ES2659526T3 - Genes y proteínas para la síntesis de alcanoil-CoA - Google Patents

Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada o purificada que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 77 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, o una secuencia de nucleótidos degenerada de codón de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, en la que la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene actividad de hexanoil-CoA sintetasa.

Description

DESCRIPCIÓN

Genes y proteínas para la síntesis de alcanoil-CoA

Campo de la invención 5

La presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas o purificadas que codifican polipéptidos que tienen actividad de hexanoil-CoA sintetasa, a polipéptidos aislados o purificados que tienen actividad de hexanoil-CoA sintetasa y a procesos que comprenden el uso de las moléculas de ácido nucleico para la modificación de los niveles de compuestos cannabinoides en organismos, células, tejidos o sistemas libres de células. 10

Antecedentes de la invención

El Cannabis sativa L. (cannabis, cáñamo, marihuana) es una de las plantas domesticadas más antiguas y versátiles, que se usa hoy en día como fuente de productos medicinales, alimenticios, cosméticos e industriales. También es 15 muy conocido por su uso como droga ilícita debido a su contenido de cannabinoides psicoactivos (por ejemplo, Δ9-tetrahidrocannabinol, Δ9-THC). Los cannabinoides y otras drogas que actúan a través de los receptores cannabinoides de mamíferos se están explorando para el tratamiento de diversas afecciones tales como el dolor crónico, la esclerosis múltiple y la epilepsia.

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Los cannabinoides tienen sus orígenes biosintéticos tanto en el metabolismo de los policétidos como de los terpenoides, y se denominan terpenofenólicos o policétidos prenilados (Page J., Nagel J. (2006) ”Biosynthesis of terpenophenolics in hop and cannabis”. en JT Romeo, ed, Integrative Plant Biochemistry, Vol. 40. Elsevier, Oxford, pág. 179-210). La biosíntesis de los cannabinoides se produce principalmente en los tricomas glandulares que cubren las flores femeninas a una alta densidad. Los cannabinoides se forman mediante un proceso biosintético de 25 tres etapas: la formación de los policétidos, la prenilación aromática y la ciclación (véase la Figura 1).

La primera etapa enzimática en la biosíntesis de los cannabinoides es la formación de ácido olivetólico por una enzima policétido sintasa que cataliza la condensación de la hexanoil-coenzima A (CoA) con tres moléculas de malonil-CoA. Los principales cannabinoides, que incluyen Δ9-ácido tetrahidrocannabinólico y ácido cannabidiólico, se 30 forman a partir del precursor de hexanoil-CoA, que es un acil-CoA graso de cadena media (véase la Figura 1). Otros cannabinoides con cadenas laterales variantes se forman a partir de CoA alifáticas de diferentes longitudes (por ejemplo, el ácido Δ9-tetrahidrocannabivarínico se forma a partir de un cebador n-butiril-CoA).

Hexanoil-CoA y otros tioésteres de acil-CoA en plantas se sintetizan mediante enzimas activadoras de acilo (AAE, 35 también denominadas acil-CoA sintetasas) que catalizan la activación de sustratos de ácido carboxílico usando ATP. Estas enzimas actúan sobre una variedad de ácidos de carboxilatos que incluyen ácidos grasos de cadena corta, media, larga y muy larga, precursores de jasmonato, ácidos derivados de fenilpropanoides (por ejemplo, ácido cinámico) y otros ácidos orgánicos tales como malonato, acetato y citrato. Se han identificado muy pocas acil CoA sintetasas de cadena media previamente en la naturaleza. En las plantas, se ha demostrado que tres enzimas de A. 40 thaliana, AAE7, At4g05160 and At5g63380, forman hexanoil-CoA a partir de hexanoato (Schneider K et al. (2005) “A new type of peroxisomal acyl-coenzyme A synthetase from Arabidopsis thaliana has the catalytic capacity to activate biosynthetic precursors of jasmonic acid”. The Journal of Biological Chemistry 280:13962-72; Shockey J. M., Fulda M. S., Browse J. (2003) “Arabidopsis contains a large superfamily of acyl-activating enzymes”. El análisis filogenético y bioquímico revela una nueva clase de acil-coenzima a sintetasas. Plant Physiology 132:1065-76). Las Acil-CoA 45 sintetasas de Pseudomonas sp. han demostrado actuar sobre ácidos grasos de cadena media tales como hexanoato (Fernandez-Valverde M., Reglero A., Martinez-Blanco H., Luengo J. M. (1993) “Purification of Pseudomonas putida acyl coenzyme A ligase active with a range of aliphatic and aromatic substrates”. Applied Environmental Microbiology 59:1149-1154).

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Los cannabinoides son valiosos productos naturales. Los genes que codifican enzimas implicadas en la biosíntesis de cannabinoides serán útiles en la obtención metabólica del cannabis para producir plantas que contengan niveles muy bajos, o niveles nulos, de THCA y otros cannabinoides mediante mutagénesis dirigida (p. TILLING) u otras técnicas de desactivación de genes. Dichos genes también pueden ser útiles para la creación, mediante la selección asistida por marcadores, de variedades de cannabis específicas para la producción de productos farmacéuticos 55 basados en cannabinoides, o para la reconstitución de la biosíntesis de los cannabinoides en organismos heterólogos tales como bacterias o levaduras, o para producir cannabinoides en sistemas libres de células que utilizan proteínas recombinantes.

Los genes que codifican enzimas de la biosíntesis de cannabinoides también pueden ser útiles en la síntesis de 60 análogos de cannabinoides y en la síntesis de análogos de precursores de cannabinoides. Los análogos de cannabinoides se han sintetizado previamente y pueden ser útiles como productos farmacéuticos.

Sigue existiendo la necesidad en la técnica de identificar enzimas y secuencias de nucleótidos que codifiquen dichas enzimas, que están implicadas en la síntesis de policétidos aromáticos. 65

Sumario de la invención

Se han encontrado dos nuevos genes de cannabis que codifican las alcanoil-CoA sintetasas previamente desconocidas. Estas dos nuevas alcanoil Co-A sintetasas se denominan en el presente documento hexanoil-CoA sintetasa 1 de Cannabis sativa (CsHCS1) y hexanoil-CoA sintetasa 2 de Cannabis sativa (CsHCS2). 5

Por lo tanto, en un primer aspecto de la invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada o purificada que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 77 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, o una secuencia de nucleótidos degenerada de codón de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, en el que la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene actividad de hexanoil-CoA sintetasa. 10

En un segundo aspecto de la invención, se proporciona un polipéptido aislado o purificado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, o una secuencia de aminoácidos sustituida conservativamente de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, en el que el polipéptido tiene actividad de hexanoil-CoA sintetasa. 15

En un tercer aspecto de la invención, se proporciona un vector, una construcción o un sistema de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención.

En un cuarto aspecto de la invención, se proporciona una célula hospedadora transformada con una molécula de 20 ácido nucleico de la invención.

Se desvela un proceso de síntesis de una alcanoil-CoA en presencia de una enzima desvelada en el presente documento.

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En un quinto aspecto de la invención, se proporciona un proceso de modificación de los niveles de compuestos cannabinoides en un organismo, una célula o un tejido que comprende:

i) usar una molécula de ácido nucleico aislada o purificada que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, en el que la molécula de 30 ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene actividad de hexanoil-CoA sintetasa, o una parte de la misma, para silenciar, en el organismo, la célula o el tejido un gen que codifica una enzima que cataliza la síntesis de una alcanoil-CoA, en comparación con un organismo, una célula o un tejido desarrollado en condiciones similares, pero sin el uso de la molécula de ácido nucleico para el silenciamiento;

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i) mutar los genes del organismo, de la célula o del tejido, y usar una molécula de ácido nucleico aislada o purificada que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 77 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, o una secuencia de nucleótidos degenerada de codón de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, en el que la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene actividad de hexanoil-CoA sintetasa para seleccionar organismos, células o tejidos que contienen mutantes o variantes de un gen que 40 codifica una enzima que cataliza la síntesis de una alcanoil-CoA, en el que el organismo, la célula o el tejido de i) e ii) es un organismo de planta de cannabis, una célula de planta de cannabis o un tejido de planta de cannabis;

iii) expresar o sobreexpresar una molécula de ácido nucleico exógena que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 77 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, o una 45 secuencia de nucleótidos degenerada de codón de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, en el que la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene actividad de hexanoil-CoA sintetasa en el organismo, la célula o el tejido en comparación con un organismo, una célula o un tejido desarrollado en condiciones similares, pero sin la expresión o sobreexpresión de la molécula de ácido nucleico exógena; o

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iv) expresar o sobreexpresar una molécula de ácido nucleico exógena que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, o una secuencia de aminoácidos sustituida conservativamente de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, en el que el polipéptido tiene actividad de hexanoil-CoA sintetasa en el organismo, la célula o el tejido en comparación con un organismo, una célula o un tejido desarrollado en condiciones similares, pero sin la 55 expresión o sobreexpresión de la molécula de ácido nucleico exógena; en el que el organismo de iii) e iv) es una planta o un microorganismo en el que la célula de iii) e iv) es de una planta o un microorganismo, y en el que el tejido de iii) e iv) es de una planta.

