KR20010042015A - 림난테스 오일 유전자 - Google Patents

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KR20010042015A
KR20010042015A KR1020007010348A KR20007010348A KR20010042015A KR 20010042015 A KR20010042015 A KR 20010042015A KR 1020007010348 A KR1020007010348 A KR 1020007010348A KR 20007010348 A KR20007010348 A KR 20007010348A KR 20010042015 A KR20010042015 A KR 20010042015A
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에드가 비. 카훈
윌리암 디. 히츠
안토니 제이. 키니
스티븐 제이. 볼머
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메리 이. 보울러
이 아이 듀폰 디 네모아 앤드 캄파니
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Abstract

본 발명은 지질 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 단리된 핵산 단편에 관한 것이다. 본 발명은 또한 센스 또는 안티센스 방향의, 지질 생합성에 관여하는 효소 전체 또는 일부분을 코딩하는 잡종 유전자의 구성에 관한 것으로, 이 때 잡종 유전자의 발현은 형질전환된 숙주 세포에서 지질 생합성에 관여하는 효소를 변화된 양으로 생산시키게 된다.

Description

림난테스 오일 유전자 {Limnanthes Oil Genes}
본 출원은 1998년 3월 20일에 출원된 미국 가출원 제60/078,736호를 우선권으로 주장한다.
생합성 또는 천연 식물원으로부터의 지방산 조성물을 조작하는 개선된 수단이 가장 중요하다. 예를 들면, 가능한 최소량의 포화 지방산을 함유하는 식용유원이 음식적인 면에서 바람직하고, 예를 들며 열대산 오일과 같이 많이 포화된 오일 제품의 현재 공급원에 대한 대체물이 요구된다.
지방산은 종자 조직을 발육시키는데 있어서의 에너지 저장을 위해 형성된 중성 지질 및 식물 막에 사용된다. 막의 지방산 조성 (극성, 사슬 길이 및 불포화도)은 그의 물리적 특성을 결정한다. 가장 일반적인 지방산은 1개 또는 그 이상의 이중 결합을 갖는 16 또는 18개의 탄소 (C16 또는 C18)를 함유한다. 보다 길거나 (C20 또는 C22) 또는 보다 짧은 (C12 또는 C14) 탄소 사슬을 갖는 지방산은 일반적이지 않고, 히드록실화된 지방산 및 상이한 위치 (델타-5 또는 델타-6)의 이중 결합을 갖는 지방산도 마찬가지이다. 보다 고등 식물은 지방산 합성 (FAS) 착체의 일부분으로서 아실 운반 단백질에 결합된 중간체와 함께, 식물 색소체 세포소기관 (즉, 엽록체, 프로플라스티드, 또는 다른 관련된 세포소기관)에서 대사 경로를 통해 일반적인 지방산을 합성하는 것으로 보인다. 불포화된종자를 발육시키는데 있어서 일반적인 지방산의 합성에 관여하는 경로가 이제 잘 이해되어 비교적 조작하기 용이하다. 지방산 생합성에서, 델타-9 아실-지질 디세츄라제 (desaturase)/델타-9 아실-CoA 디세츄라제는 가장 일반적으로는, C18 포화 지방산의 델타-9 위치에 이중 결합을 도입시켜 (즉, 스테아로일-ACP (C18:0-ACP)의 올레오일-ACP (C18:1-ACP)로의 불포화) 모노불포화 지방산을 제조시킨다. 모노불포화 지방산을 추가로 불포화시켜 폴리불포화 지방산을 제조하는 델타-6 및 델타-5 디세츄라제와 같은 몇가지 다른 지방산 디세츄라제 효소들이 고등 식물에서 알려져 있다. 지방산 카르복실기로부터 9번째 탄소 이외의 위치에서 이중 결합을 갖는 많은 천연 발생 모노불포화 지방산이 있다. 예를 들면, 림난테스 알바 (Limnanthes alba) 및 많은 다른 나자식물의 트리아실글리세롤은 모두 델타-5 위치에 이중 결합을 갖는 모노-불포화 지방산을 함유한다. 이 활성은 불포화 반응에 대한 기질로서 18:1-CoA를 사용하는 델타-9 디세츄라제와는 달리, 20:0-CoA를 대신 사용할 수 있는 델타-5 디세츄라제에 의해 촉매될 수 있다 [Pollard, M.R. and Stumpf, P.K. (1980) Plant Physiol 66:649-655; Moreau, R.A. et al. (1981) Arch Biochem Biophys 209:376-384].
메도우포옴 (Meadowfoam) (림난테스 알바)은 북쪽 캘리포니아 및 남쪽 오레곤의 보다 높은 고지대에 자생하는 식물이다. 성숙 종자의 트리아실글리세롤 분류물은 주로 20 또는 22개의 탄소 원자 및 1 또는 2개의 이중 결합을 함유하는 (20:1, 22:1 및 22:2) 지방산으로 이루어진다. 이 이중 결합은 일반적인 식물 오일의 지방산에서 정상적으로 발견되지 않는 위치: 델타-5 위치에 있다는 점에서 특이하다. 림난테스 일롱가제 (elongase)는, 공지된 식물 지방산 일롱가제에 대한 일반적인 기질인 올레오일-CoA (18:1 델타-9-CoA) 대신에 그의 기질로서 팔미토일-CoA (16:0-CoA)를 선호하는 것처럼 보인다. 림난테스에서, 16:0-CoA는 20:0-CoA로 연장되고 20:1 델타-5로 불포화된다. 이것은 18:1 델타-9가 20:1 델타-11로 연장되는 아라비돕시스 (Arabidopsis) 또는 카놀라에서와 같이 20:1 델타-11의 형성과는 대조적이다 [Pollard, M.R. and Stumpf, P.K. (1980) Plant Physiol 66:649-655]. 림난테스 델타-5 디세츄라제 및 지방산 아실 일롱가제를 코딩하는 유전자는 현재까지 단리되지 못하였고, 본 출원의 주제이다.
비록 대부분의 식물들이 적어도 미량의 매우 긴 사슬의 지방산을 함유하지만, FAS는 이들 매우 긴 사슬의 지방산의 새로운 생산에 관여하지 않는다. 대신에, FAS의 생성물이 색소체로부터 보내져서 아실-CoA 유도체로 전환되고, 이것은 이어서 지방산 연장 시스템 (FAE)에 대한 기질로서 사용된다. 아라비돕시스 FAE 에 관여하는 유전자는 FAE1 좌위로 편재되어 있다. 호호바유는 모노불포화 지방산 및 알콜의 에스테르이고 대부분이 18개 이상의 탄소 원자를 갖는 지방산 사슬을 함유하는 왁스로 주로 이루어진다. 아라비돕시스, 호호바 및 평지씨에서 매우 긴 사슬 지방산을 형성하는 연장반응은 말로닐-CoA 및 아실-CoA를 기질로서 사용한다 [Lassner, M.W. et al. (1996) Plant Cell 8:281-292]. 림난테스에서 20:0 지방산의 생합성은 초기 기질인 팔미테이트의 사슬 연장에 의해 우세하게 일어나고, 따라서 이 반응을 촉매하는 효소는 말로닐-CoA의 연장반응을 통한 매우 긴 사슬의 지방산의 제조에 관여하는 효소와 유사하지만, 이들로부터 구별되어야 한다.
유전 공학으로 지방산 생합성 경로를 조작할 수 있는 능력은 아세틸-CoA로부터 신규의 생중합체를 제조하기 위하여 식물성 오일의 지방산 조성에 변화를 주고 및(또는) 완전히 새로운 경로를 불포화된종자 내로 도입시킬 수 있게 한다. 림난테스 오일 및 지방산은 공업용 약제로서 사용될 가능성을 갖는다. 에스톨리드는 지방산의 알킬 주쇄 상에 2차 에스테르 결합을 함유하는 올리고머 지방산이다. 림난테스 오일 중에 존재하는 20:1 델타-5 지방산은 독특한 델타-5 결합이 화합물을 안정화시키는 폴리에스톨리드의 제조에 유용하다 [Isbell, T.A. and Kleiman, R. (1996) J Am Oil Chem Soc 73:1097-1107]. 림난테스 모노불포화 지방산으로부터 유도된 폴리에스톨리드의 생분해는 대두유 또는 올레산 오일로부터 유도된 폴리에스톨리드의 생분해보다 느린 것으로 보이지만, 생분해는 시간에 따라 계속되어 모든 에스톨리드가 궁극적으로는 자연적으로 분해된다 [Ehran, S.M. and Kleiman, R. (1997) J Am Oil Chem Soc 74:605-606]. 이러한 세균 분해에 대한 내성은 20:1 델타-5 지방산으로부터 유도된 폴리에스톨리드가 긴 저장 수명을 갖는 윤활제, 그리스, 플라스틱, 잉크, 화장품 및 계면활성제를 제조할 것이라는 것을 제시한다.
〈발명의 요약〉
본 발명은 림난테스 오일 생합성 효소를 코딩하는 단리된 핵산 단편에 관한 것이다. 구체적으로는, 본 발명은 델타-5 아실 CoA 디세츄라제 또는 지방산 아실-CoA 일롱가제를 코딩하는 단리된 핵산 단편에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 델타-5 아실 CoA 디세츄라제 또는 지방산 아실-CoA 일롱가제를 코딩하는 핵산 단편에 상보적인 핵산 단편에 관한 것이다. 또한 림난테스 지방산 아실-CoA 일롱가제에 의한 16:0-CoA의 20:0으로의 연장도 설명된다. 본 발명자들은 또한 20:0-CoA의 부재 하에 델타-5 디세츄라제가 16:0 및 18:0-CoA의 델타-5 위치에 이중 결합을 삽입시키게 될 것이라는 것을 보여준다.
본 발명의 추가의 실시태양은 델타-5 아실 CoA 디세츄라제 및 지방산 아실-CoA 일롱가제로 이루어진 군으로부터 선택된 지질 생합성에 관여하는 효소 전체 또는 실질적인 부분을 코딩하는 폴리펩티드에 관한 것이다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 델타-5 아실 CoA 디세츄라제 또는 지방산 아실-CoA 일롱가제를 코딩하는 잡종 유전자, 또는 적합한 조절 서열에 기능적으로 연결된, 델타-5 아실 CoA 디세츄라제 또는 지방산 아실-CoA 일롱가제를 코딩하는 핵산 단편에 상보적인 핵산 단편을 포함하는 잡종 유전자에 관한 것으로, 이 때 잡종 유전자의 발현은 형질전환된 숙주 세포에서 코딩된 단백질의 생산을 야기시킨다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 적합한 조절 서열에 기능적으로 연결된 델타-5 아실 CoA 디세츄라제 또는 지방산 아실-CoA 일롱가제를 코딩하는 잡종 유전자를 그의 게놈 중에 포함하는 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다. 잡종 유전자의 발현은 형질전환된 숙주세포에서 코딩된 단백질의 생산을 야기시킨다. 형질전환된 숙주 세포는 진핵 또는 원핵 기원의 것일 수 있고, 보다 고등 식물 및 미생물로부터 유도된 세포들을 포함한다. 본 발명은 또한 보다 고등 식물의 형질전환된 숙주세포로부터 발생되는 형질전환된 배아 및 식물, 및 상기 형질전환된 식물로부터 얻어지는 종자를 포함한다.
본 발명의 추가의 실시태양은 a) 숙주 세포를 델타-5 아실 CoA 디세츄라제 또는 지방산 아실-CoA1 일롱가제를 코딩하는 핵산 단편을 포함하는 잡종 유전자로 형질전환시키는 단계, 및 b) 형질전환된 숙주 세포에서 변화된 양의 델타-5 아실 CoA 디세츄라제 또는 지방산 아실-CoA 일롱가제의 생산을 야기시키는 잡종 유전자의 발현에 적합한 조건 하에서 형질전환된 숙주 세포를 생장시키는 단계를 포함하는 형질전환된 숙주 세포에서 델타-5 아실 CoA 디세츄라제 또는 지방산 아실-CoA 일롱가제의 양을 변화시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 실시태양은 델타-5 아실 CoA 디세츄라제 또는 지방산 아실-CoA 일롱가제를 코딩하는 아미노산 서열 전체 또는 실질적인 부분을 코딩하는 핵산 단편을 얻기 위한 방법에 관한 것이다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 숙주 세포에서 델타-5 위치에 이중 결합을 포함하는 불포화된 지방산을 생산시키는 방법, 및 델타-5 위치에 이중 결합을 포함하는 불포화 지방산을 포함하는 종자, 오일 및 불포화된종자의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 실시태양은 숙주 세포에서 16 탄소 지방산의 양을 감소시키는 방법 및 숙주 세포에서 20 탄소 지방산의 양을 증가시키는 방법, 및 감소된 양의 16 탄소 지방산 또는 증가된 양의 20 탄소 지방산을 갖는 종자, 오일 및 유지종자의 제조 방법이다.
본 발명은 식물 분자생물학 분야에 속한다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 식물 및 종자에서 지질 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 핵산 단편에 관한 것이다.
〈도면의 간단한 설명 및 서열 설명〉
본 발명은 하기하는 상세한 설명 및 수반되는 도면 및 본 출원의 일부를 이루는 서열 목록으로부터 보다 완전히 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 림난테스 종자에서 발견되는 장쇄 지방산을 형성시키는 경로를 보여준다. 팔미테이트 (16:0), 스테아레이트 (18:0) 및 올레에이트 (18:1)의 생합성은 색소체 중에서 일어나는 반면, 팔미테이트의 아라키도네이트로의 연장 및 델타-5 불포화는 소포체에서 일어난다 [Pollard, M.R. and Stumpf, P.K. (1980) Plant Physiol 66:649-655로부터 인용].
도 2는 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) 델타-9 디세츄라제 (서열 3) 및 본 발명의 림난테스 델타-5 아실-CoA 디세츄라제 (lde.pk0008.b9; 서열 2)로부터의 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다. 2가지 서열 모두에서 동일한 아미노산은 정렬 위에 별표 (*)로 표시한다. 대시 (-)는 서열의 정렬을 최대화시키기 위하여 프로그램에 의해 사용된다.
도 3은 형질전환된 대두 배아에서 C20 지방산의 생산을 증명하는, 야생형 대두 배아 (도 3a)의 및 림난테스 지방산 아실-CoA 일롱가제를 발현시키는 대두 배아 (도 3b)의 오일에 대하여 얻은 가스 크로마토그램으로부터의 기록 (tracing)을 보여준다. 크로마토그램의 다양한 피크에 대응하는 지방산을 표시한다.
도 4는 림난테스 지방산 아실-CoA 일롱가제를 발현시키는 개별 유전자도입 대두 배아에서 20:0 지방산의 증가와 동시에 생기는 16:0 지방산 축적의 감소를 나타낸다.
도 5는 야생형 대두 배아 (도 5a)의 및 림난테스 델타-5 아실-CoA 디세츄라제를 발현시키는 대두 배아 (도 5b)의 오일에 대하여 얻은 가스 크로마토그램으로부터의 기록을 보여준다. 관련 지방산들을 그들의 보유 시간으로 표시한다: 2.209는 16:0이고; 2.271은 16:1△5이고; 3.477은 18:0이고; 3.530은 18:1△5이고; 및 3.567은 18:1△9이다.
도 6은 16:1 델타-5 및 18:1 델타-5 지방산의 형성을 증명하는 림난테스 델타-5 아실-CoA 디세츄라제를 발현시키는 대두 배아로부터 제조된 지방산 메틸 에스테르의 GC-MS 분석을 나타낸다. 도 6a는 메틸 헥사데센산의 DMDS 유도체를 362 m/z에 대해 선택된 이온 주사 (scan)를 사용하여 확인한 가스 크로마토그램을 제공한다. 도 6b는 도 6a에서 두드러진 2개의 피크 중 최대의 것의 질량 스펙트럼이다. 도 6c는 메틸 옥타데센산의 DMDS 유도체를 390 m/z에 대한 선택된 이온 주사를 사용하여 확인한 가스 크로마토그램을 제공한다. 도 6d는 도 6c에서 두드러진 최대 피크의 정면 숄더 (shoulder)의 질량 스펙트럼이다.
하기하는 서열 설명 및 본 명세서에 첨부된 서열 목록은 37 C.F.R. §1.821-1.825에 기재되어 있는 바와 같이 특허 출원에서 뉴클레오티드 및(또는) 아미노산 서열 개시에 관한 법령과 일치한다.
