JP2014087347A - イネの脂肪酸組成の改変 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】イネ植物の細胞内に存在するとき、ポリヌクレオチドを欠く細胞と比較して細胞内のFad2および/またはFatB発現の調節を遺伝的に改変することを通して達成する。
【選択図】なし
Description
する米油、米ぬかおよびイネ種子に関する。本発明はまた、生産される米油、米ぬかおよ
びイネ種子がオレイン酸、パルミチン酸および/またはリノール酸の変化したレベルを有
するようにイネ植物を遺伝的に改変するための方法を提供する。
の約25%を占める(Broun et al., 1999)。植物油の現在の世界生産量は年間約1億1千
万トンであり、そのうち86%がヒトの消費のために使用される。これらの油のほとんど
全部が脂肪種子作物、例えばダイズ、ナタネ、ヒマワリ、綿実および落花生、または栽培
樹木、例えばパーム、オリーブおよびココナツから得られる(Gunstone, 2001; Oil World
Annual, 2004)。ヒトの健康の様々な局面に対する食用油の個々の脂肪酸成分の影響につ
いての科学的理解と社会的認識の高まりは、様々な食品適用のための必要な機能性を保持
しながら改善された栄養価を有する改変植物油の開発を促している。これらの改変は、植
物脂肪酸合成に関する代謝経路およびこれらの経路のための酵素をコードする遺伝子につ
いての知識を必要とする(Liu et al., 2002a; Thelen and Ohlrogge, 2002)。
の影響には多大の関心が寄せられている。食事中の高レベルのコレステロールおよび飽和
脂肪酸は心疾患の危険度を上昇させると考えられ、これは、コレステロールに富む飽和動
物性脂肪の消費を抑え、コレステロール不含の不飽和植物油を推奨する栄養上の勧告を導
いた(Liu et al., 2002a)。
ベルを有意に上昇させ得るが、同時に、油脂を含む脂肪酸自体が血清コレステロールレベ
ルに有意の作用を及ぼし得ることも認められた。特に興味深いのは、血液中の望ましくな
い低密度リポタンパク質(LDL)および望ましい高密度リポタンパク質(HDL)形態
のコレステロールへの食事性脂肪酸の影響である。一般に、飽和脂肪酸、特に植物油中に
存在する主要飽和脂肪酸であるミリスチン酸(14:0)およびパルミチン酸(16:0
)は、血清中のLDL−コレステロールを上昇させ、その結果として心臓血管疾患の危険
度を上昇させるという望ましくない性質を有する(Zock et al., 1994; Hu et al., 1997)
。しかし、植物油中に存在するその他の主要飽和脂肪酸であるステアリン酸(18:0)
が、LDL−コレステロールを上昇させず、実際上総コレステロールを低下させ得ること
は広く確立されている(Bonanome and Grundy, 1988; Dougherty et al., 1995)。ステア
リン酸は、それ故、一般に心臓血管疾患の危険度に関して少なくとも中立とみなされてい
る(Tholstrup, et al., 1994)。他方で、不飽和脂肪酸、例えば一価不飽和オレイン酸(
18:1)および多価不飽和リノール酸(18:2)およびα−リノレン酸(ALA、1
8:3)は、LDL−コレステロールを低下させ(Mensink and Katan, 1989; Roche and
Gibney, 2000)、それによって心臓血管疾患の危険度を低減するという有益な性質を有す
る。
用、特にそれらが長期間にわたって高温と酸化条件に曝露される商業的なたっぷりの油に
よる揚げ物のためには使用できない。そのような条件下では、不飽和油中に存在する数多
くの炭素二重結合の酸化分解が短鎖アルデヒド、ヒドロペルオキシドおよびケト誘導体の
発生を生じさせ、極性化合物のレベルを上昇させることによって不快な風味を与え、油の
フライ性能を低下させる(Chang et al., 1978; Williams et al., 1999)。
に伝統的に水素化に頼っており、それによってフライ適用における酸化安定性を上昇させ
、同時にマーガリンおよびショートニングにおける使用のための固形脂肪を生成する。水
素化は、炭素二重結合を炭素一重結合に変換することによって油の不飽和度を低下させる
化学工程である。完全な水素化は十分に飽和した脂肪を生じる。しかし、部分水素化の工
程は飽和脂肪酸と一価不飽和脂肪酸の両方の高レベルを生じさせる。部分水素化の間に形
成される一価不飽和物の一部は、天然に生じるシス異性体ではなくトランス異性体形態(
エライジン酸、オレイン酸のトランス異性体など)である(Sebedio et al., 1994; Ferna
ndez San Juan, 1995)。シス不飽和脂肪酸と異なり、トランス脂肪酸は、現在では、血清
LDLコレステロールレベルを上昇させ(Mensink and Katan, 1990; Noakes and Clifton
, 1998)、血清HDLコレステロールレベルを低下させる(Zock and Katan, 1992)上でパ
ルミチン酸と同程度に強力であることが公知であり、それ故心臓血管疾患の高い危険度に
寄与する(Ascherio and Willett, 1997)。トランス脂肪酸の栄養阻害作用についての認識
の高まりの結果として、現在食品産業では硬化油の使用を避け、栄養的に有益であり、水
素化を必要とせずに必要な機能性を提供し得る油脂、特に液体油が必要とされるオレイン
酸若しくは固体または半固体脂肪が好ましいステアリン酸に富むものを支持する傾向が高
まりつつある。
は、グリセロール骨格にエステル化された3本の脂肪酸(アシル)鎖から成り、オレオソ
ームと呼ばれる特殊な油体構造内に沈着している(Stymne and Stobart, 1987)。これらの
貯蔵脂質は、光合成できるようになるまで発芽実生のためのエネルギー源として働く。通
常使用される食用植物油は、一般に5つの主要脂肪酸−飽和パルミチン酸およびステアリ
ン酸、一価不飽和オレイン酸、および多価不飽和リノール酸およびα−リノレン酸から成
る。脂肪酸に加えて、植物油はまた、いくつかの重要な微量成分、例えばトコフェロール
、フィトステロール、テルペンおよび混合イソプレノイドを含む。これらの微量成分は、
一部が皮膚の健康、加齢、視力および血中コレステロールに有益な作用を及ぼす、若しく
は乳癌または心臓血管疾患を予防することが示されたため、関心が高まりつつある(Theri
ault et al., 1999; Moghadasian and Frohlich, 1999)。
種子における脂肪酸およびTAG合成
発育中の種子における脂肪酸合成についての代謝経路の概略図を図1に示す。脂肪酸合
成の初期段階は細胞の色素体画分で起こり、そこで脂肪酸炭素鎖の合成がC2分子から開
始され、段階的な縮合工程を通して伸長されて、それにより付加的なC2炭素単位がマロ
ニル−ACPから伸長アシル鎖に付与される。この連続工程における最初の段階は、マロ
ニル−ACPとアセチル−CoAの縮合を含み、β−ケトアシルシンターゼIII(KA
SIII)酵素によって触媒される。その後の縮合工程はβ−ケトアシルシンターゼI(
KASI)によって触媒され、アシルキャリアータンパク質(ACP)に連結された飽和
C16アシル鎖、パルミトイル−ACPの最終的な形成をもたらす。色素体内での最終的
な伸長はβ−ケトアシルシンターゼII(KASII)によって触媒され、飽和C18ア
シル鎖、ステアロイル−ACPを形成する。不飽和化が起こるとき、最初の二重結合が色
素体内の可溶性酵素、ステアロイル−ACPΔ9−デサチュラーゼによってC18鎖のΔ
9位置に導入され、一価不飽和C18:1オレオイル−ACPを生成する。
に色素体内に保持されるか、またはアシルチオエステラーゼによってそれらのACPから
放出されて遊離脂肪酸を生成し、遊離脂肪酸はさらなる修飾および最終的なTAG分子へ
の組込みのためにサイトゾルへと輸送される。高等植物は、少なくとも2つの型のアシル
チオエステラーゼ、すなわち不飽和アシルACPであるオレオイルACPに対して基質特
異性を有するFatA、および飽和アシルACPに選択性を有するFatBを有すること
が認められた(Jones et al.. 1995; Voelker et al., 1996)。
スファチジン酸(LPA)、ホスファチジン酸(PA)およびホスファチジルコリン(P
C)を形成するためのグリセロール3−リン酸(G−3−P)骨格への転移のために使用
可能となる。加えて、一部の植物、特にアブラナ(Brassica)種では、CoAへとエステル
化されたオレイン酸はエイコサン酸(C20:1)およびエルカ酸(C22:1)を形成
するように伸長され得る。PCへとエステル化されたオレイン酸は、TAGへの組込みの
前にさらなる修飾のために使用可能となる。食用油では、PCへの主要な修飾は、それぞ
れミクロソームΔ12−デサチュラーゼ(Fad2)およびΔ15−デサチュラーゼ(F
ad3)酵素による、リノール酸およびα−リノレン酸を形成するオレイン酸の連続的不
飽和化である。
既存の脂肪酸生合成酵素の改変
遺伝子不活性化アプローチ、例えば転写後の遺伝子サイレンシング(PTGS)は、脂
肪酸生合成遺伝子を不活性化し、脂肪種子作物において栄養的に改善された植物油を生み
出すために適用されて成功を収めた。例えば種子油中に80%のオレイン酸を含むダイズ
系統が、Fad2がコードするミクロソームΔ12−デサチュラーゼの共抑制によって創
製された(Kinney, 1996)。これはΔ12不飽和化のレベルを低下させ、高い量のオレイン
酸の蓄積をもたらした。同様のアプローチを用いて、Fad2遺伝子の共抑制に基づくサ
イレンシングがバラシカ・ナパス(Brassica napus)およびB.ユンセア(B.juncea)に
おいてオレイン酸レベルを上昇させるために使用された(Stoutjesdijk et al., 2000)。
同様に、ナタネから得られるFad2遺伝子の突然変異型対立遺伝子の綿実におけるトラ
ンスジェニック発現は、内因性綿Fad2遺伝子の発現を抑制できることが認められ、一
次トランスジェニック綿系統の約半数において高いオレイン酸含量を生じさせた(Chapman
et al., 2001)。もう1つの変法では、自己切断リボザイムによって終結されるFad2
遺伝子のダイズにおけるトランスジェニック発現は、内因性Fad2遺伝子を不活性化す
ることができ、高いオレイン酸レベルを生じさせた(Buhr et al., 2002)。RNAiを介
した遺伝子サイレンシング手法はまた栄養的に改善された脂肪酸組成を有する脂肪種子を
開発するためにも用いられてきた。綿実において、綿Fad2遺伝子ファミリーの種子特
異的成員である、ghFad2−1を標的とするヘアピンRNA(hpRNA)遺伝子サ
イレンシング構築物のトランスジェニック発現は、正常レベルである油中の総脂肪酸の1
5%から77%までオレイン酸の上昇を生じさせた(Liu et al., 2002b)。この上昇は主
としてリノール酸を代償とするものであり、リノール酸は正常レベルの60%〜4%とい
う低レベルまで低下した。
穀物中の脂肪酸
脂肪種子における脂肪酸生合成と改変に関して為されてきた多大の研究に対し、穀物中
の油の改変は比較的検討されていない。これはおそらく穀粒中の油のレベルがはるかに低
いこと(約1.5〜6重量%)、そしてその結果として認識されているヒトの食事におけ
る穀物からの油の重要性がより低いことが原因である。
世界の総生産量の約90%を生産するアジアにおいて、広く生育されている。世界中のイ
ネの圧倒的大部分は、外側のぬか層と胚芽(胚および胚盤)を除去するための収穫した穀
物を摩砕することによって生産される、基本的に米粒の内乳である「白米」として食され
ている。これは主として、「玄米」が、特に暑い熱帯条件下では、貯蔵時に良好に保存で
きないために行われる。
る脂肪種子に比べて極めて低い(Ohlrogge and Jaworski, 1997)。しかし、脂質はそれで
も穀物胚の乾燥重量の37%までを構成し得る(Choudhury and Juliano 1980)。米粒の脂
質含量の大部分は外側ぬか層に認められる(Resurreccion et al., 1979)が、一部は内乳
にも存在し、少なくとも一部はデンプンと結合している(表1および2)。米油中の主た
る脂肪酸は、パルミチン酸(16:0)(TAG中の総脂肪酸の約20%)、オレイン酸
(18:1)(約40%)およびリノール酸(18:2)(約34%)である(Radcliffe
et al, 1997)。種々のイネ栽培品種において天然に生じるレベルは多様であり、例えば
オレイン酸については37.9%〜47.5%、リノール酸(18:2)については38
.2%〜30.4%である(Taira et al., 1988)。
oAに変換される、遊離パルミチン酸の生産を触媒することに高親和性を有することが示
されたが、イネまたは他の穀物におけるFatBの役割に関する情報は報告されていない
。
定されていない。Akagai et al., (1995)は、発育中の種子からステアロイルアシルキャ
リアータンパク質デサチュラーゼをコードするイネの4番染色体上の遺伝子のヌクレオチ
ド配列を公表した。その遺伝子産物は、ステアロイルACPからのオレオイルACPの生
産に関与する。Kodama et al. (1997)は、イネにおけるFad3の構造、染色体位置およ
び発現を報告した。
)の割合が10倍上昇した(Anai et al., 2003)。ごく最近、細菌からのリノール酸イソ
メラーゼ遺伝子の導入による、イネにおける共役リノール酸の生産が報告された(Kohno-M
urase et al., 2006);共役リノール酸は抗癌活性を有することが報告されている。同じ
ように、固定化した微生物酵素を使用して、一部の疾患において食事性脂質利用を改善し
得るカプリン酸を組み込むための米ぬか油のインビトロでの改変も報告された(Jennings
and Akoh, 2000)。トウモロコシでは、Fad2およびFA−6デサチュラーゼ遺伝子が
配列決定され、染色体にマップされた(Mikkilinen and Rocheford, 2003)。Fad2およ
びFad6クローンは、トウモロコシ穀粒中のオレイン酸/リノール酸比に関していかな
るQTLにもマップすることができなかった。イネ、トウモロコシまたはコムギから特性
決定された他のFad2またはFatB遺伝子について公表された報告はない。
イネの貯蔵
高温での長期間にわたるイネの貯蔵は、ぬか油の加水分解および酸化劣化のために穀物
の品質を低下させる。玄米を生産するために収穫の間に外側の殻を除去することは、外側
のぬか層を乱し、油を外層に拡散させる。次に内因性および微生物リパーゼがトリグリセ
リドの遊離脂肪酸(FFA)への加水分解を触媒し、その後FFAは酸化されて異臭を生
じる(Yasumatsu et al., 1966, Tsuzuki et al, 2004, Zhou et al, 2002 Champagne and
Grimm, 1995)。
主要成分である(Boggs et al., 1964, Shibuya et al., 1974, Tsugita et al., 1983)。
しかし、ヘキサナール自体は「異(off)」臭の主原因ではない;劣化した米の好ましく
ない臭いと風味は、おそらく貯蔵後に増加する揮発性物質の混合物によるものである。こ
れらは、アルカナール、アルケナール、芳香族アルデヒド、ケトン、2−ペンチルフラン
、4−ビニルフェノールその他を含む(Tsugita et al., 1983)。それにもかかわらず、貯
蔵の間のヘキサナールレベルは玄米中のリノール酸(18:2)の酸化に関連することが
示されており、それ故酸化劣化の良好な指標である(Shin et al., 1986)。
され得る(St Angelo et al., 1980)。Suzuki et al. (1999)は、Lox3を欠くイネ品種
を同定し、35℃で8週間の突然変異型穀物の貯蔵時に、生および調理済み玄米粒の両方
について上部空間の蒸気中でより少ないヘキサナールが形成されることを認めた。彼らは
また、突然変異型イネがより少ないペンタナールおよびペンタノールを形成することを認
めた。
物、例えばトコフェロールおよび植物エストロゲンでもあるγ−オリザノールを含有する
、優れた食物源である(Rukmini and Raghuram, 1991)。米ぬか油中に存在する生物活性化
合物は、ヒトにおいてコレステロールを低下させることが認められた(Most et al., 2005
)。これらの生物活性成分はまた、高コレステロール食を給餌したラットにおいて脂質プ
ロフィールを改善することも示されている(Ha et al., 2005)。主としてぬかにおいて認
められたもう1つの重要な成分はビタミンA前駆体である。しかし、これらの栄養および
健康上の恩恵は、米を研磨することおよび白米の消費を通して失われる。
改善された油組成を有する穀物を生産し、同時に貯蔵時により安定である穀物品種、例え
ばイネ品種に対する需要が現在も存在する。
ン酸、約30%未満のリノール酸および/またはそれらの任意の組合せを含む脂肪酸組成
を有する米油を提供する。
は2:1より多く、より好ましくは3:1より多く、さらに一層好ましくは4:1より多
い。
ルミチン酸および約30%未満のリノール酸を含む脂肪酸組成を有する。
より多くのオレイン酸、さらに一層好ましくは約60%より多くのオレイン酸を含む脂肪
酸組成を有する。1つの実施形態では、米油の脂肪酸組成は、48〜80%のオレイン酸
、6〜16%のパルミチン酸および10〜25%のリノール酸の範囲内である。
15%未満のパルミチン酸、より好ましくは約14%未満のパルミチン酸、より好ましく
は約13%未満のパルミチン酸、さらに一層好ましくは約12%未満のパルミチン酸を含
む脂肪酸組成を有する。
満のリノール酸、さらに一層好ましくは約15%未満のリノール酸を含む脂肪酸組成を有
する。
ミチン酸、約30%未満のリノール酸および/またはそれらの任意の組合せを含む脂肪酸
組成を有する米ぬかを提供する。
は2:1より多く、より好ましくは3:1より多く、さらに一層好ましくは4:1より多
い。
パルミチン酸および約30%未満のリノール酸を含む脂肪酸組成を有する。
%より多くのオレイン酸、さらに一層好ましくは約60%より多くのオレイン酸を含む脂
肪酸組成を有する。1つの実施形態では、米ぬかの脂肪酸組成は、48〜80%のオレイ
ン酸、6〜16%のパルミチン酸および10〜25%のリノール酸の範囲内である。
約15%未満のパルミチン酸、より好ましくは約14%未満のパルミチン酸、より好まし
くは約13%未満のパルミチン酸、さらに一層好ましくは約12%未満のパルミチン酸を
含む脂肪酸組成を有する。
未満のリノール酸、さらに一層好ましくは約15%未満のリノール酸を含む脂肪酸組成を
有する。
チン酸、約30%未満のリノール酸および/またはそれらの任意の組合せを含む脂肪酸組
成を有するイネ種子を提供する。
は2:1より多く、より好ましくは3:1より多く、さらに一層好ましくは4:1より多
い。
のパルミチン酸および約30%未満のリノール酸を含む脂肪酸組成を有する。
0%より多くのオレイン酸、さらに一層好ましくは約60%より多くのオレイン酸を含む
脂肪酸組成(すなわち種子の内部の油の)を有する。1つの実施形態では、イネ種子の脂
肪酸組成は、48〜80%のオレイン酸、6〜16%のパルミチン酸および10〜25%
のリノール酸の範囲内である。
は約15%未満のパルミチン酸、より好ましくは約14%未満のパルミチン酸、より好ま
しくは約13%未満のパルミチン酸、さらに一層好ましくは約12%未満のパルミチン酸
を含む脂肪酸組成を有する。
%未満のリノール酸、さらに一層好ましくは約15%未満のリノール酸を含む脂肪酸組成
を有する。
典型的には実施例1で述べるような油の抽出およびFAME/GCによる分析によって決
定される。個々の脂肪酸に関する組成は、油中の総脂肪酸のパーセント(w/w)として
