ES2659526T3 - Genes y proteínas para la síntesis de alcanoil-CoA - Google Patents
Genes y proteínas para la síntesis de alcanoil-CoA Download PDFInfo
- Publication number
- ES2659526T3 ES2659526T3 ES12811112.7T ES12811112T ES2659526T3 ES 2659526 T3 ES2659526 T3 ES 2659526T3 ES 12811112 T ES12811112 T ES 12811112T ES 2659526 T3 ES2659526 T3 ES 2659526T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- nucleic acid
- cell
- organism
- acid molecule
- tissue
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 85
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims description 49
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims description 33
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title description 17
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 81
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 77
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 77
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 42
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 42
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 35
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 35
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 28
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 59
- 229930003827 cannabinoid Natural products 0.000 claims description 58
- 239000003557 cannabinoid Substances 0.000 claims description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 52
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 47
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 41
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 41
- OEXFMSFODMQEPE-HDRQGHTBSA-N hexanoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCCCC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 OEXFMSFODMQEPE-HDRQGHTBSA-N 0.000 claims description 31
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 28
- SXFKFRRXJUJGSS-UHFFFAOYSA-N olivetolic acid Chemical compound CCCCCC1=CC(O)=CC(O)=C1C(O)=O SXFKFRRXJUJGSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 229940065144 cannabinoids Drugs 0.000 claims description 23
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 22
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 18
- 101001120927 Cannabis sativa 3,5,7-trioxododecanoyl-CoA synthase Proteins 0.000 claims description 16
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 15
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 15
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 claims description 15
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 14
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 12
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 10
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 9
- UCONUSSAWGCZMV-UHFFFAOYSA-N Tetrahydro-cannabinol-carbonsaeure Natural products O1C(C)(C)C2CCC(C)=CC2C2=C1C=C(CCCCC)C(C(O)=O)=C2O UCONUSSAWGCZMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 7
- 229930001119 polyketide Natural products 0.000 claims description 7
- 108010075293 Cannabidiolic acid synthase Proteins 0.000 claims description 6
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 claims description 6
- CYQFCXCEBYINGO-UHFFFAOYSA-N THC Natural products C1=C(C)CCC2C(C)(C)OC3=CC(CCCCC)=CC(O)=C3C21 CYQFCXCEBYINGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- CYQFCXCEBYINGO-IAGOWNOFSA-N delta1-THC Chemical compound C1=C(C)CC[C@H]2C(C)(C)OC3=CC(CCCCC)=CC(O)=C3[C@@H]21 CYQFCXCEBYINGO-IAGOWNOFSA-N 0.000 claims description 5
- 150000003881 polyketide derivatives Chemical class 0.000 claims description 5
- UCONUSSAWGCZMV-HZPDHXFCSA-N Delta(9)-tetrahydrocannabinolic acid Chemical compound C([C@H]1C(C)(C)O2)CC(C)=C[C@H]1C1=C2C=C(CCCCC)C(C(O)=O)=C1O UCONUSSAWGCZMV-HZPDHXFCSA-N 0.000 claims description 4
- YOVRGSHRZRJTLZ-UHFFFAOYSA-N Delta9-THCA Natural products C1=C(C(O)=O)CCC2C(C)(C)OC3=CC(CCCCC)=CC(O)=C3C21 YOVRGSHRZRJTLZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- QHMBSVQNZZTUGM-UHFFFAOYSA-N Trans-Cannabidiol Natural products OC1=CC(CCCCC)=CC(O)=C1C1C(C(C)=C)CCC(C)=C1 QHMBSVQNZZTUGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- ZTGXAWYVTLUPDT-UHFFFAOYSA-N cannabidiol Natural products OC1=CC(CCCCC)=CC(O)=C1C1C(C(C)=C)CC=C(C)C1 ZTGXAWYVTLUPDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- QHMBSVQNZZTUGM-ZWKOTPCHSA-N cannabidiol Chemical compound OC1=CC(CCCCC)=CC(O)=C1[C@H]1[C@H](C(C)=C)CCC(C)=C1 QHMBSVQNZZTUGM-ZWKOTPCHSA-N 0.000 claims description 4
- 229950011318 cannabidiol Drugs 0.000 claims description 4
- WVOLTBSCXRRQFR-DLBZAZTESA-N cannabidiolic acid Chemical compound OC1=C(C(O)=O)C(CCCCC)=CC(O)=C1[C@H]1[C@H](C(C)=C)CCC(C)=C1 WVOLTBSCXRRQFR-DLBZAZTESA-N 0.000 claims description 4
- PCXRACLQFPRCBB-ZWKOTPCHSA-N dihydrocannabidiol Natural products OC1=CC(CCCCC)=CC(O)=C1[C@H]1[C@H](C(C)C)CCC(C)=C1 PCXRACLQFPRCBB-ZWKOTPCHSA-N 0.000 claims description 4
- 229960004242 dronabinol Drugs 0.000 claims description 4
- WVOLTBSCXRRQFR-SJORKVTESA-N Cannabidiolic acid Natural products OC1=C(C(O)=O)C(CCCCC)=CC(O)=C1[C@@H]1[C@@H](C(C)=C)CCC(C)=C1 WVOLTBSCXRRQFR-SJORKVTESA-N 0.000 claims description 3
- 101710095468 Cyclase Proteins 0.000 claims description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 3
- GVVPGTZRZFNKDS-YFHOEESVSA-N Geranyl diphosphate Natural products CC(C)=CCC\C(C)=C/COP(O)(=O)OP(O)(O)=O GVVPGTZRZFNKDS-YFHOEESVSA-N 0.000 claims description 2
- 102000013404 Geranyltranstransferase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010026318 Geranyltranstransferase Proteins 0.000 claims description 2
- SEEZIOZEUUMJME-FOWTUZBSSA-N cannabigerolic acid Chemical compound CCCCCC1=CC(O)=C(C\C=C(/C)CCC=C(C)C)C(O)=C1C(O)=O SEEZIOZEUUMJME-FOWTUZBSSA-N 0.000 claims description 2
- GVVPGTZRZFNKDS-JXMROGBWSA-N geranyl diphosphate Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\CO[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O GVVPGTZRZFNKDS-JXMROGBWSA-N 0.000 claims description 2
- 241000218236 Cannabis Species 0.000 claims 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- SEEZIOZEUUMJME-VBKFSLOCSA-N Cannabigerolic acid Natural products CCCCCC1=CC(O)=C(C\C=C(\C)CCC=C(C)C)C(O)=C1C(O)=O SEEZIOZEUUMJME-VBKFSLOCSA-N 0.000 claims 1
- SEEZIOZEUUMJME-UHFFFAOYSA-N cannabinerolic acid Natural products CCCCCC1=CC(O)=C(CC=C(C)CCC=C(C)C)C(O)=C1C(O)=O SEEZIOZEUUMJME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 108010060641 flavanone synthetase Proteins 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 46
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 34
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 34
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 24
- 108010030975 Polyketide Synthases Proteins 0.000 description 19
- 240000004308 marijuana Species 0.000 description 19
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 15
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 14
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 12
- 235000008697 Cannabis sativa Nutrition 0.000 description 12
- 102100026665 Malonate-CoA ligase ACSF3, mitochondrial Human genes 0.000 description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 12
- 108010089734 malonyl-CoA synthetase Proteins 0.000 description 12
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 11
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 11
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 10
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 9
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 7
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- UDWXLZLRRVQONG-UHFFFAOYSA-M sodium hexanoate Chemical compound [Na+].CCCCCC([O-])=O UDWXLZLRRVQONG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000012225 targeting induced local lesions in genomes Methods 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 6
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 6
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 6
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000028604 virus induced gene silencing Effects 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 5
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N Caprylic acid Natural products CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229930014544 aromatic polyketide Natural products 0.000 description 5
- 125000003822 aromatic polyketide group Chemical group 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 5
- -1 carboxylate acids Chemical class 0.000 description 5
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- ZNJFBWYDHIGLCU-HWKXXFMVSA-N jasmonic acid Chemical compound CC\C=C/C[C@@H]1[C@@H](CC(O)=O)CCC1=O ZNJFBWYDHIGLCU-HWKXXFMVSA-N 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 4
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 4
- 102000005870 Coenzyme A Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-N Decanoic acid Natural products CCCCCCCCCC(O)=O GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010011449 Long-chain-fatty-acid-CoA ligase Proteins 0.000 description 4
- 101100268917 Oryctolagus cuniculus ACOX2 gene Proteins 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 4
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- IRMPFYJSHJGOPE-UHFFFAOYSA-N olivetol Chemical compound CCCCCC1=CC(O)=CC(O)=C1 IRMPFYJSHJGOPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000032361 posttranscriptional gene silencing Effects 0.000 description 4
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 4
- WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-M .beta-Phenylacrylic acid Natural products [O-]C(=O)\C=C\C1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-VOTSOKGWSA-M 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710084186 Acetyl-coenzyme A synthetase Proteins 0.000 description 3
- 102100035709 Acetyl-coenzyme A synthetase, cytoplasmic Human genes 0.000 description 3
- 101710194784 Acetyl-coenzyme A synthetase, cytoplasmic Proteins 0.000 description 3
- 108091026821 Artificial microRNA Proteins 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 235000012766 Cannabis sativa ssp. sativa var. sativa Nutrition 0.000 description 3
- 235000012765 Cannabis sativa ssp. sativa var. spontanea Nutrition 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 3
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 3
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 3
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 3
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 3
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 3
- 235000009120 camo Nutrition 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 235000005607 chanvre indien Nutrition 0.000 description 3
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 3
- MNWFXJYAOYHMED-UHFFFAOYSA-N heptanoic acid Chemical compound CCCCCCC(O)=O MNWFXJYAOYHMED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 3
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- FBUKVWPVBMHYJY-UHFFFAOYSA-N nonanoic acid Chemical compound CCCCCCCCC(O)=O FBUKVWPVBMHYJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 3
- NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N valeric acid Chemical compound CCCCC(O)=O NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IQSYWEWTWDEVNO-ZIAGYGMSSA-N (6ar,10ar)-1-hydroxy-6,6,9-trimethyl-3-propyl-6a,7,8,10a-tetrahydrobenzo[c]chromene-2-carboxylic acid Chemical compound C([C@H]1C(C)(C)O2)CC(C)=C[C@H]1C1=C2C=C(CCC)C(C(O)=O)=C1O IQSYWEWTWDEVNO-ZIAGYGMSSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- GYSCBCSGKXNZRH-UHFFFAOYSA-N 1-benzothiophene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2SC(C(=O)N)=CC2=C1 GYSCBCSGKXNZRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 2
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 2
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000712615 Cannabis sativa Tetrahydrocannabinolic acid synthase Proteins 0.000 description 2
- WBYWAXJHAXSJNI-SREVYHEPSA-N Cinnamic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-SREVYHEPSA-N 0.000 description 2
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 2
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 125000003338 L-glutaminyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(=O)N([H])[H] 0.000 description 2
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 125000002707 L-tryptophyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2C(C([C@](N([H])[H])(C(=O)[*])[H])([H])[H])=C([H])N([H])C2=C1[H] 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-L Malonate Chemical compound [O-]C(=O)CC([O-])=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 2
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000589194 Rhizobium leguminosarum Species 0.000 description 2
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- OBETXYAYXDNJHR-UHFFFAOYSA-N alpha-ethylcaproic acid Natural products CCCCC(CC)C(O)=O OBETXYAYXDNJHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 108060000514 aromatic prenyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- CRFNGMNYKDXRTN-CITAKDKDSA-N butyryl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 CRFNGMNYKDXRTN-CITAKDKDSA-N 0.000 description 2
- 108010002861 cannabichromenic acid synthase Proteins 0.000 description 2
- 229930016911 cinnamic acid Natural products 0.000 description 2
- 235000013985 cinnamic acid Nutrition 0.000 description 2
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 description 2
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 description 2
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 2
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N dodecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC(O)=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000011487 hemp Substances 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-M hexadecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- ZNJFBWYDHIGLCU-UHFFFAOYSA-N jasmonic acid Natural products CCC=CCC1C(CC(O)=O)CCC1=O ZNJFBWYDHIGLCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 150000004667 medium chain fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- WBYWAXJHAXSJNI-UHFFFAOYSA-N methyl p-hydroxycinnamate Natural products OC(=O)C=CC1=CC=CC=C1 WBYWAXJHAXSJNI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 125000001147 pentyl group Chemical group C(CCCC)* 0.000 description 2
- 230000000858 peroxisomal effect Effects 0.000 description 2
- 210000002824 peroxisome Anatomy 0.000 description 2
- 229930015704 phenylpropanoid Natural products 0.000 description 2
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- XYHKNCXZYYTLRG-UHFFFAOYSA-N 1h-imidazole-2-carbaldehyde Chemical compound O=CC1=NC=CN1 XYHKNCXZYYTLRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-M 3-Methylbutanoic acid Natural products CC(C)CC([O-])=O GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHURLXDGHMZIGJ-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxy-6-(2-oxoheptyl)pyran-2-one Chemical compound CCCCCC(=O)CC1=CC(O)=CC(=O)O1 GHURLXDGHMZIGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YIXLDRQOKWESBI-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxy-6-pentylpyran-2-one Chemical compound CCCCCC1=CC(O)=CC(=O)O1 YIXLDRQOKWESBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 101100000143 Arabidopsis thaliana 4CLL7 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100000147 Arabidopsis thaliana 4CLL9 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100001093 Arabidopsis thaliana AAE7 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 235000011303 Brassica alboglabra Nutrition 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000011302 Brassica oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 1
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 1
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 1
- UVOLYTDXHDXWJU-UHFFFAOYSA-N Cannabichromene Chemical compound C1=CC(C)(CCC=C(C)C)OC2=CC(CCCCC)=CC(O)=C21 UVOLYTDXHDXWJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018208 Cannabinoid Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050007331 Cannabinoid receptor Proteins 0.000 description 1
- 208000000094 Chronic Pain Diseases 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- XXGMIHXASFDFSM-UHFFFAOYSA-N Delta9-tetrahydrocannabinol Natural products CCCCCc1cc2OC(C)(C)C3CCC(=CC3c2c(O)c1O)C XXGMIHXASFDFSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000006497 Dianthus caryophyllus Species 0.000 description 1
- 235000009355 Dianthus caryophyllus Nutrition 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150038242 GAL10 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100028501 Galanin peptides Human genes 0.000 description 1
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 description 1
