BRPI0714711A2

BRPI0714711A2 - alterando a composiÇço de Ácido graxo do arroz

Info

Publication number: BRPI0714711A2
Application number: BRPI0714711-2A
Authority: BR
Inventors: Ella Whitelaw; Sadequr Rahman; Zhongyi Li; Qing Liu; Surinder Pal Singh; Feyter Robert Charles De
Original assignee: Commw Scient Ind Res Org
Priority date: 2006-07-14
Filing date: 2007-07-13
Publication date: 2013-03-26
Also published as: US8530724B2; JP2014087347A; US9351507B2; CA2693630A1; AU2007272316B2; JP2009543561A; WO2008006171A1; CN101516181B; JP6042791B2; CN101516181A; EP2046108A4; EP2046108A1; US20160272919A1; AU2007272316A1; CN105123532B; US20090308041A1; US10260021B2; CA2693630C; CN105123532A; US20140120225A1

Abstract

ALTERANDO A COMPOSIÇçO DE ÁCIDO GRAXO DO ARROZ. A presente invenção refere-se a óleo de arroz, farelo de arroz e sementes de arroz que têm níveis alterados de ácido oleico, ácido palmítico e/ou ácido linoleico. A presente invenção também provê métodos para modificar geneticamente plantas de arroz tal que óleo de arroz, farelo de arroz e sementes de arroz produzidas a partir delas tenham níveis alterados de ácido oleico, ácido palmítico e/ou ácido linoleico. Especificamente isto é obtido através da modulação da expressão de Fad2 e/ou FatB.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ALTERANDO A COMPOSIÇÃO DE ÁCIDO GRAXO DO ARROZ".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a óleo de arroz, farelo de arroz e sementes de arroz que têm níveis alterados de ácido oleico, ácido palmítico e/ou ácido linoleico. A presente invenção também provê métodos para modi- ficar geneticamente plantas de arroz para que óleo de arroz, farelo de arroz e sementes de arroz produzidas a partir desta tenham níveis alterados de ácido oleico, ácido palmítico e/ou ácido linoleico. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Óleos vegetais são uma fonte importante de gordura de dieta para humanos, representando cerca de 25% de ingestão calórica em países desenvolvidos (Broun et al., 1999). A produção mundial atual de óleos vege- tais é de cerca de 110 milhões de toneladas por ano, das quais 86% são u- sadas para consumo humano. Quase todos esses óleos são obtidos a partir de colheitas de colheitas de sementes oleaginosas tal como, soja, canola, girassol, caroço de algodão e amendoim, ou árvores de plantação tal como palma, azeitona e coco (Gunstone, 2001; Oil World Annual, 2004). O cres- cente conhecimento científico e reconhecimento da comunidade do impacto dos componentes de ácidos graxos individuais de óleos alimentícios em vá- rios aspectos da saúde humana está motivando o desenvolvimento de óleos vegetais modificados que melhoraram o valor nutricional enquanto retêm a funcionalidade requerida para várias aplicações alimentares. Essas modifi- cações requerem conhecimento sobre as vias metabólicas para síntese de ácidos graxos e gene que codificam as enzimas para essas vias (Liu et al., 2002a; Thelen e Ohlrogge, 2002).

Atenção considerável está sendo dada ao impacto nutricional de várias gorduras e óleos, em particular a influência dos constituintes de gor- duras e óleos em doença cardiovascular, câncer e várias patologias inflama- tórias. Pensa-se que altos níveis de colesterol e ácido graxos saturados na dieta aumentam o risco de doença cardíaca e isto levou ao conselha nutri- cional para reduzir o consumo de gorduras animais saturadas ricas em co- Iesterol em favor de óleos vegetais insaturados livres de colesterol (Liu et ai, 2002a).

Enquanto ingestão de dieta de colesterol presente em gorduras animais possa aumentar significativamente os níveis de colesterol total no sangue, também foi descoberto que os ácidos graxos que compreendem as gorduras e óleos podem eles mesmos terem efeitos significativos em níveis de colesterol em soro sangüíneo. De particular interesse é o efeito de ácidos graxos de dieta nas formas da indesejada lipoproteína de baixa densidade (LDL) e da desejada lipoproteína de alta densidade (HDL) de colesterol no sangue. Em geral, ácidos graxos saturados, particularmente ácido mirístico (14:0) e ácido palmítico (16:0), os saturados principais presentes em óleos vegetais, têm a indesejada propriedade de elevar níveis de colesterol de LDL sérico e consequentemente aumentar o risco de doença cardiovascular (Zock et al., 1994; Hu et ai, 1997). Entretanto, tornou-se bem estabelecido que ácido esteárico (18:0), o outro saturado principal presente em óleos ve- getais, não eleva colesterol de LDL e pode realmente diminuir colesterol total (Bonanome e Grundy, 1988; Dougherty et al., 1995). Ácido esteárico é, por- tanto, geralmente considerado como sendo pelo menos neutro em relação ao risco de doença cardiovascular (Tholstrup, et aí., 1994). Por outro lado, ácido graxos insaturados, tal como ácido oleico monoinsaturado (18:1) e os polinsaturados ácido Iinoleico (18:2) e ácido α-linoleico (ALA, 18:3), têm a propriedade benéfica de diminuir colesterol de LDL (Mensink e Katan, 1989; Roche e Gibney, 2000), reduzindo assim o risco de doença cardiovascular.

Embora nutricionalmente desejável, óleos altamente insaturados são muito instáveis para uso em muitas aplicações alimentares, particular- mente para fritura de imersão comercial onde eles são expostos a altas tem- peraturas e condições oxidativas por longos períodos de tempo. Sob tais condições, o colapso oxidativo das numerosas ligações duplas de carbono presentes em óleso insaturados resulta no desenvolvimento de aldeído de cadeia curta, hidroperóxido e ceto derivados, conferindo aromas indesejá- veis e reduzindo o desempenho em fritura do óleo pela elevação do nível de compostos polares (Chang et al., 1978; Williams et a!., 1999). Processadores de óleo e fabricantes de alimentos têm tradicio- nalmente se baseado em hidrogenação para reduzir o nível de ácido graxos insaturados em óleos, aumentando desse modo sua estabilidade oxidativa em aplicações de tritura e também provendo gorduras sólidas para uso em margarina e manteiga para fazer bolos. A hidrogenação e um processo quí- mico que reduz o grau de insaturação de óleos pela conversão de ligações duplas de carbono em ligação simples de carbono. A hidrogenação completa produz uma gordura completamente saturada. Entretanto, o processo de hidrogenação parcial resulta em níveis aumentados tanto de ácido graxos saturados como ácidos graxos monoinsaturados. Alguns dos monoinsatura- dos formados durante a hidrogenação parcial estão na forme de isômero trans (tal como ácido elaídico, um isômero trans de ácido oleico) em vez do isômero eis que ocorre naturalmente (Sebedio et ai, 1994; Fernandez San Juan, 1995). Em contraste com ácidos graxos insaturados em eis, ácidos graxos em trans agora são conhecidos como sendo tão potentes quanto áci- do palmítico na elevação de níveis de colesterol LDL sérico (Mensink e Ka- tan, 1990; Noakes e Clifton, 1998) e diminuição de colesterol HDL sérico (Zock e Katan, 1992) e assim contribuem para risco aumentado de doença cardiovascular (Ascherio e Willett, 1997). Como resultado de aumento de consciência dos efeitos antinutricionais de ácido graxos trans, há no momen- to atual uma tendência crescente para longe do uso de óleos hidrogenados na indústria alimentícia, em favor de gorduras e óleos que são tanto nutricio- nalmente benéficos como podem prover a funcionalidade requerida sem hi- drogenação, em particular aqueles que são ricos quer em ácido oleico quan- do óleos líquidos são requeridos quer em ácido esteárico quando uma gor- dura sólida ou semissólida é preferida.

Óleos vegetais são compostos quase inteiramente de moléculas de triacilgliceróis (TAG), que consistem em três cadeias de ácido graxo (acil) esterificadas a um cerne de glicerol e são depositados em estruturas de cor- po de óleo especializado chamadas oleossomos (Stymne e Stobart1 1987). Esses lipídeos de estocagem servem como uma fonte de energia para a plântula que germina até ela ser capaz de fotossintetizar. Óleos vegetais comestíveis em uso comum são geralmente compreendidos por cinco ácidos graxos principais - os ácidos palmítico e esteárico saturados, o ácido oleico monoinsaturado e os ácido Iinoleico e α-linoleico poli-insaturados. Além de ácidos graxos, óleos vegetais também contêm alguns componentes menores importantes tal como tocoferóis, fitosteróis, terpenos e isoprenóides mistura- dos. Esses constituintes menores são de crescente interesse porque de- monstrou-se que alguns exercem efeitos benéficos na saúde da pele, enve- lhecimento, visão e colesterol sangüíneo ou previnem câncer de mama ou doença cardiovascular (Theriault et ai, 1999; Moghadasian e Frohlich, 1999).

Ácido graxo e síntese de TAG em sementes

Uma descrição geral diagramática das vias metabólicas para síntese de ácidos graxos em sementes em desenvolvimento é mostrada na Figura 1. Os estágios iniciais da síntese de ácido graxo ocorrem nos com- partimentos de plastídeos da célula, onde a síntese de cadeias de carbono de ácido graxo é iniciada com uma molécula C2 e prolongada através de um processo de condensação passo a passo pelo qual unidades de carbono C2 adicionais são doadas do malonil-ACP para as cadeias acila em alongamen- to. A primeira etapa nesta seqüência envolve a condensação de acetil-CoA com malonil-ACP e é catalisada pela enzima β-cetoacil sintase Ill (KASIII). As rodadas de condensação subsequentes são catalisadas por β-cetoacil sintase I (KASI) e resultam na formação eventual de uma cadeia de acil C16 saturada unida a uma proteína carreadora de acila (ACP), palmitoil-ACP. O alongamento final dentro do plastídeo é catalisado por β-cetoacil sintase Il (KASII) para formar a cadeia de acil C18 saturada, estearoil-ACP. Quando ocorre dessaturação, a primeira ligação dupla é introduzida na posição Δ9 da cadeia C18 por uma enzima solúvel no plastídeo, estearoil-ACP Δ9- dessaturase, para dar o oleoil-ACP C18:1 monoinsaturado.

Ácidos graxos assim sintetizados são retidos no plastídeo para modificação adicional e incorporação e lipídeos plastídicos, ou são liberados de suas ACPs por acil-tioesterases para produzir ácidos graxos livres que são exportados para o citosol para modificação adicional e eventual incorpo- ração em moléculas TAG. Demontrou-se que vegetais superiores têm pelo menos dois tipos de acil-tioesterases, FatA com especificidade de substrato para oleoil-ACP, uma acil-ACP insaturada e FatB com preferência por acil- ACPs saturadas (Jones et ai, 1995; Voelker et al., 1996).

Saindo dos plastídeos, ácidos graxos livres tornam-se esterifica-

dos para Co-enzima A (CoA) e estão então disponíveis para transferência para cernes de glicerol-3-fosfato (G-3-P) para formar ácido lisofosfatídico (LPA), ácido fosfatídico (PA) e fosfatidil-colina (PC). Adicionalmente, em al- gumas plantas, notadamente as espécies de Brassica, o ácido oleico esteri- ficado a CoA é capaz de ser alongado para formar ácido eicosenoico (C20:1) e ácido erúcico (C22:1). O ácido oleico esterificado a PC está disponível pa- ra modificações adicionais antes da incorporação em TAG. Em óleos comes- tíveis, as principais modificações em PC são as dessaturações seqüenciais de ácido oleico para formar ácidos Iinoleico e α-linoleico pelas enzimas Δ12- dessaturase (Fad2) e A15-dessaturase (Fad3) microssomais respectivamen- te.

Modificação de enzimas biossintéticas de ácidos graxos existentes

Abordagens de inativação gênica tal como silenciamento gênico pós-transcricional (PTGS) foram aplicadas com êxito para inativar genes bi- ossintéticos de ácidos graxos e desenvolver óleos vegetais melhorados nu- tricionalmente em sementes oleaginosas colheitas de por exemplo, linha- gens de soja com 80% de ácido oleico em seus óleos de semente foram cri- adas por co-supressão da A12-dessaturase microssomal codificada por Fad2 (Kinney, 1996). Isto reduziu o nível de A12-dessaturação e resultou em acúmulo de altas quantidades de ácido oleico. Usando uma abordagem simi- lar, silenciamento baseado em co-supressão do gene Fad2 foi usado para elevar níveis de ácido oleico em Brassica napus e B. Juncea (Stoutjesdijk et ai, 2000). Igualmente, demonstrou-se que a expressão transgênica em ca- roço de algodão de um alelo mutante do gene Fad2 obtido a partir de se- mente de colza é capaz de suprimir a expressão do gene Fad2 de algodão endógeno e resultou em conteúdo de ácido oleico elevado em cerca de me- tade das linhagens de algodão transgênico primárias (Chapman et ai., 2001). Em outra variação, a expressão transgênica em soja de um gene Fad2 ter- minado por uma ribozima autoclivante foi capaz de inativar o gene Fad2 en- dógeno resultando em níveis de ácido oleico elevados (Buhr et ai, 2002). Técnicas de silenciamento gênico mediado por RNAi também foram empre- gadas para desenvolver sementes oleaginosass com composição de ácido graxo nutricionalmente melhorada. Em caroço de algodão, a expressão transgênica de uma construção de silenciamento gênico de RNA em grampo (hpRNA) direcionada contra ghFad2-1, um membro específico de semente da família do gene Fad2 de algodão, resultou no aumento de ácido oleico a partir de níveis normais de 15% até 77% de ácidos graxos totais no óleo (Liu et ai, 20025b). Este aumento foi principalmente à custa do ácido Iinoleico que foi reduzido de níveis normais de 60% até tão baixos quanto 4%. Ácidos graxos em cereais

Em contraste com o trabalho considerável feito na biossíntese de ácidos graxos e modificação em sementes oleaginosas, a modificação de óleo em cereais é relativamente inexplorada. Isto provavelmente devido aos níveis muito menores de óleos (cerca de 1,5-6% em peso) em grãos de ce- reais e consequentemente a menor importância percebida de óleos de cere- ais na dieta humana. O arroz (Oryza sativa L.) é o grupo de cereal mais importante no

mundo em desenvolvimento e é crescido amplamente, particularmente na Ásia que produz cerca de 90% do total mundial. A vasta maioria de arroz no mundo é comida como "arroz branco" que é essencialmente o endosperma do grão de arroz, que tendo sido produzido pela moagem do grão colhido para remover o germe e camada de farelo externa (escutelo e embrião). Isto é feito primariamente porque "arroz marrom" não se conserva bem em esto- cagem, particularmente sob condições tropicais quentes.

O conteúdo de óleo de grãos de cereais tal como arroz (4%) é um pouco baixo em relação a sementes oleaginosas onde o óleo pode com- por até 60% do peso do grão (Ohlrogge e Jaworski, 1997). Entretanto, lipí- deos ainda podem compreender até 37% do peso seco do embrião do cereal (Choudhury e Juliano, 1980). A maior parte do conteúdo lipídico no grão de arroz é encontrado na camada de farelo externa (Resurreccion etal., 1979), mas algum também está presente no endosperma, pelo menos algum asso- ciado com o amido (Tabela 1 e 2). Os ácidos graxos principais em óleo de arroz são ácidos palmítico (16:0) (cerca de 20% de ácidos graxos totais nos TAG), oleico (18:1) (cerca de 40%) e Iinoleico (18:2) (cerca de 34%) (Radclif- fe et ai, 1997). Há uma faixa de níveis que ocorrem naturalmente em dife- rentes cultivares de arroz, por exemplo, para ácido oleico, de 37,9% até 47,5% e para Iinoleico (18:2), de 38,2% até 30,4% (Taira etal., 1988). Tabela 1. Composição de ácido graxo típica (ps% de ácidos graxos totais) para ácidos graxos selecionados de vários óleos vegetais.

Planta 16:0 18:1 18:2 Cevada 18 22 54 Soja 11 23 51 Amendoim 8 50 36 Canola 4 63 20 azeitona 15 75 9 Farelo de arroz 22 38 34

Embora o gene FatB tenha sido demonstrado como tendo uma

alta afinidade em catalisar a produção de ácido palmítico livre que é subse- qüentemente convertido a palmitoil-CoA em plantas sementes oleaginosas e plantas dicotiledôneas, nenhuma informação é relatada sobre a função de FatB em arroz ou outros cereais.

Tabela 2. Composição de ácido graxo (ps% de ácidos graxos totais) para ácidos graxos selecionados de lipídeos vegetais associados com amido.

Planta 16:0 18:1 18:2 Trigo 35-44 6-14 42-52 Cevada 55 4 36 Centeio 23 41 35 Aveia 40 22 35 Milho 37 11 46 Milho- alta amilose 36 20 38 Milho - waxy 36 23 36 Milho miúdo 36 28 29 Arroz 37-48 9-18 29-46

Dados adaptados d: Morrison (1988).

Algumas das dessaturase de ácido graxo foram caracterizadas em arroz, mas não Fad2. Akagai et al., (1995) publicaram a seqüência nu- cleotídica de um gene no cromossomo 4 de arroz codificando dessaturase de proteína carreadora de estearoil-acil de sementes em desenvolvimento. O produto gênico participa na produção de oleoil ACP de estearoil ACP. Koda- ma et al., (1997) relataram a estrutura, localização cromossômica e expres- são de Fad3 em arroz.

A proporção de ácido Iinoleico (18:3) em óleo de semente de arroz foi aumentada dez vezes pelo uso de expressão de Fad3 de soja (Anai et al., 2003). Mais recentemente, houveram relatos da produção de ácido Iinoleico conjugado em arroz pela introdução de um gene de Iinoleato isome- rase de bactérias (Kohno-Murase et al., 2006); ácido Iinoleico conjugado é relatado por ter atividade anticarcinogênica. Em uma tendência similar, modi- ficação in vitro de óleo de farelo de arroz para incorporar ácido cáprico, que pode melhorar a utilização lipídica de dieta em algumas doenças, usando enzimas microbianas imobilizadas também foi relatada (Jennings e Akoh, 2000). No milho, genes Fad2 e de FA-6 dessaturase foram sequenciados e mapeados por cromossomos (Mikkilinen e Rocheford, 2003). Os clones de Fad2 e Fad6 não poderiam ser mapeados para nenhum QLTs para razões de ácido oleico/linoleico no grão de milho. Não há relatos publicados de ou- tros genes Fad2 ou FatB caracterizados a partir de arroz, milho ou trigo. Estocagem de arroz

A estocagem de arroz por períodos de tempo prolongados em altas temperaturas prejudica a qualidade do grão devido à deterioração hi- drolítica e oxidativa de óleo de farelo. Dehulling a casca externa durante a colheita para produzir arroz marrom perturba as camadas de farelo externas, o que permite que o óleo se difunda para as camadas externas. Lipases en- dógenas e microbianas então catalisam a hidrólise de triglicerídeos a ácidos graxos livres (FFA) que são então oxidados para produzir um gosto estranho (Yasumatsu et ai, 1966, Tsuzuki et ai, 2004, Zhou et ai, 2002, Champagne e Grimm, 1995).

Hexanal é o principal componente aumentado no "headspace" de arroz marrom bruto e cozido estocado em altas temperaturas (Boggs et ai, Shibuya et ai, 1974, Tsugita et ai, 1983). Entretanto, hexanal por si só não é a causa principal do odor 'estranho'; o odor e aroma não-estimulantes de arroz deteriorado são provavelmente devidos a uma mistura dos voláteis que são aumentados após a estocagem. Esses incluem alcanais, alquenais, aldeídos aromáticos, cetonas, 2-pentilfurano, 4-vinilfenol e outros (Tsugita et ai, 1983). Contudo, demonstrou-se que níveis de hexanal durante a estoca- gem estão associados à oxidação de ácido Iinoleico (18:2) em arroz marrom e, portanto, são um bom indicador de deterioração oxidativa (Shin et al., 1986).

A produção de hexanal a partir de ácido Iinoleico pode ser catali- sada pela enzima Iipoxigenase (LOX) (St Ângelo et ai, 1980). Suzuki et ai, (1999) identificaram variedades de arroz que não possuem Lox3 e descobri- ram que na estocagem do grão mutante a 35°C por 8 semanas, menos he- xanal foi formado no vapor "headspace", tanto para grão de arroz marrom bruto como cozido. Eles também descobriram que arroz mutante formou menos pentanal e pentanol.

A camada de farelo de arroz externa rica em nutrientes obtida através de polimento das camadas externas do grão de arroz é uma exce- lente fonte de alimento, contendo compostos antioxidantes tais como tocotri- enóis e gama-orizanol que também é um fitoestrogênio (Rukmini e Raghu- ram, 1991). Descobriu-se que os compostos bioativos presentes em óleo de farelo de arroz diminuem o colesterol em seres humanos (Most et ai, 2005). Demonstrou-se também que esses componentes bioativos melhoram perfis lipídicos em ratos alimentados com uma dieta de colesterol alto (Ha et ai, 2005). Outros componentes importantes encontrados primariamente no fare- lo são precursores de vitamina A. Entretanto, esses benefícios nutricionais e de saúde são perdidos através do polimento do arroz e do consumo de arroz branco.

Ainda há uma necessidade por variedades de cereais, tal como arroz, que produzam grão com uma composição de óleo melhorada para benefícios à saúde, que ao mesmo tempo seja mais estável na estocagem, permitindo maior uso de, por exemplo, arroz marrom na dieta humana. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um aspecto, a presente invenção provê óleo de arroz que tem uma composição de ácido graxo compreendendo mais de cerca de 48% de ácido oleico, menos de cerca de 17% de ácido palmítico, menos de cerca de 30% de ácido Iinoleico e/ou qualquer combinação destes. Em uma modalidade, a razão de ácido oleico para ácido Iinoleico

é maior que 1,5:1, de preferência maior que 2:1, de maior preferência maior que 3:1 e ainda de maior preferência maior que 4:1.

Em outra modalidade, o óleo de arroz tem uma composição de ácido graxo compreendendo mais de cerca de 48% de ácido oleico, menos de cerca de 17% de ácido palmítico e menos de cerca de 30% de ácido Iino- leico.

Em uma modalidade adicional, o óleo de arroz tem uma compo- sição de ácido graxo compreendendo mais de cerca de 40% de ácido oleico, de preferência mais de cerca de 50% de ácido oleico e ainda de maior prefe- rência mais de cerca de 60% de ácido oleico. Em uma modalidade, a com- posição de ácido graxo do óleo de arroz está na faixa de 48-80% de ácido oleico, 6-16% de ácido palmítico e 10-25% de ácido linoleico.

Ainda em outra modalidade, o óleo de arroz tem uma composi- ção de ácido graxo compreendendo menos de cerca de 16% de ácido palmí- tico, de preferência menos de cerca de 15% de ácido palmítico, de maior preferência menos de cerca de 14% de ácido palmítico, de maior preferência menos de cerca de 13% de ácido palmítico e ainda de maior preferência menos de cerca de 12% de ácido palmítico.

Em outra modalidade, o óleo de arroz tem uma composição de ácido graxo compreendendo menos de cerca de 25% de ácido linoleico, de preferência menos de cerca de 20% de ácido linoleico, ainda de maior prefe- rência menos de cerca de 15% de ácido linoleico.

Em outro aspecto, a presente invenção provê farelo de arroz que tem uma composição de ácido graxo compreendendo mais de cerca de 48% de ácido oleico, menos de cerca de 17% de ácido palmítico, menos de cerca de 30% de ácido linoleico e/ou qualquer combinação destes. Em uma modalidade, a razão de ácido oleico para ácido linoleico

Em outra modalidade, o farelo de arroz tem uma composição de ácido graxo compreendendo mais de cerca de 48% de ácido oleico, menos de cerca de 17% de ácido palmítico e menos de cerca de 30% de ácido lino- leico.

Em uma modalidade adicional, o farelo de arroz tem uma com- posição de ácido graxo compreendendo mais de cerca de 40% de ácido ole- ico, de preferência mais de cerca de 50% de ácido oleico e ainda de maior preferência mais de cerca de 60% de ácido oleico. Em uma modalidade, a composição de ácido graxo do farelo de arroz está na faixa de 48-80% de ácido oleico, 6-16% de ácido palmítico e 10-25% de ácido linoleico.

Ainda em outra modalidade, o farelo de arroz tem uma composi- ção de ácido graxo compreendendo menos de cerca de 16% de ácido palmí- tico, de preferência menos de cerca de 15% de ácido palmítico, de maior preferência menos de cerca de 14% de ácido palmítico, de maior preferência menos de cerca de 13% de ácido palmítico e ainda de maior preferência menos de cerca de 12% de ácido palmítico.