서열 1은 전체 림난테스 델타-5 아실 CoA 디세츄라제를 코딩하는 클론 lde.pk0008.b9에 전체 cDNA 삽입물을 포함하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열 2는 서열 1의 뉴클레오티드 서열로부터 유도된 전체 림난테스 델타-5 아실-CoA 디세츄라제의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 3은 NCBI General Identifier No:2970034를 갖는 아라비돕시스 탈리아나 델타-9 디세츄라제의 아미노산 서열이다.
서열 4는 전체 림난테스 지방산 아실-CoA 일롱가제를 코딩하는 클론 lde.pk0008.d5 lde.및 pk0015.d10에 cDNA 삽입물로부터 조립된 콘티그 (contig)를 포함하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열 5는 서열 4의 뉴클레오티드 서열로부터 유도된 전체 림난테스 지방산 아실-CoA 일롱가제의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 6은 림난테스 지방산 아실-CoA 일롱가제의 일부분을 코딩하는 클론 lde.pk0010.e4에 cDNA의 일부분을 포함하는 뉴클레오티드 서열이다.
서열 7은 서열 6의 뉴클레오티드로부터 유도된 림난테스 지방산 아실-CoA 일롱가제의 일부분의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 목록은 본 명세서에서 참고문헌으로 인용하고 있는 문헌 [Biochemical Journal 219 (No. 2):345-373 (1984)] 및 문헌 [Nucleic Acids Research 13:3021-3030 (1985)]에 기재되어 있는 IUPAC-IUBMB 기준에 따라서 정의되는 바와 같이 뉴클레오티드 서열 문자에 대한 1글자 코드 및 아미노산에 대한 3글자 코드를 포함한다. 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 데이타에 대해 사용된 기호 및 포맷은 37 C.F.R. §1.822에 기재되어 있는 법령과 일치한다.
본 명세서에서, 많은 용어들이 사용될 것이다. 본 명세서에서 사용된 "단리된 핵산 단편"은 임의적으로는 합성, 비천연 또는 변화된 뉴클레오티드 염기를 함유하는, 한가닥 또는 두가닥인 RNA 또는 DNA의 중합체이다. DNA의 중합체 형태의 단리된 핵산 단편은 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA의 1개 이상의 세그먼트들로 이루어질 수 있다. 본 명세서에서 사용된 "콘티그"는 한 개의 연속된 뉴클레오티드 서열을 형성하는 중복 핵산 서열들의 집합물을 말한다. 예를 들면, 몇 개의 DNA 서열들을 비교하고 정렬하여 공통의 또는 중복 영역을 확인할 수 있다. 이어서 개별 서열들을 단일의 연속된 뉴클레오티드 서열으로 조립할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "실질적으로 유사한"이란 1개 이상의 뉴클레오티드 염기에서의 변화가 1개 이상의 아미노산의 치환을 야기시키지만, DNA 서열에 의해 코딩되는 단백질의 기능적 특성에는 영향을 미치지 않는 핵산 단편을 말한다. "실질적으로 유사한"은 또한 1개 이상의 뉴클레오티드 염기에서의 변화가 안티센스 또는 동시-억제 기술에 의한 유전자 발현의 변화를 조절할 수 있는 핵산 단편의 능력에는 영향을 미치지 않는 핵산 단편을 말한다. "실질적으로 유사한"이란 또한 생성된 단백질 분자의 기능적 특성의 변화 또는 안티센스 또는 동시-억제 기술에 의한 유전자 발현의 변화를 조절할 수 있는 생성된 상대 전사체의 능력의 기능적 특성에는 실질적으로 영향을 미치지 않는, 1개 이상의 뉴클레오티드의 결핍 또는 삽입과 같은 본 발명의 핵산 단편의 변형을 말한다. 그러므로 본 발명은 구체적인 예시 서열 이상을 포함하는 것으로 이해된다.
예를 들면, 유전자 발현의 안티센스 억제 및 동시-억제는 유전자의 전체 코딩 영역보다 적은 것을 나타내는 핵산 단편을 사용하여, 및 억제되어야 하는 유전자와의 100% 서열 동일성을 공유하지 않는 핵산 단편에 의해 달성될 수 있다. 게다가, 주어진 부위에서 화학적으로 등가의 아미노산의 생산을 야기시키지만, 코딩된 단백질의 기능적 특성에는 영향을 미치지 않는 유전자에서의 변화가 당 업계에 공지되어 있다. 따라서, 소수성 아미노산인 아미노산 알라닌에 대한 코돈은 다른 덜 소수성인 잔기, 예를 들면 글리신, 또는 보다 소수성인 잔기, 예를 들면 발린, 류신 또는 이소류신을 코딩하는 코돈에 의해 치환될 수 있다. 유사하게는, 다른 잔기 대신 음으로 하전된 잔기, 예를 들면 글루탐산 대신 아스파트산, 또는 다른 잔기 대신 양으로 하전된 잔기, 예를 들면 아르기닌 대신 라이신으로의 치환을 야기시키는 변화는 또한 기능적으로 등가의 생성물을 생산할 것으로 기대할 수 있다. 단백질 분자의 N-말단 및 C-말단 부분의 변화를 야기시키는 뉴클레오티드 변화는 또한 단백질의 활성을 변화시키지 않는 것으로 예측된다. 제시한 변화들 각각은 당 업계의 통상의 기술 내에 속하는 것이고, 코딩된 생성물의 생물학적 활성의 보유에 대한 측정도 마찬가지이다. 게다가, 실질적으로 유사한 핵산 단편은 또한, 엄격한 조건 (0.1X SSC, 0.1% SDS, 65 ℃) 하에서 본 발명에서 발표한 핵산 단편과 혼성화할 수 있는 그들의 능력으로 특성화될 수 있다.
본 발명의 실질적으로 유사한 핵산 단편은 또한 당 업계의 통상의 숙련인에 의해 일반적으로 사용되는 연산방식에 의해 측정되었을 때, 그들이 코딩하는 아미노산 서열의 본 명세서에서 발표된 아미노산 서열에 대한 유사성 %로 특성화될 수 있다. 뉴클레오티드 서열이 본 명세서에서 보고된 아미노산 서열에 80% 유사한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 단편이 바람직하다. 보다 바람직한 핵산 단편은 본 명세서에서 보고된 아미노산 서열에 90% 유사한 아미노산 서열을 코딩한다. 가장 바람직한 것은 본 명세서에서 보고된 아미노산 서열에 95% 유사한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 단편이다. 서열 정렬 및 % 유사성 계산은 라사르진 (LASARGENE) 생체정보 연산 스위트 (suite) [미국 위스콘신주 매디슨 소재의 드나스타 인크. (DNASTAR Inc.) 제품]의 메갈라인 (Megalign) 프로그램을 사용하여 수행된다. 서열들의 다수개의 정렬은 애초 파라미터들 (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=10)을 갖는 클러스탈 (Clustal) 정렬 방법 (Higgins, D.G. and Sharp, P.M. (1989) CABIOS. 5:151-153)을 사용하여 수행하였다. 클러스탈 방법을 사용하는 쌍 정렬에 대한 애초 파라미터는 KTUPLE 1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 및 DIAGONALS SAVED=5이었다.
아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 "실질적인 부분"은 당 업계의 통상의 숙련인에 의한 서열의 손에 의한 평가에 의해, BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul, S.F., et al., (1993) J. Mol. Biol. 215:403-410; 또한 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 참조)와 같은 연산방식을 사용하는 컴퓨터-자동화된 서열 비교 및 확인에 의해, 폴리펩티드 또는 유전자의 추정상의 확인을 줄 수 있는 충분한 유전자의 뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 포함한다. 일반적으로, 폴리펩티드 또는 핵산 서열을 공지된 단백질 또는 유전자와 동종인 것으로 추정상으로 확인하기 위해서는, 10개 이상의 연속되는 아미노산 또는 30개 이상의 뉴클레오티드의 서열이 필요하다. 게다가, 뉴클레오티드 서열에 관해서는, 20-30 연속되는 뉴클레오티드를 포함하는 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브를 유전자 확인 (예를 들면, 서던 혼성화) 및 단리 (예를 들면, 세균 콜로니 또는 박테리오파지 플라크의 현장 혼성화)의 서열-의존식 방법에 사용될 수 있다. 또한, 12-15 염기의 짧은 올리고뉴클레오티드가 프라이머를 포함하는 특정 핵산 단편을 얻기 위하여 PCR에서 증폭 프라이머로서 사용될 수 있다. 따라서, 뉴클레오티드 서열의 "실질적인 부분"은 서열을 포함하는 핵산 단편의 구체적인 동정 및(또는) 단리를 제공하는 충분한 서열을 포함한다. 본 명세서는 1개 이상의 특정 식물 단백질을 코딩하는 부분적인 또는 완전한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열을 설명한다. 본 명세서에서 보고된 서열의 특허권을 갖는 통상의 숙련인은 이제 당 업계의 통상의 숙련인에게 공지된 목적을 위하여 발표된 서열의 모든 또는 실질적인 부분을 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 수반되는 서열 목록에 보고된 완전한 서열, 뿐만 아니라 상기에서 정의한 바와 같은 이들 서열의 실질적인 부분을 포함한다.
"코돈 축퇴"는 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열에 영향을 미치지 않고서, 뉴클레오티드 서열의 변화를 허용하는 유전자 코돈에서의 일탈을 말한다. 따라서, 본 발명은 서열 2, 5 및 7에 기재한 바와 같이 델타-5 아실-CoA 디세츄라제 또는 지방산 아실-CoA 일롱가제 단백질을 코딩하는 아미노산 서열 전체 또는 실질적인 부분을 코딩하는 임의의 핵산 단편에 관한 것이다. 통상의 숙련인은 주어진 아미노산을 상술하는 뉴클레오티드 코돈의 사용시에 특정 숙주 세포에 의해 나타내어 지는 "코돈-바이어스"를 잘 알고 있다. 그러므로, 숙주 세포에서 개선된 발현을 위한 유전자를 합성할 때, 그의 코돈 사용 빈도가 숙주 세포의 바람직한 코돈 사용 빈도에 근접하도록 유전자를 디자인하는 것이 바람직하다.
"합성 유전자"는 당 업계의 통상의 숙련인에게 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드 빌딩 블록들로부터 조립될 수 있다. 이들 빌딩 블록은 연결되고 어닐링되어 유전자 세그먼트를 형성하고, 이것은 이어서 효소적으로 조립되어 전체 유전자를 구성한다. DNA 서열에 관한 "화학적으로 합성된"이란 성분 뉴클레오티드들이 생체외에서 조립되었음을 의미한다. DNA의 손에 의한 화학적 합성은 잘 확립된 방법을 사용하여 수행될 수 있고, 또는 자동화된 화학 합성은 상업적으로 입수가능한 많은 기계들 중의 하나를 사용하여 수행될 수 있다. 따라서, 유전자들은 숙주 세포의 코돈 바이어스를 반영하기 위하여 뉴클레오티드 서열의 최적화에 기초한 최적의 유전자 발현을 위하여 맞추어질 수 있다. 통상의 숙련인은 코돈 사용이 숙주에 의해 선호되는 코돈들을 향하여 바이어스될 경우 성공적인 유전자 발현의 가능성에 대해 알고 있다. 바람직한 코돈의 결정은 서열 정보가 입수가능한 숙주 세포로부터 유도된 유전자들에 관한 고찰에 기초할 수 있다.
"유전자"는 코딩 서열에 앞서고 (5' 비코딩 서열) 및 뒤이어지는 (3' 비코딩 서열) 조절 서열을 포함하는, 특정 단백질을 발현시키는 핵산 단편을 말한다. "자연 유전자"는 그들 자신의 조절 서열과 함께 자연적으로 발견되는 바와 같은 유전자를 말한다. "잡종 유전자"는 자연적으로는 함께 발견되지 않는 조절 및 코딩 서열을 포함하는, 자연 유전자가 아닌 임의의 유전자를 말한다. 따라서, 잡종 유전자는 상이한 공급원들로부터 유도된 조절 서열 및 코딩 서열, 또는 동일한 공급원으로부터 유도되었지만, 자연적으로 발견되는 바와 상이한 방식으로 배열된 조절 서열 및 코딩 서열을 포함할 수 있다. "내인성 유전자"는 유기체의 게놈에서 그의 본래의 위치에 있는 자연 유전자를 말한다. "외부" 유전자는 숙주 유기체에서는 정상적으로 발견되지 않지만, 유전자 전달에 의해 숙주 유기체 내로 도입된 유전자를 말한다. 외부 유전자는 비자연적 유기체 내로 도입된 자연 유전자 또는 잡종 유전자를 포함할 수 있다. "도입유전자"는 형질전환 방법에 의해 게놈 내로 도입되어진 유전자이다.
"코딩 서열"은 특정 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 말한다. "조절 서열"은 코딩 서열 내에, 코딩 서열의 업스트림 (5' 비코딩 서열) 또는 다운스트림 (3' 비코딩 서열)에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 말하고, 이것은 관련된 코딩 서열의 전사, RNA 처리 또는 안정성, 또는 번역에 영향을 미친다. 조절 서열은 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론, 및 폴리아데닐화 인식 서열을 포함할 수 있다.
"프로모터"는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절할 수 있는 DNA 서열을 말한다. 일반적으로, 코딩 서열은 3' 내지 프로모터 서열에 위치한다. 프로모터 서열은 인접하는 및 보다 말단의 업스트림 요소들로 이루어지며, 이 때 후자의 요소는 종종 인헨서로 언급된다. 따라서, "인헨서"는 프로모터 활성을 자극할 수 있는 DNA 서열이고, 프로모터의 양 또는 조직 특이성을 향상시키기 위하여 삽입된 이종 요소 또는 프로모터의 타고난 요소일 수 있다. 프로모터는 그들 전체가 자연 유전자로부터 유도될 수 있거나, 또는 자연적으로 발견되는 상이한 프로모터들로부터 유도된 상이한 요소들로 이루어지거나, 또는 심지어는 합성 DNA 세그먼트들을 포함한다. 상이한 프로모터들이 상이한 조직 또는 세포 타입에서, 또는 상이한 발육 단계에서, 또는 상이한 환경적 조건에 반응하여 유전자의 발현을 지시할 수 있음을 당 업계의 통상의 숙련인들은 이해할 수 있다. 대부분의 세포 타입에서 대부분의 시간에서 유전자가 발현되도록 할 수 있는 프로모터는 흔히 "구성 프로모터"로 언급된다. 식물 세포에서 유용한 다양한 타입의 신규 프로모터들이 일정하게 발견되고 있고; 수많은 예들은 문헌 [Okamuro and Goldberg, (1989) Biochemistry of Plants 15:1-82]에서 발견할 수 있다. 대부분의 경우에 조절 서열의 정확한 경계가 완전히 정의되지 않았기 때문에, 상이한 길이를 갖는 DNA 단편은 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있다.
"번역 리더 서열"은 유전자의 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 위치하는 DNA 서열을 말한다. 번역 리더 서열은 번역 시작 서열의 완전히 처리된 mRNA 업스트림에 존재한다. 번역 리더 서열은 제1 전사체의 mRNA로의 처리, mRNA 안정성 또는 번역 효율에 영향을 미칠 수 있다. 번역 리더 서열의 예가 발표되어 있다 [Turner, R. and Foster, G.D. (1995) Molecular Biotechnology 3:225].
"3' 비코딩 서열"은 코딩 서열의 다운스트림에 위치하는 DNA 서열을 말하며, 폴리아데닐화 인식 서열 및, mRNA 처리 또는 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 조절 시그널을 코딩하는 다른 서열을 포함한다. 폴리아데닐화 시그널은 일반적으로 mRNA 전구체의 3' 단부에 대한 폴리아데닐산 계통의 첨가에 영향을 미치는 것으로 특성화된다. 상이한 3' 비코딩 서열들의 사용이 문헌 [Ingelbrecht et al., (1989) Plant Cell 1:671-60]에 의해 예시된다.