En un sexto aspecto de la invención, se proporciona un proceso de síntesis de un compuesto cannabinoide de 60 origen natural o un análogo no natural de un compuesto cannabinoide en un organismo, una célula o un tejido que comprende introducir y expresar una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 77 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, o una secuencia de nucleótidos degenerada de codón de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, en el que la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene actividad de hexanoil-CoA sintetasa en el organismo, la célula o el tejido en 65 presencia de un ácido carboxílico y CoA, en el que el organismo es una planta o un microorganismo, en el que la

célula es de una planta o de un microorganismo, y en el que el tejido es de una planta.

En un séptimo aspecto de la presente invención, se proporciona un proceso de síntesis de una hexanoil-CoA en una reacción libre de células in vitro, comprendiendo dicho proceso: hacer reaccionar ácido carboxílico con coenzima A en presencia del polipéptido de la invención, preferentemente en el que el ácido carboxílico tiene de 2 a 10 átomos 5 de carbono.

Ahora se han identificado y caracterizado polipéptidos que son enzimas que catalizan la síntesis de alcanoil-CoA, y las secuencias de nucleótidos que codifican dichas enzimas. Las secuencias de nucleótidos se pueden usar para crear, a través de la cría, selección u obtención por ingeniería genética, plantas de cannabis que sobreproducen o 10 infraproducen compuestos cannabinoides, análogos de compuestos cannabinoides o mezclas de los mismos. Estas secuencias de nucleótidos también se pueden usar solas o en combinación con genes que codifican otras etapas de las vías de síntesis de cannabinoides, para diseñar la biosíntesis de cannabinoides en otras plantas o en microorganismos (por ejemplo, levaduras, bacterias, hongos) u otros organismos procariotas o eucariotas o en sistemas libres de células. Además, se podría usar el bloqueo o la reducción de la expresión de estos genes en el 15 cannabis para bloquear la biosíntesis de los cannabinoides y, por lo tanto, reducir la producción de los cannabinoides.

Se describirán otras características de la invención o serán evidentes en el transcurso de la siguiente descripción detallada. 20

Breve descripción de las figuras

Para que la invención pueda entenderse más claramente, ahora se describirán realizaciones de la misma en detalle a modo de ejemplo, con referencia a las figuras adjuntas, en las que: 25

La Figura 1 representa una vía propuesta que conduce a los principales tipos de cannabinoides en Cannabis sativa. Abreviaturas: THCA sintasa es Δ9-ácido tetrahidrocannabinólico sintasa; CBDA sintasa es ácido cannabidiólico sintasa; CBCA sintasa es ácido cannabicroménico sintasa.

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Las Figuras 2A-2F representan el análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas/espectrometría de masas (LC-MS/MS) de la actividad enzimática de hexanoil-CoA sintasas de Cannabis sativa. Cada una de las Figuras 2A-2F muestra la abundancia de iones (m/z 866 > 359) en el eje vertical y el tiempo (minutos) en el eje horizontal. Las Figuras 2A y 2B representan el tiempo de retención de un patrón auténtico de hexanoil-CoA. La Figura 2C representa un ensayo de proteína CsHCS1, CoA, MgCl2, hexanoato de sodio, ATP y tampón HEPES, 35 en el que se produjo y se detectó hexanoil-CoA. La Figura 2D representa un ensayo de proteína CsHCS2, CoA, MgCl2, hexanoato sódico, ATP y tampón HEPES, en el que se produjo hexanoil-CoA. La Figura 2E representa un ensayo en el que se había inactivado previamente la proteína CsHCS1 hirviendo a 95 ºC durante 15 minutos, CoA, hexanoato sódico, ATP y tampón HEPES, en el que no se produjo hexanoil-CoA. La Figura 2F representa un ensayo en el que se había inactivado previamente la proteína CsHCS2 hirviendo a 95 ºC durante 15 minutos, 40 CoA, hexanoato sódico, ATP y tampón HEPES, en el que no se produjo hexanoil-CoA.

La Figura 3 representa dos gráficos que ilustran sustratos de ácido carboxílico utilizados por las enzimas de la invención. La Figura 3A representa sustratos de ácido carboxílico utilizados por CsHCS1. La Figura 3B representa sustratos de ácido carboxílico utilizados por CsHCS2. 45

La Figura 4 representa un análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento de los productos producidos mediante un ensayo enzimático acoplado que consiste en la hexanoil-CoA sintetasa de Cannabis sativa CsHCS2, malonil-CoA sintetasa (MCS), "olivetol sintasa”/policétido sintasa de Cannabis sativa, y ácido olivetólico sintasa de Cannabis sativa. Los compuestos eluidos se detectaron por absorbancia a 263 nm y se identificaron 50 tanto por tener los mismos tiempos de retención que los patrones aislados, como por su masa usando un detector de masas de un solo cuadrúpolo. La detección de olivetol y ácido olivetólico indica que CsHCS2 es capaz de proporcionar suficiente sustrato de hexanoil-CoA para la síntesis de ácido olivetólico. Los ensayos que carecen de CsHCS2, CoA o hexanoato no produjeron ningún producto de policétido. HTAL = lactona hexanoiltriacética, PDAL = lactona pentildiacética, OA = ácido olivetólico, OL = olivetol. 55

La Figura 5 muestra un gráfico que muestra la producción de ácido olivetólico en células de levadura diseñadas para producir ácido olivetólico usando CsHCS1 y CsHCS2 para sintetizar hexanoil-CoA, y una fusión de la "olivetol sintasa"/policétido sintasa (PKS) y la ácido olivetólico sintasa (OAS) para formar ácido olivetólico.

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La Figura 6 representa el análisis de qRT-PCR de la expresión de CsHCS1, CsHCS2 y CBDA sintasa en diferentes tejidos de variedad cultivada de cáñamo “Finola”. Los valores de expresión génica relativos a la actina se representaron como las diferencias de plegamiento en comparación con las hojas, asignándose a la expresión de la hoja un valor de 1. Las inserciones representan la expresión de genes en flores femeninas con y sin tricomas, con los valores también indicados como las diferencias de plegamiento en comparación con las hojas. 65 R, raíces; S, tallos; L, hojas; FF+, flores femeninas con tricomas; FF-, flores femeninas con los tricomas retirados

mediante el método Beadbeater; T, tricomas; MF, flor masculina. Los valores son la media ± DT, n = 3.

Descripción de las realizaciones preferidas

Se secuenció una biblioteca de ADNc específica del tricoma de cannabis para producir 9.157 marcadores de 5 secuencia de expresión ("EST") que se ensamblaron en 4.113 secuencias únicas (1.227 cóntigos, 2.886 componentes). Los Unigenes se anotaron en comparación con la base de datos de proteínas UniProt™ usando la herramienta de búsqueda y comparación en línea denominada blastx. Las proteínas enzimáticas activadoras del acilo de cannabis se identificaron mediante la utilización de secuencias de enzimas activadoras de acilo de Arabidopsis para consultar las EST compuestas de cannabis usando la herramienta de búsqueda y comparación en 10 línea denominada tblastn. Se identificaron once enzimas activadoras de acilo y se nombraron de acuerdo con la abundancia de sus transcripciones en la biblioteca de ADNc. CsHCS1 fue la enzima activadora de acilo más abundante en función de los niveles de transcripción (42 EST); CsHCS2 tenía una menor abundancia (5 EST). En función de sus altos niveles de transcripción en los tricomas y la localización de CsHCS1 en el citoplasma, es probable que esta enzima sea la enzima activadora de acilo implicada en el suministro de hexanoil-CoA a la vía 15 cannabinoide. CsHCS2, que se ubica en el peroxisoma, probablemente no participa en la formación de cannabinoides. Sin embargo, sus propiedades cinéticas la convierten en una enzima útil para sintetizar hexanoil-CoA en hospedadores heterólogos o en sistemas libres de células.

La secuencia del gen CsHCS1 es la siguiente: 20

CsHCS1 de Cannabis sativa - 2163 pb (SEQ ID NO: 1)

La secuencia del gen CsHCS2 es la siguiente:

CsHCS2 de Cannabis sativa – 1.547 pb (SEQ ID NO: 3)

5

Se amplificaron CsHCS1 y CsHCS2 por PCR como se describe en el Ejemplo 1, y se midió la actividad alcanoil-CoA sintetasa o CoA-ligasa como se describe en el Ejemplo 2. Como se muestra en la Figura 2, CsHCS1 y CsHCS2 catalizan la producción de alcanoil-CoA a partir de un ácido carboxílico y CoA.

10

Algunas realizaciones de la presente invención se refieren a una molécula de ácido nucleico aislada o purificada que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene SEQ ID NO: 1 o que tiene al menos 77 %, al menos 78 %, al menos 79 %, al menos 80 %, al menos 81 %, al menos 82 %, al menos 83 %, al menos 84 %, al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de 15 identidad con SEQ ID NO: 1, en las que la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene actividad de hexanoil-CoA sintetasa.