Em outra modalidade, o farelo de arroz tem uma composição de ácido graxo compreendendo menos de cerca de 25% de ácido linoleico, de preferência menos de cerca de 20% de ácido linoleico, ainda de maior prefe- rência menos de cerca de 15% de ácido linoleico. Em um aspecto adicional, a presente invenção provê uma se- mente de arroz que tem uma composição de ácido graxo compreendendo mais de cerca de 48% de ácido oleico, menos de cerca de 17% de ácido palmítico, menos de cerca de 30% de ácido Iinoleico e/ou qualquer combina- ção destes.

Em uma modalidade, a razão de ácido oleico para ácido Iinoleico é maior que 1,5:1, de preferência maior que 2:1, de maior preferência maior que 3:1 e ainda de maior preferência maior que 4:1.

Em outra modalidade, a semente de arroz tem uma composição de ácido graxo compreendendo mais de cerca de 48% de ácido oleico, me- nos de cerca de 17% de ácido palmítico e menos de cerca de 30% de ácido linoleico.

Em uma modalidade adicional, o farelo de arroz tem uma com- posição de ácido graxo (isto é, do óleo dentro da semente) compreendendo mais de cerca de 40% de ácido oleico, de preferência mais de cerca de 50% de ácido oleico e ainda de maior preferência mais de cerca de 60% de ácido oleico. Em uma modalidade, a composição de ácido graxo da semente de arroz está na faixa de 48-80% de ácido oleico, 6-16% de ácido palmítico e 10-25% de ácido linoleico. Ainda em outra modalidade, a semente de arroz tem uma com-

posição de ácido graxo compreendendo menos de cerca de 16% de ácido palmítico, de preferência menos de cerca de 15% de ácido palmítico, de maior preferência menos de cerca de 14% de ácido palmítico, de maior pre- ferência menos de cerca de 13% de ácido palmítico e ainda de maior prefe- rência menos de cerca de 12% de ácido palmítico.

Em outra modalidade, a semente de arroz tem uma composição de ácido graxo compreendendo menos de cerca de 25% de ácido linoleico, de preferência menos de cerca de 20% de ácido linoleico, ainda de maior preferência menos de cerca de 15% de ácido linoleico. Em qualquer uma das modalidades descritas acima para farelo

de arroz ou semente de arroz, a composição de ácido graxo é tipicamente determinada pela extração do óleo e análise por FAME/GC como descrito no Exemplo 1. Composições para ácidos graxos individuais são expressas co- mo porcentual (p/p) dos ácidos graxos totais no óleo.

Em um aspecto adicional, é provida uma planta de arroz que produz óleo de arroz da invenção, farelo de arroz da invenção e/ou semente de arroz da invenção.

Em outro aspecto, a presente invenção provê um polinucleotídeo isolado que, quando presente em uma célula de uma planta de arroz, infrar- regula o nível de atividade de um polipeptídeo de Fad2 e/ou FatB na célula quando comparada a uma célula que não possui o citado polinucleotídeo. De preferência, o polinucleotídeo está operacionalmente ligado a

um promotor capaz de direcionar a expressão do polinucleotídeo em uma célula de uma planta de arroz.

Em uma modalidade, o polinucleotídeo infrarregula níveis de RNAm expressos a partir de pelo menos um gene Fad2 e/ou FatB. Exemplos de polinucleotídeos adequados incluem, mas não es-

tão limitados a, um polinucleotídeo selecionado de: um polinucleotídeo antis- sentido, um polinucleotídeo em sentido, um polinucleotídeo catalítico, um microRNA, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que se liga a um polipeptídeo de Fad2 e/ou FatB e um RNA de filamento duplo. Em uma modalidade, o polinucleotídeo é um polinucleotídeo an-

tissentido que se hibridiza sob condições fisiológicas a um polinucleotídeo compreendendo qualquer uma ou mais das seqüências de nucleotídeos pro- vidas como SEQ ID Nos 5 até 8, 11 até 14 ou 19 até 25.

Em uma modalidade adicional, o polinucleotídeo é um polinucle- otídeo catalítico capaz de clivar um polinucleotídeo compreendendo qual- quer uma ou mais das seqüências de nucleotídeos providas como SEQ ID Nos 5 até 8, 11 até 14 ou 19 até 25.

Em outra modalidade, o polinucleotídeo é uma molécula de RNA de filamento duplo (dsRNA) compreendendo um oligonucleotídeo que com- preende pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de qualquer uma ou mais das seqüências de nucleotídeos providas como SEQ ID Nos 5 até 8, 11 até 14 ou 19 até 25, em que a porção da molécula que é de filamento duplo tem pelo menos 19 pares de base de comprimento e compreende o citado oligo- nucleotídeo.

De preferência, o dsRNA é expresso a partir de um único promo- tor, em que os filamentos da porção de filamento duplo estão ligados por uma porção de filamento simples. Exemplos da construção de vetores para produzir tais moléculas de dsRNA são providos no Exemplo 5.

Em uma modalidade preferida, o polinucleotídeo, ou um filamen- to deste, é capaz de se hibridizar a um polinucleotídeo compreendendo qual- quer uma ou mais das seqüências de nucleotídeos providos como SEQ ID Nos 5 até 8, 11 até 14 ou 19 até 25 sob condições estringentes.

Em um aspecto adicional, a presente invenção provê um método para identificar um polinucleotídeo que, quando presente em uma célula de uma planta de arroz, infrarregula o nível de atividade de um polipeptídeo de Fad2 e/ou FatB na célula quando comparada a uma célula que não possui o citado polinucleotídeo, o método compreendendo

i) determinar a habilidade de um polinucleotídeo candidato em infrarregular o nível de atividade de um polipeptídeo de Fad2 e/ou FatB em uma célula e

ii) selecionar um polinucleotídeo que infrarregule o nível de ativi- dade de um polipeptídeo de Fad2 e/ou FatB na célula.

Etapa i) pode se basear em, por exemplo, analisar a quantidade ou atividade enzimática de um polipeptídeo de Fad2 e/ou FatB, ou na quan- tidade de mRNA codificando um polipeptídeo de Fad2 e/ou FatB na célula. Senão, etapa i) compreende analisar o conteúdo de ácido graxo da célula, ou de uma semente ou planta compreendendo a citada célula. De preferên- cia, etapa i) compreende a introdução de um polinucleotídeo candidato ou de um DNA quimérico incluindo um promotor operacionalmente ligado ao poli- nucleotídeo candidato em uma célula vegetal, de maior preferência em uma célula de arroz e ainda de maior preferência compreende a etapa de regene- rar uma planta transgênica a partir da célula vegetal e a produção da semen- te a partir da planta transgênica. O gene candidato pode ser um de uma co- leção de genes candidatos, pelo menos 2 ou 3 em número. A invenção, por- tanto, provê o uso dos polinucleotídeos da invenção em um método de tria- gem.

O polinucleotídeo pode ser, mas não está limitado a, um polinu- cleotídeo antissentido, um polinucleotídeo em sentido, um polinucleotídeo catalítico, um microRNA, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que se liga a um polipeptídeo de Fad2 e/ou FatB e um RNA de filamento du- plo.

Em uma modalidade, o polinucleotídeo antissentido se hibridiza sob condições fisiológicas a um polinucleotídeo compreendendo qualquer uma ou mais das seqüências de nucleotídeos providas como SEQ ID Nos 5 até 8, 11 até 14 ou 19 até 25.

Em outra modalidade, o polinucleotídeo catalítico é capaz de clivar um polinucleotídeo compreendendo qualquer uma ou mais das se- qüências de nucleotídeos providas como SEQ ID Nos 5 até 8, 11 até 14 ou 19 até 25.

Em uma modalidade adicional, a molécula de RNA de filamento duplo (dsRNA) compreende um oligonucleotídeo que compreende pelo me- nos 19 nucleotídeos contíguos de qualquer uma ou mais das seqüências de nucleotídeos providas como SEQ ID Nos 5 até 8, 11 até 14 ou 19 até 25, em que a porção da molécula que é de filamento duplo tem pelo menos 19 pa- res de base de comprimento e compreende o citado oligonucleotídeo.

Também é provido um polinucleotídeo isolado identificado usan- do um método da invenção.

Em um aspecto adicional, a presente invenção provê um vetor compreendendo ou codificando um polinucleotídeo da invenção.

De preferência, o polinucleotídeo, ou seqüência codificando o polinucleotídeo, está operacionalmente ligada a um promotor. De preferên- cia, o promotor confere expressão do polinucleotídeo preferencialmente no embrião, endosperma, camada do farelo e/ou semente de uma planta de arroz em relação à pelo menos um outro tecido ou órgão da citada planta.

Também é provida uma célula compreendendo o vetor da inven- ção e/ou o polinucleotídeo da invenção. Em uma modalidade, o polinucleotídeo ou vetor foi introduzido na célula ou em um progenitor da célula.

Em uma modalidade adicional, a célula é uma célula de arroz ou uma célula de Agrobacterium.

De preferência, o polinucleotídeo está integrado ao genoma da

célula.

Em outro aspecto, a presente invenção provê uma planta de ar- roz compreendendo uma célula da invenção.

Ainda em outro aspecto, a presente invenção provê um método para produzir a célula da invenção, o método compreendendo a etapa de introduzir o polinucleotídeo da invenção, ou um vetor da invenção, em uma célula.

De preferência, o método compreende adicionalmente a etapa de regenerar uma planta transgênica a partir da célula. Também é provido o uso do polinucleotídeo da invenção ou de

um vetor da invenção para produzir uma célula recombinante.

Ainda em outro aspecto, a presente invenção provê uma planta de arroz modificada geneticamente, em que a planta tem expressão diminuí- da de um polipeptídeo que tem atividade de Fad2 e/ou FatB em relação a uma planta não-modificada correspondente.

De preferência, a planta foi transformada tal que ela compreenda um polinucleotídeo da invenção, ou uma planta da progênie desta que com- preenda o citado polinucleotídeo.

Em um aspecto adicional, a presente invenção provê um método para produzir óleo de arroz da invenção, farelo de arroz da invenção e/ou semente de arroz da invenção, o método compreendendo expor uma planta de arroz a um antagonista de um polipeptídeo de Fad2 e/ou FatB.

Em outro aspecto, a presente invenção provê um método para obter uma planta de arroz modificada geneticamente que possa ser usada para produzir semente de arroz marrom com uma vida de estocagem au- mentada quando comparada a uma semente de arroz marrom não- modificada, o método compreendendo manipular geneticamente a planta tal que a atividade e/ou nível de produção de um polipeptídeo de Fad2 e/ou FatB seja reduzido na semente de arroz quando comparada a uma planta correspondente que produz semente de arroz marrom não-modificada.

De preferência, a atividade e/ou nível de produção de um poli- peptídeo de Fad2 e/ou FatB está reduzido apenas na semente da planta.

Em uma modalidade, a atividade e/ou nível de produção de um polipeptídeo de Fad2 está reduzido.

Em uma modalidade adicional, a planta transgênica compreende um polinucleotídeo da invenção ou um vetor da invenção. Em um aspecto adicional, a presente invenção provê uma planta

de arroz modificada geneticamente produzida usando um método da inven- ção, ou progênie desta.

Em um aspecto adicional, a presente invenção provê um método para selecionar uma planta de arroz que possa ser usada para produzir óleo de arroz da invenção, farelo de arroz de acordo com a invenção e/ou semen- te de arroz da invenção, o método compreendendo;

i) triar uma população mutagênica de sementes de arroz ou plantas de arroz e

ii) selecionar uma semente ou planta que seja capaz de produzir óleo de arroz da invenção, farelo de arroz da invenção e/ou semente de ar- roz da invenção.

Em uma modalidade, etapa i) compreende analisar uma semen- te e/ou planta mutagênica por um polipeptídeo que tenha atividade de Fad2 e/ou FatB.

Em outra modalidade, etapa i) compreende analisar a seqüência

e/ou níveis de expressão de um gene Fad2 e/ou FatB da semente e/ou plan- ta mutagênica.

Em uma modalidade adicional, etapa i) compreende analisar a composição de ácido graxo do óleo, farelo e/ou semente da semente e/ou planta mutagênica.

Em um aspecto adicional, a presente invenção provê um método para selecionar uma planta de arroz que possa ser usada para produzir óleo de arroz da invenção, farelo de arroz da invenção e/ou semente de arroz da invenção, o método compreendendo;

i) analisar o conteúdo de ácido graxo dos citados óleo de arroz, farelo de arroz e/ou semente obtidos de uma planta de arroz candidata e ii) selecionar uma planta de arroz que possa ser usada para pro-

duzir óleo de arroz da invenção, farelo de arroz da invenção e/ou semente de arroz da invenção.

Ainda em um aspecto adicional, a presente invenção prove um método para selecionar uma planta de arroz que possa ser usada para pro- duzir óleo de arroz da invenção, farelo de arroz da invenção e/ou semente de arroz da invenção, o método compreendendo

i) analisar uma amostra de uma planta candidata por um polipep- tídeo que tenha atividade de Fad2 e/ou FatBe

ii) selecionar uma planta de arroz que possa ser usada para pro- duzir óleo de arroz da invenção, farelo de arroz da invenção e/ou semente

de arroz da invenção com base na seqüência, nível de produção e/ou ativi- dade do citado polipeptídeo.

Em outro aspecto, a presente invenção provê um método para selecionar uma planta de arroz que possa ser usada para produzir óleo de arroz da invenção, farelo de arroz da invenção e/ou semente de arroz da invenção, o método compreendendo

i) analisar a seqüência e/ou níveis de expressão de um gene Fad2 e/ou FatB de uma planta candidata e

de arroz da invenção com base na seqüência e/ou níveis de produção do citado gene.

Ainda em outro aspecto, a presente invenção provê um método para identificar uma planta de arroz que possa ser usada para produzir óleo de arroz da invenção, farelo de arroz da invenção e/ou semente de arroz da invenção, o método compreendendo detectar uma molécula de ácido nuclei- co da planta, em que a molécula de ácido nucleico está ligada a e/ou com- preende pelo menos uma parte de, um gene Fad2 e/ou gene FatB na planta.

Em um aspecto adicional, a presente invenção provê um método para identificar uma planta de arroz que possa ser usada para produzir se- mente de arroz marrom com uma vida de estocagem aumentada, o método compreendendo detectar uma molécula de ácido nucleico da planta, em que a molécula de ácido nucleico está ligada a e/ou compreende pelo menos uma parte de, um gene Fad2 e/ou gene FatB na planta.

Em uma modalidade, os dois métodos acima compreendem:

i) hibridizar uma segunda molécula de ácido nucleico à citada molécula de ácido nucleico que é obtida a partir da citada planta,

ii) hibridizar opcionalmente pelo menos uma outra molécula de ácido nucleico à citada molécula de ácido nucleico que é obtida a partir da citada planta e

iii) detectar um produto da(s) citada(s) etapa(s) de hibridização ou a ausência de um produto da(s) citada(s) etapa(s) de hibridização.

Em uma modalidade, a segunda molécula de ácido nucleico é usada como um iniciador para transcrever reversamente ou replicar pelo menos uma porção da molécula de ácido nucleico.

O ácido nucleico pode ser detectado usando qualquer técnica tal como, mas não limitando a, análise de polimorfismo de comprimento de frag- mento de restrição, análise de polimorfismo de comprimento de fragmento de amplificação, amplificação de microssatélites e/ou sequenciamento de ácido nucleico.

Em uma modalidade, o método compreende amplificação de ácido nucleico. Em outra modalidade, o método analisa níveis de expressão do gene.

Também é provido um método para obter uma semente ou plan- ta de arroz, o método compreendendo;

i) cruzar uma primeira planta de arroz parental que compreende um alelo de Fad2 que confere uma proporção aumentada de ácido oleico no óleo do grão da planta com uma segunda planta de arroz parental que com- preende um alelo de FatB que confere uma proporção diminuída de ácido palmítico no óleo do grão da planta;

ii) triar plantas da progênie ou grãos do cruzamento por presen- ça de ambos os alelos e

iv) selecionar uma planta ou grão da progênie compreendendo ambos os alelos e tendo uma proporção aumentada de ácido oleico e uma proporção diminuída de ácido palmítico no óleo do grão da planta.

Em outro aspecto, a presente invenção provê um método para introduzir um alelo Fad2em uma planta de arroz, o método compreendendo

i) cruzar uma primeira planta de arroz parental com uma segun- da planta de arroz parental, em que a segunda planta compreende o citado alelo e

ii) cruzar de novo a progênie do cruzamento da etapa i) com plantas do mesmo genótipo da primeira planta parental por um número sufi- ciente de vezes para produzir uma planta com a maior parte do genótipo do primeiro genitor, mas compreendendo o citado alelo

iii) selecionar uma planta com a maior parte do genótipo da pri- meira planta e compreendendo o citado alelo;

em que o citado alelo confere uma proporção aumentada de áci- do oleico no óleo, farelo e/ou semente da planta.

Ainda em outro aspecto, a presente invenção provê um método para introduzir um alelo FatB em uma planta de arroz, o método compreen- dendo

em que o citado alelo confere uma proporção diminuída de ácido palmítico no óleo, farelo e/ou semente da planta.

Adicionalmente, é provido um método para aumentar a propor- ção de ácido oleico no óleo, farelo e/ou semente de uma planta de arroz, o método compreendendo manipular geneticamente a citada planta tal que a produção de um polipeptídeo Fad2 seja diminuída quando comparada a uma planta selvagem, em que o polipeptídeo tem atividade de Δ12 dessaturase.

Ainda em outro aspecto, a presente invenção provê um método para diminuir a proporção de ácido palmítico no óleo, farelo e/ou semente de uma planta de arroz, o método compreendendo manipular geneticamente a citada planta tal que a produção de um polipeptídeo FatB seja diminuída quando comparada a uma planta selvagem, em que o polipeptídeo tenha atividade (FatB).

Também é provida uma planta de arroz obtida usando um méto- do da invenção, ou planta da progênie desta. Em um aspecto adicional, a presente invenção provê óleo de

arroz obtido a partir de uma planta da invenção.

Em um aspecto adicional, a presente invenção provê farelo de arroz obtido a partir de uma planta da invenção.

Em um aspecto adicional, a presente invenção provê semente de arroz obtida a partir de uma planta da invenção.

Adicionalmente, é provido um método para produzir semente, o método compreendendo;

a) cultivar uma planta da invenção e

b) recuperar a semente.

Ainda em outro aspecto, a presente invenção provê um produto

alimentício compreendendo óleo de arroz da invenção, farelo de arroz da invenção ou 77 e/ou semente de arroz da invenção.

Em outro aspecto, a presente invenção provê um método para preparar alimentos, o método compreendendo cozinhar uma substância co- mestível em óleo de arroz da invenção.

Como será evidente, traços e características preferidas de um aspecto da invenção são aplicáveis a muitos outros aspectos da invenção. Por todo este relatório descritivo a palavra "compreende", ou va- riações tal como "compreendem" ou "compreendendo", será entendida por implicar a inclusão de um elemento relatado, inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro ele- mento, inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, inteiros ou etapas.

A invenção é descrita daqui por diante por meio dos seguintes Exemplos não-limitantes com referência às figuras acompanhantes. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS ANEXAS

Figura 1 - Vias biossintéticas de ácidos graxos principais em plastídeo e citosol de vegetais superiores.

Figura 2 - Alinhamento de proteínas FatB de arroz. Protein- FATB2 = SEQ ID NO: 1, proteinFATB3 = SEQ ID NO: 2, proteinFATBI = SEQ ID NO: 3 e proteinFATB4 = SEQ ID NO: 4.

Figura 3 - Estruturas de gene FatB de arroz. LOC_OsC)2g4 = SEQ ID NO: 5, L0C_0s11g4 = SEQ ID NO: 6, LOC_Os()6gO = SEQ ID NO: 7 e L0c_0s06g3 = SEQ ID NO: 8.

Figura 4 - Alinhamento de seqüências gênicas de FatB por Clus- talW. Foram usados parâmetros-padrão e note que os 'genes' são de com- primentos diferentes. Figura 5 - As estruturas éxon-íntron do gene FatB correspondem

a L0c_0s6g05130. A linha superior corresponde ao início da seqüência co- dificante no mRNA (SEQ ID NO: 9) e a segunda linha do par corresponde ao gene (SEQ ID NO: 10).

Figura 6 - Alinhamento de seqüência codificante de quatro iso- formas de FatB mostrando éxons consecutivos em alternância de minúscu- las e maiúsculas, respectivamente e localização de iniciadores (sublinhado) usada para distinguir as isoformas por RT-PCR. O códon de início (posição de início a) está em negrito. AC108870 = SEQ ID NO: 11, AP005291 = SEQ ID NO: 12, AP00399 = SEQ ID NO: 13 e AP004236 = SEQ ID NO: 14. Figura 7 - Alinhamento de Clustal W de seqüência polipeptídica

deduzida de isoformas de Fad2. Note que a linha F_1 corresponde a 0s02g48560, F_2 corresponde a Qs07g263410, F_3 a 0s07g23430 e 0_4 a 0s07g23390. O programa Clustal W (Fast) com parâmetros-padrão foi usa- da. ProteinF_1 = SEQ ID NO: 15, ProteinF_3 = SEQ ID NO: 16, ProteinF_2 = SEQ ID NO: 17 e ProteinF_4 = SEQ ID NO: 18.

Figura 8 - Alinhamento de seqüências de Fad2 mostrando a Io- calização 5' UTR na isoforma AP004047 (minúsculas) e localização de inici- adores usadas para amplificação por RT-PCR (sublinhado). A localização do códon de parada é indicada por uma caixa e regiões não-traduzidas a jusan- te do códon de parada estão em minúsculas. AP005168 = SEQ ID NO: 19, AP004047 = SEQ ID NO: 20 e Contig2654 = SEQ ID NO: 21. Figura 9 - Estruturas gênicas de Fad2 de arroz.

Figura 10 - Alinhamento das seqüências nucleotídicas das regi- ões codificantes de proteína para genes Fad2 de arroz. Linha 0_2 corres- ponde a 0s07g23410, 0_4 a 0s07g23390, 0_1 a 0s02g48560 e 0_3 a 0s07g23410. O programa Clustal W com parâmetros-padrão foi usado. CdsFAD20_2 = SEQ ID NO: 22, CdsFAD20_4 = SEQ ID NO: 23, Cds- FAD20_1 = SEQ ID NO: 24 e CdsFAD20_3 = SEQ ID NO: 25.

Figura 11 - Representação gráfica das porcentagens relativas de ácido palmítico, oleico e Iinoleico como determinado por análise GC de fra- ção de óleo total de grãos de genótipos indicados. Figura 12 - Representação gráfica das porcentagens relativas de

ácido palmítico e oleico em uma análise de lipídeo total GC de grãos dos genótipos indicados.

Figura 13 - Representação gráfica das porcentagens relativas de ácido Iinoleico e oleico em uma análise de lipídeo total GC de grãos dos ge- nótipos indicados.

Figura 14 - Plotagem de dispersão mostrando a porcentagem de ácido Iinoleico contra oleico no grão de plantas de arroz dos genótipos indi- cados. Note que a relação (refletida na inclinação da linha) entre as quanti- dades desse dois ácidos graxos é essencialmente a mesma em todas as linhas analisadas, mas a capacidade de tamanho do reservatório parece ser diferente (como refletido nos deslocamentos das diferentes linhas ao longo do espaço analisado. Figura 15 - Plotagem de dispersão da porcentagem de ácido Ii- noleico contra palmítico entre diferentes genótipos. Note as diferentes incli- nações das linhas afetadas em FatB comparadas aquelas afetadas em Fad2. Isto sugere a relação entre esses componentes é diferente nos dife- rentes genótipos, provavelmente refletindo as diferenças nas etapas afeta- das.

Figura 16 - Plotagem de dispersão da porcentagem de ácido ole- ico contra palmítico para vários genótipos. Note as diferentes nas inclina- ções.

Figura 17 - Representação gráfica de Análise de Componente

Principal de variação em composição de óleo para plantas com RNAi de Fad2 e plantas com RNAi de FatB. Os resultados mostram que Componente Principal 2 é Linoleico contra Oleico e Componente Principal 2 é Palmítico contra Linoleico mais Oleico.

Figura 18 -Western beat mostrando a reação de antissoros inci-

tados contra peptídeo. FatB-99 contra extratos proteicos de folha total anali- sados por SDS-PAGE. Um peptídeo de aprox. 20 kDa está faltando na linha Tos-17. A reação com soros pré-imunes é indicada. R refere-se a linhas de RNAi de FatB e T à linha Tos-17. W1 e W2 são selvagens.