- 101100121078 Homo sapiens GAL gene Proteins 0.000 description 1
- 101000582320 Homo sapiens Neurogenic differentiation factor 6 Proteins 0.000 description 1
- 125000000570 L-alpha-aspartyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[C@]([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000002059 L-arginyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])C(=N[H])N([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000010 L-asparaginyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C(=O)N([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000415 L-cysteinyl group Chemical group O=C([*])[C@@](N([H])[H])([H])C([H])([H])S[H] 0.000 description 1
- 125000002066 L-histidyl group Chemical group [H]N1C([H])=NC(C([H])([H])[C@](C(=O)[*])([H])N([H])[H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000002061 L-isoleucyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])[C@](C([H])([H])[H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000003440 L-leucyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001176 L-lysyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(N([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000002435 L-phenylalanyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000002842 L-seryl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- 125000000769 L-threonyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])[C@](O[H])(C([H])([H])[H])[H] 0.000 description 1
- 125000003798 L-tyrosyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C1=C([H])C([H])=C(O[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000003580 L-valyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])[H] 0.000 description 1
- 239000005639 Lauric acid Substances 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- LTYOQGRJFJAKNA-KKIMTKSISA-N Malonyl CoA Natural products S(C(=O)CC(=O)O)CCNC(=O)CCNC(=O)[C@@H](O)C(CO[P@](=O)(O[P@](=O)(OC[C@H]1[C@@H](OP(=O)(O)O)[C@@H](O)[C@@H](n2c3ncnc(N)c3nc2)O1)O)O)(C)C LTYOQGRJFJAKNA-KKIMTKSISA-N 0.000 description 1
- 101710202365 Napin Proteins 0.000 description 1
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 1
- 102100030589 Neurogenic differentiation factor 6 Human genes 0.000 description 1
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 1
- 241000207746 Nicotiana benthamiana Species 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 240000007817 Olea europaea Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N Propionic acid Chemical compound CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 1
- 241000589774 Pseudomonas sp. Species 0.000 description 1
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 206010048038 Wound infection Diseases 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- GONOPSZTUGRENK-UHFFFAOYSA-N benzyl(trichloro)silane Chemical compound Cl[Si](Cl)(Cl)CC1=CC=CC=C1 GONOPSZTUGRENK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-N beta-methyl-butyric acid Natural products CC(C)CC(O)=O GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010256 biochemical assay Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 108010005026 butyryl-CoA synthetase Proteins 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 244000213578 camo Species 0.000 description 1
- 125000001589 carboacyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229940114081 cinnamate Drugs 0.000 description 1
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000005860 defense response to virus Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000002185 fatty acyl-CoAs Chemical class 0.000 description 1
- 229940114123 ferulate Drugs 0.000 description 1
- KSEBMYQBYZTDHS-HWKANZROSA-N ferulic acid Chemical compound COC1=CC(\C=C\C(O)=O)=CC=C1O KSEBMYQBYZTDHS-HWKANZROSA-N 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 1
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229930005346 hydroxycinnamic acid Natural products 0.000 description 1
- DEDGUGJNLNLJSR-UHFFFAOYSA-N hydroxycinnamic acid group Chemical class OC(C(=O)O)=CC1=CC=CC=C1 DEDGUGJNLNLJSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010359 hydroxycinnamic acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000002117 illicit drug Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000004668 long chain fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- LTYOQGRJFJAKNA-DVVLENMVSA-N malonyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 LTYOQGRJFJAKNA-DVVLENMVSA-N 0.000 description 1
- 108010083942 mannopine synthase Proteins 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037350 metabolism of polyketides Effects 0.000 description 1
- 230000037349 metabolism of terpenoids Effects 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-M octanoate Chemical compound CCCCCCCC([O-])=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- KQMZYOXOBSXMII-CECATXLMSA-N octanoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCCCCCC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KQMZYOXOBSXMII-CECATXLMSA-N 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 150000002995 phenylpropanoid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000001474 phenylpropanoid group Chemical class 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 125000000830 polyketide group Chemical group 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 102220092319 rs876657875 Human genes 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 150000004666 short chain fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 150000003505 terpenes Chemical class 0.000 description 1
- TUNFSRHWOTWDNC-HKGQFRNVSA-N tetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCC[14C](O)=O TUNFSRHWOTWDNC-HKGQFRNVSA-N 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 230000006032 tissue transformation Effects 0.000 description 1
- NGSWKAQJJWESNS-ZZXKWVIFSA-M trans-4-coumarate Chemical compound OC1=CC=C(\C=C\C([O-])=O)C=C1 NGSWKAQJJWESNS-ZZXKWVIFSA-M 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 238000012250 transgenic expression Methods 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 230000009452 underexpressoin Effects 0.000 description 1
- 229940070710 valerate Drugs 0.000 description 1
- 229940005605 valeric acid Drugs 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 150000004669 very long chain fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/93—Ligases (6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
- C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Una molécula de ácido nucleico aislada o purificada que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 77 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, o una secuencia de nucleótidos degenerada de codón de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, en la que la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene actividad de hexanoil-CoA sintetasa.
Description
DESCRIPCIÓN
Genes y proteínas para la síntesis de alcanoil-CoA
Campo de la invención 5
La presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas o purificadas que codifican polipéptidos que tienen actividad de hexanoil-CoA sintetasa, a polipéptidos aislados o purificados que tienen actividad de hexanoil-CoA sintetasa y a procesos que comprenden el uso de las moléculas de ácido nucleico para la modificación de los niveles de compuestos cannabinoides en organismos, células, tejidos o sistemas libres de células. 10
Antecedentes de la invención
El Cannabis sativa L. (cannabis, cáñamo, marihuana) es una de las plantas domesticadas más antiguas y versátiles, que se usa hoy en día como fuente de productos medicinales, alimenticios, cosméticos e industriales. También es 15 muy conocido por su uso como droga ilícita debido a su contenido de cannabinoides psicoactivos (por ejemplo, Δ9-tetrahidrocannabinol, Δ9-THC). Los cannabinoides y otras drogas que actúan a través de los receptores cannabinoides de mamíferos se están explorando para el tratamiento de diversas afecciones tales como el dolor crónico, la esclerosis múltiple y la epilepsia.
20
Los cannabinoides tienen sus orígenes biosintéticos tanto en el metabolismo de los policétidos como de los terpenoides, y se denominan terpenofenólicos o policétidos prenilados (Page J., Nagel J. (2006) ”Biosynthesis of terpenophenolics in hop and cannabis”. en JT Romeo, ed, Integrative Plant Biochemistry, Vol. 40. Elsevier, Oxford, pág. 179-210). La biosíntesis de los cannabinoides se produce principalmente en los tricomas glandulares que cubren las flores femeninas a una alta densidad. Los cannabinoides se forman mediante un proceso biosintético de 25 tres etapas: la formación de los policétidos, la prenilación aromática y la ciclación (véase la Figura 1).
La primera etapa enzimática en la biosíntesis de los cannabinoides es la formación de ácido olivetólico por una enzima policétido sintasa que cataliza la condensación de la hexanoil-coenzima A (CoA) con tres moléculas de malonil-CoA. Los principales cannabinoides, que incluyen Δ9-ácido tetrahidrocannabinólico y ácido cannabidiólico, se 30 forman a partir del precursor de hexanoil-CoA, que es un acil-CoA graso de cadena media (véase la Figura 1). Otros cannabinoides con cadenas laterales variantes se forman a partir de CoA alifáticas de diferentes longitudes (por ejemplo, el ácido Δ9-tetrahidrocannabivarínico se forma a partir de un cebador n-butiril-CoA).
Hexanoil-CoA y otros tioésteres de acil-CoA en plantas se sintetizan mediante enzimas activadoras de acilo (AAE, 35 también denominadas acil-CoA sintetasas) que catalizan la activación de sustratos de ácido carboxílico usando ATP. Estas enzimas actúan sobre una variedad de ácidos de carboxilatos que incluyen ácidos grasos de cadena corta, media, larga y muy larga, precursores de jasmonato, ácidos derivados de fenilpropanoides (por ejemplo, ácido cinámico) y otros ácidos orgánicos tales como malonato, acetato y citrato. Se han identificado muy pocas acil CoA sintetasas de cadena media previamente en la naturaleza. En las plantas, se ha demostrado que tres enzimas de A. 40 thaliana, AAE7, At4g05160 and At5g63380, forman hexanoil-CoA a partir de hexanoato (Schneider K et al. (2005) “A new type of peroxisomal acyl-coenzyme A synthetase from Arabidopsis thaliana has the catalytic capacity to activate biosynthetic precursors of jasmonic acid”. The Journal of Biological Chemistry 280:13962-72; Shockey J. M., Fulda M. S., Browse J. (2003) “Arabidopsis contains a large superfamily of acyl-activating enzymes”. El análisis filogenético y bioquímico revela una nueva clase de acil-coenzima a sintetasas. Plant Physiology 132:1065-76). Las Acil-CoA 45 sintetasas de Pseudomonas sp. han demostrado actuar sobre ácidos grasos de cadena media tales como hexanoato (Fernandez-Valverde M., Reglero A., Martinez-Blanco H., Luengo J. M. (1993) “Purification of Pseudomonas putida acyl coenzyme A ligase active with a range of aliphatic and aromatic substrates”. Applied Environmental Microbiology 59:1149-1154).
50
Los cannabinoides son valiosos productos naturales. Los genes que codifican enzimas implicadas en la biosíntesis de cannabinoides serán útiles en la obtención metabólica del cannabis para producir plantas que contengan niveles muy bajos, o niveles nulos, de THCA y otros cannabinoides mediante mutagénesis dirigida (p. TILLING) u otras técnicas de desactivación de genes. Dichos genes también pueden ser útiles para la creación, mediante la selección asistida por marcadores, de variedades de cannabis específicas para la producción de productos farmacéuticos 55 basados en cannabinoides, o para la reconstitución de la biosíntesis de los cannabinoides en organismos heterólogos tales como bacterias o levaduras, o para producir cannabinoides en sistemas libres de células que utilizan proteínas recombinantes.
Los genes que codifican enzimas de la biosíntesis de cannabinoides también pueden ser útiles en la síntesis de 60 análogos de cannabinoides y en la síntesis de análogos de precursores de cannabinoides. Los análogos de cannabinoides se han sintetizado previamente y pueden ser útiles como productos farmacéuticos.
Sigue existiendo la necesidad en la técnica de identificar enzimas y secuencias de nucleótidos que codifiquen dichas enzimas, que están implicadas en la síntesis de policétidos aromáticos. 65
Sumario de la invención
Se han encontrado dos nuevos genes de cannabis que codifican las alcanoil-CoA sintetasas previamente desconocidas. Estas dos nuevas alcanoil Co-A sintetasas se denominan en el presente documento hexanoil-CoA sintetasa 1 de Cannabis sativa (CsHCS1) y hexanoil-CoA sintetasa 2 de Cannabis sativa (CsHCS2). 5
Por lo tanto, en un primer aspecto de la invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada o purificada que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 77 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, o una secuencia de nucleótidos degenerada de codón de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, en el que la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene actividad de hexanoil-CoA sintetasa. 10
En un segundo aspecto de la invención, se proporciona un polipéptido aislado o purificado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, o una secuencia de aminoácidos sustituida conservativamente de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, en el que el polipéptido tiene actividad de hexanoil-CoA sintetasa. 15
En un tercer aspecto de la invención, se proporciona un vector, una construcción o un sistema de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención.
En un cuarto aspecto de la invención, se proporciona una célula hospedadora transformada con una molécula de 20 ácido nucleico de la invención.
Se desvela un proceso de síntesis de una alcanoil-CoA en presencia de una enzima desvelada en el presente documento.
25
En un quinto aspecto de la invención, se proporciona un proceso de modificación de los niveles de compuestos cannabinoides en un organismo, una célula o un tejido que comprende:
i) usar una molécula de ácido nucleico aislada o purificada que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, en el que la molécula de 30 ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene actividad de hexanoil-CoA sintetasa, o una parte de la misma, para silenciar, en el organismo, la célula o el tejido un gen que codifica una enzima que cataliza la síntesis de una alcanoil-CoA, en comparación con un organismo, una célula o un tejido desarrollado en condiciones similares, pero sin el uso de la molécula de ácido nucleico para el silenciamiento;
35
i) mutar los genes del organismo, de la célula o del tejido, y usar una molécula de ácido nucleico aislada o purificada que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 77 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, o una secuencia de nucleótidos degenerada de codón de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, en el que la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene actividad de hexanoil-CoA sintetasa para seleccionar organismos, células o tejidos que contienen mutantes o variantes de un gen que 40 codifica una enzima que cataliza la síntesis de una alcanoil-CoA, en el que el organismo, la célula o el tejido de i) e ii) es un organismo de planta de cannabis, una célula de planta de cannabis o un tejido de planta de cannabis;
iii) expresar o sobreexpresar una molécula de ácido nucleico exógena que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 77 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, o una 45 secuencia de nucleótidos degenerada de codón de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, en el que la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene actividad de hexanoil-CoA sintetasa en el organismo, la célula o el tejido en comparación con un organismo, una célula o un tejido desarrollado en condiciones similares, pero sin la expresión o sobreexpresión de la molécula de ácido nucleico exógena; o
50
iv) expresar o sobreexpresar una molécula de ácido nucleico exógena que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, o una secuencia de aminoácidos sustituida conservativamente de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, en el que el polipéptido tiene actividad de hexanoil-CoA sintetasa en el organismo, la célula o el tejido en comparación con un organismo, una célula o un tejido desarrollado en condiciones similares, pero sin la 55 expresión o sobreexpresión de la molécula de ácido nucleico exógena; en el que el organismo de iii) e iv) es una planta o un microorganismo en el que la célula de iii) e iv) es de una planta o un microorganismo, y en el que el tejido de iii) e iv) es de una planta.
