選択すること
を含む、イネ植物または種子を得る方法が提供される。

もう１つの態様では、本発明は、
ｉ）１番目の親イネ植物を、Ｆａｄ２対立遺伝子を含む２番目の親イネ植物と交配すること、および
ｉｉ）工程ｉ）の交配の子孫を、１番目の親植物と同じ遺伝子型の植物と、１番目の親の遺伝子型の大部分を有するが前記対立遺伝子を含む植物を生産するために十分な回数だけ戻し交配すること、
ｉｉｉ）１番目の植物の遺伝子型の大部分を有し、前記対立遺伝子を含む植物を選択すること
を含み、前記対立遺伝子が、植物の油、ぬかおよび／または種子においてオレイン酸の高い比率を与える、Ｆａｄ２対立遺伝子をイネ植物に導入する方法を提供する。

さらにもう１つの態様では、本発明は、
ｉ）１番目の親イネ植物を、ＦａｔＢ対立遺伝子を含む２番目の親イネ植物と交配すること、および
ｉｉ）工程ｉ）の交配の子孫を、１番目の親植物と同じ遺伝子型の植物と、１番目の親の遺伝子型の大部分を有するが前記対立遺伝子を含む植物を生産するために十分な回数だけ戻し交配すること、
ｉｉｉ）１番目の植物の遺伝子型の大部分を有し、前記対立遺伝子を含む植物を選択すること
を含み、前記対立遺伝子が、植物の油、ぬかおよび／または種子においてパルミチン酸の低い比率を与える、ＦａｔＢ対立遺伝子をイネ植物に導入する方法を提供する。

さらに、野生型植物と比較したとき、Δ１２デサチュラーゼ活性を有するＦａｄ２ポリペプチドの生産が低下するようにイネ植物を遺伝的に操作することを含む、イネ植物の油、ぬかおよび／または種子においてオレイン酸の比率を上昇させる方法が提供される。

さらにもう１つの態様では、本発明は、野生型植物と比較したとき、（ＦａｔＢ）活性を有するＦａｔＢポリペプチドの生産が低下するようにイネ植物を遺伝的に操作することを含む、イネ植物の油、ぬかおよび／または種子においてパルミチン酸の比率を低下させる方法を提供する。

また、本発明の方法を用いて得られるイネ植物、またはその子孫植物が提供される。

さらなる態様では、本発明は、本発明の植物から得られる米油を提供する。

さらなる態様では、本発明は、本発明の植物から得られる米ぬかを提供する。

さらなる態様では、本発明は、本発明の植物から得られるイネ種子を提供する。

さらに、
ａ）本発明の植物を生育すること、および
ｂ）種子を収穫すること
を含む、種子を生産する方法が提供される。

さらにもう１つの態様では、本発明は、本発明の米油、本発明の米ぬかおよび／または本発明のイネ種子を含む食品生産物を提供する。

もう１つの態様では、本発明は、本発明の米油中で食用物質を調理することを含む、食品を調製する方法を提供する。

明白であるように、本発明の１つの態様の好ましい特徴および特性は、本発明の多くの他の態様に適用できる。

本明細書全体を通じて、「含む」という語または「含むこと」などの変形は、記述される要素、整数または工程、若しくは要素、整数または工程の群の包含を示唆するが、他の何らかの要素、整数または工程、若しくは要素、整数または工程の群の排除を示唆しないことが了解される。

以下の非限定的実施例により、および添付の図面を参照して、本発明を以下で説明する。

高等植物の色素体およびサイトゾルにおける主要脂肪酸の生合成経路。イネＦａｔＢタンパク質のアラインメント。タンパク質ＦＡＴＢ２（proteinFATB2）＝配列番号１、タンパク質ＦＡＴＢ３（proteinFATB3）＝配列番号２、タンパク質ＦＡＴＢ１（proteinFATB1）＝配列番号３、およびタンパク質ＦＡＴＢ４（proteinFATB4）＝配列番号４．イネＦａｔＢタンパク質のアラインメント。タンパク質ＦＡＴＢ２（proteinFATB2）＝配列番号１、タンパク質ＦＡＴＢ３（proteinFATB3）＝配列番号２、タンパク質ＦＡＴＢ１（proteinFATB1）＝配列番号３、およびタンパク質ＦＡＴＢ４（proteinFATB4）＝配列番号４．イネＦａｔＢ遺伝子構造。ＬＯＣＯｓ０２ｇ４＝配列番号５、ＬＯＣＯｓ１１ｇ４＝配列番号６、ＬＯＣＯｓ０６ｇ０＝配列番号７、およびＬＯＣＯｓ０６ｇ３＝配列番号８。ＣｌｕｓｔａｌＷによるＦａｔＢ遺伝子配列のアラインメント。デフォルトパラメータを使用した。「遺伝子」は異なる長さであることに留意しなければならない。ＣｌｕｓｔａｌＷによるＦａｔＢ遺伝子配列のアラインメント。デフォルトパラメータを使用した。「遺伝子」は異なる長さであることに留意しなければならない。ＣｌｕｓｔａｌＷによるＦａｔＢ遺伝子配列のアラインメント。デフォルトパラメータを使用した。「遺伝子」は異なる長さであることに留意しなければならない。ＣｌｕｓｔａｌＷによるＦａｔＢ遺伝子配列のアラインメント。デフォルトパラメータを使用した。「遺伝子」は異なる長さであることに留意しなければならない。ＣｌｕｓｔａｌＷによるＦａｔＢ遺伝子配列のアラインメント。デフォルトパラメータを使用した。「遺伝子」は異なる長さであることに留意しなければならない。ＣｌｕｓｔａｌＷによるＦａｔＢ遺伝子配列のアラインメント。デフォルトパラメータを使用した。「遺伝子」は異なる長さであることに留意しなければならない。ＣｌｕｓｔａｌＷによるＦａｔＢ遺伝子配列のアラインメント。デフォルトパラメータを使用した。「遺伝子」は異なる長さであることに留意しなければならない。ＣｌｕｓｔａｌＷによるＦａｔＢ遺伝子配列のアラインメント。デフォルトパラメータを使用した。「遺伝子」は異なる長さであることに留意しなければならない。ＣｌｕｓｔａｌＷによるＦａｔＢ遺伝子配列のアラインメント。デフォルトパラメータを使用した。「遺伝子」は異なる長さであることに留意しなければならない。ＣｌｕｓｔａｌＷによるＦａｔＢ遺伝子配列のアラインメント。デフォルトパラメータを使用した。「遺伝子」は異なる長さであることに留意しなければならない。ＣｌｕｓｔａｌＷによるＦａｔＢ遺伝子配列のアラインメント。デフォルトパラメータを使用した。「遺伝子」は異なる長さであることに留意しなければならない。ＣｌｕｓｔａｌＷによるＦａｔＢ遺伝子配列のアラインメント。デフォルトパラメータを使用した。「遺伝子」は異なる長さであることに留意しなければならない。ＬＯＣＯｓ６ｇ０５１３０に対応するＦａｔＢ遺伝子のエクソン−イントロン構造。上の列はｍＲＮＡ内のコード配列（配列番号９）の起点に対応し、対の２番目の列は遺伝子（配列番号１０）に対応する。ＬＯＣＯｓ６ｇ０５１３０に対応するＦａｔＢ遺伝子のエクソン−イントロン構造。上の列はｍＲＮＡ内のコード配列（配列番号９）の起点に対応し、対の２番目の列は遺伝子（配列番号１０）に対応する。ＬＯＣＯｓ６ｇ０５１３０に対応するＦａｔＢ遺伝子のエクソン−イントロン構造。上の列はｍＲＮＡ内のコード配列（配列番号９）の起点に対応し、対の２番目の列は遺伝子（配列番号１０）に対応する。それぞれ交互に小文字と大文字で連続するエクソンおよびＲＴ−ＰＣＲによってアイソフォームを識別するために使用したプライマーの位置（下線を付している）を示す、４つのＦａｔＢアイソフォームのコード配列のアラインメント。開始コドン（開始位置１）は太字である。ＡＣ１０８８７０＝配列番号１１、ＡＰ００５２９１＝配列番号１２、ＡＰ０００３９９＝配列番号１３、およびＡＰ００４２３６＝配列番号１４。それぞれ交互に小文字と大文字で連続するエクソンおよびＲＴ−ＰＣＲによってアイソフォームを識別するために使用したプライマーの位置（下線を付している）を示す、４つのＦａｔＢアイソフォームのコード配列のアラインメント。開始コドン（開始位置１）は太字である。ＡＣ１０８８７０＝配列番号１１、ＡＰ００５２９１＝配列番号１２、ＡＰ０００３９９＝配列番号１３、およびＡＰ００４２３６＝配列番号１４。Ｆａｄ２アイソフォームの推定ポリペプチド配列のＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント。ここで留意すべきは、Ｆ１列はＯｓ０２ｇ４８５６０に対応し、Ｆ２列はＯｓ０７ｇ２３４１０に、Ｆ３列はＯｓ０７ｇ２３４３０に、およびＯ４列はＯｓ０７ｇ２３３９０に対応することである。デフォルトパラメータでＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｆａｓｔ）プログラムを使用した。タンパク質Ｆ１＝配列番号１５、タンパク質Ｆ３＝配列番号１６、タンパク質Ｆ２＝配列番号１７、およびタンパク質Ｆ４＝配列番号１８。Ｆａｄ２アイソフォームの推定ポリペプチド配列のＣｌｕｓｔａｌＷアラインメント。ここで留意すべきは、Ｆ１列はＯｓ０２ｇ４８５６０に対応し、Ｆ２列はＯｓ０７ｇ２３４１０に、Ｆ３列はＯｓ０７ｇ２３４３０に、およびＯ４列はＯｓ０７ｇ２３３９０に対応することである。デフォルトパラメータでＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｆａｓｔ）プログラムを使用した。タンパク質Ｆ１＝配列番号１５、タンパク質Ｆ３＝配列番号１６、タンパク質Ｆ２＝配列番号１７、およびタンパク質Ｆ４＝配列番号１８。アイソフォームＡＰ００４０４７における５’ＵＴＲの位置（小文字）およびＲＴ−ＰＣＲによる増幅のために使用したプライマーの位置（下線を付している）を示すＦａｄ２配列のアラインメント。終止コドンの位置は箱で指示されており、終止コドンの下流の非翻訳領域は小文字である。ＡＰ００５１６８＝配列番号１９、ＡＰ００４０４７＝配列番号２０、およびコンティグ２６５４（contig2654）＝配列番号２１。アイソフォームＡＰ００４０４７における５’ＵＴＲの位置（小文字）およびＲＴ−ＰＣＲによる増幅のために使用したプライマーの位置（下線を付している）を示すＦａｄ２配列のアラインメント。終止コドンの位置は箱で指示されており、終止コドンの下流の非翻訳領域は小文字である。ＡＰ００５１６８＝配列番号１９、ＡＰ００４０４７＝配列番号２０、およびコンティグ２６５４（contig2654）＝配列番号２１。イネＦａｄ２遺伝子構造。イネＦａｄ２遺伝子についてのタンパク質コード領域のヌクレオチド配列のアラインメント。０２列はＯｓ０７ｇ２３４１０に対応し、Ｏ４列はＯｓ０７ｇ２３３９０に、Ｏ１列はＯｓ０２ｇ４８５６０に、およびＯ３列はＯｓ０７ｇ２３４１０に対応する。デフォルトパラメータでＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを使用した。ＣｄｓＦＡＤ２Ｏ２＝配列番号２２、ＣｄｓＦＡＤ２Ｏ４＝配列番号２３、ＣｄｓＦＡＤ２Ｏ１＝配列番号２４、およびＣｄｓＦＡＤ２Ｏ３＝配列番号２５。イネＦａｄ２遺伝子についてのタンパク質コード領域のヌクレオチド配列のアラインメント。０２列はＯｓ０７ｇ２３４１０に対応し、Ｏ４列はＯｓ０７ｇ２３３９０に、Ｏ１列はＯｓ０２ｇ４８５６０に、およびＯ３列はＯｓ０７ｇ２３４１０に対応する。デフォルトパラメータでＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを使用した。ＣｄｓＦＡＤ２Ｏ２＝配列番号２２、ＣｄｓＦＡＤ２Ｏ４＝配列番号２３、ＣｄｓＦＡＤ２Ｏ１＝配列番号２４、およびＣｄｓＦＡＤ２Ｏ３＝配列番号２５。イネＦａｄ２遺伝子についてのタンパク質コード領域のヌクレオチド配列のアラインメント。０２列はＯｓ０７ｇ２３４１０に対応し、Ｏ４列はＯｓ０７ｇ２３３９０に、Ｏ１列はＯｓ０２ｇ４８５６０に、およびＯ３列はＯｓ０７ｇ２３４１０に対応する。デフォルトパラメータでＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを使用した。ＣｄｓＦＡＤ２Ｏ２＝配列番号２２、ＣｄｓＦＡＤ２Ｏ４＝配列番号２３、ＣｄｓＦＡＤ２Ｏ１＝配列番号２４、およびＣｄｓＦＡＤ２Ｏ３＝配列番号２５。イネＦａｄ２遺伝子についてのタンパク質コード領域のヌクレオチド配列のアラインメント。０２列はＯｓ０７ｇ２３４１０に対応し、Ｏ４列はＯｓ０７ｇ２３３９０に、Ｏ１列はＯｓ０２ｇ４８５６０に、およびＯ３列はＯｓ０７ｇ２３４１０に対応する。デフォルトパラメータでＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを使用した。ＣｄｓＦＡＤ２Ｏ２＝配列番号２２、ＣｄｓＦＡＤ２Ｏ４＝配列番号２３、ＣｄｓＦＡＤ２Ｏ１＝配列番号２４、およびＣｄｓＦＡＤ２Ｏ３＝配列番号２５。表示されている遺伝子型の穀粒からの総油分画のＧＣ分析によって測定したパルミチン酸、オレイン酸およびリノール酸の相対的パーセンテージのグラフ表示。表示されている遺伝子型の穀粒からのＧＣ総脂質分析におけるパルミチン酸とオレイン酸の相対的パーセンテージのグラフ表示。表示されている遺伝子型の穀粒からのＧＣ総脂質分析におけるリノール酸とオレイン酸の相対的パーセンテージのグラフ表示。表示されている遺伝子型のイネ植物の穀粒におけるリノール酸対オレイン酸のパーセンテージを示す散布図。留意すべきは、これらの２つの脂肪酸の量の間の関係（直線の勾配に反映される）は分析したすべての系統において基本的に同じであるが、プールサイズ容量が異なると思われる（分析した空間に沿った種々の直線の位置のずれに反映される）ことである。種々の遺伝子型におけるリノール酸対パルミチン酸のパーセンテージの散布図。留意すべきは、Ｆａｄ２が影響を受ける系統と比較した、ＦａｔＢが影響を受ける系統の異なる勾配である。これは、これらの成分の間の関係は種々の遺伝子型において異なり、おそらく影響を受ける工程の相違を反映することを示唆する。様々な遺伝子型についてのオレイン酸対パルミチン酸のパーセンテージの散布図。勾配の差に留意すべきである。Ｆａｄ２ＲＮＡｉ植物とＦａｔＢＲＮＡｉ植物についての油組成の変動の主成分分析のグラフ表示。結果は、主成分２がリノール酸対オレイン酸であり、主成分２がパルミチン酸対リノール酸プラスオレイン酸であることを示す。ペプチドに対して惹起した抗血清の反応を示すウエスタンブロット。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した全葉タンパク質抽出物に対するＦａｔＢ−９９。約２０ｋＤａのペプチドがＴｏｓ−１７系統では欠落している。免疫前血清との反応が示されている。ＲはＦａｔＢＲＮＡｉ系統を表わし、ＴはＴｏｓ−１７系統である。Ｗ１およびＷ２は野生型である。〔配列表の要点〕配列番号１−イネＦａｔＢ２タンパク質。

配列番号２−イネＦａｔＢ３タンパク質。

配列番号３−イネＦａｔＢ１タンパク質。

配列番号４−イネＦａｔＢ４タンパク質。

配列番号５−イネＦａｔＢ３遺伝子。

配列番号６−イネＦａｔＢ２遺伝子。

配列番号７−イネＦａｔＢ１遺伝子。

配列番号８−イネＦａｔＢ４遺伝子。

配列番号９−イネＦａｔＢ１タンパク質をコードするｃＤＮＡ。

配列番号１０−イネＦａｔＢ１タンパク質をコードする遺伝子（部分配列のみ、図５参照−すべてのエクソン配列および一部の隣接配列およびイントロン配列を含む）。

配列番号１１−イネＦａｔＢ２タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム。

配列番号１２−イネＦａｔＢ３タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム。

配列番号１３−イネＦａｔＢ１タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム。

配列番号１４−イネＦａｔＢ４タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム。

配列番号１５−イネＦａｄ２アイソフォーム１。

配列番号１６−イネＦａｄ２アイソフォーム３。

配列番号１７−イネＦａｄ２アイソフォーム２。

配列番号１８−イネＦａｄ２アイソフォーム４。

配列番号１９−イネＦａｄ２−３ｃＤＮＡ。

配列番号２０−イネＦａｄ２−１ｃＤＮＡ。

配列番号２１−イネＦａｄ２−２ｃＤＮＡ。

配列番号２２−イネＦａｄ２−２をコードするオープンリーディングフレーム。

配列番号２３−イネＦａｄ２−４をコードするオープンリーディングフレーム。

配列番号２４−イネＦａｄ２−１をコードするオープンリーディングフレーム。

配列番号２５−イネＦａｄ２−３をコードするオープンリーディングフレーム。

配列番号２６−ＦａｔＢコンセンサス配列。

配列番号２７〜３３−Ｆａｄ２コンセンサス配列。

配列番号３４〜５５および６０〜６３−オリゴヌクレオチドプライマー。

配列番号５６〜５９−抗原性イネＦａｔＢペプチド。

配列番号６４〜８３−ＲＮＡｉのために使用できる分子の一本鎖の配列。

一般的手法
特に異なる定義が為されていない限り、本明細書で使用するすべての技術および学術用語は、当業者（例えば細胞培養、植物分子生物学、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学および生化学における）によって一般的に理解されているのと同じ意味を有すると解釈される。

異なる指示がない限り、本発明において用いられる組換えタンパク質、細胞培養および免疫学的手法は、当業者に周知の標準手順である。そのような手法は、出典文献、例えばJ. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), and F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley- Interscience(1988,現在までのすべての最新版を含む), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), and J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons（現在までのすべての最新版を含む）全体を通じて記述され、説明されている。
選択定義
本明細書で使用するとき、「Ｆａｄ２ポリペプチド」という用語は、オレイン酸をリノール酸に変換するデサチュラーゼ機能を実行するタンパク質を指す。それ故、「Ｆａｄ２活性」という用語は、オレイン酸のリノール酸への変換を表わす。これらの脂肪酸は、エステル化形態、例えばリン脂質の一部であり得る。イネＦａｄ２ポリペプチドの例は、図７および配列番号１５〜１８において提供されるアミノ酸配列を含むタンパク質、並びにその変異体および／または突然変異体を包含する。そのような変異体および／または突然変異体は、図７および配列番号１５〜１８において提供されるポリペプチドのいずれか１つに少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、より好ましくは少なくとも９５％同一、さらに一層好ましくは少なくとも９９％同一であり得る。