CHAVE PARA LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS SEQ ID NO: 1 - Proteína FatB2 de arroz. SEQ ID NO: 2 - Proteína FatB3 de arroz. SEQ ID NO: 3 - Proteína FatBI de arroz. SEQ ID NO: 4 - Proteína FatB4 de arroz.

SEQ ID NO: 5 - Gene de FatB3 de arroz. SEQ ID NO: 6 - Gene de FatB2 de arroz. SEQ ID NO: 7 - Gene de FatBI de arroz. SEQ ID NO: 8 - Gene de FatB4 de arroz. SEQ ID NO: 9 - cDNA codificando proteína FatBI de arroz.

SEQ ID NO: 10 - Gene codificando proteína FatBI de arroz (apenas se- qüência parcial, vide Figura 5 - inclui todas as seqüências exônicas e algu- ma seqüência flanqueadora e de íntron). SEQ ID NO: 11 - Fase de leitura aberta codificando proteína FatB2 de arroz. SEQ ID NO: 12 - Fase de leitura aberta codificando proteína FatB3 de arroz. SEQ ID NO: 13 - Fase de leitura aberta codificando proteína FatBI de arroz. SEQ ID NO: 14 - Fase de leitura aberta codificando proteína FatB4 de arroz. SEQ ID NO: 15 - Isoforma 1 de Fad2 de arroz. SEQ ID NO: 16 - Isoforma 3 de Fad2 de arroz. SEQ ID NO: 17 - Isoforma 2 de Fad2 de arroz. SEQ ID NO: 18 - Isoforma 4 de Fad2 de arroz. SEQ ID NO: 19 - cDNA de Fad2-3 de arroz. SEQ ID NO: 20 - cDNA de Fad2-1 de arroz. SEQ ID NO: 21 - cDNA de Fad2-2 de arroz. SEQ ID NO: 22 - Fase de leitura aberta codificando Fad2-2 de arroz. SEQ ID NO: 23 - Fase de leitura aberta codificando Fad2-4 de arroz. SEQ ID NO: 24 - Fase de leitura aberta codificando Fad2-1 de arroz. SEQ ID NO: 25 - Fase de leitura aberta codificando Fad2-3 de arroz. SEQ ID NO: 26 - Seqüência consenso de FatB. SEQ ID NO: 27 até 33 - Seqüência consenso de Fad2. SEQ ID NO: 34 até 55 e 60 até 63 - Iniciadores oligonucleotídicos. SEQ ID NO: 56 até 59 - Peptídeos de FatB de arroz antigênicos. SEQ ID NO: 64 até 83 - Seqüência de um filamento de moléculas que po- dem : ser usadas para RNAi. DESCRICÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Técnicas Gerais

A menos que especificamente definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados aqui serão tomados como tendo o mesmo significado como comumente entendido por alguém versado na téc- nica (por exemplo, em cultura de células, biologia molecular vegetal, genéti- ca molecular, imunologia, imunoistoquímica, química de proteínas e bioquí- mica).

A menos que indicado de outro modo, as técnicas de proteína

recombinante, cultura de células e imunológicas utilizadas na presente in- venção são procedimentos padrão, bem-conhecidos por aqueles versados na técnica. Tais técnicas são descritas e explicadas em toda a literatura em fontes tal como J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning1 John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et ai, Molecular Cloning: A Laboratory Manu- al, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T. A. Brown (editor), Es- sencial Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 e 2, IRL Press (1991), D. M. Glover e B. D. Hames (editores), DNA Cloning: A Practical Ap- proach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 e 1996) e F. M. Ausubel et ai, (edito- res), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, incluindo todas as atualizações até o momento), Ed Harlow e David Lane (editores) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory (1988) e J. E. Coligan et ai, (editores) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (incluindo todas as atualiza- ções até o momento). Definições Selecionadas Conforme aqui utilizado, o termo "polipeptídeo de Fad2' se refe-

re a uma proteína que realiza uma reação de dessaturase convertendo ácido oleico a ácido linoleico. Assim, o termo "atividade de Fad2' se refere à con- versão de ácido oleico a ácido linoleico. Esses ácidos graxos podem estar em uma forma esterificada, tal como, por exemplo, como parte de um fosfo- lipídeo. Exemplos de polipeptídeos Fad2 de arroz incluem proteínas com- preendendo uma seqüência de aminoácidos provida na Figura 7 e SEQ ID Nos 15 até 18, assim como variantes e/ou mutantes destes. Tais variantes e/ou mutantes podem possuir pelo menos 80% de identidade, de maior pre- ferência pelo menos 90% de identidade, de maior preferência pelo menos 95% de identidade e ainda de maior preferência pelo menos 99% de identi- dade com qualquer um dos polipeptídeos providos na Figura 7 e SEQ ID Nos 15 até 18.

Um "polinucleotídeo de Fad2' ou "gene Fad2' codifica um poli- peptídeo de Fad2. Exemplos de polinucleotídeos de Fad2 incluem ácidos nucleico compreendendo uma seqüência nucleotídica provida na Figura 8 ou e SEQ ID Nos 19 até 25, assim como variantes alélicas e/ou mutantes destes. Exemplos de genes Fad2 incluem ácidos nucleicos compreendendo uma seqüência nucleotídica provida na Figura 8 e SEQ ID Nos 19 até 21, assim como variantes alélicas e/ou mutantes destes. Tais variantes alélicas e/ou mutantes podem possuir pelo menos 80% de identidade, de maior pre- ferência pelo menos 90% de identidade, de maior preferência pelo menos 95% de identidade e ainda de maior preferência pelo menos 99% de identi- dade com qualquer um dos polinucleotídeos providos na Figura 8 e/ou 10 e/ou SEQ ID Nos 19 até 25.

Conforme aqui utilizado, o termo "polipeptídeo de FatB' se refere a uma proteína que hidrolisa palmítoil-ACP para produzir ácido palmítico Ii- vre. Assim, o termo "atividade de FatB' se refere à hidrólise de palmitoil-ACP para produzir ácido palmítico livre. Exemplos de polipeptídeos de FatB de arroz incluem proteínas compreendendo uma seqüência de aminoácidos provida na Figura 2 SEQ ID Nos 1 até 4, assim como variantes e/ou mutan- tes destes. Tais variantes e/ou mutantes podem possuir pelo menos 80% de identidade, de maior preferência pelo menos 90% de identidade, de maior preferência pelo menos 95% de identidade e ainda de maior preferência pelo menos 99% de identidade com qualquer um dos polipeptídeos providos na Figura 2 e SEQ ID Nos 1 até 4.

Um "polinucleotídeo de FatB' ou "gene FatB' codifica um poli- peptídeo de FatB. Exemplos de polinucleotídeos de FatB incluem ácidos nu- cleicos compreendendo uma seqüência nucleotídica provida na Figura 4 e 6 e SEQ ID Nos 5 até 8 e 11 até 14, assim como variantes alélicas e/ou mu- tantes destes. Exemplos de genes FatB incluem ácidos nucleicos compre- endendo uma seqüência nucleotídica provida na Figura 4 e SEQ ID Nos 5 até 8, assim como variantes alélicas e/ou mutantes destes. Tais variantes alélicas e/ou mutantes podem possuir pelo menos 80% de identidade, de maior preferência pelo menos 90% de identidade, de maior preferência pelo menos 95% de identidade e ainda de maior preferência pelo menos 99% de identidade com qualquer um dos polinucleotídeos providos na Figura 4 e/ou 6 e/ou SEQ ID Nos 5 até 8 e 11 até 14.

Conforme aqui utilizado, o termo "arroz" se refere a qualquer es- pécie do gênero Oryza incluindo progenitores dessas, assim como progênie dessas produzidas por cruzamentos com outras espécies. Prefere-se que a planta seja de uma espécie de Oryza que é cultivada comercialmente tal como, por exemplo, uma cepa ou cultivar ou variedade de Oryza sativa ou adequada para produção comercial de grão.

Conforme aqui utilizado, o termo "óleo de arroz" se refere a uma

composição obtida da semente/grão, ou de uma porção dessa tal como a camada do farelo, de uma planta de arroz que compreende pelo menos 60% (p/p) de lipídeo. Óleo de arroz é tipicamente um líquido em temperatura am- biente. De preferência, o lipídeo compreende ácidos graxos que possuem pelo menos 6 carbonos de comprimento. Os ácidos graxos estão tipicamente em uma forma esterificada, tal como, por exemplo, triacilgliceróis, fosfolipí- deo. O óleo de arroz da invenção compreende ácido oleico. O óleo de arroz da invenção também pode compreender pelo menos alguns outros ácidos graxos tal como ácido palmítico, ácido linoleico, ácido mirístico, ácido esteá- rico e/ou ácido linoleico. Os ácidos graxos podem ser ácidos graxos livres e/ou ser encontrados como triacilgliceróis (TAGs). Em uma modalidade, pelo menos 50%, de maior preferência pelo menos 70%, de maior preferência pelo menos 80% dos ácido graxos em óleo de arroz da invenção são encon- trados como TAGs. O óleo de arroz da invenção pode formar parte do grão/semente de arroz ou porção desta tal como a camada de aleurona ou embrião/escutelo, que juntos são referidos como "farelo de arroz". Senão, o óleo de arroz da invenção foi extraído de grão/semente de arroz ou farelo de arroz. Um exemplo de tal procedimento de extração é provido no Exemplo 1. Assim, em uma modalidade, o "óleo de arroz" da invenção é "consideravel- mente purificado" ou óleo de arroz "purificado" que foi separado de um ou mais outros lipídeos, ácidos nucleicos, polipeptídeos, ou outras moléculas contaminantes com as quais ele está associado em seu estado nativo. Pre- fere-se que o óleo de arroz purificado seja pelo menos 60% livre, de maior preferência pelo menos 75% livre e de maior preferência pelo menos 90% livre de outros componentes com os quais ele está naturalmente associado. Em uma modalidade preferida, na extração a razão de ácido oleico para áci- do linoleico, ácido palmítico para ácido oleico e/ou ácido palmítico para ácido Iinoleico não foi significativamente alterada (por exemplo, não mais que 5% de alteração) quando comparada à razão na semente/grão ou farelo intacto. Em uma modalidade adicional, o óleo de arroz não foi exposto a um proce- dimento, tal como hidrogenação, que pudesse alterar a razão de ácido oleico para ácido linoleico, ácido palmítico para ácido oleico e/ou ácido palmítico para ácido linoleico quando comparada à razão na semente/grão ou farelo intacto. O óleo de arroz da invenção pode adicionalmente compreender mo- léculas não ácido graxo tal como, mas não limitando a, γ-orizanóis e este- róis.

O óleo de arroz pode ser extraído a partir de semente ou farelo

de arroz por qualquer método conhecido na técnica. Isto tipicamente envolve a extração com solventes não-polares tal como éter dietílico, éter de petró- leo, clorofórmio/metanol ou misturas de butanol. Lipídeos associados com o amido no grão podem ser extraídos com butanol saturado com água. O óleo de arroz pode ser "desgomado" por métodos conhecidos na técnica para remover polissacarídeos ou tratado de outras formas para remover contami- nantes ou melhorar a pureza, estabilidade ou cor. Os triacilgliceróis e outros ésteres no óleo podem ser hidrolisados para liberar ácidos graxos livres, ou o óleo hidrogenado ou tratado quimicamente ou enzimaticamente como co- nhecido na técnica.

O óleo de arroz após extração a partir de semente ou farelo de arroz tipicamente compreende o grupo de lipídeos chamados γ-orizanóis. Conforme aqui utilizado, "compreende γ-orizanol" se refere à presença de pelo menos 0,1% (p/p) de compostos de γ-orizanol no óleo. Os níveis de γ- orizanol em óleo de arroz após extração e antes da remoção a partir do TAG é tipicamente 1,5-3,5% (p/p). Os compostos são tipicamente uma mistura de esteril e outros triterpenil ésteres do ácido ferúlico (ácido 4-hidróxi-3-metóxi cinâmico). Ferulato de cicloartenil, ferulato de 24-metileno cicloartanil e feru- Iato de campesteril são os ferulatos predominantes em orizanol, com níveis menores de ferulato de β-sitosteril e ferulato de estigmasteril. Pensa-se que a presença de γ-orizanóis ajuda a proteger consumidores de óleo de arroz contra doenças crônicas tal como doença cardíaca e câncer e, portanto, a presença de γ-orizanol é vantajosa.

Conforme aqui utilizado, o termo "farelo de arroz" se refere à camada (camada de aleurona) entre o grão de arroz branco interno e a cas- ca externa de uma semente/grão de arroz assim como o embrião/escutelo do grão. O farelo de arroz é o subproduto primário do polimento de arroz marrom para produzir arroz branco.

Conforme aqui utilizado, o termo "vida de estocagem aumenta- da" se refere a um método da invenção que produz uma semente/grão, que na colheita, pode ser estocado como arroz marrom por um período acentua- do de tempo quando comparado a, por exemplo, arroz marrom colhido a par- tir de uma planta de arroz selvagem (não-modificada geneticamente). Con- forme aqui descrito, uma media para "vida de estocagem aumentada" de arroz marrom é a produção de hexanal após estocagem por pelo menos 8 semanas a 40°C (vide o Exemplo 8). O termo "planta" inclui plantas inteiras, estruturas vegetativas

(por exemplo, folhas, caules), raízes, órgãos/estruturas florais, semente (in- cluindo embrião, endosperma e revestimento de semente, tecido vegetal (por exemplo, tecido vascular, tecido de raiz e similares), células e progênie das mesmas.

Uma "planta transgênica", "planta geneticamente modificada" ou

variações dessas se referem a uma planta que contém uma construção gê- nica ("transgene") não encontrado em uma planta selvagem da mesma es- pécie, variedade ou cultivar. Um "transgene" como referido aqui tem o signi- ficado normal na técnica de biotecnologia e inclui uma seqüência genética que foi produzida ou alterada por DNA recombinante ou tecnologia de RNA e que foi introduzida na célula vegetal. O transgene pode incluir seqüências genéticas derivadas de uma célula vegetal. Tipicamente, o transgene foi in- troduzido na planta por manipulação humana tal como, por exemplo, por transformação, mas qualquer método pode ser usado como alguém versado na técnica reconhece.

Os termos "semente" e "grão" são usados alternadamente aqui. "Grão" geralmente se refere ao grão maduro colhido, mas também pode se referir ao grão após inibição ou germinação, de acordo com o contexto. O grão maduro comumente tem uma conteúdo de umidade de menos de cerca de 18-20%.

Conforme aqui utilizado, o termo "planta não-modificada corres- pondente" se refere a uma planta selvagem. "Selvagem", conforme aqui utili- zado, se refere a uma célula, tecido ou planta que não foi modificada de a- cordo com a invenção. Células, tecidos ou plantas selvagens podem ser u- sadas como controles para comparar níveis de expressão de um ácido nu- cleico exógeno ou a extensão e natureza de modificação de traço em célu- las, tecidos ou plantas modificadas como descrito aqui. Variedades de arroz selvagem que são adequadas como um padrão de referência incluem Nip- ponbare.

"Molécula de ácido nucleico" se refere a um oligonucleotídeo, polinucleotídeo ou qualquer fragmento destes. Ela pode ser DNA ou RNA de origem genômica ou sintética, de filamento duplo ou filamento simples e combinada com carboidrato, lipídeos, proteína ou outros materiais para rea- lizar uma atividade particular definida aqui. Os termos "molécula de ácido nucleico" e "polinucleotídeo" são usados aqui alternadamente.

A % de identidade de um polinucleotídeo é determinada por aná- lise GAP (Needleman a Wunsch, 1970) (programa GCG) com uma penalida- de de criação de interrupção=5 e uma penalidade de prolongamento de in- terrupção=^^. Salvo declaração em contrário, a seqüência teste possui pelo menos 45 nucleotídeos de comprimento e a análise GAP alinha as duas se- qüências por uma região de pelo menos 45 nucleotídeos. De preferência, a seqüência teste possui pelo menos 150 nucleotídeos de comprimento e aná- lise GAP alinha as duas seqüências por uma região de pelo menos 150 nu- cleotídeos. De maior preferência, a seqüência teste possui pelo menos 300 nucleotídeos de comprimento e análise GAP alinha as duas seqüências por uma região de pelo menos 300 nucleotídeos. Ainda de maior preferência, a análise GAP alinha as duas seqüências por suas completas extensões.

"Oligonucleotídeos" podem ser RNA, DNA, ou derivados de am- bos. Embora os termos polinucleotídeo e oligonucleotídeo tenham significa- do sobreposto, oligonucleotídeo são tipicamente moléculas de filamento simples relativamente curtas. O tamanho mínimo de tais oligonucleotídeos é o tamanho requerido para a formação de um híbrido estável entre um oligo- nucleotídeo e uma seqüência complementar em uma molécula de ácido nu- cleico-alvo. De preferência, os oligonucleotídeos possuem pelo menos 15 nucleotídeos, de maior preferência pelo menos 18 nucleotídeos, de maior preferência pelo menos 19 nucleotídeos, de maior preferência pelo menos nucleotídeos, ainda de maior preferência pelo menos 25 nucleotídeos de comprimento.

Conforme aqui utilizado, o termo "amplificação de ácido nuclei-

co" se refere a qualquer método in vitro para aumentar o número de cópias de uma molécula de ácido nucleico com o uso de uma DNA polimerase. A amplificação de ácido nucleico resulta na incorporação de nucleotídeos em uma molécula de DNAou iniciador formando desse modo uma nova molécu- Ia de DNA complementar a um molde de DNA. A molécula de DNA recém- formada pode ser usada como molde para sintetizar moléculas de DNA adi- cionais.

"Operacionalmente ligado" conforme aqui utilizado se refere a uma relação funcional entre dois ou mais segmentos de ácidos nucleicos (por exemplo, DNA). Tipicamente, ela se refere à relação funcional de ele- mento regulatório transcricional com uma seqüência transcrita. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma seqüência codificante, tal como um polinucleotídeo definido aqui, se ele estimula ou modula a transcri- ção da seqüência codificante em uma célula apropriada. Geralmente, ele- mentos regulatórios transcricionais que estão operacionalmente ligados a uma seqüência transcrita estão fisicamente contíguos à seqüência transcrita, isto é, eles estão agindo em eis. Entretanto, alguns elementos regulatórios transcricionais, tal como acentuadores, não precisam estar fisicamente con- tíguos ou localizados em íntima proximidade às seqüências codificantes cuja transcrição eles acentuam.

Conforme aqui utilizado, o termo "gene" é para ser tomado em seu contexto mais amplo e inclui as seqüências de desoxirribonucleotídeo compreendendo a região codificante de proteína de um gene estrutural e incluindo seqüências localizadas adjacentemente à região codificante em ambas as extremidade 5' e 3' por uma distância de pelo menos cerca de 2 kb nas duas extremidades e que estão envolvidas na expressão do gene. As seqüências que são localizadas a 5' da região codificante e que estão pre- sentes no mRNA são referidas como seqüências 5' não-traduzidas. As se- qüências que estão localizadas a 3' ou a jusante da região codificante e que estão presentes no mRNA são referidas como seqüências 3' não-traduzidas. O termo "gene" abrange tanto a forma de cDNA como a genômica de um gene. Uma forma genômica ou clone de um gene contém a região codifican- te que pode ser interrompida com seqüências não-codificantes denominadas "íntrons" ou "regiões intervenientes" ou "seqüências intervenientes". íntrons são segmentos de um gene que são transcritos em RNA nuclear (hnRNA); íntrons podem conter elementos regulatórios tal como acentuadores. íntrons são removidos ou "processados fora" do transcrito nuclear ou primário; ín- trons, portanto, estão ausentes do transcrito de RNA mensageiro (mRNA). O mRNA funciona durante a tradução para especificar a seqüência ou ordem de aminoácidos em um polipeptídeo nascente. O termo "gene" inclui uma molécula sintética ou de fusão que codifica todas ou parte das proteínas da invenção aqui descritas e uma seqüência de nucleotídeo complementar a qualquer um dos acima.

Conforme aqui utilizado, o termo "ligado geneticamente" ou simi- lar se refere a um lócus marcador e a um segundo lócus estando suficiente- mente próximos em um cromossomo que eles serão herdados juntos em mais de 50% das meioses, por exemplo, não aleatoriamente. Esta definição inclui a situação onde o lócus marcador e o segundo lócus formam parte do mesmo gene. Além disso, esta definição inclui a modalidade onde o lócus marcador compreende um polimorfismo que é responsável pelo traço de in- teresse (em outras palavras o lócus marcador está diretamente "ligado" ou "perfeitamente ligado" ao fenótipo). Em outra modalidade, o lócus marcador e um segundo lócus são diferentes, ainda suficientemente próximos em um cromossomo que eles serão herdados juntos em mais de 50% das meioses. O porcentual de recombinação observado entre Ioci ligados geneticamente por geração (centimorgans (cM)), será menor que 50. Em modalidades parti- culares da invenção, Ioci ligados geneticamente podem estar separados por 45, 35, 25, 15, 10, 5, 4, 3, 2, ou 1 ou menos cM em um cromossomo. De pre- ferência, os marcadores estão menos de 5 cM afastados e de maior prefe- rência cerca de 0 cM afastados.

Um "alelo" se refere a uma forma específica de uma seqüência genética (tal como um gene) em uma célula, uma planta individual ou em uma população, a forma específica diferindo de outras formas do mesmo gene na seqüência de pelo menos um e freqüentemente mais de um, sítios variantes na seqüência do gene. As seqüências nesse sítios variantes que deferem entre alelos diferentes são denominadas "variâncias", "polimorfis- mos", ou "mutações".

Um "polimorfismo" conforme aqui utilizado denota uma variação na seqüência nucleotídica entre alelos dos Ioci da invenção, de diferentes espécies, cultivares, cepas ou indivíduos de uma planta. Uma "posição poli- mórfica" é uma posição nucleotídica pré-selecionada na seqüência do gene. Em alguns casos, polimorfismos genéticos são refletidos por uma variação na seqüência de aminoácidos e assim uma posição polimórfica pode resultar na localização de um polimorfismo na seqüência de aminoácidos em uma posição prédeterminada na seqüência de um polipeptídeo. Em outros casos, a região polimórfica pode estar em uma região não-codificante de polipeptí- deo do gene, por exemplo na região promotora tal pode influenciar níveis de expressão do gene. Polimorfismos típicos são deleções, inserções ou substi- tuições. Essas podem envolver um único nucleotídeo (polimorfismo de nu- cleotídeo único ou SNP) ou dois ou mais nucleotídeos.

Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são geralmente usados alternadamente e se referem a uma única cadeia polipeptídica que podem ou não ser modificada pela adição de grupos não-aminoácidos. Seria enten- dido que tais cadeias polipeptídicas podem se associar com outros polipep- tídeos ou proteínas ou outras moléculas tal como co-fatores. Os termos "pro- teínas" e "polipeptídeos" conforme aqui utilizados também incluem variantes, mutantes, modificações, análogos e/ou derivados dos polipeptídeos da in- venção como descrito aqui.

A % de identidade de um polipeptídeo é determinada por análise GAP (Needleman a Wunsch, 1970) (programa GCG) com uma penalidade de criação de interrupção=5 e uma penalidade de prolongamento de inter- rupção=^^. A seqüência teste possui pelo menos 25 aminoácidos de com- primento e a análise GAP alinha as duas seqüências por uma região de pelo menos 25 aminoácidos. De preferência, a seqüência teste possui pelo me- nos 50 aminoácidos de comprimento e análise GAP alinha as duas sequên- cias por uma região de pelo menos 50 aminoácidos. De maior preferência, a seqüência teste possui pelo menos 100 aminoácidos de comprimento e aná- lise GAP alinha as duas seqüências por uma região de pelo menos 100 ami- noácidos. Ainda de maior preferência, a seqüência teste possui pelo menos 250 aminoácidos de comprimento e análise GAP alinha as duas seqüências por uma região de pelo menos 250 aminoácidos. Ainda de maior preferência, a análise GAP alinha as duas seqüências por suas completas extensões. Polinucleotídeos antissentido

O termo "polinucleotídeo antissentido"será tomado por significar uma molécula de DNA ou RNA ou combinação destas, que é complementar a pelo menos uma porção de uma molécula de mRNA específica que codifi- ca um polipeptídeo FatB ou Fad2 e capaz de interferir em um evento pós- transcricional tal como tradução de mRNA. O uso de métodos antissentido é bem-conhecido na técnica (vide, por exemplo, G. Hartmann e S. Endres, Manual of Antisense Methodology, Kluwer (1999)). O uso de técnicas antis- sentido em plantas foi revisto por Bourque, 1995 e Sênior, 1998. Bourque, 1995 lista um vasto número de exemplos de como seqüências antissentido foram utilizadas em sistemas vegetais como um método de inativação gêni- ca. Ela também relatou que alcançando 100% de inibição de qualquer ativi- dade enzimática pode não ser necessário visto que inibição parcial irá mais que provavelmente resultar em alteração mensurável no sistema. Sênior (1009) relatou que métodos antissentido são no momento uma técnica muito bem estabelecida para manipular expressão gênica. Um polinucleotídeo antissentido da invenção se hibridizará a um polinucleotídeo-alvo sob condições fisiológicas. Conforme aqui utilizado, o termo "um polinucleotídeo antissentido que se hobridiza sob condições fisio- lógicas" significa que o polinucleotídeo (que é completamente ou parcialmen- te de filamento simples) é pelo menos capaz de formar um polinucleotídeo de filamento duplo com mRNA que codifica uma proteína, tal como aquelas providas nas Figuras 2 ou 7 ou SEQ ID Nos 1 até 4 ou 15 até 18 sob condi- ções normais em uma célula, de preferência uma célula de arroz.