En un sexto aspecto de la invención, se proporciona un proceso de síntesis de un compuesto cannabinoide de 60 origen natural o un análogo no natural de un compuesto cannabinoide en un organismo, una célula o un tejido que comprende introducir y expresar una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 77 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, o una secuencia de nucleótidos degenerada de codón de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, en el que la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene actividad de hexanoil-CoA sintetasa en el organismo, la célula o el tejido en 65 presencia de un ácido carboxílico y CoA, en el que el organismo es una planta o un microorganismo, en el que la
célula es de una planta o de un microorganismo, y en el que el tejido es de una planta.
En un séptimo aspecto de la presente invención, se proporciona un proceso de síntesis de una hexanoil-CoA en una reacción libre de células in vitro, comprendiendo dicho proceso: hacer reaccionar ácido carboxílico con coenzima A en presencia del polipéptido de la invención, preferentemente en el que el ácido carboxílico tiene de 2 a 10 átomos 5 de carbono.
Ahora se han identificado y caracterizado polipéptidos que son enzimas que catalizan la síntesis de alcanoil-CoA, y las secuencias de nucleótidos que codifican dichas enzimas. Las secuencias de nucleótidos se pueden usar para crear, a través de la cría, selección u obtención por ingeniería genética, plantas de cannabis que sobreproducen o 10 infraproducen compuestos cannabinoides, análogos de compuestos cannabinoides o mezclas de los mismos. Estas secuencias de nucleótidos también se pueden usar solas o en combinación con genes que codifican otras etapas de las vías de síntesis de cannabinoides, para diseñar la biosíntesis de cannabinoides en otras plantas o en microorganismos (por ejemplo, levaduras, bacterias, hongos) u otros organismos procariotas o eucariotas o en sistemas libres de células. Además, se podría usar el bloqueo o la reducción de la expresión de estos genes en el 15 cannabis para bloquear la biosíntesis de los cannabinoides y, por lo tanto, reducir la producción de los cannabinoides.
Se describirán otras características de la invención o serán evidentes en el transcurso de la siguiente descripción detallada. 20
Breve descripción de las figuras
Para que la invención pueda entenderse más claramente, ahora se describirán realizaciones de la misma en detalle a modo de ejemplo, con referencia a las figuras adjuntas, en las que: 25
La Figura 1 representa una vía propuesta que conduce a los principales tipos de cannabinoides en Cannabis sativa. Abreviaturas: THCA sintasa es Δ9-ácido tetrahidrocannabinólico sintasa; CBDA sintasa es ácido cannabidiólico sintasa; CBCA sintasa es ácido cannabicroménico sintasa.
30
Las Figuras 2A-2F representan el análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas/espectrometría de masas (LC-MS/MS) de la actividad enzimática de hexanoil-CoA sintasas de Cannabis sativa. Cada una de las Figuras 2A-2F muestra la abundancia de iones (m/z 866 > 359) en el eje vertical y el tiempo (minutos) en el eje horizontal. Las Figuras 2A y 2B representan el tiempo de retención de un patrón auténtico de hexanoil-CoA. La Figura 2C representa un ensayo de proteína CsHCS1, CoA, MgCl2, hexanoato de sodio, ATP y tampón HEPES, 35 en el que se produjo y se detectó hexanoil-CoA. La Figura 2D representa un ensayo de proteína CsHCS2, CoA, MgCl2, hexanoato sódico, ATP y tampón HEPES, en el que se produjo hexanoil-CoA. La Figura 2E representa un ensayo en el que se había inactivado previamente la proteína CsHCS1 hirviendo a 95 ºC durante 15 minutos, CoA, hexanoato sódico, ATP y tampón HEPES, en el que no se produjo hexanoil-CoA. La Figura 2F representa un ensayo en el que se había inactivado previamente la proteína CsHCS2 hirviendo a 95 ºC durante 15 minutos, 40 CoA, hexanoato sódico, ATP y tampón HEPES, en el que no se produjo hexanoil-CoA.
La Figura 3 representa dos gráficos que ilustran sustratos de ácido carboxílico utilizados por las enzimas de la invención. La Figura 3A representa sustratos de ácido carboxílico utilizados por CsHCS1. La Figura 3B representa sustratos de ácido carboxílico utilizados por CsHCS2. 45
La Figura 4 representa un análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento de los productos producidos mediante un ensayo enzimático acoplado que consiste en la hexanoil-CoA sintetasa de Cannabis sativa CsHCS2, malonil-CoA sintetasa (MCS), "olivetol sintasa”/policétido sintasa de Cannabis sativa, y ácido olivetólico sintasa de Cannabis sativa. Los compuestos eluidos se detectaron por absorbancia a 263 nm y se identificaron 50 tanto por tener los mismos tiempos de retención que los patrones aislados, como por su masa usando un detector de masas de un solo cuadrúpolo. La detección de olivetol y ácido olivetólico indica que CsHCS2 es capaz de proporcionar suficiente sustrato de hexanoil-CoA para la síntesis de ácido olivetólico. Los ensayos que carecen de CsHCS2, CoA o hexanoato no produjeron ningún producto de policétido. HTAL = lactona hexanoiltriacética, PDAL = lactona pentildiacética, OA = ácido olivetólico, OL = olivetol. 55
La Figura 5 muestra un gráfico que muestra la producción de ácido olivetólico en células de levadura diseñadas para producir ácido olivetólico usando CsHCS1 y CsHCS2 para sintetizar hexanoil-CoA, y una fusión de la "olivetol sintasa"/policétido sintasa (PKS) y la ácido olivetólico sintasa (OAS) para formar ácido olivetólico.
60
La Figura 6 representa el análisis de qRT-PCR de la expresión de CsHCS1, CsHCS2 y CBDA sintasa en diferentes tejidos de variedad cultivada de cáñamo “Finola”. Los valores de expresión génica relativos a la actina se representaron como las diferencias de plegamiento en comparación con las hojas, asignándose a la expresión de la hoja un valor de 1. Las inserciones representan la expresión de genes en flores femeninas con y sin tricomas, con los valores también indicados como las diferencias de plegamiento en comparación con las hojas. 65 R, raíces; S, tallos; L, hojas; FF+, flores femeninas con tricomas; FF-, flores femeninas con los tricomas retirados
mediante el método Beadbeater; T, tricomas; MF, flor masculina. Los valores son la media ± DT, n = 3.
Descripción de las realizaciones preferidas
Se secuenció una biblioteca de ADNc específica del tricoma de cannabis para producir 9.157 marcadores de 5 secuencia de expresión ("EST") que se ensamblaron en 4.113 secuencias únicas (1.227 cóntigos, 2.886 componentes). Los Unigenes se anotaron en comparación con la base de datos de proteínas UniProt™ usando la herramienta de búsqueda y comparación en línea denominada blastx. Las proteínas enzimáticas activadoras del acilo de cannabis se identificaron mediante la utilización de secuencias de enzimas activadoras de acilo de Arabidopsis para consultar las EST compuestas de cannabis usando la herramienta de búsqueda y comparación en 10 línea denominada tblastn. Se identificaron once enzimas activadoras de acilo y se nombraron de acuerdo con la abundancia de sus transcripciones en la biblioteca de ADNc. CsHCS1 fue la enzima activadora de acilo más abundante en función de los niveles de transcripción (42 EST); CsHCS2 tenía una menor abundancia (5 EST). En función de sus altos niveles de transcripción en los tricomas y la localización de CsHCS1 en el citoplasma, es probable que esta enzima sea la enzima activadora de acilo implicada en el suministro de hexanoil-CoA a la vía 15 cannabinoide. CsHCS2, que se ubica en el peroxisoma, probablemente no participa en la formación de cannabinoides. Sin embargo, sus propiedades cinéticas la convierten en una enzima útil para sintetizar hexanoil-CoA en hospedadores heterólogos o en sistemas libres de células.
La secuencia del gen CsHCS1 es la siguiente: 20
CsHCS1 de Cannabis sativa - 2163 pb (SEQ ID NO: 1)
La secuencia del gen CsHCS2 es la siguiente:
CsHCS2 de Cannabis sativa – 1.547 pb (SEQ ID NO: 3)
5
Se amplificaron CsHCS1 y CsHCS2 por PCR como se describe en el Ejemplo 1, y se midió la actividad alcanoil-CoA sintetasa o CoA-ligasa como se describe en el Ejemplo 2. Como se muestra en la Figura 2, CsHCS1 y CsHCS2 catalizan la producción de alcanoil-CoA a partir de un ácido carboxílico y CoA.
10
Algunas realizaciones de la presente invención se refieren a una molécula de ácido nucleico aislada o purificada que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene SEQ ID NO: 1 o que tiene al menos 77 %, al menos 78 %, al menos 79 %, al menos 80 %, al menos 81 %, al menos 82 %, al menos 83 %, al menos 84 %, al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de 15 identidad con SEQ ID NO: 1, en las que la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene actividad de hexanoil-CoA sintetasa.
Algunas realizaciones de la presente invención se refieren a una molécula de ácido nucleico aislada o purificada que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene SEQ ID NO: 3 o que tiene al menos 77 %, al menos 78 %, al 20 menos 79 %, al menos 80 %, al menos 81 %, al menos 82 %, al menos 83 %, al menos 84 %, al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de
identidad con SEQ ID NO: 3, en las que la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene actividad de hexanoil-CoA sintetasa.
Se desvelan moléculas de ácido nucleico que se hibridan con las secuencias de ácido nucleico desveladas anteriormente. Las condiciones de hibridación pueden ser rigurosas en el sentido de que la hibridación se producirá 5 si existe al menos una identidad de secuencia del 90 %, 95 % o 97 % con la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la presente invención. Las condiciones rigurosas pueden incluir las usadas para hibridaciones de Southern conocidas tales como, por ejemplo, incubación durante la noche a 42 ºC en una solución que tiene formamida al 50 %, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano, al 10 % y 20 microgramos/mililitro de ADN de esperma de salmón cizallado 10 desnaturalizado, siguiendo lavando el soporte de hibridación en 0,1 x SSC a aproximadamente 65 ºC. Otras condiciones de hibridación conocidas se conocen bien y se describen en Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, tercera edición, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).
Como apreciará el experto en la materia, los ligeros cambios en la secuencia de ácido nucleico no alteran 15 necesariamente la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado. Los expertos en la materia apreciarán que los cambios en las identidades de los nucleótidos en una secuencia génica específica que cambian la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado pueden producir una reducción o potenciación de la eficacia de los genes y que, en algunas aplicaciones (por ejemplo, antisentido, cosupresión o ARNi), las secuencias parciales suelen funcionar tan bien como las versiones completas. Las formas en que se puede variar o acortar la secuencia de 20 nucleótidos son bien conocidas por los expertos en la materia, como lo son las formas de ensayar la efectividad de los genes alterados. En ciertas realizaciones, la efectividad puede ensayarse fácilmente mediante, por ejemplo, cromatografía de gases convencional. La totalidad de dichas variaciones de los genes se incluyen, por lo tanto, como parte de la presente divulgación.
25
Como apreciará un experto en la materia, la longitud de la molécula de ácido nucleico descrita anteriormente dependerá del uso previsto. Por ejemplo, si el uso previsto es como un cebador o una sonda, por ejemplo, para amplificación por PCR o para explorar una biblioteca, la longitud de la molécula de ácido nucleico será menor que la secuencia de longitud completa, por ejemplo, 15-50 nucleótidos. En estas realizaciones, los cebadores o las sondas pueden ser esencialmente idénticos a una región altamente conservada de la secuencia de ácido nucleico o pueden 30 ser esencialmente idénticos al extremo 5' o 3' de la secuencia de ADN. En algunos casos, estos cebadores o sondas pueden usar bases universales en algunas posiciones para ser "esencialmente idénticos" pero seguir proporcionando flexibilidad en el reconocimiento de secuencias. Cabe señalar que las condiciones adecuadas de hibridación de cebador y sonda son bien conocidas en la técnica.
35
La presente invención también incluye la enzima CsHCS1 aislada o purificada que comprende la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2):
Algunas realizaciones se refieren a un polipéptido aislado o purificado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene SEQ ID NO: 2 o que tiene al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al 40 menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, en las que el polipéptido tiene actividad de hexanoil-CoA sintetasa.
La presente invención también incluye la enzima CsHCS2 aislada o purificada que comprende la secuencia de 45 aminoácidos (SEQ ID NO: 4):
Algunas realizaciones se refieren a un polipéptido aislado o purificado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene SEQ ID NO: 4 o que tiene al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos 5 expuesta en SEQ ID NO: 4, en las que el polipéptido tiene actividad de hexanoil-CoA sintetasa.
Algunas realizaciones se refieren a un vector, una construcción o un sistema de expresión que contiene una molécula de ácido nucleico aislada o purificada que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, o al menos 77 %, al menos 78 %, al menos 79 %, al menos 80 %, al menos 10 81 %, al menos 82 %, al menos 83 %, al menos 84 %, al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, en las que la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene actividad de hexanoil-CoA sintetasa. Se desvela un método de preparación de un vector, una construcción o un sistema de expresión que 15 incluye dicha secuencia, o una parte de la misma, para la introducción de la secuencia o secuencia parcial en una orientación sentido o antisentido, o un complemento de la misma, en una célula.
Se desvela el uso de las moléculas de ácido nucleico aisladas y/o purificadas, o los vectores, construcciones o sistemas de expresión que comprenden estas moléculas de ácido nucleico aisladas y/o purificadas para crear 20 organismos transgénicos o células de organismos que produzcan polipéptidos que catalicen la síntesis de policétidos aromáticos. Se desvelan organismos transgénicos, células o tejidos germinativos del organismo que comprende una molécula de ácido nucleico aislada y/o purificada que tiene SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, o que tiene al menos 75 %, al menos 76 %, al menos 77 %, al menos 78 %, al menos 79 %, al menos 80 %, al menos 81 %, al menos 82 %, al menos 83 %, al menos 84 %, al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 25 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3.