表わされる。
を生産するイネ植物が提供される。
を欠く細胞と比較して細胞内のFad2および/またはFatBポリペプチドの活性のレ
ベルを下方調節する単離ポリヌクレオチドを提供する。
指令することができるプロモーターに作動可能に連結されている。
FatB遺伝子から発現されるmRNAレベルを下方調節する。
チド、触媒ポリヌクレオチド、マイクロRNA、Fad2またはFatBポリペプチドに
結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび二本鎖RNAから選択される
ポリヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。
25として提供されるヌクレオチドの配列の1またはそれ以上を含むポリヌクレオチドに
生理的条件下でハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチドである。
〜25として提供されるヌクレオチドの配列の1またはそれ以上を含むポリヌクレオチド
を切断することができる触媒ポリヌクレオチドである。
9〜25として提供されるヌクレオチドの配列の1またはそれ以上の少なくとも19個の
隣接ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含有する二本鎖RNA(dsRNA)分子
であり、二本鎖である分子の部分は、少なくとも19塩基対の長さであり、前記オリゴヌ
クレオチドを含有する。
個のプロモーターから発現される。そのようなdsRNA分子を生産するためのベクター
の構築の例を実施例5で述べる。
4または19〜25として提供されるヌクレオチドの配列の1またはそれ以上を含むポリ
ヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができる。
チドの活性のレベルを下方調節する候補ポリヌクレオチドの能力を測定すること、および
ii)細胞内のFad2および/またはFatBポリペプチドの活性のレベルを下方調
節したポリヌクレオチドを選択すること
を含む、イネ植物の細胞内に存在するとき、該ポリヌクレオチドを欠く細胞と比較して細
胞内のFad2および/またはFatBポリペプチドの活性のレベルを下方調節するポリ
ヌクレオチドを同定する方法を提供する。
酵素活性、若しくは細胞内のFad2および/またはFatBポリペプチドをコードする
mRNAの量を分析することに基づき得る。あるいは、工程i)は、細胞、若しくは前記
細胞を含む種子または植物の脂肪酸含量を分析することを含み得る。好ましくは、工程i
)は、候補ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む候補ポリヌクレ
オチドまたはキメラDNAの植物細胞への導入、より好ましくはイネ細胞への導入を含み
、さらに一層好ましくは、植物細胞からトランスジェニック植物を再生する工程およびト
ランスジェニック植物からの種子の生産を含む。候補遺伝子は、合計で少なくとも2また
は3つの、候補遺伝子の収集物の1つであり得る。本発明は、それ故、スクリーニング方
法における本発明のポリヌクレオチドの使用を提供する。
ポリヌクレオチド、マイクロRNA、Fad2またはFatBポリペプチドに結合するポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび二本鎖RNAであり得るが、これらに限
定されない。
または19〜25として提供されるヌクレオチドの配列の1またはそれ以上を含むポリヌ
クレオチドに生理的条件下でハイブリダイズする。
は19〜25として提供されるヌクレオチドの配列の1またはそれ以上を含むポリヌクレ
オチドを切断することができる。
14または19〜25として提供されるヌクレオチドの配列の1またはそれ以上の少なく
とも19個の隣接ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含有し、二本鎖である分子の
部分は、少なくとも19塩基対の長さであり、前記オリゴヌクレオチドを含有する。
ターを提供する。
ーターに作動可能に連結されている。好ましくは、プロモーターは、イネ植物の少なくと
も1つの他の組織または器官と比較してイネ植物の胚、内乳、ぬか層および/または種子
において選択的にポリヌクレオチドの発現を与える。
れる。
導入された。
ターを細胞に導入する工程を含む、本発明の細胞を生産する方法を提供する。
む。
の使用が提供される。
2および/またはFatB活性を有するポリペプチドの低発現を有する、遺伝的に改変さ
れたイネ植物を提供する。
その子孫植物を含むように形質転換されている。
タゴニストに曝露することを含む、本発明の米油、本発明の米ぬかおよび/または本発明
のイネ種子を生産する方法を提供する。
子におけるFad2および/またはFatBポリペプチドの活性および/または生産のレ
ベルが低下するように植物を遺伝的に操作することを含む、非改変玄米種子と比較したと
き長い貯蔵寿命を有する玄米種子を生産するために使用できる遺伝的に改変されたイネ植
物を得る方法を提供する。
のレベルは、植物の種子においてのみ低下する。
する。
本発明のベクターを含む。
ネ植物またはその子孫を提供する。
i)イネ種子またはイネ植物の突然変異誘発された集団をスクリーニングすること、お
よび
ii)本発明の米油、本発明の米ぬかおよび/または本発明のイネ種子を生産すること
ができる種子または植物を選択すること
を含む、本発明の米油、本発明に従った米ぬかおよび/または本発明のイネ種子を生産す
るために使用できるイネ植物を選択する方法を提供する。
d2またはFatB活性を有するポリペプチドに関して分析することを含む。
Fad2またはFatB遺伝子の配列および/または発現レベルを分析することを含む。
、ぬかおよび/または種子の脂肪酸組成を分析することを含む。
i)候補イネ植物から得られた米油、米ぬかおよび/または種子の脂肪酸含量を分析す
ること、および
ii)本発明の米油、本発明の米ぬかおよび/または本発明のイネ種子を生産するため
に使用できるイネ植物を選択すること
を含む、本発明の米油、本発明の米ぬかおよび/または本発明のイネ種子を生産するため
に使用できるイネ植物を選択する方法を提供する。
i)候補植物からの試料をFad2またはFatB活性を有するポリペプチドに関して
分析すること、および
ii)前記ポリペプチドの配列、生産のレベルおよび/または活性に基づき、本発明の
米油、本発明の米ぬかおよび/または本発明のイネ種子を生産するために使用できるイネ
植物を選択すること
を含む、本発明の米油、本発明の米ぬかおよび/または本発明のイネ種子を生産するため
に使用できるイネ植物を選択する方法を提供する。
i)候補植物のFad2またはFatB遺伝子の配列および/または発現レベルを分析
すること、および
ii)前記遺伝子の配列および/または発現レベルに基づき、本発明の米油、本発明の
米ぬかおよび/または本発明のイネ種子を生産するために使用できるイネ植物を選択する
こと
を含む、本発明の米油、本発明の米ぬかおよび/または本発明のイネ種子を生産するため
に使用できるイネ植物を選択する方法を提供する。
酸分子が、植物においてFad2遺伝子および/またはFatB遺伝子に連結されている
および/またはFad2遺伝子および/またはFatB遺伝子の少なくとも一部を含有す
る、本発明の米油、本発明の米ぬかおよび/または本発明のイネ種子を生産するために使
用できるイネ植物を同定する方法を提供する。
物においてFad2遺伝子および/またはFatB遺伝子に連結されているおよび/また
はFad2遺伝子および/またはFatB遺伝子の少なくとも一部を含有する、長い貯蔵
寿命を有する玄米種子を生産するために使用できるイネ植物を同定する方法を提供する。
i)前記植物から得られる前記核酸分子に2番目の核酸分子をハイブリダイズすること
、
ii)場合により前記植物から得られる前記核酸分子に少なくとも1つの他の核酸分子
をハイブリダイズすること、および
iii)前記ハイブリダイズ工程の産物または前記ハイブリダイズ工程からの産物の不
在を検出すること
を含む。
るまたは複製するためのプライマーとして使用される。
または核酸配列決定などの、しかしこれらに限定されない任意の手法を用いて検出するこ
とができる。
は遺伝子の発現レベルを分析する。
i)植物の穀粒の油においてオレイン酸の高い比率を与えるFad2対立遺伝子を含む
1番目の親イネ植物を、植物の穀粒の油においてパルミチン酸の低い比率を与えるFat
B対立遺伝子を含む2番目の親イネ植物と交配すること、
ii)交配からの子孫植物または穀粒を両方の対立遺伝子の存在に関してスクリーニン
グすること、および
iv)両方の対立遺伝子を含み、植物の穀粒の油においてオレイン酸の高い比率および
パルミチン酸の低い比率を有する子孫植物または穀粒を選択すること
を含む、イネ植物または種子を得る方法が提供される。
i)1番目の親イネ植物を、Fad2対立遺伝子を含む2番目の親イネ植物と交配する
こと、および
ii)工程i)の交配の子孫を、1番目の親植物と同じ遺伝子型の植物と、1番目の親
の遺伝子型の大部分を有するが前記対立遺伝子を含む植物を生産するために十分な回数だ
け戻し交配すること、
iii)1番目の植物の遺伝子型の大部分を有し、前記対立遺伝子を含む植物を選択す
ること
を含み、前記対立遺伝子が、植物の油、ぬかおよび/または種子においてオレイン酸の高
い比率を与える、Fad2対立遺伝子をイネ植物に導入する方法を提供する。
i)1番目の親イネ植物を、FatB対立遺伝子を含む2番目の親イネ植物と交配する
こと、および
ii)工程i)の交配の子孫を、1番目の親植物と同じ遺伝子型の植物と、1番目の親
の遺伝子型の大部分を有するが前記対立遺伝子を含む植物を生産するために十分な回数だ
け戻し交配すること、
iii)1番目の植物の遺伝子型の大部分を有し、前記対立遺伝子を含む植物を選択す
ること
を含み、前記対立遺伝子が、植物の油、ぬかおよび/または種子においてパルミチン酸の
低い比率を与える、FatB対立遺伝子をイネ植物に導入する方法を提供する。
ペプチドの生産が低下するようにイネ植物を遺伝的に操作することを含む、イネ植物の油
、ぬかおよび/または種子においてオレイン酸の比率を上昇させる方法が提供される。
を有するFatBポリペプチドの生産が低下するようにイネ植物を遺伝的に操作すること
を含む、イネ植物の油、ぬかおよび/または種子においてパルミチン酸の比率を低下させ
る方法を提供する。
a)本発明の植物を生育すること、および
b)種子を収穫すること
を含む、種子を生産する方法が提供される。
本発明のイネ種子を含む食品生産物を提供する。
品を調製する方法を提供する。
他の態様に適用できる。
る要素、整数または工程、若しくは要素、整数または工程の群の包含を示唆するが、他の
何らかの要素、整数または工程、若しくは要素、整数または工程の群の排除を示唆しない
ことが了解される。
。
照−すべてのエクソン配列および一部の隣接配列およびイントロン配列を含む)。
。
。
。
。
特に異なる定義が為されていない限り、本明細書で使用するすべての技術および学術用
語は、当業者(例えば細胞培養、植物分子生物学、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、
タンパク質化学および生化学における)によって一般的に理解されているのと同じ意味を
有すると解釈される。
免疫学的手法は、当業者に周知の標準手順である。そのような手法は、出典文献、例えば
J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J
. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour L
aboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Prac
tical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (e
ditors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 199
6), and F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, G
reene Pub. Associates and Wiley- Interscience(1988,現在までのすべての最新版を含
む), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Sp
ring Harbour Laboratory, (1988), and J.E. Coligan et al. (editors) Current Proto
cols in Immunology, John Wiley & Sons(現在までのすべての最新版を含む)全体を通
じて記述され、説明されている。
選択定義
本明細書で使用するとき、「Fad2ポリペプチド」という用語は、オレイン酸をリノ
ール酸に変換するデサチュラーゼ機能を実行するタンパク質を指す。それ故、「Fad2
活性」という用語は、オレイン酸のリノール酸への変換を表わす。これらの脂肪酸は、エ
ステル化形態、例えばリン脂質の一部であり得る。イネFad2ポリペプチドの例は、図
7および配列番号15〜18において提供されるアミノ酸配列を含むタンパク質、並びに
その変異体および/または突然変異体を包含する。そのような変異体および/または突然
変異体は、図7および配列番号15〜18において提供されるポリペプチドのいずれか1
つに少なくとも80%同一、より好ましくは少なくとも90%同一、より好ましくは少な
くとも95%同一、さらに一層好ましくは少なくとも99%同一であり得る。
コードする。Fad2ポリヌクレオチドの例は、図8または10および配列番号19〜2
5において提供されるヌクレオチド配列を含む核酸、並びにその対立遺伝子変異体および
/または突然変異体を包含する。Fad2遺伝子の例は、図8および配列番号19〜21
において提供されるヌクレオチド配列を含む核酸、並びにその対立遺伝子変異体および/
または突然変異体を包含する。そのような対立遺伝子変異体および/または突然変異体は
、図8および/または10および/または配列番号19〜25において提供されるポリヌ
クレオチドのいずれか1つに少なくとも80%同一、より好ましくは少なくとも90%同
一、より好ましくは少なくとも95%同一、さらに一層好ましくは少なくとも99%同一
であり得る。
CPを加水分解して遊離パルミチン酸を生成するタンパク質を指す。それ故、「FatB
活性」という用語は、遊離パルミチン酸を生成するパルミトイル−ACPの加水分解を指
す。イネFatBポリペプチドの例は、図2および配列番号1〜4において提供されるア
ミノ酸配列を含むタンパク質、並びにその変異体および/または突然変異体を包含する。
そのような変異体および/または突然変異体は、図2および配列番号1〜4において提供
されるポリペプチドのいずれか1つに少なくとも80%同一、より好ましくは少なくとも
90%同一、より好ましくは少なくとも95%同一、さらに一層好ましくは少なくとも9
9%同一であり得る。
コードする。FatBポリヌクレオチドの例は、図4および6および配列番号5〜8およ
び11〜14において提供されるヌクレオチド配列を含む核酸、並びにその対立遺伝子変
異体および/または突然変異体を包含する。FatB遺伝子の例は、図4および配列番号
5〜8において提供されるヌクレオチド配列を含む核酸、並びにその対立遺伝子変異体お
よび/または突然変異体を包含する。そのような対立遺伝子変異体および/または突然変
異体は、図4および/または6、および/または配列番号5〜8および11〜14におい
て提供されるポリヌクレオチド、のいずれか1つに少なくとも80%同一、より好ましく
は少なくとも90%同一、より好ましくは少なくとも95%同一、さらに一層好ましくは
少なくとも99%同一であり得る。
交配によって生産されるその子孫を含む、イネ属(Genus Oryza)のいずれかの種を指す
。植物は、商業的に栽培されるイネ種、例えばオリザ・サティバ(Oryza sativa)または
穀物の商業生産に適する株または栽培品種または品種であることが好ましい。
を含有する、イネ植物の種子/穀粒またはその部分、例えばぬか層から得られる組成物を
指す。米油は、典型的には室温で液体である。好ましくは、脂質は、少なくとも炭素数6
の長さである脂肪酸を含む。脂肪酸は、典型的にはエステル化形態で、例えばトリアシル
グリセロール、リン脂質として存在する。本発明の米油はオレイン酸を含む、本発明の米
油はまた、少なくともいくつかの他の脂肪酸、例えばパルミチン酸、リノール酸、ミリス
チン酸、ステアリン酸および/またはリノレン酸を含み得る。脂肪酸は、遊離脂肪酸であ
り得るおよび/またはトリアシルグリセロール(TAG)として存在し得る。1つの実施
形態では、本発明の米油中の脂肪酸の少なくとも50%、より好ましくは少なくとも70
%、より好ましくは少なくとも80%がTAGとして存在し得る。本発明の米油は、合わ
せて「米ぬか」と称される、イネの穀粒/種子またはその部分、例えばアリューロン層ま
たは胚/胚盤の一部を形成し得る。あるいは、本発明の米油は、イネの穀粒/種子または
米ぬかから抽出されたものである。そのような抽出手順の一例を実施例1で述べる。それ
故、1つの実施形態では、本発明の「米油」は、その天然状態で結合している1またはそ
れ以上の他の脂質、核酸、ポリペプチドまたは他の夾雑分子から分離された、「実質的に
精製された」または「精製された」米油である。実質的に精製された米油は、それが天然
に結合している他の成分を少なくとも60%含まない、より好ましくは少なくとも75%
含まない、より好ましくは少なくとも90%含まないことが好ましい。好ましい実施形態
では、抽出後、オレイン酸対リノール酸、パルミチン酸対オレイン酸および/またはパル
ミチン酸対リノール酸の比率は、無傷種子/穀粒またはぬか中の比率と比較したとき、有
意に変化しない(例えば5%以下の変化)。さらなる実施形態では、米油は、無傷種子/
穀粒またはぬか中の比率と比較したときオレイン酸対リノール酸、パルミチン酸対オレイ
ン酸および/またはパルミチン酸対リノール酸の比率を変化させ得る手順、例えば水素化
に供されていない。本発明の米油は、γ−オリザノールおよびステロールなどの、しかし
これらに限定されない非脂肪酸分子をさらに含み得る。
れは、典型的には非極性溶媒、例えばジエチルエーテル、石油エーテル、クロロホルム/
メタノールまたはブタノール混合物による抽出を含む。穀粒中のデンプンと結合した脂質
は、水飽和ブタノールで抽出され得る。米油は、多糖類を除去するために当分野で公知の
方法によって「脱ガム化(de-gummed)」され得るか、若しくは夾雑物を除去するためま
たは純度、安定性または色を改善するために他の方法で処理され得る。油中のトリアシル
グリセロールおよび他のエステルは、遊離脂肪酸を放出するために加水分解され得るか、
または油は、水素化され得るか若しくは当分野で公知のように化学的または酵素的に処理
され得る。
質の群を含む。本明細書で使用するとき、「γ−オリザノールを含む」とは、油中の少な
くとも0.1%(w/w)のγ−オリザノール化合物の存在を指す。抽出後およびTAG
からの除去前の米油中のγ−オリザノールのレベルは、典型的には1.5〜3.5%(w
/w)である。化合物は、典型的にはフェルラ酸(4−ヒドロキシ−3−メトキシケイ皮
酸)のステリルおよび他のトリテルペニルエステルの混合物である。シクロアルテニルフ
ェルレート、24−メチレンシクロアルタニルフェルレートおよびカンペステリルフェル
レートはオリザノール中の主要なフェルレートであり、より低いレベルのβ−シトステリ
ルフェルレートおよびスチグマステリルフェルレートを含む。γ−オリザノールの存在は
、米油の消費者を慢性疾患、例えば心疾患および癌から保護するのを助けると思われ、そ