Moléculas antissentido podem incluir seqüências que correspon- dem aos genes estruturais ou seqüências que executam o controle na ex- pressão gênica ou evento de "splicing". Por exemplo, a seqüência antissen- tido pode corresponder à região codificante alvejada dos genes da invenção, ou a região 5' não-traduzida (UTR) ou a 3'-UTR ou combinação destas. Ela pode ser complementar em parte a seqüências de íntron, que podem ser processadas fora durante ou após a transcrição, de preferência apenas a seqüências de éxon do gene-alvo. Em vistas da divergência geralmente grande das UTRs, direcionamento a essas regiões provê maior especificida- de da inibição gênica.

O comprimento da seqüência antissentido deve ser de pelo me- nos 19 nucleotídeos contíguos, de preferência 50 nucleotídeos e de maior preferência pelo menos 100, 200, 500 ou 1000 nucleotídeos. A seqüência completa complementar ao transcrito de gene inteiro pode ser usada. O comprimento é da maior preferência de 100-200 nucleotídeos. O grau de identidade da seqüência antissentido ao transcrito alvejado deve ser de pelo menos 90% e de maior preferência 95-100%. A molécula de RNA antissenti- do pode é claro compreender seqüências não-relacionadas que podem fun- cionar para estabilizar a molécula. Polinucleotídeos catalíticos

O termo polinucleotídeo/ácido nucleico catalítico se refere a uma molécula de DNA ou molécula contendo DNA (também conhecida na técnica como uma "desoxirribozima") ou um RNA ou molécula contendo RNA (tam- bém conhecida como uma "ribozima") que reconhece especificamente um substrato distinto e catalisa a modificação química desse substrato. As bases de ácido nucleico no ácido nucleico catalítico podem ser bases A, C, G, T (e U para RNA).

Tipicamente, o ácido nucleico catalítico contém uma seqüência antissentido para reconhecimento específico de um ácido nucleico-alvo e uma atividade enzimática que cliva ácido nucleico (também referida aqui como o "domínio catalítico"). Os tipos de ribozimas que são particularmente úteis nesta invenção são a ribozima cabeça de martelo (Haseloff e Gerlach, 1988; Perriman etal., 1992) e a ribozima em grampo (Shippy et ai, 1999). As ribozimas desta invenção e DNA codificando as ribozimas

podem ser sintetizados quimicamente usando métodos bem-conhecidos na técnica. As ribozimas também podem ser preparadas a partir de uma molé- cula de DNA (que na transcrição, dá uma molécula de RNA) operacional- mente ligada a um promotor de RNA polimerase, por exemplo, o promotor para RNA polimerase de T7 ou RNA polimerase de SP6. Consequentemen- te, também é provida por esta invenção uma moléculas de ácido nucleico, isto é, DNAou cDNA, que codifica um polinucleotídeo catalítico da invenção. Quando o vetor também contém um promotor para RNA polimerase opera- cionalmente ligado às moléculas de DNA, a ribozima pode ser produzida in vitro em incubação com RNA polimerase e nucleotídeos. Em uma modalida- de separada, o DNA pode ser inserido em um cassete de expressão ou cas- sete de transcrição. Após a síntese, a molécula de RNA pode ser modificada por ligação a uma molécula de DNA que tem a habilidade de estabilizar a ribozima e fazê-la resistente a RNAse. Conforme com polinucleotídeos antissentido descritos aqui, poli-

nucleotídeos catalíticos da invenção também devem ser capazes de hibridi- zar uma molécula de ácido nucleico-alvo (por exemplo, um mRNA que codi- fica qualquer polipeptídeo provido nas Figuras 2 ou 7 ou SEQ ID Nos 1 até 4 ou 15 até 18) sob "condições fisiológicas", nominalmente aquelas condições dentro de uma célula (especialmente condições em uma célula vegetal tal como uma célula de arroz). Interferência por RNA RNA de interferência (RNAi) é particularmente útil para inibir es- pecificamente a produção de uma proteína particular. Embora não desejando estar limitado por teoria, Waterhouse etal., (1998) proveram um modelo para o mecanismo pelo qual dsRNA (Dúplex RNA) pode ser usado para reduzir produção proteica. Esta tecnologia se baseia na presença de moléculas ds- RNA que contém uma seqüência que é essencialmente idêntica ao mRNA do gene de interesse ou parte deste, neste caso um mRNA que codifica um polipeptídeo de acordo com a invenção. Convenientemente, o dsRNA pode ser produzido a partir de um único promotor em um vetor recombinante ou célula hospedeira, onde as seqüências em sentido e antissentido são flan- queadas por uma seqüência não relacionada que permite que as seqüências em sentido e antissentido se hibridizem para formar a moléculas de dsRNA com a seqüência não relacionada formando uma estrutura em alça. O dese- nho e produção de moléculas de dsRNA adequadas para a presente inven- ção está bem dentro da capacidade de uma pessoa versada na técnica, par- ticularmente considerando Waterhouse et ai, (1998), Smith et aí., (2000), WO 99/32619, WO 99/53050, WO 99/49029 e WO 01/34815.

Em um exemplo, é introduzido um DNA que direciona a síntese de produto(s) de RNA pelo menos parcialmente de filamento duplo com ho- mologia com o gene-alvo a ser inativado. O DNA, portanto, compreende tan- to seqüências em sentido como antissentido que, quando transcritas em RNA, podem se hibridizar para formar a região de RNA de filamento duplo. Em uma modalidade preferida, as seqüências em sentido e antissentido são separadas por uma região espaçadora que compreende um íntron que, quando transcrito em RNA, é processado fora. Demonstrou-se que este ar- ranjo resulta em uma maior eficiência de silenciamento gênico. A região de filamento duplo pode compreender uma ou duas moléculas de RNA, transcri- tas a partir de uma região de DNA ou duas. Pensa-se que a presença da molécula de filamento duplo desencadeia uma resposta de um sistema ve- getal endógeno que destrói tanto o RNA de dupla fita como também transcri- to de RNA homólogo do gene vegetal-alvo, reduzindo eficientemente ou eli- minando a atividade do gene-alvo. O comprimento das seqüências em sentido e antissentido que se hibridizam deve ser cada um de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos, de preferência pelo menos 30 até 50 nucleotídeos, e de maior preferência pelo menos 100, 200, 500 ou 1000 nucleotídeos. A seqüência completa cor- respondente ao transcrito do gene inteiro pode ser usada. Os comprimentos são da maior preferência de 100-2000 nucleotídeos. O grau de identidade das seqüências em sentido e antissentido com o transcrito alvejado deve ser de pelo menos 85%, de preferência pelo menos 90% e de maior preferência 95-100%. A molécula de RNA pode é claro compreender seqüências não- relacionadas que podem funcionar para estabilizar a molécula. A molécula de RNA pode ser expressa sob o controle de um promotor de RNA polimera- se Il ou RNA polimerase III. Exemplos do último incluem promotores de tRNA e snRNA.

Moléculas de pequeno RNA de interferência preferido ('siRNA') compreendem uma seqüência nucleotídica que é idêntica a cerca de 19-21 nucleotídeos contíguos do mRNA alvo. De preferência, a seqüência de mR- NA alvo começa com o dinucleotídeo AA, compreende um conteúdo GC de cerca de 30-70% (de preferência, 30-60%, de maior preferência, 40-60% e de maior preferência cerca de 45-55%) e não tem um alto porcentual de i- dentidade com qualquer seqüência nucleotídica fora o alvo no genoma da planta (de preferência arroz) em que ela é para ser introduzida, por exemplo, como determinado por pesquisa BLAST padrão.

Exemplos de moléculas de dsRNA da invenção são providos no Exemplo 5. Exemplos adicionais incluem aqueles que compreendem uma seqüência como provida em um ou mais de SEQ ID Nos 64 até 73 (para Fad2) e SEQ ID Nos 74 até 83 (para FatB). MicroRNA

A regulação pode microRNA é uma ramificação claramente es- pecializada da via de silenciamento de RNA que evolui na direção de regula- ção gênica, divergindo de RNAi/PTGS convencional. MicroRNAs são uma classe específica de pequenos RNAs que são codificados em elementos similares a gene organizados em uma repetição invertida característica. Quando transcritos, genes de microRNAs dão origem a RNAs precursores de alça em haste a partir dos quais os microRNAs são subseqüentemente processados. MicroRNAs são tipicamente de cerca de 21 nucleotídeos de comprimento. Os miRNAs liberados são incorporados em complexos simila- res à RISC contendo um subgrupo particular de proteínas Argonauta que exercem repressão gênica sequência-específica (vide, por exemplo, Millar e Waterhouse, 2005; Pasquinelli etal., 2005; Almeida e Allshire, 2005). Co-supressão

Outra abordagem biológica molecular que pode ser usada é co- supressão. O mecanismo de co-supressão não é bem entendido, mas pen- sa-se que envolva silenciamento gênico pós-transcricional (PTGS) e quanto a isso pode ser muito similar a muitos exemplos de supressão antissentido. Ele envolve introdução de uma cópia extra de um gene ou fragmento desse em uma planta na orientação em sentido com respeito a um promotor para sua expressão. O tamanho do fragmento em sentido, sua correspondência como regiões de gene-alvo e seu grau de identidade de seqüência com o gene-alvo são como para as seqüências antissentido descritas acima. Em alguns casos, a cópia adicional da seqüência do gene interfere com a ex- pressão do gene vegetal-alvo. Referência é feita a WO 97/20936 e EP 0465572 para métodos de implementação de abordagens de co-supressão. Hibridização de Ácido Nucleico

Em uma modalidade, polinucleotídeos da invenção, ou um fila- mento destes, se hibridizam sob condições fisiológicas a um polinucleotídeo compreendendo qualquer uma ou mais da seqüência de nucleotídeos provi- dos como SEQ ID Nos 5 até 8, 11 até 14 ou 19 até 25. Em uma modalidade adicional, polinucleotídeos da invenção, ou uma fita desses, também se hi- bridizam com um polinucleotídeo compreendendo qualquer uma ou mais da seqüência de nucleotídeos providos como SEQ ID Nos 5 até 8, 11 até 14 ou 19 até 25 sob condições estringentes. Conforme aqui utilizado, a expressão "condições estringentes"

se refere a condições sob as quais um polinucleotídeo, sonda, iniciador e/ou oligonucleotídeo se hibridizará à(s) sua(s) sequência(s)-alvo, mas a nenhu- ma outra seqüência. Condições estringentes são dependentes de seqüência e serão diferentes em diferentes circunstâncias. Seqüências mais longas se hibridizam especificamente em temperaturas mais altas que seqüências mais curtas. Geralmente, condições estringentes são selecionadas para se- rem cerca de 5°C mais baixas que o ponto de desnaturação térmica (Tm) para seqüência específica em um força iônica e pH definidos. O Tm é a tem- peratura (sob força iônica, pH e concentração de ácido nucleico definidos) em que 50% das sondas complementares à sequência-alvo se hibridizam à sequência-alvo em equilíbrio. Visto que as sequências-alvo estão geralmen- te presentes em excesso, na Tm, 50% das sondas estão ocupadas em equi- líbrio. Tipicamente, condições estringentes serão aquelas em que a concen- tração salina é menos que cerca de íon sódio a 1,0 M, tipicamente cerca de íon sódio de 0,01 a 1,0 M (ou outros sais) em pH 7,0 até 8,3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30°C para oligonucleotídeos, iniciadores ou sondas curtas (por exemplo, 10 nt até 50 nt) e pelo menos cerca de 60°C para oligo- nucleotídeos, iniciadores e sondas mais longas. Condições estringentes também podem ser obtidas com a adição de agentes desestabilizantes, tal como formamida.

Condições estringentes são conhecidas por aqueles versados na técnica e podem ser encontradas em Ausubel et aí., (supra), Current Proto- cols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6, assim como nos Exemplos descritos aqui. De preferência, as condições são tais que seqüências pelo menos cerca de 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99% homólogas umas as outras tipicamente permanecem hibridizadas umas as outras. Um exemplo não-limitante de condições de hibridização es- tringente é hibridização em um tampão de alto teor salino compreendendo SSC 6x, 50 mM de Tris-HCI (pH 7,5), 1 mM de EDTA, 0,02% de PVP, 0,02% de Ficoll, 0,02% de BSA e 500 mg/mL de DNA de esperma de salmão des- naturado a 65°C, seguido por uma ou mais lavagens em SSC 0,2x, 0,01% de BSA a 50°C. Em outra modalidade, é provida uma seqüência de ácido nucleico que é hibridizável à molécula de ácido nucleico compreendendo a seqüência nucleotídica de SEQ ID Nos 5 até 8, 11 até 14 ou 19 até 25, sob condições de moderada estringência. Um exemplo não-limitante condições de hibridização de moderada estringência é hibridização em SSC 6x, 0,5% de SDS e 100 mg/mL de DNA de esperma de salmão desnaturado a 55°C, seguido por uma ou mais lavagens em SSC 1x, 0,1% de SDS a 37°C. Ou- tras condições de estringência moderada que podem ser usadas são bem- conhecidas na técnica, vide, por exemplo, Ausubel et ai, (supra) e Kriegler, 1990; Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockon Press, NY. Ainda em outra modalidade, é provido um ácido nucleico que é hibridizá- vel à molécula de ácido nucleico compreendendo as seqüências nucleotídi- cas de SEQ ID Nos 5 até 8, 11 até 14 ou 19 até 25, sob condições de baixa estringência. Um exemplo não-limitante condições de hibridização de baixa estringência é hibridização em 35% de formamida, SSC 5x, 50 mM de Tris- HCI (pH 7,5), 5 mM de EDTA, 0,02% de PVP, 0,02% de Ficoll, 0,2% de BSA, 100 mg/mL de DNA de esperma de salmão desnaturado, 10% (p/vol) de sul- fato de dextran a 40°C, seguido por uma ou mais lavagens em SSC 2x, 25 mM de Tris-HCI (pH 7,4), 5 mM de EDTA e 0,1% de SDS a 50°C. Outras condições de baixa estringência que podem ser usadas são bem-conhecidas na técnica, vide, por exemplo, Ausubel et ai, (supra) e Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockon Press, NY, assim como os Exemplos providos aqui.

Construções de Ácido Nucleico, Vetores e Células Hospedeiras

A presente invenção inclui a produção de plantas de arroz gene- ticamente modificadas, em que a planta tem uma expressão diminuída de um polipeptídeo que tem atividade fad2 e/ou FatB em relação a uma planta não-modificada correspondente.

Construções de ácido nucleico úteis para produzir as plantas transgênicas acima mencionadas podem ser prontamente produzidas usan- do técnicas padrão.

Quando houver inserção de uma região que codifica um mRNA a construção pode compreender seqüências de íntron. Essas seqüências de íntron podem auxiliar a expressão do transgene da planta. O termo "íntron" é usado em seu sentido normal significando um segmento genético que é transcrito, mas não codifica proteína e que é processado fora de um RNA antes da tradução. íntrons podem estar incorporados em uma 5'-UTR ou uma região codificante se o transgene codifica um produto traduzido, ou em qualquer lugar na região transcrita se ele não codifica. Entretanto, em uma modalidade preferida, qualquer região codificante de polipeptídeo é provida como uma única fase de leitura aberta. Como o destinatário versado vai ter consciência, tal fases de leitura aberta pode ser obtidas por transcrição re- versa do mRNA que codifica o polipeptídeo.

Para garantir expressão apropriada do gene codificando um mRNA de interesse, a construção de ácido nucleico tipicamente compreende um ou mais elementos regulatórios tais como promotores, acentuadores, assim como seqüências de término de transcrição ou de poliadenilação. Tais elementos são bem-conhecidos na técnica.

A região de início de transcrição compreendendo o(s) elemen- to(s) regulatório(s) pode prover a expressão regulada ou constitutiva na plan- ta. De preferência, a expressão ocorre pelo menos em células do embrião, endosperma, camada do farelo em semente em desenvolvimento e/ou se- mente madura (grão). Em uma modalidade alternativa, os elementos regula- tórios podem ser promotores não específicos para células de semente (tais como promotor de ubiquitina ou promotores de CaMV35S ou 35S acentua- do).

Exemplos de promotores específicos para semente úteis para a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, o promotor de glute- nina de baixo peso molecular de trigo (Colot et ai, 1987), o promotor que expressa α-amilase em sementes de trigo (Stefanov et aí., 1991) e o promo- tor de hordeína (Brandt et a!., 1985).

Vários promotores constitutivos que são ativos em células vege- tais foram descritos. Promotores adequados para expressão constitutiva em plantas incluem, mas não estão limitados a, o promotor 35S do vírus do mo- saico da couve-flor (CaMV), o 35S de vírus do mosaico Figwort (FMV), o promotor de vírus baciliforme de cana-de-açúcar, o promotor de vírus com- melina yellow mottle, o promotor induzível por luz da subunidade pequena da ribulose-1,5-bis-fosfato carboxilase, o promotor da triosefosfato isomera- se citosólica de arroz, o promotor de adenina fosforribosiltransferase de Ara- bidopsis, o promotor do gene de actina 1 de arroz, os promotores de mano- pina sintase e octopina sintase, o promotor de Adh, o promotor de sacarose sintase, o promotor de complexo de gene Reo promotor de gene de proteí- na de ligação a clorofila α/β. Esses promotores foram usados para criar veto- res de DNA que foram expressos em plantas; vide, por exemplo, Publicação PCT WO 8402913. Todos esses promotores foram usados para criar vários tipos de vetores de DNA recombinante expressáveis em planta.

O promotor pode ser modulado por fatores tal como temperatu- ra, luz ou estresse. Ordinariamente, os elementos regulatórios serão provi- dos a 5' da seqüência genética a ser expressa. A construção também pode conter outros elementos que acentuam a transcrição tal como as regiões de poliadenilação nos 3' ou ocs 3' ou terminadores de transcrição.

A seqüência líder 5' não-traduzida pode ser derivada do promo- tor selecionado para expressar a seqüência gênica heteróloga do polinucleo- tídeo da presente invenção e pode ser especificamente modificada se dese- jado para aumentar a tradução de mRNA. Para uma revisão de otimização de expressão de transgenes, vide Koziel et al., (1996). As regiões 5' não- traduzidas também podem ser obtidas de RNAs virais de plantas (vírus do mosaico do Tabaco, vírus etch do tabaco, vírus do mosaico anão de milho, vírus do mosaico da alfafa entre outros) de genes eucarióticos adequados, genes vegetais (líder de gene de proteína de ligação a clorofila a/b de trigo e milho), ou de uma seqüência gênica sintética. A presente invenção não está limitada a construções em que a região não-traduzida é derivada da seqüên- cia 5' não-traduzida que acompanha a seqüência promotora. A seqüência líder também poderia ser derivada de uma seqüência codificante ou promo- tor não relacionado. Seqüências líderes úteis no contexto da presente inven- ção compreendem um líder de Hsp70 de milho (US 5.362.865 e US 5.859.347) e o elemento omega de TMV.

O término de transcrição é acompanhado por uma seqüência de DNA 3' não-traduzida operacionalmente ligada no vetor quimérico ao polinu- cleotídeo de interesse. A região 3' não-traduzida de uma moléculas de DNA recombinante contém um sinal de poliadenilação que funciona em plantas para causar a adição de nucleotídeos adenilato na extremidade 3' do RNA. A região 3' não-traduzida pode ser obtida de vários genes que são expressos em células vegetais. A região 3' não-traduzida de nopalina sintase, a região 3' não-traduzida de gene da subunidade pequena da Rubisco de ervilha, a região 3' não-traduzida de gene da proteína de estocagem de semente 7S de soja são comumente usadas nesta capacidade. As regiões 3' transcritas, não-traduzidas contendo o sinal de poliadenilato de genes de plasmídeo in- dutor de tumor (Ti) de Agrobacterium também são adequados.

Tipicamente, a construção de ácido nucleico compreende um marcador selecionável. Marcadores selecionáveis auxiliam na identificação e triagem de plantas ou células que foram transformadas com a moléculas de ácido nucleico exógena. O gene marcador de selecionável pode prover re- sistência a antibiótico ou herbicida às células de arroz, ou permitir a utiliza- ção de substratos tal como manose. O marcador selecionável confere de preferência resistência a higromicina às células de arroz.

De preferência, a construção de ácido nucleico é estavelmente incorporada no genoma da planta. Consequentemente, o ácido nucleico compreende elementos apropriados que permitem que a moléculas seja in- corporada no genoma, ou a construção é colocada em um vetor apropriado que pode ser incorporado em um cromossomo de uma célula vegetal.

Uma modalidade da presente invenção inclui um vetor recombi- nante, que inclui pelo menos uma molécula polinucleotídica da presente in- venção, inserida em qualquer vetor capaz de distribuir a molécula de ácido nucleico em uma célula hospedeira. Tal vetor contém seqüências de ácido nucleico heterólogo, isto é, seqüências de ácido nucleico que não são en- contradas naturalmente adjacentes às moléculas de ácido nucleico da pre- sente invenção e que de preferência são derivadas de uma espécie fora a espécie a partir da qual a(s) molécula(s) de ácido nucleico são derivadas. O vetor pode ser RNA ou DNA, procariótico ou eucariótico e tipicamente é um vírus ou um plasmídeo. Vários vetores adequados para transfecção estável de células vegetais ou para o estabelecimento de plantas transgênicas foram descritos em, por exemplo, Pouwels et ai, Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, supp. 1987; Weissbach e Weissbach, Methods for Plant Molecular Bio- logy, Academic Press, 1989; e gelvin et ai, Plant Molecular Biology Manual, KIuwerAcademic Publishers, 1990. Tipicamente, vetores de expressão vege- tal incluem, por exemplo, um ou mais genes vegetais clonados sob o contro- le transcricional de seqüências regulatórias 5' e 3' e um marcador selecioná- vel dominante. Tais vetores de expressão vegetal também podem conter uma região regulatória de promotor (por exemplo, uma região regulatória que controla expressão induzível ou constitutiva, regulada ambientalmente ou pela desenvolvimento, ou célula- ou tecido-específica), um sítio de inicia- ção de transcrição, um sítio de ligação a ribossomo, um sinal de processa- mento de RNA, um sítio de término de transcrição e/ou um sinal de poliade- nilação.

Outra modalidade da presente invenção inclui uma célula re- combinante compreendendo uma célula hospedeira transformada com uma ou mais moléculas recombinantes da presente invenção. A transformação de uma molécula de ácido nucleico em uma célula pode ser executada por qualquer método pelo qual uma molécula de ácido nucleico possa ser inseri- da na célula. Técnicas de transformação incluem, mas não estão limitadas a, transfecção, eletroporação, microinjeção, lipofecção, adsorção e fusão de protoplasto. Uma célula recombinante pode permanecer unicelular ou pode crescer em um tecido, órgão ou um organismo multicelular. Moléculas de ácido nucleico transformadas da presente invenção podem permanecer ex- tracromossomais ou podem integrar-se em um ou mais sítios em um cro- mossomo da célula transformada (isto é, recombinante) de tal modo que su- as habilidades de serem expressas sejam retidas. Células hospedeiras pre- feridas são célula vegetais, de maior preferência células de uma planta de cereal e ainda de maior preferência uma célula de arroz. Plantas Transgênicas

Arroz transgênico (também referido como arroz geneticamente modificado) pode ser produzido usando técnicas conhecidas na técnica, tal como aquelas geralmente descritas em A. Slater etal., Plant Biotechnology - The Genetic Manipulation of Plants, Oxford University Press (2003) e P. C- hristou e H. Klee, Handbook of Plant Biotechnology, John Wiley and Sons (2004).