「Ｆａｄ２ポリヌクレオチド」または「Ｆａｄ２遺伝子」は、Ｆａｄ２ポリペプチドをコードする。Ｆａｄ２ポリヌクレオチドの例は、図８または１０および配列番号１９〜２５において提供されるヌクレオチド配列を含む核酸、並びにその対立遺伝子変異体および／または突然変異体を包含する。Ｆａｄ２遺伝子の例は、図８および配列番号１９〜２１において提供されるヌクレオチド配列を含む核酸、並びにその対立遺伝子変異体および／または突然変異体を包含する。そのような対立遺伝子変異体および／または突然変異体は、図８および／または１０および／または配列番号１９〜２５において提供されるポリヌクレオチドのいずれか１つに少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、より好ましくは少なくとも９５％同一、さらに一層好ましくは少なくとも９９％同一であり得る。

本明細書で使用するとき、「ＦａｔＢポリペプチド」という用語は、パルミトイル−ＡＣＰを加水分解して遊離パルミチン酸を生成するタンパク質を指す。それ故、「ＦａｔＢ活性」という用語は、遊離パルミチン酸を生成するパルミトイル−ＡＣＰの加水分解を指す。イネＦａｔＢポリペプチドの例は、図２および配列番号１〜４において提供されるアミノ酸配列を含むタンパク質、並びにその変異体および／または突然変異体を包含する。そのような変異体および／または突然変異体は、図２および配列番号１〜４において提供されるポリペプチドのいずれか１つに少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、より好ましくは少なくとも９５％同一、さらに一層好ましくは少なくとも９９％同一であり得る。

「ＦａｔＢポリヌクレオチド」または「ＦａｔＢ遺伝子」は、ＦａｔＢポリペプチドをコードする。ＦａｔＢポリヌクレオチドの例は、図４および６および配列番号５〜８および１１〜１４において提供されるヌクレオチド配列を含む核酸、並びにその対立遺伝子変異体および／または突然変異体を包含する。ＦａｔＢ遺伝子の例は、図４および配列番号５〜８において提供されるヌクレオチド配列を含む核酸、並びにその対立遺伝子変異体および／または突然変異体を包含する。そのような対立遺伝子変異体および／または突然変異体は、図４および／または６、および／または配列番号５〜８および１１〜１４において提供されるポリヌクレオチド、のいずれか１つに少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、より好ましくは少なくとも９５％同一、さらに一層好ましくは少なくとも９９％同一であり得る。

本明細書で使用するとき、「イネ（米）」という用語は、その祖先、並びに他の種との交配によって生産されるその子孫を含む、イネ属（Genus Oryza）のいずれかの種を指す。植物は、商業的に栽培されるイネ種、例えばオリザ・サティバ（Oryza sativa）または穀物の商業生産に適する株または栽培品種または品種であることが好ましい。

本明細書で使用するとき、「米油」という用語は、少なくとも６０％（ｗ／ｗ）の脂質を含有する、イネ植物の種子／穀粒またはその部分、例えばぬか層から得られる組成物を指す。米油は、典型的には室温で液体である。好ましくは、脂質は、少なくとも炭素数６の長さである脂肪酸を含む。脂肪酸は、典型的にはエステル化形態で、例えばトリアシルグリセロール、リン脂質として存在する。本発明の米油はオレイン酸を含む、本発明の米油はまた、少なくともいくつかの他の脂肪酸、例えばパルミチン酸、リノール酸、ミリスチン酸、ステアリン酸および／またはリノレン酸を含み得る。脂肪酸は、遊離脂肪酸であり得るおよび／またはトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）として存在し得る。１つの実施形態では、本発明の米油中の脂肪酸の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％がＴＡＧとして存在し得る。本発明の米油は、合わせて「米ぬか」と称される、イネの穀粒／種子またはその部分、例えばアリューロン層または胚／胚盤の一部を形成し得る。あるいは、本発明の米油は、イネの穀粒／種子または米ぬかから抽出されたものである。そのような抽出手順の一例を実施例１で述べる。それ故、１つの実施形態では、本発明の「米油」は、その天然状態で結合している１またはそれ以上の他の脂質、核酸、ポリペプチドまたは他の夾雑分子から分離された、「実質的に精製された」または「精製された」米油である。実質的に精製された米油は、それが天然に結合している他の成分を少なくとも６０％含まない、より好ましくは少なくとも７５％含まない、より好ましくは少なくとも９０％含まないことが好ましい。好ましい実施形態では、抽出後、オレイン酸対リノール酸、パルミチン酸対オレイン酸および／またはパルミチン酸対リノール酸の比率は、無傷種子／穀粒またはぬか中の比率と比較したとき、有意に変化しない（例えば５％以下の変化）。さらなる実施形態では、米油は、無傷種子／穀粒またはぬか中の比率と比較したときオレイン酸対リノール酸、パルミチン酸対オレイン酸および／またはパルミチン酸対リノール酸の比率を変化させ得る手順、例えば水素化に供されていない。本発明の米油は、γ−オリザノールおよびステロールなどの、しかしこれらに限定されない非脂肪酸分子をさらに含み得る。

米油は、当分野で公知の任意の方法によってイネ種子またはぬかから抽出され得る。これは、典型的には非極性溶媒、例えばジエチルエーテル、石油エーテル、クロロホルム／メタノールまたはブタノール混合物による抽出を含む。穀粒中のデンプンと結合した脂質は、水飽和ブタノールで抽出され得る。米油は、多糖類を除去するために当分野で公知の方法によって「脱ガム化（de-gummed）」され得るか、若しくは夾雑物を除去するためまたは純度、安定性または色を改善するために他の方法で処理され得る。油中のトリアシルグリセロールおよび他のエステルは、遊離脂肪酸を放出するために加水分解され得るか、または油は、水素化され得るか若しくは当分野で公知のように化学的または酵素的に処理され得る。

イネ種子またはぬかからの抽出後の米油は、典型的にはγ−オリザノールと呼ばれる脂質の群を含む。本明細書で使用するとき、「γ−オリザノールを含む」とは、油中の少なくとも０．１％（ｗ／ｗ）のγ−オリザノール化合物の存在を指す。抽出後およびＴＡＧからの除去前の米油中のγ−オリザノールのレベルは、典型的には１．５〜３．５％（ｗ／ｗ）である。化合物は、典型的にはフェルラ酸（４−ヒドロキシ−３−メトキシケイ皮酸）のステリルおよび他のトリテルペニルエステルの混合物である。シクロアルテニルフェルレート、２４−メチレンシクロアルタニルフェルレートおよびカンペステリルフェルレートはオリザノール中の主要なフェルレートであり、より低いレベルのβ−シトステリルフェルレートおよびスチグマステリルフェルレートを含む。γ−オリザノールの存在は、米油の消費者を慢性疾患、例えば心疾患および癌から保護するのを助けると思われ、それ故γ−オリザノールの存在は有益である。

本明細書で使用するとき、「米ぬか」という用語は、内側の白米粒と外側のイネ種子／穀粒の殻との間の層（アリューロン層）並びに穀粒の胚／胚盤を指す。米ぬかは、白米を生成するための玄米の研磨の主要副産物である。

本明細書で使用するとき、「長い貯蔵寿命」という用語は、収穫後、例えば野生型（遺伝的に改変されていない）イネ植物から収穫された玄米と比較したとき、長期間にわたって玄米として貯蔵できる種子／穀粒を生産する本発明の方法を指す。本明細書で述べるように、玄米の「長い貯蔵寿命」についての１つの評価尺度は、４０℃で少なくとも８週間の貯蔵後のヘキサナール産生である（実施例８参照）。

「植物」という用語は、全植物、植物構造（例えば葉、幹）、根、花器／花構造、種子（胚、内乳および種皮を含む）、植物組織（例えば維管束組織、基本組織等）、細胞およびその子孫を含む。

「トランスジェニック植物」、「遺伝的に改変された植物」またはその変形は、同じ種、品種または栽培品種の野生型植物では認められない遺伝子構築物（「導入遺伝子」）を含む植物を指す。本明細書で言及される「導入遺伝子」は、生物工学の分野における通常の意味を有し、組換えＤＮＡまたはＲＮＡ技術によって生産または変更され、植物細胞に導入された遺伝子配列を含む。導入遺伝子は、植物細胞に由来する遺伝子配列を含み得る。典型的には、導入遺伝子はヒトの操作によって、例えば形質転換によって植物に導入されるが、当業者が認識するいかなる方法も使用され得る。

「種子」および「穀粒」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。「穀粒」は、一般に成熟し、収穫された穀粒を指すが、文脈に従って吸水または発芽後の穀粒も意味し得る。成熟穀粒は、一般に約１８〜２０％未満の含水率を有する。

本明細書で使用するとき、「対応する非改変植物」という用語は、野生型植物を指す。「野生型」は、本明細書で使用するとき、本発明に従って改変されていない細胞、組織または植物を指す。野生型細胞、組織または植物は、本明細書で述べるように改変された細胞、組織または植物と、外来性核酸の発現のレベルまたは形質改変の程度および性質を比較するための対照として使用され得る。参照標準として適する野生型イネ品種は、日本晴（Nipponbare）である。

「核酸分子」は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはそのいずれかのフラグメントを指す。二本鎖または一本鎖の、ゲノムまたは合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡであり得、本明細書で定義される特定活性を実行するために炭水化物、脂質、タンパク質または他の物質と組合わされ得る。「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。

ポリヌクレオチドの同一性パーセントは、ＧＡＰ(Needleman and Wunsch, 1970)分析（ＧＣＧプログラム）により、ギャップ生成ペナルティー＝５、ギャップ伸長ペナルティー＝０．３で決定される。異なる記述がない限り、問い合わせ配列は少なくとも４５ヌクレオチド長であり、ＧＡＰ分析は少なくとも４５ヌクレオチドの領域にわたって２つの配列を並置する。好ましくは、問い合わせ配列は少なくとも１５０ヌクレオチド長であり、ＧＡＰ分析は少なくとも１５０ヌクレオチドの領域にわたって２つの配列を並置する。より好ましくは、問い合わせ配列は少なくとも３００ヌクレオチド長であり、ＧＡＰ分析は少なくとも３００ヌクレオチドの領域にわたって２つの配列を並置する。さらに一層好ましくは、ＧＡＰ分析は、２つの配列をそれらの長さ全体にわたって並置する。

「オリゴヌクレオチド」は、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはそのいずれかの誘導体であり得る。ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドという用語は重複する意味を有するが、オリゴヌクレオチドは、典型的には比較的短い一本鎖分子である。そのようなオリゴヌクレオチドの最小の大きさは、標的核酸分子上でオリゴヌクレオチドと相補的配列の間での安定な雑種の形成のために必要な大きさである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１８ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１９ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド、さらに一層好ましくは少なくとも２５ヌクレオチドの長さである。

本明細書で使用するとき、「核酸増幅」という用語は、ＤＮＡポリメラーゼを使用して核酸分子のコピー数を増加させるための任意のインビトロ法を指す。核酸増幅は、ＤＮＡ分子またはプライマーへのヌクレオチドの組込みを生じさせ、それによってＤＮＡ鋳型に相補的な新しいＤＮＡ分子を形成する。新たに形成されたＤＮＡ分子は、さらなるＤＮＡ分子を合成するための鋳型として使用できる。

本明細書で使用する「作動可能に連結された」とは、２またはそれ以上の核酸（例えばＤＮＡ）セグメントの間の機能的関係を指す。典型的には、転写配列に対する転写調節エレメント（プロモーター）の機能的関係を指す。例えばプロモーターは、適切な細胞においてコード配列の転写を刺激するまたは調節する場合、コード配列、例えば本明細書で定義されるポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。一般に、転写配列に作動可能に連結されているプロモーター転写調節エレメントは、転写配列に物理的に隣接する、すなわちそれらはシス作用性である。しかし、一部の転写調節エレメント、例えばエンハンサーは、それらが転写を増強するコード配列に物理的に隣接するまたは近接して位置する必要はない。

本明細書で使用するとき、「遺伝子」という用語は、その最も広い文脈において解釈されるべきであり、構造遺伝子のタンパク質コード領域を含むデオキシリボヌクレオチド配列を包含し、５’および３’末端の両方に関していずれかの末端で少なくとも約２ｋｂの距離にわたってコード領域に隣接して位置し、遺伝子の発現に関与する配列を包含する。コード領域の５’側に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳配列と称される。コード領域の３’側または下流に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻訳配列と称される。「遺伝子」という用語は、ｃＤＮＡおよびゲノム形態の遺伝子の両方を包含する。遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と称される非コード領域で分断されていてもよいコード領域を含む。イントロンは、核内ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）へと転写される遺伝子のセグメントである；イントロンは、調節エレメント、例えばエンハンサーを含み得る。イントロンは核または一次転写産物から除去されるまたは「スプライシング」される；イントロンは、それ故、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物中には存在しない。ｍＲＮＡは、翻訳の間に新生ポリペプチドにおける配列またはアミノ酸の順序を規定するように機能する。「遺伝子」という用語は、本明細書で述べる本発明のタンパク質の全部または部分をコードする合成または融合分子および上記のいずれかに相補的なヌクレオチド配列を包含する。

本明細書で使用するとき、「遺伝的に連鎖する」または同様の用語は、５０％より多い減数分裂において、例えばランダムではなく、それらが共に遺伝される染色体上の十分に近接するマーカ遺伝子座と２番目の遺伝子座を指す。この定義は、マーカ遺伝子座と２番目の遺伝子座が同じ遺伝子の部分を形成する状況を含む。さらに、この定義は、マーカ遺伝子座が対象形質の原因となる多型を含む（言い換えるとマーカ遺伝子座が表現型に直接「連鎖する」または「完全に連鎖する」）実施形態を包含する。もう１つの実施形態では、マーカ遺伝子座と２番目の遺伝子座は、異なるが、５０％より多い減数分裂において共に遺伝される染色体上で十分に近接する。世代当たりの遺伝的に連鎖する遺伝子の間で認められる組換えのパーセント（センチモルガン（ｃＭ））は５０未満である。本発明の特定実施形態では、遺伝的に連鎖する遺伝子座は、染色体上で４５、３５、２５、１５、１０、５、４、３、２、１またはそれ以下のｃＭだけ離れ得る。好ましくは、マーカは５ｃＭ未満離れていて、最も好ましくは、約０ｃＭ離れる。

「対立遺伝子］は、細胞、個々の植物または集団内の遺伝子配列の１つの特定形態（例えば遺伝子）を指し、特定形態は、遺伝子の配列内の少なくとも１、しばしば２以上の変異部位の配列が同じ遺伝子の他の形態と異なる。異なる対立遺伝子の間で異なるこれらの変異部位の配列は、「変異（variance）」、「多型」または「突然変異」と称される。

本明細書で使用する「多型」は、植物の異なる種、栽培品種、株または個体の、本発明の遺伝子座の対立遺伝子の間でのヌクレオチド配列の変異を表わす。「多型位置」は、遺伝子の配列内のあらかじめ選択されたヌクレオチド位置である。一部の場合、遺伝子多型はアミノ酸配列の変異によって反映され、それ故多型位置は、ポリペプチドの配列内の所定の位置にアミノ酸配列の多型の配置を生じさせ得る。また別の場合には、多型領域は、遺伝子の非ポリペプチドコード領域内、例えば遺伝子の発現レベルに影響を及ぼし得るプロモーター領域内であり得る。典型的な多型は、欠失、挿入または置換である。これらは、１個のヌクレオチド（一塩基多型またはＳＮＰ）若しくは２またはそれ以上のヌクレオチドを含み得る。

「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、一般に交換可能に使用され、非アミノ酸基の付加によって修飾されていてもよくまたは修飾されていなくてもよい１本のポリペプチド鎖を指す。そのようなポリペプチド鎖が他のポリペプチドまたはタンパク質または他の分子、例えば補因子と結合し得ることは了解される。本明細書で使用する「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語はまた、本明細書で述べる本発明のポリペプチドの変異型、突然変異型、修飾型、類似体および／または誘導体を包含する。

ポリペプチドの同一性パーセントは、ＧＡＰ(Needleman and Wunsch, 1970)分析（ＧＣＧプログラム）により、ギャップ生成ペナルティー＝５、ギャップ伸長ペナルティー＝０．３で決定される。問い合わせ配列は少なくとも２５アミノ酸長であり、ＧＡＰ分析は少なくとも２５アミノ酸の領域にわたって２つの配列を並置する。好ましくは、問い合わせ配列は少なくとも５０アミノ酸長であり、ＧＡＰ分析は少なくとも５０アミノ酸の領域にわたって２つの配列を並置する。より好ましくは、問い合わせ配列は少なくとも１００アミノ酸長であり、ＧＡＰ分析は少なくとも１００アミノ酸の領域にわたって２つの配列を並置する。さらに一層好ましくは、問い合わせ配列は少なくとも２５０アミノ酸長であり、ＧＡＰ分析は少なくとも２５０アミノ酸の領域にわたって２つの配列を並置する。さらに一層好ましくは、ＧＡＰ分析は、２つの配列をそれらの長さ全体にわたって並置する。
アンチセンスポリヌクレオチド
「アンチセンスポリヌクレオチド」という用語は、ＦａｔＢまたはＦａｄ２ポリペプチドをコードする特定ｍＲＮＡ分子の少なくとも一部に相補的であり、転写後事象、例えばｍＲＮＡ翻訳に干渉することができる、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはそれらの組合せの分子を意味すると解釈されるべきである。アンチセンス法の使用は当分野において周知である（例えばG. Hartmann and S. Endres, Manual of Antisense Methodology, Kluwer (1999)参照)。植物におけるアンチセンス手法の使用は、Bourque, 1995 and Senior, 1998によって総説されている。Bourque, 1995は、アンチセンス配列が遺伝子不活性化の方法として植物系においてどのように利用されてきたかについて数多くの例を列挙している。Bourqueはまた、部分阻害が系に測定可能な変化を生じさせる可能性がより高いので、酵素活性の１００％阻害を達成することは必要ないと考えられると述べている。Senior (1998)は、アンチセンス法は現在、遺伝子発現を操作するための非常によく確立された手法であると述べている。

本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、生理的条件下で標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする。本明細書で使用するとき、「生理的条件下でハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチド」という用語は、ポリヌクレオチド（完全なまたは部分的一本鎖）が、細胞、好ましくはイネ細胞内の通常の条件下で、少なくともタンパク質をコードするｍＲＮＡ、例えば図２または７または配列番号１〜４または１５〜１８において提供されるものと二本鎖ポリヌクレオチドを形成することができることを意味する。