Preferentemente, el organismo es una planta, un microorganismo o un insecto. Las plantas son preferentemente del 30 género Cannabis, por ejemplo, Cannabis sativa L., Cannabis indica Lam. y Cannabis ruderalis Janisch. En especial, se prefiere Cannabis sativa. Los microorganismos son preferentemente bacterias (por ejemplo, Escherichia coli) o levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae). El insecto es preferentemente Spodoptera frugiperda.
Los organismos, las células y los tejidos germinativos de la presente divulgación pueden tener niveles alterados de 35 compuestos cannabinoides. Con referencia a la Figura 1, un experto en la materia apreciará que la expresión o sobreexpresión de las moléculas de ácido nucleico de la invención dará lugar a la expresión o sobreexpresión de la enzima que cataliza la síntesis de hexanoil-CoA que, en combinación con otras enzimas, puede dar lugar a la producción o al aumento de la producción de compuestos cannabinoides tales como el ácido cannabigerólico (CBGA), ácido Δ9-tetrahidrocannabinólico (THCA), ácido cannabidiólico (CBDA), ácido cannabicroménico (CBCA), 40 ácido Δ9-tetrahidrocannabinol (THC), cannabidiol (CBD), cannabicromeno (CBC), etc. De manera similar, dependiendo del sustrato usado, la expresión o la sobreexpresión de las moléculas de ácido nucleico de la invención que da lugar a la expresión o sobreexpresión de la enzima que cataliza la síntesis de hexanoil-CoA puede dar lugar a la producción o al aumento de la producción de análogos de compuestos cannabinoides, o análogos de precursores de dichos compuestos. 45
El silenciamiento del gen en el organismo, la célula o el tejido producirá la infraexpresión de la enzima que puede producir la acumulación de precursores tales como ácido hexanoico (seis átomos de carbono), ácido octanoico (ocho átomos de carbono), ácido nonanoico (nueve átomos de carbono), ácido valérico (cinco átomos de carbono), ácido heptanoico (siete átomos de carbono) u otros ácidos carboxílicos y/o la reducción de los cannabinoides tales 50 como THCA (el precursor de THC) o CBDA (el precursor de CBD).
Como se ha tratado anteriormente, el quinto aspecto de la presente invención proporciona un proceso de alteración de los niveles de compuestos cannabinoides en un organismo, una célula o un tejido mediante la expresión o sobreexpresión de una molécula de ácido nucleico exógena que codifica un polipéptido de la invención en el 55
organismo, la célula o el tejido, en comparación con una variedad similar de organismo, célula o tejido desarrollado en condiciones similares, pero sin la expresión o sobreexpresión de una enzima exógena de la invención, en el que la célula es de una planta o un microorganismo y en el que el tejido es de una planta.
La expresión o sobreexpresión de las moléculas de ácido nucleico de la invención se puede realizar en combinación 5 con la expresión o sobreexpresión de uno o más ácidos nucleicos adicionales que codifican una o más enzimas en una vía biosintética de cannabinoides. Algunos ejemplos de otros ácidos nucleicos incluyen aquellos que codifican: una policétido sintasa de tipo III, una policétido ciclasa, una preniltransferasa aromática y una oxidocilasa formadora de cannabinoides. Los ejemplos específicos de estas enzimas incluyen "olivetol sintasa"/policétido sintasa, ácido olivetólico sintasa, una geranilpirofosfato:olivetolato geraniltransferasa, una ácido Δ9-tetrahidrocannabinólico sintasa, 10 una ácido cannabidiólico sintasa o una ácido cannabicroménico sintasa. La síntesis de alcanoil-CoA en presencia de un polipéptido enzimático de la presente invención puede realizarse in vivo o in vitro. Como se ha mencionado anteriormente, dichas síntesis in vivo se pueden realizar expresando o sobreexpresando la molécula de ácido nucleico de la invención en un organismo, una célula o un tejido.
15
La síntesis de alcanoil-CoA in vitro puede tener lugar en un sistema libre de células. Como parte de un sistema libre de células in vitro, se pueden mezclar el ácido carboxílico y una enzima de la presente invención entre sí en un recipiente de reacción adecuado para efectuar la reacción.
In vitro, los polipéptidos de la presente invención se pueden usar en combinación con otras enzimas para efectuar 20 una síntesis completa de un compuesto cannabinoide a partir de un precursor. Por ejemplo, dichas otras enzimas pueden estar implicadas en una vía biosintética de cannabinoides como se describe en la Figura 1 (tal como "olivetol sintasa"/PKS, ácido olivetólico sintasa, preniltransferasa aromática, THCA sintasa, CBDA sintasa, CBCA sintasa).
Los polipéptidos de la presente invención se pueden usar, in vivo o in vitro, para sintetizar análogos de compuestos 25 cannabinoides que no se producen de forma natural en la especie del hospedador. Dichos análogos pueden producirse usando compuestos de ácido carboxílico distintos de los usados para producir compuestos cannabinoides naturales en plantas. Por ejemplo, ácido acético, ácido butírico, ácido octanoico, ácido decanoico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico; ácidos de cadena ramificada tales como ácido isovalérico; y ácidos hidroxicinámicos tales como ácido cinámico. 30
Términos:
Para facilitar la revisión de las diversas realizaciones de la divulgación, se proporcionan las siguientes explicaciones de los términos específicos: 35
Alcanoil-CoA: un alcanoil-CoA es un compuesto de carbonilo alifático que tiene una fracción de coenzima A unida al átomo de carbono del grupo carbonilo a través de un puente de sulfuro. Los compuestos de alcanoil-CoA preferidos comprenden de 2 a 10 átomos de carbono en la parte de carbonilo alifático del compuesto. Más preferentemente, la alcanoil-CoA es CoA-S-C(O)-(CH2)n-CH3, donde n es un número entero de 0 a 8. Algunos 40 ejemplos de compuestos de alcanoil-CoA son acetil-CoA, butiril-CoA, hexanoil-CoA y octanoil-CoA. El uso de acetil-CoA proporciona una cadena lateral de metilo al policétido aromático resultante; el uso de butiril-CoA proporciona una cadena lateral de propilo; y el uso de hexanoil-CoA proporciona una cadena lateral de pentilo. Se prefiere en especial Hexanoil-CoA. Los cannabinoides con cadenas laterales más cortas existen en el cannabis (por ejemplo, ácido tetrahidrocannabivarínico, que tiene una cadena lateral de propilo en lugar de la 45 cadena lateral de pentilo de THCA).
Degeneración de codón: se apreciará que la presente divulgación abarca la degeneración del uso del codón como entenderán los expertos en la materia y como se ilustra en la Tabla 1.
50
Tabla 1. Degeneraciones del codón
- Aminoácido
- Codones
- Ala/A
- GCT, GCC, GCA, GCG
- Arg/R
- CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG
- Asn/N
- AAT, AAC
- Asp/D
- GAT, GAC
- Cys/C
- TGT, UGC
- Gln/Q
- CAA, CAG
- Glu/E
- GAA, GAG
- Gly/G
- GGT, GGC, GGA, GGG
- Aminoácido
- Codones
- His/H
- CAT, CAC
- Ile/I
- ATT, ATC, ATA
- Leu/L
- TTA, TTG, CTT, CTC, CTA, CTG
- Lys/K
- AAA, AAG
- Met/M
- ATG
- Phe/F
- TTT, TTC
- Pro/P
- CCT, CCC, CCA, CCG
- Ser/S
- TCT, TCC, TCA, TCG, AGT, AGC
- Thr/T
- ACT, ACC, ACA, ACG
- Trp/W
- TGG
- Tyr/Y
- TAT, TAC
- Val/V
- GTT, GTC, GTA, GTG
- START
- ATG
- STOP
- TAG, TGA, TAA
Secuencia de nucleótidos complementaria: por "secuencia de nucleótidos complementaria" de una secuencia se entiende cualquier molécula de ácido nucleico cuyos nucleótidos son complementarios a los de una secuencia desvelada en el presente documento, y cuya orientación está invertida (secuencia antiparalela).
5
Sustituciones conservativas: un experto en la materia entenderá que pueden realizarse sustituciones conservativas en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido sin alterar la estructura ni la función tridimensional del polipéptido. Por consiguiente, la presente invención incluye polipéptidos que comprenden CsHCS1 y CsHCS2 sustituidos conservativamente. Las sustituciones conservativas son realizadas por el experto en la materia mediante la sustitución de aminoácidos con hidrofobicidad, polaridad y longitud de cadena R similares entre sí. Además, 10 comparando secuencias alineadas de proteínas homólogas de diferentes especies, se pueden identificar sustituciones conservativas localizando residuos de aminoácidos que han sido mutados entre especies sin alterar las funciones básicas de las proteínas codificadas. La Tabla 2 proporciona una lista ilustrativa de sustituciones conservativas.
15
Tabla 2. Sustituciones conservativas
- Tipo de aminoácido
- Aminoácidos sustituibles
- Hidrófilo
- Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Thr
- Sulfhidrilo
- Cys
- Alifático
- Val, Ile, Leu, Met
- Básico
- Lys, Arg, His
- Aromático
- Phe, Tyr, Trp
Grado o porcentaje de homología de secuencia: la expresión "grado o porcentaje de homología de secuencia" se refiere al grado o porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias después de la alineación óptima.
20
Secuencia homóloga aislada y/o purificada: por "secuencia homóloga aislada y/o purificada" se entiende una secuencia aislada y/o purificada que tiene un porcentaje de identidad con las bases de una secuencia de nucleótidos, o los aminoácidos de una secuencia polipeptídica, de al menos aproximadamente el 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,6 % o 99,7 %. Este porcentaje es puramente estadístico, y es posible distribuir 25 las diferencias entre las dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos al azar y en toda su longitud. La identidad de la secuencia puede determinarse, por ejemplo, mediante programas informáticos diseñados para realizar alineaciones de una o de múltiples secuencias.
Aumento, disminución, modulación, alteración o similares: como apreciará un experto en la materia, dichos términos 30 se refieren a la comparación con una variedad o cepa similar cultivada en condiciones similares, pero sin la
modificación que da lugar al aumento, a la disminución, a la modulación o a la alteración. En algunos casos, esto puede ser un control no transformado, un control transformado simulado o un control transformado por vector.
Aislado: como apreciará un experto en la materia, "aislado" se refiere a polipéptidos o ácidos nucleicos que han sido "aislados" de su entorno nativo. 5
Nucleótido, polinucleótido o secuencia de ácido nucleico: por "nucleótido, polinucleótido o secuencia de ácido nucleico" se entenderá tanto bicatenario como monocatenario en las formas monoméricas y diméricas (denominadas en tándem) y sus productos de transcripción.
10
Identidad de secuencia: se dice que dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos son "idénticas" si la secuencia de aminoácidos o nucleótidos de las dos secuencias es la misma cuando se alinean para una correspondencia máxima como se describe a continuación. El porcentaje de identidad de secuencia (o grado de identidad) se determina comparando dos secuencias óptimamente alineadas en una ventana de comparación, donde la parte del péptido o secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, 15 huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que se produce el resto de aminoácido idéntico o la base de ácido nucleico en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de 20 identidad de secuencia.
La alineación óptima de las secuencias para comparación se puede realizar mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Ad. App. Math 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante la búsqueda del método de similitud de Pearson y 25 Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 85: 2444 (1988), mediante LA implementación computarizada de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA del paquete informático de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis.) o mediante examen visual.
La definición de identidad de secuencia dada anteriormente es la definición que usaría un experto en la materia. La 30 definición en sí misma no necesita la ayuda de ningún algoritmo, solo siendo dichos algoritmos útiles para lograr las alineaciones óptimas de las secuencias, en lugar del cálculo de la identidad de la secuencia.
A partir de la definición dada anteriormente, se deduce que existe un único y bien definido valor para la identidad de secuencia entre dos secuencias comparadas cuyo valor corresponde al valor obtenido para la alineación mejor u 35 óptima.
Hibridación rigurosa: por hibridación en condiciones de rigurosidad con una secuencia de nucleótidos se entiende una hibridación en condiciones de temperatura y fuerza iónica seleccionadas de manera que permiten el mantenimiento de la hibridación entre dos fragmentos de moléculas de ácido nucleico complementarias. 40
Los homólogos de los nuevos genes descritos en el presente documento obtenidos de otros organismos, por ejemplo, de plantas, pueden obtenerse explorando las bibliotecas apropiadas que incluyen los homólogos, de modo que la exploración se realiza con la secuencia de nucleótidos de los genes específicos de la invención, o partes o sondas de la misma, o se identifica mediante la búsqueda de homología de secuencia usando programas de 45 búsqueda de alineación de secuencia tales como BLAST o FASTA.
El aislamiento y la clonación de ácidos nucleicos están bien establecidos. De forma similar, se puede insertar un gen aislado en un vector y transformarse en una célula mediante técnicas convencionales que son conocidas por los expertos en la materia. Las moléculas de ácido nucleico pueden transformarse en un organismo. Como se conoce 50 en la técnica, hay varias formas en que los genes, los vectores, las construcciones y los sistemas de expresión pueden introducirse en organismos, y se ha integrado una combinación de técnicas de transformación y cultivo de tejidos se con éxito en estrategias efectivas para crear organismos transgénicos. Estos métodos, que pueden usarse en la invención, se han descrito en otra parte (Potrykus I (1991) “Gene transfer to plants: Assessment of published approaches and results”. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 205-225; Vasil I. K. (1994) “Molecular 55 improvement of cereals”. Plant Mol. Biol. 25: 925-937. Walden R, Wingender R (1995) “Gene-transfer and plant regeneration techniques”. Trends in Biotechnology 13: 324-331; Songstad D. D., Somers D. A., Griesbach R. J. (1995) “Advances in alternative DNA delivery techniques”. Plant Cell Tissue Organ Cult. 40:1-15), y son muy conocidos por los expertos en la materia.