Em uma modalidade preferida, as plantas transgênicas são ho- mozigotas para cada e todo polinucleotídeo que foi introduzido (transgene) de modo que a progênie delas não se segreguem do fenótipo desejado. As plantas transgênicas também podem ser heterozigotas para o(s) transge- ne(s) introduzido(s), tal como, por exemplo, na progênie F1 que foi cultivada a partir de semente híbrida. Tais plantas podem prover vantagens tal como vigor híbrido, bem-conhecido na técnica.

Quatro métodos gerais para distribuição direta de um gene em células foram descritos: (1) métodos químicos (Graham et ai, 1973); (2) mé- todos físicos tal como microinjeção (Capecchi, 1980); eletroporação (vide, por exemplo, WO 87/06614, US 5.472.869, 5.384.253, WO 92/09696 e WO 93/21335); e a pistola gênica (vide, por exemplo, US 4.945.050 e US 5.141.131); (3) vetores virais (Clapp, 1993; Lu et ai, 1993; Eglitis et ai, 1988); e (4) mecanismos mediados por receptor (Curiel et aí., 1992; Wagner etal., 1992).

Métodos de aceleração que podem ser usados incluem, por e- xemplo, bombardeio de microprojétil e similares. Um exemplo de um método para distribuir moléculas de ácido nucleico transformantes a célula vegetais é bombardeio de microprojétil. Este método foi revisado por Yang et ai, Par- ticle Bombardment Technology for Gene Transfer, Oxford Press, Oxford, In- glaterra (1994). Partículas não-biológicas (microprojéteis) que podem ser revestidos com ácidos nucleicos e distribuídos em células por uma força propulsora. Partículas exemplares incluem aquelas compreendidas por tungstênio, ouro, platina e similares. Uma vantagem particular de bombar- deio de microprojéteis, além disso ser um meio eficaz para transformar re- produtivelmente monocotiledôneas, é que nem o isolamento de protoplastos, nem a suscetibilidade a infecção por Agrobacterium são requeridas. Uma modalidade ilustrativa de um método para distribuir DNA em células de Zea mays por aceleração é um sistema de distribuição de α-partícula biolística, que pode ser usado para propelir partículas revestidas com DNA através de uma tela, tal como tela de Nytex ou aço inoxidável, em uma superfície de filtro coberta com células de milho cultivadas em suspensão. Um sistema de distribuição de partículas adequado para uso com a presente invenção é a pistola de PDS-1000/He de aceleração por hélio disponível em Bio-Rad La- boratories.

Para o bombardeio, células em suspensão podem ser concen- tradas em filtros. Filtros contendo as células a serem bombardeadas são posicionados a uma distância apropriada abaixo da placa de parada do mi- croprojétil. Se desejado, uma ou mais telas também são posicionadas entre a pistola e as células a serem bombardeadas.

Senão, embriões imaturos ou outras células-alvo podem ser ar- ranjados em meio de cultura sólido. As células a serem bombardeadas são posicionadas em uma distância apropriada abaixo da placa de parada do microprojétil. Se desejado, uma ou mais telas também são posicionadas en- tre o dispositivo de aceleração e as células a serem bombardeadas. Através do uso de técnicas aqui expostas alguém pode obter até 1000 ou mais foci de células expressando transientemente um gene marcador. O número de células em um foco que expressam o produto gênico exógeno 48 horas pós- bombardeio freqüentemente varia de um até dez e média um até três.

Em transformação por bombardeio, alguém pode otimizar as condições de cultivo pré-bombardeio e os parâmetros de bombardeio para render o número máximo de transformantes estáveis. Tanto os parâmetros físicos como biológicos para bombardeio são importantes nesta tecnologia. Fatores físicos são aqueles que envolvem manipular o precipitado DNA/microprojétil ou aqueles que afetam o voo e velocidade de macro- ou microprojéteis. Fatores biológicos incluem todas as etapas envolvidas na manipulação de células antes e imediatamente após o bombardeio, o ajuste osmótico de células-alvo para auxiliar a aliviar o trauma associado com o bombardeio e também a natureza do DNA transformante, tal como DNA Iine- arizado ou plasmídeos superenovelados intactos. Acredita-se que manipula- ções pré-bombardeio são especialmente importantes para transformação com êxito de embriões imaturos.

Em outra modalidade alternartiva, plastídeos podem ser trans- formados estavelmente. O método divulgado para transformação de plastí- deo em plantas superiores inclui distribuição de pistola de partícula de DNA contendo um marcador selecionável e direcionamento do DNA para o geno- ma do plastídeo através de recombinação homóloga (US 5.451.513, US 5.545.818, US 5.877.402, US 5.932.479 e WO 99/05265.

Consequentemente, é contemplado que alguém pode desejar ajustar vários aspectos dos parâmetros de bombardeio em estudos de pe- quena escala para otimizar completamente as condições. Alguém pode par- ticularmente desejar ajustar parâmetros físicos tais como distância de inter- rupção, distância de voo, distância de tecido e pressão de hélio. Alguém também pode minimizar os fatores de redução de trauma pela modificação das condições que influenciam eficiências de transformação e integração. Por exemplo, o estado osmótico, hidratação tecidual e o estágio da subcultu- ra ou ciclo celular das células receptoras podem ser ajustados por transfor- mação otimizada. A execução de outros ajustes de rotina será conhecida por aqueles versados na técnica à luz da presente divulgação.

A transferência mediada por Agrobacterium é um sistema am- plamente aplicável para introduzir genes em células vegetais porque o DNA pode ser introduzido em tecidos vegetais inteiros, transpassando desse mo- do a necessidade de regeneração de uma planta intacta a partir de um pro- toplasto. O uso de vetores que se integram em plantas mediados por Agro- bacterium para introduzir DNA em células vegetais é bem-conhecido na téc- nica (vide, por exemplo, US 5.177.010, US 5.104.310, US 5.004.863, US 5.159.135). Adicionalmente, a integração do T-DNA é um processo relativa- mente preciso que resulta em poucos rearranjos. A região de DNA a ser transferida é definida pelas seqüências de borda e DNA interveniente geral- mente é inserido no genoma da planta.

Vetores de transformação por Agrobacterium modernos são ca- pazes de replicar em E. coli assim como Agrobacterium, permitindo manipu- lações convenientes como descrito (Klee et ai., In: Plant DNA Infectious A- gents, Hohn and Schell, eds., Springer-Verlag, Nova Iorque, pp. 179-203 (1985). Além disso, avanços tecnológicos em vetores para transferência gê- nica mediada por Agrobacterium melhorou o arranjo de genes e sítios de restrição nos vetores para facilitar a construção de vetores capazes de ex- pressar vários genes codificantes de polipeptídeos. Os vetores descritos têm convenientes regiões de ligação múltipla flanqueadas por um promotor e um sítio de poliadenilação para expressão direta de gene codificantes de poli- peptídeos inseridos e são adequados para fins atuais. Além disso, Agrobac- terium contendo tanto genes Ti armados como desarmados pode ser usada para as transformações. Naquelas variedades de plantas onde a transforma- ção mediada por Agrobacterium é eficiente, este é o método de escolha de- vido à natureza fácil e definida da transferência gênica.

Uma planta transgênica formada usando métodos de transfor- mação por Agrobaeterium tipicamente contém um único loco genético em um cromossomo. Tais plantas transgênicas pode ser referidas como sendo hemizigotas para o gene adicionado. Mais preferida é uma planta transgêni- ca que é homozigota para o gene estrutural adicionado; isto é, uma planta transgênica que contém dois genes adicionados, um gene no mesmo loco em cada cromossomo de um par de cromossomos. Uma planta transgênica homozigota pode ser obtida por acasalamento sexual (autoacasalamento) com uma planta transgênica segregante independente que contenha um ú- nico gene adicionado, germinação de algumas das sementes produzidas e análise das plantas resultantes pelo gene de interesse.

Também é para entender-se que duas plantas transgênicas dife- rentes também podem ser acasaladas para produzir descendência que con- tenha dois genes exógenos independentemente segregantes. Autoacasala- mento de progênie apropriada pode produzir plantas que são homozigotas para ambos os genes exógenos. Cruzamento de novo com uma planta pa- rental e cruzamento externo com uma planta não-transgênica também são contemplados, como é a propagação vegetativa. Descrições de outros mé- todos de reprodução que são comumente usados por diferentes traços e colheitas podem ser encontrados em Fehr1 In: Breeding methods for Cultivar Development, Wilcox J. Ed., American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987).

A transformação de protoplastos vegetais pode ser obtida usan-

do métodos baseados em precipitação de fosfato de cálcio, tratamento com polietileno glicol, eletroporação e combinações desses tratamentos. A aplica- ção desses sistemas para variedades diferentes de plantas depende da ha- bilidade para regenerar aquela cepa de planta particular a partir de proto- plastos. Métodos ilustrativos para a regeneração de cereais a partir de pro- toplastos são descritos (Fujimara et ai, 1985; Toriyama et ai, 1986; Abdullah et al., 1986).

Outros métodos para transformação de células também podem ser usados e incluem, mas não estão limitados à introdução de DNA em plantas por transferência de DNA direta em pólen, por injeção direta de DNA em órgãos reprodutivos de uma planta, ou por injeção direta de DNA nas células de embriões imaturos seguida pela reidratação de embriões desse- cados.

A regeneração, desenvolvimento e cultivo de plantas a partir de transformantes de protoplasto de planta única ou a partir de vários explantes transformados são bem-conhecidos na técnica (Weissbach et ai, In: Me- thods for Plant Molecular Biology, Academic Press, San Diego, Calif. (1988). Este processo de regeneração e crescimento tipicamente inclui as etapas de seleção de células transformadas, cultivo daquelas células individualizadas através dos estágios usuais de desenvolvimento embrionário através do es- tágio de plântula enraizada. Embriões e sementes transgênicos são regene- rados similarmente. Os brotos enraizados transgênicos resultantes são daí em diante plantados em um meio de crescimento vegetal apropriado tal co- mo solo.

O desenvolvimento ou regeneração de plantas contendo o gene

externo, exógeno é bem-conhecido na técnica. De preferência, as plantas regeneradas são autopolinizadas para prover plantas transgênicas homozi- gotas. Do contrário, pólen obtido das plantas regeneradas é cruzado com plantas crescidas de sementes de linhagens agronomicamente importantes. Inversamente, pólen de plantas dessas linhagens importantes é usado para polinizar plantas regeneradas. Uma planta transgênica da presente invenção contendo um ácido nucleico exógeno desejado é cultivada usando métodos bem-conhecidos por alguém versado na técnica.

Métodos para a transformação de plantas de cereais tal como arroz para introduzir variação genética na planta pela introdução de um áci- do nucleico exógeno e para regeneração de plantas a partir de protoplastos ou embriões de planta imaturos são bem-conhecidos na técnica, vide, por exemplo, Pedido de Patente Canadense No. 2.092.588, Pedido de Patente Australiana No 61781/94, Pedido de PatenteAustraIiana No 667939, Patente US No. 6.100.447, Pedido de Patente Internacional PCT/US97/10621, Pa- tente US No. 5.589.617, Patente US No. 6.541.257 e outros métodos são propostos em relatório descritivo da Patente W099/14314. De preferência, plantas de arroz transgênicas são produzidas por procedimentos de trans- formação mediada por Agrobacterium tumefaciens. Um exemplo de trans- formação mediada por Agrobacterium de arroz é provida aqui no Exemplo 5. Vetores portando a construção de ácido nucleico desejado podem ser intro- duzidas em células de arroz regeneráveis de plantas de cultura de tecidos ou explantes, ou sistemas vegetais adequados tal como protoplastos.

As células de arroz regeneráveis são de preferência do escutelo de embriões imaturos, embriões maduros, calo derivado desses ou do tecido meristemático.

Para confirmar a presença dos transgenes em células transgêni-

cas e plantas, uma amplificação de reação em cadeia da polimerase (PCR) ou análise de Southern blot pode ser realizada usando métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Produtos de expressão dos transgenes podem ser detectados em qualquer dentre uma variedade de modos, de- pendendo da natureza do produto e incluem Western blot e ensaio enzimáti- co. Um modo particularmente útil para quantificar expressão proteica e para detectar replicação em diferentes tecidos de plantas é usar um gene repor- ter, tal como GUS. Uma vez que plantas transgênicas tenham sido obtidas, elas podem ser crescidas para produzir tecidos ou partes vegetais que te- nham o fenótipo desejado. O tecido ou partes vegetais, podem ser recupe- rados e/ou a semente coletada. A semente pode servir como uma fonte para crescer plantas adicionais com tecidos ou partes que tenham as característi- cas desejadas.

Seleção Assistida por Marcador

Seleção assistida por marcador é um método bem reconhecido de seleção de plantas heterozigotas requerido quando há cruzamento de novo com um progenitor recorrente em um programa de cultivo clássico. A população de plantas em cada geração retrocruzada será heterozigota para o gene de interesse normalmente presente em uma razão de 1:1 em uma população retrocruzada e o marcador molecular pode ser usado para distin- guir os dois alelos do gene. Extraindo DNA de, por exemplo, brotos jovens e testando com um marcador específico para o traço desejável de introgres- são, é feita seleção precoce de plantas para retrocruzamento adicional em- bora energia e recursos estejam concentrados em poucas plantas. Para mo- ver-se mais depressa adicionalmente no programa de retrocruzamento, o embrião de sementes imaturas (25 dias pós-antese) pode ser excisado e crescido em meios nutrientes sob condições estéreis, em vez de permitir plena maturidade da semente. Este processo, denominado "resgate de em- brião", usado em combinação com extração de DNA no estágio de folha três e análise do genótipo desejado permite a rápida seleção de plantas portando o traço desejado, que pode ser nutrido até a maturidade na estufa ou campo para subsequente retrocruzamento adicional com o genitor recorrente.

Qualquer técnica de biologia molecular conhecida na técnica que é capaz de detectar um gene Fad2 ou FatB pode ser usada nos métodos da presente invenção. Tais métodos incluem, mas não estão limitados ao uso de amplificação de ácido nucleico, sequenciamento de ácido nucleico, hibri- dização de ácido nucleico com sondas marcadas adequadamente, análise de conformacional de filamento simples (SSCA), eletroforese em gel de gra- diente desnaturante (DGGE), análise de heterodúplex (HET), análise de cli- vagem química (CCM), clivagem de ácido nucleico catalítico ou uma combi- nação destes (vide, por exemplo, Lemieux, 2000; Langridge et ai, 2001). A invenção também inclui o uso de técnicas de marcador molecular para de- tectar polimorfismos ligados aos alelos de (por exemplo) um gene de Fad2 ou FatB que confere o fenótipo desejado. Tais métodos incluem a detecção ou análise de polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição (R- FLP), RAPD, polimorfismos de comprimento de fragmento amplificado (A- FLP) e polimorfismos de microssatélite (repetição de seqüência simples, SSR). Os marcadores intimamente ligados podem ser obtidos prontamente por métodos bem-conhecidos na técnica, tal como Análise Segregante Avo- lumada (Bulked Segregant Analysis), como revisado por Langridge et ai, (2001).

A "reação em cadeia da polimerase" ("PCR") é uma reação em que são feitas cópias em replicata de um polinucleotídeo-alvo usando um "par de iniciadores" ou "grupo de iniciadores" consistindo em iniciador "a ju- sante" e um "a montante" e um catalisador de polimerização, tal como uma DNA polimerase e tipicamente uma enzima polimerase termicamente está- vel. Métodos de PCR são conhecidos na técnica e são ensinados, por e- xemplo, em "PCR" (Ed. M.J. McPherson and S. G Moller (2000) BIOS Publi- shers Ltd, Osford). A PCR pode ser realizada em cDNA obtido transcreven- do-se reversamente mRNA isolado de células vegetais. Entretanto, será ge- ralmente mais fácil se a PCR for realizada em DNA genômico isolado de uma planta.

Um primer é uma seqüência oligonucleotídica que é capaz de se hibridizar de uma maneira sequência-específica com a sequência-alvo e ser prolongada durante a PCR. Amplicons ou produtos de PCR ou fragmentos de PCR ou produtos de amplificação são produtos de extensão que compre- endem o iniciador e as cópias recém-sintetizadas das sequências-alvo. Sis- temas de PCR multiplex contém múltiplos grupos de iniciadores que resul- tam na produção simultânea de mais de um amplicon. Iniciadores podem ser perfeitamente pareados com a sequência-alvo ou eles podem conter bases mal pareadas internas que podem resultar na introdução de sítios de enzima de restrição ou de reconhecimento/clivagem de ácido nucleico catalítico em sequências-alvo específicas. Iniciadores também podem conter seqüências adicionais e/ou conter nucleotídeos marcados ou modificados para facilitar a captura ou detecção de amplicons. Ciclos repetidos de desnaturação por calor do DNA1 ligação de iniciadores a suas seqüências complementares e prolongamento dos iniciadores ligados com polimerase resulta em amplifica- ção exponencial da sequência-alvo. Os termos alvo ou sequência-alvo ou molde se referem a seqüências de ácido nucleico que são amplificadas.

Métodos para sequenciamento direto de seqüências nucleotídi- cas são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica e podem ser en- contrados, por exemplo, em Ausubel et ai, (supra) e Sambrook et ai, (su- pra). Sequenciamento pode ser efetuado por qualquer método adequado, por exemplo, sequenciamento didesoxi, sequenciamento químico ou varia- ções destes. Sequenciamento direto tem a vantagem de determinar a varia- ção em qualquer par de base de uma seqüência particular.

Sistemas de detecção baseados em hibridização incluem, mas não estão limitados ao ensaio TaqMan e faróis moleculares. O ensaio Taq- Man (US 5.962.233) usa sondas alelo-específicas (ASO) com um corante doador em uma extremidade e um corante aceptor na outra extremidade tal que o par de corantes interaja através de transferência de energia ressonan- te fluorescente (FRET). Uma sequência-alvo é amplificada por PCR modifi- cada para incluir a adição da sonda ASO marcada. As condições de PCR são ajustadas de modo que uma única diferença nucleotídica afetará a liga- ção da sonda. Devido à atividade nuclease 5' da enzima Taq polimerase, uma sonda perfeitamente complementar é clivada durante a PCR enquanto uma sonda com uma única base mal pareada não é clivada. A clivagem da sonda dissocia o corante doador do corante aceptor subjugante, aumentan- do enormemente a fluorescência do doador.

Uma alternativa ao ensaio TaqMan é o ensaio de farol molecular (US 5.925.517). No ensaio de farol molecular, as sondas ASO contêm se- qüências complementares flanqueando a espécie específica a alvo de modo que um estrutura de grampo seja formada. A alça do grampo é complemen- tar à sequência-alvo enquanto cada braço do grampo contém corantes doa- dores ou aceptores. Quando não hibridizada com uma seqüência doadora, a estrutura de grampo traz o corante doador e o aceptor intimamente juntos extinguindo desse modo a fluorescência do doador. Quando hibridizada à sequência-alvo específica, entretanto, os corantes doador e aceptor são se- parados com um aumento na fluorescência de até 900 vezes. Faróis molecu- lares podem ser usados em conjunto com amplificação da sequência-alvo por PCR e prover um método para detecção em tempo real da presença de sequências-alvo ou podem ser usados após a amplificação. TILLING

Plantas da invenção podem ser produzidas usando o processo conhecido como TILLING (Lesões Locais Induzidas por Direcionamento em Genomas). Em uma primeira etapa, mutações introduzidas tal como altera- ções de único par de bases novas são induzidas em uma população de plan- tas pelo tratamento de sementes (ou pólen) com um agente mutagênico químico e então plantas adiantando plantas para uma geração onde muta- ções serão estavelmente herdadas. DNA é extraído e sementes são estoca- das a partir de todos os membros da população para criar um recurso que pode ser acessado repetidamente com o tempo. Para um ensaio TILLING, iniciadores de PCR são desenhados

para amplificar especificamente um único gene-alvo de interesse. A especifi- cidade é especialmente importante se um alvo é um membro de uma família gênica ou parte de um genoma poliplóide. Em seguida, iniciadores marcador com corante podem ser usados para amplificar produtos de PCR a partir de DNA de reservatório de múltiplos indivíduos. Esses produtos de PCR são desnaturados e religados para permitir a formação de pares de base mal pareados. Mal pareamentos ou heterodúplexes, representam tanto polimor- fismos de nucleotídeo único (SNPs) que ocorrem naturalmente (isto é, várias plantas da população provavelmente portam o mesmo polimorfismo) como SNPs induzidos (isto é, apenas raras plantas individuais são prováveis de exibir a mutação). Após a formação de heterodúplex, o uso de uma endonu- clease, tal como Cel I, que reconhece e cliva DNA mal pareado é a chave para descobrir novos SNPs dentro de uma população TILLING.

Usando esta abordagem, muitos milhares de plantas podem ser tríadas para identificar qualquer indivíduo com uma única alteração de base assim como pequenas inserções ou deleções (1-30 pb) em qualquer gene ou região específica do genoma. Fragmentos genômica sendo avaliados podem variar em tamanho em qualquer lugar de 0,3 até 1,6 kb. Reunindo em um fundo comum 8 vezes, fragmentos de 1,4 kb (descontando as extremi- dades onde a detecção de SNP é problemática devido ao ruído) e 96 colu- nas por ensaio, essa combinação permite até um milhão de pares de base de DNA genômico a serem triados por único ensaio, tornando TILLING uma técnica de alta produção.

TILLING é descrita adicionalmente em Slade e Knauf (2005) e Henikoff et ai, (2004).

Além de permitir detecção eficiente de mutações, a tecnologia TILLING de alta produção é ideal para a detecção de polimorfismos naturais. Portanto, interrogar um DNA homólogo desconhecido por formação de hete- rodúples com uma seqüência conhecida revela o número e posição de sítios polimórficos. Tanto alterações nucleotídicas como pequenas inserções e de- leções são identificadas, incluindo pelo menos alguns polimorfismos de nú- mero de repetição. Isto foi chamado Ecotilling (Cornai etal., 2004).

Cada SNP é registrado por sua posição aproximada em poucos nucleotídeos. Assim, cada haplótipo pode ser arquivado com base em sua mobilidade. Dados de seqüência podem ser obtidos com um incremento de esforço relativamente pequeno usando alíquotas do mesmo DNA amplificado que é usado para o ensaio de clivagem-mal pareamento. O iniciador de se- quenciamento esquerdo ou direito para umaúnica reação é escolhido por sua proximidade com o polimorfismo. Programa de computador sequencher realiza um alinhamento múltiplo e descobre a alteração de base, que em cada caso confirmou a bando no gel. Ecotilling pode ser realizado de modo mais econômico que se-

quenciamento completo, o método atualmente usado para a maior parte da descoberta de SNP Placas contendo DNA ecotípico em arranjo pode ser triada em vez de reservatórios de DNA de plantas mutagênicas. Devido à detecção ser em géis com resolução de par de bases por pouco e padrões de ruído serem uniformes pelas bandas, bandas que são de tamanho idênti- co podem ser pareadas, descobrindo e genotipando assim SNPs em uma única etapa. Deste modo, sequenciamento final do SNP é simples e eficien- te, feito mais pelo fato de que as alíquotas dos mesmos produtos de PCR usados para triagem podem ser submetidas a sequenciamento de DNA. Procedimentos de Mutaqênese

Técnicas para gerar linhagens de plantas de arroz mutantes são conhecidas na técnica. Exemplos de agentes mutagênicos que podem ser usados para gerar plantas de arroz mutantes incluem mutagênese por irradi- ação e química. Mutantes também podem ser produzidos por técnicas tal como inserção de T-DNA e mutagênese induzida por transposon. O proce- dimento de mutagênese pode ser realizado em qualquer célula parental de uma planta de arroz, por exemplo uma semente ou uma célula parental em cultura de tecidos.

Agentes mutagênicos químicos são classificáveis por proprieda- des químicas, por exemplo, agentes alquilantes, agentes reticuladores, etc. Agentes mutagênicos químicos úteis incluem, mas não estão limitados a, N- etil-N-nitrosuréia (ENU); N-metil-N-nitrosuréia (MNU); cloreto de procarbazi- na; clorambucil; ciclofosfamida; metanossulfonato de metila (MMS); meta- nossulfonato de etila (EMS); sulfato de dietila; monômero de acrilamida; trie- tileno melamina (TEM); malfalano; nitrogênio mostarda; vincristina; dimetilni- trosamina; N-metil-N'-nitro-Nitrosoguani-dina (MNNG); 7,12- dimetilbenzantraceno (DMBA); óxido de etileno; hexametilfosforamida e bi- sulfano.