アンチセンス分子は、構造遺伝子若しくは遺伝子発現またはスプライシング事象への制御を生じさせる配列に対応する配列を含み得る。例えばアンチセンス配列は、本発明の遺伝子の標的コード領域、若しくは５’非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’ＵＴＲまたはこれらの組合せに対応し得る。アンチセンス配列は、部分的に、転写の間または転写後のスプライシングされ得るイントロン配列に相補的であり得、好ましくは標的遺伝子のエクソン配列にのみ相補的であり得る。一般にＵＴＲのより大きな相違を考慮して、これらの領域を標的することは遺伝子阻害のより大きな特異性を提供する。

アンチセンス配列の長さは、少なくとも１９隣接ヌクレオチド、好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１００、２００、５００または１０００ヌクレオチドであるべきである。遺伝子転写産物全体に相補的な完全長配列が使用され得る。長さは、最も好ましくは少なくとも１００〜２０００ヌクレオチドである。標的転写産物に対するアンチセンス配列の同一性の程度は、少なくとも９０％、より好ましくは９５〜１００％であるべきである。アンチセンスＲＮＡ分子は、言うまでもなく、分子を安定化するように機能し得る無関係な配列を含み得る。
触媒ポリヌクレオチド
触媒ポリヌクレオチド／核酸という用語は、個別の基質を特異的に認識し、この基質の化学的修飾を触媒する、ＤＮＡ分子またはＤＮＡ含有分子（当分野では「デオキシリボザイム」としても知られる）若しくはＲＮＡまたはＲＮＡ含有分子（「リボザイム」としても知られる）を指す。触媒核酸における核酸塩基は、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ塩基（およびＲＮＡについてはＵ）であり得る。

典型的には、触媒核酸は、標的核酸の特異的認識のためのアンチセンス配列、および核酸切断性酵素活性（本明細書では「触媒ドメイン」とも称する）を含む。本発明において特に有用なリボザイムの型は、ハンマーヘッド型リボザイム(Haseloff and Gerlach, 1988; Perriman et al, 1992)およびヘアピン型リボザイム(Shippy et al, 1999)である。

本発明のリボザイムおよびリボザイムをコードするＤＮＡは、当分野で周知の方法を用いて化学合成することができる。リボザイムはまた、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼについてのプロモーターに作動可能に連結されたＤＮＡ分子（転写後、ＲＮＡ分子を生じる）から調製し得る。従って、本発明の触媒ポリヌクレオチドをコードする核酸分子、すなわちＤＮＡまたはｃＤＮＡも、本発明によって提供される。ベクターが、ＤＮＡ分子に作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼプロモーターを同時に含むとき、ＲＮＡポリメラーゼおよびヌクレオチドとのインキュベーション後にインビトロでリボザイムを生産することができる。別の実施形態では、ＤＮＡを発現カセットまたは転写カセットに挿入し得る。合成後、リボザイムを安定化し、ＲＮアーゼに対して抵抗性にする能力を有するＤＮＡ分子への連結によってＲＮＡ分子を修飾し得る。

本明細書で述べるアンチセンスポリヌクレオチドに関して、本発明の触媒ポリヌクレオチドはまた、「生理的条件」下で、すなわち細胞内の条件（特にイネ細胞などの植物細胞内の条件）下で標的核酸分子（例えば図２または７または配列番号１〜４または１５〜１８において提供されるポリペプチドをコードするｍＲＮＡ）にハイブリダイズすることができるべきである。
ＲＮＡ干渉
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、特定タンパク質の生産を特異的に阻害するために特に有用である。理論に縛られるのは望むところではないが、Waterhouse et al.(1998)は、タンパク質産生を低減するためにｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）が使用できる機構についてのモデルを提供した。この技術は、対象とする遺伝子またはその部分、この場合は本発明に従ったポリペプチドをコードするｍＲＮＡと本質的に同一である配列を含むｄｓＲＮＡ分子の存在に基づく。好都合には、ｄｓＲＮＡは、センスおよびアンチセンス配列が、センス配列とアンチセンス配列がハイブリダイズして、無関係な配列とループ構造を形成するｄｓＲＮＡ分子を形成することを可能にする、無関係な配列によって隣接されている、組換えベクターまたは宿主細胞において１個のプロモーターから生産され得る。本発明のための適切なｄｓＲＮＡ分子の設計と生産は、特にWaterhouse et al.(1998),Smith et al. (2000), 国際公開広報第９９／３２６１９号、同第９９／５３０５０号、同第９９／４９０２９号および同第０１／３４８１５号を考慮して、十分に当業者の能力の範囲内である。

一例では、不活性化しようとする標的遺伝子に相同性を有する、少なくとも部分的に二本鎖のＲＮＡ産物の合成を指令するＤＮＡを導入する。ＤＮＡは、それ故、ＲＮＡに転写されたときに、二本鎖ＲＮＡ領域を形成するようにハイブリダイズし得るセンスおよびアンチセンス配列の両方を含む。好ましい実施形態では、センス配列とアンチセンス配列は、ＲＮＡに転写されたときスプラインシングされるイントロンを含む、スペーサー領域によって分離されている。この配置は遺伝子サイレンシングのより高い効率を生じさせることが示された。二本鎖領域は、１つのＤＮＡ領域または２つのＤＮＡ領域いずれかから転写された、１または２個のＲＮＡ分子を含み得る。二本鎖分子の存在は、二本鎖ＲＮＡおよびまた標的植物遺伝子からの相同なＲＮＡ転写産物の両方を破壊する内因性植物系からの応答を誘因し、標的遺伝子の活性を効率よく低下させるまたは排除すると思われる。

ハイブリダイズするセンスおよびアンチセンス配列の長さは、各々少なくとも１９個の隣接ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０または５０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１００、２００、５００または１０００ヌクレオチドであるべきである。遺伝子転写産物全体に対応する完全長配列を使用し得る。長さは、最も好ましくは１００〜２０００ヌクレオチドである。標的転写産物に対するセンスおよびアンチセンス配列の同一性の程度は、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５〜１００％であるべきである。ＲＮＡ分子は、言うまでもなく、分子を安定化するように機能し得る無関係な配列を含み得る。ＲＮＡ分子は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの制御下で発現され得る。後者の例は、ｔＲＮＡまたはｓｎＲＮＡプロモーターを含む。

好ましい低分子干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）分子は、標的ｍＲＮＡの約１９〜２１個の隣接ヌクレオチドに同一であるヌクレオチド配列を含む。好ましくは、標的ｍＲＮＡ配列は、ジヌクレオチドＡＡから始まり、約３０〜７０％（好ましくは３０〜６０％、より好ましくは４０〜６０％、より好ましくは４５〜５５％）のＧＣ含量を含み、例えば標準ＢＬＡＳＴ検索によって測定したとき、それが導入される植物（好ましくはイネ）のゲノムにおいて標的以外のいかなるヌクレオチド配列にも高い同一性パーセンテージを有さない。

本発明のｄｓＲＮＡ分子の例を実施例５に示す。さらなる例は、配列番号６４〜７３（Ｆａｄ２について）および配列番号７４〜８３（ＦａｔＢについて）の１またはそれ以上において提供される配列を含むものを包含する。
マイクロＲＮＡ
マイクロＲＮＡの調節は、従来のＲＮＡｉ／ＰＴＧＳから枝分かれした、遺伝子調節へと進化するＲＮＡサイレンシング経路の明らかに特殊な部門である。マイクロＲＮＡは、特徴的な逆方向反復配列に構成された遺伝子様エレメントにおいてコードされる特定のクラスの低分子ＲＮＡである。転写されたとき、マイクロＲＮＡ遺伝子は、マイクロＲＮＡがその後そこからプロセシングされるステムループ状の前駆体ＲＮＡを生じさせる。マイクロＲＮＡは、典型的には約２１ヌクレオチド長である。放出されたｍｉＲＮＡは、配列特異的遺伝子抑制を及ぼすＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質の特定サブセットを含むＲＩＳＣ様複合体に組み込まれる（例えばMillar and Waterhouse, 2005; Pasquinelli et al, 2005; Almeida and Allshire, 2005参照)。
共抑制
使用し得るもう１つの分子生物学的アプローチは共抑制である。共抑制の機構は十分には理解されていないが、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）を含むと思われ、それに関してはアンチセンス抑制の多くの例と非常に類似し得る。余分なコピーの遺伝子またはそのフラグメントを、その発現のためにプロモーターに対してセンス方向で植物に導入することを含む。センスフラグメントの大きさ、標的遺伝子領域に対するその対応度および標的遺伝子との配列同一性の程度は、アンチセンス配列に関して上述した通りである。一部の場合、追加コピーの遺伝子配列は標的植物遺伝子の発現に干渉する。共抑制アプローチを実行する方法については、国際公開広報第９７／２０９３６号および欧州特許第０４６５５７２号参照。
核酸ハイブリダイゼーション
１つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドまたはその鎖は、配列番号５〜８、１１〜１４または１９〜２５として提供されるヌクレオチドの配列の１またはそれ以上のいずれかを含むポリヌクレオチドに生理的条件下でハイブリダイズする。さらなる実施形態では、本発明のポリヌクレオチドまたはその鎖はまた、配列番号５〜８、１１〜１４または１９〜２５として提供されるヌクレオチドの配列の１またはそれ以上のいずれかを含むポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズする。

本明細書で使用するとき、「ストリンジェント条件」という語句は、ポリヌクレオチド、プローブ、プライマーおよび／またはオリゴヌクレオチドがその標的配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェント条件は配列依存的であり、種々の状況において異なる。より長い配列は、短い配列よりも高温で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェント条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで特定配列についての熱融点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。Ｔｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡で標的配列にハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下で）である。標的配列は一般に過剰に存在するので、Ｔｍでは、プローブの５０％が平衡で占有される。典型的には、ストリンジェント条件は、塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的にはｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン（または他の塩）であり、温度は、短いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチド（例えば１０ヌクレオチド〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、より長いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドについては少なくとも約６０℃である。ストリンジェント条件はまた、不安定化剤、例えばホルムアルデヒドの添加によっても達成され得る。

ストリンジェント条件は当業者に公知であり、Ausubel et al. (supra), Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6、並びに本明細書で述べる実施例に認められる。好ましくは、条件は、互いに少なくとも約６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％相同な配列が、典型的には互いにハイブリダイズしたままである条件である。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、６５℃で６×ＳＳＣ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ＢＳＡ、および５００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む高塩濃度緩衝液中でのハイブリダイゼーション、次いで５０℃で０．２．×ＳＳＣ、０．０１％ＢＳＡ中で１回またはそれ以上の洗浄である。もう１つの実施形態では、中ストリンジェンシーの条件下で、配列番号５〜８、１１〜１４または１９〜２５のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズし得る核酸配列が提供される。中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、５５℃で６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中でのハイブリダイゼーション、次いで３７℃で１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回またはそれ以上の洗浄である。使用し得る中ストリンジェンシーの他の条件は当分野において周知であり、例えばAusubel et al. (supra), and Kriegler, 1990; Gene Transfer And Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY参照。さらにもう１つの実施形態では、低ストリンジェンシーの条件下で、配列番号５〜８、１１〜１４または１９〜２５のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズし得る核酸が提供される。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、４０℃で３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）硫酸デキストラン中でのハイブリダイゼーション、次いで５０℃で２×ＳＳＣ、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭＥＤＴＡ、および０．１％ＳＤＳ中での１回またはそれ以上の洗浄である。使用し得る低ストリンジェンシーの他の条件は当分野において周知であり、例えばAusubel et al. (supra) and Kriegler, 1990, Gene Transfer And Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY、並びに本明細書で提供する実施例参照。
核酸構築物、ベクターおよび宿主細胞
本発明は、対応する非改変植物と比較してＦａｄ２および／またはＦａｔＢ活性を有するポリペプチドの低発現を有する、遺伝的に改変されたイネ植物の生産を含む。

上記トランスジェニック植物を生産するために有用な核酸構築物は、標準手法を用いて容易に作製することができる。

ｍＲＮＡをコードする領域を挿入するとき、構築物はイントロン配列を含み得る。これらのイントロン配列は、植物における導入遺伝子の発現を助け得る。「イントロン」という用語は、転写されるがタンパク質をコードせず、翻訳の前にＲＮＡからスプライシングされる遺伝子セグメントを意味するものとして、その通常の意味で使用される。イントロンは、５’−ＵＴＲまたは導入遺伝子が翻訳産物をコードする場合はコード領域内、または導入遺伝子が翻訳産物をコードしない場合は転写領域内のどこかに組み込まれ得る。しかし、好ましい実施形態では、いずれのポリペプチドコード領域も１つのオープンリーディングフレームとして提供される。当業者が認識するように、そのようなオープンリーディングフレームは、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを逆転写することによって入手できる。

対象とするｍＲＮＡをコードする遺伝子の適切な発現を確実にするため、核酸構築物は、典型的には１またはそれ以上の調節エレメント、例えばプロモーター、エンハンサー、並びに転写終結配列またはポリアデニル化配列を含む。このようなエレメントは当分野において周知である。

調節エレメントを含む転写開始領域は、植物における調節されたまたは構成的な発現を提供し得る。好ましくは、発現は、少なくとも胚、内乳、ぬか層、発育中の種子および／または成熟種子（穀粒）の細胞において起こる。代替的実施形態では、調節エレメントは、種子細胞に特異的でないプロモーター（例えばユビキチンプロモーターまたはＣａＭＶ３５Ｓまたは増強３５Ｓプロモーター）であり得る。

本発明のために有用な種子特異的プロモーターの例は、コムギ低分子量グルテニンプロモーター(Colot et al, 1987)、コムギ種子においてα−アミラーゼを発現するプロモーター(Stefanov et al., 1991)、およびホルデインプロモーター(Brandt et al., 1985)を含むが、これらに限定されない。

植物細胞において活性な多くの構成的プロモーターが記述されている。植物における構成的発現のための適切なプロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ゴマノハグサ（Figword）モザイクウイルス（ＦＭＶ）３５Ｓ、サトウキビバシリフォームウイルスプロモーター、ツユクサ（commelina）黄色斑紋ウイルスプロモーター、リブロース−１，５−ビス−リン酸カルボキシラーゼの小さなサブユニットからの光誘導性プロモーター、イネサイトゾルトリオースリン酸イソメラーゼプロモーター、シロイヌナズナ（Arabidopsis）のアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼプロモーター、イネアクチン１遺伝子プロモーター、マンノピンシンターゼおよびオクトピンシンターゼプロモーター、Ａｄｈプロモーター、スクロースシンターゼプロモーター、Ｒ遺伝子複合体プロモーター、およびクロロフィルα／β結合タンパク質遺伝子プロモーターを含むが、これらに限定されない。これらのプロモーターは、植物において発現されるＤＮＡベクターを創製するために使用されてきた；例えばＰＣＴ国際公開広報第ＷＯ８４０２９１３号参照。これらのプロモーターはすべて、様々な型の植物発現性組換えＤＮＡベクターを創製するために使用されてきた。

プロモーターは、温度、光またはストレスなどの因子によって調節され得る。通常、調節エレメントは発現される遺伝子配列の５’側に与えられる。構築物はまた、転写を増強する他のエレメント、例えばｎｏｓ３’またはｏｃｓ３’ポリアデニル化領域または転写ターミネーターを含み得る。

５’非翻訳リーダー配列は、本発明のポリヌクレオチドの異種遺伝子配列を発現するために選択されたプロモーターから誘導され得、所望する場合は、ｍＲＮＡの翻訳を上昇させるために特異的に修飾され得る。導入遺伝子の発現を最適化することの総説については、Koziel et al. (1996)参照。５’非翻訳領域はまた、植物ウイルスＲＮＡ（中でも特に、タバコモザイクウイルス、タバコエッチウイルス、トウモロコシドワーフモザイクウイルス、アルファルファモザイクウイルス）から、適切な真核生物遺伝子、植物遺伝子（コムギおよびトウモロコシクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子リーダー）から、または合成遺伝子配列から入手できる。本発明は、非翻訳領域が、プロモーター配列を伴う５’非翻訳配列に由来する構築物に限定されない。リーダー配列はまた、無関係なプロモーターまたはコード配列に由来し得る。本発明に関して有用なリーダー配列は、トウモロコシＨｓｐ７０リーダー（米国特許第５，３６２，８６５号および米国特許第５，８５９，３４７号）およびＴＭＶオメガエレメントを含む。

転写の終結は、キメラベクター内で対象ポリヌクレオチドに作動可能に連結された３’非翻訳ＤＮＡ配列によって達成される。組換えＤＮＡ分子の３’非翻訳領域は、植物においてＲＮＡの３’末端にアデニル酸ヌクレオチドの付加を生じさせるように機能するポリアデニル化シグナルを含む。３’非翻訳領域は、植物細胞において発現される様々な遺伝子から入手できる。ノパリンシンターゼ３’非翻訳領域、エンドウマメ小サブユニットルビスコ遺伝子、ダイズ７Ｓ種子貯蔵タンパク質遺伝子からの３’非翻訳領域がこの役割において一般的に使用される。アグロバクテリウム腫瘍誘導性（Ｔｉ）プラスミド遺伝子のポリアデニル酸シグナルを含む３’転写・非翻訳領域も適切である。

典型的には、核酸構築物は選択マーカを含む。選択マーカは、外来性核酸分子で形質転換された植物または細胞の同定とスクリーニングに役立つ。選択マーカ遺伝子は、イネ細胞に抗生物質または除草剤耐性を提供し得るか、またはマンノースのような基質の利用を可能にし得る。選択マーカは、好ましくはイネ細胞にハイグロマイシン耐性を付与する。

好ましくは、核酸構築物は植物のゲノムに安定に組み込まれる。従って、核酸は、分子がゲノムに組み込まれることを可能にする適切なエレメントを含むか、または構築物は、植物細胞の染色体に組み込まれ得る適切なベクター内に位置する。

本発明の１つの実施形態は、核酸分子を宿主細胞に送達することができるいずれかのベクターに挿入された、少なくとも１つの本発明のポリヌクレオチド分子を含む組換えベクターを包含する。そのようなベクターは、天然では本発明の核酸分子に隣接して認められない核酸配列であり、好ましくはその核酸分子が由来する種以外の種に由来する、異種核酸配列を含む。ベクターは、原核生物または真核生物のＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであり得、典型的にはウイルスまたはプラスミドである。

植物細胞の安定なトランスフェクションまたはトランスジェニック植物の樹立に適する多くのベクターが、例えばPouwels et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, supp. 1987; Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989; and Gelvin et al, Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990に述べられている。典型的には、植物発現ベクターは、例えば５’および３’調節配列の転写制御下にある１またはそれ以上のクローニングされた植物遺伝子および優性選択マーカを含む。そのような植物発現ベクターはまた、プロモーター調節領域（例えば誘導的または構成的に、環境的または発生的に調節された、若しくは細胞特異的または組織特異的な発現を制御する調節領域）、転写開始部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセシングシグナル、転写終結部位、および／またはポリアデニル化シグナルを含み得る。