"RNA 전사체"는 DNA 서열의 RNA 폴리머라제-촉매된 전사로부터 생성되는 생성물을 말한다. RNA 전사체가 DNA 서열의 완벽한 상보적 복제물일 때, 1차 전사체로 언급되거나, 또는 1차 전사체의 후전사 처리로부터 유도된 RNA 서열일 수 있고 성숙 RNA로 언급된다. "메신저 RNA (mRNA)"는 인트론이 없는 RNA를 말하며 세포에 의해 단백질로 번역될 수 있다. "cDNA"는 mRNA로부터 유도되고 mRNA에 상보적인 2가닥 DNA를 말한다. "센스" RNA는 mRNA를 포함하는 RNA 전사체를 말하고, 세포에 의해 단백질로 번역될 수 있다. "안티센스 RNA"는 표적 1차 전사체 또는 mRNA 전체 또는 일부에 상보적이고 표적 유전자의 발현을 막는 RNA 전사체를 말한다 (본 명세서에서 참고문헌으로 인용하고 있는 미국 특허 제5,107,065호). 안티센스 RNA의 상보성은 특정 유전자 전사체의 임의의 부분, 즉 5' 비코딩 서열, 3' 비코딩 서열, 인트론 또는 코딩 서열에서 일 수 있다. "기능적 RNA"는 센스 RNA, 안티센스 RNA, 리보자임 RNA, 또는 번역되지 않을 수 있지만 또한 세포 처리에 영향을 미칠 수 있는 다른 RNA을 말한다.
용어 "기능적으로 연결된"이란 단일 핵산 단편 상에서 한 서열의 기능이 다른 것에 의해 영향을 받도록 하는 핵산 서열들의 결합을 말한다. 예를 들면, 프로모터는 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있을 때 (즉, 코딩 서열이 프로모터의 전사 조절 하에 있을 때) 코딩 서열과 기능적으로 연결된다. 코딩 서열은 센스 또는 안티센스 방향으로 조절 서열에 기능적으로 연결될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "발현"은 본 발명의 핵산 단편으로부터 유도된 센스 (mRNA) 또는 안티센스 RNA의 전사 및 안정된 축적을 말한다. 발현은 또한 mRNA의 폴리펩티드로의 번역을 말할 수도 있다. "안티센스 억제"는 표적 단백질의 발현을 억압시킬 수 있는 안티센스 RNA 전사체의 생산을 말한다. "과발현"은 정상적인 또는 형질전환되지 않은 유기체에서의 생산 수준을 초과하는, 유전자도입 유기체에서의 유전자 생성물의 생산을 말한다. "동시-억제"는 동일하거나 또는 실질적으로 유사한 외부 또는 내인성 유전자의 발현을 억제할 수 있는 센스 RNA 전사체의 생산을 말한다 (본 명세서에서 참고문헌으로 인용하고 있는 미국 특허 제5,231,020호).
"변화된 양"은 정상적인 또는 형질전환되지 않은 유기체의 경우와는 상이한 양 또는 비율의, 유전자도입 유기체에서의 유전자 생성물(들)의 생산을 말한다.
"성숙" 단백질은 번역후에 처리된 폴리펩티드; 즉, 1차 번역 생성물 중에 존재하는 임의의 프레- 또는 프로펩티드들이 제거된 것을 말한다. "전구체" 단백질은 mRNA의 번역의 1차 생성물, 즉 프레- 및 프로펩티드들이 여전히 존재하는 것을 말한다. 프레- 및 프로펩티드들은 세포내 편재 시그널일 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
"엽록체 통과 펩티드"는 단백질과 함께 번역되어 단백질을 엽록체 또는 단백질이 제조되는 세포 중에 존재하는 다른 색소체 타입으로 보내는 아미노산 서열이다. "엽록체 통과 서열"은 엽록체 통과 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 말한다. "시그널 펩티드"는 단백질과 함께 번역되어 단백질을 분비계로 보내는 아미노산 서열을 말한다 (Chrispeels, J.J., (1991) Ann. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol. 42:21-53). 단백질이 액포로 보내질 경우, 액포 표적화 시그널 (상기한 문헌)이 추가로 첨가될 수 있거나, 또는 소포체로 보내질 경우, 소포체 보유 시그널 (상기한 문헌)이 첨가될 수 있다. 단백질이 핵으로 보내질 경우, 존재하는 임의의 시그널 펩티드는 제거되어야 하고, 대신에 핵 편재 시그널이 포함되어야 한다 (Raikhel (1992) Plant Phys. 100:1627-1632).
"형질전환"은 유전적으로 안정한 유전을 야기시키는, 숙주 유기체의 게놈 내로의 핵산 단편의 전달을 말한다. 형질전환된 핵산 단편을 함유하는 숙주 유기체를 "유전자도입" 유기체로 언급한다. 식물 형질전환 방법의 예로는 아그로박테륨-매개 형질전환 (De Blaere et al. (1987) Meth. Enzymol. 143:277) 및 입자-가속화된 또는 "유전자 건 (gun)" 형질전환 기술 (Klein TM et al. (1987) Nature (London) 327:70-73; 본 명세서에서 참고문헌으로 인용하고 있는 미국 특허 제4,945,050호)을 들 수 있다.
본 명세서에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당 업계에 공지되어 있으며, 문헌 [Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (이하 "Maniatis")]에 보다 자세하게 설명되어 있다.
지질 생합성에 관여하는 2개의 효소의 적어도 일부분을 코딩하는 핵산 단편을 단리하여 당 업계의 통상의 숙련인에게 공지된 BLAST 연산방식을 사용하여 핵산 및 단백질 서열을 함유하는 대중 데이타베이스의 무작위 식물 cDNA 서열과 비교하여 동정하였다. 이들 효소의 동정을 실시예 6에서 기재하는 바와 같이 기능 분석으로 동정하였다. 표 1은 본 명세서에서 설명한 단백질 및 이들 단백질을 코딩하는 핵산 단편을 포함하는 cDNA 클론의 표시를 열거한다.
림난테스 오일 생합성 효소
효소 클론 식물
델타-5 아실-CoA 디세츄라제 lde.pk0008.b9 림난테스 도우글라시이
지방산 아실-CoA 일롱가제 lde.pk0008.d5lde.pk0015.d10의 콘티그 림난테스 도우글라시이
lde.pk0010.e4 림난테스 도우글라시이
본 발명의 핵산 단편을 사용하여 동일한 또는 다른 식물 종으로부터 동종 단백질을 코딩하는 cDNA 및 유전자를 단리할 수 있다. 서열 의존성 프로토콜을 사용하는 동종 유전자의 단리는 당 업계에 공지되어 있다. 서열 의존성 프로토콜의 예로는 핵산 혼성화 방법, 및 핵산 증폭 기술 (예를 들면, 폴리머라제 사슬 반응, 리가제 사슬 반응)의 다양한 용도에 의해 예시되는 바와 같은 DNA 및 RNA 증폭 방법을 들 수 있으나, 이들로 제한되지는 않는다.
예를 들면, cDNA 또는 게놈 DNA로서 다른 델타-5 아실-CoA 디세츄라제 또는 지방산 아실-CoA 일롱가제 동족체를 코딩하는 유전자는 본 발명의 핵산 단편 전체 또는 일부분을 DNA 혼성화 프로브로 사용하여 당 업계의 통상의 숙련인에게 공지된 방법을 사용하여 임의의 바람직한 식물로부터의 라이브러리를 스크리닝함으로써 직접적으로 단리될 수 있다. 본 발명의 핵산 서열에 기초한 구체적인 올리고뉴클레오티드 프로브가 당 업계에 공지되어 있는 방법 (Maniatis)에 의해 디자인되고 합성될 수 있다. 게다가, 전체 서열을 사용하여 당 업계의 통상의 숙련인에게 공지된 방법, 예를 들면 무작위 프라이머 DNA 표지, 닉 번역 또는 단부-표지 기술에 의해 DNA 프로브, 또는 이용가능한 생체외 전사 시스템을 사용하여 RNA 프로브를 직접적으로 합성할 수 있다. 또한, 특정 프라이머를 디자인하여 본 발명의 서열의 일부 또는 전체를 증폭시키는데 사용할 수 있다. 생성된 증폭 생성물은 증폭 반응 동안 직접적으로 표지화되거나 또는 증폭 반응 후에 표지화될 수 있고, 적절한 엄격함을 갖는 조건 하에서 완전한 길이의 cDNA 또는 게놈 단편을 단리하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 핵산 단편들 중 2개의 짧은 세그먼트를 폴리머라제 사슬 반응 프로토콜에 사용하여 DNA 또는 RNA로부터의 동종 유전자를 코딩하는 보다 긴 핵산 단편을 증폭시킬 수 있다. 폴리머라제 사슬 반응은 또한 클로닝된 핵산 단편의 라이브러리 상에서 수행될 수 있는데, 이 때 한 프라이머의 서열은 본 발명의 핵산 단편으로부터 유도되고, 다른 프라이머의 서열은 식물 유전자를 코딩하는 mRNA 전구체의 3' 단부에 폴리아데닐산 계통이 존재하는 것을 이용한다. 별법으로는, 제2 프라이머 서열은 클로닝 벡터로부터 유도된 서열에 기초할 수 있다. 예를 들면, 당 업계의 통상의 숙련인은 전사체 중의 단일 지점과 3' 또는 5' 단부 사이의 영역의 복제물을 증폭시키는 PCR을 사용하여 cDNA를 생성시키기 위해 RACE 프로토콜 (Frohman et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8998)을 따를 수 있다. 본 서열로부터 3' 및 5' 방향으로 배향된 프라이머가 디자인될 수 있다. 상업적으로 입수가능한 3' RACE 또는 5' RACE 시스템 (BRL)을 사용하여, 특정 3' 또는 5; cDNA 단편을 단리할 수 있다 (Ohara et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5673; Loh et al., (1989) Science 243:217). 3' 및 5' RACE 방법에 의해 생성된 생성물들을 합하여 완전한 길이의 cDNA를 생성시킬 수 있다 (Frohman, M.A. and Martin, G.R., (1989) Techniques 1:165).
본 발명의 뉴클레오티드 및 추론된 아미노산 서열의 입수용이성은 cDNA 발현 라이브러리의 면역학적 스크리닝을 용이하게 한다. 본 발명의 아미노산 서열의 일부분을 나타내는 합성 펩티드를 합성할 수 있다. 이들 펩티드를 사용하여 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 단백질에 대한 특이성을 갖는 폴리클론 또는 모노클론 항체를 생산하기 위하여 동물을 면역시킬 수 있다. 이들 항체는 이어서 cDNA 발현 라이브러리를 스크리닝하여 관심을 갖는 완전한 길이의 cDNA 클론을 단리시키는데 사용될 수 있다 (Lerner, R.A. (1984) Adv. Immunol. 36:1; Maniatis).
식물 중에서의 오일 생합성은 상당히 잘 연구되어 있다 (Harwood (1989) in Critical Reviews in Plant Sciences, Vol. 8:1-43 참조). 본 명세서에서 사용된 "유지종자 작물"은 특정 기관, 주로 종자에서 트리아실글리세롤을 생산하고 저장하는 식물 종을 말한다. 구체적으로는, 본 발명의 목적상, "유지종자 작물"은 대두, 옥수수, 해바라기, 땅콩, 잇꽃, 참깨, 나이저 (niger), 목화, 코코아, 아마인 (아마), 저 리놀레산 아마, 피마자, 팜유, 코코넛, 카놀라 및 다른 브라시카 (Brassica) 유지종자 종, 예를 들면 비. 나푸스 (B. napus), 비. 캄페스트리스 (B. campestris), 비. 올레라세아 (B. oleracea), 비. 카리나타 (B. carinata), 비. 준세아 (B. juncea), 비. 니그라 (B. nigra), 비. 아드프레사 (B. adpressa), 비. 투어네포르티이 (B. tournefortii), 비. 프루티쿨로사스 (B. fruticulosas)를 말한다.
본 발명의 핵산 단편을 사용하여, 발표된 델타-5 아실-CoA 디세츄라제 또는 지방산 아실-CoA 일롱가제가 정상보다 많거나 또는 적은 양으로 존재하는, 또는 정상적으로는 발견되지 않는 세포 타입 또는 발육 단계에 존재하는 유전자도입 식물을 생성시킬 수 있다. 이것은 이들 세포에서 지방산 포화도 및 사슬 길이를 변화시킬 수 있는 효과를 갖는다. 이하 실시예 6에서 입증되는 바와 같이, 유지종자 작물에서 림난테스 지방산 아실-CoA 일롱가제의 과발현은 팔미트산 (16:0)의 아라키돈산 (20:0)으로의 연장을 야기시킨다. 유지종자 작물에서 림난테스 델타-5 아실-CoA 디세츄라제의 과발현은 지방산 사슬의 델타-5 위치에 이중 결합을 도입시켜 16:1 및 18:1 델타-5 지방산의 생산을 야기시킨다. 유지종자 작물에서 이들 2가지 유전자 모두의 과발현은 20:1 델타-5 지방산의 생산을 가능하게 할 것이다. 이로부터 나오는 2가지 이상의 긍정적인 효과가 있다: 식품 오일 중에서 포화 지방산 (특히 16:0)의 감소 및 무수한 공업적 용도를 갖는 지방산 (20:1 델타-5)의 생산.
본 발명의 델타-5 아실-CoA 디세츄라제 또는 지방산 아실-CoA 일롱가제의 과발현은 코딩 영역이 바람직한 발육 단계에서 바람직한 조직 중에서의 유전자의 발현을 지시할 수 있는 프로모터에 기능적으로 연결되어 있는 잡종 유전자를 먼저 구성함으로써 달성될 수 있다. 편의상의 이유로, 잡종 유전자는 동일한 유전자로부터 유도된 프로모터 서열 및 번역 리더 서열을 포함할 수 있다. 전사 종료 시그널을 코딩하는 3' 비코딩 서열도 또한 제공될 수 있다. 본 발명의 잡종 유전자는 또한 유전자 발현을 용이하게 하기 위하여 1개 이상의 인트론을 포함할 수 있다.
이어서 본 발명의 잡종 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터가 구성될 수 있다. 플라스미드 벡터의 선택은 숙주 식물을 형질전환시키기 위해 사용되게 되는 방법에 의존한다. 통상의 숙련인은 잡종 유전자를 함유하는 숙주 세포를 성공적으로 형질전환시키고, 선택시키고 및 증식시키기 위하여 플라스미드 벡터 상에 존재해야 하는 유전 요소들을 잘 알고 있다. 통상의 숙련인은 또한 상이한 독립적인 형질전환 사건들이 상이한 수준 및 패턴의 발현을 야기시키게 되고 (Jones et al,. (1985) EMBO J. 4:2411-2418; De Almeida et al., (1989) Mol. Gen. Genetics 218:78-86), 따라서 원하는 발현 수준 및 패턴을 나타내는 세포주를 얻기 위해서는 다수개의 사건들이 스크리닝되어야 한다는 것을 잘 인식하고 있을 것이다. 이러한 스크리닝은 DNA의 서던 분석, mRNA 발현의 노던 분석, 단백질 발현의 웨스턴 분석 또는 표현형 분석에 의해 달성될 수 있다.
몇몇 응용분야의 경우, 지질 생합성에 관여하는 본 발명의 효소를 상이한 세포 격실로 보내거나, 또는 세포로부터 그의 분비를 용이하게 하는 것이 유용할 수 있다. 따라서 상기한 잡종 유전자는 델타-5 아실-CoA 디세츄라제 또는 지방산 아실-CoA 일롱가제를 코딩하는 코딩 서열을 적절한 세포내 표적 서열, 예를 들면 통과 서열 (Keegstra, K. (1989) Cell 56:247-253), 시그널 서열, 또는 소포체 편재를 코딩하는 서열 (Chrispeels, J.J., (1991) Ann. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol. 42:21-53) 또는 핵 편재 시그널 (Raikhel, N. (1992) Plant Phys. 100:1627-1632)을 첨가하여 및(또는) 이미 존재하는 표적 서열들을 제거하여 변화시킴으로써 추가로 보충될 수 있을 것으로 기대된다. 인용한 참고문헌들이 이들 각각의 예를 제공하지만, 목록이 전부를 다 망라하는 것은 아니고, 유용성을 갖는 보다 표적화된 시그널들이 미래에 발견될 수 있을 것이다.