Um exemplo de irradiação adequada para induzir mutações é por radiação gama, tal como aquela fornecida por uma fonte de Césio 137. A radição gama de preferência é fornecida à planta em um dosagem de apro- ximadamente 60 até 200 Krad. e da maior preferência em uma dosagem de aproximadamente 60 até 90 Krad.

Plantas são tipicamente expostas a um agente mutagênico por uma duração suficiente para realizar a modificação genética desejada, mas insuficiente para destruir completamente a viabilidade das células e suas habilidades para serem regeneradas em uma planta. Anticorpos

Anticorpos monoclonais ou policlonais que se ligam especifica-

mente a polipeptídeos FatB ou Fad2 podem ser úteis para alguns dos méto- dos da invenção.

O termo "se liga especificamente" se refere à habilidade do anti- corpo de se ligar a um polipeptídeo de FatB ou Fad2, mas não a outras pro- teínas de arroz, especialmente proteínas de sementes de arroz.

Conforme aqui utilizado, o termo "epítopo" se refere a uma regi- ão de um polipeptídeo de FatB ou Fad2 que é ligada pelo anticorpo. Um epí- topo pode ser administrado a um animal para gerar anticorpos contra o epí- topo, entretanto, anticorpos úteis para os métodos descritos aqui de prefe- rência se ligam especificamente à região de epítopo no contexto do polipep- tídeo inteiro.

Se anticorpos policlonais são desejados, um mamífero selecio- nado (por exemplo, camundongo, coelho, cabra, cavalo, etc.) é imunizado com um polipeptídeo imunogênico tal como aquele provido nas Figuras 2 ou 7 ou SEQ ID Nos 1 até 4 ou 15 até 18. Soro do animal imunizado é coletado e tratado de acordo com procedimentos conhecidos. Se o soro contendo anticorpos policlonais contiver anticorpos para outros antígenos, os anticor- pos policlonais podem ser purificados por cromatografia de imunoafinidade. Técnicas para produzir e processar antissoros policlonais são conhecidas na técnica. A fim de que tais anticorpos possam ser feitos, a invenção também provê peptídeos da invenção ou fragmentos desses haptenizados para outro peptídeo para uso como imunógenos em animais.

Anticorpos monoclonais direcionados contra polipeptídeos da invenção também podem ser prontamente produzidos por alguém versado na técnica. A metodologia geral para fazer anticorpos monoclonais por hibri- domas é bem-conhecida. Linhagens celulares produtoras de anticorpo po- dem ser criadas por fusão celular e também por outras técnicas tais como transformação direta de linfócitos B com DNA oncogênico, ou transfecção com vírus Epstein-Barr. Painéis de anticorpos monoclonais produzidos po- dem ser triados por várias propriedades; isto é, por afinidade de epítopo e isotipo.

Uma técnica alternativa envolve triagem de bibliotecas de visua-

lização de fago onde, por exemplo, o fago expressa fragmentos scFv na su- perfície de seu revestimento com uma grande variedade de regiões determi- nantes de complementaridade (CDRs). Esta técnica é bem-conhecida na técnica.

Para os fins desta invenção, o termo "anticorpo", a menos que

especificado em contrário, inclui fragmentos de anticorpos inteiros que retém sua atividade de ligação a um antígeno-alvo. Tais fragmentos incluem frag- mentos Fv, F(ab') e F(ab')2, assim como anticorpos de cadeia única (scFv). Além disso, os anticorpos e fragmentos desses podem ser anticorpos huma- nizados, por exemplo como descrito em EP-A-239400.

Anticorpos podem ser ligados em um suporte sólido e/ou emba- lados em kits em um recipiente adequado junto com reagentes adequados, controles, instruções e similares.

De preferência, os anticorpos são marcados detectavelmente. Marcadores detectáveis exemplares que permitem a medição direta de liga- ção de anticorpo incluem radiomarcadores, fluróforos, corantes, microesfe- ras magnéticas, quimioluminescentes, partículas coloidais e similares. E- xemplos de marcadores que permitem medição indireta de ligação incluem enzimas onde o substrato pode prover um produto colorido ou fluorescente. Marcadores detectáveis exemplares adicionais incluem enzimas covalente- mente ligadas capazes de prover um sinal de produto detectável após adi- ção de substrato adequado. Exemplos de enzimas adequadas para uso em conjugados incluem peroxidase de rábano selvagem, fosfatase alcalina, ma- Iato desidrogenase e similares. Quando não disponíveis comercialmente, tais conjugados anticorpo-enzima são prontamente produzidos por técnicas conhecidas por aqueles versados na técnica. Marcadores detectáveis exem- plares adicionais incluem biotina, que se liga com alta afinidade a avidina ou estreptavidica; fluorocromo (por exemplo, ficobiliproteínas, ficoeritrina e alofi- cocianinas; fluoresceína e vermelho Texas), que podem ser usados com um classificador celular ativado por fluorescência; haptenos e similares. De pre- ferência, o marcador detectável permite a medição direta em um luminôme- tro de placa, por exemplo, biotina. Tais anticorpos marcados podem ser usa- dos em técnicas conhecidas na técnica para detectar polipeptídeos da in- venção. EXEMPLOS

Exemplo 1. Materiais e Métodos Extração de óleo com metóxido de sódio

Para análises de ácido graxo e outras, lipídeo total foi extraído de grãos de arroz como se segue salvo declaração em contrário. Em alguns casos, amostras cada uma consistindo em uma metade de grão foram usa- das para a extração, com a segunda metade de grão contendo o embrião a ser usado para resgate de embrião. A técnica também pode ser usada com outros cereais.

Uma única semente em desenvolvimento ou metade de semente foi espremida entre papéis de filtro e colocada em um tubo. Dois mililitros de metóxido de sódio a 0,5M foram adicionados, o tubo selado apertadamente e então incubado a 80°C por 10 min. Após o tubo ser resfriado, 0,1 ml_ de ácido acético glacial foi adicionado seguido por 2 ml_ de água destilada e 2 mL de espírito de petróleo. As misturas foram agitadas em vórtex por 10 s e após as fases tinham se separado, a camada de petróleo superior foi trans- ferida para um tubo de teste pequeno. Aproximadamente 1g de mistura de bicarbonato de potássio/sulfato de sódio foi adicionado aos tubos de teste e a mistura agitada em vórtex. As soluções de amostra foram transferidas para frascos de autoamostrador e estocadas em um congelador a -20°C até a análise de GC ser realizada como descrito por Soutjesdic et a!., (2002). Extração de lipídeos a partir de tecidos com alto conteúdo aquoso (Método Bligh-Dyer)

Esse método foi adaptado de Bligh e Dyer (1959). 1,5 mL de CHCI3ZMeOH (1:2) foram adicionados a uma amostra de tecido em 0,4 mL de tampão e a amostra agitada em vórtex vigorasamente. 0,5 mL de CHCI3 adicionais foram adicionados e a amostra agitada em vórtex de novo. 0,5 mL de água foram adicionados e a amostra agitada em vórtex de novo. O tubo foi centrifugado brevemente a 3000 rpm em fases separadas; um precipitado branco apareceu na interface. A fase orgânica (inferior) foi transferida para um tubo novo e concentrada sob vácuo. Se lipídeos ácidos fossem para ser extraídos, 0,5 mL de 1% de HcIO4 eram adicionados em vez de 0,5 mL de H2O. Os volumes no procedimento acima poderiam ser modificados contanto que as razões de CHCI3ZMeOHZH2O fossem mantidas. Preparação de ésteres metílicos de ácido graxo (FAME) para determinação quantitativa de conteúdo de ácido graxo

Para preparar FAME diretamente a partir do grão, 10-15 semen- tes foram pesadas precisamente e transferidas para um tubo de vidro. Um padrão interno de 10 μί de 1 mg/mL de 17:0-éster metílico foi adicionado a cada amostra de semente. 0,75 mL de metanólico-HCI a 1N (SupeIco) foram adicionados a cada tubo que foi tampado com firmeza e submetido a refluxo a 80°C por pelo menos 2-3 h ou durante a noite. Amostras foram resfriadas, 0,5 mL de NaCI (0,9% p/v) adicionados seguidos por 300 [jL de hexano. Os tubos foram tampados de novo e agitados em vórtex vigorosamente. A fase de hexano superior (200-250 pL) foi cuidadosamente transferida para um tubo eppendorf. A amostra foi seca completamente sob nitrogênio. As amos- tras de FAME secas foram dissolvidas em 20 μί de hexano e transferidas para insertos de vidro cônico em frascos para análise GC. Análise FA por cromatografia gasosa Ésteres metílicos de ácido graxo foram preparados por transme-

tilação alcalina como se segue. Amostras de semente únicas foram espremi- das entre discos de papel de filtro. Os ácidos graxos no lipídeo transferidos para discos de papel de filtro então metilados em 2 mL de metóxido de sódio a 0,02 M por 10 minutos a 80°C, seguido por resfriamento por 30 minutos. 0,1 mL de ácido acético glacial foram então adicionados, seguidos em ordem por 2 mL de água destilada e 2 mL de hexano. Após agitação em vórtex e separação de fase, a camada de hexano superior contendo os ésteres meti- Iicos de ácido graxo foi transferida para um microfrasco. Esteres metílicos de ácido graxo foram analisados por cromatografia gasosa-líquida como descri- to previamente (Soutjesdijk etal., 2002). Transformação de arroz Arroz (cv. Nipponbare) foi transformado como se segue. i)lndução de calo e cultura

Cascas secas foram removidas do grão maduro, que foi então encharcados com EtHO 70% por 30 s para remover qualquer camada exter- na de cera. Os grãos limpos foram lavados 3 vezes com H2O estéril e en- charcados com uma solução de 25% de alvejante (com 2 gotas de detergen- te Tween-20 adicionadas) por 20 minutos com agitação para esterilizá-los na superfície. Sob condições assépticas, os grãos foram rinsados brevemente com EtOH 70%, lavados cuidadosamente com H2O estéril 8-10 vezes e co- locados em meio N6D. Placas foram seladas com fita Micropore e incubadas sob luz máxima luz a 28°C. Calos foram produzidos após 6-8 semanas e então transferidos para meios NB. Eles foram selados com papel de parafina e deixados nos 28°C com sub-cultivo a cada 4 semanas em placas NB fres- cas. Calos não foram usados para transformação após mais de 5 subculti- vos.

ii) Transformação

Calos parecendo saudáveis foram apanhados de placas de sub- cultivo e transferidos para placas NB frescas em uma densidade de 25-30 calos/placa. Dois dias depois, foi esabelecida uma cultura fresca da cepa de Agrobacterium contendo a construção a ser usada e incubada a 28 C. O meio de cultura foi meio NB suplementado com 100μΜ de acetosiringona. Calos foram imersos em uma suspensão das células por 10 minutos. Após drenar excesso de suspensão, calos foram colocados em meio NB suple- mentado com 100 μΜ de acetosiringona e incubados no escuro a 25°C por 3 dias (co-cultivo). Após a etapa de co-cultivo, calos foram lavados gentilmente três vezes em um tubo com H2O estéril contendo 150 mg/mL de Timetina. Calos foram transferidos secos em papel de filtro e plaqueados bem espa- çados em palcas de NBCT (contendo 100 pg/mL de canamicina se um gene de marcador selecionável de canamicina tiver sido usado ou outro agente de seleção conforme apropriado, 150 pg/mLde Timentina e 200pg/mLde Claro- forano). As placas foram incubadas no escuro por 3-4 semanas a 26-28°C. Calos resistentes foram observados após cerca de 10 dias e transferidos para NBCT + placas de seleção e incubados no escuro por 14-21 dias adi- cionais. Calos saudáveis foram transferidos para PRCT + placas de seleção e incubados no escuro por 8-12 dias, então transferidos em RCT + placas de seleção e incubados em luz máxima a 28°C por 30 dias. Após este tempo, plântulas que se desenvolveram foram transferidas para meio 1/2MS em

potes de cultura de tecidos sob luz por 10-14 dias para crescimento adicional antes de transferência para solo.

iii) Composição de meios e componentes para cultura de tecidos

de arroz.

Macroelementos N6 (20X) (g/L): (NH4)2SO4, 9,3; KNO3, 56,6;

KH2PO4, 8; MgSO4TH2O, 3,7; CaCI22H20, 3,3.

Micro N6 (1000X) (mg/1 OOmL): MnSO4^H2O1 440; ZnSO4TH2O, 150; H3BO3, 160; Kl, 80.

Vitaminas N6 (100X) (mg/1 OOmL): Glicina, 20; Tiamina-HCI, 10; Piridoxina-HCI, 5; ácido nicotínico, 5.

Microelementos B5 (100X) (mg/1000mL): MnS044H20, 1000;

Na2Mo04'2H20, 25; H3BO3, 300; ZnSO4TH2O1 200; CuS045H20, 3,87; Co- CI2"6H20, 2,5; Kl, 75.

Vitaminas B5 (100X) e solução de vitamina de Gamborg (1000x) de cultura celular Sigma.

FeEDTA (200X) (g/200mL): sal sódio férrico, 1,47.

2,4-D (1mg/mL): Dissolva 100 mg de ácido 2,4-dicloro- fenoxiacético em 1 mLde etanol absoluto, adicione 3mLde KOH a 1N, ajus- te para pH 6 com HCI a 1N.

BAP (1mg/mL): 6-benzil amino purina de cultura celular Sigma.

NAA (1 mg/mL): ácido naftaleno acético de cultura celular Sigma.

ABA (2,5mg/mL): Dissolva 250mg de ácido abscísico em 2 mL de NaOH 1M, complete até 100 mL com água destilada estéril. Concentra- ção de ruído final a ser 20mM de NaOH.

Higromicina (50mg/mL): Solução de higromicina da Roche. Timetina (150mg/ml_): Dissolva 31 OOmg de Timetina em 20,66mL de água estéril. Concentração final a ser 150 mg/mL. Claforano (200mg/mL): Dissolva 4gm de Claforano em 20mL de

água estéril.

Sais MS: Meio orgânico mínimo de Murashige-Skoog. Meio N6D (quantidade por litro): N6 macro (1OX) IOOmL N6 micro (1000X) 1mL

vitaminas N6 (1000X) 1 mL ferro MS/EDTA 5mL Mioinositol 100mg Ácido casam ínico 300mg Prolina 2,9mg

2,4-D (1 mg/mL) 2mL Sacarose 30mg

pH ajustado a 5,8 com KOH a 1M, adicionar 3g de fitogel/litro,

autoclavar.

Meio NB (quantidade por litro):

Macroelementos N6 (20X) 50mL microelementos B5 (100X) 10mL vitaminas B5 (100X) 10mL FeEDTA (200X) 5mL 2,4-D (1 mg/mL) 2mL

Sacarose 30mg Prolina 500mg Glutamina 500mg

Hidrolisado de caseína enzimática (CEH) 300mg NBO: Meios NB1 mais 30g/L de manitol e 30g/L de sorbitol, adi-

cionados antes de ajuste de pH.

NBCT + seleção (Higromicina-H30): Meios NB1 mais 30mg/L de de higromicina, Timentina 150 mg/mL, Claforan 200 mg/L.

NBCT + seleção (Higromicina-H50): Meios NB, mais seleção por 50mg/L de de higromicina, Claforan 200 mg/L e Timentina 150 mg/mL.

PRCT + Seleção: Meios NB com nenhum 2,4-D, mais em segui- da adicionados após autoclave: BAP, 2 mg/L; NAA, 0,5mg/L; ABA, 5 mg/L; Claforan, 100g/L; Timentina; 150mg/mL + seleção.

RCT + Seleção: Meios NB com nenhum 2,4-D, mais em seguida adicionados após autoclave: BAP; 3 mg/L; NAA, 0,5mg/L; Timentina, 150mg/mL; Claforan, 100g/L + seleção. Meios 1/2MS: Mistura de sais e vitamina MS1 2,21 g; Sacarose,

10g por litro, adicionar 2,5 g de fitogel/L, após autoclavação adicionar 0,05mg/Lde NAA e Timentina 150mg/mL. Exemplo 2. Identificação e isolamento de genes FatB de arroz

Genes FatB codificam a enzima palmitoil-ACP tioesterase que tem a atividade preferencialmene de transferir ácidos graxos que têm um comprimento de 16 carbonos ou menos da proteína carreadora de acila para acil-COA e assim previne alongamento adicional da cadeia de carbono de ácido graxo. Seqüências de FatB de arroz putativas foram identificadas u- sando pesquisas baseadas em homologia usando a seqüência para o aces- so do GenBank de Arabdopsis loco AtACPTE32 e loco Iris AF213480. O programa usado foi Megablast disponível em NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Parâmetros-padrão usados pelo NCBI foram usados e os bancos de dados usados foram tanto não-redundantes (nr) co- mo seqüências gênicas de alta produção (htgs) para arroz, Oryza sativa. As seqüências mais similares de arroz selecionadas pelo programa Megablast foram então traduzidas e examinadas pela presença da seqüência conser- vada NQHVNN (SEQ ID NO: 26) encontrada em todas as seqüências de FatB. Um resíduo de aminoácido adicional que se acredita ser essencial em Arabdopsis é cisteína 264 e junto com asparagina 227 e histidina 229 (que estão ambas presentes na seqüência conservada NQHVNN) compreende a tríade catalítica proposta. O Banco de Dados de Arroz Chinês (endereço de portal atual http://rise.genomics.org.cn/rice/index2.jsp) também foi usado em uma extensão limitada e parâmetros-padrão para busca BLAST foram usa- dos com a seqüência de Arabidopsis e seqüências lris. As seqüências tradu- zidas são alinhadas na Figura 2.

Um vista geral das estruturas de todos os genes de FatB é mos- trada na Figura 3. Os genes descritos correspondem como se segue às se- qüências proteicas discutidas-AC108870 corresponde a 0s11g43820, AP005291 corresponde a 0s02g43090, AP000399 corresponde a 0s06g5130 e AP004236 corresponde a 0s06g39520. Note a possibilidade de múltiplos transcritos de um gene como indicado no diagrama. A Figura 4 mostra um alinhamento de CLUSTAL W (rápido) das seqüências do 'gene' usando parâmetros-padrão note que os 'genes' são de comprimentos dife- rentes.

Os genes compreendem 6 éxons. A estrutura do gene descrito por OS06g5130 é mostrada em detalhe na Figura 5. A Figura 6 mostra um alinhamento das seqüências codificantes

dos cDNAs de FatB indicando os diferentes iniciadores usadas para amplifi- cação de PCR seletiva.

A identidade de seqüência entre seqüência peptídica traduzida de 0s06g5130 e 0s06g39520 (correspondentes à seqüência ap000399 e ap004236 na Figura 2) foi de 74% total e a identidade no nível nucleotídico pela seqüência codificante inteira foi de 69%. Em ambos os casos o progra- ma BESTFIT com parâmetros-padrão foi usado. Os polipeptídeos deduzidos de 0s02g43090 (um transcrito), 0s06g05130, 0s06g39520 e 0s011g43820 correspondem a 298, 427, 423 e 425 aminoácidos respectivamente. A atividade das proteínas codificadas foi suposta a partir do alto

grau de identidade de seqüência com polipeptídeos conhecidos mostrados como tendo essa atividade. Além disso, o efeito observado em níveis de áci- do palmítico de construções que inativam gene baseadas nessas seqüên- cias também foi consistente com essa conclusão (vaja abaixo). A expressão da família gênica foi complexa, com pelo menos

sete transcritos previstos a partir desses quatro genes. Com a base de expe- rimentos de RT-PCR que foram realizados e números relativos de clones recuperados a partir de bibliotecas de EST1 pareceu que RNA de 0s06g05130 era relativamente abundante no grão, enquanto 0s11g43820 era expresso em níveis moderados naquele tecido e os outros genes eram expressos apenas em um baixo nível.

Exemplo 3. Identificação e isolamento de genes Fad2 de arroz

Proteínas codificadas por genes Fad2 (ácido graxo dessaturase 2) são responsáveis pela introdução de um ligação dupla em ácido graxos 18:1 - elas são Δ12 dessaturases. A seqüência do GenBank a partir do Iocus de Arabidopsis athd12aaa foi usada para buscar os bancos de dados nr e htgs para Oryza sativa usando Megablast em ajustes padrão. As seqüências mais similares resgatadas a partir de arroz foram traduzidas e examinadas pela presença de motivos hidrofóbicos conservados FSYWHDLVIVAALLFALVMI (SEQ ID NO:27),

AWPLYlAQGCVLTGVWVIA (SEQ ID NO:28), ISDVGVSAGLALFKLSSAFGF (SEQ ID NO:29), VVRVYGVPLLIVNAWLVLITYLQ (SEQ ID N0:30)

e as seqüências de arroz de histidina HECGHH (SEQ ID NO: 31); HRRHHA (SEQ ID NO: 32) e HVAHH (SEQ ID NO: 33). As seqüências de aminoácidos traduzidos das isoformas obtidas são mostradas na Figura 7.

A Figura 8 provê um alinhamento de seqüências de Fad2 mos- trando a localização de 5' UTR na isoforma AP004047 (minúsculas) e locali- zação de iniciadores usados para amplificação por RT-PCR (sublinhado). A localização do códon de parada é indicada por uma caixa e regiões não- traduzidas a jusante do códon de parada estão em minúsculas.

Quatro seqüências gênicas são recuperadas como sendo alta- mente similares a partir do genoma de arroz quando a seqüência nucleotídi- ca codificando a proteína com a seqüência de aminoácidos de AP004047 foi usada para buscar o genoma de arroz usando o programa BLAST com os parâmetros-padrão. A estrutura total desses genes é mostrada na Figura 9. Os genes correspondem às seqüências proteicas como se segue. A seqüên- cia proteica AP004047 (também chamada FAD2-1 aqui) correspondeu ao gene 0s02g48560, a seqüência AP005168 (também chamada FAD2-2 aqui) correspondeu a 0s07g23410 e a seqüência contig2654 correspondeu a 0s07g23430. Além disso, havia uma seqüência que compartilhou uma intri- gante extensão de identidade de seqüência, mas era claramente diferente dessas seqüências e pode ser um pseudogene. Esta seqüência era 0s07g23390.

Diferente dos genes FatB, os genes Fad2 não contêm quaisquer

íntrons. Um alinhamento de todas as seqüências codificantes de proteína é mostrado na Figura 10. A identidade de seqüência pela região codificante inteira para 0s02g48560 até 0s07g23410 foi de 79%.

O peso molecular do polipeptídeo codificado por 0s02g48560 (isto é, AP004047) foi de 44,35 kDa antes do processamento e continha 388 aminoácidos. O peso molecular do polipeptídeo codificado por 0s07g23410 foi de 44,9 kDa e continha 390 aminoácidos. Esses polipeptídeos deduzidos tiveram 77% de identidade de seqüência como determinado pelo programa BASTFIT usando parâmetros-padrão. O polipeptídeo deduzido de 0s07g23430 teve um peso molecular de 41 kDa (363 aminoácidos) e de 0s07g23390 foi de 24 kDa (223 aminoácidos). Um alinhamento de todas as seqüências polipeptídicas deduzidas é mostrado na Figura 7.

A seqüência correspondente a 0s02g48560 foi expressa no grão e esta observação foi consistente com dados das freqüências relativas de clones para este gene em bibliotecas EST onde seqüências cognatas foram recuperadas de bibliotecas cDNA de grão. Seqüências correspondentes a duas das isoformas codificadas no cromossomo 7 (0s07g23430, 23410) fo- ram recuperadas a partir de uma biblioteca de EST de folha, mas a seqüên- cia correspondente ao outro gene (0s07g23390) não foi relatada; nós con- cluímos que ele pode ser expresso em níveis baixos se for.