本発明のもう１つの実施形態は、本発明の１またはそれ以上の組換え分子で形質転換された宿主細胞を含む組換え細胞を包含する。細胞への核酸分子の形質転換は、核酸分子を細胞に挿入することができるいかなる方法によっても達成され得る。形質転換手法は、トランスフェクション、電気穿孔、微量注入、リポフェクション、吸着およびプロトプラスト融合を含むが、これらに限定されない。組換え細胞は、単細胞のままであり得るかまたは組織、器官または多細胞生物へと増殖し得る。本発明の形質転換核酸分子は、染色体外のままであり得るかまたはそれらの発現されるべき能力が保持されるように形質転換（すなわち組換え）細胞の染色体内の１またはそれ以上の部位に組み込まれ得る。好ましい宿主細胞は、植物細胞、より好ましくは穀物用植物の細胞、さらに一層好ましくはイネ細胞である。
トランスジェニック植物
トランスジェニックイネ（本明細書では遺伝的に改変されたイネとも称する）は、当分野で公知の手法、例えばA. Slater et al., Plant Biotechnology-The Genetic Manipulation of Plants, Oxford University Press (2003), and P. Christou and H. Klee, Handbook of Plant Biotechnology, John Wiley and Sons (2004)において一般的に述べられている手法を用いて生産できる。

好ましい実施形態では、トランスジェニック植物は、それらの子孫が望ましい表現型に関して分離しないように、導入されたありとあらゆるポリヌクレオチド（導入遺伝子）についてホモ接合である。トランスジェニック植物はまた、例えば雑種種子から成長したＦ１子孫においては、導入された導入遺伝子に関してヘテロ接合であり得る。そのような植物は、当分野で周知の雑種強勢のような利点を提供し得る。

細胞内への遺伝子の直接送達のための４つの一般的方法が記述されている：（１）化学的方法(Graham et al., 1973)；（２）物理的方法、例えば微量注入(Capecchi, 1980)；電気穿孔（例えば国際公開広報第８７／０６６１４号、米国特許第５，４７２，８６９号、同第５，３８４，２５３号、国際公開広報第９２／０９６９６号および同第９３／２１３３５号参照）；および遺伝子銃（例えば米国特許第４，９４５，０５０および米国特許第５，１４１，１３１号参照）；（３）ウイルスベクター(Clapp, 1993; Lu et al, 1993; Eglitis et al., 1988)；および（４）受容体を介した機構(Curiel et al., 1992; Wagner et al, 1992)。

使用し得る加速法は、例えば微粒子銃（マイクロプロジェクタイル・ボンバードメント）等を含む。形質転換核酸分子を植物細胞に送達するための方法の一例は微粒子銃である。本方法は、Yang et al., Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, Oxford Press, Oxford, England (1994)によって総説されている。非生物学的粒子（微粒子）を核酸で被覆し、推進力によって細胞内に送達し得る。例示的な粒子は、タングステン、金、白金等からなるものを含む。微粒子銃の特別の利点は、単子葉植物を再現可能に形質転換する有効な手段であることに加えて、プロトプラストの単離またはアグロバクテリウム感染の感受性のいずれも必要としないことである。加速によってＤＮＡをトウモロコシ（Zea mays）細胞に送達するための方法の例示的な実施形態は、スクリーン、例えばステンレス鋼またはＮｙｔｅｘスクリーンを通して、懸濁培養したトウモロコシ細胞で覆ったフィルター表面に、ＤＮＡで被覆した粒子を推進するために使用できる、バイオリスティックα−粒子送達システム（a biolistics α-particle delivery system）である。本発明と共に使用するのに適した粒子送達システムは、Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能なヘリウム加速ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ銃である。

打ち込み（ボンバードメント）のために、懸濁液中の細胞をフィルター上で濃縮し得る。打ち込む細胞を含むフィルターをマイクロプロジェクタイル停止プレートの下方の適切な距離に位置づける。所望する場合は、１またはそれ以上のスクリーンを銃と打ち込む細胞の間に配置する。

あるいは、未熟胚または他の標的細胞を固体培地に配置してもよい。打ち込む細胞をマイクロプロジェクタイル停止プレートの下方の適切な距離に位置づける。所望する場合は、１またはそれ以上のスクリーンを加速装置と打ち込む細胞の間に配置する。本明細書で述べる手法の使用を通して、マーカ遺伝子を一過性に発現している細胞の１０００までまたはそれ以上の増殖巣を得ることができる。打ち込みの４８時間後に外来性遺伝子産物を発現する増殖巣中の細胞数は、しばしば１〜１０の範囲であり、平均すると１〜３である。

微粒子銃形質転換では、最大数の安定な形質転換体を生成するために打ち込み前の培養条件および打ち込みのパラメーターを最適化し得る。打ち込みに関する物理的および生物学的パラメーターの両方がこの技術において重要である。物理的因子は、ＤＮＡ／マイクロプロジェクタイル沈降物の操作に関与するもの若しくはマクロプロジェクタイルまたはマイクロプロジェクタイルのいずれかの飛行および速度に影響を及ぼすものである。生物学的因子は、打ち込みの前および打ち込み直後の細胞の操作に関わるすべての工程、打ち込みに伴う損傷を軽減するのに役立つ標的細胞の浸透圧調整、およびまた形質転換ＤＮＡの性質、例えば線状ＤＮＡまたは無傷のスーパーコイル状プラスミドを含む。打ち込み前の操作は、未熟胚の形質転換を成功させるために特に重要であると考えられる。

もう１つの代替的実施形態では、色素体を安定に形質転換することができる。高等植物における色素体形質転換のための開示されている方法は、選択マーカを含むＤＮＡのパーティクルガン送達および相同的組換えを通しての色素体ゲノムへのＤＮＡのターゲティングを含む（米国特許第５，４５１，５１３号、同第５，５４５，８１８号、同第５，８７７，４０２号、同第５，９３２４７９号および国際公開広報第９９／０５２６５号）。

従って、条件を十分に最適化するために小規模試験では打ち込みパラメーターの様々な態様を調整することが望ましいと考えられる。物理的パラメーター、例えばギャップ距離、飛行距離、組織距離およびヘリウム圧を調整することが特に望ましい。また、受容細胞の生理的状態に影響を及ぼし、それ故形質転換および組込み効率に影響を及ぼし得る条件を改変することにより、損傷軽減因子（trauma reduction factors）を最小限に抑え得る。例えば受容細胞の浸透圧状態、組織の水和および継代培養段階または細胞周期を最適形質転換のために調整し得る。他の常套的な調整の実施は、本開示に照らして当業者に理解される。

アグロバクテリウムを介した遺伝子導入は、ＤＮＡを植物の組織全体に導入することができ、それによりプロトプラストから無傷植物を再生させる必要を回避できることから、遺伝子を植物細胞に導入するための広く適用できるシステムである。ＤＮＡを植物細胞に導入するための、アグロバクテリウムを介した植物組込みベクターの使用は、当分野において周知である（例えば米国特許第５，１７７，０１０号、同第５，１０４，３１０号、同第５，００４，８６３号、同第５，１５９，１３５号参照）。さらに、Ｔ−ＤＮＡの組込みは、再配列をほとんど生じさせない比較的正確な工程である。導入するＤＮＡの領域は境界配列によって規定され、介在ＤＮＡが、通常、植物ゲノムに挿入される。

最新のアグロバクテリウム形質転換ベクターは、大腸菌並びにアグロバクテリウムにおいて複製が可能であり、記述されている(Klee et al, In: Plant DNA Infectious Agents, Hohn and Schell, eds., Springer- Verlag, New York, pp. 179-203 (1985))ように好都合な操作を可能にする。さらに、アグロバクテリウムを介した遺伝子導入のためのベクターにおける技術的進歩は、ベクター内の遺伝子および制限部位の配置を改善し、様々なポリペプチドコード遺伝子を発現することができるベクターの構築を容易にした。記述されているベクターは、挿入されたポリペプチドコード遺伝子の直接発現のためにプロモーターとポリアデニル化部位によって隣接された好都合なマルチリンカー領域を有し、本発明の目的に適する。加えて、アームドおよびディスアームドＴｉ遺伝子の両方を含むアグロバクテリウムを形質転換のために使用できる。アグロバクテリウムを介した形質転換が効率的である植物品種では、遺伝子導入の容易で明確な性質のために選択される方法である。

アグロバクテリウム形質転換法を用いて形成されたトランスジェニック植物は、典型的には１つの染色体上に単一遺伝子座を含む。そのようなトランスジェニック植物は、付加された遺伝子についてヘミ接合であると称され得る。付加された構造遺伝子についてホモ接合であるトランスジェニック植物、すなわち、染色体対の各々の染色体上の同じ遺伝子座に１個ずつ、２個の付加遺伝子を含むトランスジェニック植物がより好ましい。ホモ接合トランスジェニック植物は、１個の付加遺伝子を含む独立した分離個体であるトランスジェニック植物を雌雄交配（自殖）させ、生成された種子の一部を発芽させて、生じた植物を対象遺伝子に関して分析することによって入手できる。

また、２つの独立した分離外来性遺伝子を含む子孫を生産するために２つの異なるトランスジェニック植物も交配できることが了解される。適切な子孫の自殖は、両方の外来性遺伝子についてホモ接合である植物を生産することができる。親植物への戻し交配および非トランスジェニック植物との他殖も、栄養繁殖と同様に、考慮される。種々の形質および作物について一般的に使用される他の交配方法に記述は、Fehr, In: Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987)に見出される。

植物プロトプラストの形質転換は、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール処理、電気穿孔、およびこれらの処理の組合せに基づく方法を用いて達成され得る。種々の植物品種へのこれらのシステムの適用は、プロトプラストからその特定植物株を再生する能力に依存する。プロプラストから穀物を再生するための例示的方法が記述されている(Fujimura et al., 1985; Toriyama et al., 1986; Abdullah et al., 1986)。

細胞形質転換の他の方法も使用でき、花粉への直接ＤＮＡ導入、植物の生殖器官へのＤＮＡの直接注入、または未熟胚の細胞へのＤＮＡの直接注入とそれに続く乾燥胚の再水和による植物へのＤＮＡの導入を含むが、これらに限定されない。

単一植物プロトプラスト形質転換体からまたは様々な形質転換外植体からの植物の再生、発生および栽培は当分野において周知である(Weissbach et al., In: Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, San Diego, Calif., (1988))。この再生と成長の過程は、典型的には形質転換細胞の選択、発根小植物体段階を経た胚発生の通常の段階を通して個別細胞を培養することの工程を含む。トランスジェニック胚および種子も同様に再生される。生じたトランスジェニック発根芽を、その後、適切な植物成長媒質、例えば土壌に定植する。

異種の外来性遺伝子を含む植物の発生または再生は当分野において周知である。好ましくは、再生した植物は、自家受粉してホモ接合トランスジェニック植物を与える。さもなければ、再生植物体から得た花粉を、農学的に重要な系統の種子成長植物に交配する。逆に、これらの重要な系統の植物からの花粉を使用して再生植物体に受粉させる。所望の外来性核酸を含む本発明のトランスジェニック植物は、当業者に周知の方法を用いて栽培される。

外来性核酸の導入によって植物に遺伝的変異を導入するためおよびプロトプラストまたは未熟植物胚から植物を再生するための、穀物用植物、例えばイネの形質転換のための方法は、当分野において周知であり、例えばカナダ特許出願第２，０９２，５８８号、オーストラリア特許出願第６１７８１／９４号、オーストラリア特許第６６７９３９号、米国特許第６，１００，４４７号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／１０６２１号、米国特許第５，５８９，６１７号、米国特許第６，５４１，２５７号が参照され、他の方法は国際公開広報第９９／１４３１４号特許明細書に述べられている。好ましくは、トランスジェニックイネ植物はアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を介した形質転換手順によって生産される。イネのアグロバクテリウムを介した形質転換の一例を本明細書で実施例５において提供する。所望の核酸構築物を担持するベクターを、組織培養植物体または外植体の再生可能なイネ細胞、または適切な植物体系、例えばプロトプラストに導入し得る。

再生可能なイネ細胞は、好ましくは未熟胚の胚盤、成熟胚、これらに由来するカルス、または分裂組織からである。

トランスジェニック細胞および植物における導入遺伝子の存在を確認するため、当業者に公知の方法を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅またはサザンブロット分析が実施できる。導入遺伝子の発現産物は、産物の性質に依存して様々な方法のいずれかによって検出でき、ウエスタンブロット法および酵素検定法を含む。種々の植物組織においてタンパク質発現を定量し、複製を検出するための１つの特に有用な方法は、レポーター遺伝子、例えばＧＵＳを使用することである。ひとたびトランスジェニック植物が得られれば、それらを成長させて所望の表現型を有する植物体組織または部分を生産し得る。植物体組織または植物体部分は収穫され得るおよび／または種子を収集され得る。種子は、所望の特性を備えた組織または部分を有するさらなる植物体を成長させるためのソースとして役立ち得る。
マーカ利用選抜
マーカ利用選抜は、古典的交配育種において反復親と戻し交配するときに必要とされるヘテロ接合植物を選択する、広く認識されている方法である。各戻し交配世代の植物の集団は、戻し交配集団において通常は１：１の比率で存在する対象遺伝子についてヘテロ接合であり、遺伝子の２つの対立遺伝子を識別するために分子マーカが使用できる。例えば若い苗条からＤＮＡを抽出し、遺伝子移入された望ましい形質についての特異的マーカで試験することにより、エネルギーと資源をより少ない植物に集中させながら、さらなる戻し交配のための植物の初期選択を行う。戻し交配プログラムをさらに迅速化するために、完全に種子を成熟させるのではなく、未熟種子からの胚（開花後２５日目）を切り出し、無菌条件下に栄養培地で成長させ得る。本葉３枚展開時にＤＮＡ抽出と組み合わせて使用される、「胚救助法（embryo rescue）」と称されるこの工程および所望の遺伝子型に関する分析は、その後反復親へのさらなる戻し交配のために温室または圃場で成熟するまで育成し得る、所望形質を担持する植物の速やかな選抜を可能にする。

Ｆａｄ２またはＦａｔＢ遺伝子を検出することができる当分野で公知のいかなる分子生物学的手法も本発明の方法において使用できる。そのような方法は、核酸増幅、核酸配列決定、適切に標識されたプローブとの核酸ハイブリダイゼーション、一本鎖立体配座解析（ＳＳＣＡ）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、ヘテロ二本鎖分析（ＨＥＴ）、化学的切断分析（ＣＣＭ）、触媒核酸切断またはそれらの組合せを含むが、これらに限定されない（例えばLemieux, 2000; Langridge et al., 2001参照)。本発明はまた、所望表現型を与える（例えば）Ｆａｄ２またはＦａｔＢ遺伝子の対立遺伝子に連鎖する多型を検出するための分子マーカ手法の使用を包含する。そのような方法は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、ＲＡＰＤ、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）およびマイクロサテライト（単純配列反復、ＳＳＲ）多型の検出または分析を含む。密接に連鎖するマーカは、当分野において周知の方法、例えばLangridge et al. (2001)によって総説されている、バルクセグレガント分析（Bulked Segregant Analysis）によって容易に入手できる。

「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）は、「上流」と「下流」のプライマーから成る「プライマーの対」または「プライマーのセット」、および重合の触媒、例えばＤＮＡポリメラーゼ、典型的には耐熱ポリメラーゼ酵素を使用して標的ポリヌクレオチドで複製コピーを作製する反応である。ＰＣＲのための方法は当分野で公知であり、例えば■PCR
■(Ed. MJ. McPherson and S.G Moller (2000) BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxfor
d)において教示される。ＰＣＲは、植物細胞から単離したｍＲＮＡを逆転写することから得られるｃＤＮＡに関して実施できる。しかし、植物から単離したゲノムＤＮＡに関してＰＣＲを実施する場合は、一般により容易である。

プライマーは、配列内で標的配列に特異的にハイブリダイズすることができ、ＰＣＲの間に伸長されるオリゴヌクレオチド配列である。アンプリコンまたはＰＣＲ産物またはＰＣＲフラグメントまたは増幅産物は、プライマーおよび標的配列の新たに合成されたコピーを含む伸長産物である。多重ＰＣＲシステムは、２以上のアンプリコンの同時生産を生じさせる複数のセットのプライマーを含む。プライマーは、標的配列に完全にマッチし得るかまたは特定標的配列内に制限酵素または触媒核酸認識／切断部位の導入を生じさせ得る内部ミスマッチ塩基を含み得る。プライマーはまた、アンプリコンの捕捉または検出を容易にする追加配列を含み得るおよび／または修飾または標識ヌクレオチドを含み得る。ＤＮＡの熱変性、相補的配列へのプライマーのアニーリングおよびポリメラーゼによるアニーリングされたプライマーの伸長の反復サイクルは、標的配列の指数関数的増幅をもたらす。標的または標的配列または鋳型という用語は、増幅される核酸配列を指す。

ヌクレオチド配列の直接配列決定のための方法は当業者に周知であり、例えばAusubel et al. (supra) and Sambrook et al. (supra)に見出される。配列決定は、任意の適切な方法、例えばジデオキシ配列決定法、化学的配列決定法またはその変法によって実施できる。直接配列決定は、特定配列のいかなる塩基対の変異も判定するという利点を有する。

ハイブリダイゼーションに基づく検出システムは、ＴａｑＭａｎアッセイおよび分子ビーコンを含むが、これらに限定されない。ＴａｑＭａｎアッセイ（米国特許第５，９６２，２３３号）は、一方の末端に供与体染料、他方の末端に受容体染料を有し、染料の対が蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を通して相互作用する、対立遺伝子特異的（ＡＳＯ）プローブを使用する。標的配列は、標識ＡＳＯプローブの付加を含むように改変されたＰＣＲによって増幅される。ＰＣＲ条件は、１個のヌクレオチドの相違がプローブの結合を生じさせるように調整される。Ｔａｑポリメラーゼ酵素の５’ヌクレアーゼ活性により、完全に相補的なプローブはＰＣＲの間に切断されるが、１個のミスマッチ塩基を有するプローブは切断されない。プローブの切断は消光受容体染料から供与体染料を解離し、供与体蛍光を大きく上昇させる。