본 발명의 델타-5 아실-CoA 디세츄라제 또는 지방산 아실-CoA 일롱가제 (또는 그의 일부분)는 이종 숙주 세포, 특히 미생물 숙주의 세포들 중에서 생산될 수 있고, 당 업계의 통상의 숙련인에 공지된 방법에 의해 이들 단백질에 대한 항체를 준비하는데 사용될 수 있다. 항체들은 세포 중에서 생체내로 또는 세포 추출물 중에서 생체외로 델타-5 아실-CoA 디세츄라제 또는 지방산 아실-CoA 일롱가제를 검출하는데 유용하다. 본 발명의 델타-5 아실-CoA 디세츄라제 또는 지방산 아실-CoA 일롱가제의 생산에 바람직한 이종 숙주 세포는 미생물 숙주이다. 외부 단백질의 고도의 발현을 지시하는 조절 서열을 함유하는 미생물 발현계 및 발현 벡터들은 당 업계의 통상의 숙련인에게 공지되어 있다. 이들 중 임의의 것을 사용하여 본 발명의 델타-5 아실-CoA 디세츄라제 또는 지방산 아실-CoA 일롱가제의 생산을 위한 잡종 유전자를 구성할 수 있다. 이어서 이 잡종 유전자를 형질전환을 통해 적절한 미생물 내로 도입시켜 지질 생합성에 관여하는 코딩된 효소의 많은 양의 발현을 제공할 수 있다. 세균 숙주에서 델타-5 아실-CoA 디세츄라제 또는 지방산 아실-CoA 일롱가제의 많은 양의 발현을 위한 벡터의 예가 제공된다 (실시예 7).
본 발명의 핵산 단편 전체 또는 실질적인 부분은 또한 이들이 일부분인 유전자를 유전 및 물리적 지도를 만들기 위한 프로브로서, 및 이들 유전자에 연결된 특성에 대한 마커로서 사용될 수 있다. 이러한 정보는 바람직한 표현형을 갖는 세포주를 발육시키기 위한 식물 품종개량에 유용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 핵산 단편을 제한 단편 길이 다형성 (RFLP) 마커로서 사용할 수 있다. 제한-소화된 식물 게놈 DNA의 서던 블롯 (Maniatis)을 본 발명의 핵산 단편으로 프로빙할 수 있다. 이어서 생성된 밴드 패턴을 유전 지도를 구성하기 위하여 컴퓨터 프로그램, 예를 들면 맵메이커 (MapMaker) (Lander et al., (1987) Genomics 1:174-181)를 사용하는 유전 분석을 행할 수 있다. 또한, 본 발명의 핵산 단편을 사용하여, 정의된 유전 교차의 모체 및 자손을 나타내는 일련의 개체들의 제한 엔도뉴클레아제 처리된 게놈 DNA를 함유하는 서던 블롯을 프로빙할 수 있다. DNA 다형성의 분리를 주목하여 이 집단을 사용하여 앞에서 얻은 유전 지도에서 본 발명의 핵산 서열의 위치를 계산하는데 사용한다 (Botstein, D. et al., (1980) Am. J. Hum. Genet. 32:314-331).
유전 지도작성에 사용하기 위한 식물 유전자-유도 프로브의 생산 및 사용은 문헌 [R. Bernatzky, R. and Tanksley, S.D. (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4(1):37-41]에 설명되어 있다. 수많은 출판물들이 상기 개략한 방법 또는 이들의 변법을 사용하는 특정 cDNA 클론의 유전 지도작성을 설명한다. 예를 들면, F2 내부교차 집단, 역교잡, 무작위 교배된 집단, 거의 동질유전자형 세포주, 및 다른 일련의 개체들을 지도작성에 사용될 수 있다. 이러한 방법들은 당 업계의 통상의 숙련인에게 공지되어 있다.
본 발명의 핵산 서열로부터 유도된 핵산 프로브도 또한 물리 지도작성 (즉, 물리적 지도 상에서의 서열 위치)에 사용될 수 있다 (Hoheisel, J.D., et al., In: Nonmammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, pp. 319-346, 및 본 명세서에서 인용한 참고문헌).
다른 실시태양에서, 본 발명의 핵산 서열로부터 유도된 핵산 프로브를 직접 형광 현장 혼성화 (FISH) 지도작성에 사용될 수 있다 (Trask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:149-154). 비록 현재의 FISH 지도작성이 큰 클론의 사용을 선호하지만 (수 내지 수백 KB; Laan, M. et al. (1995) Genome Research 5:13-20), 감도에서의 개선은 보다 짧은 프로브를 사용하여 FISH 지도작성의 성능을 가능하게 할 수 있다.
다양한 핵산 증폭 기재 유전 및 물리적 지도작성 방법들을 본 발명의 핵산 서열을 사용하여 수행할 수 있다. 예로서는 대립유전자-특이성 증폭 (Kazazian, H.H. (1989) J. Lab. Clin. Med. 114(2):95-96), PCR-증폭된 단편의 다형성 (CAPS; Sheffield, V.C. et al. (1993) Genomics 16:325-332), 대립유전자-특이성 연결 (Landegren, U. et al. (1988) Science 241:1077-1080), 뉴클레오티드 연장 반응 (Sokolov, B.P. (1990) Nucleic Acid Res. 18:3671), 방사선 하이브리드 맵핑 (Walter, M.A. et al., (1997) Nature Genetics 7:22-28) 및 해피 맵핑 (Dear, P.H. and Cook. P.R. (1989) Nucleic Acid Res. 17:6795-6807)을 들 수 있다. 이들 방법의 경우, 핵산 단편의 서열을 사용하여 증폭 반응에 또는 프라이머 연장 반응에 사용하기 위한 프라이머 쌍을 디자인하고 생산한다. 이러한 프라이머의 디자인은 당 업계의 통상의 숙련인에게 공지되어 있다. PCR-기재 유전 지도작성을 사용하는 방법에서는, 본 발명의 핵산 서열에 대응하는 영역에서 교차 지도작성의 모체들 사이에서의 DNA 서열 차이를 확인할 필요가 있다. 그러나, 이것은 지도작성 방법에서는 일반적으로 필요하지 않다.
본 발명을 하기하는 실시예에서 추가로 정의하는데, 실시예에서는 달리 언급되지 않는 한, 모든 부 및 %는 중량 기준이고 도는 섭씨이다. 이들 실시예가 비록 본 발명의 바람직한 실시태양을 나타내지만 단지 예시의 목적으로 제공된 것임을 이해해야 한다. 상기한 논의 및 이들 실시예로부터, 당 업계의 통상의 숙련인은 본 발명의 본질적인 특징을 확인할 수 있고, 본 발명의 본질 및 영역을 벗어나지 않고서도 본 발명의 각종 변화 및 변형을 만들어 본 발명을 다양한 용도 및 조건에 적용시킬 수 있다.
〈실시예 1〉
cDNA 라이브러리의 구성; cDNA 클론의 단리 및 서열화
림난테스 도우글라시이 (Limnanthes douglasii) 배아 조직으로부터의 mRNA를 나타내는 cDNA 라이브러리를 pcDNAII 벡터 중에서 제조업체의 프로토콜에 따라 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) 제조하였다. 재조합 pcDNAII 플라스미드를 함유하는 무작위로 취한 세균 콜로니로부터 cDNA 삽입물을 삽입된 cDNA 서열의 옆에 있는 벡터 서열에 특이적인 프라이머를 사용하는 폴리머라제 사슬 반응을 통해 증폭시키거나, 또는 배양된 세균 세포로부터 플라스미드 DNA를 제조하였다. 증폭된 삽입 DNA 또는 플라스미드 DNA를 염료-프라이머 서열화 반응으로 서열화시켜 부분적인 cDNA 서열을 생성시켰다 (발현된 서열 태그 (tag) 또는 "ESTs"; Adams, M.D. et al., (1991) Sciences 252:1651 참조). 생성된 ESTs를 퍼킨 엘머 모델 (Perkin Elmer Model) 377 형광 서열화기를 사용하여 분석하였다.
〈실시예 2〉
cDNA 클론의 동정
지질 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 ESTs를 BLAST "nr" 데이타베이스 (모든 비중복 진뱅크 CDS 번역, 3-차원 구조 Brookhaven Protein Data Bank로부터 유도된 서열, 마지막 중요한 SWISS-PROT 단백질 방출 서열 데이타베이스, EMBL, 및 DDBJ 데이타베이스를 포함)에 함유된 서열에 대한 유사성에 대한 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul, S.F., et al., (1993) J. Mol. Biol. 215:403-410; 또한 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 참조) 연구를 행하여 동정하였다. 실시예 1에서 얻은 cDNA 서열을 National Center for Biotechnology Information (NCBI)에 의해 제공되는 BLASTN 연산방식을 사용하여 "nr" 데이타베이스에 함유되어 있는 모든 대중적으로 입수할 수 있는 DNA 서열에 대한 유사성을 분석하였다. DNA 서열을 모든 판독 프레임 중에서 번역하여 NCBI에 의해 제공되는 BLASTX 연산방식 (Gish, W. and States, D.J. (1993) Nature Genetics 3:266-272)을 사용하여 "nr" 데이타베이스에 함유되어 있는 모든 대중적으로 입수할 수 있는 단백질 서열에 대한 유사성을 비교하였다. 편의상, BLAST에 의해 계산하였을 때 단지 우연히 연구한 데이타베이스 중에 함유된 서열에 대한 cDNA 서열의 일치를 관찰할 수 있는 P-값 (확률)을 본 명세서에서는 "pLog"값으로 보고하고, 이것은 보고된 P-값의 연산방식의 음수를 나타낸다. 따라서, pLog값이 클수록 cDNA 서열 및 BLAST "히트 (hit)"가 동종 단백질을 나타낼 가능성이 더 크다.
〈실시예 3〉
델타-5 아실-CoA 디세츄라제 동족체를 코딩하는 cDNA 클론의 특성화
클론 lde.pk0004.c10, lde.pk0012.e5 및 lde.pk0012.g11, 및 클론 lde.pk0010.a8로부터의 전체 cDNA 삽입물로부터 얻은 EST 서열을 사용한 BLASTX 연구는 로사 하이브리다 (Rosa hybrida) (GenBank Accession No. S80863; NCBI General Identifier No. 1911477)로부터의 델타-9 아실-지질 디세츄라제/델타-9 아실-CoA 디세츄라제에 의해 코딩되는 단백질의 유사성을 보여주었다. 클론 lde.pk0008.b9로부터의 EST 서열을 사용하는 BLASTX 연구는 로사 하이브리다로부터의 지방산 디세츄라제 (GenBank Accession No. S49383; NCBI General Identifier No. 2580425)에 대한 cDNA에 의해 코딩되는 단백질의 유사성을 나타냈다. 이들 서열 각각에 대한 BLAST 결과를 표 2에 나타낸다:
디세츄라제와 동족체인 폴리펩티드를 코딩하는 클론에 대한 BLAST 결과
클론 진뱅크 (GenBank) 기탁 번호 BLAST pLog 스코어
lde.pk0004.c10 S80863 48.23
lde.pk0012.e5 S80863 23.64
lde.pk0012.g11 S80863 14.42
lde.pk0010.a8 S80863 9.89
lde.pk0008.b9 D49383 1.44
클론 lde.pk0008.b9 내의 전체 cDNA 삽입물의 서열을 결정하여 서열 1로 나타내고; 이 cDNA의 추론된 아미노산 서열을 서열 2로 나타낸다. 클론 lde.pk0004.c10, lde.pk0012.e5, lde.pk0012.g11 및 lde.pk0010.a8에 대한 EST 서열은 서열 1에 기재된 서열에 의해 포함된다. 서열 2에 기재한 아미노산 서열을 BLASTP으로 평가하여, 아라비돕시스 탈리아나 델타-9 디세츄라제 서열 (NCBI General Identifier No. 2970034)에 대한 250을 넘는 pLog 값을 얻는다. 도 1은 아라비돕시스 탈리아나 델타-9 디세츄라제 서열 (서열 3) 및 서열 2에 기재된 아미노산 서열의 정렬을 제공한다. 서열 2에 기재한 아미노산 서열은 아라비돕시스 탈리아나 서열 (서열 3)과 유사한 47.9%이다. 서열 정렬 및 % 동일성 계산은 라사르진 생체정보 연산 스위트 (미국 위스콘신주 매디슨 소재의 드나스타 인크. 제품)의 메갈라인 프로그램을 사용하여 수행된다. 아미노산 서열 및 % 유사성 계산의 쌍 정렬을 애초 파라미터 (GAP PENALTY=5, KTUPLE=1, WINDOW=5 및 DIAGONALS SAVED=5)를 갖는 클러스탈 정렬 방법 (Higgins, D.G. and Sharp, P.M. (1989) CABIOS. 5:151-153)을 사용하여 수행하였다.
서열 정렬, BLAST 스코어 및 확률은 본 발명의 핵산 단편이 전체 림난테스 델타-9 아실-CoA 디세츄라제를 코딩한다는 것을 제시하였다. 그러나, 림난테스로부터 유도된 오일은 주로 델타-5 시스 이중 결합을 갖는 매우 긴 사슬 지방산으로 이루어지고, 이것은 본 발명의 핵산 단편은 사실상 델타-9 디세츄라제보다 델타-5 아실-CoA 디세츄라제를 코딩할 수 있음을 암시한다. 실시예 6에 나타낸 바와 같이, 대두 배아에서 림난테스 디세츄라제의 발현은 16:1 및 18:1 델타-5 지방산을 함유하는 오일의 형성을 야기시킨다. 따라서, 본 발명의 핵산 단편은 델타-5 아실-CoA 디세츄라제를 코딩하는 제1 림난테스 도우글라시이 서열을 포함한다.
〈실시예 4〉
지방산 아실-CoA 일롱가제 동족체를 코딩하는 cDNA 클론의 특성화
클론 lde.pk0008.d5 및 lde.pk0010.e4로부터 얻은 EST 서열을 사용한 BLASTX 연구는 아라비돕시스 탈리아나로부터 얻은 베타-케토아실-CoA 신타제 (GenBank Accession No. AC003105; NCBI General Identifier No. 2760830)에 의해 코딩된 단백질의 유사성을 나타냈다. 이들 ESTs에 대한 BLAST 결과를 표 3에 나타낸다.
베타-케토아실-CoA 신타제와 동족체인 폴리펩티드를 코딩하는 클론에 대한 BLAST 결과
클론 BLAST pLog 스코어 AC003105
lde.pk0004.d5 78.05
lde.pk0010.e4 72.66
특허 데이타베이스의 추가의 연구는 클론 lde.pk0015.d10이 또한 베타-케토아실-CoA 신타제에 대한 유사성을 나타냈음을 보여주었다. 클론 lde.pk0008.d5 중의 전체 DNA 삽입물의 서열을 결정하고, 콘티그를 이 서열 및 클론 lde.pk0015.d10으로부터 cDNA 삽입물의 일부로부터의 서열과 함께 조립하였다. 이 콘티그의 뉴클레오티드 서열을 서열 4에 나타내고, 이 콘티그의 추론된 아미노산 서열을 서열 5에 나타낸다. 서열 4에 기재한 뉴클레오티드 서열을 사용한 BLASTX 연구는 아라비돕시스 탈리아나 베타-케토아실-CoA 신타제 서열에 대한 254보다 큰 pLog 값을 초래하였다. 클론 lde.pk0010.e4로부터의 거의 전체 cDNA 삽입물의 서열을 서열 6에 나타내고, 이 cDNA의 추론된 아미노산 서열을 서열 7에 나타낸다. 서열 6에 기재한 뉴클레오티드 서열을 사용한 BLASTX 연구는 아라비돕시스 탈리아나 서열에 대한 132의 pLog 값을 초래하였다. 서열 5에 기재한 아미노산 서열은 아라비돕시스 탈리아나 서열에 대하여 74.5% 유사하고, 서열 7에 기재한 아미노산 서열은 아라비돕시스 탈리아나 서열에 대하여 80.3% 유사하다. 2개의 림난테스 서열들은 서로 88.0% 유사하고, 이것은 2가지 림난테스 서열 모두가 유사한 기능의 단백질을 코딩한다는 것을 의미한다.
BLAST 스코어 및 확률은 본 발명의 핵산 단편이 림난테스 도우글라시이 베타-케토아실-CoA 신타제 동족체의 일부분 및 전체 임난데스 도우글라시이 베타-케토아실-CoA 신타제 동족체를 코딩한다는 것을 나타냈다. 그러나, 림난테스 중의 오일은 델타-5 시스 이중 결합을 갖는 매우 긴 사슬 지방산으로 주로 이루어지고, 이것은 본 발명의 핵산 단편이 사실상 베타-케토아실-CoA 신타제 이외의 지방산 아실-CoA 일롱가제를 코딩한다는 것을 제시하였다. 이것은, 대두 배아 중의 림난테스 일롱가제의 발현이 20:0 지방산의 풍부를 야기시킨 실시예 6에서 확인된다. 그러므로 이들 서열은 지방산 아실-CoA 일롱가제를 코딩하는 제1 림난테스 도우글라시이 서열을 나타낸다.