れ故γ−オリザノールの存在は有益である。
穀粒の殻との間の層(アリューロン層)並びに穀粒の胚/胚盤を指す。米ぬかは、白米を
生成するための玄米の研磨の主要副産物である。
伝的に改変されていない)イネ植物から収穫された玄米と比較したとき、長期間にわたっ
て玄米として貯蔵できる種子/穀粒を生産する本発明の方法を指す。本明細書で述べるよ
うに、玄米の「長い貯蔵寿命」についての1つの評価尺度は、40℃で少なくとも8週間
の貯蔵後のヘキサナール産生である(実施例8参照)。
(胚、内乳および種皮を含む)、植物組織(例えば維管束組織、基本組織等)、細胞およ
びその子孫を含む。
、品種または栽培品種の野生型植物では認められない遺伝子構築物(「導入遺伝子」)を
含む植物を指す。本明細書で言及される「導入遺伝子」は、生物工学の分野における通常
の意味を有し、組換えDNAまたはRNA技術によって生産または変更され、植物細胞に
導入された遺伝子配列を含む。導入遺伝子は、植物細胞に由来する遺伝子配列を含み得る
。典型的には、導入遺伝子はヒトの操作によって、例えば形質転換によって植物に導入さ
れるが、当業者が認識するいかなる方法も使用され得る。
は、一般に成熟し、収穫された穀粒を指すが、文脈に従って吸水または発芽後の穀粒も意
味し得る。成熟穀粒は、一般に約18〜20%未満の含水率を有する。
「野生型」は、本明細書で使用するとき、本発明に従って改変されていない細胞、組織ま
たは植物を指す。野生型細胞、組織または植物は、本明細書で述べるように改変された細
胞、組織または植物と、外来性核酸の発現のレベルまたは形質改変の程度および性質を比
較するための対照として使用され得る。参照標準として適する野生型イネ品種は、日本晴
(Nipponbare)である。
メントを指す。二本鎖または一本鎖の、ゲノムまたは合成起源のDNAまたはRNAであ
り得、本明細書で定義される特定活性を実行するために炭水化物、脂質、タンパク質また
は他の物質と組合わされ得る。「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」という用語は、
本明細書では交換可能に使用される。
GCGプログラム)により、ギャップ生成ペナルティー=5、ギャップ伸長ペナルティー
=0.3で決定される。異なる記述がない限り、問い合わせ配列は少なくとも45ヌクレ
オチド長であり、GAP分析は少なくとも45ヌクレオチドの領域にわたって2つの配列
を並置する。好ましくは、問い合わせ配列は少なくとも150ヌクレオチド長であり、G
AP分析は少なくとも150ヌクレオチドの領域にわたって2つの配列を並置する。より
好ましくは、問い合わせ配列は少なくとも300ヌクレオチド長であり、GAP分析は少
なくとも300ヌクレオチドの領域にわたって2つの配列を並置する。さらに一層好まし
くは、GAP分析は、2つの配列をそれらの長さ全体にわたって並置する。
ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドという用語は重複する意味を有するが、オリ
ゴヌクレオチドは、典型的には比較的短い一本鎖分子である。そのようなオリゴヌクレオ
チドの最小の大きさは、標的核酸分子上でオリゴヌクレオチドと相補的配列の間での安定
な雑種の形成のために必要な大きさである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、少なく
とも15ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも18ヌクレオチド、より好ましくは少
なくとも19ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも20ヌクレオチド、さらに一層好
ましくは少なくとも25ヌクレオチドの長さである。
核酸分子のコピー数を増加させるための任意のインビトロ法を指す。核酸増幅は、DNA
分子またはプライマーへのヌクレオチドの組込みを生じさせ、それによってDNA鋳型に
相補的な新しいDNA分子を形成する。新たに形成されたDNA分子は、さらなるDNA
分子を合成するための鋳型として使用できる。
DNA)セグメントの間の機能的関係を指す。典型的には、転写配列に対する転写調節エ
レメント(プロモーター)の機能的関係を指す。例えばプロモーターは、適切な細胞にお
いてコード配列の転写を刺激するまたは調節する場合、コード配列、例えば本明細書で定
義されるポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。一般に、転写配列に作動可能に
連結されているプロモーター転写調節エレメントは、転写配列に物理的に隣接する、すな
わちそれらはシス作用性である。しかし、一部の転写調節エレメント、例えばエンハンサ
ーは、それらが転写を増強するコード配列に物理的に隣接するまたは近接して位置する必
要はない。
れるべきであり、構造遺伝子のタンパク質コード領域を含むデオキシリボヌクレオチド配
列を包含し、5’および3’末端の両方に関していずれかの末端で少なくとも約2kbの
距離にわたってコード領域に隣接して位置し、遺伝子の発現に関与する配列を包含する。
コード領域の5’側に位置し、mRNA上に存在する配列は、5’非翻訳配列と称される
。コード領域の3’側または下流に位置し、mRNA上に存在する配列は、3’非翻訳配
列と称される。「遺伝子」という用語は、cDNAおよびゲノム形態の遺伝子の両方を包
含する。遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」また
は「介在配列」と称される非コード領域で分断されていてもよいコード領域を含む。イン
トロンは、核内RNA(hnRNA)へと転写される遺伝子のセグメントである;イント
ロンは、調節エレメント、例えばエンハンサーを含み得る。イントロンは核または一次転
写産物から除去されるまたは「スプライシング」される;イントロンは、それ故、メッセ
ンジャーRNA(mRNA)転写産物中には存在しない。mRNAは、翻訳の間に新生ポ
リペプチドにおける配列またはアミノ酸の順序を規定するように機能する。「遺伝子」と
いう用語は、本明細書で述べる本発明のタンパク質の全部または部分をコードする合成ま
たは融合分子および上記のいずれかに相補的なヌクレオチド配列を包含する。
減数分裂において、例えばランダムではなく、それらが共に遺伝される染色体上の十分に
近接するマーカ遺伝子座と2番目の遺伝子座を指す。この定義は、マーカ遺伝子座と2番
目の遺伝子座が同じ遺伝子の部分を形成する状況を含む。さらに、この定義は、マーカ遺
伝子座が対象形質の原因となる多型を含む(言い換えるとマーカ遺伝子座が表現型に直接
「連鎖する」または「完全に連鎖する」)実施形態を包含する。もう1つの実施形態では
、マーカ遺伝子座と2番目の遺伝子座は、異なるが、50%より多い減数分裂において共
に遺伝される染色体上で十分に近接する。世代当たりの遺伝的に連鎖する遺伝子の間で認
められる組換えのパーセント(センチモルガン(cM))は50未満である。本発明の特
定実施形態では、遺伝的に連鎖する遺伝子座は、染色体上で45、35、25、15、1
0、5、4、3、2、1またはそれ以下のcMだけ離れ得る。好ましくは、マーカは5c
M未満離れていて、最も好ましくは、約0cM離れる。
えば遺伝子)を指し、特定形態は、遺伝子の配列内の少なくとも1、しばしば2以上の変
異部位の配列が同じ遺伝子の他の形態と異なる。異なる対立遺伝子の間で異なるこれらの
変異部位の配列は、「変異(variance)」、「多型」または「突然変異」と称される。
の遺伝子座の対立遺伝子の間でのヌクレオチド配列の変異を表わす。「多型位置」は、遺
伝子の配列内のあらかじめ選択されたヌクレオチド位置である。一部の場合、遺伝子多型
はアミノ酸配列の変異によって反映され、それ故多型位置は、ポリペプチドの配列内の所
定の位置にアミノ酸配列の多型の配置を生じさせ得る。また別の場合には、多型領域は、
遺伝子の非ポリペプチドコード領域内、例えば遺伝子の発現レベルに影響を及ぼし得るプ
ロモーター領域内であり得る。典型的な多型は、欠失、挿入または置換である。これらは
、1個のヌクレオチド(一塩基多型またはSNP)若しくは2またはそれ以上のヌクレオ
チドを含み得る。
アミノ酸基の付加によって修飾されていてもよくまたは修飾されていなくてもよい1本の
ポリペプチド鎖を指す。そのようなポリペプチド鎖が他のポリペプチドまたはタンパク質
または他の分子、例えば補因子と結合し得ることは了解される。本明細書で使用する「タ
ンパク質」および「ポリペプチド」という用語はまた、本明細書で述べる本発明のポリペ
プチドの変異型、突然変異型、修飾型、類似体および/または誘導体を包含する。
Gプログラム)により、ギャップ生成ペナルティー=5、ギャップ伸長ペナルティー=0
.3で決定される。問い合わせ配列は少なくとも25アミノ酸長であり、GAP分析は少
なくとも25アミノ酸の領域にわたって2つの配列を並置する。好ましくは、問い合わせ
配列は少なくとも50アミノ酸長であり、GAP分析は少なくとも50アミノ酸の領域に
わたって2つの配列を並置する。より好ましくは、問い合わせ配列は少なくとも100ア
ミノ酸長であり、GAP分析は少なくとも100アミノ酸の領域にわたって2つの配列を
並置する。さらに一層好ましくは、問い合わせ配列は少なくとも250アミノ酸長であり
、GAP分析は少なくとも250アミノ酸の領域にわたって2つの配列を並置する。さら
に一層好ましくは、GAP分析は、2つの配列をそれらの長さ全体にわたって並置する。
アンチセンスポリヌクレオチド
「アンチセンスポリヌクレオチド」という用語は、FatBまたはFad2ポリペプチ
ドをコードする特定mRNA分子の少なくとも一部に相補的であり、転写後事象、例えば
mRNA翻訳に干渉することができる、DNAまたはRNAまたはそれらの組合せの分子
を意味すると解釈されるべきである。アンチセンス法の使用は当分野において周知である
(例えばG. Hartmann and S. Endres, Manual of Antisense Methodology, Kluwer (1999
)参照)。植物におけるアンチセンス手法の使用は、Bourque, 1995 and Senior, 1998によ
って総説されている。Bourque, 1995は、アンチセンス配列が遺伝子不活性化の方法とし
て植物系においてどのように利用されてきたかについて数多くの例を列挙している。Bour
queはまた、部分阻害が系に測定可能な変化を生じさせる可能性がより高いので、酵素活
性の100%阻害を達成することは必要ないと考えられると述べている。Senior (1998)
は、アンチセンス法は現在、遺伝子発現を操作するための非常によく確立された手法であ
ると述べている。
イブリダイズする。本明細書で使用するとき、「生理的条件下でハイブリダイズするアン
チセンスポリヌクレオチド」という用語は、ポリヌクレオチド(完全なまたは部分的一本
鎖)が、細胞、好ましくはイネ細胞内の通常の条件下で、少なくともタンパク質をコード
するmRNA、例えば図2または7または配列番号1〜4または15〜18において提供
されるものと二本鎖ポリヌクレオチドを形成することができることを意味する。
御を生じさせる配列に対応する配列を含み得る。例えばアンチセンス配列は、本発明の遺
伝子の標的コード領域、若しくは5’非翻訳領域(UTR)または3’UTRまたはこれ
らの組合せに対応し得る。アンチセンス配列は、部分的に、転写の間または転写後のスプ
ライシングされ得るイントロン配列に相補的であり得、好ましくは標的遺伝子のエクソン
配列にのみ相補的であり得る。一般にUTRのより大きな相違を考慮して、これらの領域
を標的することは遺伝子阻害のより大きな特異性を提供する。
50ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも100、200、500または1000ヌ
クレオチドであるべきである。遺伝子転写産物全体に相補的な完全長配列が使用され得る
。長さは、最も好ましくは少なくとも100〜2000ヌクレオチドである。標的転写産
物に対するアンチセンス配列の同一性の程度は、少なくとも90%、より好ましくは95
〜100%であるべきである。アンチセンスRNA分子は、言うまでもなく、分子を安定
化するように機能し得る無関係な配列を含み得る。
触媒ポリヌクレオチド
触媒ポリヌクレオチド/核酸という用語は、個別の基質を特異的に認識し、この基質の
化学的修飾を触媒する、DNA分子またはDNA含有分子(当分野では「デオキシリボザ
イム」としても知られる)若しくはRNAまたはRNA含有分子(「リボザイム」として
も知られる)を指す。触媒核酸における核酸塩基は、A、C、G、T塩基(およびRNA
についてはU)であり得る。
酸切断性酵素活性(本明細書では「触媒ドメイン」とも称する)を含む。本発明において
特に有用なリボザイムの型は、ハンマーヘッド型リボザイム(Haseloff and Gerlach, 198
8; Perriman et al, 1992)およびヘアピン型リボザイム(Shippy et al, 1999)である。
いて化学合成することができる。リボザイムはまた、RNAポリメラーゼプロモーター、
例えばT7 RNAポリメラーゼまたはSP6 RNAポリメラーゼについてのプロモー
ターに作動可能に連結されたDNA分子(転写後、RNA分子を生じる)から調製し得る
。従って、本発明の触媒ポリヌクレオチドをコードする核酸分子、すなわちDNAまたは
cDNAも、本発明によって提供される。ベクターが、DNA分子に作動可能に連結され
たRNAポリメラーゼプロモーターを同時に含むとき、RNAポリメラーゼおよびヌクレ
オチドとのインキュベーション後にインビトロでリボザイムを生産することができる。別
の実施形態では、DNAを発現カセットまたは転写カセットに挿入し得る。合成後、リボ
ザイムを安定化し、RNアーゼに対して抵抗性にする能力を有するDNA分子への連結に
よってRNA分子を修飾し得る。
チドはまた、「生理的条件」下で、すなわち細胞内の条件(特にイネ細胞などの植物細胞
内の条件)下で標的核酸分子(例えば図2または7または配列番号1〜4または15〜1
8において提供されるポリペプチドをコードするmRNA)にハイブリダイズすることが
できるべきである。
RNA干渉
RNA干渉(RNAi)は、特定タンパク質の生産を特異的に阻害するために特に有用
である。理論に縛られるのは望むところではないが、Waterhouse et al.(1998)は、タン
パク質産生を低減するためにdsRNA(二本鎖RNA)が使用できる機構についてのモ
デルを提供した。この技術は、対象とする遺伝子またはその部分、この場合は本発明に従
ったポリペプチドをコードするmRNAと本質的に同一である配列を含むdsRNA分子
の存在に基づく。好都合には、dsRNAは、センスおよびアンチセンス配列が、センス
配列とアンチセンス配列がハイブリダイズして、無関係な配列とループ構造を形成するd
sRNA分子を形成することを可能にする、無関係な配列によって隣接されている、組換
えベクターまたは宿主細胞において1個のプロモーターから生産され得る。本発明のため
の適切なdsRNA分子の設計と生産は、特にWaterhouse et al.(1998),Smith et al. (
2000), 国際公開広報第99/32619号、同第99/53050号、同第99/49
029号および同第01/34815号を考慮して、十分に当業者の能力の範囲内である
。
本鎖のRNA産物の合成を指令するDNAを導入する。DNAは、それ故、RNAに転写
されたときに、二本鎖RNA領域を形成するようにハイブリダイズし得るセンスおよびア
ンチセンス配列の両方を含む。好ましい実施形態では、センス配列とアンチセンス配列は
、RNAに転写されたときスプラインシングされるイントロンを含む、スペーサー領域に
よって分離されている。この配置は遺伝子サイレンシングのより高い効率を生じさせるこ
とが示された。二本鎖領域は、1つのDNA領域または2つのDNA領域いずれかから転
写された、1または2個のRNA分子を含み得る。二本鎖分子の存在は、二本鎖RNAお
よびまた標的植物遺伝子からの相同なRNA転写産物の両方を破壊する内因性植物系から
の応答を誘因し、標的遺伝子の活性を効率よく低下させるまたは排除すると思われる。
隣接ヌクレオチド、好ましくは少なくとも30または50ヌクレオチド、より好ましくは
少なくとも100、200、500または1000ヌクレオチドであるべきである。遺伝
子転写産物全体に対応する完全長配列を使用し得る。長さは、最も好ましくは100〜2
000ヌクレオチドである。標的転写産物に対するセンスおよびアンチセンス配列の同一
性の程度は、少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは95〜1
00%であるべきである。RNA分子は、言うまでもなく、分子を安定化するように機能
し得る無関係な配列を含み得る。RNA分子は、RNAポリメラーゼIIまたはRNAポ
リメラーゼIIIプロモーターの制御下で発現され得る。後者の例は、tRNAまたはs
nRNAプロモーターを含む。
の隣接ヌクレオチドに同一であるヌクレオチド配列を含む。好ましくは、標的mRNA配
列は、ジヌクレオチドAAから始まり、約30〜70%(好ましくは30〜60%、より
好ましくは40〜60%、より好ましくは45〜55%)のGC含量を含み、例えば標準
BLAST検索によって測定したとき、それが導入される植物(好ましくはイネ)のゲノ
ムにおいて標的以外のいかなるヌクレオチド配列にも高い同一性パーセンテージを有さな
い。
Fad2について)および配列番号74〜83(FatBについて)の1またはそれ以上
において提供される配列を含むものを包含する。
マイクロRNA
マイクロRNAの調節は、従来のRNAi/PTGSから枝分かれした、遺伝子調節へ
と進化するRNAサイレンシング経路の明らかに特殊な部門である。マイクロRNAは、
特徴的な逆方向反復配列に構成された遺伝子様エレメントにおいてコードされる特定のク
ラスの低分子RNAである。転写されたとき、マイクロRNA遺伝子は、マイクロRNA
がその後そこからプロセシングされるステムループ状の前駆体RNAを生じさせる。マイ
クロRNAは、典型的には約21ヌクレオチド長である。放出されたmiRNAは、配列
特異的遺伝子抑制を及ぼすArgonauteタンパク質の特定サブセットを含むRIS
C様複合体に組み込まれる(例えばMillar and Waterhouse, 2005; Pasquinelli et al,
2005; Almeida and Allshire, 2005参照)。
共抑制
使用し得るもう1つの分子生物学的アプローチは共抑制である。共抑制の機構は十分に
は理解されていないが、転写後遺伝子サイレンシング(PTGS)を含むと思われ、それ
に関してはアンチセンス抑制の多くの例と非常に類似し得る。余分なコピーの遺伝子また
はそのフラグメントを、その発現のためにプロモーターに対してセンス方向で植物に導入
することを含む。センスフラグメントの大きさ、標的遺伝子領域に対するその対応度およ
び標的遺伝子との配列同一性の程度は、アンチセンス配列に関して上述した通りである。
一部の場合、追加コピーの遺伝子配列は標的植物遺伝子の発現に干渉する。共抑制アプロ
ーチを実行する方法については、国際公開広報第97/20936号および欧州特許第0
465572号参照。
核酸ハイブリダイゼーション
1つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドまたはその鎖は、配列番号5〜8、1
1〜14または19〜25として提供されるヌクレオチドの配列の1またはそれ以上のい
ずれかを含むポリヌクレオチドに生理的条件下でハイブリダイズする。さらなる実施形態
では、本発明のポリヌクレオチドまたはその鎖はまた、配列番号5〜8、11〜14また
は19〜25として提供されるヌクレオチドの配列の1またはそれ以上のいずれかを含む
ポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズする。
、プローブ、プライマーおよび/またはオリゴヌクレオチドがその標的配列にハイブリダ
イズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェント条件は配
列依存的であり、種々の状況において異なる。より長い配列は、短い配列よりも高温で特
異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェント条件は、規定されたイオン強度お
よびpHで特定配列についての熱融点(Tm)より約5℃低いように選択される。Tmは
、標的配列に相補的なプローブの50%が平衡で標的配列にハイブリダイズする温度(規
定されたイオン強度、pHおよび核酸濃度下で)である。標的配列は一般に過剰に存在す
るので、Tmでは、プローブの50%が平衡で占有される。典型的には、ストリンジェン
ト条件は、塩濃度が約1.0M未満のナトリウムイオン、典型的にはpH7.0〜8.3
で約0.01〜1.0Mのナトリウムイオン(または他の塩)であり、温度は、短いプロ
ーブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチド(例えば10ヌクレオチド〜50ヌクレオチ
ド)については少なくとも約30℃、より長いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレ
オチドについては少なくとも約60℃である。ストリンジェント条件はまた、不安定化剤
、例えばホルムアルデヒドの添加によっても達成され得る。
ocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6、並びに
本明細書で述べる実施例に認められる。好ましくは、条件は、互いに少なくとも約65%
、70%、75%、85%、90%、95%、98%または99%相同な配列が、典型的
には互いにハイブリダイズしたままである条件である。ストリンジェントハイブリダイゼ
ーション条件の非限定的な例は、65℃で6×SSC、50mMトリス−HCl(pH7
.5)、1mM EDTA、0.02% PVP、0.02% Ficoll、0.02%
BSA、および500mg/ml変性サケ精子DNAを含む高塩濃度緩衝液中でのハイブ
リダイゼーション、次いで50℃で0.2.×SSC、0.01% BSA中で1回また
はそれ以上の洗浄である。もう1つの実施形態では、中ストリンジェンシーの条件下で、
配列番号5〜8、11〜14または19〜25のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイ
ブリダイズし得る核酸配列が提供される。中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション
条件の非限定的な例は、55℃で6×SSC、5×デンハルト溶液、0.5% SDSお
よび100mg/ml変性サケ精子DNA中でのハイブリダイゼーション、次いで37℃
で1×SSC、0.1% SDS中での1回またはそれ以上の洗浄である。使用し得る中
ストリンジェンシーの他の条件は当分野において周知であり、例えばAusubel et al. (su
pra), and Kriegler, 1990; Gene Transfer And Expression, A Laboratory Manual, Sto
ckton Press, NY参照。さらにもう1つの実施形態では、低ストリンジェンシーの条件下
で、配列番号5〜8、11〜14または19〜25のヌクレオチド配列を含む核酸分子に
ハイブリダイズし得る核酸が提供される。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション
条件の非限定的な例は、40℃で35%ホルムアミド、5×SSC、50mMトリス−H
Cl(pH7.5)、5mM EDTA、0.02% PVP、0.02% Ficoll
、0.2% BSA、100mg/ml変性サケ精子DNA、10%(wt/vol)硫
酸デキストラン中でのハイブリダイゼーション、次いで50℃で2×SSC、25mMト
リス−HCl(pH7.4)、5mM EDTA、および0.1% SDS中での1回また
はそれ以上の洗浄である。使用し得る低ストリンジェンシーの他の条件は当分野において
周知であり、例えばAusubel et al. (supra) and Kriegler, 1990, Gene Transfer And E
xpression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY、並びに本明細書で提供する実施
例参照。
核酸構築物、ベクターおよび宿主細胞
本発明は、対応する非改変植物と比較してFad2および/またはFatB活性を有す
るポリペプチドの低発現を有する、遺伝的に改変されたイネ植物の生産を含む。
容易に作製することができる。
らのイントロン配列は、植物における導入遺伝子の発現を助け得る。「イントロン」とい
う用語は、転写されるがタンパク質をコードせず、翻訳の前にRNAからスプライシング
される遺伝子セグメントを意味するものとして、その通常の意味で使用される。イントロ
ンは、5’−UTRまたは導入遺伝子が翻訳産物をコードする場合はコード領域内、また
は導入遺伝子が翻訳産物をコードしない場合は転写領域内のどこかに組み込まれ得る。し
かし、好ましい実施形態では、いずれのポリペプチドコード領域も1つのオープンリーデ
ィングフレームとして提供される。当業者が認識するように、そのようなオープンリーデ
ィングフレームは、ポリペプチドをコードするmRNAを逆転写することによって入手で
きる。
、典型的には1またはそれ以上の調節エレメント、例えばプロモーター、エンハンサー、
並びに転写終結配列またはポリアデニル化配列を含む。このようなエレメントは当分野に
おいて周知である。
提供し得る。好ましくは、発現は、少なくとも胚、内乳、ぬか層、発育中の種子および/
または成熟種子(穀粒)の細胞において起こる。代替的実施形態では、調節エレメントは
、種子細胞に特異的でないプロモーター(例えばユビキチンプロモーターまたはCaMV
35Sまたは増強35Sプロモーター)であり得る。
モーター(Colot et al, 1987)、コムギ種子においてα−アミラーゼを発現するプロモー
ター(Stefanov et al., 1991)、およびホルデインプロモーター(Brandt et al., 1985)を
含むが、これらに限定されない。
成的発現のための適切なプロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)3
5Sプロモーター、ゴマノハグサ(Figword)モザイクウイルス(FMV)35S、サト
ウキビバシリフォームウイルスプロモーター、ツユクサ(commelina)黄色斑紋ウイルス
プロモーター、リブロース−1,5−ビス−リン酸カルボキシラーゼの小さなサブユニッ
トからの光誘導性プロモーター、イネサイトゾルトリオースリン酸イソメラーゼプロモー
ター、シロイヌナズナ(Arabidopsis)のアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼプ
ロモーター、イネアクチン1遺伝子プロモーター、マンノピンシンターゼおよびオクトピ
ンシンターゼプロモーター、Adhプロモーター、スクロースシンターゼプロモーター、
R遺伝子複合体プロモーター、およびクロロフィルα/β結合タンパク質遺伝子プロモー
ターを含むが、これらに限定されない。これらのプロモーターは、植物において発現され
るDNAベクターを創製するために使用されてきた;例えばPCT国際公開広報第WO8
402913号参照。これらのプロモーターはすべて、様々な型の植物発現性組換えDN
Aベクターを創製するために使用されてきた。
節エレメントは発現される遺伝子配列の5’側に与えられる。構築物はまた、転写を増強
する他のエレメント、例えばnos3’またはocs3’ポリアデニル化領域または転写
ターミネーターを含み得る。
めに選択されたプロモーターから誘導され得、所望する場合は、mRNAの翻訳を上昇さ
せるために特異的に修飾され得る。導入遺伝子の発現を最適化することの総説については
、Koziel et al. (1996)参照。5’非翻訳領域はまた、植物ウイルスRNA(中でも特に
、タバコモザイクウイルス、タバコエッチウイルス、トウモロコシドワーフモザイクウイ
ルス、アルファルファモザイクウイルス)から、適切な真核生物遺伝子、植物遺伝子(コ
ムギおよびトウモロコシクロロフィルa/b結合タンパク質遺伝子リーダー)から、また
は合成遺伝子配列から入手できる。本発明は、非翻訳領域が、プロモーター配列を伴う5
’非翻訳配列に由来する構築物に限定されない。リーダー配列はまた、無関係なプロモー
ターまたはコード配列に由来し得る。本発明に関して有用なリーダー配列は、トウモロコ
シHsp70リーダー(米国特許第5,362,865号および米国特許第5,859,
347号)およびTMVオメガエレメントを含む。
非翻訳DNA配列によって達成される。組換えDNA分子の3’非翻訳領域は、植物にお
いてRNAの3’末端にアデニル酸ヌクレオチドの付加を生じさせるように機能するポリ
アデニル化シグナルを含む。3’非翻訳領域は、植物細胞において発現される様々な遺伝
子から入手できる。ノパリンシンターゼ3’非翻訳領域、エンドウマメ小サブユニットル
ビスコ遺伝子、ダイズ7S種子貯蔵タンパク質遺伝子からの3’非翻訳領域がこの役割に
おいて一般的に使用される。アグロバクテリウム腫瘍誘導性(Ti)プラスミド遺伝子の
ポリアデニル酸シグナルを含む3’転写・非翻訳領域も適切である。
換された植物または細胞の同定とスクリーニングに役立つ。選択マーカ遺伝子は、イネ細
胞に抗生物質または除草剤耐性を提供し得るか、またはマンノースのような基質の利用を
可能にし得る。選択マーカは、好ましくはイネ細胞にハイグロマイシン耐性を付与する。
がゲノムに組み込まれることを可能にする適切なエレメントを含むか、または構築物は、
植物細胞の染色体に組み込まれ得る適切なベクター内に位置する。
クターに挿入された、少なくとも1つの本発明のポリヌクレオチド分子を含む組換えベク
ターを包含する。そのようなベクターは、天然では本発明の核酸分子に隣接して認められ
ない核酸配列であり、好ましくはその核酸分子が由来する種以外の種に由来する、異種核
酸配列を含む。ベクターは、原核生物または真核生物のRNAまたはDNAのいずれかで
あり得、典型的にはウイルスまたはプラスミドである。
多くのベクターが、例えばPouwels et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 198
5, supp. 1987; Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Aca
demic Press, 1989; and Gelvin et al, Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Acad
emic Publishers, 1990に述べられている。典型的には、植物発現ベクターは、例えば5
’および3’調節配列の転写制御下にある1またはそれ以上のクローニングされた植物遺
伝子および優性選択マーカを含む。そのような植物発現ベクターはまた、プロモーター調
節領域(例えば誘導的または構成的に、環境的または発生的に調節された、若しくは細胞
特異的または組織特異的な発現を制御する調節領域)、転写開始部位、リボソーム結合部
位、RNAプロセシングシグナル、転写終結部位、および/またはポリアデニル化シグナ
ルを含み得る。
れた宿主細胞を含む組換え細胞を包含する。細胞への核酸分子の形質転換は、核酸分子を
細胞に挿入することができるいかなる方法によっても達成され得る。形質転換手法は、ト
ランスフェクション、電気穿孔、微量注入、リポフェクション、吸着およびプロトプラス
ト融合を含むが、これらに限定されない。組換え細胞は、単細胞のままであり得るかまた
は組織、器官または多細胞生物へと増殖し得る。本発明の形質転換核酸分子は、染色体外
のままであり得るかまたはそれらの発現されるべき能力が保持されるように形質転換(す
なわち組換え)細胞の染色体内の1またはそれ以上の部位に組み込まれ得る。好ましい宿
主細胞は、植物細胞、より好ましくは穀物用植物の細胞、さらに一層好ましくはイネ細胞
である。
トランスジェニック植物
トランスジェニックイネ(本明細書では遺伝的に改変されたイネとも称する)は、当分
野で公知の手法、例えばA. Slater et al., Plant Biotechnology-The Genetic Manipula
tion of Plants, Oxford University Press (2003), and P. Christou and H. Klee, Han
dbook of Plant Biotechnology, John Wiley and Sons (2004)において一般的に述べられ
ている手法を用いて生産できる。
関して分離しないように、導入されたありとあらゆるポリヌクレオチド(導入遺伝子)に
ついてホモ接合である。トランスジェニック植物はまた、例えば雑種種子から成長したF
1子孫においては、導入された導入遺伝子に関してヘテロ接合であり得る。そのような植
物は、当分野で周知の雑種強勢のような利点を提供し得る。
的方法(Graham et al., 1973);(2)物理的方法、例えば微量注入(Capecchi, 1980);
電気穿孔(例えば国際公開広報第87/06614号、米国特許第5,472,869号
、同第5,384,253号、国際公開広報第92/09696号および同第93/21
335号参照);および遺伝子銃(例えば米国特許第4,945,050および米国特許
第5,141,131号参照);(3)ウイルスベクター(Clapp, 1993; Lu et al, 1993
; Eglitis et al., 1988);および(4)受容体を介した機構(Curiel et al., 1992; Wag
ner et al, 1992)。
)等を含む。形質転換核酸分子を植物細胞に送達するための方法の一例は微粒子銃である
。本方法は、Yang et al., Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, Oxfo
rd Press, Oxford, England (1994)によって総説されている。非生物学的粒子(微粒子)
を核酸で被覆し、推進力によって細胞内に送達し得る。例示的な粒子は、タングステン、
金、白金等からなるものを含む。微粒子銃の特別の利点は、単子葉植物を再現可能に形質
転換する有効な手段であることに加えて、プロトプラストの単離またはアグロバクテリウ
ム感染の感受性のいずれも必要としないことである。加速によってDNAをトウモロコシ
(Zea mays)細胞に送達するための方法の例示的な実施形態は、スクリーン、例えばステ
ンレス鋼またはNytexスクリーンを通して、懸濁培養したトウモロコシ細胞で覆った
フィルター表面に、DNAで被覆した粒子を推進するために使用できる、バイオリスティ
ックα−粒子送達システム(a biolistics α-particle delivery system)である。本発
明と共に使用するのに適した粒子送達システムは、Bio−Rad Laborator
iesから入手可能なヘリウム加速PDS−1000/He銃である。
。打ち込む細胞を含むフィルターをマイクロプロジェクタイル停止プレートの下方の適切
な距離に位置づける。所望する場合は、1またはそれ以上のスクリーンを銃と打ち込む細
胞の間に配置する。
イクロプロジェクタイル停止プレートの下方の適切な距離に位置づける。所望する場合は
、1またはそれ以上のスクリーンを加速装置と打ち込む細胞の間に配置する。本明細書で
述べる手法の使用を通して、マーカ遺伝子を一過性に発現している細胞の1000までま
たはそれ以上の増殖巣を得ることができる。打ち込みの48時間後に外来性遺伝子産物を
発現する増殖巣中の細胞数は、しばしば1〜10の範囲であり、平均すると1〜3である
。
条件および打ち込みのパラメーターを最適化し得る。打ち込みに関する物理的および生物
学的パラメーターの両方がこの技術において重要である。物理的因子は、DNA/マイク
ロプロジェクタイル沈降物の操作に関与するもの若しくはマクロプロジェクタイルまたは
マイクロプロジェクタイルのいずれかの飛行および速度に影響を及ぼすものである。生物
学的因子は、打ち込みの前および打ち込み直後の細胞の操作に関わるすべての工程、打ち
込みに伴う損傷を軽減するのに役立つ標的細胞の浸透圧調整、およびまた形質転換DNA
の性質、例えば線状DNAまたは無傷のスーパーコイル状プラスミドを含む。打ち込み前
の操作は、未熟胚の形質転換を成功させるために特に重要であると考えられる。
における色素体形質転換のための開示されている方法は、選択マーカを含むDNAのパー
ティクルガン送達および相同的組換えを通しての色素体ゲノムへのDNAのターゲティン
グを含む(米国特許第5,451,513号、同第5,545,818号、同第5,87
7,402号、同第5,932479号および国際公開広報第99/05265号)。
態様を調整することが望ましいと考えられる。物理的パラメーター、例えばギャップ距離
、飛行距離、組織距離およびヘリウム圧を調整することが特に望ましい。また、受容細胞
の生理的状態に影響を及ぼし、それ故形質転換および組込み効率に影響を及ぼし得る条件
を改変することにより、損傷軽減因子(trauma reduction factors)を最小限に抑え得る
。例えば受容細胞の浸透圧状態、組織の水和および継代培養段階または細胞周期を最適形
質転換のために調整し得る。他の常套的な調整の実施は、本開示に照らして当業者に理解
される。
でき、それによりプロトプラストから無傷植物を再生させる必要を回避できることから、
遺伝子を植物細胞に導入するための広く適用できるシステムである。DNAを植物細胞に
導入するための、アグロバクテリウムを介した植物組込みベクターの使用は、当分野にお
いて周知である(例えば米国特許第5,177,010号、同第5,104,310号、
同第5,004,863号、同第5,159,135号参照)。さらに、T−DNAの組
込みは、再配列をほとんど生じさせない比較的正確な工程である。導入するDNAの領域
は境界配列によって規定され、介在DNAが、通常、植物ゲノムに挿入される。
いて複製が可能であり、記述されている(Klee et al, In: Plant DNA Infectious Agents
, Hohn and Schell, eds., Springer- Verlag, New York, pp. 179-203 (1985))ように好
都合な操作を可能にする。さらに、アグロバクテリウムを介した遺伝子導入のためのベク
ターにおける技術的進歩は、ベクター内の遺伝子および制限部位の配置を改善し、様々な
ポリペプチドコード遺伝子を発現することができるベクターの構築を容易にした。記述さ
れているベクターは、挿入されたポリペプチドコード遺伝子の直接発現のためにプロモー
ターとポリアデニル化部位によって隣接された好都合なマルチリンカー領域を有し、本発
明の目的に適する。加えて、アームドおよびディスアームドTi遺伝子の両方を含むアグ
ロバクテリウムを形質転換のために使用できる。アグロバクテリウムを介した形質転換が
効率的である植物品種では、遺伝子導入の容易で明確な性質のために選択される方法であ
る。
には1つの染色体上に単一遺伝子座を含む。そのようなトランスジェニック植物は、付加
された遺伝子についてヘミ接合であると称され得る。付加された構造遺伝子についてホモ
接合であるトランスジェニック植物、すなわち、染色体対の各々の染色体上の同じ遺伝子
