ES2610482T3

ES2610482T3 - Genes de la diacilglicerol aciltransferasa 2 y proteínas codificadas por los mismos procedentes de algas

Info

Publication number: ES2610482T3
Application number: ES08868776.9T
Authority: ES
Inventors: Jitao Zou; Jingyu Xu; Zhifu Zheng
Original assignee: National Research Council of Canada; Dow AgroSciences LLC
Current assignee: National Research Council of Canada; Corteva Agriscience LLC
Priority date: 2007-12-21
Filing date: 2008-12-16
Publication date: 2017-04-27
Anticipated expiration: 2028-12-16
Also published as: WO2009085169A2; CA2709067A1; US8993034B2; US20110061130A1; JP5554246B2; JP2011507513A; EP2234474A2; EP3146836A1; US8658855B2; EP2234474B1; US20140330003A1; EP2234474A4; WO2009085169A3; CN101951755A

Abstract

Un polipéptido aislado o purificado que comprende una secuencia que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 15, en donde el polipéptido tiene actividad diacilglicerol aciltransferasa.

Description

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B. Polipéptidos homólogos al DGAT2 de T. pseudonana con actividad diacilglicerol transferasa tipo 2

Se pueden encontrar proteínas que son homologas a la secuencia completa de DGAT2 de T. pseudonana mediante la búsqueda en bases de datos de proteínas, tales como la base de datos de proteínas NCBI, con motores de búsqueda, tales como BLAST. También se pueden identificar mediante diseño racional. El proceso de diseño racional puede comprender identificar sustituciones conservadoras de aminoácidos dentro de la longitud de la secuencia de polipéptido deseada, y hacer esas sustituciones en la proteína codificada.

La búsqueda con la secuencia completa de aminoácidos de DGAT2 de T. pseudonana en la base de datos de proteínas NCBI (BLASTP) revela polipéptidos con una homología de secuencia significativa a TpDGAT2, varios de los cuales se muestran alineados con TpDGAT2 en la FIG. 2. El dominio conservado diacilglicerol transferasa tipo 2 se alinea en la FIG. 2, y consiste en los residuos de aminoácidos 236 – 365 en TpDGAT2 y los residuos correspondientes de los otros polipéptidos DGAT2 representados. El domino conservado diacilglicerol transferasa tipo 2 se describe dentro de la base de datos de dominios conservados de NCBI ncbi(PUNTO)nlm(PUNTO)nih(PUNTO)gov/Structure/cdd/wrpsb(PUNTO)cgi. Las secuencias de polipéptidos que son homólogas a este dominio conservado confieren a las proteínas que las contienen la actividad de diacilglicerol de tipo 2 de TpDGAT2.

Los expertos corrientes en la técnica entienden que los polipéptidos con secuencias homólogas se pueden diseñar para exhibir la misma estructura y funciones que sus homólogos. El experto en la técnica está capacitado para diseñar polipéptidos homólogos a aquellos descritos específicamente en los ejemplos de esta descripción mediante el alineamiento de secuencias de la FIG. 2. Tales polipéptidos homólogos pueden ser aquellos que contienen sustituciones conservadoras con polipéptidos de la presente descripción, por ejemplo los polipéptidos de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, o SEQ ID NO: 19. Aquellos que son expertos en la técnica conocen ensayos experimentales simples que determinan qué proteínas homólogas exhiben actividad diacilglicerol transferasa de tipo 2 sustancialmente similar a TpDGAT2. Tales ensayos no son excesivamente costosos en tiempo, caros, o difíciles técnicamente. Por ejemplo, se puede utilizar cromatografía de gases convencional para detectar TAG producido por TpDGAT2. Se describen varios de estos ensayos en los ejemplos detallados más adelante.

C. Uso de moléculas de ácido nucleico para transformar con actividad DGAT2

Se debe entender que las realizaciones descritas no incluyen las secuencias genómicas de nucleótidos tomadas en su ambiente natural; esto quiere decir, en el genoma natural de T. pseudonana, Chlamydomonas reinhardtii, Ostreococcus lucimarinus, Ostreococcus tauri, o Phaeodactylum tricornutum. Algunas realizaciones se refieren a secuencias que ha sido posible aislar, purificar o purificar parcialmente, a partir de métodos de separación tales como, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, mediante exclusión basada en tamaño molecular, o mediante afinidad, o alternativamente técnicas de fraccionamiento basadas en la solubilidad en diferentes disolventes, o a partir de métodos de ingeniería genética tales como amplificación, clonar, y subclonar, siendo posible que vectores porten las secuencias..