〈실시예 5〉
단자엽식물 세포에서의 잡종 유전자의 발현
5' 내지 cDNA에 위치하는 옥수수 27 kD 제인 프로모터, 및 3' 내지 cDNA 단편에 위치하는 10 kD 제인 3' 단부에 관하여 센스 방향으로 지질 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 cDNA를 포함하는 잡종 유전자를 구성할 수 있다. 이 유전자의 cDNA 단편은 적절한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 cDNA 클론의 폴리머라제 사슬 반응 (PCR)에 의해 생성될 수 있다. 클로닝 부위 (NcoI 또는 SmaI)를 올리고뉴클레오티드 내로 혼입시켜, 하기하는 바와 같이 소화된 벡터 pML103으로 삽입되었을 때 DNA 단편의 적절한 배향을 제공할 수 있다. 이어서 증폭을 표준 PCR로 수행한다. 이어서 증폭된 DNA를 제한 효소 NcoI 및 SmaI로 소화시키고, 아가로스 겔 상에서 분류시켰다. 적절한 밴드는 겔로부터 단리하여 플라스미드 pML103의 4.9 kb NcoI-SmaI 단편과 합하였다. 플라스미드 pML103을 부다페스트 조약 하에 ATCC (American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209)에 기탁하여, 기탁 번호 ATCC 97366를 받았다. pML103으로부터의 DNA 세그먼트는 벡터 pGem9Zf(+) (Promega) 중에 옥수수 27 kD 유전자의 1.05 kb SalI-NcoI 프로모터 단편 및 옥수수 10 kD 제인 유전자의 3' 단부로부터의 0.96 kb SmaI-SalI 단편을 함유한다. 벡터 및 삽입된 DNA를, 본질적으로 설명한 바와 같이 (Maniatis), 15 ℃에서 밤동안 연결시킬 수 있다. 이어서 연결된 DNA를 사용하여 이. 콜리 (E. coli) XL1-Blue (Epicurian Coli XL-1 BlueTM; Stratagene)을 형질전환시킬 수 있다. 세균 형질전환체를 플라스미드 DNA의 제한 효소 소화 및 디데옥시 사슬 종료 방법 (SequenaseTMDNA 서열화 키트; U.S. Biochemical)을 사용하여 제한된 뉴클레오티드 서열 분석에 의해 스크리닝시킬 수 있다. 생성된 플라스미드 구성물은 5' 내지 3' 방향으로, 옥수수 27 kD 제인 프로모터, 지질 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 cDNA 단편, 및 10 kD 제인 3' 영역을 코딩하는 잡종 유전자를 포함한다.
이어서 상기한 잡종 유전자를 하기하는 방법에 의해 옥수수 세포 내로 도입시킬 수 있다. 미성숙 옥수수 배아를 옥수수 근친교계 H99 및 LH132의 교차로부터 유도된 발육하는 영과로부터 절개하였다. 배아를 그들이 1.0 내지 1.5 mm 길이일 때 수분작용 후 10 내지 11일 후에 단리하였다. 이어서 배아를 축 쪽을 아래로 향하게 하고 아가로스 고화된 N6 배지와 접촉하도록 위치시킨다 (Chu et al., (1975) Sci. Sin. Peking 18:659-668). 배아를 27 ℃에서 암실 중에서 유지시켰다. 배병 구조 상에 타고난 체세포 전배자모양 및 배자모양을 갖는 세포들의 미분화된 덩어리로 이루어진 부서지기 쉬운 배형성 유합조직은 이들 미성숙 배아의 배반으로부터 증식한다. 1차 외식체로부터 단리된 배형성 유합조직을 N6 배지 상에서 배양시키고 매 2 내지 3주 마다 이 배지 상에서 계대배양시켰다.
플라스미드, p35S/Ac (Dr. Peter Eckes, Hoechst Ag, Frankfurt, Germany로부터 얻음)를 선택가능한 마커를 제공하기 위하여 형질전환 실험에 사용할 수 있다. 이 플라스미드는 포스피노투리신 아세틸 트랜스퍼라제 (PAT)를 코딩하는 Pat 유전자 (유럽 특허 공고 0 242 236 참조)를 함유한다. 효소 PAT는 포스피노트리신과 같은 제초성 글루타민 신테타제 억제제에 대한 내성을 준다. p35S/Ac 중의 pat 유전자는 아그로박테륨 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)의 Ti 플라스미드의 T-DNA로부터의 노팔린 신타제 유전자의 3' 영역 및 컬리플라워 모자이크 바이러스 (Cauliflower Mosaic Virus) (Odell et al., (1985) Nature 313:810-812)로부터의 35S 프로모터의 조절 하에 있다.
입자 충격 방법 (Klein TM et al. (1987) Nature (London) 327:70-73)을 사용하여 유합조직 배양 세포로 유전자를 전달시킬 수 있다. 이 방법에 따르면, 금 입자 (직경 1 μm)를 하기하는 기술을 사용하여 DNA로 코팅시킨다. 플라스미드 DNA 10 μg을 금 입자의 현탁액 (mL 당 60 mg) 50 μL에 첨가한다. 염화칼슘 (2.5 M 용액의 50 μL) 및 스퍼미딘 없는 염기 (1.0 M 용액의 20 μL)를 입자에 첨가한다. 현탁액을 이들 용액의 첨가 동안 와류시킨다. 10분 후, 튜브를 짧게 원심분리시키고 (15,000 rpm에서 5 초) 상징액을 제거하였다. 입자를 무수 에탄올 200 μL 중에 재현탁시키고, 다시 원심분리시키고 상징액을 제거하였다. 에탄올 헹굼을 다시 수행하고 에탄올 30 μL의 최종 부피 중에 재현탁시킨다. DNA-코팅된 금 입자의 분취액 (5 μL)을 KaptonTM플라잉 디스크 (Bio-Rad Labs)의 중심에 위치시킬 수 있다. 이어서 입자들을 1000 psi의 헬륨 압력, 0.5 cm의 갭 거리 및 1.0 cm의 플라잉 거리를 사용하여 BiolisticTMPDS-1000/He (Bio-Rad Instruments, Hercules CA)로 옥수수 조직 내로 가속화시켰다.
충격을 위하여, 배형성 조직을 아가로스-고화된 N6 배지 상에 위치시킨다. 조직을 얇은 잔디로 배열시키고, 직경 약 5 cm의 원형 면적을 덮었다. 조직을 함유하는 페트리 디쉬를 스톱핑 스크린으로부터 대략 8 cm의 PDS-1000/He 챔버 내에 위치시킨다. 이어서 챔버 중의 공기를 배기시켜 28 인치의 Hg로 진공으로 하였다. 충격 튜브 내의 He 압력이 1000 psi에 이르면 터지는 파열 막을 사용하여 헬륨 충격 파로 마크로캐리어를 가속화시킨다.
충격 몇일 후 조직을 글루포시네이트 (리터 당 2 mg)을 함유하고 카제인 또는 프롤린이 없는 N6 배지로 이동시킬 수 있다. 조직을 이 배지 상에서 천천이 계속해서 생장시킨다. 추가의 2 주 후에, 조직을 글루포시네이트를 함유하는 새로운 N6 배지로 전달시킬 수 있다. 6 주 후, 능동적으로 생장하는 유합조직의 직경 약 1 cm의 면적을 글루포시네이트 보충 배지를 함유하는 플레이트들 중의 몇 개 상에서 동정할 수 있다. 이들 유합조직은 선택 배지 상에서 계대배양시켰을 때 계속해서 생장할 수 있다.
조직 덩어리를 먼저 리터 당 0.2 mg의 2,4-D를 보충한 N6 배지에 전달시킴으로써 식물을 유전자도입 유합조직으로부터 재생시킬 수 있다. 2주 후, 조직을 재생 배지 (Fromm et al., (1990) Bio/Technology 8:833-839)로 전달시킬 수 있다.
〈실시예 6〉
쌍자엽식물 세포에서의 잡종 유전자의 발현
콩 파세올러스 불가리스 (Phaseolus vulgaris) (Doyle, J.J. et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:9228-9328)로부터의 종자 저장 단백질 파세올린의 β 서브유닛을 코딩하는 유전자로부터의 전사 종료암호 및 촉진제로 이루어진 종자 특이적 발현 카세트를 형질전환된 쌍자엽식물에서 지질 생합성에 관여하는 본 발명의 효소의 발현에 사용할 수 있다. 파세올린 카세트는 번역 개시 코돈으로부터 업스트림 (5')의 약 500 뉴클레오티드 및 파세올린의 번역 중단 코돈으로부터 다운스트림 (3')의 약 1650 뉴클레오티드를 포함한다. 5' 및 3' 영역 사이에 독특한 제한 엔도뉴클레아제 부위 NcoI (ATG 번역 개시 코돈을 포함), Sma I, Kpn I 및 Xba I가 있다. 전체 카세트는 Hind III 부위의 옆에 있다.
이 유전자의 cDNA 단편은 적절한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 cDNA 클론의 폴리머라제 사슬 반응 (PCR)에 의해 생성될 수 있다. 클로닝 부위는 올리고뉴클레오티드 내로 혼입되어, 발현 벡터 내에 삽입되었을 때 DNA 단편의 적절한 배향을 제공할 수 있다. 이어서 상기한 바와 같이 증폭을 행하고 단리한 단편을 종자 발현 카세트를 운반하는 pUC18 벡터 내로 삽입시킨다.
이어서 쌍자엽식물 배아를 지질 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질전환시킬 수 있다. 체세포 배아를 유발하기 위해서, 선택된 쌍자엽식물의 표면 멸균된 미성숙 종자로부터 절개된 3-5 mm 길이의 자엽을 적절한 한천 배지 상에서 6-10주 동안 26 ℃에서 일광 중에서 또는 암실에서 배양시킬 수 있다. 이어서 2차 배아를 생산하는 체세포 배아를 절개하여 적합한 액체 매질 내에 위치시켰다. 초기의 구형 단계의 배아로서 증식된 체세포 배아의 덩어리에 대한 반복된 선별 후에, 현탁액을 하기하는 바와 같이 유지시킨다.
쌍자엽식물 배형성 현탁액 배양물을 150 rpm의 회전 진탕기 상에서 26 ℃에서 16:8 시간 낮/밤 스케쥴의 형광으로 35 mL 액체 배지 중에서 유지시킬 수 있다. 조직 약 35 mg을 액체 배지 35 mL 내로 접종함으로써 배양물을 매 2주 마다 계대배양하였다.
이어서 쌍자엽식물 배형성 현탁액 배양물을 입자 건 충격 방법 (Klein T.M. et al., (1987) Nature (London) 327:70-73, U.S. Patent No. 4,945,050)에 의해 형질전환시킬 수 있다. DuPont BiolisticTMPDS1000/HE 장치 (헬륨 개장)를 이들 형질전환에 사용할 수 있다.
식물 형질전환을 용이하게 하기 위하여 사용될 수 있는 선택가능한 마커 유전자는 컬리플라워 모자이크 바이러스 (Odell et al., (1985) Nature 313:810-812)로부터의 35S 프로모터, 플라스미드 pJR225 (E. coli로부터; Gritz L et al. (1983) Gene 25:179-188)로부터의 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 및 아그로박테륨 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)의 Ti 플라스미드의 T-DNA로부터의 노팔린 신타제 유전자의 3' 영역으로 이루어진 잡종 유전자이다. 파세올린 5' 영역, 지질 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 단편 및 파세올린 3' 영역을 포함하는 종자 발현 카세트를 제한 단편으로서 단리할 수 있다. 이어서 이 단편을 마커 유전자를 갖는 벡터의 독특한 제한 부위 내로 삽입시킬 수 있다.
60 mg/mL 1 μm 금 입자 현탁액 50 μL에, 다음의 것을 (순서대로) 첨가한다: DNA (1 μg/μL) 5 μL, 스퍼미딘 (0.1 M) 20 μl, 및 CaCl2(2.5 M) 50 μL. 이어서 입자 제제를 3 분 동안 교반시키고, 마이크로퓨지 (microfuge) 중에서 10초 동안 회전시키고 상징액을 제거한다. DNA-코팅된 입자를 이어서 70% 에탄올 400 μL 중에 한번 세척하고 무수 에탄올 40 μL 중에 재현탁시킨다. DNA/입자 현탁액을 각각 1초 동안 3회 초음파처리시킨다. DNA-코팅된 금 입자 5 μL를 이어서 각 마크로캐리어 디스크 상에 놓는다.
2주된 현탁액 배양물 약 300-400 mg을 빈 60 x 15 mm 페트리 디쉬 중에 위치시키고, 잔류 액체를 피펫으로 조직으로부터 제거하였다. 각 형질전환 실험의 경우, 조직의 약 5-10 플레이트들을 정상적으로 충격시킨다. 막 파열 압력을 1100 psi로 설정하고, 챔버를 배기시켜 수은 28 인치의 진공으로 하였다. 조직을 보유 스크린으로부터 약 3.5 인치 떨어지게 위치시키고, 3회 충격시킨다. 충격 후, 조직을 반으로 나누어 다시 액체 중에 위치시키고 상기한 바와 같이 배양시켰다.
충격 후 5 내지 7일 후, 액체 배지를 새로운 배지로 교환시키고, 충격 후 11 내지 12일 후 하이그로마이신 50 mg/mL를 함유하는 새로운 배지로 대체하였다. 이 선택 배지는 매주 새롭게 할 수 있다. 충격 후 6 내지 8주 후, 형질전환되지 않은 괴사성 배형성 덩어리로부터 생장하는 녹색의 형질전환된 조직을 관찰할 수 있다. 단리된 녹색 조직을 제거하고 개별 플라스크 내로 접종시켜 새로운 클론 증식된 형질전환된 배형성 현탁액 배양물을 생성시킨다. 새로운 각 세포계를 독립적인 형질전환 사건으로 처리할 수 있다. 이어서 이들 현탁액을 계대배양시키고 미성숙 배아의 덩어리로 유지시키거나 또는 개별 체세포 배아의 성숙 및 발아에 의해 전체 식물로 재생시킬 수 있다.
대두 배아 중에서 림난테스 델타-5 아실-CoA 디세츄라제 및 지방산 아실-CoA 일롱가제의 발현
서열 1 (림난테스 델타-5 아실-CoA 지질 디세츄라제를 코딩) 및 서열 4 (림난테스 지방산 아실-CoA 일롱가제를 코딩)에 기재된 핵산 단편들의 동일성 및 활성을 확인하기 위하여, 이들 핵산을 개별적으로 생체내 발현 벡터 내로 클로닝시켰다. 벡터 pcDNAII를 클로닝하는 라이브러리에서 cDNA 삽입물은 Not I 소화에 의한 전체 cDNA 삽입물의 제거를 가능하게 하는 Not I 부위의 옆에 있다. 델타-5 아실-CoA 디세츄라제 및 지방산 아실-CoA 일롱가제 코딩 플라스미드를 Not I로 소화시키고, cDNA 단편을 단리시키고 정제시키고 표준 분자 생물학 기술에 따라 pKS67 벡터 (하기 설명됨) 내로 연결시킨다.
특정 세균 및 특정 식물 세포 중에서 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제의 발현을 가능하게 하는 잡종 유전자를 함유하는 플라스미드, pZBL100을 하기하는 유전 요소들로부터 구성하였다: a) T7 프로모터 + Shine-Delgarno/하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 (HPT)/T7 종료암호 서열, b) 컬리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV)/ 35S 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제 (HPT)/노팔린 신타제 (아그로박테륨 투메파시엔스 T-DNA로부터의 NOS3') 및 c) b-락타마제 코딩 영역 (암피실린 내성 유전자)이 제거된 pSP72 플라스미드 벡터 (Promega).
HPT 유전자를 클레브시엘라 (Klebsiella)-유도된 플라스미드 pJR225를 함유한 이. 콜리 균주 W677로부터의 PCR에 의해 증폭시켰다. pSP72 벡터로 출발하여, 요소들을 표준 클로닝 방법 (Maniatis)을 사용하여 단일의 플라스미드 내로 조립시켰다.