座に1個ずつ、2個の付加遺伝子を含むトランスジェニック植物がより好ましい。ホモ接
合トランスジェニック植物は、1個の付加遺伝子を含む独立した分離個体であるトランス
ジェニック植物を雌雄交配(自殖)させ、生成された種子の一部を発芽させて、生じた植
物を対象遺伝子に関して分析することによって入手できる。
ンスジェニック植物も交配できることが了解される。適切な子孫の自殖は、両方の外来性
遺伝子についてホモ接合である植物を生産することができる。親植物への戻し交配および
非トランスジェニック植物との他殖も、栄養繁殖と同様に、考慮される。種々の形質およ
び作物について一般的に使用される他の交配方法に記述は、Fehr, In: Breeding Methods
for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison
Wis. (1987)に見出される。
理、電気穿孔、およびこれらの処理の組合せに基づく方法を用いて達成され得る。種々の
植物品種へのこれらのシステムの適用は、プロトプラストからその特定植物株を再生する
能力に依存する。プロプラストから穀物を再生するための例示的方法が記述されている(F
ujimura et al., 1985; Toriyama et al., 1986; Abdullah et al., 1986)。
NAの直接注入、または未熟胚の細胞へのDNAの直接注入とそれに続く乾燥胚の再水和
による植物へのDNAの導入を含むが、これらに限定されない。
、発生および栽培は当分野において周知である(Weissbach et al., In: Methods for Pla
nt Molecular Biology, Academic Press, San Diego, Calif., (1988))。この再生と成長
の過程は、典型的には形質転換細胞の選択、発根小植物体段階を経た胚発生の通常の段階
を通して個別細胞を培養することの工程を含む。トランスジェニック胚および種子も同様
に再生される。生じたトランスジェニック発根芽を、その後、適切な植物成長媒質、例え
ば土壌に定植する。
くは、再生した植物は、自家受粉してホモ接合トランスジェニック植物を与える。さもな
ければ、再生植物体から得た花粉を、農学的に重要な系統の種子成長植物に交配する。逆
に、これらの重要な系統の植物からの花粉を使用して再生植物体に受粉させる。所望の外
来性核酸を含む本発明のトランスジェニック植物は、当業者に周知の方法を用いて栽培さ
れる。
は未熟植物胚から植物を再生するための、穀物用植物、例えばイネの形質転換のための方
法は、当分野において周知であり、例えばカナダ特許出願第2,092,588号、オー
ストラリア特許出願第61781/94号、オーストラリア特許第667939号、米国
特許第6,100,447号、国際特許出願第PCT/US97/10621号、米国特
許第5,589,617号、米国特許第6,541,257号が参照され、他の方法は国
際公開広報第99/14314号特許明細書に述べられている。好ましくは、トランスジ
ェニックイネ植物はアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefacien
s)を介した形質転換手順によって生産される。イネのアグロバクテリウムを介した形質
転換の一例を本明細書で実施例5において提供する。所望の核酸構築物を担持するベクタ
ーを、組織培養植物体または外植体の再生可能なイネ細胞、または適切な植物体系、例え
ばプロトプラストに導入し得る。
または分裂組織からである。
に公知の方法を用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅またはサザンブロット分析が
実施できる。導入遺伝子の発現産物は、産物の性質に依存して様々な方法のいずれかによ
って検出でき、ウエスタンブロット法および酵素検定法を含む。種々の植物組織において
タンパク質発現を定量し、複製を検出するための1つの特に有用な方法は、レポーター遺
伝子、例えばGUSを使用することである。ひとたびトランスジェニック植物が得られれ
ば、それらを成長させて所望の表現型を有する植物体組織または部分を生産し得る。植物
体組織または植物体部分は収穫され得るおよび/または種子を収集され得る。種子は、所
望の特性を備えた組織または部分を有するさらなる植物体を成長させるためのソースとし
て役立ち得る。
マーカ利用選抜
マーカ利用選抜は、古典的交配育種において反復親と戻し交配するときに必要とされる
ヘテロ接合植物を選択する、広く認識されている方法である。各戻し交配世代の植物の集
団は、戻し交配集団において通常は1:1の比率で存在する対象遺伝子についてヘテロ接
合であり、遺伝子の2つの対立遺伝子を識別するために分子マーカが使用できる。例えば
若い苗条からDNAを抽出し、遺伝子移入された望ましい形質についての特異的マーカで
試験することにより、エネルギーと資源をより少ない植物に集中させながら、さらなる戻
し交配のための植物の初期選択を行う。戻し交配プログラムをさらに迅速化するために、
完全に種子を成熟させるのではなく、未熟種子からの胚(開花後25日目)を切り出し、
無菌条件下に栄養培地で成長させ得る。本葉3枚展開時にDNA抽出と組み合わせて使用
される、「胚救助法(embryo rescue)」と称されるこの工程および所望の遺伝子型に関
する分析は、その後反復親へのさらなる戻し交配のために温室または圃場で成熟するまで
育成し得る、所望形質を担持する植物の速やかな選抜を可能にする。
物学的手法も本発明の方法において使用できる。そのような方法は、核酸増幅、核酸配列
決定、適切に標識されたプローブとの核酸ハイブリダイゼーション、一本鎖立体配座解析
(SSCA)、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動(DGGE)、ヘテロ二本鎖分析(HET)
、化学的切断分析(CCM)、触媒核酸切断またはそれらの組合せを含むが、これらに限
定されない(例えばLemieux, 2000; Langridge et al., 2001参照)。本発明はまた、所望
表現型を与える(例えば)Fad2またはFatB遺伝子の対立遺伝子に連鎖する多型を
検出するための分子マーカ手法の使用を包含する。そのような方法は、制限断片長多型(
RFLP)、RAPD、増幅断片長多型(AFLP)およびマイクロサテライト(単純配
列反復、SSR)多型の検出または分析を含む。密接に連鎖するマーカは、当分野におい
て周知の方法、例えばLangridge et al. (2001)によって総説されている、バルクセグレ
ガント分析(Bulked Segregant Analysis)によって容易に入手できる。
る「プライマーの対」または「プライマーのセット」、および重合の触媒、例えばDNA
ポリメラーゼ、典型的には耐熱ポリメラーゼ酵素を使用して標的ポリヌクレオチドで複製
コピーを作製する反応である。PCRのための方法は当分野で公知であり、例えば■PCR
■(Ed. MJ. McPherson and S.G Moller (2000) BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxfor
d)において教示される。PCRは、植物細胞から単離したmRNAを逆転写することから
得られるcDNAに関して実施できる。しかし、植物から単離したゲノムDNAに関して
PCRを実施する場合は、一般により容易である。
間に伸長されるオリゴヌクレオチド配列である。アンプリコンまたはPCR産物またはP
CRフラグメントまたは増幅産物は、プライマーおよび標的配列の新たに合成されたコピ
ーを含む伸長産物である。多重PCRシステムは、2以上のアンプリコンの同時生産を生
じさせる複数のセットのプライマーを含む。プライマーは、標的配列に完全にマッチし得
るかまたは特定標的配列内に制限酵素または触媒核酸認識/切断部位の導入を生じさせ得
る内部ミスマッチ塩基を含み得る。プライマーはまた、アンプリコンの捕捉または検出を
容易にする追加配列を含み得るおよび/または修飾または標識ヌクレオチドを含み得る。
DNAの熱変性、相補的配列へのプライマーのアニーリングおよびポリメラーゼによるア
ニーリングされたプライマーの伸長の反復サイクルは、標的配列の指数関数的増幅をもた
らす。標的または標的配列または鋳型という用語は、増幅される核酸配列を指す。
et al. (supra) and Sambrook et al. (supra)に見出される。配列決定は、任意の適切な
方法、例えばジデオキシ配列決定法、化学的配列決定法またはその変法によって実施でき
る。直接配列決定は、特定配列のいかなる塩基対の変異も判定するという利点を有する。
ーコンを含むが、これらに限定されない。TaqManアッセイ(米国特許第5,962
,233号)は、一方の末端に供与体染料、他方の末端に受容体染料を有し、染料の対が
蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)を通して相互作用する、対立遺伝子特異的(ASO
)プローブを使用する。標的配列は、標識ASOプローブの付加を含むように改変された
PCRによって増幅される。PCR条件は、1個のヌクレオチドの相違がプローブの結合
を生じさせるように調整される。Taqポリメラーゼ酵素の5’ヌクレアーゼ活性により
、完全に相補的なプローブはPCRの間に切断されるが、1個のミスマッチ塩基を有する
プローブは切断されない。プローブの切断は消光受容体染料から供与体染料を解離し、供
与体蛍光を大きく上昇させる。
5,517号)。分子ビーコンアッセイでは、ASOプローブは、ヘアピン型構造が形成
されるように標的特定種に隣接する相補的配列を含む。ヘアピンのループは標的配列に相
補的であるが、ヘアピンの各々の腕は供与体染料または受容体染料のいずれかを含む。供
与体配列にハイブリダイズしないとき、ヘアピン型構造は供与体染料と受容体染料を互い
に近接させ、それによって供与体蛍光を消滅させる。特定標的配列にハイブリダイズした
ときは、供与体染料と受容体染料は900倍までの蛍光の上昇を伴って分離される。分子
ビーコンは、PCRによる標的配列の増幅と共に使用でき、標的配列のリアルタイム検出
のための方法を提供するか、または増幅後に使用できる。
TILLING
本発明の植物は、TILLING(Targeting Induced Local Lesions IN Genomes)とし
て知られる方法を用いて生産できる。最初の工程では、種子(または花粉)を化学的突然
変異原で処理することにより、植物の集団において導入突然変異、例えば新規一塩基対変
化を誘導し、その後植物を、突然変異が遺伝によって安定に受け継がれる世代へと前進さ
せる。DNAを抽出し、種子を集団のすべての成員から貯蔵して、長期間にわたって繰り
返しアクセスできる供給源を創製する。
を特異的に増幅するように設計される。標的が遺伝子ファミリーの成員であるかまたは倍
数体ゲノムの部分である場合、特異性は特に重要である。次に、多数の個体のプールした
DNAからPCR産物を増幅するために染料標識したプライマーが使用できる。これらの
PCR産物を変性し、ミスマッチ塩基対の形成を許容するように再アニーリングする。ミ
スマッチまたはヘテロ二本鎖は、いずれも、天然に生じる一塩基多型(SNP)(すなわ
ち集団からのいくつかの植物は同じ多型を担持する可能性がある)および誘導されたSN
P(すなわちごくまれな個別植物が突然変異を示す可能性がある)である。ヘテロ二本鎖
の形成後、ミスマッチDNAを認識し、切断するエンドヌクレアーゼ、例えばCel I
の使用が、TILLING集団内の新規SNPを発見するために重要である。
に一塩基変化並びに小さな挿入または欠失(1〜30bp)を有する個体を同定するため
にスクリーニングすることができる。アッセイされるゲノム断片は、0.3〜1.6kb
の範囲内の大きさであり得る。8倍プール、1.4kbフラグメント(ノイズのためにS
NPの検出に問題があるフラグメントの末端を除く)およびアッセイ当たり96レーンで
、この組合せは1回のアッセイにつき百万塩基対までのゲノムDNAをスクリーニングす
ることを可能にし、TILLINGをハイスループット手法にする。
に説明されている。
技術は自然多形の検出のために理想的である。それ故、公知の配列にヘテロ二本鎖形成す
ることにより未知の相同なDNAを問い合わせることは、多型部位の数と位置を明らかに
する。少なくともいくつかの反復数の多型を含む、ヌクレオチド変化および小さな挿入と
欠失の両方が同定される。これはEcotilling(Comai et al., 2004)と呼ばれて
いる。
。それ故、各ハプロタイプはその移動度に基づいて保管され得る。配列データは、ミスマ
ッチ切断アッセイのために使用される同じ増幅DNAのアリコートを使用して比較的小さ
な漸増作業(incremental effort)で入手できる。1つの反応のための左側または右側配
列決定プライマーは、多型へのその近接度によって選択される。Sequencherソ
フトウエアは多重アラインメントを実行し、塩基変化を発見して、各々の場合にゲルバン
ドを確認する。
SNP発見のために使用される。突然変異した植物からのDNAのプールではなく、整列
した生態型(ecotypic)DNAを含むプレートをスクリーニングすることができる。検出
は塩基対に近い分解能を有するゲル上であり、バックグラウンドパターンはレーン全体に
わたって均一であるので、同一の大きさのバンドはマッチし、それ故単一工程でSNPを
発見し、遺伝子型分類することができる。このように、SNPの最終的な塩基配列決定は
簡単で効率的であり、スクリーニングのために使用される同じPCR産物のアリコートを
DNA塩基配列決定に供することができるのでなおさらである。
突然変異誘発手順
突然変異型イネ植物系統を作出するための手法は当分野において公知である。突然変異
型イネ植物を作出するために使用できる変異原の例は、照射および化学物質による突然変
異誘発を含む。突然変異体はまた、T−DNA挿入およびトランスポゾン誘導型突然変異
誘発のような手法によって作製され得る。突然変異誘発手順は、イネ植物の任意の親細胞
、例えば種子または組織培養下の親細胞に関して実施され得る。
用な化学的変異原は、N−エチル−N−ニトロソ尿素(ENU);N−メチル−N−ニト
ロソ尿素(MNU);塩酸プロカルバジン;クロラムブシル;シクロホスファミド;メタ
ンスルホン酸メチル(MMS);メタンスルホン酸エチル(EMS);硫酸ジエチル;ア
クリルアミド単量体;トリエチレンメラミン(TEM);メルファラン;ナイトロジェン
マスタード;ビンクリスチン;ジメチルニトロソアミン;N−メチル−N’−ニトロ−N
−ニトロソグアニジン(MNNG);7,12ジメチルベンズアントラセン(DMBA)
;エチレンオキシド;ヘキサメチルホスホルアミド;およびビスルファンを含むが、これ
らに限定されない。
によって供給されるものである。γ線照射は、好ましくは約60〜200Kradの線量
、最も好ましくは約60〜90Kradの線量で植物細胞に与えられる。
よび細胞が植物に再生される能力を完全に破壊するには不十分な期間、変異原に曝露され
る。
抗体
FatBまたはFad2ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナルまたはポリク
ローナル抗体は、本発明の方法の一部のために有用であり得る。
が、イネの他のタンパク質、特にイネ種子のタンパク質には結合しない、抗体の能力を指
す。
tBまたはFad2ポリペプチドの領域を指す。エピトープは、エピトープに対する抗体
を作製するために動物に投与され得るが、本明細書で述べる方法のために有用な抗体は、
好ましくは全長ポリペプチドの中のエピトープ領域に特異的に結合する。
ウマ等)を抗原性ポリペプチド、例えば図2または7または配列番号1〜4または15〜
18において提供されるもので免疫する。免疫動物からの血清を収集し、公知の手順に従
って処理する。ポリクローナル抗体を含有する血清が他の抗原に対する抗体を含む場合は
、免疫アフィニティークロマトグラフィーによってポリクローナル抗体を精製することが
できる。ポリクローナル抗血清を作製し、処理するための手法は当分野において公知であ
る。そのような抗体を作製し得るために、本発明はまた、動物における免疫原として使用
するための、もう1つ別のペプチドにハプテン化された本発明のペプチドまたはそのフラ
グメントを提供する。
得る。ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を作製するための一般的な方法は周知
である。抗体産生不死化細胞系統は、細胞融合によっておよびまた他の手法、例えば発癌
性DNAでのBリンパ球の直接形質転換またはエプスタイン‐バーウイルスでのトランス
フェクションによって創製し得る。産生されたモノクローナル抗体のパネルを様々な性質
に関して、すなわちアイソタイプおよびエピトープ親和性に関してスクリーニングするこ
とができる。
域(CDR)を有するscFvフラグメントを発現するファージディスプレイライブラリ
ーをスクリーニングすることを含む。この手法は当分野において周知である。
合活性を保持する全長抗体のフラグメントを包含する。そのようなフラグメントは、Fv
、F(ab’)およびF(ab’)2フラグメント、並びに一本鎖抗体(scFv)を含
む。さらに、抗体およびそのフラグメントは、例えば欧州特許出願第A−239400号
に記載されているような、ヒト化抗体であり得る。
適切な容器中でキットに包装され得る。
検出可能標識は、放射性標識、蛍光物質、染料、磁気ビーズ、化学発光物質、コロイド粒
子等を含む。結合の間接測定を可能にする標識の例は、基質が着色産物または蛍光産物を
与え得る酵素を含む。さらなる例示的な検出可能標識は、適切な基質の添加後に検出可能
産物のシグナルを与えることができる共有結合酵素を含む。複合体における使用のための
適切な酵素の例は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リ
ンゴ酸デヒドロゲナーゼ等を含む。市販されていない場合は、そのような抗体−酵素複合
体は、当業者に公知の手法によって容易に作製される。さらなる例示的な検出可能標識は
、高親和性でアビジンまたはストレプトアビジンに結合するビオチン;蛍光活性化セルソ
ーターと共に使用できる、蛍光色素(例えばフィコビリタンパク質、フィコエリトリンお
よびアロフィコシアニン;フルオレセインおよびテキサスレッド);ハプテン等を含む。
好ましくは、検出可能標識はプレートルミノメーターでの直接測定を可能にし、例えばビ
オチンであり得る。そのような標識抗体は、本発明のポリペプチドを検出するために当分
野で公知の手法において使用できる。
試験材料および方法
ナトリウムメトキシドによる油の抽出
脂肪酸および他の分析のために、異なる記述がない限り以下のようにしてイネ穀粒から
全脂質を抽出した。一部の場合には、各々が穀粒の半分から成る試料を抽出のために使用
し、胚を含有する残りの半分の穀粒を胚救助のために使用した。この手法は他の穀物に関
しても使用できる。
ナトリウムメトキシド2mlを添加し、管を固く密閉して、その後80℃で10分間イン
キュベートした。管を冷却した後、氷酢酸0.1mlを添加し、次いで蒸留水2mlおよ
び石油精油2mlを添加した。混合物を10秒間ボルテックスし、相が分離した後、上部
石油層を小さな試験管に移した。重炭酸カリウム/硫酸ナトリウム混合物約1gを試験管
に添加し、混合物をボルテックスした。試料溶液をオートサンプラーバイアルに写し、So
utjesdic et al. (2002)によって述べられているようにGC分析を実施するまで冷凍庫に
おいて−20℃で保存した。
高水分含量を有する組織からの脂質の抽出(ブライ−ダイアー(Bligh-Dyer)法)
本方法はBligh and Dyer (1959)から適合された。CHCl3/MeOH(1:2)1.