ＴａｑＭａｎアッセイの代替法は、分子ビーコンアッセイである（米国特許第５，９２５，５１７号）。分子ビーコンアッセイでは、ＡＳＯプローブは、ヘアピン型構造が形成されるように標的特定種に隣接する相補的配列を含む。ヘアピンのループは標的配列に相補的であるが、ヘアピンの各々の腕は供与体染料または受容体染料のいずれかを含む。供与体配列にハイブリダイズしないとき、ヘアピン型構造は供与体染料と受容体染料を互いに近接させ、それによって供与体蛍光を消滅させる。特定標的配列にハイブリダイズしたときは、供与体染料と受容体染料は９００倍までの蛍光の上昇を伴って分離される。分子ビーコンは、ＰＣＲによる標的配列の増幅と共に使用でき、標的配列のリアルタイム検出のための方法を提供するか、または増幅後に使用できる。
ＴＩＬＬＩＮＧ
本発明の植物は、ＴＩＬＬＩＮＧ(Targeting Induced Local Lesions IN Genomes)として知られる方法を用いて生産できる。最初の工程では、種子（または花粉）を化学的突然変異原で処理することにより、植物の集団において導入突然変異、例えば新規一塩基対変化を誘導し、その後植物を、突然変異が遺伝によって安定に受け継がれる世代へと前進させる。ＤＮＡを抽出し、種子を集団のすべての成員から貯蔵して、長期間にわたって繰り返しアクセスできる供給源を創製する。

ＴＩＬＬＩＮＧアッセイのために、ＰＣＲプライマーは、対象とする１個の遺伝子標的を特異的に増幅するように設計される。標的が遺伝子ファミリーの成員であるかまたは倍数体ゲノムの部分である場合、特異性は特に重要である。次に、多数の個体のプールしたＤＮＡからＰＣＲ産物を増幅するために染料標識したプライマーが使用できる。これらのＰＣＲ産物を変性し、ミスマッチ塩基対の形成を許容するように再アニーリングする。ミスマッチまたはヘテロ二本鎖は、いずれも、天然に生じる一塩基多型（ＳＮＰ）（すなわち集団からのいくつかの植物は同じ多型を担持する可能性がある）および誘導されたＳＮＰ（すなわちごくまれな個別植物が突然変異を示す可能性がある）である。ヘテロ二本鎖の形成後、ミスマッチＤＮＡを認識し、切断するエンドヌクレアーゼ、例えばＣｅｌＩの使用が、ＴＩＬＬＩＮＧ集団内の新規ＳＮＰを発見するために重要である。

このアプローチを使用して、何千もの植物を、任意の遺伝子またはゲノムの特定領域内に一塩基変化並びに小さな挿入または欠失（１〜３０ｂｐ）を有する個体を同定するためにスクリーニングすることができる。アッセイされるゲノム断片は、０．３〜１．６ｋｂの範囲内の大きさであり得る。８倍プール、１．４ｋｂフラグメント（ノイズのためにＳＮＰの検出に問題があるフラグメントの末端を除く）およびアッセイ当たり９６レーンで、この組合せは１回のアッセイにつき百万塩基対までのゲノムＤＮＡをスクリーニングすることを可能にし、ＴＩＬＬＩＮＧをハイスループット手法にする。

ＴＩＬＬＩＮＧは、Slade and Knauf (2005)およびHenikoff et al. (2004)の中でさらに説明されている。

突然変異の効率的な検出を可能にすることに加えて、ハイスループットＴＩＬＬＩＮＧ技術は自然多形の検出のために理想的である。それ故、公知の配列にヘテロ二本鎖形成することにより未知の相同なＤＮＡを問い合わせることは、多型部位の数と位置を明らかにする。少なくともいくつかの反復数の多型を含む、ヌクレオチド変化および小さな挿入と欠失の両方が同定される。これはＥｃｏｔｉｌｌｉｎｇ(Comai et al., 2004)と呼ばれている。

各々のＳＮＰは、いくつかのヌクレオチド内のそのおおよその位置によって記録される。それ故、各ハプロタイプはその移動度に基づいて保管され得る。配列データは、ミスマッチ切断アッセイのために使用される同じ増幅ＤＮＡのアリコートを使用して比較的小さな漸増作業（incremental effort）で入手できる。１つの反応のための左側または右側配列決定プライマーは、多型へのその近接度によって選択される。Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒソフトウエアは多重アラインメントを実行し、塩基変化を発見して、各々の場合にゲルバンドを確認する。

Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇは完全配列決定よりも安価に実施でき、本方法が現在、大部分のＳＮＰ発見のために使用される。突然変異した植物からのＤＮＡのプールではなく、整列した生態型（ecotypic）ＤＮＡを含むプレートをスクリーニングすることができる。検出は塩基対に近い分解能を有するゲル上であり、バックグラウンドパターンはレーン全体にわたって均一であるので、同一の大きさのバンドはマッチし、それ故単一工程でＳＮＰを発見し、遺伝子型分類することができる。このように、ＳＮＰの最終的な塩基配列決定は簡単で効率的であり、スクリーニングのために使用される同じＰＣＲ産物のアリコートをＤＮＡ塩基配列決定に供することができるのでなおさらである。
突然変異誘発手順
突然変異型イネ植物系統を作出するための手法は当分野において公知である。突然変異型イネ植物を作出するために使用できる変異原の例は、照射および化学物質による突然変異誘発を含む。突然変異体はまた、Ｔ−ＤＮＡ挿入およびトランスポゾン誘導型突然変異誘発のような手法によって作製され得る。突然変異誘発手順は、イネ植物の任意の親細胞、例えば種子または組織培養下の親細胞に関して実施され得る。

化学的変異原は、化学的性質、例えばアルキル化剤、架橋剤等によって分類できる。有用な化学的変異原は、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ＥＮＵ）；Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ＭＮＵ）；塩酸プロカルバジン；クロラムブシル；シクロホスファミド；メタンスルホン酸メチル（ＭＭＳ）；メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）；硫酸ジエチル；アクリルアミド単量体；トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）；メルファラン；ナイトロジェンマスタード；ビンクリスチン；ジメチルニトロソアミン；Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）；７，１２ジメチルベンズアントラセン（ＤＭＢＡ）；エチレンオキシド；ヘキサメチルホスホルアミド；およびビスルファンを含むが、これらに限定されない。

突然変異を誘導するための適切な照射の一例は、γ線照射、例えばセシウム１３７線源によって供給されるものである。γ線照射は、好ましくは約６０〜２００Ｋｒａｄの線量、最も好ましくは約６０〜９０Ｋｒａｄの線量で植物細胞に与えられる。

植物は、典型的には所望の遺伝的改変を達成するために十分であるが、細胞の生存能および細胞が植物に再生される能力を完全に破壊するには不十分な期間、変異原に曝露される。
抗体
ＦａｔＢまたはＦａｄ２ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体は、本発明の方法の一部のために有用であり得る。

「特異的に結合する」という用語は、ＦａｔＢまたはＦａｄ２ポリペプチドに結合するが、イネの他のタンパク質、特にイネ種子のタンパク質には結合しない、抗体の能力を指す。

本明細書で使用するとき、「エピトープ」という用語は、抗体によって結合されるＦａｔＢまたはＦａｄ２ポリペプチドの領域を指す。エピトープは、エピトープに対する抗体を作製するために動物に投与され得るが、本明細書で述べる方法のために有用な抗体は、好ましくは全長ポリペプチドの中のエピトープ領域に特異的に結合する。

ポリクローナル抗体を所望する場合は、選択哺乳動物（例えばマウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等）を抗原性ポリペプチド、例えば図２または７または配列番号１〜４または１５〜１８において提供されるもので免疫する。免疫動物からの血清を収集し、公知の手順に従って処理する。ポリクローナル抗体を含有する血清が他の抗原に対する抗体を含む場合は、免疫アフィニティークロマトグラフィーによってポリクローナル抗体を精製することができる。ポリクローナル抗血清を作製し、処理するための手法は当分野において公知である。そのような抗体を作製し得るために、本発明はまた、動物における免疫原として使用するための、もう１つ別のペプチドにハプテン化された本発明のペプチドまたはそのフラグメントを提供する。

本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体も、当業者によって容易に作製され得る。ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を作製するための一般的な方法は周知である。抗体産生不死化細胞系統は、細胞融合によっておよびまた他の手法、例えば発癌性ＤＮＡでのＢリンパ球の直接形質転換またはエプスタイン‐バーウイルスでのトランスフェクションによって創製し得る。産生されたモノクローナル抗体のパネルを様々な性質に関して、すなわちアイソタイプおよびエピトープ親和性に関してスクリーニングすることができる。

代替的手法は、例えばファージが、それらのコートの表面に極めて多様な相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するｓｃＦｖフラグメントを発現するファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることを含む。この手法は当分野において周知である。

本発明に関して、「抗体」という用語は、異なる規定がない限り、標的抗原に対する結合活性を保持する全長抗体のフラグメントを包含する。そのようなフラグメントは、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）₂フラグメント、並びに一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含む。さらに、抗体およびそのフラグメントは、例えば欧州特許出願第Ａ−２３９４００号に記載されているような、ヒト化抗体であり得る。

抗体は、固体支持体に結合され得るおよび／または適切な試薬、対照、指示書等と共に適切な容器中でキットに包装され得る。

好ましくは、抗体は検出可能に標識される。抗体結合の直接測定を可能にする例示的な検出可能標識は、放射性標識、蛍光物質、染料、磁気ビーズ、化学発光物質、コロイド粒子等を含む。結合の間接測定を可能にする標識の例は、基質が着色産物または蛍光産物を与え得る酵素を含む。さらなる例示的な検出可能標識は、適切な基質の添加後に検出可能産物のシグナルを与えることができる共有結合酵素を含む。複合体における使用のための適切な酵素の例は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ等を含む。市販されていない場合は、そのような抗体−酵素複合体は、当業者に公知の手法によって容易に作製される。さらなる例示的な検出可能標識は、高親和性でアビジンまたはストレプトアビジンに結合するビオチン；蛍光活性化セルソーターと共に使用できる、蛍光色素（例えばフィコビリタンパク質、フィコエリトリンおよびアロフィコシアニン；フルオレセインおよびテキサスレッド）；ハプテン等を含む。好ましくは、検出可能標識はプレートルミノメーターでの直接測定を可能にし、例えばビオチンであり得る。そのような標識抗体は、本発明のポリペプチドを検出するために当分野で公知の手法において使用できる。

〔実施例１〕
試験材料および方法
ナトリウムメトキシドによる油の抽出
脂肪酸および他の分析のために、異なる記述がない限り以下のようにしてイネ穀粒から全脂質を抽出した。一部の場合には、各々が穀粒の半分から成る試料を抽出のために使用し、胚を含有する残りの半分の穀粒を胚救助のために使用した。この手法は他の穀物に関しても使用できる。

１個の発育中の種子または半分の種子をろ紙の間で押しつぶし、管に入れた。０．５Ｍナトリウムメトキシド２ｍｌを添加し、管を固く密閉して、その後８０℃で１０分間インキュベートした。管を冷却した後、氷酢酸０．１ｍｌを添加し、次いで蒸留水２ｍｌおよび石油精油２ｍｌを添加した。混合物を１０秒間ボルテックスし、相が分離した後、上部石油層を小さな試験管に移した。重炭酸カリウム／硫酸ナトリウム混合物約１ｇを試験管に添加し、混合物をボルテックスした。試料溶液をオートサンプラーバイアルに写し、Soutjesdic et al. (2002)によって述べられているようにＧＣ分析を実施するまで冷凍庫において−２０℃で保存した。
高水分含量を有する組織からの脂質の抽出（ブライ−ダイアー（Bligh-Dyer）法）
本方法はBligh and Dyer (1959)から適合された。ＣＨＣｌ₃／ＭｅＯＨ（１：２）１．５ｍｌを緩衝液０．４ｍｌ中の組織試料に添加し、試料を強くボルテックスした。さらなるＣＨＣｌ₃ ０．５ｍｌを添加し、試料を再びボルテックスした。Ｈ₂Ｏ０．５ｍｌを添加し、試料を再びボルテックスした。相を分離するために管を３０００ｒｐｍで手早く遠心した；白色沈殿物が界面に出現した。有機（下部）相を新たな管に移し、真空下で濃縮した。酸性脂質を抽出しようとする場合は、Ｈ₂Ｏ０．５ｍｌの代わりに１％ＨＣｌＯ₄ ０．５ｍｌを添加した。上記手順における容量は、ＣＨＣｌ₃／ＭｅＯＨ／Ｈ₂Ｏの比率が維持される限り、変更し得る。
脂肪酸含量の定量のための脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）の調製
穀粒からＦＡＭＥを直接調製するため、１０〜１５の種子を正確に計量し、ガラス管に移した。１ｍｇ／ｍｌ１７：０−メチルエステル１０μｌの内部標準を各々の種子試料に添加した。１Ｎメタノール−ＨＣｌ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）０．７５ｍｌを各管に添加し、しっかりと蓋をして、８０℃で少なくとも２〜３時間または一晩還流した。試料を冷却し、ＮａＣｌ（０．９％ｗ／ｖ）０．５ｍｌ、次いでヘキサン３００μｌを添加した。管に再び蓋をし、強くボルテックスした。上部ヘキサン相（２００〜２５０μｌ）を注意深くエッペンドルフ管に移した。試料を窒素下で完全に乾燥した。乾燥したＦＡＭＥ試料をヘキサン２０μｌに溶解し、ＧＣ分析のためにバイアル中の円錐形ガラスインサートに移した。
ガスクロマトグラフィーによるＦＡ分析
脂肪酸メチルエステルを、以下のようにアルカリメチル基転移によって調製した。単一種子試料をろ紙ディスクの間で押しつぶした。ろ紙ディスクに移した脂質中の脂肪酸を、次に、０．０２Ｍナトリウムメトキシド２ｍＬ中８０℃で１０分間メチル化し、その後３０分間冷却した。氷酢酸０．１ｍＬを添加し、次いで蒸留水２ｍＬおよびヘキサン２ｍＬを順に添加した。ボルテックスし、相を分離した後、脂肪酸メチルエステルを含む上部ヘキサン層をマイクロバイアルに移した。脂肪酸メチルエステルを、先に述べられているように(Stoutjesdijk et al., 2002)気−液クロマトグラフィーによって分析した。
イネの形質転換
イネ（日本晴品種）（cv.Nipponbare）を以下のように形質転換した。
ｉ）カルスの誘導と培養
成熟穀粒からもみ殻を取り除き、その後７０％ＥｔＯＨに３０秒間浸漬してろうの外層を除去した。清浄にした穀粒を滅菌水で３回洗浄し、表面滅菌するために振とうしながら２５％漂白剤の溶液（Ｔｗｅｅｎ２０界面活性剤２滴を添加）に２０分間浸漬した。無菌条件下で、穀粒を７０％ＥｔＯＨで手早くすすぎ、滅菌水で８〜１０回十分に洗浄して、Ｎ₆Ｄ培地に塗布した。プレートを微小孔テープで密閉し、自然光の下で(under full light)２８℃でインキュベートした。６〜８週間後にカルスが生成され、それらをＮＢ培地に移した。パラフィン紙で密閉し、４週間ごとに新鮮ＮＢプレートに継代培養しながら２８℃で放置した。５継代以降のカルスは形質転換に使用しなかった。
ｉｉ）形質転換
健康に見えるカルスを継代培養プレートから採取し、２５〜３０カルス／プレートの密度で新鮮ＮＢプレートに移した。２日後、使用する構築物を含むアグロバクテリウム株の新鮮培養物を樹立し、２８℃でインキュベートした。培養培地は、アセトシリンゴン１００μＭを添加したＮＢ培地であった。カルスを細胞の懸濁液に１０分間液浸した。過剰の懸濁液を廃棄した後、アセトシリンゴン１００μＭを添加したＮＢ培地にカルスを置き、暗所にて２５℃で３日間インキュベートした（共培養）。共培養工程後、カルスを管の中で１５０ｍｇ／ｍｌチメンチン（Timentin）を含む滅菌水で静かに３回洗浄した。カルスをろ紙に乾燥ブロットし、十分な間隔を置いてＮＢＣＴプレート（カナマイシン選択マーカ遺伝子を使用する場合は１００μｇ／ｍｌカナマイシンまたは適宜に他の選択薬剤、１５０μｇ／ｍｌチメンチンおよび２００μｇ／ｍｌクラフォラン（Claforan）を含有する）に塗布した。プレートを暗所にて２６〜２８℃で３〜４週間インキュベートした。耐性カルスが約１０日後に認められ、ＮＢＣＴ＋選択プレートに移して、さらに１４〜２１日間暗所でインキュベートした。健康なカルスをＰＲＣＴ＋選択プレートに移し、暗所で８〜１２日間インキュベートして、その後ＲＣＴ＋選択プレートに移し、自然光の下、２８℃で３０日間インキュベートした。この期間後、発生した小植物体を組織培養鉢中の１／２ＭＳ培地に移し、さらなる成長のために光下で１０〜１４日間インキュベートした後、土壌に移した。
ｉｉｉ）イネ組織培養のための培地組成および成分
Ｎ６マクロエレメント（２０Ｘ）（ｇ／１）：（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、９．３；ＫＮＯ₃、５６．６；ＫＨ₂ＰＯ₄、８；ＭｇＳＯ₄．７Ｈ₂Ｏ、３．７；ＣａＣｌ₂．２Ｈ₂Ｏ、３．３。

Ｎ６ミクロ（１０００Ｘ）（ｍｇ／１００ｍｌ）：ＭｎＳＯ₄．４Ｈ₂Ｏ、４４０；ＺｎＳＯ₄．７Ｈ₂Ｏ、１５０；Ｈ₃ＢＯ₃、１６０；ＫＩ、８０。

Ｎ６ビタミン（１００Ｘ）（ｍｇ／ｌ００ｍｌ）：グリシン、２０；チアミン−ＨＣｌ、１０；ピリドキシン−ＨＣｌ、５；ニコチン酸、５。

Ｂ５ミクロエレメント（１００Ｘ）（ｍｇ／１０００ｍｌ）：ＭｎＳＯ₄．４Ｈ₂Ｏ、１０００；Ｎａ₂ＭｏＯ₄．２Ｈ₂Ｏ、２５；Ｈ₃ＢＯ₃、３００；ＺｎＳＯ₄．７Ｈ₂Ｏ、２００；ＣｕＳＯ₄．５Ｈ₂Ｏ、３．８７；ＣｏＣｌ₂．６Ｈ₂Ｏ、２．５；ＫＩ、７５。

Ｂ５ビタミン（１００Ｘ）およびＳｉｇｍａ細胞培養からのガンボーグビタミン溶液（Gamborg's vitamin solution）（１０００Ｘ）。

ＦｅＥＤＴＡ（２００Ｘ）（ｇ／２００ｍｌ）：第二鉄ナトリウム塩、１．４７。

２，４−Ｄ（ｌｍｇ／ｍｌ）：２，４−ジクロロフェノキシ酢酸１００ｍｇを無水エタノール１ｍｌに溶解し、１ＮＫＯＨ３ｍｌを添加して、１ＮＨＣｌでｐＨ６に調整する。

ＢＡＰ（１ｍｇ／ｍｌ）：Ｓｉｇｍａ細胞培養からの６−ベンジルアミノプリン。

ＮＡＡ（１ｍｇ／ｍｌ）：Ｓｉｇｍａ細胞培養からのナフタレン酢酸。

ＡＢＡ（２．５ｍｇ／ｍｌ）：アブシジン酸２５０ｍｇを１ＭＮａＯＨ２ｍｌに溶解し、滅菌蒸留水を加えて１００ｍｌにする。最終的なバックグラウンド濃度は２０ｍＭＮａＯＨである。

ハイグロマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）：Ｒｏｃｈｅからのハイグロマイシン溶液。
チメンチン（１５０ｍｇ／ｍｌ）：チメンチン３１００ｍｇを滅菌水２０．６６ｍｌに溶解する。最終濃度は１５０ｍｇ／ｍｌである。

クラフォラン（２００ｍｇ／ｍｌ）：クラフォラン４ｇｍを滅菌水２０ｍｌに溶解する。

ＭＳ塩：ムラシゲ‐スクーグ（Murashige-Skoog）最小有機培地。

Ｎ６Ｄ培地（１リットル当たりの量）：
Ｎ６マクロ（１０Ｘ）１００ｍｌ
Ｎ６ミクロ（１０００Ｘ）１ｍｌ
Ｎ６ビタミン（１０００Ｘ）１ｍｌ
ＭＳ鉄／ＥＤＴＡ５ｍｌ
ミオイノシトール１００ｍｇ
カサミノ酸３００ｍｇ
プロリン２．９ｇ
２，４−Ｄ（１ｍｇ／ｍｌ）２ｍｌ
スクロース３０ｇ
１ＭＫＯＨでｐＨを５．８に調整し、フィトゲル３ｇ／ｌを添加して、加圧滅菌する。

ＮＢ培地（１リットル当たりの量）：
Ｎ６マクロエレメント（２０Ｘ）５０ｍｌ
Ｂ５ミクロエレメント（１００Ｘ）１０ｍｌ
Ｂ５ビタミン（１００Ｘ）１０ｍｌ
ＦｅＥＤＴＡ（２００Ｘ）５ｍｌ
２，４−Ｄ（１ｍｇ／ｍｌ）２ｍｌ
スクロース３０ｇ
プロリン５００ｍｇ
グルタミン５００ｍｇ
カゼインの酵素加水分解物（ＣＥＨ）３００ｍｇ
ＮＢＯ：ＮＢ培地、プラス３０ｇ／ｌマンニトールおよび３０ｇ／ｌソルビトール、ｐＨ調整の前に添加する。

ＮＢＣＴ＋選択（ハイグロマイシン−Ｈ３０）：ＮＢ培地プラス３０ｍｇ／ｌハイグロマイシン、チメンチン１５０ｍｇ／ｍｌ、クラフォラン２００ｍｇ／ｌ。

ＮＢＣＴ＋選択（ハイグロマイシン−Ｈ５０）：ＮＢ培地プラス選択５０ｍｇ／ｌハイグロマイシン、２００ｍｇ／ｌクラフォランおよびチメンチン１５０ｍｇ／ｍｌ。

ＰＲＣＴ＋選択：２，４−Ｄを含まないＮＢ培地、プラス、加圧滅菌後に以下を添加する：ＢＡＰ、２ｍｇ／ｌ；ＮＡＡ、１ｍｇ／ｌ；ＡＢＡ、５ｍｇ／ｌ；クラフォラン、１００ｇ／１；チメンチン、１５０ｍｇ／ｍｌ＋選択。

ＰＲＣＴ＋選択：２，４−Ｄを含まないＮＢ培地、プラス、加圧滅菌後に以下を添加する：ＢＡＰ；３ｍｇ／ｌ；ＮＡＡ、０．５ｍｇ／ｌ；チメンチン、１５０ｍｇ／ｍｌ；クラフォラン、１００ｍｇ／１＋選択。

１／２ＭＳ培地：ＭＳ塩およびビタミン混合物、２．２１ｇ；スクロース、１０ｇ／ｌ、フィトゲル２．５ｇ／１を添加し、加圧滅菌後、０．０５ｍｇ／ｌＮＡＡおよびチメンチン１５０ｍｇ／ｍｌを添加する。
〔実施例２〕
イネからのＦａｔＢ遺伝子の同定と単離
ＦａｔＢ遺伝子は、炭素数１６以下の長さを有する脂肪酸をアシルキャリアータンパク質からアシルＣｏＡに選択的に転移する活性を有し、それ故脂肪酸炭素鎖のさらなる延長を妨げる酵素、パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする。推定上のイネＦａｔＢ配列を、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッションシロイヌナズナ遺伝子座ＡｔＡＣＰＴＥ３２およびアヤメ遺伝子座ＡＦ２１３４８０についての配列を使用した相同性に基づく検索を用いて同定した。使用したプログラムは、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）において入手可能なＭｅｇａｂｌａｓｔであった。ＮＣＢＩによって使用されたデフォルトパラメータを使用し、使用したデータベースは、イネ、オリザ・サティバについての非重複（ｎｒ）配列およびハイスループット遺伝子配列（ｈｔｇｓ）の両方であった。Ｍｅｇａｂｌａｓｔプログラムによって選択されたイネからの最も類似度の高い配列を翻訳し、すべてのＦａｔＢ配列において認められた保存された配列ＮＱＨＶＮＮ（配列番号２６）の存在に関して検討した。シロイヌナズナにおいて必須であると考えられるさらなるアミノ酸残基はシステイン２６４であり、アスパラギン２２７およびヒスチジン２２９（どちらも保存された配列ＮＱＨＶＮＮ内に存在する）と共に、提案された触媒三つ組残基を含む。

ＴｈｅＣｈｉｎｅｓｅＲｉｃｅＤａｔａｂａｓｅ（現在のウエブサイトアドレスhttp://rise.genomics.org.cn/rice/index2.jsp）も限られた範囲内で使用し、ＢＬＡＳＴ検索についてのデフォルトパラメータをシロイヌナズナ配列およびアヤメ配列と共に使用した。翻訳された配列を図２に整列する。

すべてのＦａｔＢ遺伝子の構造の概略を図３に示す。記載されている遺伝子は、論じられているタンパク質配列に以下のように対応する：ＡＣ１０８８７０はＯｓ１１ｇ４３８２０に対応し、ＡＰ００５２９１はＯｓ０２ｇ４３０９０に対応し、ＡＰ０００３９９はＯｓ０６ｇ５１３０に対応し、およびＡＰ００４２３６はＯｓ０６ｇ３９５２０に対応する。図に指示されているように１個の遺伝子から複数の転写産物の可能性があることに留意すべきである。図４は、デフォルトパラメータを使用した「遺伝子」配列のＣＬＵＳＴＡＬＷ（ｆａｓｔ）アラインメントを示す−「遺伝子」は種々の長さであることに留意すべきである。

遺伝子は６つのエクソンを含む。Ｏｓ０６ｇ５１３０によって表わされる遺伝子の構造を図５に詳細に示す。

図６は、選択的ＰＣＲ増幅のために使用した種々のプライマーを指示する、ＦａｔＢｃＤＮＡのコード配列のアラインメントを示す。

Ｏｓ０６ｇ５１３０とＯｓ０６ｇ３９５２０（図２の配列ａｐ０００３９９およびａｐ００４２３６に対応する）の翻訳されたペプチド配列の間の配列同一性は、全体で７４％であり、コード配列全体にわたるヌクレオチドレベルでの同一性は６９％であった。どちらの場合も、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムをデフォルトパラメータで使用した。Ｏｓ０２ｇ４３０９０（１つの転写産物）、Ｏｓ０６ｇ０５１３０、Ｏｓ０６ｇ３９５２０およびＯｓ０１１ｇ４３８２０から推定されるポリペプチドは、それぞれ２９８、４２７、４２３および４２５アミノ酸に対応する。

コードされるタンパク質の活性を、この活性を有することが示されている公知のポリペプチドとの高度の配列同一性から推測した。さらに、これらの配列に基づく遺伝子不活性化構築物のパルミチン酸レベルへの認められた作用も、この結論と一致した（以下参照）。

遺伝子ファミリーの発現は複雑であり、これら４つの遺伝子から少なくとも７つの転写産物が予測された。実施したＲＴ−ＰＣＲ実験およびＥＳＴライブラリーから回収されたクローンの相対数に基づき、Ｏｓ０６ｇ５１３０からのＲＮＡは穀粒において比較的豊富であるが、Ｏｓ１１ｇ４３８２０はその組織において中等度のレベルで発現され、その他の遺伝子は低レベルでしか発現されないと思われた。
〔実施例３〕
イネからのＦａｄ２遺伝子の同定と単離
Ｆａｄ２遺伝子によってコードされるタンパク質（脂肪酸デサチュラーゼ２）は、１８：１脂肪酸への二重結合の導入の役割を担う−それらはΔ１２デサチュラーゼである。シロイヌナズナ遺伝子座ａｔｈｄｌ２ａａａからのＧｅｎｂａｎｋ配列を、Ｍｅｇａｂｌａｓｔをデフォルト設定で使用してオリザ・サティバについてのｎｒおよびｈｔｇｓデータベースを検索するために使用した。イネから回収された最も類似する配列を翻訳し、保存された疎水性モチーフＦＳＹＶＶＨＤＬＶＩＶＡＡＬＬＦＡＬＶＭＩ（配列番号２７）、ＡＷＰＬＹＩＡＱＧＣＶＬＴＧＶＷＶＩＡ（配列番号２８）、ＩＳＤＶＧＶＳＡＧＬＡＬＦＫＬＳＳＡＦＧＦ（配列番号２９）、ＶＶＲＶＹＧＶＰＬＬＩＶＮＡＷＬＶＬＩＴＹＬＱ（配列番号３０）およびヒスチジンイネ配列ＨＥＣＧＨＨ（配列番号３１）、ＨＲＲＨＨＡ（配列番号３２）およびＨＶＡＨＨ（配列番号３３）の存在に関して検討した。得られたアイソフォームの翻訳されたアミノ酸配列を図７に示す。

図８は、アイソフォームＡＰ００４０４７（小文字）における５’ＵＴＲの位置およびＲＴ−ＰＣＲによる増幅のために使用したプライマーの位置（下線）を示す、Ｆａｄ２配列のアラインメントを提供する。終止コドンの位置を箱で指示し、終止コドンの下流の非翻訳領域を小文字で示す。

ＡＰ００４０４７のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、ＢＬＡＳＴプログラムをデフォルトパラメータで使用してイネゲノムを検索するために使用したとき、４つの遺伝子配列がイネゲノムから高度に類似するとして回収される。これらの遺伝子の全体構造を図９に示す。遺伝子は以下のようにタンパク質配列に対応する。タンパク質配列ＡＰ００４０４７（本明細書ではＦＡＤ２−１とも称される）は遺伝子Ｏｓ０２ｇ４８５６０に対応し、配列ＡＰ００５１６８（本明細書ではＦＡＤ２−２とも称される）は遺伝子Ｏｓ０７ｇ２３４１０に対応し、配列コンティグ２６５４は遺伝子Ｏｓ０７ｇ２３４３０に対応する。加えて、興味深い程度の配列同一性を共有するが、明らかにこれらの配列と異なり、偽遺伝子であると考えられる配列が存在した。この配列はＯｓ０７ｇ２３３９０であった。

ＦａｔＢ遺伝子と異なり、Ｆａｄ２遺伝子はイントロンを全く含まなかった。すべてのタンパク質コード配列のアラインメントを図１０に示す。Ｏｓ０２ｇ４８５６０からＯｓ０７ｇ２３４１０までについてのコード領域全体にわたる配列同一性は７９％であった。

Ｏｓ０２ｇ４８５６０によってコードされるポリペプチド（すなわちＡＰ００４０４７）の分子量は、プロセシング前は４４．３５ｋＤａであり、３８８アミノ酸を含んだ。Ｏｓ０７ｇ２３４１０によってコードされるポリペプチドの分子量は４４．９ｋＤａであり、３９０アミノ酸を含んだ。これらの推定ポリペプチドは、デフォルトパラメータを用いたＢＥＳＴＦＩＴプログラムによって測定したとき、７７％の配列同一性を有していた。Ｏｓ０７ｇ２３４３０からの推定ポリペプチドは、４１ｋＤａ（３６３アミノ酸）の分子量を有し、Ｏｓ０７ｇ２３３９０からの推定ポリペプチドは２４ｋＤａ（２２３アミノ酸）であった。すべての推定ポリペプチド配列のアラインメントを図７に示す。

Ｏｓ０２ｇ４８５６０に対応する配列が穀粒において発現され、この所見は、コグネイト配列が穀粒ｃＤＮＡライブラリーから回収されたＥＳＴライブラリーにおけるこの遺伝子についてのクローンの相対頻度からのデータと一致した。７番染色体上にコードされるアイソフォームの２つに対応する配列（Ｏｓ０７ｇ２３４３０、２３４１０）は、葉ＥＳＴライブラリーから回収されたが、その他の遺伝子（Ｏｓ０７ｇ２３３９０）に対応する配列はまだ報告されていない；我々は、この配列は、存在するとしても低レベルで発現されるであろうと判定した。

結論として、イネＦａｄ２遺伝子ファミリーはまた、複雑な遺伝子ファミリーでもあった。Ｏｓ０２ｇ４８５６０から推定される２つの転写産物は、配列によって区別することができなかった。Ｏｓ０２ｇ４８５６０から推定される配列は、穀粒において明らかに発現された。
〔実施例４〕
イネにおけるＦａｔＢおよびＦａｄ２遺伝子の発現
実施例２および３で述べたようにイネにおいて同定された４つの推定上のＦａｔＢおよび３つのＦａｄ２遺伝子のうちで、もし少しでも発現されるとすれば、いずれが発育中のイネ穀粒において発現され得るかを判定するため、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイを実施した。遺伝子は配列において密接に関連していたので、各遺伝子についての転写産物を特異的にアッセイするために、プライマーを遺伝子の各々について特異的であるように設計しなければならなかった。配列多様性（sequence divergence）の領域をアラインメントから同定し（図６および８）、いくつかのプライマー対を設計して、試験した。推定上のＦａｔＢ遺伝子の発現を検出するためのプライマー配列を表３および４に示す。発現レベルを比較するための内部標準として、αチューブリンをコードするイネ遺伝子、ＯｓＴｕｂＡ１の発現に関してＲＮＡでもＲＴ−ＰＣＲを実施した。この遺伝子は活発に分裂しているすべての組織において発現されることが公知であり、ホルモンＡＢＡによって影響されず、それ故葉および穀粒分析のための構成的に発現される対照として適切であった。

ＲＮＡは、ＱｉａｇｅｎＲＮｅａｓｙキットを使用し、製造者によって供給されるプロトコルに従って、開花の約１５日後にイネ穀粒から調製した。次にＤＮアーゼ処理（ＤＮＡ−フリーキット、Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、ＲＮＡ調製物から夾雑ＤＮＡを除去した。ＲＴ−ＰＣＲ混合物は、最終容量２５μｌになるように、５ｘＱｉａｇｅｎＯｎｅＳｔｅｐＲＴ−ＰＣＲ緩衝液５μｌ、ｄＮＴＰ混合物１μｌ（各々のｄＮＴＰ１０ｍＭを含む）、各々のプライマー１５ｐｍｏｌおよびＲＮＡ約２０ｐｇを含んだ。以下のＲＴ−ＰＣＲサイクリングプログラムをＲＴ−ＰＣＲ増幅のために使用した：５０℃、３０分間（逆転写）、９５℃で１５分間（初期ＰＣＲ活性化）、（９４℃で１分間、５７℃で１分間、７２℃で１分間）の３０サイクル（ＰＣＲ増幅）、その後７２℃で１０分間の最終伸長。

ＲＴ−ＰＣＲ実験からの結果は、配列Ｆａｄ２−１遺伝子（ＴＩＧＲイネデータベース識別子ＬＯＣＯｓ０２ｇ４８５６０）が、その他のアイソフォームをコードする遺伝子と比較して穀粒および葉の両方で高発現されることを証明した。その他の２つのＦａｄ２遺伝子（ＬＯＣＯｓ０７ｇ２３４１０およびＬＯＣＯｓ０７ｇ２３４３０）は、低レベルで、主として葉において発現されると思われた。ＦａｔＢアイソフォームをコードする遺伝子の分析は、ＦａｔＢ−１（Ｇｅｎｂａｎｋ識別子ＡＰ０００３９９、ＴｉｇｒＬＯＣＯｓ０６ｇ０５１３０）およびＦａｔＢ−２（Ｇｅｎｂａｎｋ識別子ＡＣ１０８８７０、ＴＩＧＲ識別子Ｏｓ１１ｇ４３８２０）がその他の２つの遺伝子よりも穀粒においてより高度に発現されることを示した。Ｔｏｓ−１７転位挿入突然変異体は、ＡＰ０００３９９をコードする遺伝子内に挿入を有していた。

葉組織では、ＦａｔＢ−１（Ｇｅｎｂａｎｋ識別子ＡＰ０００３９９、ＴＩＧＲＬＯＣＯｓ０６ｇ０５１３０）およびＦａｔＢ−４（ＡＰ００４２３６、ＴＩＧＲＬＯＣＯｓ０６ｇ３９５２０）がより高度に発現され、これらの遺伝子からのｍＲＮＡ転写産物の相対的豊富さを示唆した。コムギ穀粒において中等度に豊富なｍＲＮＡであり、それ故イネ穀粒においても同様の存在率であると予想される、標準品としてのチューブリン遺伝子転写産物の存在率と比較したとき、ＦａｔＢおよびＦａｄ２ｍＲＮＡはすべて、ＲＴ−ＰＣＲによって測定したとき低レベルに蓄積された。しかしこの結論は、プライマーが、試験した遺伝子の各々について、チューブリンプライマー／転写産物と同様の効率で標的転写産物にハイブリダイズするという仮定に基づいた。

この結論は、ＥＳＴデータベース検索によって裏付けられる。イネＥＳＴ配列を検索するためにＦａｄ２−１（ＴＩＧＲＯｓ０２ｇ４８５６０）配列を使用したとき、転写産物配列は円錐花序、根および全植物体ｃＤＮＡライブラリーに存在した。これに対し、Ｆａｄ２−２（ＴＩＧＲＯｓ０７ｇ２３４１０）およびＦａｄ２−３（ＴＩＧＲＯｓ０７ｇ２３４３０）配列は、葉、苗条または全植物体ライブラリーにのみ存在した。偽遺伝子であると考えられるＦａｄ２様遺伝子、Ｏｓ０７ｇ２３３９０についての配列は、ＥＳＴライブラリーのいずれにも存在しなかった。同様に、ＦａｔＢ−１（ＴＩＧＲＯｓ０６ｇ０５１３０）配列は葉と円錐花序ＥＳＴライブラリーの両方に存在し、ＦａｔＢ−２配列（ＴＩＧＲＯｓ１１ｇ４３８２０）は円錐花序または全植物体ＥＳＴライブラリーにのみ存在し、ＦａｔＢ−４（ＴＩＧＲＯｓ０６ｇ３９５２０）は葉のライブラリーにのみ存在した。ＦａｔＢ−３（ＡＰ００５２９１、Ｏｓ０２ｇ４３０９００）配列は、ＲＴ−ＰＣＲによって判定したとき葉と穀粒の両方においてその他よりも比較的低レベルで発現されるが、円錐花序および全植物体ＥＳＴライブラリーに存在した。これらの検索は、ＥＳＴデータベースを使用し、検索をイネからの配列に限定して、ＮＣＢＩウエブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi）のＢＬＡＳＴプログラムを使用した。