따라서 플라스미드 pZBL100은 람다 DE3에 대하여 용원성인 (lacUV5 조절 하에서 T7 RNA 폴리머라제 유전자를 운반함) 이. 콜리의 특정 균주, 예를 들면 노바블루 (NovaBlue) (DE3) (Novagen)에서 HPT 효소의 발현을 위한 T7 프로모터/HPT/T7 종료암호 카세트를 함유한다. 플라스미드 pZBL100은 또한 대두와 같은 식물에서 HPT 효소의 구성적 발현을 위한 35S/HPT/NOS 카세트를 함유한다. 이들 2가지 발현 시스템은 하이그로마이신의 존재하에서의 생장에 대한 선별이 세균 및 식물 시스템 모두 중에 플라스미드를 함유하는 세포를 동정하는 수단으로서 사용될 수 있도록 한다. pZBL100은 또한 다른 잡종 유전자를 이 벡터 내로 클로닝시키는데 적합한 3개의 독특한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 함유한다.
클로닝 벡터 pUC18의 Hind III 부위 내로 b-콘글리시닌 유전자의 5' 비코딩 영역 (프로모터 영역 함유) 555 bp에 이어, Nco L, Sma I, Kpn I 및 Xba I에 대한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 함유하는 다수개의 클로닝 서열, 이어서 공통적인 콩 파세올린 3' 미번역 영역 1174 bp를 Hind III 부위 내로 삽입시켜 플라스미드 pCW109를 상업적으로 입수가능한 플라스미드 pUC18 (Gibco-BRL)로부터 유도하였다. 사용된 b-콘글리시닌 프로모터 영역은 27 뉴클레오티드 위치에서의 차이 때문에 공개된 b-콘글리시닌 유전자 (Doyle et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:9228-9238)의 대립유전자이다. 독특한 Not I 부위를 Nco I 및 Xba I로의 소화에 이어 한 가닥 DNA 단부를 제거하여 pCW109에서의 b-콘글리시닌 프로모터 및 파세올린 3' 단부 사이의 클로닝 영역내로 도입시키고, 개조 콩 엑소뉴클레아제 Not I 링커 (New England Biochemical catalog number NEB 1125)를 선형화 플라스미드 내로 연결시켜 플라스미드 pAW35를 생성시켰다.
플라스미드 pML18은 문헌 (Beck, E. et al. (1982) Gene 19:327-336)에 기재되어 있는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자의 발현을 구동시키는 비조직-특이성 및 구성적 컬리플라워 모자이크 바이러스 (35S) 프로모터 (Odell, J.T. et al. (1985) Nature 313:810-812; Hull et al. (1987) Virology 86:482-493)에 이어지는, 문헌 (Depicker et al. (1982) J. Appl. Genet. 1:561-574)에 기재되어 있는 뉴클레오티드 848 내지 1550을 포함하는 노팔린 신타제 유전자의 3' 단부로 이루어진다. 이 전사 단위를 시판되는 클로닝 벡터 pGEM9Z (Gibco-BRL) 내로 삽입시키고, 35S 프로모터의 5' 단부에서 순서대로의 제한 부위 Sal I, Xba I, Bam HI 및 Sma I에 인접하게 한다. 추가의 Sal I 부위가 NOS 3' 서열의 3' 단부에 존재하고, Xba I, Bam HI 및 Sal I 부위는 독특하다. pML18 중의 단일의 Not I 부위를 Not I로 소화시켜 파괴시키고, 단일 가닥의 단부에서 dNTPs Klenow 단편으로 채운 후, 선형화된 플라스미드를 재연결시킨다. 변형된 pML18을 이어서 Hind III로 소화시키고, 송아지 장 포스파타제로 처리하였다. pAW35에서의 b-콘글리시닌:Not I:파세올린 발현 카세트를 Hind III 부위로 소화시켜 제거하고, 1.8 kB 단편을 아가로스 겔 전기영동으로 단리시키고, 상기한 바와 같은 변형되고 선형화된 pML18 구성물 내로 연결시킨다. 원하는 배향을 갖는 클론을 Not I 및 Xba I로 소화시켜 1.08 kB 단편을 방출시켜, b-콘글리시닌 전사 단위의 배향이 선택가능한 마커 전사 단위와 동일하다는 것을 나타냄으로써 동정하였다. 생성된 플라스미드에는 pBS19라는 명칭을 붙였다.
pBS19로부터의 단편을 함유하는 b-콘글리시닌을 Hind III로 소화시켜 단리시키고, 겔 전기영동에 의한 단리 및 송아지 알칼리 포스파타제로 처리된 Hind III-소화된 pZBL100 내로의 연결에 의해 pKS67 벡터를 제조하였다.
대두 배형성 현탁액 배양물을 입자 건 충격 (Klein TM et al. (1987) Nature (London) 327:70-73; 미국 특허 제4,945,050호) 방법에 의해 발현 벡터로 형질전환시켰다. 유전자도입 배아의 유지, 오일의 제조 및 가스 크로마토그래피에 의한 지방산 함량의 측정을 PCT 공개 WO93/11245 (본 명세서에서 참고문헌으로 인용함)에 지시되어 있는 바와 같이 수행하였다.
일롱가제 활성의 증명
16:0 지방산의 축적율은 지방산 아실-CoA 일롱가제를 발현시키는 대두 배아에서 감소되는 한편, 20:0 지방산의 양은 극적으로 증가된다. 도 3은 유전자도입되지 않은 야생형 대두 배아 (도 3a)로부터 및 림난테스 지방산 아실-CoA 일롱가제를 발현시키는 유전자도입 대두 배아 (도 3b)로부터 유도된 오일의 크로마토그래피 분석을 제공한다. 오일 중에 존재하는 상이한 지방산에 대응하는 피크들을 나타낸다. 16:0 및 18:2 지방산의 양은 유전자도입되지 않은 야생형 대두 배아로부터 유도된 오일과 비교하였을 때 지방산 아실-CoA 일롱가제-발현 대두 배아로부터 얻은 오일 중에서 감소된다. 또한, 20:0 지방산의 양은 유전자도입 배아의 오일 중에서 크게 풍부하다. 야생형 대두 배아 및 림난테스 지방산 아실-CoA 일롱가제를 발현시키는 대두 배아에서 16:0 및 20:0 지방산의 정량화된 분포를 표 4에 나타낸다. 야생형에서 20:0 지방산의 양이 0.2 내지 0.6%인 반면, 지방산 아실-CoA 일롱가제-발현 배아에서는, 20:0 지방산의 %가 7.7% 내지 11.0% 범위이다.
림난테스 지방산 아실-CoA 일롱가제를 발현시키는 유전자도입 대두 배아 중의 지방산 분포%
배아 16:0 20:0
4155 (야생형) 12.9 0.2
323 (야생형) 13.0 0.4
312 (야생형) 18.4 0.6
4111 (야생형) 15.4 0.6
4102 (야생형) 15.2 0.6
195 (야생형) 16.2 0.6
155 (유전자도입) 7.4 9.3
161 (유전자도입) 7.6 8.2
163 (유전자도입) 7.9 7.7
175 (유전자도입) 8.4 11.0
2211 (유전자도입) 8.5 7.9
341 (유전자도입) 6.4 10.8
도 4는 림난테스 지방산 아실-CoA 일롱가제를 발현시키는 유전자도입 대두 배아에서 16:0 지방산 함량의 감소와 20:0 지방산 함량의 증가 사이의 직선 관계를 예시한다.
델타-5 디세츄라제 활성의 증명
림난테스 델타-5 아실-CoA 디세츄라제를 발현시키는 유전자도입 대두 배아는 야생형 배아에 나타나지 않는 16:1 지방산을 생산한다. 델타-5 디세츄라제를 발현시키는 대두 배아에서의 지방산 분포는, 야생형 대두 배아 (도 5a) 및 림난테스 델타-5 아실-CoA 디세츄라제를 발현시키는 대두 배아 (도 5b)로부터 얻은 오일들에 대응하는 크로마토그램을 나타낸다. 표 5는 야생형 배아 및 림난테스 델타-5 아실-CoA 디세츄라제를 발현시키는 유전자도입 배아에서의 16:0, 16:1 델타-5, 18:0 및 18:1 델타-5의 정량화된 분포 %를 나타낸다.
림난테스 델타-5 아실-CoA 디세츄라제를 발현시키는 유전자도입 대두 배아에서의 지방산 분포%
배아 16:0 16:1△5 18:0 18:1△5
216.0 (야생형) 13.03052 0 2.47064 0
216.1 (야생형) 10.60185 0 1.76857 0
216.2 (야생형) 11.95366 0 1.67544 0
218.0 (야생형) 12.93328 0 2.15752 0
218.5 (야생형) 11.57688 0 2.24243 0
220.0(유전자도입) 10.17740 3.63283 1.25350 0.57574
220.1(유전자도입) 8.99496 4.27946 1.22194 0.71544
220.2(유전자도입) 9.78203 2.86631 1.57083 nd
220.3(유전자도입) 9.47315 3.35682 1.49796 0.60828
220.4(유전자도입) 12.16690 2.46238 1.84877 0.45737
220.5(유전자도입) 12.22757 2.75365 2.38873 0.53878
220.6(유전자도입) 11.72778 2.43411 2.37860 0.57778
220.7(유전자도입) 9.31376 3.39302 1.33830 0.59855
220.8(유전자도입) 9.48067 3.66554 1.45045 0.66508
220.9(유전자도입) 9.37735 3.47590 0.95774 0.75598
217.1(유전자도입) 9.86364 3.56592 1.51745 0.64637
217.2(유전자도입) 11.03674 2.79068 1.92739 0.55140
217.3(유전자도입) 13.57543 2.45928 2.26611 0.56306
217.4(유전자도입) 11.33959 2.88931 1.73524 0.53747
217.5(유전자도입) 9.61358 3.40842 1.94986 0.73811
217.6(유전자도입) 10.54626 3.11490 1.69327 nd
217.7(유전자도입) 11.60064 3.34681 2.77254 0.78978
217.8(유전자도입) 13.76804 1.41011 3.41123 nd
217.9(유전자도입) 11.21888 2.98101 1.87345 0.61650
nd = 장치에 의해 적분되어야 하는 생산된 18:1 델타-5가 충분하지 않음
디세츄라제에 의해 촉매된 이중 결합의 위치를 확인하기 위하여, 모노불포화 지방산의 이중 결합 위치를 문헌 (Yamamoto, K. et al. (1991) Chem Phys Lipids 60:39-50)에 기재되어 있고 도 6에 예시되어 있는 바와 같이 지방산 메틸 에스테르의 디술파이드 유도체의 GC-MS 분석으로 입증하였다.
림난테스 델타-5 아실-CoA 디세츄라제를 발현시키는 대두 배아로부터 제조한 지방산 메틸 에스테르를 앞에서 설명한 (Yamamoto, K. et al. (1991) Chem Phys Lipids 60:39-50) 바와 같이 디메틸 디술파이드와 반응시켰다. 이 반응은 불포화 지방산 메틸 에스테르의 이중 결합을 디메틸 디술파이드 (DMDS) 부가물로 전환시킨다. GC-MS로 분석하였을 때, 이들 유도체는 지방산 중에서 이중 결합의 위치에 대해 진단할 수 있는 이온을 생성시킨다. 유전자도입 대두 배아로부터의 지방산 메틸 에스테르의 DMDS 유도체를 GC-MS로 분석하였다. 이들 유도체들을 185 ℃ (5 분 유지) 내지 237 ℃ (25 분 유지)로 7.5 ℃/분의 속도로 프로그램된 HP6890 가스 크로마토그래피 온도의 오븐 온도로 0.25 mm (내경) x 30 m HP-INNOWax 컬럼 (Hewlett Packard)를 사용하여 분할하였다. 분할된 DMDS 유도체의 질량 스펙트럼을 가스 크로마토그래피와 서로 경계를 같이 하고 있는 HP5973 질량 선택적 검출기를 사용하여 얻었다. 메틸 헥사데센산의 DMDS 유도체를 메틸 16:1의 DMDS 유도체의 분자 이온에 대응하는, 362 m/z에 대해 선택된 이온 주사를 사용하여 동정하였다. 이것은 18.5 분 및 19.5 분 사이의 보유 시간을 갖는 2개의 피크의 동정을 초래한다 (도 6a). 이들 피크들 중의 최대의 질량 스펙트럼은 161 및 201의 m/z을 갖는 풍부한 이온들을 함유하였다 (도 6b). 이들 이온의 질량은 델타-5 탄소 원자에서의 이중 결합의 존재와 일치한다. 161 m/z 이온 (단편 Y)이 메틸 16:1△5 DMDS 유도체의 카르복실 부분에 대한 예측되는 질량이고, 201 m/z 이온 (단편 X)이 16:1△5 DMDS 유도체의 메틸 단부에 대한 예측되는 질량이다. 16:1△5 DMDS 유도체가 32 m/z의 손실을 갖는 단편 Y의 재배열에 의해 생성되는 129 m/z 이온일 때 이 피크의 동정과 역시 일치한다. 일반적으로, Y-32 이온은 모노불포화 지방산의 메틸 에스테르의 DMDS 유도체에 대해 진단할 수 있는 이온으로 여겨진다 (Francis, G.W. (1981) Chem. Phys. Lipids 29:369-374). 도 6a에서 제2의 및 보다 작은 피크는 메틸 16:1△9의 DMDS 유도체로 확인되었다 (결과는 나타나지 않음). 이 지방산은 16:1△5와 대조적으로, 사실상 모든 식물 조직 중에서 소량으로 검출가능하다.
메틸 옥타데센산 (18:1) DMDS 유도체를, 이들 부가물의 분자 이온의 질량에 대응하는 390 m/z에 대해 선택된 이온 주사를 사용하여 먼저 동정하였다 (도 6c). 도 6d에 나타낸 바와 같이, 메틸 18:1△5의 DMDS 유도체의 단편화는 각각 단편 X, Y 및 Y-32에 대응하는 161 m/z, 229 m/z 및 129 m/z의 이온을 생성시킬 것으로 예측된다. 이들 이온은 대두 배아의 중요한 모노불포화 지방산인 메틸 18:1△9의 유도체에 대응하는 피크의 정면 상의 숄더로 검출되었다.
본 실시예에서 제공된 결과는 림난테스 델타-5 아실-CoA 디세츄라제를 발현시키는 유전자도입 대두 배아로부터 유도된 지방산 메틸 에스테르에서의 16:1△5 및 18:1△5의 발생을 입증한다. 야생형 대두 배아로부터 제조한 유도체중에서는 이들 지방산 모두 검출될 수 없다.
이들 실험은 대두 배아 중에서 발현되었을 때, 림난테스 지방산 아실-CoA 일롱가제 (서열 5)는 팔미테이트 (16:0)로부터 아라키도네이트 (20:0)의 생산을 촉매한다는 것을 보여준다. 이들 실험은 또한 유전자도입 대두 배아 중에 발현되었을 때 림난테스 아실-CoA 디세츄라제 (서열 2)는 16:1 델타-5 및 18:1 델타-5 지방산을 생산시키는 델타-5 디세츄라제를 코딩한다는 것을 보여준다. 이들 실험은, 그의 서열이 서열 2, 서열 5 및 서열 7에 기재되어 있는 림난테스 도우글라시이 델타-5 아실-CoA 디세츄라제 및 지방산 아실-CoA 일롱가제의 활성을 처음으로 입증한 것이다.
다른 오일 생산 작물에서 림난테스 지방산 아실-CoA 일롱가제의 발현은 C20:0의 양을 약 1% 미만으로부터 약 15% 이상으로 증가시키게 된다. 다른 유지종자 작물에서 림난테스 지방산 아실-CoA 일롱가제 및 델타-5 아실-CoA 디세츄라제의 발현은 20:1 델타-5 오일을 생산시키는 결과를 갖게 되고, 이것은 이어서 공업적으로 유용한 화합물의 제조에 사용될 수 있다.