60
Los vectores adecuados son bien conocidos por los expertos en la materia y se describen en referencias técnicas generales tales como Pouwels et al., “Cloning Vectors. A Laboratory Manual”, Elsevier, Amsterdam (1986). Los vectores particularmente adecuados incluyen los vectores de plásmido Ti. Por ejemplo, un experto en la materia sabrá sin duda que, además de la transformación mediada por Agrobacterium de Arabidopsis mediante infiltración al vacío (Bechtold N., Ellis J., Pelletier G. (1993) en “planta Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult 65 Arabidopsis thaliana plants”. C. R. Acad Sci Paris, Sciences de la vie/Life sciences 316: 1194-1199) o la inoculación
en heridas (KatavicV, Haughn G. W., Reed D., Martin M., Kunst L. (1994) en “planta transformation of Arabidopsis thaliana”. Mol. Gen. Genet. 245: 363-370), es igualmente posible transformar otras especies de plantas, usando la transformación mediada por el plásmido Ti de Agrobacterium (por ejemplo, hipocotilo (DeBlock M., DeBrouwer D., Tenning P. (1989) “Transformation of Brassica napus and Brassica oleracea using Agrobacterium tumefaciens and the expression of the bar and neo genes in the transgenic plants”. Plant Physiol. 91: 694-701) o peciolo cotiledonar 5 (Moloney M. M., Walker J. M., Sharma K. K. (1989) “High efficiency transformation of Brassica napus using Agrobacterium vectors”. Plant Cell Rep. 8: 238-242) infección de heridas, métodos de bombardeo de partículas/biolísticos (Sanford J. C., Klein T. M., Wolf E. D., Allen N. (1987) “Delivery of substances into cells and tissues using a particle bombardment process”. J. Part. Sci. Technol. 5: 27-37) o con métodos de transformación de protoplastos asistidos por polietilenglicol (Rhodes C. A., Pierce D. A., Mettler I. J., Mascarenhas D., Detmer J. J. 10 (1988) “Genetically transformed maize plants from protoplasts”. Science 240: 204-207).
Como también será evidente para los expertos en la materia, y como se describe en otra parte (Meyer P. (1995) “Understanding and controlling transgene expression”. Trends in Biotechnology 13: 332-337; Datla R., Anderson J. W., Selvaraj G. (1997) “Plant promoters for transgene expression”. Biotechnology Annual Review 3: 269-296), es 15 posible utilizar promotores enlazados operativamente a la molécula de ácido nucleico para dirigir cualquier regulación deseada por aumento o por disminución de la expresión transgénica usando promotores no regulados (es decir, constitutivos) (por ejemplo, los basados en CaMV35S) o mediante el uso de promotores que pueden dirigir la expresión génica a determinadas células, tejidos (por ejemplo, promotor de napina para la expresión de transgenes en cotiledones de semillas en desarrollo), órganos (por ejemplo, raíces), a una determinada etapa de desarrollo o en 20 respuesta a un determinado estímulo externo (por ejemplo, choque térmico).
Los promotores de uso en la invención pueden ser inducibles, constitutivos o específicos de tejido o tener diversas combinaciones de dichas características. Los promotores útiles incluyen, pero sin limitación, promotores constitutivos tales como el promotor del virus del anillo grabado del clavel (CERV), el promotor 35S del virus del 25 mosaico de la coliflor (CaMV) o, más particularmente, el promotor del virus del mosaico de la coliflor doble mejorado, que comprende dos promotores 35S de CaMV en tándem (denominado promotor "doble 35S"). En ciertos casos, puede ser deseable usar un promotor específico de tejido o regulado por el desarrollo en lugar de un promotor constitutivo. Un promotor específico de tejido permite la sobreexpresión en ciertos tejidos sin afectar a la expresión en otros tejidos. 30
Las regiones reguladoras de promotor y de terminación serán funcionales en la célula hospedadora y pueden ser heterólogas (es decir, no naturales) u homólogas (derivadas de la especie hospedadora) a la célula y al gen.
La región reguladora de la terminación puede derivarse de la región 3' del gen del que se obtuvo el promotor o de 35 otro gen. Las regiones de terminación adecuadas que se pueden usar son bien conocidas en la técnica e incluyen el terminador de la nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (Tnos), el terminador de la mannopina sintasa de A. tumefaciens (Tmas) y el terminador 35S de CaMV (T35S). Las regiones de terminación particularmente preferidas para su uso en la presente invención incluyen la región de terminación de la subunidad pequeña de ribulosa bisfosfato carboxilasa de guisante (TrbcS) o la región de terminación de Tnos. Las construcciones génicas para su 40 uso en la invención se pueden examinar adecuadamente para determinar su actividad mediante, por ejemplo, la transformación en una planta hospedadora a través de Agrobacterium y la exploración de los niveles de cannabinoides alterados.
Las moléculas de ácido nucleico de la invención, o los fragmentos de las mismas, se pueden usar para bloquear la 45 biosíntesis de cannabinoides en organismos que producen de manera natural compuestos cannabinoides. El silenciamiento usando una molécula de ácido nucleico de la invención se puede realizar de una serie de formas conocidas en general en la técnica, por ejemplo, técnicas de interferencia de ARN (ARNi), técnicas de microARN artificiales, técnicas de silenciamiento génico inducido por virus (VIGS), técnicas antisentido, técnicas de cosupresión sentido y técnicas de mutagénesis dirigida. 50
Las técnicas de ARNi implican una transformación estable usando construcciones de plásmidos de interferencia de ARN (ARNi) (Helliwell C. A., Waterhouse P. M. (2005) “Constructs and methods for hairpin RNA-mediated gene silencing in plants”. Methods Enzymology 392:24-35). Dichos plásmidos se componen de un fragmento del gen diana que se silenciará en una estructura de repetición invertida. Las repeticiones invertidas están separadas por un 55 espaciador, a menudo un intrón. La construcción de ARNi impulsada por un promotor adecuado, por ejemplo, el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), se integra en el genoma de la planta, y la posterior transcripción del transgén conduce a una molécula de ARN que se repliega para formar un ARN bicatenario de horquilla. Esta estructura de ARN bicatenario es reconocida por la planta y cortada en ARN pequeños (de aproximadamente 21 nucleótidos de longitud) denominados ARN interferentes pequeños (ARNip). Los ARNip se 60 asocian con un complejo de proteína (RISC) que pasa a la degradación directa del ARNm para el gen diana.
Las técnicas de microARN artificial (miARNa) aprovechan la vía de microARN (miARN) que funciona para silenciar genes endógenos en plantas y otros eucariotas (Schwab R., Ossowski S., Riester M., Warthmann N., Weigel D. (2006) “Highly specific gene silencing by artificial microRNAs in Arabidopsis”. Plant Cell 18:1121-33; Alvarez J. P., 65 Pekker I., Goldshmidt A., Blum E., Amsellem Z., Eshed Y. (2006) “Endogenous and synthetic microRNAs stimulate
simultaneous, efficient, and localized regulation of multiple targets in diverse species”. Plant Cell 18:1134-51). En este método, se introducen fragmentos de 21 nucleótidos de largo del gen que se va a silenciar en un gen pre-miARN para formar una construcción de pre-miARNa. La construcción de pre-miARNa se transfiere al genoma del organismo usando métodos de transformación que serían evidentes para un experto en la materia. Después de la transcripción del pre-miARNa, el procesamiento produce miARNa que se dirigen a genes que comparten la identidad 5 de los nucleótidos con la secuencia de 21 nucleótidos de miARNa.
En las técnicas de silenciamiento de ARNi, dos factores pueden influir en la elección de la longitud del fragmento. Cuanto más corto sea el fragmento, menos eficaz será el silenciamiento, pero las horquillas muy largas aumentan la posibilidad de recombinación en cepas bacterianas del hospedador. La efectividad del silenciamiento también 10 parece ser dependiente del gen y podría reflejar la accesibilidad del ARNm diana o las abundancias relativas del ARNm diana y el ARN en horquilla en las células en las que el gen está activo. En general, es adecuada una longitud de fragmento de entre 100 y 800 pb, preferentemente de entre 300 y 600 pb, para aumentar al máximo la eficacia del silenciamiento obtenido. La otra consideración es la parte del gen que se va a dirigir. Se pueden usar fragmentos de UTR 5', región de codificación y UTR 3' con resultados igualmente buenos. Como el mecanismo de 15 silenciamiento depende de la homología de secuencia, existe la posibilidad del silenciamiento cruzado de secuencias de ARNm relacionadas. Cuando esto no sea deseable, se debe escoger una región con baja similitud de secuencia con otras secuencias, tales como una UTR 5' o 3'. La regla para evitar el silenciamiento de homología cruzada parece ser el uso de secuencias que no tengan bloques de identidad de secuencia de más de 20 bases entre la construcción y las secuencias de genes no diana. Muchos de estos mismos principios se aplican a la 20 selección de regiones diana para diseñar los miARNa.
Las técnicas de silenciamiento génico inducido por virus (VIGS) son una variación de las técnicas de ARNi que aprovecha las defensas antivíricas endógenas de las plantas. La infección de plantas con virus de VIGS recombinantes que contienen fragmentos de ADN del hospedador conduce al silenciamiento génico posterior a la 25 transcripción para el gen diana. En una realización, se puede usar un sistema de VIGS basado en el virus del cascabeleo del tabaco (TRV) con las secuencias de nucleótidos de la presente invención.
Las técnicas antisentido implican la introducción en una planta de un oligonucleótido antisentido que se unirá al ARN mensajero (ARNm) producido por el gen de interés. El oligonucleótido "antisentido" tiene una secuencia de bases 30 complementaria al ARN mensajero (ARNm) del gen, que se denomina secuencia "sentido". La actividad del segmento sentido del ARNm está bloqueada por el segmento de ARNm antisentido, lo que inactiva eficazmente la expresión génica. La aplicación del antisentido al silenciamiento génico en plantas se ha descrito con más detalle por Stam M., de Bruin R., van Blokland R., van der Hoorn R. A., Mol J. N., Kooter J. M. (2000) “Distinct features of post-transcriptional gene silencing by antisense transgenes in single copy and inverted T-DNA repeat loci”. Plant J. 35 21:27-42.
Las técnicas de cosupresión sentido implican la introducción de un transgén sentido altamente expresado en una planta que produce una expresión reducida de tanto el transgén como del gen endógeno (Depicker A., Montagu M. V. (1997) “Post-transcriptional gene silencing in plants”. Curr Opin Cell Biol. 9: 373-82). El efecto depende de la 40 identidad de secuencia entre el transgén y el gen endógeno.
Las técnicas de mutagénesis dirigida, por ejemplo, TILLING (Inducción Dirigida de Lesiones Locales en el Genoma) y de “eliminación de un gen" usando el bombardeo de neutrones rápidos, pueden usarse para desactivar la función del gen en un organismo (Henikoff S., Till B. J., Comai L. (2004) “TILLING. Traditional mutagenesis meets functional 45 genomics”. Plant Physiol 135:630-6; Li X., Lassner M., Zhang Y. (2002) “Deleteagene: a fast neutron deletion mutagenesis-based gene knockout system for plants”. Comp Funct Genomics. 3: 158-60). El TILLING implica el tratamiento del germoplasma o células individuales con un mutágeno para causar mutaciones puntuales que luego se descubren en genes de interés usando un método sensible para la detección de mutaciones de un solo nucleótido. La detección de las mutaciones deseadas (por ejemplo, mutaciones que dan lugar a la inactivación del 50 producto génico de interés) se puede realizar, por ejemplo, mediante métodos de PCR. Por ejemplo, se pueden preparar cebadores oligonucleotídicos derivados del gen de interés y se puede usar la PCR para amplificar regiones del gen de interés de organismos en la población mutagenizada. Los genes mutantes amplificados pueden hibridarse a genes de tipo silvestre para encontrar los desapareamientos entre los genes mutantes y los genes de tipo silvestre. Las diferencias detectadas pueden rastrearse hasta el organismo que tenía el gen mutante, revelando 55 de ese modo qué organismo mutagenizado tendrá la expresión deseada (por ejemplo, el silenciamiento del gen de interés). Estos organismos se pueden criar luego selectivamente para producir una población que tenga la expresión deseada. El TILLING puede proporcionar una serie alélica que incluya mutaciones sin sentido y desactivadas, que presenten una expresión reducida del gen diana. El TILLING se promociona como un posible enfoque para la desactivación de genes que no implica la introducción de transgenes y, por lo tanto, puede ser más aceptable para 60 los consumidores. El bombardeo de neutrones rápidos induce mutaciones, es decir, eliminaciones, en genomas de organismos que también se pueden detectar usando PCR de una manera similar a la TILLING.
Los expertos en la materia entenderán que los procesos desvelados también se pueden llevar a cabo en un entorno libre de células en presencia de uno o más ácidos carboxílicos. 65
Las realizaciones de la invención son susceptibles de diversas modificaciones y formas alternativas además de los ejemplos específicos incluidos en el presente documento. Por lo tanto, las realizaciones de la invención no se limitan a las formas particulares desveladas.
Ejemplos 5
Ejemplo 1: Amplificación y clonación de CsHCS1 y CsHCS2
Se amplificaron CsHCS1 y CsHCS2 por PCR a partir de clones plasmídicos de ADNc usando los cebadores enumerados en la Tabla 3 y la polimerasa Phusion™ (Finnzymes). Los productos de PCR se purificaron y se 10 clonaron en el vector de entrada pCR8/GW/TOPO (Invitrogen). Después de la transformación en células TOP10 de E. coli (Invitrogen), se verificaron los clones individuales mediante secuenciación. Los genes CsHCS1 y CsHCS2 se recombinaron en el vector de destino pHIS8/GW usando LR recombinasa (Invitrogen). Los productos de reacción de LR se transformaron en células TOP10 y se verificaron mediante secuenciación.