これらのデータに基づき、Ｆａｄ２−１およびＦａｔＢ−２は、穀粒脂質の改変のために下方調節されるべき遺伝子であると考えられた。ＦａｔＢ−３もこれに関して重要であると思われた。
〔実施例５〕
遺伝子サイレンシング構築物の構築およびイネの形質転換
Ｆａｄ２発現の阻害のための二本鎖ＲＮＡ構築物の創製
Ｆａｄ２−１の発現を低下させるために発育中のイネ穀粒において二本鎖ＲＮＡ（ヘアピン型ＲＮＡ）を発現する構築物を設計した。脂肪酸組成への作用を潜在的に最大化するために、３つのＦａｄ２遺伝子の共通領域を標的することにより、イネ穀粒において同定された３つのＦａｄ２遺伝子すべてに有効であるように構築物を設計した。サイレンシング効率を改善するため、構築物は、Smith et al. (2000)によって述べられたように逆方向反復配列のセンス部分とアンチセンス部分の間にイントロンを含んだ。

５０５塩基対フラグメントを、オリゴヌクレオチドｐＦａｄ２−Ｆ５’−ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣ−３’（配列番号５２）およびｐＦａｄ２−Ｒ５’−ＡＡＡＡＣＴＡＧＴＧＡＡＴＴＣＴＡＣＡＣＧＴＡＣＧＧＧＧＴＧＴＡＣＣＡ−３’（配列番号５３）を使用してＦａｄ２−１遺伝子の５’末端からＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙに連結し、大腸菌に形質転換して、挿入物を含むコロニーを同定した。５０５ｂｐのＦａｄ２フラグメントを含む、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｆａｄ２と称されるプラスミドからのＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントを、次に、イントロンＲｉｎｔ９を含むベクターＺＬＲｉｎｔ９ＢＣ３８９５（ＺｈｏｎｇｙｉＬｉ，ＣＳＩＲＯＰｌａｎｔＩｎｄｕｓｔｒｙより入手した）にセンス方向で連結した。ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｆａｄ２からのＢａｍＨＩ／ＳｐｅＩフラグメントを、ヘアピン型構築物を含むイントロンが形成されるように、生じたプラスミドに（アンチセンス方向で）連結した。ヘアピンを含有するＦａｄ２−１イントロンを含むＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩフラグメントを、次に、サイレンシング遺伝子が（プロモーター）センス−イントロン−アンチセンス（ターミネーター）の順で発育中の種子において発現されるようにＮｏｓターミネーター／ポリアデニル化配列を含有するＢｘ１７種子特異的プロモーターを含む、ｐＢｘｌ７ｃａｓＮＯＴベクター（ＺｈｏｎｇｙｉＬｉ，私信）の同じ制限部位に挿入した。Ｂｘ１７プロモーターおよびＦａｄ２−１逆方向反復領域を含むＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩフラグメントを、ハイグロマイシン耐性を与える選択マーカ遺伝子を含むバイナリーベクターｐＷＢｖｅｃ８(Wang et al, 1998)の同じ制限部位に挿入した。次にこのベクターをアグロバクテリウムに導入し、実施例１で述べたようにイネ形質転換のために使用した。二本鎖ＲＮＡ構築物をｄｓＲＮＡ−Ｆａｄ２−１と称した。
ＦａｔＢ発現の阻害のための二本鎖ＲＮＡ構築物の創製
イネパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼＦａｔＢ−１遺伝子（ＴｉｇｒＬＯＣＯｓ０６ｇ０５１３０）の６６５塩基対フラグメントを、以下の配列：Ｒｔｅ−ｓ１、５’−ＡＧＴＣＡＴＧＧＣＴＧＧＴＴＣＴＣＴＴＧＣＧＧＣ−３’（配列番号５４）およびＲｔｅ−ａ１、５’−ＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＡＡＧＡＧＡＣＣＡＧＣＡＧＴ−３’（配列番号５５）を有するプライマーを用いたＰＣＲによって増幅した。このＰＣＲフラグメントを、綿ミクロソームω６−デサチュラーゼＧｈＦａｄ２−１遺伝子(Liu et al., 1999)の５’ＵＴＲからのイントロン配列によって分けられた、センス方向に１コピーのフラグメントおよびアンチセンス方向に２番目のコピーを有する逆方向反復構築物を作製するために使用した。逆方向反復構築物を、その後、ｐＵｂｉｌｃａｓＮＯＴ(Li et al., 1997に述べられた配列に基づきZhongyi Liより)のＵｂｉｌプロモーターとＮｏｓターミネーターの間のＳａｃＩ部位に挿入した。ｐＵｂｉｌプロモーターとイネＦａｔＢの逆方向反復部分をバイナリーベクターｐＷＢＶｅｃ８のＮｏｔＩ部位に挿入し、上述したＦａｄ２構築物と同様にアグロバクテリウムに導入した。二本鎖ＲＮＡ構築物をｄｓＲＮＡ−ＦａｔＢ−１と称した。
形質転換したイネにおける脂肪酸組成の分析
ｄｓＲＮＡ−Ｆａｄ２−１で得られた１０の独立した稔性トランスジェニック植物を、プロモーター領域内の部位に対応する１個のプライマーとＦａｄ２配列の末端についての２番目のプライマーを用いたＰＣＲによってｄＲＮＡ遺伝子の存在に関して試験した。１０の植物のうち９がＰＣＲ反応において陽性と認められ、それ故Ｆａｄ２ＲＮＡｉ構築物を含んだ。同様に、２３の稔性トランスジェニック系統をＦａｔＢＲＮＡｉ構築物に関して試験し、２０の系統がＰＣＲ陽性と認められた。

脂肪酸組成への導入遺伝子の影響を分析するため、形質転換イネ植物の穀粒および葉試料から総脂質を単離した。これを、ＦａｔＢ−１（アクセッション番号ＡＰ０００３９９によって同定されるタンパク質に対応するＴＩＧＲ遺伝子座Ｏｓ０６ｇ５１３０）についての遺伝子内にＴｏｓ１７挿入配列を含むイネ突然変異型系統に関しても、この遺伝子を特異的に不活性化する作用を比較するために実施した。実施例１で述べたようにＧＣ−ＦＡＭＥによって各々の脂質抽出物について脂肪酸組成を測定した。データを表５〜７に提示しており、またデータの一部は図１１〜１３にグラフで示している。各脂肪酸の割合は、実施例１で述べたようにＨＰＬＣによって測定した穀粒の種子油中の総脂肪酸のパーセンテージとして表わした。

結果の最も顕著で驚くべき態様は、Ｆａｄ２ｄｓＲＮＡ植物における穀粒オレイン酸およびリノール酸組成の変化の程度であった。一部の系統でのオレイン酸の比率は３６％から少なくとも６５％（ｗ／ｗ）に上昇し、リノール酸の割合は、最も影響を受けたイネ系統（２２Ａ系統）では３７％から約１３％に低下した。驚くべきことに、Ｆａｄ２系統におけるパルミチン酸の比率も低下し、例えば２２Ａ系統では対照（１８％）と比較して１４％未満に低下した。

ＦａｔＢｄｓＲＮＡ系統では、穀粒におけるパルミチン酸の割合の低下はリノール酸含量の上昇と相関したが、オレイン酸とリノレン酸の割合は基本的に変化しなかった。Ｆａｄ２およびＦａｔＢの両トランスジェニック系統におけるパルミチン酸の割合の低下の程度は同様であったが、ＦａｔＢ系統におけるリノール酸レベルの上昇の程度は、Ｆａｄ２系統で認められた低下の程度をはるかに下回った。すなわち、リノール酸のレベルの変化の程度はＦａｄ２構築物に関してより大きかった。

経路のＦａｔＢが触媒する工程についての興味深い洞察が、ＦａｔＢの１つのアイソフォーム、ＦａｔＢ−１のＴｏｓ−１７挿入ノックアウトの分析によって提供される。Ｔｏｓ−１７突然変異体では、パルミチン酸とオレイン酸の比率の変化の程度がＦａｔＢｄｓＲＮＡ系統に比べて小さかった。これらの結果は、ＦａｔＢアイソフォームをコードする遺伝子が機能において異なることを指示した。

リノール酸対オレイン酸の比率の結果を散布図として作図したとき（図１４）、リノール酸の比率は大きく低下したが、Ｆａｄ２ノックアウトにおけるこれら２つの脂肪酸の間の関係が野生型イネと同じであることは明らかであった。これに対し、ＦａｔＢノックアウトに関しておよび、より小さな程度であるがＦａｔＢＴｏｓ−１７系統では、リノール酸とオレイン酸の間の関係は同様であったが、一定の比率でシフトしている。これは、ＦａｔＢノックアウト植物では、所与の量のオレイン酸に対して野生型またはＦａｄ２ノックアウト植物におけるよりもより多くのリノール酸が存在することを意味した。これは、ＦａｔＢのノックアウトはオレイン酸およびリノール酸の量を制御する経路に影響を及ぼすが、Ｆａｄ２によって制御される、オレイン酸とリノール酸を直接結びつける工程には影響を及ぼさないという見解と一致した。

リノール酸対パルミチン酸の割合の結果も、分析したすべてのイネ系統について作図した。正の直線関係がＦａｄ２ノックアウト系統に関して認められ、逆の関係がリノール酸対オレイン酸について認められた。ＦａｔＢ系統に関しては、しかしながら、異なる関係が認められる（図１５）。Ｆａｄ２ｄｓＲＮＡ植物とＦａｔＢｄｓＲＮＡ植物を散布図として作図したとき（図１６）、オレイン酸とパルミチン酸の間の関係の相違も認められた。これらの結果は、パルミチン酸とリノール酸（およびオレイン酸）の間の関係が経路の２つの乱れに関して異なることを確認した。

経路の種々の乱れの下での様々な脂肪酸の割合の主成分分析は、主成分１（最大変動を与える軸を指示する）がリノール酸対オレイン酸の割合から成り、主成分２（軸の２番目に最も重要なセット）がリノール酸およびオレイン酸対パルミチン酸の割合で構成されたことを確認する。これを図１７に例示する。

我々はまた、この実施例で示した結果から、突然変異を組み合わせるためにｄｓＲＮＡＦａｄ２植物をｄｓＲＮＡＦａｔＢ植物またはＴｏｓ−１７ＦａｔＢ植物と交雑することは、オレイン酸の相対比率をさらに上昇させ、パルミチン酸およびリノール酸のレベルをさらに低下させると結論した。
〔実施例６〕
抗体の作製および使用
ＦａｔＢの推定配列内に存在する１５または１６量体ペプチドを合成することによって抗体を惹起した。ＦａｔＢに対する抗体を惹起するために使用したペプチドは以下の通りであった：

ＦａｔＢ−Ｕ１Ａｃ−ＣＧＭＮＫＮＴＲＲＬＳＫＭＰＤＥ（配列番号５６）。

これは、アミノ酸位置番号２５９からのＦａｔＢの翻訳配列（アクセッション番号ＡＰ０００３９９）に対応し、ＡＰ００５２９１、ＡＣ１０８８７０およびＡＣ００４２３６から翻訳された配列においても認められた。しかし、前記配列は、配列ＴＲＲＬＳＫＭＰＤＥ（配列番号５７）内の４つのアイソフォームの間でのみ同一であった。

ＦａｔＢ−Ｕ２Ａｃ−ＣＧＥＫＱＷＴＬＬＤＷＫＰＫＫＰＤ（配列番号５８）。

この配列は、４つのＦａｔＢアイソフォームすべての翻訳配列において認められた。

ＦａｔＢ−９９Ａｃ−ＣＧＡＱＧＥＧＮＭＧＦＦＰＡＥＳ（配列番号５９）。

この配列はＡＰ００３９９においてのみ認められ、推定ポリペプチドのまさにＣ末端に存在した。

合成後、架橋剤ＭＢＳ（マレイミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシルスクシンアミドエステル）を使用し、標準手法を用いてペプチドをオボアルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニンタンパク質（ＫＬＨ）のいずれかに結合した。架橋ペプチドを透析し、凍結乾燥して、約１ｍｇ／ｍｌの濃度のフロイント不完全アジュバントと共に２週間の間隔で２ヶ月間にわたってウサギに注射した。ＦａｔＢ−９９に対して惹起された抗血清は、野生型イネに存在する２０ｋＤａのポリペプチドが、ＴＩＧＲ識別子Ｏｓ０６ｇ５１３０に対応する遺伝子内に挿入を有するＴｏｓ−１７突然変異型系統においては欠落しており、産物はＦａｔＢ−１に対応し、配列はアクセッション番号ＡＰ０００３９９によって表わされるという、ＦａｔＢアイソフォームの間での明らかな相違を検出した（図１８）。これは約４０ｋＤａの予想サイズとは異なっていたが、そのような不一致は以前にＦａｔＢアイソフォームに関して認められていた。異なる大きさのＦａｔＢ産物が発育中および成熟Ｃｕｐｈｅａｗｒｉｇｈｔｉｉ種子で認められ、成熟種子でより長い大きさであり、成熟種子でより短い産物である、５つの異なるＦａｔＢアイソフォームを示した(Leonard et al, 1997)。

抗血清は、トランスジェニックまたは突然変異体植物試料においてＦａｔＢタンパク質を検出するためおよび遺伝子不活性化の程度を確認するために使用できる。
〔実施例７〕
イネＦａｄ２における突然変異体の同定
Ｆａｄ２−１（ＮＣＢＩデータベースにおけるＡＰ００４０４７、ＴＩＧＲ遺伝子座識別子ＬＯＣＯｓ０２ｇ４８５６０に対応するコード配列）の活性部位（開始ＡＴＧをＴＩＧＲＬｏｃＯｓ２ｇ４８５６０における番号付けの起点とみなす場合は基本的に位置３３０〜１０２０）全体にわたるＰＣＲ産物を、多数の異なるイネ登録から抽出したイネＤＮＡから作製する。産物の大きさは、使用するプライマーに依存して８００ｂｐまでである。二組のオーバーラップするプライマー対を使用する必要があると考えられる。プライマーの１つの可能なセットは以下の通りである：

セットＡ
ＧＴＧＣＣＧＧＣＧＧＣＡＧＧＡＴＧＡＣＧＧ（配列番号６０）
（図１０に示すアラインメントにおける位置５〜２０）
ＧＣＣＧＡＣＧＡＴＧＴＣＧＴＣＧＡＧＣＡＣ（配列番号６１）
（図１０に示すアラインメントにおける位置３７９−３９８の逆方向相補物）

セットＢ
ＴＧＣＣＴＴＣＴＣＣＧＡＣＴＡＣＴＣＧＧ（配列番号６２）
（図１０における位置３６０〜３７９）
ＣＣＴＣＧＣＧＣＣＡＴＧＴＣＧＣＣＴＴＧＧ（配列番号６３）
（図１０における位置１０９９〜１１１８の逆方向相補物）。

アニーリングした産物を、Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅ６０００装置（ＣｏｒｂｅｔｔＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ）またはヘテロ二量体の融解の差をＬＣグリーン染料の蛍光を変化させることによって高感度に検出できる同等の装置において融解に供する。１日に数百、場合により数千のイネ系統をこの手法によってスクリーニングすることができる。

変化した熱プロフィールを示す試料からのＰＣＲ産物を配列決定し、Ｆａｄ２における突然変異を同定する。Ｆａｄ２を不活性化する選択した突然変異を、その後、低いＦａｄ２活性を有し、それ故高いオレイン酸を含有するイネ系統を生産する優良イネ系統に交配することができる。Ｆａｄ２アイソフォームの２または全部を除外する必要がある場合、これは、種々のアイソフォームにおいて必要とされる突然変異を有する系統を同定し、マーカ利用交配を通して優良イネ系統における突然変異を組み合わせることによって達成され得る。少なくともＦａｄ２−１遺伝子は、オレイン酸含量の実質的上昇またはリノール酸含量の低下のために不活性である必要がある。付加的なＦａｄ２遺伝子の１またはそれ以上の不活性化は、オレイン酸含量をさらに上昇させ、リノール酸含量をさらに低下させる。付加的なＦａｄ２遺伝子内に突然変異を有する突然変異体は、付加的なＦａｄ遺伝子に特異的なプライマーを使用して、Ｆａｄ２−１と同じ方法で同定し得る。
〔実施例８〕
安定性分析−貯蔵中のヘキサナール産生の検出
野生型イネにおいて貯蔵時のヘキサナールの産生を検出するための実験がＦＳＡ，Ｗｅｒｒｉｂｅｅで進行中である。これは、高温（４０℃）で保存された穀粒の上部空間における揮発性物質を検出する試料採取器を使用したＧＣを含む。ひとたびシステムが最適化されれば（また、我々が十分な量の穀粒を入手すれば）、野生型およびＦａｄ２ＲＮＡｉおよびＦａｔＢＲＮＡｉイネ系統および適切な遺伝子型の組合せの貯蔵時の、揮発性物質、特にヘキサナールの産生の比較を実施する。これは、穀粒の貯蔵のためやぬかの貯蔵のためにイネ産業において重要な品質上の問題である。穀粒の品質を損なう上で役割を果たし得る他の揮発性物質の産生および検出も、ＦＳＡ，ＷｅｒｒｉｂｅｅおよびＣＳＩＲＯＥｎｔｏｍｏｌｏｇｙの両方で検討されている。

生玄米約１０ｇが上部空間分析のために必要とされる。玄米を４℃（対照）および３５℃で８週間保存する。玄米から放出される気体試料を、８０℃で加熱することによってまたは自然拡散によってバイアルの上部空間で得ることができる。次に、上部空間の揮発性成分をＧＣまたはＧＣ−ＭＳ機器に直接注入し、ガスクロマトグラフィープロフィールを分析することによって検査できる(Suzuki et al., 1999)。上部空間の揮発性物質を分析するためのもう１つの方法は、窒素をパージガスとして使用する、Nielsen et al. (2004)によって述べられたような適切なマトリックス（例えば２５０ｍｇＴｅｎａｘＧＲ）上への揮発性物質の捕捉を通してである。次に芳香化合物の脱離を熱によって実施し、捕捉された分子をＧＣによって分析して、標準手法を用いて同定する。