Se incluyen además moléculas de ácidos nucleicos que hibridan con las secuencias anteriormente descritas. Las condiciones de hibridación pueden ser estrictas en las que la hibridación ocurrirá si hay al menos 90%, 95% o 97% de identidad con las moléculas de ácido nucleico que codifican las moléculas de DGAT2 descritas. Las condiciones estrictas pueden incluir aquellas utilizadas para las hibridaciones Southern conocidas, tales como, por ejemplo, incubación durante la noche a 42ºC en una disolución que tiene un 50% de formamida, 5 x SSC (150 mM de NaCl, 15 mM de citrato de trisodio), 50 mM de fosfato de sodio (pH 7,6), 5 x de solución de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano, y 20 microgramos/mililitro de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y triturado, seguida de un lavado del soporte de la hibridación en 0,1 x SSC a aproximadamente 65ºC. Se conocen bien otras condiciones conocidas de hibridación y se describen en Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera edición, Cold Sring Harbor, N.Y. (2001).

El aislamiento y clonaje de ADN está bien establecido. De manera similar, mediante técnicas convencionales se puede insertar ADN que codifica una enzima aislada en un vector y transformar células de levadura. Sin embargo, como no se ha clonado ningún gen DGAT2 que pueda utilizar eficientemente VLCPUFA, no ha sido posible abordar la posibilidad de modificaciones genéticas mediante la modulación de la actividad DGAT2. Nosotros confirmamos que la DGAT2 está involucrada en la síntesis de TAG y que utiliza VLCPUFA más eficientemente que DGAT.

Moléculas de ácido nucleico que codifican para DGAT2, por ejemplo secuencias que tienen al menos 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, o SEQ ID NO: 61, se pueden transformar en un organismo, por ejemplo una planta. Tales secuencias homólogas se ejemplifican mediante las SEQ ID NOS: 21 – 24. Tal y como se conoce en la técnica, hay varias maneras mediante las cuales se pueden introducir genes y construcciones de genes en organismos, por ejemplo plantas, y se han integrado con éxito una combinación de técnicas de transformación y cultivo de tejido en estrategias efectivas para crear organismos transgénicos, por ejemplo, plantas de cultivo. Se han descrito estos

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transformantes inducidas por GAL mediante centrifugación a 5.000 rpm durante 5 min. y se resuspendieron en 100 mM Hepes NaOH, pH 7,4, que contenía 1 mM EDTA y 1 mM DTT.

En referencia a la FIG. 9, no se produjo TAG en el vector vacío, control negativo (carril 8), mientras que el control positivo (carril 1) mostró una banda de TAG. Cada uno de los vectores que contenían DGAT2 (carriles 2 -6) mostró una banda de TAG que confirmó que DGAT2 tiene la capacidad de sintetizar TAG. El carril a la derecha del carril 8 se cargó con un estándar de TAG que se utilizó como un marcador de TAG.

Ejemplo 3: Preferencia de sustrato de la DGAT2

Se prepararon lisados de células utilizando bolas de cristal lavadas con ácido como se describe en Ausubel, et al., (1995). Se midió la proteína en los lisados de levadura utilizando el ensayo de Bradford (1976), se normalizaron los niveles de proteína en cada lisado y se realizaron ensayos de actividad de DGAT2 de alícuotas (250 µg de proteína).

Los ensayos de DGAT se llevaron a cabo a pH 7,4, con agitación a 100 rev/min en un baño de agua a 30ºC durante 10 min. Las mezclas de ensayo (0,5 ml de volumen final) contenían 100 µg de lisado de proteína, 90 mM de HEPES-NaOH, 200 µM de sn-1,2 dioleína, y 18 µM de 14C Acil-CoAs (actividad específica 2 nCi/nmol) como el donante de acil. Los TAGs marcados con 14C se aislaron mediante TLC en placas de gel G de sílice desarrolladas en hexano:dietiléter:ácido acético (70:30:1 v/v/v), las bandas de TAG radiomarcado se visualizaron en un escáner de radio-TLC Bioscan AR-2000 utilizando el programa Win-Scan 2D® (Bioscan Inc., Washington D.C., EE.UU.) y las bandas se rascaron y cuantificaron como se describe en Taylor, et al. (1991).