Algunas realizaciones de la presente invención se refieren a una molécula de ácido nucleico aislada o purificada que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene SEQ ID NO: 3 o que tiene al menos 77 %, al menos 78 %, al 20 menos 79 %, al menos 80 %, al menos 81 %, al menos 82 %, al menos 83 %, al menos 84 %, al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de

identidad con SEQ ID NO: 3, en las que la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene actividad de hexanoil-CoA sintetasa.

Se desvelan moléculas de ácido nucleico que se hibridan con las secuencias de ácido nucleico desveladas anteriormente. Las condiciones de hibridación pueden ser rigurosas en el sentido de que la hibridación se producirá 5 si existe al menos una identidad de secuencia del 90 %, 95 % o 97 % con la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la presente invención. Las condiciones rigurosas pueden incluir las usadas para hibridaciones de Southern conocidas tales como, por ejemplo, incubación durante la noche a 42 ºC en una solución que tiene formamida al 50 %, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), 5 x solución de Denhardt, sulfato de dextrano, al 10 % y 20 microgramos/mililitro de ADN de esperma de salmón cizallado 10 desnaturalizado, siguiendo lavando el soporte de hibridación en 0,1 x SSC a aproximadamente 65 ºC. Otras condiciones de hibridación conocidas se conocen bien y se describen en Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, tercera edición, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).

Como apreciará el experto en la materia, los ligeros cambios en la secuencia de ácido nucleico no alteran 15 necesariamente la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado. Los expertos en la materia apreciarán que los cambios en las identidades de los nucleótidos en una secuencia génica específica que cambian la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado pueden producir una reducción o potenciación de la eficacia de los genes y que, en algunas aplicaciones (por ejemplo, antisentido, cosupresión o ARNi), las secuencias parciales suelen funcionar tan bien como las versiones completas. Las formas en que se puede variar o acortar la secuencia de 20 nucleótidos son bien conocidas por los expertos en la materia, como lo son las formas de ensayar la efectividad de los genes alterados. En ciertas realizaciones, la efectividad puede ensayarse fácilmente mediante, por ejemplo, cromatografía de gases convencional. La totalidad de dichas variaciones de los genes se incluyen, por lo tanto, como parte de la presente divulgación.

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Como apreciará un experto en la materia, la longitud de la molécula de ácido nucleico descrita anteriormente dependerá del uso previsto. Por ejemplo, si el uso previsto es como un cebador o una sonda, por ejemplo, para amplificación por PCR o para explorar una biblioteca, la longitud de la molécula de ácido nucleico será menor que la secuencia de longitud completa, por ejemplo, 15-50 nucleótidos. En estas realizaciones, los cebadores o las sondas pueden ser esencialmente idénticos a una región altamente conservada de la secuencia de ácido nucleico o pueden 30 ser esencialmente idénticos al extremo 5' o 3' de la secuencia de ADN. En algunos casos, estos cebadores o sondas pueden usar bases universales en algunas posiciones para ser "esencialmente idénticos" pero seguir proporcionando flexibilidad en el reconocimiento de secuencias. Cabe señalar que las condiciones adecuadas de hibridación de cebador y sonda son bien conocidas en la técnica.

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La presente invención también incluye la enzima CsHCS1 aislada o purificada que comprende la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2):

Algunas realizaciones se refieren a un polipéptido aislado o purificado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene SEQ ID NO: 2 o que tiene al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al 40 menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, en las que el polipéptido tiene actividad de hexanoil-CoA sintetasa.

La presente invención también incluye la enzima CsHCS2 aislada o purificada que comprende la secuencia de 45 aminoácidos (SEQ ID NO: 4):

Algunas realizaciones se refieren a un polipéptido aislado o purificado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene SEQ ID NO: 4 o que tiene al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos 5 expuesta en SEQ ID NO: 4, en las que el polipéptido tiene actividad de hexanoil-CoA sintetasa.

Algunas realizaciones se refieren a un vector, una construcción o un sistema de expresión que contiene una molécula de ácido nucleico aislada o purificada que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, o al menos 77 %, al menos 78 %, al menos 79 %, al menos 80 %, al menos 10 81 %, al menos 82 %, al menos 83 %, al menos 84 %, al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, en las que la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene actividad de hexanoil-CoA sintetasa. Se desvela un método de preparación de un vector, una construcción o un sistema de expresión que 15 incluye dicha secuencia, o una parte de la misma, para la introducción de la secuencia o secuencia parcial en una orientación sentido o antisentido, o un complemento de la misma, en una célula.

Se desvela el uso de las moléculas de ácido nucleico aisladas y/o purificadas, o los vectores, construcciones o sistemas de expresión que comprenden estas moléculas de ácido nucleico aisladas y/o purificadas para crear 20 organismos transgénicos o células de organismos que produzcan polipéptidos que catalicen la síntesis de policétidos aromáticos. Se desvelan organismos transgénicos, células o tejidos germinativos del organismo que comprende una molécula de ácido nucleico aislada y/o purificada que tiene SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, o que tiene al menos 75 %, al menos 76 %, al menos 77 %, al menos 78 %, al menos 79 %, al menos 80 %, al menos 81 %, al menos 82 %, al menos 83 %, al menos 84 %, al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 25 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3.

Preferentemente, el organismo es una planta, un microorganismo o un insecto. Las plantas son preferentemente del 30 género Cannabis, por ejemplo, Cannabis sativa L., Cannabis indica Lam. y Cannabis ruderalis Janisch. En especial, se prefiere Cannabis sativa. Los microorganismos son preferentemente bacterias (por ejemplo, Escherichia coli) o levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae). El insecto es preferentemente Spodoptera frugiperda.

Los organismos, las células y los tejidos germinativos de la presente divulgación pueden tener niveles alterados de 35 compuestos cannabinoides. Con referencia a la Figura 1, un experto en la materia apreciará que la expresión o sobreexpresión de las moléculas de ácido nucleico de la invención dará lugar a la expresión o sobreexpresión de la enzima que cataliza la síntesis de hexanoil-CoA que, en combinación con otras enzimas, puede dar lugar a la producción o al aumento de la producción de compuestos cannabinoides tales como el ácido cannabigerólico (CBGA), ácido Δ9-tetrahidrocannabinólico (THCA), ácido cannabidiólico (CBDA), ácido cannabicroménico (CBCA), 40 ácido Δ9-tetrahidrocannabinol (THC), cannabidiol (CBD), cannabicromeno (CBC), etc. De manera similar, dependiendo del sustrato usado, la expresión o la sobreexpresión de las moléculas de ácido nucleico de la invención que da lugar a la expresión o sobreexpresión de la enzima que cataliza la síntesis de hexanoil-CoA puede dar lugar a la producción o al aumento de la producción de análogos de compuestos cannabinoides, o análogos de precursores de dichos compuestos. 45

El silenciamiento del gen en el organismo, la célula o el tejido producirá la infraexpresión de la enzima que puede producir la acumulación de precursores tales como ácido hexanoico (seis átomos de carbono), ácido octanoico (ocho átomos de carbono), ácido nonanoico (nueve átomos de carbono), ácido valérico (cinco átomos de carbono), ácido heptanoico (siete átomos de carbono) u otros ácidos carboxílicos y/o la reducción de los cannabinoides tales 50 como THCA (el precursor de THC) o CBDA (el precursor de CBD).

Como se ha tratado anteriormente, el quinto aspecto de la presente invención proporciona un proceso de alteración de los niveles de compuestos cannabinoides en un organismo, una célula o un tejido mediante la expresión o sobreexpresión de una molécula de ácido nucleico exógena que codifica un polipéptido de la invención en el 55

organismo, la célula o el tejido, en comparación con una variedad similar de organismo, célula o tejido desarrollado en condiciones similares, pero sin la expresión o sobreexpresión de una enzima exógena de la invención, en el que la célula es de una planta o un microorganismo y en el que el tejido es de una planta.

La expresión o sobreexpresión de las moléculas de ácido nucleico de la invención se puede realizar en combinación 5 con la expresión o sobreexpresión de uno o más ácidos nucleicos adicionales que codifican una o más enzimas en una vía biosintética de cannabinoides. Algunos ejemplos de otros ácidos nucleicos incluyen aquellos que codifican: una policétido sintasa de tipo III, una policétido ciclasa, una preniltransferasa aromática y una oxidocilasa formadora de cannabinoides. Los ejemplos específicos de estas enzimas incluyen "olivetol sintasa"/policétido sintasa, ácido olivetólico sintasa, una geranilpirofosfato:olivetolato geraniltransferasa, una ácido Δ9-tetrahidrocannabinólico sintasa, 10 una ácido cannabidiólico sintasa o una ácido cannabicroménico sintasa. La síntesis de alcanoil-CoA en presencia de un polipéptido enzimático de la presente invención puede realizarse in vivo o in vitro. Como se ha mencionado anteriormente, dichas síntesis in vivo se pueden realizar expresando o sobreexpresando la molécula de ácido nucleico de la invención en un organismo, una célula o un tejido.

15

La síntesis de alcanoil-CoA in vitro puede tener lugar en un sistema libre de células. Como parte de un sistema libre de células in vitro, se pueden mezclar el ácido carboxílico y una enzima de la presente invención entre sí en un recipiente de reacción adecuado para efectuar la reacción.