〈실시예 7〉
미생물 세포에서의 잡종 유전자의 발현
지질 생합성에 관여하는 본 발명의 효소를 코딩하는 cDNA를 T7 이. 콜리 발현 벡터 pBT430 내로 삽입시킬 수 있다. 이 벡터는 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제/T7 프로모터 시스템을 사용하는 pET-3a (Rosenberg et al. (1987) Gene 56:125-135)의 유도체이다. 그들의 원 위치에 있는 pET-3a 중의 EcoR I 및 Hind III 부위를 먼저 파괴시켜 플라스미드 pBT430을 구성하였다. EdoR I 및 Hind III 부위를 함유하는 올리고뉴클레오티드 어댑터를 pET-3a의 BamH I 부위에 삽입시켰다. 이것은 유전자들이 발현 벡터내로의 삽입을 위한 추가의 독특한 클로닝 부위를 갖는 pET-3aM을 생성시켰다. 이어서, 번역 개시 위치에 있는 Nde I 부위를 올리고뉴클레오티드-유도 돌연변이를 사용하여 Nco I 부위로 전환시켰다. 이 영역에서 pET-3aM의 DNA 서열, 5'-CATATGG를 pBT430에서 5'-CCCATGG로 전환시켰다.
cDNA를 함유하는 플라스미드 DNA는 적절하게 소화되어 단백질을 코딩하는 핵산 단편을 방출시킬 수 있다. 이어서 이 단편을 1% NuSieve GTGTM저융점 아가로스 겔 (FMC) 상에서 정제시켰다. 완충제 및 아가로스는 DNA 단편의 가시화를 위하여 브론화에티듐 10 μg/ml를 함유한다. 이어서 단편을 제조업자의 지시에 따라 GELaseTM(Epicentre Technologies)로 소화시켜 아가로스 겔로부터 정제시키고, 에탄올 침전시키고, 건조시키고 및 물 20 μL 중에서 재현탁시켰다. 적절한 올리고뉴클레오티드 어댑터를 T4 DNA 리가제 (New England Biolabs, Beverly, MA)를 사용하여 단편에 연결시킬 수 있다. 연결된 어댑터를 함유하는 단편을 상기한 바와 같은 저융점 아가로스를 사용하여 과량의 어댑터로부터 정제시킬 수 있다. 벡터 pBT430을 소화시키고, 알칼리 포스파타제 (NEB)로 탈인산화시키고 상기한 바와 같이 페놀/클로로포름으로 단백질제거하였다. 제조한 벡토 pBT430 및 단편을 이어서 16 ℃에서 15 시간 동안 연결시킨 후에 DH5 전기적응 세포 (GIBCO BRL) 내로 형질전환시킬 수 있다. 형질전환체는 LB 배지 및 암피실린 100 μg/mL를 함유하는 한천 플레이트 상에서 선택될 수 있다. 이어서 지질 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 함유하는 형질전환체를 제한 효소 분석에 의한 T7 프로모터에 관한 정확한 배향에 대하여 스크리닝한다.
많은 양의 발현을 위하여, T7 프로모터에 비하여 정확한 배향의 cDNA 삽입물을 갖는 플라스미드 클론을 이. 콜리 균주 BL21 (DE3) (Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:113-130) 내로 형질전환시킬 수 있다. 배양물을 25 ℃에서 암피실린 (100 mg/L)을 함유하는 LB 배지 중에서 생장시켰다. 600 nm에서 대략 1의 광학 밀도에서, IPTG (이소프로필티오-β-갈락토시드, 인듀서)를 0.4 mM의 최종 농도에 첨가할 수 있고, 인큐베이션을 25 ℃에서 3 시간 동안 계속할 수 있다. 이어서 세포들을 원심분리로 수확하고, 0.1 mM DTT 및 0.2 mM 페닐 메틸술포닐 플루오라이드를 함유하는 pH 8.0의 50 mM 트리스-HCl 50 μL 중에 재현탁시켰다. 소량의 1 mm 유리 비이드를 첨가하고, 혼합물을 각 경우에 마이크로프로브 초음파기로 약 5초 동안 3회 초음파처리시켰다. 혼합물을 원심분리시키고, 상징액의 단백질 농도를 측정하였다. 배양물의 가용성 분획물로부터 단백질 1 μg을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리시킬 수 있다. 겔은 예측되는 분자량에서 이동하는 단백질 밴드에 대하여 관찰할 수 있다.
〈110〉 E. I. DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY
〈120〉 LIMNANTHES OIL GENES
〈130〉 BB-1117
〈140〉
〈141〉
〈150〉 60/078,736
〈151〉 1998-03-20
〈160〉 7
〈170〉 MICROSOFT WORD VERSION 7.0A
〈210〉 1
〈211〉 1355
〈212〉 DNA
〈213〉 Limnanthes douglasii
〈400〉 1
gcttgagact ctctctctac ttccccatct ctatatctct ctctctctct ctagaagcca 60
tggcttcttt catcgcaacc acaacaccag caatgccagc tttcgcttca gttcttgatc 120
caaaaatacc cacaaaacca gaacccaaaa ccgaaacccc caaaccaaaa gacgatctcg 180
aacgcttccg gacatcagaa gtcgtgttgg agaggaaatc caaaggattc tggcgccgga 240
aatggaaccc tcgtgatatt caaaacgccg tcactttact ggtcctgcat gctcttgcag 300
cgatggcgcc cttttatttc agctgggatg cgttttggat ctcttttatc ttgcttggtt 360
tcgcaagcgg tgttcttggt atcactttgt gcttccatag gtgtcttact catggcggtt 420
tcaagcttcc taagttggtt gagtacttct ttgcctactg tggctctctc gctcttcagg 480
gagatcccat ggaatgggtg agcaaccata ggtaccatca ccagttcgtc gatacagaaa 540
gagatgttca tagtccaact caaggatttt ggttctgtca cattggttgg gttcttgaca 600
aagatttatt cgtcgaaaaa cgtggtggcc gaagaaacaa tgtgaatgat ttgaagaaac 660
aagccttcta cagattcctc cagaaaactt atatgtacca tcaattggct ctaatagctc 720
tactttacta cgtcggaggg tttccataca ttgtctgggg aatgggtttt agattggtgt 780
ttatgttcca ttccactttc gctatcaact cagtttgtca taaatggggc ggaaggccat 840
ggaatactgg agatttatcg accaacaata tgtttgttgc attgtgtgcg tttggagagg 900
gctggcataa caaccaccac gcattcgaac aatcagctcg acacgggcta gaatggtggc 960
agatcgatgt tacttggtac gttatcagga ctctacaagc tattggattg gctaccaatg 1020
tgaagctacc aactgaagct cagaagcaaa agctcaaagc aaagagtgcc taaggagttt 1080
gaagcatgta ataagtgttt gtattcgata cctacttata tatgtttcta gagtcgtacg 1140
tgtaatgaat aaagttcgag gcagctatat agactgtgtt cggatatgaa aatcgttgta 1200
ttcttgtatc tgatcgaaaa tagctgcctt gataggtgtt cgataaaaca ttgttatgtt 1260
gcttggtgta gttgtgtggg tcttgctttg tactgtattg tgttgtgtca cgttttgaga 1320
ttatatatag ttttcttgtg ttcaaaaaaa aaaaa 1355
〈210〉 2
〈211〉 356
〈212〉 PRT
〈213〉 Limnanthes douglasii
〈400〉 2
Leu Arg Leu Ser Leu Tyr Phe Pro Ile Ser Ile Ser Leu Ser Leu Ser
1 5 10 15
Leu Glu Ala Met Ala Ser Phe Ile Ala Thr Thr Thr Pro Ala Met Pro
20 25 30
Ala Phe Ala Ser Val Leu Asp Pro Lys Ile Pro Thr Lys Pro Glu Pro
35 40 45
Lys Thr Glu Thr Pro Lys Pro Lys Asp Asp Leu Glu Arg Phe Arg Thr
50 55 60
Ser Glu Val Val Leu Glu Arg Lys Ser Lys Gly Phe Trp Arg Arg Lys
65 70 75 80
Trp Asn Pro Arg Asp Ile Gln Asn Ala Val Thr Leu Leu Val Leu His
85 90 95
Ala Leu Ala Ala Met Ala Pro Phe Tyr Phe Ser Trp Asp Ala Phe Trp
100 105 110
Ile Ser Phe Ile Leu Leu Gly Phe Ala Ser Gly Val Leu Gly Ile Thr
115 120 125
Leu Cys Phe His Arg Cys Leu Thr His Gly Gly Phe Lys Leu Pro Lys
130 135 140
Leu Val Glu Tyr Phe Phe Ala Tyr Cys Gly Ser Leu Ala Leu Gln Gly
145 150 155 160
Asp Pro Met Glu Trp Val Ser Asn His Arg Tyr His His Gln Phe Val
165 170 175
Asp Thr Glu Arg Asp Val His Ser Pro Thr Gln Gly Phe Trp Phe Cys
180 185 190
His Ile Gly Trp Val Leu Asp Lys Asp Leu Phe Val Glu Lys Arg Gly
195 200 205
Gly Arg Arg Asn Asn Val Asn Asp Leu Lys Lys Gln Ala Phe Tyr Arg
210 215 220
Phe Leu Gln Lys Thr Tyr Met Tyr His Gln Leu Ala Leu Ile Ala Leu
225 230 235 240
Leu Tyr Tyr Val Gly Gly Phe Pro Tyr Ile Val Trp Gly Met Gly Phe
245 250 255
Arg Leu Val Phe Met Phe His Ser Thr Phe Ala Ile Asn Ser Val Cys
260 265 270
His Lys Trp Gly Gly Arg Pro Trp Asn Thr Gly Asp Leu Ser Thr Asn
275 280 285
Asn Met Phe Val Ala Leu Cys Ala Phe Gly Glu Gly Trp His Asn Asn
290 295 300
His His Ala Phe Glu Gln Ser Ala Arg His Gly Leu Glu Trp Trp Gln
305 310 315 320
Ile Asp Val Thr Trp Tyr Val Ile Arg Thr Leu Gln Ala Ile Gly Leu
325 330 335
Ala Thr Asn Val Lys Leu Pro Thr Glu Ala Gln Lys Gln Lys Leu Lys
340 345 350
Ala Lys Ser Ala
355
〈210〉 3
〈211〉 305
〈212〉 PRT
〈213〉 Arabidopsis thaliana
〈400〉 3
Met Ser Leu Ser Ala Ser Glu Lys Glu Glu Asn Asn Lys Lys Met Ala
1 5 10 15
Ala Asp Lys Ala Glu Met Gly Arg Lys Lys Arg Ala Met Trp Glu Arg
20 25 30
Lys Trp Lys Arg Leu Asp Ile Val Lys Ala Phe Ala Ser Leu Phe Val
35 40 45
His Phe Leu Cys Leu Leu Ala Pro Phe Asn Phe Thr Trp Pro Ala Leu
50 55 60
Arg Val Ala Leu Ile Val Tyr Thr Val Gly Gly Leu Gly Ile Thr Val
65 70 75 80
Ser Tyr His Arg Asn Leu Ala His Arg Ser Phe Lys Val Pro Lys Trp
85 90 95
Leu Glu Tyr Phe Phe Ala Tyr Cys Gly Leu Leu Ala Ile Gln Gly Asp
100 105 110
Pro Ile Asp Trp Val Ser Thr His Arg Tyr His His Gln Phe Thr Asp
115 120 125
Ser Asp Arg Asp Pro His Ser Pro Asn Glu Gly Phe Trp Phe Ser His
130 135 140
Leu Leu Trp Leu Phe Asp Thr Gly Tyr Leu Val Glu Lys Cys Gly Arg
145 150 155 160
Arg Thr Asn Val Glu Asp Leu Lys Arg Gln Trp Tyr Tyr Lys Phe Leu
165 170 175
Gln Arg Thr Val Leu Tyr His Ile Leu Thr Phe Gly Phe Leu Leu Tyr
180 185 190
Tyr Phe Gly Gly Leu Ser Phe Leu Thr Trp Gly Met Gly Ile Gly Val
195 200 205
Ala Met Glu His His Val Thr Cys Leu Ile Asn Ser Leu Cys His Val
210 215 220
Trp Gly Ser Arg Thr Trp Lys Thr Asn Asp Thr Ser Arg Asn Val Trp
225 230 235 240
Trp Leu Ser Val Phe Ser Phe Gly Glu Ser Trp His Asn Asn His His
245 250 255
Ala Phe Glu Ser Ser Ala Arg Gln Gly Leu Glu Trp Trp Gln Ile Asp
260 265 270
Ile Ser Trp Tyr Ile Val Arg Phe Leu Glu Ile Ile Gly Leu Ala Thr
275 280 285
Asp Val Lys Leu Pro Ser Glu Ser Gln Arg Arg Arg Met Ala Met Val
290 295 300
Arg
305
〈210〉 4
〈211〉 1807
〈212〉 DNA
〈213〉 Limnanthes douglasii
〈220〉
〈221〉 unsure
〈222〉 (302)..(303)
〈220〉
〈221〉 unsure
〈222〉 (312)
〈220〉
〈221〉 unsure
〈222〉 (315)
〈220〉
〈221〉 unsure
〈222〉 (421)
〈220〉
〈221〉 unsure
〈222〉 (1727)
〈400〉 4
ctcactctca cacctccttc tctctctttg tcggcttctc cggcgagata ctcaacggat 60
tcaatcgaag ggtagtacaa tatgtcggag acaaaacctg agaaaccttt gatcgcaacc 120
gtgaaaaaca cactacctga tttaaaacta tcaataaact taaaacacgt gaaactcggt 180
taccattacc tgatcaccca tggaatgtac ctgtgtctcc ctcctctcgc actagtcctc 240
ttcgctcaaa tctcaacttt gtccctcaaa gatttcaacg acatctggga acagcttcag 300
tnnaatctca tntcngtcgt tgtttcatca acacttcttg tctccttact tatcctttac 360
ttcatgactc gtccgaggcc ggtttatttg atggatttcg cgtgctataa acccgacgaa 420
nctcgaaaat ctactagaga acattttatg aagtgtggtg agagtttggg ctcttttacg 480
gaggataata tcgattttca gaggaaatta gtcgcacgat ctggacttgg tgatgctacg 540
tatttacctg aagctatcgg tactatcccg gctcatccgt cgatgaaagc tgcgagaaga 600
gaagctgagt tggtgatgtt tggtgcgatt gatcaacttt tggagaagac aaaggtgaat 660
ccgaaggata tagggatctt ggttgttaat tgcagcctgt ttagtccgac tccgtccctc 720
tcgtcgatga ttgttaacca ctataaactc cgtgggaaca ttataagcta caatctaggc 780
ggaatgggtt gcagtgctgg tttaatttcg gtcgacttag ctaaaagact tctcgagaca 840
aatccaaaca cttacgcttt agttatgagc actgaaaata tcacactaaa ctggtacatg 900
ggcaatgacc ggtccaaact cgtgtccaat tgtcttttcc ggatgggagg agctgcggtc 960
ttgttatcaa acaaaacctc tgataagaaa agatcgaagt atcagttggt tactaccgtc 1020
cgaagccaca aaggtgctga cgataattgc tacggttgca tattccaaga agaagactcc 1080
aacggcaaaa tcggtgtaag cctctccaaa aatctaatgg cggtcgcagg ggacgcgctt 1140
aagactaaca tcacgacgct tggtccgttg gttttaccaa tgtcggaaca acttttgttt 1200
ttcgccacgc tggttgctcg aaaagttttc aagaagaaaa ttaagcccta cattccggac 1260
tttaaactag cttttgatca tttctgtatt catgcgggtg gtcgagctgt tttggacgag 1320
cttgagaaga atttgcagtt gtcaagctgg catctagagc cgtcgagaat gacgtttatc 1380
cggtttggta atacgtcgag tagtactttg tggtacgagc tggcgtattc ggaagccaaa 1440
gggaggatta gaaaaggaga aagagtttgg cagatagggt ttggttctgg gtttaaatgt 1500
aatagtgctg tctggaaagc cttaaagagc gttgatccaa agaaagagaa caatccatgg 1560
atggatgaga tccaccagtt tccggttgct gttgtctaag gttgtgtttt gatgtttaat 1620
gtttggtgtg ttgatgcttg ctaattggtt agtgtaagaa gtacttggtt gctgctgttt 1680
caattactaa ctaaagagag tgttgaataa gcatagaaca aagtaantaa ctggaaagtg 1740
ctttgttgtt tgttcagtaa ctctattact gctgaatttc tctcaagaga agaattatgt 1800
ttaaaaa 1807
〈210〉 5
〈211〉 505
〈212〉 PRT
〈213〉 Limnanthes douglasii
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (74)
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (77)
〈220〉
〈221〉 UNSURE
〈222〉 (114)