Em conclusão, a família gênica de Fad2 de arroz também era uma família gênica complexa. Os dois transcritos deduzidos de 0s02g48560 eram indistinguíveis pela seqüência. A seqüência deduzida de 0s02g48560 era claramente expressa no grão. Exemplo 4. Expressão de genes FatB e Fad2 em arroz

Para determinar quais, se algum, dos 4 genes de FatB e 3 de Fad2 putativos identificados em arroz como descrito nos Exemplos 2 e 3 po- diam ser expressos em grão de arroz em desenvolvimento, ensaios de rea- ção em cadeia da polimerase e transcrição reversa (RT-PCR) foram efetua- dos. Visto que genes eram intimamente relacionados em seqüência, tinham que ser desenhados iniciadores que fossem específicos para cada um dos genes, para avaliar transcritos para cada gene especificamente. Regiões de divergência de seqüência foram identificadas a partir dos alinhamentos (Fi- guras 6 e 8) e vários pares de iniciadores foram desenhados e testados. Se- qüências de iniciador para detectar a expressão dos genes FatB putativos são dadas nas Tabelas 3 e 4. Como um padrão interno contra o que compa- rar níveis de expressão, RT-PCR também foi efetuado no RNA para expres- são do gene de arroz codificando alfa-tubulina, OsTubAI. Este gene era co- nhecido como sendo expresso em todos os tecidos em divisão ativa e não foi afetado pelo hormônio ABA e portanto era adequado como um controle expresso constitutivamente para análise em folha e grão. O RNA foi preparado a partir de grãos de arroz aproximadamen-

te 15 dias após a floração usando o kit Rneasy da Qiagen seguindo protoco- los fornecidos pelo fabricante. Tratamento com DNAse (kit livre de DNA, Ambion) foi então usado para remover DNA contaminante da preparação de RNA. A mistura de RT-PCR continha 5 μΙ_ de tampão de RT-PCR OneStep 5x, 1 μΙ_ de mistura de dNTP (contendo 10mM de cada dNTP), 15 pmol de cada iniciador e aproximadamente 20 pg de RNA em um volume final de 25 μΙ_. O seguinte programa de ciclagem de RT-PCR foi usado para as amplifi- cações de RT-PCR: 30 min a 50°C (transcrição reversa), 15 min a 95°C (ati- vação de PCR inicial), 30 ciclos de (1min a 94°C, 1min a 57°C, 1min a 72°C) (amplificação de PCR), então uma extensão final de 10min a 72°C.

Tabela 3. Iniciadores desenhados para amplificar e descriminar expressão relativa dos transcritos de FatB putativos usando RT-PCR de uma etapa.

Gene Amplifi- cado Id do GenBank/ID do Contig Chinês n°. Nome do iniciador Seqüência do inici- ador FatB-1 AP000399 p0399F2 CGCTGCTACCAAACAATTCA (SEQ ID NO:34) ... 1TCTGTGTTGCCATCATCG P0399R2 | (SEQID NO:35) FatB-2 AC108870 p5291_F2 CAGO AAATAAAGTrGGTGATGATG (SEQID NO:36) p8870R CTTCACAATATCAGCTCCTGACTC (SEQIDNO:37) FatB-3 AP005291 p5291_F2 CAGOAAATAAAGTrGOTOATGATG (SEQ lDNO:38) p5291R CTTCACAATGTCAGCCTTCAC (SEQ ID NO:39) FatB-4 AP004236 P4236F2 ACAGGCCTGACTCCACGAT (SEQ ID N0:40) P4236R2 GTCCAGAGTGCTTGTTGCAG (SEQ IDN0:41) OsTubAI AF182523 OSTUBA1_F TACCCACTCCCTCCTTGAGC (SEQ ID NO:42) OSTUBA_R AGGCACTGTTGGTGATCTCG (SEQ ID NO:43)

Tabela 4. Iniciadores desenhados para amplificar e descriminar expressão relativa dos transcritos de Fad2 putativos usando RT-PCR de uma etapa.

Gene Amplifi- cado Id do GenBank/ID do Contig Chinês n°. Nome do iniciador Seqüência do inici- ador Fad2-1 AP004047 pFad2-1 F CACAAAGAGGGAGGGAACAA (SEQ ID NO:44) pFad2-1 R GAAGGACTTGATCACCGAGC (SEQ ID NO:45) Fad2-2 Contig2654 UTR_2654_F CACAACATCACGGACACACA (SEQ ID NO:46) UTR_2654_R GCAAGACCGACATGGCTAAT (SEQ IDNO:47) Fad2-3 AP005168 UTR_5168_F ACGTCCTCCACCACCTCTT (SEQ ID NO:48) UTR_5168_R CAGAAGCAGTGACATACCCAAG (SEQ ID NO:49) OsTubAI AF182523 0STUBA1_F TACCCACTCCCTCCTTGAGC (SEQ ID N0:50) 0STUBA1_R AGGCACTGTTGGTGATCTCG (SEQ IDN0:51)

Resultados dos experimentos de RT-PCR demonstraram que a

seqüência do gene Fad2-1 (identificador de banco de dados de arroz em TIGR L0c_0s02g48560) era altamente expressa tanto em grão como em folha em relação aos genes codificando as outras isoformas. Os outros dois genes Fad2 (L0c_0s07g23410 e L0c_0s07g23430) pareceram ser ex- pressos em baixos níveis e primariamente na folha. A análise de genes codi- ficando as isoformas de FatB mostraram que FatB-1 (identificador do Gen- Bank AP000399, Tigr L0c_0s06g05130) e FatB-2 (identificador do Gen- Bank AC108870, identificador TIGR 0s11g43820) foram mais altamente ex- pressos no grão que ou outros dois genes. O mutante de inserção transposi- cional Tos-17 tece uma inserção no gene codificando AP000399.

Em tecido de folha, FatB-1 (identificador do GenBank AP000399,

Tigr L0c_0s06g05130) e FatB-4 (AP004236, TIGR L0c_0s06g39520) fo- ram mais altamente expressos, referindo-se à abundância relativa de trans- critos de mRNA dos genes. Quando comparada à abundância dos transcri- tos de gene de tubulina como um padrão, que era um mRNA moderadamen- te abundante em grão de trigo e era portanto esperado como sendo similar- mente abundante em grão de arroz, todos os mRNAs de FatB e Fad2 acu- mularam-se em baixos níveis como determinado por RT-PCR. Entretanto, esta conclusão foi baseada assumindo-se que os iniciadores, para cada um dos genes testados, hibridizaram-se aos transcritos-alvos com eficiência si- milar aos iniciadores de tubulina/transcrito.

Esta conclusão é corroborada por busca em banco de dados de EST. Quando a seqüência Fad2-1 (TIGR 0s02g48560) foi usada para bus- car seqüências de EST de arroz, seqüências de transcrito estavam presen- tes em bibliotecas de cDNA de panícula, raiz e planta inteira. Em contraste, seqüências de Fad2-2 (TIGR 0s07g23410) e Fad2-3 (TIGR 0s07g23430) estavam presentes apenas em bibliotecas de folha, broto ou planta inteira. A seqüência para 0s07g23390, o gene similar a Fad2 considerado como sen- do um pseudogene, não estava presente em nenhuma das bibliotecas de EST. Similarmente, seqüências de FatB-I (TIGR 0s06g05130) estavam pre- sentes tanto em bibliotecas de EST de folha como de panícula, enquanto seqüências de FatB-2 (TIGR 0s11g43820) estavam presentes apenas em bibliotecas de EST de panícula ou planta inteira e FatB-4 (TIGR 0s06g39520) apenas em uma biblioteca de folha. Seqüências de FatB-3 (AP005291, Os02G430900) embora expressadas em um nível relativamente baixo para os outros tanto em folha como grão como julgado por RT-PCR, estavam presentes em bibliotecas de Est de panícula e planta inteira. Essas buscas usaram o programa BLAST no portal NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi) usando o banco de dados de EST e limitando a busca às seqüências de arroz.

Com base nesses dados, Fad2-1 e FatB-2 foram considerados como sendo os genes que deveriam ser infrarregulados para alteração de lipídeo em grão. Também se pensou que FatB-3 era importante a esse res- peito.

Exemplo 5. Construção de construções de silenciamento gênico e transfor- mação de arroz

Criação de construção dúplex RNA para inibição de expressão

de Fad2

Um construto foi desenhado para expressar um Dúplex RNA (RNA em grampo) em grão de arroz em desenvolvimento a fim de reduzir a expressão de Fad2-1. Pelo direcionamento a regiões comuns das três se- qüências gênicas de Fad2, a construção foi desenhada de modo que ela fosse eficaz para todos os três genes de Fad2 indetificados em grão de arroz a fim de potencialmente maximizar o efeito na composição de ácido graxo. Para melhorar o silenciamento gênico, a construção continha um íntron entre as porções em sentido e antissentido das seqüências de repetição invertidas como descrito por Smith et al., (2000). Um fragmento de 505 pares de base foi amplificado por PCR a

partir da extremidade 5' do gene Fad2-1 usando os oligonucleotídeos

pFAd2-F AAAGGATCCTCTAGAGGGAGGAGCAGCAGAAGC-3· (SEQ ID NO:52) Q

pFad2-R 5'-AAAACTAGTGAATTCTACACGTACGGGGTGTACCA-3' (SEQ ID NO:53). O produto de PCR foi ligado em pGEM-Teasy1 transformado em E.coli e co- lônias contendo o insero identificadas. O fragmento Xbal/EcoRI do plasmí- deo designado pGEM-T-Fad2, contendo o fragmento de Fad2 de 505 pb, foi então ligado na direção em sentido no vetor ZLRint9_BC3895 (obtido de Zhongyi Li, CSIRO Plant Industry) contendo o íntron Rint9. Um fragmento BamHI/Spel de pGEM-T-Fad2 foi então ligado (na orientação antissentido) no plasmídeo resultante de modo que um íntron contendo construção de grampo foi formado. O fragmento BamHI/Kpnl contendo o íntron Fad2-1 con- tendo grampo foi então inserido nos mesmo sítios de restrição do vetor pBx17casN0T (Zhongyi Li, comunicação pessoal), contendo o promotor es- pecífico de semente Bx17 contendo uma seqüência de poliadenila- ção/terminadora de Nos de modo que o gene de silenciamento seria expres- sado em semente em desenvolvimento na ordem (promotor) sentido-íntron- antissentido (terminador). O fragmento Hindlll/Notl contendo o promotor Bx17 e região de repetição invertida de Fad2-1 foi então inserido nos mes- mos sítios de restrição do vetor pWBvec8 (Wang et al., 1998) que continham um gene de marcador selecionável conferindo resistência a higromicina. Es- te vetor foi então introduzido em Agrobacterium e usado para transformação de arroz como descrito no Exemplo 1. A construção de Dúplex RNA foi de- signada dsRNA-Fad2-1.

Criação de construção de dúplex RNA para inibição de expressão de FatB

Um fragmento de 665 pares de bases do gene de palmitoil-ACP tioesterase de arroz (Tigr L0ç_0s06g05130) foi amplificado por PCR usan- do iniciadores com as seguintes seqüências:

Rte-si, s^agtcatggctggttctcttgcggc-s' (seq id no:54) 0

Rte-al, 5'- ACCATCACCTAAGAGACCAGCAGT-3' (SEQ ID NO:55). £ste

fragmento de PCR foi usado para fazer uma construção de repetição inverti- da com uma cópia do fragmento na orientação em sentido e uma segunda cópia na orientação antissentido, separada pela seqüência de íntron de 5'UTR do gene GhFad2-1 de u)6-dessaturase microssomol de algodão (Liu et al., 1999). A construção de repetição invertida foi subseqüentemente inse- rida no sítio de Sacl entre o promotor d Ubil e terminador Nos de pUbilcas- NOT (de Zhongyi Li baseado na seqüência descrita em Li et al., 1997). A porção de repetição invertida de FatB de arroz com o promotor pUbil foi en- tão inserida no sítio de Notl do cetor binário pWBVec8 e introduzida em A- grobacterium como para a construção de Fad2 descrita acima. A construção de Dúplex RNA foi designada dsRNA-FatB-1. Análise de composição de ácido graxo em arroz transformado

Dez plantas transgênicas férteis independentes obtidas com ds- RNA-Fad2-1 foram testadas pela presença do gene dRNA por PCR usando um iniciador correspondente a um sítio dentro da região promotora e um se- gundo iniciador para a extremidade da seqüência de Fad2. Nove das dez plantas foram descobertas como positivas na reação de PCR e portanto con- tinham a construção de RNAi de Fad2. Similarmente, 23 linhagens transgê- nicas férteis foram testadas para a construção de RNAi de FatB e 20 Iinha- gens foram descobertas como sendo positivas para PCR.

Para analisar o efeito dos transgenes na composição de ácido graxo, lipídeo total foi isolado de amostras de grão e folhas das plantas de arroz transformadas. Isto também foi feito para uma linhagem mutante de arroz contendo uma seqüência insercional Tos17 no gene FatB-1 (TIGR Ιο- ί 0 eus 0s06g05130 correspondendo à proteína identificada pelo No. de Acesso AP000399) para comparar o efeito de inativar especificamente esse gene. A composição de ácido graxo foi determinada para cada extrato lipídico por GC-FAME como descrito no Exemplo 1. Os dados são apresentados nas Tabelas 5 até 7 e alguns desses dados estão presentes graficamente nas Figuras 11 até 13. A proporção de cada ácido graxo foi expressa como uma porcentagem do ácido graxo total no óleo de semente do grão como deter- minado por HPLC como descrito no Exemplo 1.

O aspecto mais admirável e surpreendente dos resultados foi a extensão da alteração na composição de ácido oleico e ácido Iinoleico de grão nas plantas dsRNA. A proporção de ácido oleico em algumas linhagens aumentou de 36% até pelo menos 65% (p/p) e dessas de ácido Iinoleico di- minuiu de 37% até cerca de 13% na linhagem de arroz mais afetada (Linha- gem 22A). Surpreendentemente, a proporção de ácido palmítivo nas linha- gens Fad2 também foi diminuída, por exemplo na Linhagem 22A menos de 14% de quando comparado ao controle (18%).

Nas linhagens dsRNA de FatB, a redução na proporção de ácido palmítico no grão está correlacionada com um aumento no conteúdo de áci- do Iinoleico enquanto as proporções de ácido oleico e ácidos Iineoleicos fica- ram essencialmente inalteradas. Foi notado que a extensão da diminuição na proporção de ácido palmítico nas linhagens transgênicas tanto de Fad2 como de FatB foi similar, mas a extensão de aumento no nível de ácido Iino- Ieico nas linhagens de FatB foi muito menor que a extensão da diminuição observada nas linhagens Fad2. Isto é, a extensão da alteração em níveis de Iinoleico foi maior com a construção de Fad2.

Uma perspicácia interessante na etapa da via catalisada por FatB é provida pela análise do knockaut insercional Tos-17 de uma isoforma de FatB, FatB-1. No mutante Tos-17, a extensão da alteração nas propor- ções de ácido palmítico e ácido oleico foi reduzida comparada às linhagens dsRNA de FatB. Esses resultados indicaram que genes codificando as iso- formas de FatB diferiram em suas funções.

Quando os resultados das proporções de ácido Iinoleico contra ácido oleico foram plotadas em uma plotagem de dispersão (Figura 14), fi- cou claro que a relação entre esses dois ácidos graxos nos nocautes de Fad2 era a mesma que em arroz selvagem, embora a proporção de ácido Iinoleico estivesse vastamente reduzida. Em contraste, com o knockaut de FatB e

Tabela 5. Análise GC de composição de ácido graxo em grão de arroz de

mutantes de FatB e Fad2

Grão-Mutante Mirfstico (C14:0) Palmítico (C16:0) Esteárico (C18:0) Oleico (C18:1) Linoleico (C18:2) Linoleico (C18:3) Selvagem (WH12) 0,70 18,83 1,64 38,41 36,42 1,29 Mutante inser- cional Tos17 de FatB 0,72 15,13 2,33 37,15 38,61 1,87 Linhagem transformada dsRNA de FatB 0,58 11,43 1,81 34,92 46,60 1,91 Linhagem transformada dsRNAde Fad2 0,58 14,26 2,11 64,94 12,62 1,23 Controle para Tos 17 0,85 17,91 2,60 33,23 39,84 1,76 Controle para dsRNa de FatB 1,03 18,86 1,84 34,08 39,63 1,75 Controle para dsRNa de Fad2 1,02 17,47 2,38 36,03 37,42 1,50 Tabela 6. Análise GC de composição de ácido graxo em folhas de arroz de m utantes de FatB e Fad2

Folha- Mutante Láurico (C12:0) Mirístico (C14:0) Pal mítico (C16:0) Esteárico (C18:0) Oleico (C18:1) Linoleico (C18:2) Linoleieo (C18:3) Selvagem (WF2) 0,80 14,43 1,90 2,32 8,99 68,96 Mutante insercional Tos17 de FatB 0,34 11,55 1,84 2,24 15,04 67,70 Linhagem transformada dsRNA de FatB 0,56 1,01 14,39 2,09 2,07 13,21 64,56 Linhagem transformada dsRNA de Fad2 Controle para Tos17 0,39 10,52 1,80 2,30 15,61 67,65 Controle para dsRNa de FatB 0,72 1,15 13,30 2,03 4,04 24,62 52,28

Tabela 7. Quantidades relativas de ácidos graxos de grãos em linhagens mutantes comparadas a linhagens controle correspondentes (% em mutan-

Mirístico (C14:0) Palmítico (C16:0) Esteárico (C18:0) Oleico (C18:1) Linoleico (C18:2) Linoleieo (C18:3) Ácidos graxos de grão Mutante insercional Tos 17 de FatB 0,85 0,8451* 0,899 1,118* 0,9691 1,06 Linhagem trans- formada dsRNA de FatB 0,57* 0,6060* 0,980 1,025 1,176* 1,09 Linhagem trans- formada dsRNA de Fad2 0,570* 0,8167* 0,887* 1,802* 0,3373* 0,822* Ácidos graxos de folha Mutante insercional Tos 17 de FatB nd 0,911* 0,977 1,03 1,037 0,9992 Linhagem trans- formada dsRNA de FatB nd 0,9247 0,969 1,95* 1,864* 0,8098* *Alteração estatisticamente significativa.

e a uma extensão inferior na linhagem Tos-17 de FatB, embora a relação entre ácido Iinoleico e oleico fosse similar, ela é mudada por uma constante. Isto significou que havia mais ácido Iinoleico nas plantas knockaut de FatB para uma dada quantidade de ácido oleico que em plantas selvagens ou no- cautes de Fad2. Isto foi consistente com a idéia de que knockaut de FatB influenciou as vias que controlam as quantidades de ácido oleico e linoleico, mas não a etapa que liga diretamente ácido oleico e ácido linoleico que foi controlada por Fad2.

Os resultados da proporção de ácido linoleico contra palmítico também foram plotadas para todas as linhagens de arroz analisadas. Uma relação linear positiva foi observada para as linhagens nocautes de Fad2, inverso do que foi observado para ácido linoleico contra oleico. Para as li- nhagens FatB, entretanto, uma relação diferente é observada (Figura 15). Uma diferença na relação entre ácido oleico e palmítico também foi obser- vada quando as plantas dsRNA de Fad2 e plantas dsRNA de FatB foram plotadas como uma plotagem de dispersão (Figura 16). Esses resultados confirmaram que a relação entre ácido palmítico e linoleico (e ácido oleico) era diferente para as duas perturbações da via.

Análise de componente principal das proporções dos vários áci- dos graxos sob perturbações diferentes da via confirmam que componente principal 1 (que indica os eixos que contribuem coma maior variação) era composto das proporções de linoleico contra oleico enquanto o componente principal 2 (o segundo mais importante grupo de eixos) era composto de proporções de ácido linoleico e oleico contra ácido palmítico. Isto é ilustrado na Figura 17.

Foi também concluído a partir desses resultados apresentados neste Exemplo que cruzamento de plantas Fad2 dsRNA com as plantas FatB dsRNA ou plantas FatB Tos-17 para combinar as mutações aumentari- am adicionalmente a proporção relativa de ácido oleico e diminuiriam adicio- nalmente níveis de ácido palmítico e linoleico. Exemplo 6. Produção e uso de anticorpos Anticorpos foram construídos pela síntese de 15 ou 16-mer de peptídeos que estavam presentes na seqüência deduzida de FatB. Os pep- tídeos usados para construir anticorpos contra FatB foram: FatB-Ul Ac-CGMNKNTRRLSKMPDE (SEQ ID NO:56).

Este corresponde à seqüência traduzida de FatB (No. de Acesso Ap000399) a partir da posição de aminoácido número 259 e também foi encontrado em seqüências traduzidas de AP005291, AC108870 e AC004236. Entretanto, a seqüência foi apenas idêntica entre as quatro isoformas na seqüência TRR- LSKMPDE (SEQ ID NO: 57).

FatB-m. Ac-CGEKQWTLLDWKPKKPD (SEQ ID NO:58).

Esta seqüência foi encontrada na seqüência traduzida de todas as quatro isoformas de FatB.

FatB-99. Ac-CGAQGEGNMGFFPAES (SEQ ID NO:59).

Esta seqüência foi encontrada apenas em AP00399 e estava na extremidade mais C-terminal do polipeptídeo deduzido.

Após a síntese, os peptídeos foram acoplados ou a ovoalbumina ou proteína hemocianina Keyhole Limpet (KLH) usando o reticulador MBS (succinamida éster N-hidrxílixo do ácido maleimidobenzóizo) usando técni- cas pdrão. O peptídeo reticulado foi dialisado e Iiofilizado injetado em coe- lhos em dois intervalos semanalmente por dois meses com adjuvante in- completo de Freund em uma concentração de aproximadamente 1mg/mL. Antissoros incitados contra FatB-99 detectaram uma clara diferença entre isoformas de FatB em que um polipeptídeo de 20 kDa presente em arroz selvagem foi perdido na linhagem mutante Tos-17 que tem uma inserção no gene correspondente ao identificador TIGR 0s06g05130, o produto corres- ponde a FatB-1, a seqüência está representada pelo No. de acesso AP000399 (Figura 18). Embora isto tenha sido diferente do tamanho espera- do de aproximadamente 40 kDa, tal discrepância foi noticiada antes com isoformas de FatB. Tamanho diferente de produtos de FatB foram observa- dos em sementes de Cuphea wrightii em desenvolvimento e maduras mos- trando cinco diferentes isoformas de FatB, tamanho maior em sementes ma- duras e produto mais curto em sementes maduras (Leonard etal., 1997). Os antissoros podem ser usados para detectar proteína de FatB em amostras de planta transgênica ou mutante e confirmar a extensão da inativação gênica.

Exemplo 7. Identificação de mutantes em Fad2 de arroz Produtos de PCR transpondo os sítios ativos (essencialmente

posições 330 até 1020 se o ATG de iniciação for tomado como o início da numeração em TIGR Loc_0s2g48560) de Fad2-1 (seqüência codificante correspondente a AP00 4047 em banco de dados NCBI, identificador de Io- cus TIGR L0c_0s02g48560) serão produzidos a partir de DNA de arroz ex- traído de um grande número de diferentes acessos de arroz. O tamanho dos produtos serão de até 800 pb dependendo dos iniciadores usados. Dois gru- pos de pares de iniciadores sobrepostos podem precisar ser usados. Um possível grupo de iniciadores é: GrupoA

GTGCCGGCGGCAGGATGACGG (SEQ ID N0:60)

(posições 5-20 no alinhamento mostrado na Figura 10)

GCCGACGATGTCGTCGAGCAC (SEQ ID NO:61)

(complemento reverso de posições 379-398 no alinhamento mostrado na Figura 10) Grupo B

TGCCTTCTCCGACTACTCGG (SEQ ID NO:62)

(posições 360-379 na Figura 10)

CCTCGCGCCATGTCGCCTTGG (SEQ ID NO:63)

(complemento reverso de posições 1099-1118 na Figura 10).

Os produtos ligados serão então submetidos a fusão em um ins- trumento Rotorgene 6000 (Corbett Life Science) ou um instrumento compa- rável onde diferenças em fusão de heterodúplexes possa ser sensivelmente detectadas por meio da alteração de fluorescência de um corante Verde LC. Centenas e possivelmente milhares de linhagens de arroz podem ser tríadas diariamente por esta técnica.

Os produtos de PCR de amostras mostrando um perfil térmico alterado serão sequenciados e as mutações em Fad2 identificadas. Muta- ções selecionadas que inativam Fad2 podem então ser cruzadas em linha- gens de arroz de elite para produzir linhagens de arroz com atividade de Fad2 reduzida e portanto, alto ácido oleico. Se duas ou todas as isoformas de Fad2 precisam ser eliminadas então isto pode ser obtido pela identifica- ção de linhagens com as mutações requeridas em diferentes isoformas e combinação das mutações em uma linhagem de arroz de elite através de reprodução assistida por marcador. Pelo menos o gene Fad2-1 precisa estar inativo para aumentos consideráveis em conteúdo de ácido oleico ou conte- údo de ácido Iinoleico diminuído. Inativação de um ou mais dos genes Fad2 adicionais irá aumentar adicionalmente conteúdo de ácido oleico e diminuir conteúdo de ácido linoleico. Mutantes que têm mutações em genes Fad2 adicionais podem ser identificados da mesma maneira como para Fad2-1, usando iniciadores específicos para os genes de Fad adicionais. Exemplo 8. Análise de estabilidade - detecção de produção de hexanal em estocagem

Experimentos estão em andamento com FSA1 Weribee para de- tectar a produção de hexanal em estocagem em arroz selvagem. Isto envol- ve GC usando um amostrador para detectar os voláteis na "headspace" do grão estocada em alta temperatura (40°C). Uma vez que o sistema seja oti- mizado (e além disso, há quantidade suficiente de grão) nós iremos empre- ender uma comparação da produção de voláteis, particularmente hexanal, na estocagem de linhagens de arroz selvagem e de RNAi de Fad2i e RNAi de FatB e combinações adequadas de genótipos. Isto é um assunto de qua- Iidade importante na indústria de arroz para estocagem de grão e também de estocagem de farelo. A produção e detecção de outros voláteis, que po- deriam ter uma função afetando a qualidade do grão, também está sendo investigada, tanto com FSA, Werribee como CSIRO Entomology.