In vitro, los polipéptidos de la presente invención se pueden usar en combinación con otras enzimas para efectuar 20 una síntesis completa de un compuesto cannabinoide a partir de un precursor. Por ejemplo, dichas otras enzimas pueden estar implicadas en una vía biosintética de cannabinoides como se describe en la Figura 1 (tal como "olivetol sintasa"/PKS, ácido olivetólico sintasa, preniltransferasa aromática, THCA sintasa, CBDA sintasa, CBCA sintasa).

Los polipéptidos de la presente invención se pueden usar, in vivo o in vitro, para sintetizar análogos de compuestos 25 cannabinoides que no se producen de forma natural en la especie del hospedador. Dichos análogos pueden producirse usando compuestos de ácido carboxílico distintos de los usados para producir compuestos cannabinoides naturales en plantas. Por ejemplo, ácido acético, ácido butírico, ácido octanoico, ácido decanoico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico; ácidos de cadena ramificada tales como ácido isovalérico; y ácidos hidroxicinámicos tales como ácido cinámico. 30

Términos:

Para facilitar la revisión de las diversas realizaciones de la divulgación, se proporcionan las siguientes explicaciones de los términos específicos: 35

Alcanoil-CoA: un alcanoil-CoA es un compuesto de carbonilo alifático que tiene una fracción de coenzima A unida al átomo de carbono del grupo carbonilo a través de un puente de sulfuro. Los compuestos de alcanoil-CoA preferidos comprenden de 2 a 10 átomos de carbono en la parte de carbonilo alifático del compuesto. Más preferentemente, la alcanoil-CoA es CoA-S-C(O)-(CH2)n-CH3, donde n es un número entero de 0 a 8. Algunos 40 ejemplos de compuestos de alcanoil-CoA son acetil-CoA, butiril-CoA, hexanoil-CoA y octanoil-CoA. El uso de acetil-CoA proporciona una cadena lateral de metilo al policétido aromático resultante; el uso de butiril-CoA proporciona una cadena lateral de propilo; y el uso de hexanoil-CoA proporciona una cadena lateral de pentilo. Se prefiere en especial Hexanoil-CoA. Los cannabinoides con cadenas laterales más cortas existen en el cannabis (por ejemplo, ácido tetrahidrocannabivarínico, que tiene una cadena lateral de propilo en lugar de la 45 cadena lateral de pentilo de THCA).

Degeneración de codón: se apreciará que la presente divulgación abarca la degeneración del uso del codón como entenderán los expertos en la materia y como se ilustra en la Tabla 1.

50

Tabla 1. Degeneraciones del codón

Aminoácido

Codones

Ala/A

GCT, GCC, GCA, GCG

Arg/R

CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG

Asn/N

AAT, AAC

Asp/D

GAT, GAC

Cys/C

TGT, UGC

Gln/Q

CAA, CAG

Glu/E

GAA, GAG

Gly/G

GGT, GGC, GGA, GGG

Aminoácido

Codones

His/H

CAT, CAC

Ile/I

ATT, ATC, ATA

Leu/L

TTA, TTG, CTT, CTC, CTA, CTG

Lys/K

AAA, AAG

Met/M

ATG

Phe/F

TTT, TTC

Pro/P

CCT, CCC, CCA, CCG

Ser/S

TCT, TCC, TCA, TCG, AGT, AGC

Thr/T

ACT, ACC, ACA, ACG

Trp/W

TGG

Tyr/Y

TAT, TAC

Val/V

GTT, GTC, GTA, GTG

START

ATG

STOP

TAG, TGA, TAA

Secuencia de nucleótidos complementaria: por "secuencia de nucleótidos complementaria" de una secuencia se entiende cualquier molécula de ácido nucleico cuyos nucleótidos son complementarios a los de una secuencia desvelada en el presente documento, y cuya orientación está invertida (secuencia antiparalela).

5

Sustituciones conservativas: un experto en la materia entenderá que pueden realizarse sustituciones conservativas en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido sin alterar la estructura ni la función tridimensional del polipéptido. Por consiguiente, la presente invención incluye polipéptidos que comprenden CsHCS1 y CsHCS2 sustituidos conservativamente. Las sustituciones conservativas son realizadas por el experto en la materia mediante la sustitución de aminoácidos con hidrofobicidad, polaridad y longitud de cadena R similares entre sí. Además, 10 comparando secuencias alineadas de proteínas homólogas de diferentes especies, se pueden identificar sustituciones conservativas localizando residuos de aminoácidos que han sido mutados entre especies sin alterar las funciones básicas de las proteínas codificadas. La Tabla 2 proporciona una lista ilustrativa de sustituciones conservativas.

15

Tabla 2. Sustituciones conservativas

Tipo de aminoácido

Aminoácidos sustituibles

Hidrófilo

Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Thr

Sulfhidrilo

Cys

Alifático

Val, Ile, Leu, Met

Básico

Lys, Arg, His

Aromático

Phe, Tyr, Trp

Grado o porcentaje de homología de secuencia: la expresión "grado o porcentaje de homología de secuencia" se refiere al grado o porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias después de la alineación óptima.

20

Secuencia homóloga aislada y/o purificada: por "secuencia homóloga aislada y/o purificada" se entiende una secuencia aislada y/o purificada que tiene un porcentaje de identidad con las bases de una secuencia de nucleótidos, o los aminoácidos de una secuencia polipeptídica, de al menos aproximadamente el 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,6 % o 99,7 %. Este porcentaje es puramente estadístico, y es posible distribuir 25 las diferencias entre las dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos al azar y en toda su longitud. La identidad de la secuencia puede determinarse, por ejemplo, mediante programas informáticos diseñados para realizar alineaciones de una o de múltiples secuencias.

Aumento, disminución, modulación, alteración o similares: como apreciará un experto en la materia, dichos términos 30 se refieren a la comparación con una variedad o cepa similar cultivada en condiciones similares, pero sin la

modificación que da lugar al aumento, a la disminución, a la modulación o a la alteración. En algunos casos, esto puede ser un control no transformado, un control transformado simulado o un control transformado por vector.

Aislado: como apreciará un experto en la materia, "aislado" se refiere a polipéptidos o ácidos nucleicos que han sido "aislados" de su entorno nativo. 5

Nucleótido, polinucleótido o secuencia de ácido nucleico: por "nucleótido, polinucleótido o secuencia de ácido nucleico" se entenderá tanto bicatenario como monocatenario en las formas monoméricas y diméricas (denominadas en tándem) y sus productos de transcripción.

10

Identidad de secuencia: se dice que dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos son "idénticas" si la secuencia de aminoácidos o nucleótidos de las dos secuencias es la misma cuando se alinean para una correspondencia máxima como se describe a continuación. El porcentaje de identidad de secuencia (o grado de identidad) se determina comparando dos secuencias óptimamente alineadas en una ventana de comparación, donde la parte del péptido o secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, 15 huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que se produce el resto de aminoácido idéntico o la base de ácido nucleico en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de 20 identidad de secuencia.

La alineación óptima de las secuencias para comparación se puede realizar mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Ad. App. Math 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante la búsqueda del método de similitud de Pearson y 25 Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 85: 2444 (1988), mediante LA implementación computarizada de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA del paquete informático de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis.) o mediante examen visual.

La definición de identidad de secuencia dada anteriormente es la definición que usaría un experto en la materia. La 30 definición en sí misma no necesita la ayuda de ningún algoritmo, solo siendo dichos algoritmos útiles para lograr las alineaciones óptimas de las secuencias, en lugar del cálculo de la identidad de la secuencia.

A partir de la definición dada anteriormente, se deduce que existe un único y bien definido valor para la identidad de secuencia entre dos secuencias comparadas cuyo valor corresponde al valor obtenido para la alineación mejor u 35 óptima.

Hibridación rigurosa: por hibridación en condiciones de rigurosidad con una secuencia de nucleótidos se entiende una hibridación en condiciones de temperatura y fuerza iónica seleccionadas de manera que permiten el mantenimiento de la hibridación entre dos fragmentos de moléculas de ácido nucleico complementarias. 40

Los homólogos de los nuevos genes descritos en el presente documento obtenidos de otros organismos, por ejemplo, de plantas, pueden obtenerse explorando las bibliotecas apropiadas que incluyen los homólogos, de modo que la exploración se realiza con la secuencia de nucleótidos de los genes específicos de la invención, o partes o sondas de la misma, o se identifica mediante la búsqueda de homología de secuencia usando programas de 45 búsqueda de alineación de secuencia tales como BLAST o FASTA.

El aislamiento y la clonación de ácidos nucleicos están bien establecidos. De forma similar, se puede insertar un gen aislado en un vector y transformarse en una célula mediante técnicas convencionales que son conocidas por los expertos en la materia. Las moléculas de ácido nucleico pueden transformarse en un organismo. Como se conoce 50 en la técnica, hay varias formas en que los genes, los vectores, las construcciones y los sistemas de expresión pueden introducirse en organismos, y se ha integrado una combinación de técnicas de transformación y cultivo de tejidos se con éxito en estrategias efectivas para crear organismos transgénicos. Estos métodos, que pueden usarse en la invención, se han descrito en otra parte (Potrykus I (1991) “Gene transfer to plants: Assessment of published approaches and results”. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 205-225; Vasil I. K. (1994) “Molecular 55 improvement of cereals”. Plant Mol. Biol. 25: 925-937. Walden R, Wingender R (1995) “Gene-transfer and plant regeneration techniques”. Trends in Biotechnology 13: 324-331; Songstad D. D., Somers D. A., Griesbach R. J. (1995) “Advances in alternative DNA delivery techniques”. Plant Cell Tissue Organ Cult. 40:1-15), y son muy conocidos por los expertos en la materia.