Ejemplo 4: Composición de ácidos grasos de los transformantes TpDGAT2

Se transformó la cepa H1246 MAT – α de S. cerevisiae con A. thaliana/pYES2.1 o T. pseudonana/pYES2.1. Los transformantes se hicieron crecer durante 3 días a 28ºC y se indujeron mediante galactosa. Los transformantes se trataron o con nada (control), o con 50 µM DHA o con 150 µM DHA. El perfil de ácidos grasos en base al análisis de cromatografía de gas convencional de tres transformantes que contienen AtDGAT1/pYES2.1 y tres transformantes que contienen TpDGAT2/pYES2.1 se muestran en la Tabla 1.

Los ácidos grasos se identificaron como 16:0, 16:1, 18:0, 18:1 (ácido oleico), y 22:6 (DHA); y la composición de cada uno se presenta como un porcentaje del total de ácidos grasos. La expresión de DHA aumentó desde cero en la cepa control hasta 6,01% en la TpDGAT2/pYES2.1 de 150µM y fue más del doble que aquella de AtDGAT/pYES2.1 de 150 µM (Tabla 1). Estos resultados confirman además que TpDGAT2 utiliza ácidos grasos DHA más eficientemente que DGAT1.

En términos de composición de ácidos grasos, las líneas mutantes que contienen ADNc de DGAT2 mostraron una disminución en los saturados totales, y un aumento en los insaturados como se muestra en la Tabla 1. Dichos cambios van todos hacia un perfil de aceite “más saludable” y se pueden aplicar directamente a Canola, otras oleaginosas en las Brassicaceae y otros cultivos oleaginosos comestibles para producir mejoras similares en la composición de aceite.

Tabla1. Composición de ácidos grasos de TAG expresados mediante DGAT2 y DGAT1 en la levadura mutante H1246 MAT – α.

Composición de ácidos grasos

Tratamiento: % 16:0 % 16:1 % 18:0 % 18:1 %22:6 % Sat. % Insat.

AtDGAT/pYES2.1 – sin alimentación: 13,93 35,71 17,84 32,51 0,00 31,78 68,22

AtDGAT/pYES2.1 – 50 µM DHA: 19,68 27,54 16,51 34,82 1,46 36,18 62,36

AtDGAT/pYES2.1 – 150 µM DHA: 19,24 27,83 15,21 35,08 2,63 34,45 62,91

TpDGAT2/pYES2.1 – sin alimentación: 10,03 30,23 13,83 45,90 0,00 23,87 76,13

TpDGAT2/pYES2.1 – 50 µM DHA: 6,43 35,39 8,49 45,07 4,62 14,92 80,47

TpDGAT2/pYES2.1 – 150 µM DHA: 5,77 31,73 11,57 44,93 6,01 17,34 76,66

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hasta su uso para transformación, en donde se añade una alícuota de bacteria a 2 ml de Caldo de Cultivo de Infusión de Cerebro y Corazón (Difco, EE.UU.) que contiene un 2% de sacarosa, 50 µM de acetosiringona, pH 5,6 y se incuba durante la noche a 28ºC. La densidad de células bacterianas es aproximadamente 1x109 células por ml.

Se exponen explantes de cotiledón a Agrobacterium que contiene el vector de transformación de planta de acuerdo con el método de Moloney, et al. (1989), Plant Cell Rep 8:238 – 242. La superficie de corte del peciolo de los explantes se sumerge brevemente en el cultivo de bacterias. Los explantes se insertan en el medio de co-cultivo de modo que la superficie de corte está en contacto con el medio. Se colocan diez explantes en cada placa de Petri de 100 x 15 mm. Las placas de co-cultivo se sellan con plástico de envolver STRETCH’N SEALTM. Las placas se incuban durante tres días en una cámara de crecimiento con condiciones de temperatura y fotoperiodo, como anteriormente, respecto a la etapa de germinación de las semillas. Los explantes se transfieren entonces al medio de selección.