〈400〉 5
Met Ser Glu Thr Lys Pro Glu Lys Pro Leu Ile Ala Thr Val Lys Asn
1 5 10 15
Thr Leu Pro Asp Leu Lys Leu Ser Ile Asn Leu Lys His Val Lys Leu
20 25 30
Gly Tyr His Tyr Leu Ile Thr His Gly Met Tyr Leu Cys Leu Pro Pro
35 40 45
Leu Ala Leu Val Leu Phe Ala Gln Ile Ser Thr Leu Ser Leu Lys Asp
50 55 60
Phe Asn Asp Ile Trp Glu Gln Leu Gln Xaa Asn Leu Xaa Ser Val Val
65 70 75 80
Val Ser Ser Thr Leu Leu Val Ser Leu Leu Ile Leu Tyr Phe Met Thr
85 90 95
Arg Pro Arg Pro Val Tyr Leu Met Asp Phe Ala Cys Tyr Lys Pro Asp
100 105 110
Glu Xaa Arg Lys Ser Thr Arg Glu His Phe Met Lys Cys Gly Glu Ser
115 120 125
Leu Gly Ser Phe Thr Glu Asp Asn Ile Asp Phe Gln Arg Lys Leu Val
130 135 140
Ala Arg Ser Gly Leu Gly Asp Ala Thr Tyr Leu Pro Glu Ala Ile Gly
145 150 155 160
Thr Ile Pro Ala His Pro Ser Met Lys Ala Ala Arg Arg Glu Ala Glu
165 170 175
Leu Val Met Phe Gly Ala Ile Asp Gln Leu Leu Glu Lys Thr Lys Val
180 185 190
Asn Pro Lys Asp Ile Gly Ile Leu Val Val Asn Cys Ser Leu Phe Ser
195 200 205
Pro Thr Pro Ser Leu Ser Ser Met Ile Val Asn His Tyr Lys Leu Arg
210 215 220
Gly Asn Ile Ile Ser Tyr Asn Leu Gly Gly Met Gly Cys Ser Ala Gly
225 230 235 240
Leu Ile Ser Val Asp Leu Ala Lys Arg Leu Leu Glu Thr Asn Pro Asn
245 250 255
Thr Tyr Ala Leu Val Met Ser Thr Glu Asn Ile Thr Leu Asn Trp Tyr
260 265 270
Met Gly Asn Asp Arg Ser Lys Leu Val Ser Asn Cys Leu Phe Arg Met
275 280 285
Gly Gly Ala Ala Val Leu Leu Ser Asn Lys Thr Ser Asp Lys Lys Arg
290 295 300
Ser Lys Tyr Gln Leu Val Thr Thr Val Arg Ser His Lys Gly Ala Asp
305 310 315 320
Asp Asn Cys Tyr Gly Cys Ile Phe Gln Glu Glu Asp Ser Asn Gly Lys
325 330 335
Ile Gly Val Ser Leu Ser Lys Asn Leu Met Ala Val Ala Gly Asp Ala
340 345 350
Leu Lys Thr Asn Ile Thr Thr Leu Gly Pro Leu Val Leu Pro Met Ser
355 360 365
Glu Gln Leu Leu Phe Phe Ala Thr Leu Val Ala Arg Lys Val Phe Lys
370 375 380
Lys Lys Ile Lys Pro Tyr Ile Pro Asp Phe Lys Leu Ala Phe Asp His
385 390 395 400
Phe Cys Ile His Ala Gly Gly Arg Ala Val Leu Asp Glu Leu Glu Lys
405 410 415
Asn Leu Gln Leu Ser Ser Trp His Leu Glu Pro Ser Arg Met Thr Phe
420 425 430
Ile Arg Phe Gly Asn Thr Ser Ser Ser Thr Leu Trp Tyr Glu Leu Ala
435 440 445
Tyr Ser Glu Ala Lys Gly Arg Ile Arg Lys Gly Glu Arg Val Trp Gln
450 455 460
Ile Gly Phe Gly Ser Gly Phe Lys Cys Asn Ser Ala Val Trp Lys Ala465 470 475 480
Leu Lys Ser Val Asp Pro Lys Lys Glu Asn Asn Pro Trp Met Asp Glu
485 490 495
Ile His Gln Phe Pro Val Ala Val Val
500 505
〈210〉 6
〈211〉 844
〈212〉 DNA
〈213〉 Limnanthes douglasii
〈400〉 6
acacgggcaa tgaccgatcg aaactcgtgt ctaattgtct tttccgtatg ggaggagctg 60
cggttttatt atcaaacaaa cattcggaca aaaaacgatc gaaataccag ttggttacta 120
ccgtccgaag ccacaaaggt gctgacgata attgctatgg ctgcatcttt caagaagagg 180
actcgactgg aataagtggt gtaagtctct cgaaaaatct aatggcagtc gcaggcgatg 240
cactcaagac aaacatcacg acgatcggtc cgttagtttt accaatgact gaacaacttt 300
tgtattttgc ctccttggtc ggccgaaata ttttcaaaat gaaaataaaa acctacgttc 360
ccgattttaa actcgccttc gagcatttct gtattcacgc aggtggtcga ggagtgttgg 420
acgcgctgga gaagaatttg cagttgtcgg agtggcatct tgagccatcg aggatgacgt 480
tgtaccgatt tggtaatacg tcgagtagta gtttatggta tgagctggcg tattcggaag 540
ccaaagggag aattaagaag ggagagaggg tttggcagat agggtttggt tcagggttta 600
agtgtaatag tgtggtttgg aaagcgctac ggacagtaga tccgaaggaa gagaataatc 660
cttggacgga tgagatccac cagtttccag ttgctgttgt ctgagtttat gttggatgtt 720
tgaagtaaac ttaatgtttt ggtctggtgt ccatgctgag attagtgcag caactctttt 780
gcgaaataat aaatgcttag aaactgtttt gttgtttaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840
aaaa 844
〈210〉 7
〈211〉 233
〈212〉 PRT
〈213〉 Limnanthes douglasii
〈400〉 7
Thr Gly Asn Asp Arg Ser Lys Leu Val Ser Asn Cys Leu Phe Arg Met
1 5 10 15
Gly Gly Ala Ala Val Leu Leu Ser Asn Lys His Ser Asp Lys Lys Arg
20 25 30
Ser Lys Tyr Gln Leu Val Thr Thr Val Arg Ser His Lys Gly Ala Asp
35 40 45
Asp Asn Cys Tyr Gly Cys Ile Phe Gln Glu Glu Asp Ser Thr Gly Ile
50 55 60
Ser Gly Val Ser Leu Ser Lys Asn Leu Met Ala Val Ala Gly Asp Ala
65 70 75 80
Leu Lys Thr Asn Ile Thr Thr Ile Gly Pro Leu Val Leu Pro Met Thr
85 90 95
Glu Gln Leu Leu Tyr Phe Ala Ser Leu Val Gly Arg Asn Ile Phe Lys
100 105 110
Met Lys Ile Lys Thr Tyr Val Pro Asp Phe Lys Leu Ala Phe Glu His
115 120 125
Phe Cys Ile His Ala Gly Gly Arg Gly Val Leu Asp Ala Leu Glu Lys
130 135 140
Asn Leu Gln Leu Ser Glu Trp His Leu Glu Pro Ser Arg Met Thr Leu
145 150 155 160
Tyr Arg Phe Gly Asn Thr Ser Ser Ser Ser Leu Trp Tyr Glu Leu Ala
165 170 175
Tyr Ser Glu Ala Lys Gly Arg Ile Lys Lys Gly Glu Arg Val Trp Gln
180 185 190
Ile Gly Phe Gly Ser Gly Phe Lys Cys Asn Ser Val Val Trp Lys Ala
195 200 205
Leu Arg Thr Val Asp Pro Lys Glu Glu Asn Asn Pro Trp Thr Asp Glu
210 215 220
Ile His Gln Phe Pro Val Ala Val Val
225 230
7

Claims (34)

  1. (a) 서열 2에 기재된 아미노산 서열 전체 또는 실질적인 부분을 코딩하는 단리된 핵산 단편;
    (b) 서열 2에 기재된 아미노산 서열 전체 또는 실질적인 부분을 코딩하는 단리된 핵산 단편과 실질적으로 유사한 단리된 핵산 단편; 및
    (c) (a) 또는 (b)에 상보적인 단리된 핵산 단편
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 단편을 포함하는, 델타-5 아실-CoA 디세츄라제 전체 또는 실질적인 부분을 코딩하는 단리된 핵산 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단편의 뉴클레오티드 서열이 서열 1에 기재된 서열 전체 또는 일부분을 포함하는 단리된 핵산 단편.
  3. 적합한 조절 서열에 기능적으로 연결된, 제1항에 기재된 핵산 단편을 포함하는 잡종 유전자.
  4. 제3항에 기재된 잡종 유전자를 포함하는 형질전환된 숙주 세포.
  5. 서열 2에 기재된 아미노산 서열 전체 또는 실질적인 부분을 포함하는 델타-5 아실-CoA 디세츄라제 폴리펩티드.
  6. (a) 서열 5 및 서열 7로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 기재된 아미노산 서열 전체 또는 실질적인 부분을 코딩하는 단리된 핵산 단편;
    (b) 서열 5 및 서열 7로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 기재된 아미노산 서열 전체 또는 실질적인 부분을 코딩하는 단리된 핵산 단편과 실질적으로 유사한 단리된 핵산 단편; 및
    (c) (a) 또는 (b)에 상보적인 단리된 핵산 단편
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 단편을 포함하는, 지방산 아실-CoA 일롱가제 전체 또는 실질적인 부분을 코딩하는 단리된 핵산 단편.
  7. 제6항에 있어서, 상기 단편의 뉴클레오티드 서열이 서열 4 및 서열 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 기재된 서열 전체 또는 일부분을 포함하는 단리된 핵산 단편.
  8. 적합한 조절 서열에 기능적으로 연결된 제6항에 기재된 핵산 단편을 포함하는 잡종 유전자.
  9. 제8항에 기재된 잡종 유전자를 포함하는 형질전환된 숙주 세포.
  10. 서열 5 및 서열 7로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 기재된 아미노산 서열 전체 또는 실질적인 부분을 포함하는 지방산 아실-CoA 일롱가제 폴리펩티드.
  11. (a) 숙주 세포를 제3 및 8항 중의 어느 한 항에 기재된 잡종 유전자로 형질전환시키는 단계, 및
    (b) 단계 (a)에서 생산된 형질전환된 숙주 세포를 잡종 유전자의 발현에 적합한 조건 하에서 생장시키는 단계
    를 포함하고, 이 때 잡종 유전자의 발현이 형질전환된 숙주 세포에서 지질 생합성에 관여하는 효소를 변화된 양으로 생산시키게 되는, 숙주 세포에서 지질 생합성에 관여하는 효소의 발현 정도를 변화시키는 방법.
  12. (a) 숙주 세포를 제3항에 기재된 잡종 유전자로 형질전환시키는 단계, 및
    (b) 단계 (a)에서 생산된 형질전환된 숙주 세포를 잡종 유전자의 발현에 적합한 조건 하에서 생장시키는 단계
    를 포함하고, 이 때 잡종 유전자의 발현이 델타-5 위치에 이중 결합을 포함하는 불포화된 지방산을 생산시키게 되는, 숙주 세포에서 델타-5 위치에 이중 결합을 포함하는 불포화된 지방산의 생산 방법.
  13. 종자가 델타-5 위치에 이중 결합을 포함하는 불포화된 지방산을 포함하는, 유지종자 작물로부터 얻은 종자.
  14. 제13항에 있어서, 상기 유지종자 작물이 대두인 종자.
  15. 오일이 델타-5 위치에 이중 결합을 포함하는 불포화된 지방산을 포함하는, 유지종자 작물의 종자로부터 얻은 오일.
  16. 제15항에 있어서, 상기 유지종자 작물이 대두인 오일.
  17. (a) 제3항에 기재된 잡종 유전자로 식물 세포를 형질전환시키는 단계,
    (b) 단계 (a)의 형질전환된 식물 세포로부터 얻은 수정된 식물을 생장시키는 단계,
    (c) 단계 (b)의 식물로부터 종자를 얻는 단계, 및
    (d) 단계 (c)의 종자를 가공하여 오일을 얻는 단계
    를 포함하는, 델타-5 위치에 이중 결합을 포함하는 불포화된 지방산을 포함하는 종자 오일의 생산 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 식물 세포가 유지종자 작물로부터 유도된 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 유지종자 작물이 대두인 방법.
  20. 제17항에 기재된 방법에 의해 생산된 종자 오일.
  21. (a) 제8항에 기재된 잡종 유전자로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계, 및
    (b) 단계 (a)에서 생산된 형질전환된 숙주 세포를 잡종 유전자의 발현에 적합한 조건 하에서 생장시키는 단계
    를 포함하고, 이 때 잡종 유전자의 발현이 제8항에 기재된 잡종 유전자로 형질전환되지 않은 숙주 세포에서의 16 탄소 지방산의 양과 비교하였을 때 형질전환된 숙주 세포에서의 16 탄소 지방산의 양을 감소시키게 되는, 숙주 세포에서 16 탄소 지방산의 양의 감소 방법.
  22. (a) 제8항에 기재된 잡종 유전자로 식물 세포를 형질전환시키는 단계,
    (b) 단계 (a)의 형질전환된 식물 세포로부터 얻은 수정된 식물을 생장시키는 단계,
    (c) 단계 (b)의 식물로부터 종자를 얻는 단계, 및
    (d) 단계 (c)의 종자를 가공하여 오일을 얻는 단계
    를 포함하고, 이 때, 오일이 제8항에 기재된 잡종 유전자로 형질전환되지 않은 식물 세포로부터 생장된 식물로부터 얻은 종자의 오일보다 적은 양의 16 탄소 지방산을 포함하는, 감소된 양의 16 탄소 지방산을 갖는 종자 오일의 생산 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 식물이 유지종자 작물인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 유지종자 작물이 대두인 방법.
  25. 제22항에 기재된 방법에 의해 생산된 종자 오일.
  26. (a) 제8항에 기재된 잡종 유전자로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계, 및
    (b) 단계 (a)에서 생산된 형질전환된 숙주 세포를 잡종 유전자의 발현에 적합한 조건 하에서 생장시키는 단계
    를 포함하고, 이 때 잡종 유전자의 발현이 제8항에 기재된 잡종 유전자로 형질전환되지 않은 숙주 세포에서의 20 탄소 지방산의 양과 비교하였을 때 형질전환된 숙주 세포에서의 20 탄소 지방산의 양을 증가시키게 되는, 숙주 세포에서 20 탄소 지방산의 양의 증가 방법.
  27. (a) 제8항에 기재된 잡종 유전자로 식물 세포를 형질전환시키는 단계,
    (b) 단계 (a)의 형질전환된 식물 세포로부터 얻은 수정된 식물을 생장시키는 단계,
    (c) 단계 (b)의 식물로부터 종자를 얻는 단계, 및
    (d) 단계 (c)의 종자를 가공하여 오일을 얻는 단계
    를 포함하고, 이 때, 오일이 제8항에 기재된 잡종 유전자로 형질전환되지 않은 식물 세포로부터 생장된 식물로부터 얻은 종자의 오일보다 많은 양의 20 탄소 지방산을 포함하는, 증가된 양의 20 탄소 지방산을 갖는 종자 오일의 생산 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 식물이 유지종자 작물인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 유지종자 작물이 대두인 방법.
  30. 제27항에 기재된 방법에 의해 생산된 종자 오일.
  31. (a) 제1 및 6항 중 어느 한 항에 기재된 핵산 단편으로 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 프로빙시키는 단계,
    (b) 제1 및 6항 중 어느 한 항에 기재된 핵산 단편과 혼성화되는 DNA를 동정하는 단계,
    (c) 단계 (b)에서 동정된 DNA 클론을 단리시키는 단계, 및
    (d) 단계 (c)에서 단리된 클론을 포함하는 cDNA 또는 게놈 단편을 서열화시키는 단계
    를 포함하고, 이 때 서열화된 핵산 단편이 지질 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 아미노산 서열 전체 또는 실질적인 부분을 코딩하는, 지질 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 아미노산 서열 전체 또는 실질적인 부분을 코딩하는 핵산 단편을 얻는 방법.
  32. (a) 서열 1, 4 및 6 중의 어느 하나에 기재된 서열의 일부분에 해당하는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 합성하는 단계, 및
    (b) 단계 (a)의 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 클로닝 벡터의 서열을 나타내는 프라이머를 사용하여 클로닝 벡터 중에 존재하는 cDNA 삽입물을 증폭시키는 단계
    를 포함하고, 이 때 증폭된 핵산 단편이 지질 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 아미노산 서열의 실질적인 부분을 코딩하는, 지질 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 아미노산 서열의 실질적인 부분을 코딩하는 핵산 단편을 얻는 방법.
  33. 제31항의 방법에 따라 얻어진 핵산 단편.
  34. 제32항의 방법에 따라 얻어진 핵산 단편.
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