60

Los vectores adecuados son bien conocidos por los expertos en la materia y se describen en referencias técnicas generales tales como Pouwels et al., “Cloning Vectors. A Laboratory Manual”, Elsevier, Amsterdam (1986). Los vectores particularmente adecuados incluyen los vectores de plásmido Ti. Por ejemplo, un experto en la materia sabrá sin duda que, además de la transformación mediada por Agrobacterium de Arabidopsis mediante infiltración al vacío (Bechtold N., Ellis J., Pelletier G. (1993) en “planta Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult 65 Arabidopsis thaliana plants”. C. R. Acad Sci Paris, Sciences de la vie/Life sciences 316: 1194-1199) o la inoculación

en heridas (KatavicV, Haughn G. W., Reed D., Martin M., Kunst L. (1994) en “planta transformation of Arabidopsis thaliana”. Mol. Gen. Genet. 245: 363-370), es igualmente posible transformar otras especies de plantas, usando la transformación mediada por el plásmido Ti de Agrobacterium (por ejemplo, hipocotilo (DeBlock M., DeBrouwer D., Tenning P. (1989) “Transformation of Brassica napus and Brassica oleracea using Agrobacterium tumefaciens and the expression of the bar and neo genes in the transgenic plants”. Plant Physiol. 91: 694-701) o peciolo cotiledonar 5 (Moloney M. M., Walker J. M., Sharma K. K. (1989) “High efficiency transformation of Brassica napus using Agrobacterium vectors”. Plant Cell Rep. 8: 238-242) infección de heridas, métodos de bombardeo de partículas/biolísticos (Sanford J. C., Klein T. M., Wolf E. D., Allen N. (1987) “Delivery of substances into cells and tissues using a particle bombardment process”. J. Part. Sci. Technol. 5: 27-37) o con métodos de transformación de protoplastos asistidos por polietilenglicol (Rhodes C. A., Pierce D. A., Mettler I. J., Mascarenhas D., Detmer J. J. 10 (1988) “Genetically transformed maize plants from protoplasts”. Science 240: 204-207).

Como también será evidente para los expertos en la materia, y como se describe en otra parte (Meyer P. (1995) “Understanding and controlling transgene expression”. Trends in Biotechnology 13: 332-337; Datla R., Anderson J. W., Selvaraj G. (1997) “Plant promoters for transgene expression”. Biotechnology Annual Review 3: 269-296), es 15 posible utilizar promotores enlazados operativamente a la molécula de ácido nucleico para dirigir cualquier regulación deseada por aumento o por disminución de la expresión transgénica usando promotores no regulados (es decir, constitutivos) (por ejemplo, los basados en CaMV35S) o mediante el uso de promotores que pueden dirigir la expresión génica a determinadas células, tejidos (por ejemplo, promotor de napina para la expresión de transgenes en cotiledones de semillas en desarrollo), órganos (por ejemplo, raíces), a una determinada etapa de desarrollo o en 20 respuesta a un determinado estímulo externo (por ejemplo, choque térmico).

Los promotores de uso en la invención pueden ser inducibles, constitutivos o específicos de tejido o tener diversas combinaciones de dichas características. Los promotores útiles incluyen, pero sin limitación, promotores constitutivos tales como el promotor del virus del anillo grabado del clavel (CERV), el promotor 35S del virus del 25 mosaico de la coliflor (CaMV) o, más particularmente, el promotor del virus del mosaico de la coliflor doble mejorado, que comprende dos promotores 35S de CaMV en tándem (denominado promotor "doble 35S"). En ciertos casos, puede ser deseable usar un promotor específico de tejido o regulado por el desarrollo en lugar de un promotor constitutivo. Un promotor específico de tejido permite la sobreexpresión en ciertos tejidos sin afectar a la expresión en otros tejidos. 30

Las regiones reguladoras de promotor y de terminación serán funcionales en la célula hospedadora y pueden ser heterólogas (es decir, no naturales) u homólogas (derivadas de la especie hospedadora) a la célula y al gen.

La región reguladora de la terminación puede derivarse de la región 3' del gen del que se obtuvo el promotor o de 35 otro gen. Las regiones de terminación adecuadas que se pueden usar son bien conocidas en la técnica e incluyen el terminador de la nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (Tnos), el terminador de la mannopina sintasa de A. tumefaciens (Tmas) y el terminador 35S de CaMV (T35S). Las regiones de terminación particularmente preferidas para su uso en la presente invención incluyen la región de terminación de la subunidad pequeña de ribulosa bisfosfato carboxilasa de guisante (TrbcS) o la región de terminación de Tnos. Las construcciones génicas para su 40 uso en la invención se pueden examinar adecuadamente para determinar su actividad mediante, por ejemplo, la transformación en una planta hospedadora a través de Agrobacterium y la exploración de los niveles de cannabinoides alterados.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención, o los fragmentos de las mismas, se pueden usar para bloquear la 45 biosíntesis de cannabinoides en organismos que producen de manera natural compuestos cannabinoides. El silenciamiento usando una molécula de ácido nucleico de la invención se puede realizar de una serie de formas conocidas en general en la técnica, por ejemplo, técnicas de interferencia de ARN (ARNi), técnicas de microARN artificiales, técnicas de silenciamiento génico inducido por virus (VIGS), técnicas antisentido, técnicas de cosupresión sentido y técnicas de mutagénesis dirigida. 50

Las técnicas de ARNi implican una transformación estable usando construcciones de plásmidos de interferencia de ARN (ARNi) (Helliwell C. A., Waterhouse P. M. (2005) “Constructs and methods for hairpin RNA-mediated gene silencing in plants”. Methods Enzymology 392:24-35). Dichos plásmidos se componen de un fragmento del gen diana que se silenciará en una estructura de repetición invertida. Las repeticiones invertidas están separadas por un 55 espaciador, a menudo un intrón. La construcción de ARNi impulsada por un promotor adecuado, por ejemplo, el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), se integra en el genoma de la planta, y la posterior transcripción del transgén conduce a una molécula de ARN que se repliega para formar un ARN bicatenario de horquilla. Esta estructura de ARN bicatenario es reconocida por la planta y cortada en ARN pequeños (de aproximadamente 21 nucleótidos de longitud) denominados ARN interferentes pequeños (ARNip). Los ARNip se 60 asocian con un complejo de proteína (RISC) que pasa a la degradación directa del ARNm para el gen diana.

Las técnicas de microARN artificial (miARNa) aprovechan la vía de microARN (miARN) que funciona para silenciar genes endógenos en plantas y otros eucariotas (Schwab R., Ossowski S., Riester M., Warthmann N., Weigel D. (2006) “Highly specific gene silencing by artificial microRNAs in Arabidopsis”. Plant Cell 18:1121-33; Alvarez J. P., 65 Pekker I., Goldshmidt A., Blum E., Amsellem Z., Eshed Y. (2006) “Endogenous and synthetic microRNAs stimulate

simultaneous, efficient, and localized regulation of multiple targets in diverse species”. Plant Cell 18:1134-51). En este método, se introducen fragmentos de 21 nucleótidos de largo del gen que se va a silenciar en un gen pre-miARN para formar una construcción de pre-miARNa. La construcción de pre-miARNa se transfiere al genoma del organismo usando métodos de transformación que serían evidentes para un experto en la materia. Después de la transcripción del pre-miARNa, el procesamiento produce miARNa que se dirigen a genes que comparten la identidad 5 de los nucleótidos con la secuencia de 21 nucleótidos de miARNa.

En las técnicas de silenciamiento de ARNi, dos factores pueden influir en la elección de la longitud del fragmento. Cuanto más corto sea el fragmento, menos eficaz será el silenciamiento, pero las horquillas muy largas aumentan la posibilidad de recombinación en cepas bacterianas del hospedador. La efectividad del silenciamiento también 10 parece ser dependiente del gen y podría reflejar la accesibilidad del ARNm diana o las abundancias relativas del ARNm diana y el ARN en horquilla en las células en las que el gen está activo. En general, es adecuada una longitud de fragmento de entre 100 y 800 pb, preferentemente de entre 300 y 600 pb, para aumentar al máximo la eficacia del silenciamiento obtenido. La otra consideración es la parte del gen que se va a dirigir. Se pueden usar fragmentos de UTR 5', región de codificación y UTR 3' con resultados igualmente buenos. Como el mecanismo de 15 silenciamiento depende de la homología de secuencia, existe la posibilidad del silenciamiento cruzado de secuencias de ARNm relacionadas. Cuando esto no sea deseable, se debe escoger una región con baja similitud de secuencia con otras secuencias, tales como una UTR 5' o 3'. La regla para evitar el silenciamiento de homología cruzada parece ser el uso de secuencias que no tengan bloques de identidad de secuencia de más de 20 bases entre la construcción y las secuencias de genes no diana. Muchos de estos mismos principios se aplican a la 20 selección de regiones diana para diseñar los miARNa.