リノール酸含量の低いイネ系統で米の貯蔵が改善されるという予想は多くの所見に基づく。Suzuki et al. (1999)は、遊離リノール酸の量が貯蔵の間に上昇し、揮発性アルデヒド、例えばペンタナール、ヘキサナールおよびペンタノールの量が３５℃で３倍に上昇するというデータを提示した。臭気とヘキサナールおよび揮発性アルデヒドとの相関も他の著者によって認められている。他方で、Zhou et al. (2002)は、貯蔵時の総リノール酸の低下を認め、これをリノール酸の、異臭の原因である揮発性物質を含む他の生成物への分解に関連付けた。結果の相違は、抽出および分析方法の違いによるものと考えられる。

インビトロでのリノール酸に関するヘキサナールの産生はNielsen et al. (2004)によって明らかにされた。

広く述べられている本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、特定実施形態において示される本発明に対して数多くの変更および／または修正を施し得ることは当業者に認識される。本実施形態は、それ故、あらゆる点で例示とみなされるべきであり、限定と解釈されるべきではない。

本明細書で論じるおよび／または参照するすべての公表文献は、それらの全体が本明細書に組み込まれる。

本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、オーストラリア特許第２００６９０３８１０号の優先権を主張する。

本明細書に含まれる文書、法令、資料、装置、論文等のいかなる考察も、本発明についての背景を提供することだけを目的とする。これらの事柄のいずれかまたは全部が先行技術の基礎の一部を形成することまたは本出願の各々の特許請求の優先日以前に存在した、本発明に関する分野における共通の一般知識であったことの承認と解釈されるべきではない。

文献

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Claims

約４８％より多くのオレイン酸、約１７％未満のパルミチン酸、約３０％未満のリノール酸および／またはそれらの任意の組合せを含む脂肪酸組成を有する米油。
オレイン酸対リノール酸の比率が１．５：１より多い、請求項１に記載の米油。
約４８％より多くのオレイン酸、約１７％未満のパルミチン酸および約３０％未満のリノール酸を含む脂肪酸組成を有する、請求項１または２に記載の米油。
約６０％より多くのオレイン酸を含む脂肪酸組成を有する、請求項１から３のいずれか１項に記載の米油。
約１２％未満のパルミチン酸を含む脂肪酸組成を有する、請求項１から４のいずれか１項に記載の米油。
約１５％未満のリノール酸を含む脂肪酸組成を有する、請求項１から５のいずれか１項に記載の米油。
約４８％より多くのオレイン酸、約１７％未満のパルミチン酸、約３０％未満のリノール酸および／またはそれらの任意の組合せを含む脂肪酸組成を有する米ぬか。
オレイン酸対リノール酸の比率が１．５：１より多い、請求項７に記載の米ぬか。
約４８％より多くのオレイン酸、約１７％未満のパルミチン酸および約３０％未満のリノール酸を含む脂肪酸組成を有する、請求項７または８に記載の米ぬか。
約６０％より多くのオレイン酸を含む脂肪酸組成を有する、請求項７から９のいずれか１項に記載の米ぬか。
約１２％未満のパルミチン酸を含む脂肪酸組成を有する、請求項７から１０のいずれか１項に記載の米ぬか。
約１５％未満のリノール酸を含む脂肪酸組成を有する、請求項７から１１のいずれか１項に記載の米ぬか。
約４８％より多くのオレイン酸、約１７％未満のパルミチン酸、約３０％未満のリノール酸および／またはそれらの任意の組合せを含む脂肪酸組成を有するイネ種子。
オレイン酸対リノール酸の比率が１．５：１より多い、請求項１３に記載のイネ種子。
約４８％より多くのオレイン酸、約１７％未満のパルミチン酸および約３０％未満のリノール酸を含む脂肪酸組成を有する、請求項１３または１４に記載のイネ種子。
約６０％より多くのオレイン酸を含む脂肪酸組成を有する、請求項１３から１５のいずれか１項に記載のイネ種子。
約１２％未満のパルミチン酸を含む脂肪酸組成を有する、請求項１３から１６のいずれか１項に記載のイネ種子。
約１５％未満のリノール酸を含む脂肪酸組成を有する、請求項１３から１７のいずれか１項に記載のイネ種子。
請求項１から６のいずれか１項に記載の米油を生産するイネ植物。
請求項７から１２のいずれか１項に記載の米ぬかを生産するイネ植物。
請求項１３から１８のいずれか１項に記載のイネ種子を生産するイネ植物。
イネ植物の細胞内に存在するとき、ポリヌクレオチドを欠く細胞と比較して細胞内のＦａｄ２および／またはＦａｔＢポリペプチドの活性のレベルを下方調節する単離ポリヌクレオチド。
イネ植物の細胞においてポリヌクレオチドの発現を指令することができるプロモーターに作動可能に連結されている、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。
少なくとも１個のＦａｄ２および／またはＦａｔＢ遺伝子から発現されるｍＲＮＡレベルを下方調節する、請求項２２または２３に記載のポリヌクレオチド。
ポリヌクレオチドが、アンチセンスポリヌクレオチド、センスポリヌクレオチド、触媒ポリヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、Ｆａｄ２またはＦａｔＢポリペプチドに結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および二本鎖ＲＮＡから選択される、請求項２２から２４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
配列番号５〜８、１１〜１４または１９〜２５として提供されるヌクレオチドの配列の１またはそれ以上を含むポリヌクレオチドに生理的条件下でハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチドである、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
配列番号５〜８、１１〜１４または１９〜２５として提供されるヌクレオチドの配列の１またはそれ以上を含むポリヌクレオチドを切断することができる触媒ポリヌクレオチドである、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
リボザイムである、請求項２７に記載のポリヌクレオチド。
配列番号５〜８、１１〜１４または１９〜２５として提供されるヌクレオチドの配列の１またはそれ以上の少なくとも１９個の隣接ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子であり、二本鎖である分子の部分が、少なくとも１９塩基対の長さであり、および前記オリゴヌクレオチドを含有する、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
二本鎖部分の鎖が一本鎖部分によって連結されており、１個のプロモーターから発現される、請求項２９に記載のｄｓＲＮＡ分子。
ｉ）細胞内のＦａｄ２および／またはＦａｔＢポリペプチドの活性のレベルを下方調節する候補ポリヌクレオチドの能力を測定すること、および
ｉｉ）細胞内のＦａｄ２および／またはＦａｔＢポリペプチドの活性のレベルを下方調節したポリヌクレオチドを選択すること
を含む、イネ植物の細胞内に存在するとき、ポリヌクレオチドを欠く細胞と比較して細胞内のＦａｄ２および／またはＦａｔＢポリペプチドの活性のレベルを下方調節するポリヌクレオチドを同定する方法。
ポリヌクレオチドが、アンチセンスポリヌクレオチド、センスポリヌクレオチド、触媒ポリヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、Ｆａｄ２またはＦａｔＢポリペプチドに結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および二本鎖ＲＮＡから選択される、請求項３１に記載の方法。
ポリヌクレオチドが、配列番号５〜８、１１〜１４または１９〜２５として提供されるヌクレオチドの配列の１またはそれ以上を含むポリヌクレオチドに生理的条件下でハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチドである、請求項３２に記載の方法。
ポリヌクレオチドが、配列番号５〜８、１１〜１４または１９〜２５として提供されるヌクレオチドの配列の１またはそれ以上を含むポリヌクレオチドを切断することができる触媒ポリヌクレオチドである、請求項３２に記載の方法。
ポリヌクレオチドが、配列番号５〜８、１１〜１４または１９〜２５として提供されるヌクレオチドの配列の１またはそれ以上の少なくとも１９個の隣接ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子であり、二本鎖である分子の部分が少なくとも１９塩基対の長さであり、前記オリゴヌクレオチドを含有する、請求項３２に記載の方法。
請求項３１から３５のいずれか１項に記載の方法を用いて同定される単離ポリヌクレオチド。
請求項２２から３０または３６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むまたはコードするベクター。
ポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドをコードする配列がプロモーターに作動可能に連結されている、請求項３７に記載のベクター。
プロモーターが、イネ植物体の少なくとも１つの他の組織または器官と比較してイネ植物体の胚、内乳、ぬか層および／または種子において選択的にポリヌクレオチドの発現を与える、請求項３７または３８に記載のベクター。
請求項３７から３９のいずれか１項に記載のベクター、および／または請求項２２から３０または３６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞。
ポリヌクレオチドまたはベクターが細胞または細胞の前駆体に導入された、請求項４０に記載の細胞。
イネ細胞またはアグロバクテリウム（Agrobacterium）細胞である、請求項４０または４１に記載の細胞。
ポリヌクレオチドが細胞のゲノムに組み込まれている、請求項４０から４２のいずれか１項に記載の細胞。
請求項４０から４３のいずれか１項に記載の細胞を含むイネ植物。
請求項２２から３０または３６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３７から３９のいずれか１項に記載のベクターを細胞に導入する工程を含む、請求項４０から４３のいずれか１項に記載の細胞を生産する方法。
細胞からトランスジェニック植物を再生する工程をさらに含む、請求項４５に記載の方法。
組換え細胞を生産するための、請求項２２から３０または３６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３７から３９のいずれか１項に記載のベクターの使用。
植物が、対応する非改変植物と比較してＦａｄ２および／またはＦａｔＢ活性を有するポリペプチドの低発現を有する、遺伝的に改変されたイネ植物。
請求項２２から３０または３６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むように形質転換された、請求項４８に記載の植物、または前記ポリヌクレオチドを含むその子孫植物。
イネ植物をＦａｄ２またはＦａｔＢポリペプチドのアンタゴニストに曝露することを含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の米油、請求項７から１２のいずれか１項に記載の米ぬかおよび／または請求項１３から１８のいずれか１項に記載のイネ種子を生産する方法。
非改変玄米種子を生産する対応植物と比較してイネ種子におけるＦａｄ２および／またはＦａｔＢポリペプチドの活性および／または生産のレベルが低下するように植物を遺伝的に操作することを含む、非改変玄米種子と比較したとき長い貯蔵寿命を有する玄米種子を生産するために使用できる遺伝的に改変されたイネ植物を得る方法。
Ｆａｄ２および／またはＦａｔＢポリペプチドの活性および／または生産のレベルが植物の種子においてのみ低下する、請求項５１に記載の方法。
Ｆａｄ２ポリペプチドの活性および／または生産のレベルが低下する、請求項５１または５２に記載の方法。
トランスジェニック植物が、請求項２２から３０または３６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３７から３９のいずれか１項に記載のベクターを含む、請求項５１から５３のいずれか１項に記載の方法。
請求項５１から５４のいずれか１項に記載の方法を使用して生産される遺伝的に改変されたイネ植物、またはその子孫。
ｉ）イネ種子またはイネ植物の突然変異誘発された集団をスクリーニングすること、および
ｉｉ）請求項１から６のいずれか１項に記載の米油、請求項７から１２のいずれか１項に記載の米ぬかおよび／または請求項１３から１８のいずれか１項に記載のイネ種子を生産することができる種子または植物を選択すること
を含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の米油、請求項７から１２のいずれか１項に記載の米ぬかおよび／または請求項１３から１８のいずれか１項に記載のイネ種子を生産するために使用できるイネ植物を選択する方法。
工程ｉ）が、突然変異誘発された種子および／または植物をＦａｄ２またはＦａｔＢ活性を有するポリペプチドに関して分析することを含む、請求項５６に記載の方法。
工程ｉ）が、突然変異誘発された種子および／または植物のＦａｄ２またはＦａｔＢ遺伝子の配列および／または発現レベルを分析することを含む、請求項５６または５７に記載の方法。
工程ｉ）が、突然変異誘発された種子および／または植物の油、ぬかおよび／または種子の脂肪酸組成を分析することを含む、請求項５６から５８のいずれか１項に記載の方法。
ｉ）候補イネ植物から得られた米油、米ぬかおよび／または種子の脂肪酸含量を分析すること、および
ｉｉ）請求項１から６のいずれか１項に記載の米油、請求項７から１２のいずれか１項に記載の米ぬかおよび／または請求項１３から１８のいずれか１項に記載のイネ種子を生産するために使用できるイネ植物を選択すること
を含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の米油、請求項７から１２のいずれか１項に記載の米ぬかおよび／または請求項１３から１８のいずれか１項に記載のイネ種子を生産するために使用できるイネ植物を選択する方法。
ｉ）候補植物からの試料をＦａｄ２またはＦａｔＢ活性を有するポリペプチドに関して分析すること、および
ｉｉ）前記ポリペプチドの配列、生産のレベルおよび／または活性に基づき、請求項１から６のいずれか１項に記載の米油、請求項７から１２のいずれか１項に記載の米ぬかおよび／または請求項１３から１８のいずれか１項に記載のイネ種子を生産するために使用できるイネ植物を選択すること
を含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の米油、請求項７から１２のいずれか１項に記載の米ぬかおよび／または請求項１３から１８のいずれか１項に記載のイネ種子を生産するために使用できるイネ植物を選択する方法。
ｉ）候補植物のＦａｄ２またはＦａｔＢ遺伝子の配列および／または発現レベルを分析すること、および
ｉｉ）前記遺伝子の配列および／または発現レベルに基づき、請求項１から６のいずれか１項に記載の米油、請求項７から１２のいずれか１項に記載の米ぬかおよび／または請求項１３から１８のいずれか１項に記載のイネ種子を生産するために使用できるイネ植物を選択すること
を含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の米油、請求項７から１２のいずれか１項に記載の米ぬかおよび／または請求項１３から１８のいずれか１項に記載のイネ種子を生産するために使用できるイネ植物を選択する方法。
植物の核酸分子を検出することを含み、核酸分子が、植物においてＦａｄ２遺伝子および／またはＦａｔＢ遺伝子に連結されているおよび／またはＦａｄ２遺伝子および／またはＦａｔＢ遺伝子の少なくとも一部を含有する、請求項１から６のいずれか１項に記載の米油、請求項７から１２のいずれか１項に記載の米ぬかおよび／または請求項１３から１８のいずれか１項に記載のイネ種子を生産するために使用できるイネ植物を同定する方法。
植物の核酸分子を検出することを含み、核酸分子が、植物においてＦａｄ２遺伝子および／またはＦａｔＢ遺伝子に連結されているおよび／またはＦａｄ２遺伝子および／またはＦａｔＢ遺伝子の少なくとも一部を含有する、長い貯蔵寿命を有する玄米種子を生産するために使用できるイネ植物を同定する方法。
ｖ）前記植物から得られる前記核酸分子に２番目の核酸分子をハイブリダイズすること、
ｖｉ）場合により前記植物から得られる前記核酸分子に少なくとも１つの他の核酸分子をハイブリダイズすること、および
ｖｉｉ）前記ハイブリダイズ工程の産物または前記ハイブリダイズ工程からの産物の不在を検出すること
を含む、請求項６３または６４に記載の方法。
２番目の核酸分子が、前記核酸分子の少なくとも一部を逆転写するまたは複製するためのプライマーとして使用される、請求項６５に記載の方法。
核酸が、制限断片長多型分析、増幅断片長多型分析、マイクロサテライト増幅および／または核酸配列決定から成る群より選択される手法を用いて検出される、請求項６３から６７のいずれか１項に記載の方法。
核酸増幅を含む、請求項６３から６７のいずれか１項に記載の方法。
方法が遺伝子の発現レベルを分析する、請求項６３から６８のいずれか１項に記載の方法。
ｉ）植物の穀粒の油においてオレイン酸の高い比率を与えるＦａｄ２対立遺伝子を含む１番目の親イネ植物を、植物の穀粒の油においてパルミチン酸の低い比率を与えるＦａｔＢ対立遺伝子を含む２番目の親イネ植物と交配すること、
ｉｉ）交配からの子孫植物または穀粒を両方の対立遺伝子の存在に関してスクリーニングすること、および
ｉｉｉ）両方の対立遺伝子を含み、植物の穀粒の油においてオレイン酸の高い比率およびパルミチン酸の低い比率を有する子孫植物または穀粒を選択すること
を含む、イネ植物または種子を得る方法。
ｉ）１番目の親イネ植物を、Ｆａｄ２対立遺伝子を含む２番目の親イネ植物と交配すること、および
ｉｉ）工程ｉ）の交配の子孫を、１番目の親植物と同じ遺伝子型の植物と、１番目の親の遺伝子型の大部分を有するが前記対立遺伝子を含む植物を生産するために十分な回数だけ戻し交配すること、
ｉｉｉ）１番目の植物の遺伝子型の大部分を有し、前記対立遺伝子を含む植物を選択すること
を含み、前記対立遺伝子が、植物の油、ぬかおよび／または種子においてオレイン酸の高い比率を与える、Ｆａｄ２対立遺伝子をイネ植物に導入する方法。
ｉ）１番目の親イネ植物を、ＦａｔＢ対立遺伝子を含む２番目の親イネ植物と交配すること、および
ｉｉ）工程ｉ）の交配の子孫を、１番目の親植物と同じ遺伝子型の植物と、１番目の親の遺伝子型の大部分を有するが前記対立遺伝子を含む植物を生産するために十分な回数だけ戻し交配すること、
ｉｉｉ）１番目の植物の遺伝子型の大部分を有し、前記対立遺伝子を含む植物を選択すること
を含み、前記対立遺伝子が、植物の油、ぬかおよび／または種子においてパルミチン酸の低い比率を与える、ＦａｔＢ対立遺伝子をイネ植物に導入する方法。
野生型植物と比較したとき、Δ１２デサチュラーゼ活性を有するＦａｄ２ポリペプチドの生産が低下するようにイネ植物を遺伝的に操作することを含む、イネ植物の油、ぬかおよび／または種子においてオレイン酸の比率を上昇させる方法。
野生型植物と比較したとき、ＦａｔＢ活性を有するＦａｔＢポリペプチドの生産が低下するようにイネ植物を遺伝的に操作することを含む、イネ植物の油、ぬかおよび／または種子においてパルミチン酸の比率を低下させる方法。
請求項５６から７４のいずれか１項に記載の方法を用いて得られるイネ植物、またはその子孫植物。
請求項４４、４８、４９、５５または７５のいずれか１項に記載の植物から得られる米油。
請求項４４、４８、４９、５５または７５のいずれか１項に記載の植物から得られる米ぬか。
請求項４４、４８、４９、５５または７５のいずれか１項に記載の植物から得られるイネ種子。
ａ）請求項１９から２１、４４、４８、４９、５５または７６のいずれか１項に記載の植物を生育すること、および
ｂ）種子を収穫すること
を含む、種子を生産する方法。
請求項１から６または７６のいずれか１項に記載の米油、請求項７から１２または７７のいずれか１項に記載の米ぬかおよび／または請求項１３から１８または７８のいずれか１項に記載のイネ種子を含む食品生産物。
請求項１から６または７６のいずれか１項に記載の米油中で食用物質を調理することを含む、食品を調製する方法。