5mlを緩衝液0.4ml中の組織試料に添加し、試料を強くボルテックスした。さらな
るCHCl3 0.5mlを添加し、試料を再びボルテックスした。H2O 0.5mlを
添加し、試料を再びボルテックスした。相を分離するために管を3000rpmで手早く
遠心した;白色沈殿物が界面に出現した。有機(下部)相を新たな管に移し、真空下で濃
縮した。酸性脂質を抽出しようとする場合は、H2O 0.5mlの代わりに1% HCl
O4 0.5mlを添加した。上記手順における容量は、CHCl3/MeOH/H2Oの
比率が維持される限り、変更し得る。
脂肪酸含量の定量のための脂肪酸メチルエステル(FAME)の調製
穀粒からFAMEを直接調製するため、10〜15の種子を正確に計量し、ガラス管に
移した。1mg/ml 17:0−メチルエステル10μlの内部標準を各々の種子試料
に添加した。1Nメタノール−HCl(Supelco)0.75mlを各管に添加し、
しっかりと蓋をして、80℃で少なくとも2〜3時間または一晩還流した。試料を冷却し
、NaCl(0.9%w/v)0.5ml、次いでヘキサン300μlを添加した。管に
再び蓋をし、強くボルテックスした。上部ヘキサン相(200〜250μl)を注意深く
エッペンドルフ管に移した。試料を窒素下で完全に乾燥した。乾燥したFAME試料をヘ
キサン20μlに溶解し、GC分析のためにバイアル中の円錐形ガラスインサートに移し
た。
ガスクロマトグラフィーによるFA分析
脂肪酸メチルエステルを、以下のようにアルカリメチル基転移によって調製した。単一
種子試料をろ紙ディスクの間で押しつぶした。ろ紙ディスクに移した脂質中の脂肪酸を、
次に、0.02Mナトリウムメトキシド2mL中80℃で10分間メチル化し、その後3
0分間冷却した。氷酢酸0.1mLを添加し、次いで蒸留水2mLおよびヘキサン2mL
を順に添加した。ボルテックスし、相を分離した後、脂肪酸メチルエステルを含む上部ヘ
キサン層をマイクロバイアルに移した。脂肪酸メチルエステルを、先に述べられているよ
うに(Stoutjesdijk et al., 2002)気−液クロマトグラフィーによって分析した。
イネの形質転換
イネ(日本晴品種)(cv.Nipponbare)を以下のように形質転換した。
i)カルスの誘導と培養
成熟穀粒からもみ殻を取り除き、その後70% EtOHに30秒間浸漬してろうの外
層を除去した。清浄にした穀粒を滅菌水で3回洗浄し、表面滅菌するために振とうしなが
ら25%漂白剤の溶液(Tween20界面活性剤2滴を添加)に20分間浸漬した。無
菌条件下で、穀粒を70% EtOHで手早くすすぎ、滅菌水で8〜10回十分に洗浄し
て、N6D培地に塗布した。プレートを微小孔テープで密閉し、自然光の下で(under full
light)28℃でインキュベートした。6〜8週間後にカルスが生成され、それらをNB
培地に移した。パラフィン紙で密閉し、4週間ごとに新鮮NBプレートに継代培養しなが
ら28℃で放置した。5継代以降のカルスは形質転換に使用しなかった。
ii)形質転換
健康に見えるカルスを継代培養プレートから採取し、25〜30カルス/プレートの密
度で新鮮NBプレートに移した。2日後、使用する構築物を含むアグロバクテリウム株の
新鮮培養物を樹立し、28℃でインキュベートした。培養培地は、アセトシリンゴン10
0μMを添加したNB培地であった。カルスを細胞の懸濁液に10分間液浸した。過剰の
懸濁液を廃棄した後、アセトシリンゴン100μMを添加したNB培地にカルスを置き、
暗所にて25℃で3日間インキュベートした(共培養)。共培養工程後、カルスを管の中
で150mg/mlチメンチン(Timentin)を含む滅菌水で静かに3回洗浄した。カルス
をろ紙に乾燥ブロットし、十分な間隔を置いてNBCTプレート(カナマイシン選択マー
カ遺伝子を使用する場合は100μg/mlカナマイシンまたは適宜に他の選択薬剤、1
50μg/mlチメンチンおよび200μg/mlクラフォラン(Claforan)を含有する
)に塗布した。プレートを暗所にて26〜28℃で3〜4週間インキュベートした。耐性
カルスが約10日後に認められ、NBCT+選択プレートに移して、さらに14〜21日
間暗所でインキュベートした。健康なカルスをPRCT+選択プレートに移し、暗所で8
〜12日間インキュベートして、その後RCT+選択プレートに移し、自然光の下、28
℃で30日間インキュベートした。この期間後、発生した小植物体を組織培養鉢中の1/
2MS培地に移し、さらなる成長のために光下で10〜14日間インキュベートした後、
土壌に移した。
iii)イネ組織培養のための培地組成および成分
N6マクロエレメント(20X)(g/1):(NH4)2SO4、9.3;KNO3、5
6.6;KH2PO4、8;MgSO4.7H2O、3.7;CaCl2.2H2O、3.3。
SO4.7H2O、150;H3BO3、160;KI、80。
、10;ピリドキシン−HCl、5;ニコチン酸、5。
000;Na2MoO4.2H2O、25;H3BO3、300;ZnSO4.7H2O、20
0;CuSO4.5H2O、3.87;CoCl2.6H2O、2.5;KI、75。
Gamborg's vitamin solution)(1000X)。
ノール1mlに溶解し、1N KOH 3mlを添加して、1N HClでpH6に調整
する。
解し、滅菌蒸留水を加えて100mlにする。最終的なバックグラウンド濃度は20mM
NaOHである。
チメンチン(150mg/ml):チメンチン3100mgを滅菌水20.66mlに溶
解する。最終濃度は150mg/mlである。
。
N6マクロ(10X) 100ml
N6ミクロ(1000X) 1ml
N6ビタミン(1000X) 1ml
MS鉄/EDTA 5ml
ミオイノシトール 100mg
カサミノ酸 300mg
プロリン 2.9g
2,4−D(1mg/ml) 2ml
スクロース 30g
1M KOHでpHを5.8に調整し、フィトゲル3g/lを添加して、加圧滅菌する
。
N6マクロエレメント(20X) 50ml
B5ミクロエレメント(100X) 10ml
B5ビタミン(100X) 10ml
FeEDTA(200X) 5ml
2,4−D(1mg/ml) 2ml
スクロース 30g
プロリン 500mg
グルタミン 500mg
カゼインの酵素加水分解物(CEH)300mg
NBO:NB培地、プラス30g/l マンニトールおよび30g/l ソルビトール、
pH調整の前に添加する。
ロマイシン、チメンチン150mg/ml、クラフォラン200mg/l。
グロマイシン、200mg/l クラフォランおよびチメンチン150mg/ml。
る:BAP、2mg/l;NAA、1mg/l;ABA、5mg/l;クラフォラン、1
00g/1;チメンチン、150mg/ml+選択。
る:BAP;3mg/l;NAA、0.5mg/l;チメンチン、150mg/ml;ク
ラフォラン、100mg/1+選択。
、フィトゲル2.5g/1を添加し、加圧滅菌後、0.05mg/l NAAおよびチメ
ンチン150mg/mlを添加する。
〔実施例2〕
イネからのFatB遺伝子の同定と単離
FatB遺伝子は、炭素数16以下の長さを有する脂肪酸をアシルキャリアータンパク
質からアシルCoAに選択的に転移する活性を有し、それ故脂肪酸炭素鎖のさらなる延長
を妨げる酵素、パルミトイル−ACPチオエステラーゼをコードする。推定上のイネFa
tB配列を、Genbankアクセッションシロイヌナズナ遺伝子座AtACPTE32
およびアヤメ遺伝子座AF213480についての配列を使用した相同性に基づく検索を
用いて同定した。使用したプログラムは、NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)に
おいて入手可能なMegablastであった。NCBIによって使用されたデフォルト
パラメータを使用し、使用したデータベースは、イネ、オリザ・サティバについての非重
複(nr)配列およびハイスループット遺伝子配列(htgs)の両方であった。Meg
ablastプログラムによって選択されたイネからの最も類似度の高い配列を翻訳し、
すべてのFatB配列において認められた保存された配列NQHVNN(配列番号26)
の存在に関して検討した。シロイヌナズナにおいて必須であると考えられるさらなるアミ
ノ酸残基はシステイン264であり、アスパラギン227およびヒスチジン229(どち
らも保存された配列NQHVNN内に存在する)と共に、提案された触媒三つ組残基を含
む。
http://rise.genomics.org.cn/rice/index2.jsp)も限られた範囲内で使用し、BLAS
T検索についてのデフォルトパラメータをシロイヌナズナ配列およびアヤメ配列と共に使
用した。翻訳された配列を図2に整列する。
れているタンパク質配列に以下のように対応する:AC108870はOs11g438
20に対応し、AP005291はOs02g43090に対応し、AP000399は
Os06g5130に対応し、およびAP004236はOs06g39520に対応す
る。図に指示されているように1個の遺伝子から複数の転写産物の可能性があることに留
意すべきである。図4は、デフォルトパラメータを使用した「遺伝子」配列のCLUST
AL W(fast)アラインメントを示す−「遺伝子」は種々の長さであることに留意
すべきである。
を図5に詳細に示す。
cDNAのコード配列のアラインメントを示す。
004236に対応する)の翻訳されたペプチド配列の間の配列同一性は、全体で74%
であり、コード配列全体にわたるヌクレオチドレベルでの同一性は69%であった。どち
らの場合も、BESTFITプログラムをデフォルトパラメータで使用した。Os02g
43090(1つの転写産物)、Os06g05130、Os06g39520およびO
s011g43820から推定されるポリペプチドは、それぞれ298、427、423
および425アミノ酸に対応する。
プチドとの高度の配列同一性から推測した。さらに、これらの配列に基づく遺伝子不活性
化構築物のパルミチン酸レベルへの認められた作用も、この結論と一致した(以下参照)
。
産物が予測された。実施したRT−PCR実験およびESTライブラリーから回収された
クローンの相対数に基づき、Os06g5130からのRNAは穀粒において比較的豊富
であるが、Os11g43820はその組織において中等度のレベルで発現され、その他
の遺伝子は低レベルでしか発現されないと思われた。
〔実施例3〕
イネからのFad2遺伝子の同定と単離
Fad2遺伝子によってコードされるタンパク質(脂肪酸デサチュラーゼ2)は、18
:1脂肪酸への二重結合の導入の役割を担う−それらはΔ12デサチュラーゼである。シ
ロイヌナズナ遺伝子座athdl2aaaからのGenbank配列を、Megabla
stをデフォルト設定で使用してオリザ・サティバについてのnrおよびhtgsデータ
ベースを検索するために使用した。イネから回収された最も類似する配列を翻訳し、保存
された疎水性モチーフFSYVVHDLVIVAALLFALVMI(配列番号27)、
AWPLYIAQGCVLTGVWVIA(配列番号28)、ISDVGVSAGLAL
FKLSSAFGF(配列番号29)、VVRVYGVPLLIVNAWLVLITYL
Q(配列番号30)およびヒスチジンイネ配列HECGHH(配列番号31)、HRRH
HA(配列番号32)およびHVAHH(配列番号33)の存在に関して検討した。得ら
れたアイソフォームの翻訳されたアミノ酸配列を図7に示す。
RT−PCRによる増幅のために使用したプライマーの位置(下線)を示す、Fad2配
列のアラインメントを提供する。終止コドンの位置を箱で指示し、終止コドンの下流の非
翻訳領域を小文字で示す。
、BLASTプログラムをデフォルトパラメータで使用してイネゲノムを検索するために
使用したとき、4つの遺伝子配列がイネゲノムから高度に類似するとして回収される。こ
れらの遺伝子の全体構造を図9に示す。遺伝子は以下のようにタンパク質配列に対応する
。タンパク質配列AP004047(本明細書ではFAD2−1とも称される)は遺伝子
Os02g48560に対応し、配列AP005168(本明細書ではFAD2−2とも
称される)は遺伝子Os07g23410に対応し、配列コンティグ2654は遺伝子O
s07g23430に対応する。加えて、興味深い程度の配列同一性を共有するが、明ら
かにこれらの配列と異なり、偽遺伝子であると考えられる配列が存在した。この配列はO
s07g23390であった。
タンパク質コード配列のアラインメントを図10に示す。Os02g48560からOs
07g23410までについてのコード領域全体にわたる配列同一性は79%であった。
)の分子量は、プロセシング前は44.35kDaであり、388アミノ酸を含んだ。O
s07g23410によってコードされるポリペプチドの分子量は44.9kDaであり
、390アミノ酸を含んだ。これらの推定ポリペプチドは、デフォルトパラメータを用い
たBESTFITプログラムによって測定したとき、77%の配列同一性を有していた。
Os07g23430からの推定ポリペプチドは、41kDa(363アミノ酸)の分子
量を有し、Os07g23390からの推定ポリペプチドは24kDa(223アミノ酸
)であった。すべての推定ポリペプチド配列のアラインメントを図7に示す。
ト配列が穀粒cDNAライブラリーから回収されたESTライブラリーにおけるこの遺伝
子についてのクローンの相対頻度からのデータと一致した。7番染色体上にコードされる
アイソフォームの2つに対応する配列(Os07g23430、23410)は、葉ES
Tライブラリーから回収されたが、その他の遺伝子(Os07g23390)に対応する
配列はまだ報告されていない;我々は、この配列は、存在するとしても低レベルで発現さ
れるであろうと判定した。
た。Os02g48560から推定される2つの転写産物は、配列によって区別すること
ができなかった。Os02g48560から推定される配列は、穀粒において明らかに発
現された。
〔実施例4〕
イネにおけるFatBおよびFad2遺伝子の発現
実施例2および3で述べたようにイネにおいて同定された4つの推定上のFatBおよ
び3つのFad2遺伝子のうちで、もし少しでも発現されるとすれば、いずれが発育中の
イネ穀粒において発現され得るかを判定するため、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−
PCR)アッセイを実施した。遺伝子は配列において密接に関連していたので、各遺伝子
についての転写産物を特異的にアッセイするために、プライマーを遺伝子の各々について
特異的であるように設計しなければならなかった。配列多様性(sequence divergence)
の領域をアラインメントから同定し(図6および8)、いくつかのプライマー対を設計し
て、試験した。推定上のFatB遺伝子の発現を検出するためのプライマー配列を表3お
よび4に示す。発現レベルを比較するための内部標準として、αチューブリンをコードす
るイネ遺伝子、OsTubA1の発現に関してRNAでもRT−PCRを実施した。この
遺伝子は活発に分裂しているすべての組織において発現されることが公知であり、ホルモ
ンABAによって影響されず、それ故葉および穀粒分析のための構成的に発現される対照
として適切であった。
ロトコルに従って、開花の約15日後にイネ穀粒から調製した。次にDNアーゼ処理 (
DNA−フリーキット、Ambion)を使用して、RNA調製物から夾雑DNAを除去
した。RT−PCR混合物は、最終容量25μlになるように、5xQiagen On
eStep RT−PCR緩衝液5μl、dNTP混合物1μl(各々のdNTP 10
mMを含む)、各々のプライマー15pmolおよびRNA約20pgを含んだ。以下の
RT−PCRサイクリングプログラムをRT−PCR増幅のために使用した:50℃、3
0分間(逆転写)、95℃で15分間(初期PCR活性化)、(94℃で1分間、57℃
で1分間、72℃で1分間)の30サイクル(PCR増幅)、その後72℃で10分間の
最終伸長。
識別子LOC Os02g48560)が、その他のアイソフォームをコードする遺伝子
と比較して穀粒および葉の両方で高発現されることを証明した。その他の2つのFad2
遺伝子(LOC Os07g23410およびLOC Os07g23430)は、低レベ
ルで、主として葉において発現されると思われた。FatBアイソフォームをコードする
遺伝子の分析は、FatB−1(Genbank識別子AP000399、Tigr L
OC Os06g05130)およびFatB−2(Genbank識別子AC1088
70、TIGR識別子Os11g43820)がその他の2つの遺伝子よりも穀粒におい
てより高度に発現されることを示した。Tos−17転位挿入突然変異体は、AP000
399をコードする遺伝子内に挿入を有していた。
C Os06g05130)およびFatB−4(AP004236、TIGR LOC
Os06g39520)がより高度に発現され、これらの遺伝子からのmRNA転写産
物の相対的豊富さを示唆した。コムギ穀粒において中等度に豊富なmRNAであり、それ
故イネ穀粒においても同様の存在率であると予想される、標準品としてのチューブリン遺
伝子転写産物の存在率と比較したとき、FatBおよびFad2 mRNAはすべて、R
T−PCRによって測定したとき低レベルに蓄積された。しかしこの結論は、プライマー
が、試験した遺伝子の各々について、チューブリンプライマー/転写産物と同様の効率で
標的転写産物にハイブリダイズするという仮定に基づいた。
るためにFad2−1(TIGR Os02g48560)配列を使用したとき、転写産
物配列は円錐花序、根および全植物体cDNAライブラリーに存在した。これに対し、F