Las técnicas de silenciamiento génico inducido por virus (VIGS) son una variación de las técnicas de ARNi que aprovecha las defensas antivíricas endógenas de las plantas. La infección de plantas con virus de VIGS recombinantes que contienen fragmentos de ADN del hospedador conduce al silenciamiento génico posterior a la 25 transcripción para el gen diana. En una realización, se puede usar un sistema de VIGS basado en el virus del cascabeleo del tabaco (TRV) con las secuencias de nucleótidos de la presente invención.

Las técnicas antisentido implican la introducción en una planta de un oligonucleótido antisentido que se unirá al ARN mensajero (ARNm) producido por el gen de interés. El oligonucleótido "antisentido" tiene una secuencia de bases 30 complementaria al ARN mensajero (ARNm) del gen, que se denomina secuencia "sentido". La actividad del segmento sentido del ARNm está bloqueada por el segmento de ARNm antisentido, lo que inactiva eficazmente la expresión génica. La aplicación del antisentido al silenciamiento génico en plantas se ha descrito con más detalle por Stam M., de Bruin R., van Blokland R., van der Hoorn R. A., Mol J. N., Kooter J. M. (2000) “Distinct features of post-transcriptional gene silencing by antisense transgenes in single copy and inverted T-DNA repeat loci”. Plant J. 35 21:27-42.

Las técnicas de cosupresión sentido implican la introducción de un transgén sentido altamente expresado en una planta que produce una expresión reducida de tanto el transgén como del gen endógeno (Depicker A., Montagu M. V. (1997) “Post-transcriptional gene silencing in plants”. Curr Opin Cell Biol. 9: 373-82). El efecto depende de la 40 identidad de secuencia entre el transgén y el gen endógeno.

Las técnicas de mutagénesis dirigida, por ejemplo, TILLING (Inducción Dirigida de Lesiones Locales en el Genoma) y de “eliminación de un gen" usando el bombardeo de neutrones rápidos, pueden usarse para desactivar la función del gen en un organismo (Henikoff S., Till B. J., Comai L. (2004) “TILLING. Traditional mutagenesis meets functional 45 genomics”. Plant Physiol 135:630-6; Li X., Lassner M., Zhang Y. (2002) “Deleteagene: a fast neutron deletion mutagenesis-based gene knockout system for plants”. Comp Funct Genomics. 3: 158-60). El TILLING implica el tratamiento del germoplasma o células individuales con un mutágeno para causar mutaciones puntuales que luego se descubren en genes de interés usando un método sensible para la detección de mutaciones de un solo nucleótido. La detección de las mutaciones deseadas (por ejemplo, mutaciones que dan lugar a la inactivación del 50 producto génico de interés) se puede realizar, por ejemplo, mediante métodos de PCR. Por ejemplo, se pueden preparar cebadores oligonucleotídicos derivados del gen de interés y se puede usar la PCR para amplificar regiones del gen de interés de organismos en la población mutagenizada. Los genes mutantes amplificados pueden hibridarse a genes de tipo silvestre para encontrar los desapareamientos entre los genes mutantes y los genes de tipo silvestre. Las diferencias detectadas pueden rastrearse hasta el organismo que tenía el gen mutante, revelando 55 de ese modo qué organismo mutagenizado tendrá la expresión deseada (por ejemplo, el silenciamiento del gen de interés). Estos organismos se pueden criar luego selectivamente para producir una población que tenga la expresión deseada. El TILLING puede proporcionar una serie alélica que incluya mutaciones sin sentido y desactivadas, que presenten una expresión reducida del gen diana. El TILLING se promociona como un posible enfoque para la desactivación de genes que no implica la introducción de transgenes y, por lo tanto, puede ser más aceptable para 60 los consumidores. El bombardeo de neutrones rápidos induce mutaciones, es decir, eliminaciones, en genomas de organismos que también se pueden detectar usando PCR de una manera similar a la TILLING.

Los expertos en la materia entenderán que los procesos desvelados también se pueden llevar a cabo en un entorno libre de células en presencia de uno o más ácidos carboxílicos. 65

Las realizaciones de la invención son susceptibles de diversas modificaciones y formas alternativas además de los ejemplos específicos incluidos en el presente documento. Por lo tanto, las realizaciones de la invención no se limitan a las formas particulares desveladas.

Ejemplos 5

Ejemplo 1: Amplificación y clonación de CsHCS1 y CsHCS2

Se amplificaron CsHCS1 y CsHCS2 por PCR a partir de clones plasmídicos de ADNc usando los cebadores enumerados en la Tabla 3 y la polimerasa Phusion™ (Finnzymes). Los productos de PCR se purificaron y se 10 clonaron en el vector de entrada pCR8/GW/TOPO (Invitrogen). Después de la transformación en células TOP10 de E. coli (Invitrogen), se verificaron los clones individuales mediante secuenciación. Los genes CsHCS1 y CsHCS2 se recombinaron en el vector de destino pHIS8/GW usando LR recombinasa (Invitrogen). Los productos de reacción de LR se transformaron en células TOP10 y se verificaron mediante secuenciación.

15

Tabla 3: Oligonucleótidos

Nombre

Secuencia (5’-3’)

CsHCS1 directo (SEQ ID NO: 5)

ATGGGTAAGAATTACAAGTCCCT

CsHCS1 inverso (SEQ ID NO: 6)

GAGCTCTCATTCAAAGTGAGAAAATTGCTG

CsHCS2 directo (SEQ ID NO: 7)

ATGGAGAAATCTGGGTATGGAAG

CsHCS2 inverso (SEQ ID NO: 8)

TCACATGTTGGAGCGTACTTTC

MCS directo (SEQ ID NO: 9)

ATGAGCAACCATCTTTTCGACG

MCS inverso (SEQ ID NO: 10)

TTACGTCCTGGTATAAAGATCGGC

Se transformaron pHIS8/GW-CsHCS1 y pHIS8/GW-CsHCS2 en células Rosetta 2 de E. coli (Merck). Se usaron colonias individuales para inocular cultivos a pequeña escala de medio líquido LB que contenía cloranfenicol y kanamicina, que se usaron para inocular 500 ml de medio líquido LB sin antibióticos. Tras el crecimiento a DO600 de 20 0,6, se indujo la expresión mediante la adición de IPTG a 0,2 μΜ. A continuación, se cultivaron los cultivos con expresión de CsHCS1 a 12 ºC con agitación durante 24 h, mientras que los cultivos de CsHCS2 se cultivaron a 37 ºC durante 16 h. Se usaron diferentes temperaturas, porque se observó que CsHCS1 no producía proteína soluble a la temperatura más alta.

25

Se recogieron las células por centrifugación y se volvieron a suspender en 10 ml de tampón de lisis marcado con His (Tris-HCl 50 mM, pH 7, NaCl 500 mM, imidazol 2,5 mM, glicerol al 10 % v/v, β-mercaptoetanol 10 mM, Tween ™ 20 al 1 % v/v y 750 µg/ml de lisozima). Se incubaron las células resuspendidas en hielo durante 1 h y luego se lisaron mediante ultrasonidos. Tras la centrifugación durante 20 min a 12.000 g a 4 ºC, se añadió la fracción de proteína soluble a 160 μl de resina Talon™ (Clontech) que se había lavado previamente con tampón de lavado marcado con 30 His (HWB; Tris-HCl 50 mM pH 7, NaCl 500 mM, imidazol 2,5 mM, glicerol al 10 %, β-mercaptoetanol 10 mM). Se incubaron las muestras con balanceo suave a 4 ºC, tras el que se aisló la resina por centrifugación (700 g durante 5 min). Se volvió a suspender la resina en tampón HWB y se lavó con agitación suave a 4 ºC y luego se centrifugó. Se repitió la etapa de lavado dos veces y se cargó la resina resuspendida en una columna de cromatografía y se dejó drenar. Tras lavar la resina con 10 ml de tampón HWB, se eluyeron las proteínas marcadas con His mediante la 35 adición de 2,5 ml de tampón de elución marcado con His (Tris-HCl 50 mM, pH 7, NaCl 500 mM, imidazol 250 mM, glicerol al 10 % v/v, β-mercaptoetanol 10 mM). Se intercambiaron las fracciones eluidas en tampón de almacenamiento (HEPES 50 mM, pH 9, glicerol al 10 % v/v, MgCl2 2 mM y ditiotreitol 2 mM) usando columnas PD10 (Amersham Biosciences). Se verificó la pureza de las proteínas aisladas mediante SDS-PAGE, y se determinó la concentración de proteína mediante el ensayo de Bradford. 40

Ejemplo 2: Análisis de la actividad de Hexanoil-CoA sintetasa

Se midió la actividad de Hexanoil-CoA sintetasa incubando 0,1 µg de enzima en una mezcla de reacción de 20 µl que contenía HEPES 50 mM, pH 9, ATP 8 mM, MgCl2 10 mM, CoA 0,5 mM y hexanoato de sodio 4 mM. Las 45 reacciones se incubaron durante 10 min a 40 ºC, se terminaron con 2 µl de HCl 1 N y se almacenaron en hielo hasta el análisis.