15
Tabla 3: Oligonucleótidos
- Nombre
- Secuencia (5’-3’)
- CsHCS1 directo (SEQ ID NO: 5)
- ATGGGTAAGAATTACAAGTCCCT
- CsHCS1 inverso (SEQ ID NO: 6)
- GAGCTCTCATTCAAAGTGAGAAAATTGCTG
- CsHCS2 directo (SEQ ID NO: 7)
- ATGGAGAAATCTGGGTATGGAAG
- CsHCS2 inverso (SEQ ID NO: 8)
- TCACATGTTGGAGCGTACTTTC
- MCS directo (SEQ ID NO: 9)
- ATGAGCAACCATCTTTTCGACG
- MCS inverso (SEQ ID NO: 10)
- TTACGTCCTGGTATAAAGATCGGC
Se transformaron pHIS8/GW-CsHCS1 y pHIS8/GW-CsHCS2 en células Rosetta 2 de E. coli (Merck). Se usaron colonias individuales para inocular cultivos a pequeña escala de medio líquido LB que contenía cloranfenicol y kanamicina, que se usaron para inocular 500 ml de medio líquido LB sin antibióticos. Tras el crecimiento a DO600 de 20 0,6, se indujo la expresión mediante la adición de IPTG a 0,2 μΜ. A continuación, se cultivaron los cultivos con expresión de CsHCS1 a 12 ºC con agitación durante 24 h, mientras que los cultivos de CsHCS2 se cultivaron a 37 ºC durante 16 h. Se usaron diferentes temperaturas, porque se observó que CsHCS1 no producía proteína soluble a la temperatura más alta.
25
Se recogieron las células por centrifugación y se volvieron a suspender en 10 ml de tampón de lisis marcado con His (Tris-HCl 50 mM, pH 7, NaCl 500 mM, imidazol 2,5 mM, glicerol al 10 % v/v, β-mercaptoetanol 10 mM, Tween ™ 20 al 1 % v/v y 750 µg/ml de lisozima). Se incubaron las células resuspendidas en hielo durante 1 h y luego se lisaron mediante ultrasonidos. Tras la centrifugación durante 20 min a 12.000 g a 4 ºC, se añadió la fracción de proteína soluble a 160 μl de resina Talon™ (Clontech) que se había lavado previamente con tampón de lavado marcado con 30 His (HWB; Tris-HCl 50 mM pH 7, NaCl 500 mM, imidazol 2,5 mM, glicerol al 10 %, β-mercaptoetanol 10 mM). Se incubaron las muestras con balanceo suave a 4 ºC, tras el que se aisló la resina por centrifugación (700 g durante 5 min). Se volvió a suspender la resina en tampón HWB y se lavó con agitación suave a 4 ºC y luego se centrifugó. Se repitió la etapa de lavado dos veces y se cargó la resina resuspendida en una columna de cromatografía y se dejó drenar. Tras lavar la resina con 10 ml de tampón HWB, se eluyeron las proteínas marcadas con His mediante la 35 adición de 2,5 ml de tampón de elución marcado con His (Tris-HCl 50 mM, pH 7, NaCl 500 mM, imidazol 250 mM, glicerol al 10 % v/v, β-mercaptoetanol 10 mM). Se intercambiaron las fracciones eluidas en tampón de almacenamiento (HEPES 50 mM, pH 9, glicerol al 10 % v/v, MgCl2 2 mM y ditiotreitol 2 mM) usando columnas PD10 (Amersham Biosciences). Se verificó la pureza de las proteínas aisladas mediante SDS-PAGE, y se determinó la concentración de proteína mediante el ensayo de Bradford. 40
Ejemplo 2: Análisis de la actividad de Hexanoil-CoA sintetasa
Se midió la actividad de Hexanoil-CoA sintetasa incubando 0,1 µg de enzima en una mezcla de reacción de 20 µl que contenía HEPES 50 mM, pH 9, ATP 8 mM, MgCl2 10 mM, CoA 0,5 mM y hexanoato de sodio 4 mM. Las 45 reacciones se incubaron durante 10 min a 40 ºC, se terminaron con 2 µl de HCl 1 N y se almacenaron en hielo hasta el análisis.
Se diluyeron las mezclas de reacción 1:100 con agua y posteriormente se separaron usando un sistema Acquity UPLC de Waters dotado de una columna Acquity UPLC BEH C18 (1,7 μm de tamaño de partícula, columna de 2,1 x 50 50 mm) y se analizaron por MS/MS usando un espectrómetro de masas de triple cuadrúpolo Quattro Ultima de Micromass. El sistema disolvente usado era tampón A: TEA 5 mM y ácido acético 3 mM en agua, y tampón B: TEA 5 mM y ácido acético 3 mM en metanol:agua 95:5. El programa de flujo se muestra en la Tabla 4. Los ajustes del espectrómetro de masas fueron: ESI en modo positivo, energía de colisión de 27 V, cono de 135 V, exploración para
transiciones de 866 > 359.
Tabla 4. Programa de flujo para la cromatografía líquida
- Tiempo
- Caudal % de A % de B
- (min)
- (ml/min)
- 0
- 0,2 94,7 5,3
- 1
- 0,2 94,7 5,3
- 6
- 0,2 85,0 15,0
- 10
- 0,2 0,1 50,0
- 21
- 0,2 0,1 99 9
- 22
- 0,8 0,1 99,9
- 24
- 0,8 0,1 99,9
- 24,1
- 0,4 94,7 5,3
- 27
- 0,4 94,7 5,3
- 27,1
- 0,2 94,7 5,3
Como se muestra en la Figura 2, CsHCS1 y CsHCS2 catalizaron la formación de hexanoil-CoA a partir de hexanoato 5 y CoA. Las Figuras 2A y 2B muestran la elución del patrón auténtico de hexanoil-CoA. La Figura 2C muestra un ensayo completo que comprende CsHCS1, HEPES 50 mM, pH 9, ATP 8 mM, MgCl2 10 mM, CoA 0,5 mM y hexanoato de sodio 4 mM. Se puede observar un compuesto con las mismas transiciones de masa y el mismo tiempo de elución que el patrón auténtico de hexanoil-CoA a los 9,25 minutos. La Figura 2D muestra un ensayo completo que comprende CsHCS2, HEPES 50 mM, pH 9, ATP 8 mM, MgCl2 10 mM, CoA 0,5 mM y hexanoato de 10 sodio 4 mM. Se puede observar un compuesto con las mismas transiciones de masa y el mismo tiempo de elución que el patrón auténtico de hexanoil-CoA a los 9,25 minutos. Las Figuras 2E y 2F muestran controles negativos con enzimas CsHCS1 y CsHCS2 inactivadas (hervidas). Como puede verse en las Figuras 2E y 2F, estos ensayos no mostraron síntesis de hexanoil-CoA.
15
Tanto CsHCS1 como CsHCS2 presentaron temperatura y pH óptimos de 40 ºC y pH 9, respectivamente. Al ensayar una selección de cationes divalentes, CsHCS1 usó Mg2+ de manera óptima y, en menor medida, Mn2+ y Co2+. La actividad de CsHCS2 fue la más alta usando Co2+, pero también se observó que era alta con Mg2+, Mn2+ y, en menor medida, Ca2+. La relevancia biológica de la alta actividad con Co2+ no es clara, y se usó Mg2+ para todos los ensayos adicionales. 20
Con hexanoato, CsHCS1 resultó tener una Km de 6,1 ± 1,0 mM, una Vmáx de 15,6 ± 1,7 pKat y una kcat de 4,5 s-1. CsHCS2 resultó tener una Km de 320 mM, una Vmáx de 1,7 pKat y una kcat de 57,6 s-1.
Ejemplo 3: Ensayo con diferentes ácidos carboxílicos 25
Para ensayar el intervalo de ácidos carboxílicos que CsHCS1 y CsHCS2 pueden activar, se realizaron ensayos enzimáticos con una amplia selección de ácidos carboxílicos y ATP limitante. Las condiciones de ensayo usadas fueron similares a las de Schneider K et al. (2005). “A new type of peroxisomal acyl-coenzyme A synthetase from Arabidopsis thaliana has the catalytic capacity to activate biosynthetic precursors of jasmonic acid”. The Journal of 30 Biological Chemistry, 280:13962-72. En resumen, se incubó la enzima HCS purificada (1 µg) con sustrato de ácido carboxílico 500 μΜ y CoA 100 μΜ en un ensayo que contenía HEPES 100 mM, pH 9, MgCl2 250 μΜ, ATP 50 μΜ y DTT 1 mM. Se disolvieron todos los sustratos de ácido carboxílico en Triton™ X-100 al 2 % v/v, lo que condujo a una concentración final de Triton X-100 al 0,05 % en el ensayo. Tras reaccionar durante 3 h a 29 ºC, se transfirieron 10 μl de alícuotas de las reacciones a placas de 96 pocillos para una medición basada en luciferina/luciferasa de ATP 35 no consumido. Se analizaron las placas con un contador 1420 Multilabel (PerkinElmer). A cada pocillo, se inyectaron 90 μΙ de una solución que contenía Tris 100 mM, pH 7,8, MgCl2 1 mM, 2,3 μg de luciferina y 0,5 μg de luciferasa, y después de agitar durante 2 segundos, se midió la luminiscencia durante 15 segundos sin filtro en su lugar. Las lecturas más bajas, en comparación con las reacciones sin sustrato de ácido carboxílico, indican una mayor cantidad de actividad enzimática y, por lo tanto, de utilización del sustrato. Los resultados se muestran en la Figura 3, en la 40 que las barras de error representan el porcentaje de error de la proporción, n = 3.
Como se muestra en la Figura 3A, se observó que CsHCS1 utiliza hexanoato (seis átomos de carbono), octanoato (ocho átomos de carbono) y nonanoato (nueve átomos de carbono) y, en menor medida, valerato (cinco átomos de carbono) y heptanoato (siete átomos de carbono), como sustratos. Por el contrario, como se muestra en la Figura 45 3B, CsHCS2 presentó una mayor promiscuidad, y es capaz de utilizar una amplia selección de sustratos, que varían
desde propanoato (C3) a araquidoato (C20), y una serie de fenilpropanoides (cinamato, ferulato, y en menor medida, p-coumarato).
En un experimento separado, se midieron las propiedades cinéticas de CsHCS1 y CsHCS3 con mayor precisión para CoA y ácidos grasos representativos de cadena corta (butanoato), media (hexanoato y decanoato) y larga 5 (palmitato) (Tabla 5). Las altas concentraciones de CoA inhibieron CsHCS1. Usando un modelo de inhibición de sustrato de regresión no lineal, se estimó que CsHCS1 era 5,101 ± 1,8 mM. CoA no inhibió CsHCS2 a las concentraciones ensayadas. El ácido decanoico inhibió CsHCS2 (Ki = 120,8 ± 47,9 μΜ) e inhibió ligeramente CsHCS1 a concentraciones superiores a 4 mM (Ki, no medida). Estos datos muestran las mismas tendencias que los datos cinéticos presentados anteriormente. 10
Tabla 5. Propiedades cinéticas de CsHCS1 y CsHCS2
- Sustrato
- CsHCS1 CsHCS2
- Km Vmáx (pKat) Km Vmáx (pKat) kcat (s-1)
- CoA
- 0,26 ± 0,05 µM - 0,16 ± 0,01 µM - -
- butanoato
- >10 mM - >10 mM - -
- hexanoato
- 3,7 ± 0,7 mM 6,8 ± 0,7 261 ± 37 µM 1,8 ± 0,05 57,6
- decanoato
- 1,7 ± 0,2mM 1,8 ± 0,7 16,1 ± 5,8 µM 1,6 ± 0,1 10,0
- palmitato
- n.d.a - 1,3 ± 0,5 µM 0,4 ± 0,01 2,4
- a no determinada debido a la falta de actividad catalítica
Ejemplo 4: Síntesis del ácido olivetólico usando CsHCS2
15
Se usó CsHCS2 para la síntesis quimioenzimática del policétido aromático ácido olivetólico. El ácido olivetólico es el primer precursor que se ve comprometido para la biosíntesis de los cannabinoides. Esta síntesis in vitro hizo uso de cuatro enzimas recombinantes: CsHCS2, malonil-CoA sintetasa (MCS) de Rhizobium leguminosarum, "olivetol sintasa”/policétido sintasa de cannabis y ácido olivetólico sintasa de cannabis.
20
Se amplificó la Malonil-CoA sintetasa (MCS) a partir del ADN genómico de Rhizobium leguminosarum con los cebadores MCS directo y MCS inverso (véase la Tabla 3). El producto de la PCR se clonó en el vector pCR8/GW/TOPO (Invitrogen) recombinado en el vector pHIS8/GW. Tras la verificación por secuenciación, se transformó el plásmido en Rosetta II (DE3) de E. coli. El MCS recombinante se expresó y se purificó como se describe para las enzimas CsHCS. 25
La clonación, expresión y purificación de "olivetol sintasa"/policétido sintasa y la ácido olivetólico sintasa se realizaron de la siguiente manera. Para la expresión en células de E. coli, se amplificaron los marcos de lectura abiertos de policétido sintasa/olivetol sintasa y la ácido olivetólico sintasa por PCR, se clonaron en pHIS8/GW para policétido sintasa/olivatol sintasa o pET100 (Invitrogen) para la ácido olivetólico sintasa y se transformaron en BL21 30 de E. coli (DE3) (Invitrogen). La clonación se verificó por secuenciación.