ad2−2(TIGR Os07g23410)およびFad2−3(TIGR Os0
7g23430)配列は、葉、苗条または全植物体ライブラリーにのみ存在した。偽遺伝
子であると考えられるFad2様遺伝子、Os07g23390についての配列は、ES
Tライブラリーのいずれにも存在しなかった。同様に、FatB−1(TIGR Os0
6g05130)配列は葉と円錐花序ESTライブラリーの両方に存在し、FatB−2
配列(TIGR Os11g43820)は円錐花序または全植物体ESTライブラリー
にのみ存在し、FatB−4(TIGR Os06g39520)は葉のライブラリーに
のみ存在した。FatB−3(AP005291、Os02g430900)配列は、R
T−PCRによって判定したとき葉と穀粒の両方においてその他よりも比較的低レベルで
発現されるが、円錐花序および全植物体ESTライブラリーに存在した。これらの検索は
、ESTデータベースを使用し、検索をイネからの配列に限定して、NCBIウエブサイ
ト(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi)のBLASTプログラムを使用し
た。
に下方調節されるべき遺伝子であると考えられた。FatB−3もこれに関して重要であ
ると思われた。
〔実施例5〕
遺伝子サイレンシング構築物の構築およびイネの形質転換
Fad2発現の阻害のための二本鎖RNA構築物の創製
Fad2−1の発現を低下させるために発育中のイネ穀粒において二本鎖RNA(ヘア
ピン型RNA)を発現する構築物を設計した。脂肪酸組成への作用を潜在的に最大化する
ために、3つのFad2遺伝子の共通領域を標的することにより、イネ穀粒において同定
された3つのFad2遺伝子すべてに有効であるように構築物を設計した。サイレンシン
グ効率を改善するため、構築物は、Smith et al. (2000)によって述べられたように逆方
向反復配列のセンス部分とアンチセンス部分の間にイントロンを含んだ。
ATCCTCTAGAGGGAGGAGCAGCAGAAGC−3’(配列番号52)お
よびpFad2−R 5’−AAAACTAGTGAATTCTACACGTACGGG
GTGTACCA−3’(配列番号53)を使用してFad2−1遺伝子の5’末端から
PCRによって増幅した。PCR産物をpGEM−Teasyに連結し、大腸菌に形質転
換して、挿入物を含むコロニーを同定した。505bpのFad2フラグメントを含む、
pGEM−T−Fad2と称されるプラスミドからのXbaI/EcoRIフラグメント
を、次に、イントロンRint9を含むベクターZLRint9 BC3895(Zho
ngyi Li,CSIRO Plant Industryより入手した)にセンス方
向で連結した。pGEM−T−Fad2からのBamHI/SpeIフラグメントを、ヘ
アピン型構築物を含むイントロンが形成されるように、生じたプラスミドに(アンチセン
ス方向で)連結した。ヘアピンを含有するFad2−1イントロンを含むBamHI/K
pnIフラグメントを、次に、サイレンシング遺伝子が(プロモーター)センス−イント
ロン−アンチセンス(ターミネーター)の順で発育中の種子において発現されるようにN
osターミネーター/ポリアデニル化配列を含有するBx17種子特異的プロモーターを
含む、pBxl7casNOTベクター(Zhongyi Li,私信)の同じ制限部位
に挿入した。Bx17プロモーターおよびFad2−1逆方向反復領域を含むHindI
II/NotIフラグメントを、ハイグロマイシン耐性を与える選択マーカ遺伝子を含む
バイナリーベクターpWBvec8(Wang et al, 1998)の同じ制限部位に挿入した。次に
このベクターをアグロバクテリウムに導入し、実施例1で述べたようにイネ形質転換のた
めに使用した。二本鎖RNA構築物をdsRNA−Fad2−1と称した。
FatB発現の阻害のための二本鎖RNA構築物の創製
イネパルミトイル−ACPチオエステラーゼFatB−1遺伝子(Tigr LOC
Os06g05130)の665塩基対フラグメントを、以下の配列:Rte−s1、5
’−AGTCATGGCTGGTTCTCTTGCGGC−3’(配列番号54)および
Rte−a1、5’−ACCATCACCTAAGAGACCAGCAGT−3’(配列
番号55)を有するプライマーを用いたPCRによって増幅した。このPCRフラグメン
トを、綿ミクロソームω6−デサチュラーゼGhFad2−1遺伝子(Liu et al., 1999)
の5’UTRからのイントロン配列によって分けられた、センス方向に1コピーのフラグ
メントおよびアンチセンス方向に2番目のコピーを有する逆方向反復構築物を作製するた
めに使用した。逆方向反復構築物を、その後、pUbilcasNOT(Li et al., 1997
に述べられた配列に基づきZhongyi Liより)のUbilプロモーターとNosターミネー
ターの間のSacI部位に挿入した。pUbilプロモーターとイネFatBの逆方向反
復部分をバイナリーベクターpWBVec8のNotI部位に挿入し、上述したFad2
構築物と同様にアグロバクテリウムに導入した。二本鎖RNA構築物をdsRNA−Fa
tB−1と称した。
形質転換したイネにおける脂肪酸組成の分析
dsRNA−Fad2−1で得られた10の独立した稔性トランスジェニック植物を、
プロモーター領域内の部位に対応する1個のプライマーとFad2配列の末端についての
2番目のプライマーを用いたPCRによってdRNA遺伝子の存在に関して試験した。1
0の植物のうち9がPCR反応において陽性と認められ、それ故Fad2 RNAi構築
物を含んだ。同様に、23の稔性トランスジェニック系統をFatB RNAi構築物に
関して試験し、20の系統がPCR陽性と認められた。
料から総脂質を単離した。これを、FatB−1(アクセッション番号AP000399
によって同定されるタンパク質に対応するTIGR遺伝子座Os06g5130)につい
ての遺伝子内にTos17挿入配列を含むイネ突然変異型系統に関しても、この遺伝子を
特異的に不活性化する作用を比較するために実施した。実施例1で述べたようにGC−F
AMEによって各々の脂質抽出物について脂肪酸組成を測定した。データを表5〜7に提
示しており、またデータの一部は図11〜13にグラフで示している。各脂肪酸の割合は
、実施例1で述べたようにHPLCによって測定した穀粒の種子油中の総脂肪酸のパーセ
ンテージとして表わした。
およびリノール酸組成の変化の程度であった。一部の系統でのオレイン酸の比率は36%
から少なくとも65%(w/w)に上昇し、リノール酸の割合は、最も影響を受けたイネ
系統(22A系統)では37%から約13%に低下した。驚くべきことに、Fad2系統
におけるパルミチン酸の比率も低下し、例えば22A系統では対照(18%)と比較して
14%未満に低下した。
含量の上昇と相関したが、オレイン酸とリノレン酸の割合は基本的に変化しなかった。F
ad2およびFatBの両トランスジェニック系統におけるパルミチン酸の割合の低下の
程度は同様であったが、FatB系統におけるリノール酸レベルの上昇の程度は、Fad
2系統で認められた低下の程度をはるかに下回った。すなわち、リノール酸のレベルの変
化の程度はFad2構築物に関してより大きかった。
ォーム、FatB−1のTos−17挿入ノックアウトの分析によって提供される。To
s−17突然変異体では、パルミチン酸とオレイン酸の比率の変化の程度がFatB d
sRNA系統に比べて小さかった。これらの結果は、FatBアイソフォームをコードす
る遺伝子が機能において異なることを指示した。
ル酸の比率は大きく低下したが、Fad2ノックアウトにおけるこれら2つの脂肪酸の間
の関係が野生型イネと同じであることは明らかであった。これに対し、FatBノックア
ウトに関しておよび、より小さな程度であるがFatB Tos−17系統では、リノー
ル酸とオレイン酸の間の関係は同様であったが、一定の比率でシフトしている。これは、
FatBノックアウト植物では、所与の量のオレイン酸に対して野生型またはFad2ノ
ックアウト植物におけるよりもより多くのリノール酸が存在することを意味した。これは
、FatBのノックアウトはオレイン酸およびリノール酸の量を制御する経路に影響を及
ぼすが、Fad2によって制御される、オレイン酸とリノール酸を直接結びつける工程に
は影響を及ぼさないという見解と一致した。
た。正の直線関係がFad2ノックアウト系統に関して認められ、逆の関係がリノール酸
対オレイン酸について認められた。FatB系統に関しては、しかしながら、異なる関係
が認められる(図15)。Fad2 dsRNA植物とFatB dsRNA植物を散布
図として作図したとき(図16)、オレイン酸とパルミチン酸の間の関係の相違も認めら
れた。これらの結果は、パルミチン酸とリノール酸(およびオレイン酸)の間の関係が経
路の2つの乱れに関して異なることを確認した。
与える軸を指示する)がリノール酸対オレイン酸の割合から成り、主成分2(軸の2番目
に最も重要なセット)がリノール酸およびオレイン酸対パルミチン酸の割合で構成された
ことを確認する。これを図17に例示する。
Fad2植物をdsRNA FatB植物またはTos−17 FatB植物と交雑す
ることは、オレイン酸の相対比率をさらに上昇させ、パルミチン酸およびリノール酸のレ
ベルをさらに低下させると結論した。
〔実施例6〕
抗体の作製および使用
FatBの推定配列内に存在する15または16量体ペプチドを合成することによって
抗体を惹起した。FatBに対する抗体を惹起するために使用したペプチドは以下の通り
であった:
FatB−U1 Ac−CGMNKNTRRLSKMPDE(配列番号56)。
000399)に対応し、AP005291、AC108870およびAC004236
から翻訳された配列においても認められた。しかし、前記配列は、配列TRRLSKMP
DE(配列番号57)内の4つのアイソフォームの間でのみ同一であった。
FatB−U2 Ac−CGEKQWTLLDWKPKKPD(配列番号58)。
FatB−99 Ac−CGAQGEGNMGFFPAES(配列番号59)。
存在した。
)を使用し、標準手法を用いてペプチドをオボアルブミンまたはキーホールリンペットヘ
モシアニンタンパク質(KLH)のいずれかに結合した。架橋ペプチドを透析し、凍結乾
燥して、約1mg/mlの濃度のフロイント不完全アジュバントと共に2週間の間隔で2
ヶ月間にわたってウサギに注射した。FatB−99に対して惹起された抗血清は、野生
型イネに存在する20kDaのポリペプチドが、TIGR識別子Os06g5130に対
応する遺伝子内に挿入を有するTos−17突然変異型系統においては欠落しており、産
物はFatB−1に対応し、配列はアクセッション番号AP000399によって表わさ
れるという、FatBアイソフォームの間での明らかな相違を検出した(図18)。これ
は約40kDaの予想サイズとは異なっていたが、そのような不一致は以前にFatBア
イソフォームに関して認められていた。異なる大きさのFatB産物が発育中および成熟
Cuphea wrightii種子で認められ、成熟種子でより長い大きさであり、成
熟種子でより短い産物である、5つの異なるFatBアイソフォームを示した(Leonard e
t al, 1997)。
を検出するためおよび遺伝子不活性化の程度を確認するために使用できる。
〔実施例7〕
イネFad2における突然変異体の同定
Fad2−1(NCBIデータベースにおけるAP00 4047、TIGR遺伝子座
識別子LOC Os02g48560に対応するコード配列)の活性部位(開始ATGを
TIGR Loc Os2g48560における番号付けの起点とみなす場合は基本的に
位置330〜1020)全体にわたるPCR産物を、多数の異なるイネ登録から抽出した
イネDNAから作製する。産物の大きさは、使用するプライマーに依存して800bpま
でである。二組のオーバーラップするプライマー対を使用する必要があると考えられる。
プライマーの1つの可能なセットは以下の通りである:
セットA
GTGCCGGCGGCAGGATGACGG(配列番号60)
(図10に示すアラインメントにおける位置5〜20)
GCCGACGATGTCGTCGAGCAC(配列番号61)
(図10に示すアラインメントにおける位置379−398の逆方向相補物)
セットB
TGCCTTCTCCGACTACTCGG(配列番号62)
(図10における位置360〜379)
CCTCGCGCCATGTCGCCTTGG(配列番号63)
(図10における位置1099〜1118の逆方向相補物)。
アニーリングした産物を、Rotorgene 6000装置(Corbett Li
fe Science)またはヘテロ二量体の融解の差をLCグリーン染料の蛍光を変化
させることによって高感度に検出できる同等の装置において融解に供する。1日に数百、
場合により数千のイネ系統をこの手法によってスクリーニングすることができる。
突然変異を同定する。Fad2を不活性化する選択した突然変異を、その後、低いFad
2活性を有し、それ故高いオレイン酸を含有するイネ系統を生産する優良イネ系統に交配
することができる。Fad2アイソフォームの2または全部を除外する必要がある場合、
これは、種々のアイソフォームにおいて必要とされる突然変異を有する系統を同定し、マ
ーカ利用交配を通して優良イネ系統における突然変異を組み合わせることによって達成さ
れ得る。少なくともFad2−1遺伝子は、オレイン酸含量の実質的上昇またはリノール
酸含量の低下のために不活性である必要がある。付加的なFad2遺伝子の1またはそれ
以上の不活性化は、オレイン酸含量をさらに上昇させ、リノール酸含量をさらに低下させ
る。付加的なFad2遺伝子内に突然変異を有する突然変異体は、付加的なFad遺伝子
に特異的なプライマーを使用して、Fad2−1と同じ方法で同定し得る。
〔実施例8〕
安定性分析−貯蔵中のヘキサナール産生の検出
野生型イネにおいて貯蔵時のヘキサナールの産生を検出するための実験がFSA,We
rribeeで進行中である。これは、高温(40℃)で保存された穀粒の上部空間にお
ける揮発性物質を検出する試料採取器を使用したGCを含む。ひとたびシステムが最適化
されれば(また、我々が十分な量の穀粒を入手すれば)、野生型およびFad2 RNA
iおよびFatB RNAiイネ系統および適切な遺伝子型の組合せの貯蔵時の、揮発性
物質、特にヘキサナールの産生の比較を実施する。これは、穀粒の貯蔵のためやぬかの貯
蔵のためにイネ産業において重要な品質上の問題である。穀粒の品質を損なう上で役割を
果たし得る他の揮発性物質の産生および検出も、FSA,WerribeeおよびCSI
RO Entomologyの両方で検討されている。
℃で8週間保存する。玄米から放出される気体試料を、80℃で加熱することによってま
たは自然拡散によってバイアルの上部空間で得ることができる。次に、上部空間の揮発性
成分をGCまたはGC−MS機器に直接注入し、ガスクロマトグラフィープロフィールを
分析することによって検査できる(Suzuki et al., 1999)。上部空間の揮発性物質を分析
するためのもう1つの方法は、窒素をパージガスとして使用する、Nielsen et al. (2004
)によって述べられたような適切なマトリックス(例えば250mg Tenax GR)
上への揮発性物質の捕捉を通してである。次に芳香化合物の脱離を熱によって実施し、捕
捉された分子をGCによって分析して、標準手法を用いて同定する。
く。Suzuki et al. (1999)は、遊離リノール酸の量が貯蔵の間に上昇し、揮発性アルデヒ
ド、例えばペンタナール、ヘキサナールおよびペンタノールの量が35℃で3倍に上昇す
るというデータを提示した。臭気とヘキサナールおよび揮発性アルデヒドとの相関も他の
著者によって認められている。他方で、Zhou et al. (2002)は、貯蔵時の総リノール酸の
低下を認め、これをリノール酸の、異臭の原因である揮発性物質を含む他の生成物への分
解に関連付けた。結果の相違は、抽出および分析方法の違いによるものと考えられる。
って明らかにされた。
いて示される本発明に対して数多くの変更および/または修正を施し得ることは当業者に
認識される。本実施形態は、それ故、あらゆる点で例示とみなされるべきであり、限定と
解釈されるべきではない。
書に組み込まれる。
2006903810号の優先権を主張する。
ての背景を提供することだけを目的とする。これらの事柄のいずれかまたは全部が先行技
術の基礎の一部を形成することまたは本出願の各々の特許請求の優先日以前に存在した、
本発明に関する分野における共通の一般知識であったことの承認と解釈されるべきではな
い。
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Claims (81)
- 約48%より多くのオレイン酸、約17%未満のパルミチン酸、約30%未満のリノー
ル酸および/またはそれらの任意の組合せを含む脂肪酸組成を有する米油。 - オレイン酸対リノール酸の比率が1.5:1より多い、請求項1に記載の米油。
- 約48%より多くのオレイン酸、約17%未満のパルミチン酸および約30%未満のリ
ノール酸を含む脂肪酸組成を有する、請求項1または2に記載の米油。 - 約60%より多くのオレイン酸を含む脂肪酸組成を有する、請求項1から3のいずれか
1項に記載の米油。 - 約12%未満のパルミチン酸を含む脂肪酸組成を有する、請求項1から4のいずれか1
項に記載の米油。 - 約15%未満のリノール酸を含む脂肪酸組成を有する、請求項1から5のいずれか1項
に記載の米油。 - 約48%より多くのオレイン酸、約17%未満のパルミチン酸、約30%未満のリノー