Se diluyeron las mezclas de reacción 1:100 con agua y posteriormente se separaron usando un sistema Acquity UPLC de Waters dotado de una columna Acquity UPLC BEH C18 (1,7 μm de tamaño de partícula, columna de 2,1 x 50 50 mm) y se analizaron por MS/MS usando un espectrómetro de masas de triple cuadrúpolo Quattro Ultima de Micromass. El sistema disolvente usado era tampón A: TEA 5 mM y ácido acético 3 mM en agua, y tampón B: TEA 5 mM y ácido acético 3 mM en metanol:agua 95:5. El programa de flujo se muestra en la Tabla 4. Los ajustes del espectrómetro de masas fueron: ESI en modo positivo, energía de colisión de 27 V, cono de 135 V, exploración para

transiciones de 866 > 359.

Tabla 4. Programa de flujo para la cromatografía líquida

Tiempo

Caudal % de A % de B

(min)

(ml/min)

0

0,2 94,7 5,3

1

0,2 94,7 5,3

6

0,2 85,0 15,0

10

0,2 0,1 50,0

21

0,2 0,1 99 9

22

0,8 0,1 99,9

24

0,8 0,1 99,9

24,1

0,4 94,7 5,3

27

0,4 94,7 5,3

27,1

0,2 94,7 5,3

Como se muestra en la Figura 2, CsHCS1 y CsHCS2 catalizaron la formación de hexanoil-CoA a partir de hexanoato 5 y CoA. Las Figuras 2A y 2B muestran la elución del patrón auténtico de hexanoil-CoA. La Figura 2C muestra un ensayo completo que comprende CsHCS1, HEPES 50 mM, pH 9, ATP 8 mM, MgCl2 10 mM, CoA 0,5 mM y hexanoato de sodio 4 mM. Se puede observar un compuesto con las mismas transiciones de masa y el mismo tiempo de elución que el patrón auténtico de hexanoil-CoA a los 9,25 minutos. La Figura 2D muestra un ensayo completo que comprende CsHCS2, HEPES 50 mM, pH 9, ATP 8 mM, MgCl2 10 mM, CoA 0,5 mM y hexanoato de 10 sodio 4 mM. Se puede observar un compuesto con las mismas transiciones de masa y el mismo tiempo de elución que el patrón auténtico de hexanoil-CoA a los 9,25 minutos. Las Figuras 2E y 2F muestran controles negativos con enzimas CsHCS1 y CsHCS2 inactivadas (hervidas). Como puede verse en las Figuras 2E y 2F, estos ensayos no mostraron síntesis de hexanoil-CoA.

15

Tanto CsHCS1 como CsHCS2 presentaron temperatura y pH óptimos de 40 ºC y pH 9, respectivamente. Al ensayar una selección de cationes divalentes, CsHCS1 usó Mg2+ de manera óptima y, en menor medida, Mn2+ y Co2+. La actividad de CsHCS2 fue la más alta usando Co2+, pero también se observó que era alta con Mg2+, Mn2+ y, en menor medida, Ca2+. La relevancia biológica de la alta actividad con Co2+ no es clara, y se usó Mg2+ para todos los ensayos adicionales. 20

Con hexanoato, CsHCS1 resultó tener una Km de 6,1 ± 1,0 mM, una Vmáx de 15,6 ± 1,7 pKat y una kcat de 4,5 s-1. CsHCS2 resultó tener una Km de 320 mM, una Vmáx de 1,7 pKat y una kcat de 57,6 s-1.

Ejemplo 3: Ensayo con diferentes ácidos carboxílicos 25

Para ensayar el intervalo de ácidos carboxílicos que CsHCS1 y CsHCS2 pueden activar, se realizaron ensayos enzimáticos con una amplia selección de ácidos carboxílicos y ATP limitante. Las condiciones de ensayo usadas fueron similares a las de Schneider K et al. (2005). “A new type of peroxisomal acyl-coenzyme A synthetase from Arabidopsis thaliana has the catalytic capacity to activate biosynthetic precursors of jasmonic acid”. The Journal of 30 Biological Chemistry, 280:13962-72. En resumen, se incubó la enzima HCS purificada (1 µg) con sustrato de ácido carboxílico 500 μΜ y CoA 100 μΜ en un ensayo que contenía HEPES 100 mM, pH 9, MgCl2 250 μΜ, ATP 50 μΜ y DTT 1 mM. Se disolvieron todos los sustratos de ácido carboxílico en Triton™ X-100 al 2 % v/v, lo que condujo a una concentración final de Triton X-100 al 0,05 % en el ensayo. Tras reaccionar durante 3 h a 29 ºC, se transfirieron 10 μl de alícuotas de las reacciones a placas de 96 pocillos para una medición basada en luciferina/luciferasa de ATP 35 no consumido. Se analizaron las placas con un contador 1420 Multilabel (PerkinElmer). A cada pocillo, se inyectaron 90 μΙ de una solución que contenía Tris 100 mM, pH 7,8, MgCl2 1 mM, 2,3 μg de luciferina y 0,5 μg de luciferasa, y después de agitar durante 2 segundos, se midió la luminiscencia durante 15 segundos sin filtro en su lugar. Las lecturas más bajas, en comparación con las reacciones sin sustrato de ácido carboxílico, indican una mayor cantidad de actividad enzimática y, por lo tanto, de utilización del sustrato. Los resultados se muestran en la Figura 3, en la 40 que las barras de error representan el porcentaje de error de la proporción, n = 3.

Como se muestra en la Figura 3A, se observó que CsHCS1 utiliza hexanoato (seis átomos de carbono), octanoato (ocho átomos de carbono) y nonanoato (nueve átomos de carbono) y, en menor medida, valerato (cinco átomos de carbono) y heptanoato (siete átomos de carbono), como sustratos. Por el contrario, como se muestra en la Figura 45 3B, CsHCS2 presentó una mayor promiscuidad, y es capaz de utilizar una amplia selección de sustratos, que varían

desde propanoato (C3) a araquidoato (C20), y una serie de fenilpropanoides (cinamato, ferulato, y en menor medida, p-coumarato).

En un experimento separado, se midieron las propiedades cinéticas de CsHCS1 y CsHCS3 con mayor precisión para CoA y ácidos grasos representativos de cadena corta (butanoato), media (hexanoato y decanoato) y larga 5 (palmitato) (Tabla 5). Las altas concentraciones de CoA inhibieron CsHCS1. Usando un modelo de inhibición de sustrato de regresión no lineal, se estimó que CsHCS1 era 5,101 ± 1,8 mM. CoA no inhibió CsHCS2 a las concentraciones ensayadas. El ácido decanoico inhibió CsHCS2 (Ki = 120,8 ± 47,9 μΜ) e inhibió ligeramente CsHCS1 a concentraciones superiores a 4 mM (Ki, no medida). Estos datos muestran las mismas tendencias que los datos cinéticos presentados anteriormente. 10

Tabla 5. Propiedades cinéticas de CsHCS1 y CsHCS2

Sustrato

CsHCS1 CsHCS2

Km Vmáx (pKat) Km Vmáx (pKat) kcat (s-1)

CoA

0,26 ± 0,05 µM - 0,16 ± 0,01 µM - -

butanoato

>10 mM - >10 mM - -

hexanoato

3,7 ± 0,7 mM 6,8 ± 0,7 261 ± 37 µM 1,8 ± 0,05 57,6

decanoato

1,7 ± 0,2mM 1,8 ± 0,7 16,1 ± 5,8 µM 1,6 ± 0,1 10,0

palmitato

n.d.a - 1,3 ± 0,5 µM 0,4 ± 0,01 2,4

a no determinada debido a la falta de actividad catalítica

Ejemplo 4: Síntesis del ácido olivetólico usando CsHCS2

15

Se usó CsHCS2 para la síntesis quimioenzimática del policétido aromático ácido olivetólico. El ácido olivetólico es el primer precursor que se ve comprometido para la biosíntesis de los cannabinoides. Esta síntesis in vitro hizo uso de cuatro enzimas recombinantes: CsHCS2, malonil-CoA sintetasa (MCS) de Rhizobium leguminosarum, "olivetol sintasa”/policétido sintasa de cannabis y ácido olivetólico sintasa de cannabis.

20

Se amplificó la Malonil-CoA sintetasa (MCS) a partir del ADN genómico de Rhizobium leguminosarum con los cebadores MCS directo y MCS inverso (véase la Tabla 3). El producto de la PCR se clonó en el vector pCR8/GW/TOPO (Invitrogen) recombinado en el vector pHIS8/GW. Tras la verificación por secuenciación, se transformó el plásmido en Rosetta II (DE3) de E. coli. El MCS recombinante se expresó y se purificó como se describe para las enzimas CsHCS. 25

La clonación, expresión y purificación de "olivetol sintasa"/policétido sintasa y la ácido olivetólico sintasa se realizaron de la siguiente manera. Para la expresión en células de E. coli, se amplificaron los marcos de lectura abiertos de policétido sintasa/olivetol sintasa y la ácido olivetólico sintasa por PCR, se clonaron en pHIS8/GW para policétido sintasa/olivatol sintasa o pET100 (Invitrogen) para la ácido olivetólico sintasa y se transformaron en BL21 30 de E. coli (DE3) (Invitrogen). La clonación se verificó por secuenciación.