Tras 3 o 4 semanas en el medio de selección, los brotes verdes que se regeneran (transformantes putativos) se escinden y se transfieren a un medio de selección fresco para un crecimiento continuado. Cuando los brotes verdes consiguen una longitud de 1,5 – 2,0 cm se transfieren a un medio de enraizamiento. Los brotes transgénicos putativos se criban para detectar la expresión del gen gus esencialmente como describe Jefferson, R. A. (1987), Plant Mol. Biol. Rep. 5:387 – 405. La presencia de una mancha azul se considera como una prueba de la transformación.

La confirmación de la transformación se establece mediante selección con kanamicina, Southern blots, PCR (reacción en cadena de la polimerasa) y análisis de progenie.

Ejemplo 10: Selección de transformantes putativos (plantas transgénicas) y análisis de plantas transgénicas

Las semillas se recolectan en masa para cada construcción. Se esteriliza la superficie de las semillas sumergiéndolas en una disolución que contiene un 20% de lejía y 0,01% de Triton X-100 durante 20 minutos, seguido de tres lavados con agua estéril. Las semillas esterilizadas se cultivan en placas volviéndolas a suspender en fitoagar al 0,1% estéril a temperatura ambiente (alrededor de 1 ml de fitoagar por cada 500 – 1.000 semillas), y aplicando un volumen que contiene 2.000 – 4.000 semillas en una placa de selección con kanamicina de 150 x 15 mm. Las placas se incuban durante dos días en frío sin luz, y se hacen crecer durante siete a diez días en un ambiente controlado (22ºC bajo iluminación fluorescente (120 µE·m-2s-1) en un régimen de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad). El medio de selección contiene 1/2 de medio MSG, 0,8% de fitoagar, 3% de sacarosa, 50 µg/ml de kanamicina y 50 µg/ml de Timentin. Las placas de Petri y las tapas se sellan con un esparadrapo MicroporeTM (3M Canadá, London, ON, Canadá). Tras siete a diez días, las plantas resistentes a antibiótico que tienen hojas verdes y raíces bien consolidadas dentro del medio se identifican como transformantes, y en la etapa de tres a cinco hojas, los transformantes seleccionados se trasplantan en semilleros rellenos con una mezcla de tierra muy húmeda. Los transformantes se hacen crecer hasta la madurez y la semillas maduras (generación T2 tal y como se define en Katavic, et al. (1994)) de las plantas individuales se recolectan, y después se analizan.

Se aísla ADN genómico a partir de plantas individuales T1. Se realiza una amplificación por PCR para confirmar la presencia del ADNc o del gen, respectivamente, en los transformantes T1. Se realizan análisis Southern para seleccionar los transformantes que contienen una sola copia del fragmento insertado. Las muestras de ADN se digieren con enzimas de restricción, y se determinan mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%, y se realizan Southern blots utilizando un filtro de nailon (Hybond-N+, Ámsterdam). El fragmento de ADNc DGAT2, marcado con α-[32P] dCTP (NEN/DuPont), se utiliza como una sonda. La hibridación se realiza a 60ºC. El filtro se expone entonces a una película Kodak X-OMAT-AR.

Referencias

Ausubel F.M., R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith, y K. Stuhl, eds (1995). Current Protocols in Molecular Biology, Vols 1, 2, y 3. Wiley, New York.

Bechtold N., J. Ellis, y G. Pelletier (1993). In planta Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C.R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie/Life sciences 316:1194-1199.

Becker D., R. Brettschneider y H. Lorz (1994). Fertile transgenic wheat from microprojectile bombardment of scutellar tissue. Plant J. 5:299-307.

Bradford M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72:248-254.

Budziszewski G.J., K.P.C. Croft, y D.F. Hildebrand (1996). Uses of biotechnology in modifying plant lipids. Lipids 31:557-569.

Datla R., J.W. Anderson, y G. Selvaraj (1997). Plant promoters for transgene expression. Biotechnology Annual Review 3:269-296.

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Claims

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