La ácido olivetólico sintasa se expresó en 200 ml de cultivo de caldo Terrific, mientras que la policétido sintasa/olivetol sintasa creció en un cultivo de 1 l. Se incubaron ambos cultivos a 30 ºC/150 rpm con agitación, se indujeron con IPTG 0,5 µM y se cultivaron durante la noche. Se centrifugaron los cultivos a 16.000 g durante 20 35 minutos y se lisaron los sedimentos mediante tratamiento con lisozima y ultrasonidos. Se mezclaron los lisados clarificados con resina de Talon (200 µl para la ácido olivetólico sintasa, 1 ml para la policétido sintasa/olivetol sintasa; Clontech), se lavaron con 5 ml de tampón de lavado marcado con His (Tris-HCl 50 mM (pH 7), NaCl 150 mM, imidazol 20 mM, β-mercaptoetanol 10 mM) y se eluyeron las proteínas recombinantes usando tampón de elución marcado con His (Tris HCl 20 mM (pH 7), NaCl 150 mM, imidazol 100 mM, β-mercaptoetanol 10 mM). Se 40 concentró la fracción eluida usando un concentrador YM10 y se cambió el tampón a tampón de almacenamiento (HEPES 20 mM (pH 7,5), NaCl 25 mM, glicerol al 10 %, DTT 5 mM). Se cuantificaron las soluciones de proteínas finales mediante el uso de un kit de ensayo de proteína RC/DC (Bio-Rad) que encontró concentraciones de proteína de 0,5 mg/ml (ácido olivetólico sintasa) y 5,6 mg/ml (policétido sintasa/olivatol sintasa). El análisis en gel de SDS-PAGE confirmó la pureza de ambas proteínas. 45
Se ensayó la capacidad de unir la síntesis de hexanoil-CoA con la síntesis de policétido aromático usando reactivos de bajo coste realizando ensayos enzimáticos que consistían en hexanoato 4 mM, malonato 8 mM, CoA 0,4 mM, ATP 0,4 mM, MgCl2 5 mM, DTT 2 mM, HEPES 20 mM, pH 7,5, 0,3 µg de CsHCS2, 12 µg de MCS, 8 µg de "olivetol sintasa"/PKS y 10 µg de OAS. La reacción se incubó a temperatura ambiente durante 16 h, se acidificó y se extrajo 50 en acetato de etilo. La fracción polar se recuperó, se evaporó a sequedad y se volvió a suspender en 50 µl de metanol. Se analizó una alícuota (5 μΙ) mediante LCMS, y los productos se identificaron por sus tiempos de retención y masas (véase la Figura 4).
Ejemplo 5: Síntesis del ácido olivetólico en levadura usando CsHCS1 y CsHCS2
Se diseñó levadura (Saccharomyces cerevisiae) para producir ácido olivetólico usando CsHCS1 y CsHCS2 para sintetizar hexanoil-CoA, y una fusión de la "olivetol sintasa"/policétido sintasa (PKS) y la ácido olivetólico sintasa (OAS) de cannabis para formar ácido olivetólico. 5
Se clonó OAS en fase con la "olivetol sintasa"/PKS usando una secuencia enlazadora sintética codificante de los aminoácidos AATSGSTGSTGSTGSGRSTGSTGSTGSGRSHMV (SEQ ID NO: 11) en el vector de expresión de levadura pESC-Trp (Stratagene) bajo el control del promotor GAL10. El marco de lectura abierto de CsHCS1 se clonó en el vector de expresión de levadura pYESDEST52-Ura (Invitrogen) usando la tecnología Gateway. El marco 10 de lectura abierto de CsHCS2 se clonó en el vector de expresión de levadura pesca-Trp (Stratagene) bajo el control del promotor GAL1.
Se transformaron células de levadura (InVSc I, Invitrogen) con las construcciones anteriores (OAS: fusión de "olivetol sintasa”/PKS sola; OAS: fusión de "olivetol synthase"/PKS y CsHCS1; OAS: fusión de "olivetol sintasa"/PKS y 15 CsHCS2), y se cultivaron los transformantes en una placa de SD-Trp durante 3 días a 28 ºC. Para cada una, se inoculó una sola colonia en 3 ml de medio de glucosa SD-Trp y se incubó con agitación a 28 ºC durante 2 días. Se usó una alícuota de 0,5 ml de cultivo iniciador para inocular 10 ml de medio de SD-Trp galactosa que contenía hexanoato sódico 1 mM y se incubó a 20 ºC durante 4 días. Se extrajo el cultivo completo con acetato de etilo, se secó y se volvió a suspender el residuo en 100 µl de acetonitrilo al 30 %/agua al 70 %/ácido fórmico al 0,05 %. Los 20 productos se analizaron usando LCMS (véase la Figura 5).
Ejemplo 6: papel de CsHSC1 y CsHSC2 en la biosíntesis de cannabinoides en plantas
A través de un análisis basado en secuencias del conjunto de datos EST de tricoma y el ensayo bioquímico de cinco 25 AAE, se identificaron dos que poseían actividad de hexanoil-CoA sintetasa (CsHSC1 y CsHSC2). Para determinar cuál de estos es probable que participe en la vía biosintética de los cannabinoides, se realizaron experimentos de qRT-PCR y de localización subcelular.
qRT-PCR de la expresión de CsHSC1 y CsHSC2 30
Se cultivaron plantas de “Finola'” desde la etapa de siembra hasta la mitad de la floración. Se tomaron muestras de las raíces, los tallos, las hojas, las flores femeninas (con tricomas y después del aislamiento de los tricomas usando el Beadbeater), células de tricomas y flores masculinas de tres plantas. Se aisló ARN total como se ha descrito anteriormente. El ARN tenía una Abs260: Abs280 de > 1,9 y mostró bandas ribosomales distintas en el gel 35 desnaturalizante. El ADNc de la primera hebra se sintetizó usando ARN 0,5 µg con un kit de síntesis de ADNc QuantiTect (Qiagen). Se diluyó cada muestra de ADNc de 20 μΙ 1:4 con agua, y se usó 1 μl como molde de PCR. Se diseñaron cebadores específicos de los genes para producir amplicones de 90-200 pb. Se realizaron reacciones de PCR (20 μΙ) en placas de 96 pocillos usando un ensayo basado en SYBR Green (kit QuantiFast SYBR Green, Qiagen) con un instrumento StepOne Plus (Applied Biosystems). Los parámetros de ciclado usados fueron 95 ºC 40 durante 5 min seguidos de 40 ciclos de 95 ºC durante 10 s, 60 ºC durante 30 s, y un protocolo de disociación convencional (95 ºC 15 s, 60 ºC durante 1 min, 60-95 ºC en incrementos de 0,3 ºC durante 15 s). Los experimentos se realizaron usando ADNc de tres plantas con dos repeticiones técnicas. Se usó el gen actina, que resultó tener expresión estable en todos los tejidos ensayados, como gen de referencia. Las eficiencias para todos los pares de cebadores fueron del 90 al 110 % calculadas usando el método de curva patrón. Se calcularon los valores de Ct 45 usando el programa informático StepOne (Applied Biosystems). Se usó el método 2-ΔΔCt para el análisis de la expresión génica relativa.
Ubicación subcelular de CsHSC1 y CsHSC2
50
Se construyeron fusiones de YFP:CsHSC1 y de YFP:CsHSC2 por recombinación en pEARLYGATE104 (Earley, K. W., Haag, J. R., Pontes, O., Opper, K., Juehne, T., Song, K. y Pikaard, C. S. (2006). “Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics”. Plant J. 45, 616-629) usando LR recombinasa (Invitrogen). Para generar una construcción de OLS:CFP, se clonó OLS que carecía de un codón de parada en pCR8/GW/TOPO antes de la recombinación en pEARLYGATE102 usando LR recombinasa. El marcador de peroxisoma PX-CK (Nelson, B. K., 55 Cai, X. y Nebenführ, A. (2007). “A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants”. Plant J. 51, 1126-1136) era de ABRC (www.arabidopsis.org). Se transformaron plásmidos en Agrobacterium tumefaciens GV3101 por electroporación y se seleccionaron en placas LB que contenían 10 µg/ml de rifampacina y 50 µg/ml de kanamicina. Se infiltraron hojas de plantas de dos semanas de edad de Nicotiana benthamiana con la solución de Agrobacterium a una DO600 de 0,02 (Sparkes, I. A., Runions, J., 60 Kearns, A. y Hawes, C. (2006). “Rapid, transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants”. Nat. Protocol. 1, 2019-2025). Dos días después de la infiltración, se visualizaron células epidérmicas foliares usando un microscopio confocal Zeiss LSM510. La CFP se visualizó con una excitación de 458 nm y una recogida de imágenes con un filtro de paso de banda de 475-525 nm; la YFP a 514 nm con un filtro de paso de banda de 530-600 nm. Las imágenes se recogieron y se analizaron usando el paquete 65 informático Zeiss LSM.
Claims (16)
- REIVINDICACIONES1. Una molécula de ácido nucleico aislada o purificada que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 77 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, o una secuencia de nucleótidos degenerada de codón de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, en la que la molécula de ácido nucleico codifica un 5 polipéptido que tiene actividad de hexanoil-CoA sintetasa.
- 2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3.10
- 3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que la secuencia de nucleótidos es como se expone en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, o una secuencia de nucleótidos degenerada de codón de la misma.
- 4. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que la secuencia de nucleótidos es como se expone en SEQ ID NO: 1. 15
- 5. Un polipéptido aislado o purificado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, o una secuencia de aminoácidos sustituida conservativamente de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, en el que el polipéptido tiene actividad de hexanoil-CoA sintetasa. 20
- 6. Un vector, una construcción o un sistema de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
- 7. Una célula hospedadora transformada con una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las 25 reivindicaciones 1 a 4.
- 8. Un proceso de modificación de los niveles de compuestos cannabinoides en un organismo, una célula o un tejido que comprende:30i) usar la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2, o una parte de la misma, para silenciar, en el organismo, la célula o el tejido, un gen que codifica una enzima que cataliza la síntesis de una hexanoil-CoA, en comparación con un organismo, una célula o un tejido cultivado en condiciones similares, pero sin el uso de la molécula de ácido nucleico para el silenciamiento;ii) mutar genes del organismo, la célula o el tejido, y usar la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las 35 reivindicaciones 1 a 4 para seleccionar organismos, células o tejidos que contienen mutantes o variantes de un gen que codifique una enzima que catalice la síntesis de una hexanoil-CoA;en el que el organismo, la célula o el tejido de i) e ii) es un organismo de planta de cannabis, una célula de planta de cannabis o un tejido de planta de cannabis;iii) expresar o sobreexpresar una molécula de ácido nucleico exógena de una cualquiera de las reivindicaciones 40 1 a 4 en el organismo, la célula o el tejido en comparación con un organismo, una célula o un tejido desarrollado en condiciones similares, pero sin la expresión o sobreexpresión de la molécula de ácido nucleico exógena; oiv) expresar o sobreexpresar una molécula de ácido nucleico exógena que codifica el polipéptido de la reivindicación 5 en el organismo, la célula o el tejido en comparación con un organismo, una célula o un tejido desarrollado en condiciones similares, pero sin la expresión o sobreexpresión de la molécula de ácido nucleico 45 exógena;en el que el organismo de iii) e iv) es una planta o un microorganismo, en el que la célula de iii) e iv) es de una planta o un microorganismo, y en el que el tejido de iii) e iv) es de una planta.
- 9. Un proceso de síntesis de una hexanoil-CoA en una reacción libre de células in vitro, comprendiendo dicho 50 proceso hacer reaccionar ácido carboxílico con CoA en presencia del polipéptido de la reivindicación 5, preferentemente en el que el ácido carboxílico tiene de 2 a 10 átomos de carbono.
- 10. El proceso de la reivindicación 8, comprendiendo dicho proceso:55iii) expresar o sobreexpresar una molécula de ácido nucleico exógena de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el organismo, la célula o el tejido en comparación con un organismo, una célula o un tejido desarrollado en condiciones similares, pero sin la expresión o sobreexpresión de la molécula de ácido nucleico exógena; oiv) expresar o sobreexpresar una molécula de ácido nucleico exógena que codifica el polipéptido de la reivindicación 5 en el organismo, la célula o el tejido en comparación con un organismo, una célula o un tejido 60 desarrollado en condiciones similares, pero sin la expresión o sobreexpresión de la molécula de ácido nucleico exógena; yen el que se aumenta el nivel del compuesto cannabinoide.65
- 11. El proceso de la reivindicación 8, comprendiendo dicho proceso:i) usar la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2, o una parte de la misma, para silenciar, en el organismo, la célula o el tejido, un gen que codifica una enzima que cataliza la síntesis de una alcanoil-CoA, en comparación con un organismo, una célula o un tejido cultivado en condiciones similares, pero sin el uso de la molécula de ácido nucleico para el silenciamiento; oii) mutar genes en el organismo, la célula o el tejido y usar la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las 5 reivindicaciones 1 a 4 para seleccionar organismos, células o tejidos que contengan mutantes o variantes de un gen que codifique una enzima que catalice la síntesis de una alcanoil-CoA; yen el que se reduce el nivel del compuesto cannabinoide.10
- 12. Un proceso de síntesis de un compuesto cannabinoide de origen natural o un análogo no natural de un compuesto cannabinoide en un organismo, una célula o un tejido que comprende introducir y expresar la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el organismo, la célula o el tejido en presencia de un ácido carboxílico y CoA, en el que el organismo es una planta o un microorganismo, en el que la célula es de una planta o de un microorganismo, y en el que el tejido es de una planta. 15
- 13. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 8, 10 u 11, en el que el organismo es un microorganismo, preferentemente en el que el microorganismo es levadura Saccharomyces cerevisiae o E. coli.
- 14. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 8, 10, 12 o 13, comprendiendo dicho proceso: 20iii) expresar o sobreexpresar una molécula de ácido nucleico exógena de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el organismo, la célula o el tejido en comparación con un organismo, una célula o un tejido desarrollado en condiciones similares, pero sin la expresión o sobreexpresión de la molécula de ácido nucleico exógena; oiv) expresar o sobreexpresar una molécula de ácido nucleico exógena que codifica el polipéptido de la 25 reivindicación 5 en el organismo, la célula o el tejido en comparación con un organismo, una célula o un tejido desarrollado en condiciones similares, pero sin la expresión o sobreexpresión de la molécula de ácido nucleico exógena; yen el que la molécula de ácido nucleico se expresa o sobreexprese en combinación con la expresión o 30 sobreexpresión de ácidos nucleicos que codifican enzimas en una vía biosintética de cannabinoides.