ル酸および/またはそれらの任意の組合せを含む脂肪酸組成を有する米ぬか。 - オレイン酸対リノール酸の比率が1.5:1より多い、請求項7に記載の米ぬか。
- 約48%より多くのオレイン酸、約17%未満のパルミチン酸および約30%未満のリ
ノール酸を含む脂肪酸組成を有する、請求項7または8に記載の米ぬか。 - 約60%より多くのオレイン酸を含む脂肪酸組成を有する、請求項7から9のいずれか
1項に記載の米ぬか。 - 約12%未満のパルミチン酸を含む脂肪酸組成を有する、請求項7から10のいずれか
1項に記載の米ぬか。 - 約15%未満のリノール酸を含む脂肪酸組成を有する、請求項7から11のいずれか1
項に記載の米ぬか。 - 約48%より多くのオレイン酸、約17%未満のパルミチン酸、約30%未満のリノー
ル酸および/またはそれらの任意の組合せを含む脂肪酸組成を有するイネ種子。 - オレイン酸対リノール酸の比率が1.5:1より多い、請求項13に記載のイネ種子。
- 約48%より多くのオレイン酸、約17%未満のパルミチン酸および約30%未満のリ
ノール酸を含む脂肪酸組成を有する、請求項13または14に記載のイネ種子。 - 約60%より多くのオレイン酸を含む脂肪酸組成を有する、請求項13から15のいず
れか1項に記載のイネ種子。 - 約12%未満のパルミチン酸を含む脂肪酸組成を有する、請求項13から16のいずれ
か1項に記載のイネ種子。 - 約15%未満のリノール酸を含む脂肪酸組成を有する、請求項13から17のいずれか
1項に記載のイネ種子。 - 請求項1から6のいずれか1項に記載の米油を生産するイネ植物。
- 請求項7から12のいずれか1項に記載の米ぬかを生産するイネ植物。
- 請求項13から18のいずれか1項に記載のイネ種子を生産するイネ植物。
- イネ植物の細胞内に存在するとき、ポリヌクレオチドを欠く細胞と比較して細胞内のF
ad2および/またはFatBポリペプチドの活性のレベルを下方調節する単離ポリヌク
レオチド。 - イネ植物の細胞においてポリヌクレオチドの発現を指令することができるプロモーター
に作動可能に連結されている、請求項22に記載のポリヌクレオチド。 - 少なくとも1個のFad2および/またはFatB遺伝子から発現されるmRNAレベ
ルを下方調節する、請求項22または23に記載のポリヌクレオチド。 - ポリヌクレオチドが、アンチセンスポリヌクレオチド、センスポリヌクレオチド、触媒
ポリヌクレオチド、マイクロRNA、Fad2またはFatBポリペプチドに結合するポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド、および二本鎖RNAから選択される、請求項
22から24のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。 - 配列番号5〜8、11〜14または19〜25として提供されるヌクレオチドの配列の
1またはそれ以上を含むポリヌクレオチドに生理的条件下でハイブリダイズするアンチセ
ンスポリヌクレオチドである、請求項25に記載のポリヌクレオチド。 - 配列番号5〜8、11〜14または19〜25として提供されるヌクレオチドの配列の
1またはそれ以上を含むポリヌクレオチドを切断することができる触媒ポリヌクレオチド
である、請求項25に記載のポリヌクレオチド。 - リボザイムである、請求項27に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号5〜8、11〜14または19〜25として提供されるヌクレオチドの配列の
1またはそれ以上の少なくとも19個の隣接ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含
有する二本鎖RNA(dsRNA)分子であり、二本鎖である分子の部分が、少なくとも
19塩基対の長さであり、および前記オリゴヌクレオチドを含有する、請求項25に記載
のポリヌクレオチド。 - 二本鎖部分の鎖が一本鎖部分によって連結されており、1個のプロモーターから発現さ
れる、請求項29に記載のdsRNA分子。 - i)細胞内のFad2および/またはFatBポリペプチドの活性のレベルを下方調節
する候補ポリヌクレオチドの能力を測定すること、および
ii)細胞内のFad2および/またはFatBポリペプチドの活性のレベルを下方調
節したポリヌクレオチドを選択すること
を含む、イネ植物の細胞内に存在するとき、ポリヌクレオチドを欠く細胞と比較して細胞
内のFad2および/またはFatBポリペプチドの活性のレベルを下方調節するポリヌ
クレオチドを同定する方法。 - ポリヌクレオチドが、アンチセンスポリヌクレオチド、センスポリヌクレオチド、触媒
ポリヌクレオチド、マイクロRNA、Fad2またはFatBポリペプチドに結合するポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチド、および二本鎖RNAから選択される、請求項
31に記載の方法。 - ポリヌクレオチドが、配列番号5〜8、11〜14または19〜25として提供される
ヌクレオチドの配列の1またはそれ以上を含むポリヌクレオチドに生理的条件下でハイブ
リダイズするアンチセンスポリヌクレオチドである、請求項32に記載の方法。 - ポリヌクレオチドが、配列番号5〜8、11〜14または19〜25として提供される
ヌクレオチドの配列の1またはそれ以上を含むポリヌクレオチドを切断することができる
触媒ポリヌクレオチドである、請求項32に記載の方法。 - ポリヌクレオチドが、配列番号5〜8、11〜14または19〜25として提供される
ヌクレオチドの配列の1またはそれ以上の少なくとも19個の隣接ヌクレオチドを含むオ
リゴヌクレオチドを含有する二本鎖RNA(dsRNA)分子であり、二本鎖である分子
の部分が少なくとも19塩基対の長さであり、前記オリゴヌクレオチドを含有する、請求
項32に記載の方法。 - 請求項31から35のいずれか1項に記載の方法を用いて同定される単離ポリヌクレオ
チド。 - 請求項22から30または36のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含むまたは
コードするベクター。 - ポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドをコードする配列がプロモーターに作動可
能に連結されている、請求項37に記載のベクター。 - プロモーターが、イネ植物体の少なくとも1つの他の組織または器官と比較してイネ植
物体の胚、内乳、ぬか層および/または種子において選択的にポリヌクレオチドの発現を
与える、請求項37または38に記載のベクター。 - 請求項37から39のいずれか1項に記載のベクター、および/または請求項22から
30または36のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞。 - ポリヌクレオチドまたはベクターが細胞または細胞の前駆体に導入された、請求項40
に記載の細胞。 - イネ細胞またはアグロバクテリウム(Agrobacterium)細胞である、請求項40または
41に記載の細胞。 - ポリヌクレオチドが細胞のゲノムに組み込まれている、請求項40から42のいずれか
1項に記載の細胞。 - 請求項40から43のいずれか1項に記載の細胞を含むイネ植物。
- 請求項22から30または36のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項
37から39のいずれか1項に記載のベクターを細胞に導入する工程を含む、請求項40
から43のいずれか1項に記載の細胞を生産する方法。 - 細胞からトランスジェニック植物を再生する工程をさらに含む、請求項45に記載の方
法。 - 組換え細胞を生産するための、請求項22から30または36のいずれか1項に記載の
ポリヌクレオチドまたは請求項37から39のいずれか1項に記載のベクターの使用。 - 植物が、対応する非改変植物と比較してFad2および/またはFatB活性を有する
ポリペプチドの低発現を有する、遺伝的に改変されたイネ植物。 - 請求項22から30または36のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含むように
形質転換された、請求項48に記載の植物、または前記ポリヌクレオチドを含むその子孫
植物。 - イネ植物をFad2またはFatBポリペプチドのアンタゴニストに曝露することを含
む、請求項1から6のいずれか1項に記載の米油、請求項7から12のいずれか1項に記
載の米ぬかおよび/または請求項13から18のいずれか1項に記載のイネ種子を生産す
る方法。 - 非改変玄米種子を生産する対応植物と比較してイネ種子におけるFad2および/また
はFatBポリペプチドの活性および/または生産のレベルが低下するように植物を遺伝
的に操作することを含む、非改変玄米種子と比較したとき長い貯蔵寿命を有する玄米種子
を生産するために使用できる遺伝的に改変されたイネ植物を得る方法。 - Fad2および/またはFatBポリペプチドの活性および/または生産のレベルが植
物の種子においてのみ低下する、請求項51に記載の方法。 - Fad2ポリペプチドの活性および/または生産のレベルが低下する、請求項51また
は52に記載の方法。 - トランスジェニック植物が、請求項22から30または36のいずれか1項に記載のポ
リヌクレオチドまたは請求項37から39のいずれか1項に記載のベクターを含む、請求
項51から53のいずれか1項に記載の方法。 - 請求項51から54のいずれか1項に記載の方法を使用して生産される遺伝的に改変さ
れたイネ植物、またはその子孫。 - i)イネ種子またはイネ植物の突然変異誘発された集団をスクリーニングすること、お
よび
ii)請求項1から6のいずれか1項に記載の米油、請求項7から12のいずれか1項
に記載の米ぬかおよび/または請求項13から18のいずれか1項に記載のイネ種子を生
産することができる種子または植物を選択すること
を含む、請求項1から6のいずれか1項に記載の米油、請求項7から12のいずれか1項
に記載の米ぬかおよび/または請求項13から18のいずれか1項に記載のイネ種子を生
産するために使用できるイネ植物を選択する方法。 - 工程i)が、突然変異誘発された種子および/または植物をFad2またはFatB活
性を有するポリペプチドに関して分析することを含む、請求項56に記載の方法。 - 工程i)が、突然変異誘発された種子および/または植物のFad2またはFatB遺
伝子の配列および/または発現レベルを分析することを含む、請求項56または57に記
載の方法。 - 工程i)が、突然変異誘発された種子および/または植物の油、ぬかおよび/または種
子の脂肪酸組成を分析することを含む、請求項56から58のいずれか1項に記載の方法
。 - i)候補イネ植物から得られた米油、米ぬかおよび/または種子の脂肪酸含量を分析す
ること、および
ii)請求項1から6のいずれか1項に記載の米油、請求項7から12のいずれか1項
に記載の米ぬかおよび/または請求項13から18のいずれか1項に記載のイネ種子を生
産するために使用できるイネ植物を選択すること
を含む、請求項1から6のいずれか1項に記載の米油、請求項7から12のいずれか1項
に記載の米ぬかおよび/または請求項13から18のいずれか1項に記載のイネ種子を生
産するために使用できるイネ植物を選択する方法。 - i)候補植物からの試料をFad2またはFatB活性を有するポリペプチドに関して
分析すること、および
ii)前記ポリペプチドの配列、生産のレベルおよび/または活性に基づき、請求項1
から6のいずれか1項に記載の米油、請求項7から12のいずれか1項に記載の米ぬかお
よび/または請求項13から18のいずれか1項に記載のイネ種子を生産するために使用
できるイネ植物を選択すること
を含む、請求項1から6のいずれか1項に記載の米油、請求項7から12のいずれか1項
に記載の米ぬかおよび/または請求項13から18のいずれか1項に記載のイネ種子を生
産するために使用できるイネ植物を選択する方法。 - i)候補植物のFad2またはFatB遺伝子の配列および/または発現レベルを分析
すること、および
ii)前記遺伝子の配列および/または発現レベルに基づき、請求項1から6のいずれ
か1項に記載の米油、請求項7から12のいずれか1項に記載の米ぬかおよび/または請
求項13から18のいずれか1項に記載のイネ種子を生産するために使用できるイネ植物
を選択すること
を含む、請求項1から6のいずれか1項に記載の米油、請求項7から12のいずれか1項
に記載の米ぬかおよび/または請求項13から18のいずれか1項に記載のイネ種子を生
産するために使用できるイネ植物を選択する方法。 - 植物の核酸分子を検出することを含み、核酸分子が、植物においてFad2遺伝子およ
び/またはFatB遺伝子に連結されているおよび/またはFad2遺伝子および/また
はFatB遺伝子の少なくとも一部を含有する、請求項1から6のいずれか1項に記載の
米油、請求項7から12のいずれか1項に記載の米ぬかおよび/または請求項13から1
8のいずれか1項に記載のイネ種子を生産するために使用できるイネ植物を同定する方法
。 - 植物の核酸分子を検出することを含み、核酸分子が、植物においてFad2遺伝子およ
び/またはFatB遺伝子に連結されているおよび/またはFad2遺伝子および/また
はFatB遺伝子の少なくとも一部を含有する、長い貯蔵寿命を有する玄米種子を生産す
るために使用できるイネ植物を同定する方法。 - v)前記植物から得られる前記核酸分子に2番目の核酸分子をハイブリダイズすること
、
vi)場合により前記植物から得られる前記核酸分子に少なくとも1つの他の核酸分子
をハイブリダイズすること、および
vii)前記ハイブリダイズ工程の産物または前記ハイブリダイズ工程からの産物の不
在を検出すること
を含む、請求項63または64に記載の方法。 - 2番目の核酸分子が、前記核酸分子の少なくとも一部を逆転写するまたは複製するため
のプライマーとして使用される、請求項65に記載の方法。 - 核酸が、制限断片長多型分析、増幅断片長多型分析、マイクロサテライト増幅および/
または核酸配列決定から成る群より選択される手法を用いて検出される、請求項63から
67のいずれか1項に記載の方法。 - 核酸増幅を含む、請求項63から67のいずれか1項に記載の方法。
- 方法が遺伝子の発現レベルを分析する、請求項63から68のいずれか1項に記載の方
法。 - i)植物の穀粒の油においてオレイン酸の高い比率を与えるFad2対立遺伝子を含む
1番目の親イネ植物を、植物の穀粒の油においてパルミチン酸の低い比率を与えるFat
B対立遺伝子を含む2番目の親イネ植物と交配すること、
ii)交配からの子孫植物または穀粒を両方の対立遺伝子の存在に関してスクリーニン
グすること、および
iii)両方の対立遺伝子を含み、植物の穀粒の油においてオレイン酸の高い比率およ
びパルミチン酸の低い比率を有する子孫植物または穀粒を選択すること
を含む、イネ植物または種子を得る方法。 - i)1番目の親イネ植物を、Fad2対立遺伝子を含む2番目の親イネ植物と交配する
こと、および
ii)工程i)の交配の子孫を、1番目の親植物と同じ遺伝子型の植物と、1番目の親
の遺伝子型の大部分を有するが前記対立遺伝子を含む植物を生産するために十分な回数だ
け戻し交配すること、
iii)1番目の植物の遺伝子型の大部分を有し、前記対立遺伝子を含む植物を選択す
ること
を含み、前記対立遺伝子が、植物の油、ぬかおよび/または種子においてオレイン酸の高
い比率を与える、Fad2対立遺伝子をイネ植物に導入する方法。 - i)1番目の親イネ植物を、FatB対立遺伝子を含む2番目の親イネ植物と交配する
こと、および
ii)工程i)の交配の子孫を、1番目の親植物と同じ遺伝子型の植物と、1番目の親
の遺伝子型の大部分を有するが前記対立遺伝子を含む植物を生産するために十分な回数だ
け戻し交配すること、
iii)1番目の植物の遺伝子型の大部分を有し、前記対立遺伝子を含む植物を選択す
ること
を含み、前記対立遺伝子が、植物の油、ぬかおよび/または種子においてパルミチン酸の
低い比率を与える、FatB対立遺伝子をイネ植物に導入する方法。 - 野生型植物と比較したとき、Δ12デサチュラーゼ活性を有するFad2ポリペプチド
の生産が低下するようにイネ植物を遺伝的に操作することを含む、イネ植物の油、ぬかお
よび/または種子においてオレイン酸の比率を上昇させる方法。 - 野生型植物と比較したとき、FatB活性を有するFatBポリペプチドの生産が低下
するようにイネ植物を遺伝的に操作することを含む、イネ植物の油、ぬかおよび/または
種子においてパルミチン酸の比率を低下させる方法。 - 請求項56から74のいずれか1項に記載の方法を用いて得られるイネ植物、またはそ
の子孫植物。 - 請求項44、48、49、55または75のいずれか1項に記載の植物から得られる米
油。 - 請求項44、48、49、55または75のいずれか1項に記載の植物から得られる米
ぬか。 - 請求項44、48、49、55または75のいずれか1項に記載の植物から得られるイ
ネ種子。 - a)請求項19から21、44、48、49、55または76のいずれか1項に記載の
植物を生育すること、および
b)種子を収穫すること
を含む、種子を生産する方法。 - 請求項1から6または76のいずれか1項に記載の米油、請求項7から12または77
のいずれか1項に記載の米ぬかおよび/または請求項13から18または78のいずれか
1項に記載のイネ種子を含む食品生産物。 - 請求項1から6または76のいずれか1項に記載の米油中で食用物質を調理することを
含む、食品を調製する方法。
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