Por volta de 10g de arroz marrom bruto é necessário para análi- se de "headspace". O arroz marrom é estocado a 4°C (controle) e 35°C por 8 semanas. A amostra gasosa liberada de arroz marrom pode ser obtida na "headspace" de um frasco por aquecimento a 80°C ou por difusão natural. Os componentes voláteis na "headspace" podem então ser analisados por injeção direta em uma máquina GC ou GC-MS e análise dos perfis cromato- gráficos gasosos (Suzuki etal., 1999). Outro método para análise de voláteis na "headspace" é através de aprisionamento de voláteis em uma matriz a- dequada (por exemplo, 250mg de Tenax GR) como descrito por Nielsen et a!., (2004) usando nitrogênio como um gás purgante. A dessorção dos com- postos de aroma é então feita termicamente e as moléculas capturadas são analisadas por GC e identificadas usando padrões.

A expectativa de que estocagem de arroz seria melhorada em linhagens de arroz com baixo ácido Iinoleico é baseada em várias observa- ções. Suzuki et aí., (1999) apresentaram dados de que a quantidade de áci- do Iinoleico livre aumenta durante a estocagem e que a quantidade de aldeí- dos voláteis tais como pentanal, hexanal e pentanol aumenta três vezes a 35C. A correlação de hexanal e aldeídos voláteis com odor foi notada por outros autores igualmente. Por outro lado, Zhou et ai, (2002) encontraram uma redução de ácido Iinoleico total na estocagem e relacionaram isto à de- composição de ácido Iinoleico em outros produtos, incluindo voláteis respon- sáveis por odores estranhos. As diferenças nos resultados podem ser devi- das às diferenças nos métodos de extração e analíticos. A produção de hexanal por ácido Iinoleico in vitro foi demonstra-

da por Nielsen etal., (2004).

Será apreciado por pessoas versadas na técnica que numerosas variações e/ou modificações podem ser feitas à invenção como mostrado nas modalidades específicas sem divergir do espírito ou âmbito da invenção como amplamente descrito. As presentes modalidades são, portanto, para serem consideradas em todos as considerações como ilustrativas e não res- tritivas.

Todas as publicações discutidas e/ou referenciadas aqui são incorporadas aqui em sua totalidade. Este relatório descritivo reivindica prioridade de AU 2006903810,

os conteúdos inteiros do qual são incorporados aqui como referência.

Qualquer discussão de documentos, atos, materiais, dispositi- vos, artigos ou similares que tenha sido incluída no presente relatório descri- tivo é apenas para a finalidade de prover um contexto para a presente in- venção. Não é para ser tomada como uma admissão de que qualquer uma ou todas essas questões formam parte da base de técnica anterior ou eram conhecimento geral comum no campo relevante da presente invenção como existiu antes da data de prioridade de cada reivindicação deste relatório des- critivo.

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Claims

1. Óleo de arroz que tem uma composição de ácido graxo com- preendendo mais de cerca de 48% de ácido oleico, menos de cerca de 17% de ácido palmítico, menos de cerca de 30% de ácido Iinoleico e/ou qualquer combinação destes.

2. Óleo de arroz de acordo com a reivindicação 1, em que a ra- zão de ácido oleico para ácido Iinoleico é maior que 1,5:1.

3. Óleo de arroz de acordo com a reivindicação 1 ou reivindica- ção 2, que tem uma composição de ácido graxo compreendendo mais de cerca de 48% de ácido oleico, menos de cerca de 17% de ácido palmítico e menos de cerca de 30% de ácido linoleico.

4. Óleo de arroz de acordo com qualquer uma das reivindica- ções de 1 até 3, que tem uma composição de ácido graxo compreendendo mais de cerca de 60% de ácido oleico.

5. Óleo de arroz de acordo com qualquer uma das reivindica- ções de 1 até 4, que tem uma composição de ácido graxo compreendendo menos de cerca de 12% de ácido palmítico.

6. Óleo de arroz de acordo com qualquer uma das reivindica- ções de 1 até 5, que tem uma composição de ácido graxo compreendendo menos de cerca de 15% de ácido linoleico.

7. Farelo de arroz que tem uma composição de ácido graxo compreendendo mais de cerca de 48% de ácido oleico, menos de cerca de 17% de ácido palmítico, menos de cerca de 30% de ácido linoleico e/ou qualquer combinação destes.

8. Farelo de arroz de acordo com a reivindicação 7, em que a razão de ácido oleico para ácido linoleico é maior que 1,5:1.

9. Farelo de arroz de acordo com a reivindicação 7 ou reivindi- cação 8, que tem uma composição de ácido graxo compreendendo mais de cerca de 48% de ácido oleico, menos de cerca de 17% de ácido palmítico e menos de cerca de 30% de ácido linoleico.

10. Farelo de arroz de acordo com qualquer uma das reivindica- ções de 7 até 9, que tem uma composição de ácido graxo compreendendo mais de cerca de 60% de ácido oleico.

11. Farelo de arroz de acordo com qualquer uma das reivindica- ções de 7 até 10, que tem uma composição de ácido graxo compreendendo menos de cerca de 12% de ácido palmítico.

12. Farelo de arroz de acordo com qualquer uma das reivindica- ções de 7 até 11, que tem uma composição de ácido graxo compreendendo menos de cerca de 15% de ácido linoleico.

13. Semente de arroz que tem uma composição de ácido graxo compreendendo mais de cerca de 48% de ácido oleico, menos de cerca de 17% de ácido palmítico, menos de cerca de 30% de ácido linoleico e/ou qualquer combinação destes.

14. Semente de arroz de acordo com a reivindicação 13, em que a razão de ácido oleico para ácido linoleico é maior que 1,5:1.

15. Semente de arroz de acordo com a reivindicação 13 ou rei- vindicação 14, que tem uma composição de ácido graxo compreendendo mais de cerca de 48% de ácido oleico, menos de cerca de 17% de ácido palmítico e menos de cerca de 30% de ácido linoleico.

16. Semente de arroz de acordo com qualquer uma das reivindi- cações de 13 até 15, que tem uma composição de ácido graxo compreen- dendo mais de cerca de 60% de ácido oleico.

17. Semente de arroz de acordo com qualquer uma das reivindi- cações de 13 até 16, que tem uma composição de ácido graxo compreen- dendo menos de cerca de 12% de ácido palmítico.

18. Semente de arroz de acordo com qualquer uma das reivindi- cações de 13 até 17, que tem uma composição de ácido graxo compreen- dendo menos de cerca de 15% de ácido linoleico.

19. Planta de arroz que produz óleo de arroz de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 até 6.

20. Planta de arroz que produz farelo de arroz de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 até 12.

21. Planta de arroz que produz semente de arroz de acordo com qualquer uma das reivindicações de 13 até 18.

22. Polinucleotídeo isolado que, quando presente em uma célula de uma planta de arroz, infrarregula o nível de atividade de um polipeptídio de Fad2 e/ou FatB na célula quando comparada a uma célula que não pos- sui o citado polinucleotídeo.

23. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 22, que está operacionalmente ligado a um promotor capaz de direcionar a expressão do polinucleotídeo em uma célula de uma planta de arroz.

24. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 22 ou reivin- dicação 23, que infrarregula níveis de RNAm expressos a partir de pelo me- nos um gene Fad2 e/ou FatB.

25. Polinucleotídeo de acordo com qualquer um das reivindica- ções de 22 até 24, em que o polinucleotídeo é selecionado de: um polinucle- otídeo antissentido, um polinucleotídeo em sentido, um polinucleotídeo cata- lítico, um microRNA, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídio que se liga a um polipeptídio de Fad2 e/ou FatB e um RNA de filamento duplo.

26. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 25, que é um polinucleotídeo antissentido que se hibridiza sob condições fisiológicas a um polinucleotídeo compreendendo qualquer uma ou mais das seqüências de nucleotídeos providas como SEQ ID Nos 5 até 8, 11 até 14 ou 19 até 25.

27. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 25, que é um polinucleotídeo catalítico capaz de clivar um polinucleotídeo compreendendo qualquer uma ou mais das seqüências de nucleotídeos providas como SEQ ID Nos 5 até 8, 11 até 14 ou 19 até 25.

28. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 27, que é uma ribozima.

29. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 25, que é uma molécula de RNA de filamento duplo (dsRNA) compreendendo um oli- gonucleotídeo que compreende pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de qualquer uma ou mais das seqüências de nucleotídeos providas como SEQ ID Nos 5 até 8, 11 até 14 ou 19 até 25, em que a porção da molécula que é de filamento duplo tem pelo menos 19 pares de base de comprimento e compreende o citado oligonucleotídeo.

30. Molécula de dsRNA de acordo com a reivindicação 29, que é expressa a partir de um único promotor em que os filamentos da porção de filamento duplo estão ligados por uma porção de filamento simples.

31. Método para identificar um polinucleotídeo que, quando pre- sente em uma célula de uma planta de arroz, infrarregula o nível de ativida- de de um polipeptídio de Fad2 e/ou FatB na célula quando comparada a uma célula que não possui o citado polinucleotídeo, o método compreen- dendo i) determinar a habilidade de um polinucleotídeo candidato em infrarregular o nível de atividade de um polipeptídio de Fad2 e/ou FatB em uma célula e ii) selecionar um polinucleotídeo que infrarregule o nível de ativi- dade de um polipeptídio de Fad2 e/ou FatB na célula.

32. Método de acordo com a reivindicação 31, em que o polinu- cleotídeo é selecionado de: um polinucleotídeo antissentido, um polinucleo- tídeo em sentido, um polinucleotídeo catalítico, um microRNA, um polinucle- otídeo que codifica um polipeptídio que se liga a um polipeptídio de Fad2 e/ou FatB e um RNA de filamento duplo.

33. Método de acordo com a reivindicação 32, em que o polinu- cleotídeo é um polinucleotídeo antissentido que se hibridiza sob condições fisiológicas a um polinucleotídeo compreendendo qualquer uma ou mais das seqüências de nucleotídeos providas como SEQ ID Nos 5 até 8, 11 até 14 ou 19 até 25.

34. Método de acordo com a reivindicação 32, em que o polinu- cleotídeo é um polinucleotídeo catalítico capaz de clivar um polinucleotídeo compreendendo qualquer uma ou mais das seqüências de nucleotídeos pro- vidas como SEQ ID Nos 5 até 8, 11 até 14 ou 19 até 25.

35. Método de acordo com a reivindicação 32, em que o polinu- cleotídeo é uma molécula de RNA de filamento duplo (dsRNA) compreen- dendo um oligonucleotídeo que compreende pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de qualquer uma ou mais das seqüências de nucleotídeos provi- das como SEQ ID Nos 5 até 8, 11 até 14 ou 19 até 25, em que a porção da molécula que é de filamento duplo tem pelo menos 19 pares de base de comprimento e compreende o citado oligonucleotídeo.

36. Polinucleotídeo isolado identificado usando um método como definido em qualquer uma das reivindicações de 31 até 35.

37. Vetor compreendendo ou codificando o polinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações de 22 até 30 ou 36.

38. Vetor de acordo com a reivindicação 37, em que o polinucle- otídeo, ou seqüência codificando o polinucleotídeo, está operacionalmente ligada a um promotor.

39. Vetor de acordo com a reivindicação 37 ou reivindicação 38, em que o promotor confere expressão do polinucleotídeo preferencialmente no embrião, endosperma, camada do farelo e/ou semente de uma planta de arroz em relação a pelo menos um outro tecido ou órgão da citada planta.

40. Célula compreendendo o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações de 37 até 39 e/ou o polinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 22 até 30 ou 36.

41. Célula de acordo com a reivindicação 40, em que o polinu- cleotídeo ou vetor foi introduzido na célula ou em um progenitor da célula.

42. Célula de acordo com a reivindicação 40 ou reivindicação 41, que é uma célula de arroz ou uma célula de Agrobacterium.

43. Célula como definido em qualquer uma das reivindicações 40 até 42, em que o polinucleotídeo está integrado ao genoma da célula.

44. Planta de arroz compreendendo uma célula como definido em qualquer uma das reivindicações de 40 até 43.

45. Método para produzir a célula como definido em qualquer uma das reivindicações de 40 até 43, o método compreendendo a etapa de introduzir o polinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindica- ções de 22 até 30 ou 36, ou um vetor como definido em qualquer uma das reivindicações de 37 até 39 em uma célula.

46. Método de acordo com a reivindicação 45, compreendendo adicionalmente a etapa de regenerar uma planta transgênica a partir da célu- la.

47. Uso do polinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações de 22 até 30 ou 36, ou de um vetor como definido em qual- quer uma das reivindicações de 37 até 39 para produzir uma célula recombi- nante.

48. Planta de arroz modificada geneticamente, em que a planta tem expressão diminuída de um polipeptídio que tem atividade de Fad2 e/ou FatB em relação a uma planta não-modificada correspondente.

49. Planta de acordo com a reivindicação 48, a planta tendo sido transformada tal que ela compreenda um polinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações de 22 até 30 ou 36, ou uma planta da pro- gênie desta que compreenda o citado polinucleotídeo.

50. Método para produzir óleo de arroz como definido em qual- quer uma das reivindicações de 1 até 6, farelo de arroz como definido em qualquer uma das reivindicações de 7 até 12 e/ou semente de arroz como definido em qualquer uma das reivindicações de 13 até 18, o método com- preendendo expor uma planta de arroz a um antagonista de um polipeptídio de Fad2 e/ou FatB.

51. Método para obter uma planta de arroz modificada geneti- camente que possa ser usada para produzir semente de arroz marrom com uma vida de estocagem aumentada quando comparada a uma semente de arroz marrom não-modificada, o método compreendendo manipular geneti- camente a planta tal que a atividade e/ou nível de produção de um polipeptí- dio de Fad2 e/ou FatB seja reduzido na semente de arroz quando compara- da a uma planta correspondente que produz semente de arroz marrom não- modificada.

52. Método de acordo com a reivindicação 51, em que a ativida- de e/ou nível de produção de um polipeptídio de Fad2 e/ou FatB esteja re- duzido apenas na semente da planta.

53. Método de acordo com a reivindicação 51 ou reivindicação 52, em que a atividade e/ou nível de produção de um polipeptídio de Fad2 esteja reduzido.

54. Método como definido em qualquer uma das reivindicações de 51 até 53, em que a planta transgênica compreende um polinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações de 22 até 30 ou 36, ou um vetor como definido em qualquer uma das reivindicações de 37 até 39.

55. Planta de arroz modificada geneticamente produzida usando um método como definido em qualquer uma das reivindicações de 51 até 54, ou progênie desta.

56. Método para selecionar uma planta de arroz que possa ser usada para produzir óleo de arroz como definido em qualquer uma das rei- vindicações de 1 até 6, farelo de arroz como definido em qualquer uma das reivindicações de 7 até 12 e/ou semente de arroz como definido em qualquer uma das reivindicações de 13 até 18, o método compreendendo; i) triar uma população mutagênica de sementes de arroz ou plantas de arroz e ii) selecionar uma semente ou planta que seja capaz de produzir óleo de arroz como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 até 6, farelo de arroz como definido em qualquer uma das reivindicações de 7 até e/ou semente de arroz como definido em qualquer uma das reivindica- ções de 13 até 18.

57. Método de acordo com a reivindicação 56, em que a etapa i) compreende analisar uma semente e/ou planta mutagênica por um polipep- tídio que tenha atividade de Fad2 e/ou FatB.

58. Método de acordo com a reivindicação 56 ou reivindicação 57, em que a etapa i) compreende analisar a seqüência e/ou níveis de ex- pressão de um gene Fad2 e/ou FatB da semente e/ou planta mutagênica.

59. Método como definido em qualquer uma das reivindicações de 56 até 58, em que a etapa i) compreende analisar a composição de ácido graxo do óleo, farelo e/ou semente da semente e/ou planta mutagênica.

60. Método para selecionar uma planta de arroz que possa ser usada para produzir óleo de arroz como definido em qualquer uma das rei- vindicações de 1 até 6, farelo de arroz como definido em qualquer uma das reivindicações de 7 até 12 e/ou semente de arroz como definido em qualquer uma das reivindicações de 13 até 18, o método compreendendo; i) analisar o conteúdo de ácido graxo dos citados óleo de arroz, farelo de arroz e/ou semente obtidos de uma planta de arroz candidata e ii) selecionar uma planta de arroz que possa ser usada para pro- duzir óleo de arroz como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 até 6, farelo de arroz como definido em qualquer uma das reivindicações de 7 até 12 e/ou semente de arroz como definido em qualquer uma das reivin- dicações de 13 até 18.

61. Método para selecionar uma planta de arroz que possa ser usada para produzir óleo de arroz como definido em qualquer uma das rei- vindicações de 1 até 6, farelo de arroz como definido em qualquer uma das reivindicações de 7 até 12 e/ou semente de arroz como definido em qualquer uma das reivindicações de 13 até 18, o método compreendendo; i) analisar uma amostra de uma planta candidata por um polipep- tídio que tenha atividade de Fad2 e/ou FatBe ii) selecionar uma planta de arroz que possa ser usada para pro- duzir óleo de arroz como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 até 6, farelo de arroz como definido em qualquer uma das reivindicações de 7 até 12 e/ou semente de arroz como definido em qualquer uma das reivin- dicações de 13 até 18 com base na seqüência, nível de produção e/ou ativi- dade do citado polipeptídio.

62. Método para selecionar uma planta de arroz que possa ser usada para produzir óleo de arroz como definido em qualquer uma das rei- vindicações de 1 até 6, farelo de arroz como definido em qualquer uma das reivindicações de 7 até 12 e/ou semente de arroz como definido em qualquer uma das reivindicações de 13 até 18, o método compreendendo; i) analisar a seqüência e/ou níveis de expressão de um gene Fad2 e/ou FatB de uma planta candidata e ii) selecionar uma planta de arroz que possa ser usada para pro- duzir óleo de arroz como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 até 6, farelo de arroz como definido em qualquer uma das reivindicações de 7 até 12 e/ou semente de arroz como definido em qualquer uma das reivin- dicações de 13 até 18 com base na seqüência e/ou níveis de produção do citado gene.

63. Método para identificar uma planta de arroz que possa ser usada para produzir óleo de arroz como definido em qualquer uma das rei- vindicações de 1 até 6, farelo de arroz como definido em qualquer uma das reivindicações de 7 até 12 e/ou semente de arroz como definido em qualquer uma das reivindicações de 13 até 18, o método compreendendo detectar uma molécula de ácido nucleico da planta, em que a molécula de ácido nu- cleico está ligada a e/ou compreende pelo menos uma parte de, um gene Fad2 e/ou gene FatB na planta.

64. Método para identificar uma planta de arroz que possa ser usada para produzir semente de arroz marrom com uma vida de estocagem aumentada, o método compreendendo detectar uma molécula de ácido nu- cleico da planta, em que a molécula de ácido nucleico está ligada a e/ou compreende pelo menos uma parte de, um gene Fad2 e/ou gene FatB na planta.

65. Método de acordo com a reivindicação 63 ou reivindicação 64, que compreende: v) hibridizar uma segunda molécula de ácido nucleico à citada molécula de ácido nucleico que é obtida a partir da citada planta, vi) hibridizar opcionalmente pelo menos uma outra molécula de ácido nucleico à citada molécula de ácido nucleico que é obtida a partir da citada planta e vii) detectar um produto da(s) citada(s) etapa(s) de hibridização ou a ausência de um produto da(s) citada(s) etapa(s) de hibridização.

66. Método de acordo com a reivindicação 65, em que a segun- da molécula de ácido nucleico é usada como um iniciador para transcrever reversamente ou replicar pelo menos uma porção da molécula de ácido nu- cleico.

67. Método como definido em qualquer uma das reivindicações de 63 até 67, em que o ácido nucleico é detectado usando uma técnica sele- cionada do grupo que consiste em: análise de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição, análise de polimorfismo de comprimento de frag- mento de amplificação, amplificação de microssatélites e/ou sequenciamento de ácido nucleico.

68. Método como definido em qualquer uma das reivindicações de 63 até 67, que compreende amplificação de ácido nucleico.

69. Método como definido em qualquer uma das reivindicações de 63 até 68, em que o método analisa níveis de expressão do gene.

70. Método para obter uma semente ou planta de arroz, o méto- do compreendendo; i) cruzar uma primeira planta de arroz parental que compreende um alelo de Fad2 que confere uma proporção aumentada de ácido oleico no óleo do grão da planta com uma segunda planta de arroz parental que com- preende um alelo de FatB que confere uma proporção diminuída de ácido palmítico no óleo do grão da planta; ii) triar plantas da progênie ou grãos do cruzamento por presen- ça de ambos os alelos e viii) selecionar uma planta ou grão da progênie compreendendo ambos os alelos e tendo uma proporção aumentada de ácido oleico e uma proporção diminuída de ácido palmítico no óleo do grão da planta.

71. Método para introduzir um alelo Fad2 em uma planta de ar- roz, o método compreendendo i) cruzar uma primeira planta de arroz parental com uma segun- da planta de arroz parental, em que a segunda planta compreende o citado alelo e ii) cruzar de novo a progênie do cruzamento da etapa i) com plantas do mesmo genótipo da primeira planta parental por um número sufi- ciente de vezes para produzir uma planta com a maior parte do genótipo do primeiro genitor, mas compreendendo o citado alelo iii) selecionar uma planta com a maior parte do genótipo da pri- meira planta e compreendendo o citado alelo; em que o citado alelo confere uma proporção aumentada de áci- do oleico no óleo, farelo e/ou semente da planta.

72. Método para introduzir um alelo FatB em uma planta de ar- roz, o método compreendendo i) cruzar uma primeira planta de arroz parental com uma segun- da planta de arroz parental, em que a segunda planta compreende o citado alelo e ii) cruzar de novo a progênie do cruzamento da etapa i) com plantas do mesmo genótipo da primeira planta parental por um número sufi- ciente de vezes para produzir uma planta com a maior parte do genótipo do primeiro genitor, mas compreendendo o citado alelo iii) selecionar uma planta com a maior parte do genótipo da pri- meira planta e compreendendo o citado alelo; em que o citado alelo confere uma proporção diminuída de ácido palmítico no óleo, farelo e/ou semente da planta.

73. Método para aumentar a proporção de ácido oleico no óleo, farelo e/ou semente de uma planta de arroz, o método compreendendo ma- nipular geneticamente a citada planta tal que a produção de um polipeptídio Fad2 seja diminuída quando comparada a uma planta selvagem, em que o polipeptídio tenha atividade de Δ12 desaturase.

74. Método para diminuir a proporção de ácido palmítico no óleo, farelo e/ou semente de uma planta de arroz, o método compreendendo ma- nipular geneticamente a citada planta tal que a produção de um polipeptídio FatB seja diminuída quando comparada a uma planta selvagem, em que o polipeptídio tenha atividade de FatB.

75. Planta de arroz obtida usando um método como definido em qualquer uma das reivindicações de 56 até 74, ou planta da progênie desta.

76. Óleo de arroz obtido a partir de uma planta como definido em qualquer uma das reivindicações 44, 48, 49, 55 ou 75.

77. Farelo de arroz obtido a partir de uma planta como definido em qualquer uma das reivindicações 44, 48, 49, 55 ou 75.

78. Semente de arroz obtida a partir de uma planta como defini- do em qualquer uma das reivindicações 44, 48, 49, 55 ou 75.

79. Método para produzir semente, o método compreendendo; a) cultivar uma planta como definido em qualquer uma das rei- vindicações de 19 até 21, 44, 48, 49, 55 ou 76 e b) colher a semente.

80. Produto alimentício compreendendo óleo de arroz como de- finido em qualquer uma das reivindicações de 1 até 6 ou 76, farelo de arroz como definido em qualquer uma das reivindicações de 7 até 12 ou 77 e/ou semente de arroz como definido em qualquer uma das reivindicações de 13 até 18 ou 78.

81. Método para preparar alimentos, o método compreendendo cozinhar uma substância comestível em óleo de arroz como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 até 6 ou 76.