- 15. El proceso de la reivindicación 14, en el que las enzimas de la vía biosintética de cannabinoides son una ácido olivetólico sintasa, una policétido sintasa de tipo III, una policétido ciclasa y una oxidocilasa formadora de cannabinoides, opcionalmente, en la que las enzimas de la vía biosintética de cannabinoides son olivetol sintasa, 35 una policétido ciclasa, una geranilpirofosfato:olivetolato geraniltransferasa, una ácido Δ9-tetrahidrocannabinólico sintasa, una ácido cannabidiólico sintasa o una ácido cannabicroménico sintasa.
- 16. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 8 o 10 a 15, en el que el compuesto cannabinoide es uno o más de ácido cannabigerólico, ácido Δ9-tetrahidrocannabinólico, ácido cannabidiólico, ácido cannabicroménico, Δ9-40 tetrahidrocannabinol, cannabidiol o cannabicromeno, o un análogo de compuesto cannabinoide del mismo que comprende una cadena lateral de 1 a 9 átomos de carbono de longitud.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201161507331P | 2011-07-13 | 2011-07-13 | |
US201161507331P | 2011-07-13 | ||
PCT/CA2012/000656 WO2013006953A1 (en) | 2011-07-13 | 2012-07-13 | Genes and proteins for alkanoyl-coa synthesis |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2659526T3 true ES2659526T3 (es) | 2018-03-16 |
Family
ID=47505453
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES12811112.7T Active ES2659526T3 (es) | 2011-07-13 | 2012-07-13 | Genes y proteínas para la síntesis de alcanoil-CoA |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9546362B2 (es) |
EP (1) | EP2732037B1 (es) |
JP (1) | JP6177774B2 (es) |
KR (1) | KR102031022B1 (es) |
CN (1) | CN103842509B (es) |
AU (1) | AU2012283708B2 (es) |
BR (1) | BR112014000735A2 (es) |
CA (2) | CA2851316C (es) |
CL (1) | CL2014000096A1 (es) |
DK (1) | DK2732037T3 (es) |
ES (1) | ES2659526T3 (es) |
HK (1) | HK1198298A1 (es) |
IL (1) | IL230439B (es) |
MX (1) | MX346923B (es) |
RU (1) | RU2650766C2 (es) |
WO (1) | WO2013006953A1 (es) |
Families Citing this family (37)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL240830B (en) | 2013-02-28 | 2022-08-01 | Teewinot Tech Limited | Processes for chemical engineering and the device for the synthesis of compounds |
WO2015109168A1 (en) | 2014-01-17 | 2015-07-23 | Conagen Inc. | Methods of using capsaicin synthase for the microbial production of capsaicinoids |
WO2015196275A1 (en) | 2014-06-27 | 2015-12-30 | National Research Council Of Canada (Nrc) | Cannabichromenic acid synthase from cannabis sativa |
CA2990071C (en) | 2014-07-14 | 2023-01-24 | Librede Inc. | Production of cannabigerolic acid |
BR112017003966A2 (pt) | 2014-08-25 | 2018-10-23 | Full Spectrum Laboratories Ltd | aparelhos e métodos para a produção simultânea de compostos canabinoides |
CN107846861A (zh) * | 2015-05-28 | 2018-03-27 | 推德有限公司 | Thca合成酶表达改变的大麻植物 |
BR112018013539A2 (pt) | 2016-01-07 | 2018-12-04 | Conagen Inc | métodos de preparar capsinoides por processos biossintéticos |
US11046978B2 (en) * | 2016-03-16 | 2021-06-29 | William Marsh Rice University | Synthesis of isoprenoids and derivatives |
CA3020460A1 (en) * | 2016-04-14 | 2017-10-19 | Ebbu, LLC | Enhanced cannabis plants and methods of making and using the same |
US10499584B2 (en) | 2016-05-27 | 2019-12-10 | New West Genetics | Industrial hemp Cannabis cultivars and seeds with stable cannabinoid profiles |
KR20190027830A (ko) | 2016-07-19 | 2019-03-15 | 코나겐 인크. | 특정 자연 캡사이시노이드의 미생물 생산 방법 |
EP3516048B1 (en) * | 2016-09-20 | 2023-01-11 | 22nd Century Limited, LLC | Trichome specific promoters for the manipulation of cannabinoids and other compounds in glandular trichomes |
US10239808B1 (en) | 2016-12-07 | 2019-03-26 | Canopy Holdings, LLC | Cannabis extracts |
ES2921017T3 (es) * | 2016-12-30 | 2022-08-16 | Natures Toolbox Inc | Sistema de expresión libre de células que tiene una nueva regeneración de energía basada en polifosfato inorgánico |
MX2019009708A (es) | 2017-02-17 | 2020-02-07 | Hyasynth Biologicals Inc | Metodo y linea celular para la produccion de fitocannabinoides y analogos de fitocannabinoides en levadura. |
EP3600361A4 (en) | 2017-03-24 | 2021-01-06 | Trait Biosciences, Inc. | HIGH LEVEL IN VIVO BIOSYNTHESIS AND ISOLATION OF WATER-SOLUBLE CANNABINOIDS IN PLANT SYSTEMS |
ES2898272T3 (es) | 2017-04-27 | 2022-03-04 | Univ California | Microorganismos y métodos para producir cannabinoides y derivados de cannabinoides |
CA3062645A1 (en) * | 2017-05-10 | 2018-11-15 | Baymedica, Inc. | Recombinant production systems for prenylated polyketides of the cannabinoid family |
CN111465700A (zh) | 2017-07-11 | 2020-07-28 | 特征生物科学公司 | 在酵母和植物细胞悬浮培养物中产生水溶性大麻素化合物和材料组合物 |
US11946059B2 (en) | 2017-07-11 | 2024-04-02 | Trait Biosciences, Inc. | In vivo generation of water-soluble cannabinoids in plant cell suspension cultures |
US11905543B2 (en) | 2017-07-11 | 2024-02-20 | Trait Biosceinces, Inc. | In vivo generation of water-soluble acetylated cannabinoid glycoside compounds in plant cell suspension cultures |
EP3652327A4 (en) * | 2017-07-12 | 2021-04-21 | Biomedican, Inc. | MAKING CANNABINOIDS IN YEAST |
EP3745884A1 (en) | 2018-01-31 | 2020-12-09 | Canopy Holdings, Llc | Hemp powder |
US10897925B2 (en) | 2018-07-27 | 2021-01-26 | Joseph Pandolfino | Articles and formulations for smoking products and vaporizers |
US20200035118A1 (en) | 2018-07-27 | 2020-01-30 | Joseph Pandolfino | Methods and products to facilitate smokers switching to a tobacco heating product or e-cigarettes |
WO2020060948A1 (en) | 2018-09-17 | 2020-03-26 | Levadura Biotechnology, Inc. | Production of cannabinoids in yeast using a fatty acid feedstock |
CA3119729A1 (en) | 2018-10-10 | 2020-04-16 | Treehouse Biotech, Inc. | Synthesis of cannabigerol |
WO2020102430A1 (en) * | 2018-11-14 | 2020-05-22 | Baymedica, Inc. | Use of type i and type ii polyketide synthases for the production of cannabinoids and cannabinoid analogs |
WO2020176547A1 (en) | 2019-02-25 | 2020-09-03 | Ginkgo Bioworks, Inc. | Biosynthesis of cannabinoids and cannabinoid precursors |
WO2020198679A1 (en) * | 2019-03-27 | 2020-10-01 | Rynetech Bio, Inc. | Biosynthetic cannabinoid production in engineered microorganisms |
CA3134844A1 (en) * | 2019-04-19 | 2020-10-22 | Genomatica, Inc. | Olivetol synthase variants and methods for production of olivetolic acid and its analog compounds |
EP4065717A4 (en) * | 2019-11-27 | 2024-04-24 | Genomatica, Inc. | GENETICALLY MODIFIED CELLS FOR THE PRODUCTION OF CANNABINOIDS AND OTHER MALONYL-COA DERIVED PRODUCTS |
CN110923242B (zh) * | 2019-12-14 | 2021-04-13 | 厦门梓蔓生物科技有限公司 | 一种大麻腺毛中分离的转录因子CsAPL1及其应用 |
WO2022040475A1 (en) * | 2020-08-19 | 2022-02-24 | Amyris, Inc. | Microbial production of cannabinoids |
CN112489738B (zh) * | 2020-11-30 | 2023-05-26 | 上海交通大学 | 高活性苯丙素类衍生物的定向设计及其生物合成方法 |
CN114196648B (zh) * | 2021-09-10 | 2022-09-13 | 北京蓝晶微生物科技有限公司 | 一种橄榄醇合成酶变体t及其用途 |
WO2023170694A1 (en) * | 2022-03-11 | 2023-09-14 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Transgenic helichrysum umbraculigerum cell, tissue, or plant |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2080056C1 (ru) * | 1994-01-21 | 1997-05-27 | Чувашский сельскохозяйственный институт | Способ селекции растений конопли |
GB9625086D0 (en) | 1996-12-03 | 1997-01-22 | Univ Strathclyde | Cannabis detection |
JP2000078979A (ja) | 1998-09-04 | 2000-03-21 | Taisho Pharmaceut Co Ltd | テトラヒドロカンナビノール酸シンターゼ遺伝子 |
JP2001029082A (ja) | 1999-07-22 | 2001-02-06 | Yukihiro Masayama | カンナビジオール酸シンターゼをコードするdna |
EP1546177A2 (en) | 2002-07-19 | 2005-06-29 | Arizona Board of Regents, acting on behalf of Arizona State University | Dna fingerprinting for cannabis sativa (marijuana) using short tandem repeat (str) markers |
JP2007020466A (ja) | 2005-07-15 | 2007-02-01 | Institute Of Physical & Chemical Research | 大麻CannabissativaL.の識別方法 |
US8884100B2 (en) * | 2009-08-12 | 2014-11-11 | National Research Council Of Canada | Aromatic prenyltransferase from Cannabis |
-
2012
- 2012-07-13 JP JP2014519356A patent/JP6177774B2/ja active Active
- 2012-07-13 EP EP12811112.7A patent/EP2732037B1/en active Active
- 2012-07-13 WO PCT/CA2012/000656 patent/WO2013006953A1/en active Application Filing
- 2012-07-13 CN CN201280044678.9A patent/CN103842509B/zh active Active
- 2012-07-13 MX MX2014000535A patent/MX346923B/es active IP Right Grant
- 2012-07-13 US US14/232,465 patent/US9546362B2/en active Active
- 2012-07-13 AU AU2012283708A patent/AU2012283708B2/en active Active
- 2012-07-13 KR KR1020147003736A patent/KR102031022B1/ko active IP Right Grant
- 2012-07-13 DK DK12811112.7T patent/DK2732037T3/en active
- 2012-07-13 BR BR112014000735A patent/BR112014000735A2/pt unknown
- 2012-07-13 RU RU2014104668A patent/RU2650766C2/ru active
- 2012-07-13 CA CA2851316A patent/CA2851316C/en active Active
- 2012-07-13 ES ES12811112.7T patent/ES2659526T3/es active Active
- 2012-07-13 CA CA3130623A patent/CA3130623A1/en active Pending
-
2014
- 2014-01-13 IL IL230439A patent/IL230439B/en active IP Right Grant
- 2014-01-13 CL CL2014000096A patent/CL2014000096A1/es unknown
- 2014-11-21 HK HK14111838.7A patent/HK1198298A1/xx unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2732037B1 (en) | 2017-12-06 |
IL230439B (en) | 2020-07-30 |
EP2732037A4 (en) | 2015-01-14 |
AU2012283708A2 (en) | 2014-04-10 |
AU2012283708A1 (en) | 2014-02-27 |
CA2851316C (en) | 2021-10-19 |
WO2013006953A9 (en) | 2014-04-03 |
HK1198298A1 (en) | 2015-06-12 |
MX346923B (es) | 2017-04-05 |
CA3130623A1 (en) | 2013-01-17 |
RU2014104668A (ru) | 2015-08-20 |
DK2732037T3 (en) | 2018-02-26 |
CN103842509A (zh) | 2014-06-04 |
NZ621037A (en) | 2016-02-26 |
MX2014000535A (es) | 2015-05-12 |
AU2012283708B2 (en) | 2017-02-23 |
JP2014521311A (ja) | 2014-08-28 |
CA2851316A1 (en) | 2013-01-17 |
BR112014000735A2 (pt) | 2017-06-13 |
JP6177774B2 (ja) | 2017-08-16 |
WO2013006953A8 (en) | 2014-06-19 |
US20140141476A1 (en) | 2014-05-22 |
RU2650766C2 (ru) | 2018-04-17 |
CL2014000096A1 (es) | 2015-06-05 |
KR102031022B1 (ko) | 2019-10-11 |
WO2013006953A1 (en) | 2013-01-17 |
IL230439A0 (en) | 2014-03-31 |
KR20140108210A (ko) | 2014-09-05 |
CN103842509B (zh) | 2016-06-08 |
EP2732037A1 (en) | 2014-05-21 |
US9546362B2 (en) | 2017-01-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2659526T3 (es) | Genes y proteínas para la síntesis de alcanoil-CoA | |
US11939614B2 (en) | Genes and proteins for aromatic polyketide synthesis | |
EP2234474B1 (en) | Diacylglycerol acyltransferase 2 genes and proteins encoded thereby from algae | |
Liu et al. | Increasing seed mass and oil content in transgenic Arabidopsis by the overexpression of wri1-like gene from Brassica napus | |
US8884100B2 (en) | Aromatic prenyltransferase from Cannabis | |
US8704042B2 (en) | Tor-interacting proteins (TIPs) and genes therefor | |
NZ621037B2 (en) | Genes and proteins for alkanoyl-coa synthesis |