La ácido olivetólico sintasa se expresó en 200 ml de cultivo de caldo Terrific, mientras que la policétido sintasa/olivetol sintasa creció en un cultivo de 1 l. Se incubaron ambos cultivos a 30 ºC/150 rpm con agitación, se indujeron con IPTG 0,5 µM y se cultivaron durante la noche. Se centrifugaron los cultivos a 16.000 g durante 20 35 minutos y se lisaron los sedimentos mediante tratamiento con lisozima y ultrasonidos. Se mezclaron los lisados clarificados con resina de Talon (200 µl para la ácido olivetólico sintasa, 1 ml para la policétido sintasa/olivetol sintasa; Clontech), se lavaron con 5 ml de tampón de lavado marcado con His (Tris-HCl 50 mM (pH 7), NaCl 150 mM, imidazol 20 mM, β-mercaptoetanol 10 mM) y se eluyeron las proteínas recombinantes usando tampón de elución marcado con His (Tris HCl 20 mM (pH 7), NaCl 150 mM, imidazol 100 mM, β-mercaptoetanol 10 mM). Se 40 concentró la fracción eluida usando un concentrador YM10 y se cambió el tampón a tampón de almacenamiento (HEPES 20 mM (pH 7,5), NaCl 25 mM, glicerol al 10 %, DTT 5 mM). Se cuantificaron las soluciones de proteínas finales mediante el uso de un kit de ensayo de proteína RC/DC (Bio-Rad) que encontró concentraciones de proteína de 0,5 mg/ml (ácido olivetólico sintasa) y 5,6 mg/ml (policétido sintasa/olivatol sintasa). El análisis en gel de SDS-PAGE confirmó la pureza de ambas proteínas. 45

Se ensayó la capacidad de unir la síntesis de hexanoil-CoA con la síntesis de policétido aromático usando reactivos de bajo coste realizando ensayos enzimáticos que consistían en hexanoato 4 mM, malonato 8 mM, CoA 0,4 mM, ATP 0,4 mM, MgCl2 5 mM, DTT 2 mM, HEPES 20 mM, pH 7,5, 0,3 µg de CsHCS2, 12 µg de MCS, 8 µg de "olivetol sintasa"/PKS y 10 µg de OAS. La reacción se incubó a temperatura ambiente durante 16 h, se acidificó y se extrajo 50 en acetato de etilo. La fracción polar se recuperó, se evaporó a sequedad y se volvió a suspender en 50 µl de metanol. Se analizó una alícuota (5 μΙ) mediante LCMS, y los productos se identificaron por sus tiempos de retención y masas (véase la Figura 4).

Ejemplo 5: Síntesis del ácido olivetólico en levadura usando CsHCS1 y CsHCS2

Se diseñó levadura (Saccharomyces cerevisiae) para producir ácido olivetólico usando CsHCS1 y CsHCS2 para sintetizar hexanoil-CoA, y una fusión de la "olivetol sintasa"/policétido sintasa (PKS) y la ácido olivetólico sintasa (OAS) de cannabis para formar ácido olivetólico. 5

Se clonó OAS en fase con la "olivetol sintasa"/PKS usando una secuencia enlazadora sintética codificante de los aminoácidos AATSGSTGSTGSTGSGRSTGSTGSTGSGRSHMV (SEQ ID NO: 11) en el vector de expresión de levadura pESC-Trp (Stratagene) bajo el control del promotor GAL10. El marco de lectura abierto de CsHCS1 se clonó en el vector de expresión de levadura pYESDEST52-Ura (Invitrogen) usando la tecnología Gateway. El marco 10 de lectura abierto de CsHCS2 se clonó en el vector de expresión de levadura pesca-Trp (Stratagene) bajo el control del promotor GAL1.

Se transformaron células de levadura (InVSc I, Invitrogen) con las construcciones anteriores (OAS: fusión de "olivetol sintasa”/PKS sola; OAS: fusión de "olivetol synthase"/PKS y CsHCS1; OAS: fusión de "olivetol sintasa"/PKS y 15 CsHCS2), y se cultivaron los transformantes en una placa de SD-Trp durante 3 días a 28 ºC. Para cada una, se inoculó una sola colonia en 3 ml de medio de glucosa SD-Trp y se incubó con agitación a 28 ºC durante 2 días. Se usó una alícuota de 0,5 ml de cultivo iniciador para inocular 10 ml de medio de SD-Trp galactosa que contenía hexanoato sódico 1 mM y se incubó a 20 ºC durante 4 días. Se extrajo el cultivo completo con acetato de etilo, se secó y se volvió a suspender el residuo en 100 µl de acetonitrilo al 30 %/agua al 70 %/ácido fórmico al 0,05 %. Los 20 productos se analizaron usando LCMS (véase la Figura 5).

Ejemplo 6: papel de CsHSC1 y CsHSC2 en la biosíntesis de cannabinoides en plantas

A través de un análisis basado en secuencias del conjunto de datos EST de tricoma y el ensayo bioquímico de cinco 25 AAE, se identificaron dos que poseían actividad de hexanoil-CoA sintetasa (CsHSC1 y CsHSC2). Para determinar cuál de estos es probable que participe en la vía biosintética de los cannabinoides, se realizaron experimentos de qRT-PCR y de localización subcelular.

qRT-PCR de la expresión de CsHSC1 y CsHSC2 30

Se cultivaron plantas de “Finola'” desde la etapa de siembra hasta la mitad de la floración. Se tomaron muestras de las raíces, los tallos, las hojas, las flores femeninas (con tricomas y después del aislamiento de los tricomas usando el Beadbeater), células de tricomas y flores masculinas de tres plantas. Se aisló ARN total como se ha descrito anteriormente. El ARN tenía una Abs260: Abs280 de > 1,9 y mostró bandas ribosomales distintas en el gel 35 desnaturalizante. El ADNc de la primera hebra se sintetizó usando ARN 0,5 µg con un kit de síntesis de ADNc QuantiTect (Qiagen). Se diluyó cada muestra de ADNc de 20 μΙ 1:4 con agua, y se usó 1 μl como molde de PCR. Se diseñaron cebadores específicos de los genes para producir amplicones de 90-200 pb. Se realizaron reacciones de PCR (20 μΙ) en placas de 96 pocillos usando un ensayo basado en SYBR Green (kit QuantiFast SYBR Green, Qiagen) con un instrumento StepOne Plus (Applied Biosystems). Los parámetros de ciclado usados fueron 95 ºC 40 durante 5 min seguidos de 40 ciclos de 95 ºC durante 10 s, 60 ºC durante 30 s, y un protocolo de disociación convencional (95 ºC 15 s, 60 ºC durante 1 min, 60-95 ºC en incrementos de 0,3 ºC durante 15 s). Los experimentos se realizaron usando ADNc de tres plantas con dos repeticiones técnicas. Se usó el gen actina, que resultó tener expresión estable en todos los tejidos ensayados, como gen de referencia. Las eficiencias para todos los pares de cebadores fueron del 90 al 110 % calculadas usando el método de curva patrón. Se calcularon los valores de Ct 45 usando el programa informático StepOne (Applied Biosystems). Se usó el método 2-ΔΔCt para el análisis de la expresión génica relativa.

Ubicación subcelular de CsHSC1 y CsHSC2

50

Se construyeron fusiones de YFP:CsHSC1 y de YFP:CsHSC2 por recombinación en pEARLYGATE104 (Earley, K. W., Haag, J. R., Pontes, O., Opper, K., Juehne, T., Song, K. y Pikaard, C. S. (2006). “Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics”. Plant J. 45, 616-629) usando LR recombinasa (Invitrogen). Para generar una construcción de OLS:CFP, se clonó OLS que carecía de un codón de parada en pCR8/GW/TOPO antes de la recombinación en pEARLYGATE102 usando LR recombinasa. El marcador de peroxisoma PX-CK (Nelson, B. K., 55 Cai, X. y Nebenführ, A. (2007). “A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants”. Plant J. 51, 1126-1136) era de ABRC (www.arabidopsis.org). Se transformaron plásmidos en Agrobacterium tumefaciens GV3101 por electroporación y se seleccionaron en placas LB que contenían 10 µg/ml de rifampacina y 50 µg/ml de kanamicina. Se infiltraron hojas de plantas de dos semanas de edad de Nicotiana benthamiana con la solución de Agrobacterium a una DO600 de 0,02 (Sparkes, I. A., Runions, J., 60 Kearns, A. y Hawes, C. (2006). “Rapid, transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants”. Nat. Protocol. 1, 2019-2025). Dos días después de la infiltración, se visualizaron células epidérmicas foliares usando un microscopio confocal Zeiss LSM510. La CFP se visualizó con una excitación de 458 nm y una recogida de imágenes con un filtro de paso de banda de 475-525 nm; la YFP a 514 nm con un filtro de paso de banda de 530-600 nm. Las imágenes se recogieron y se analizaron usando el paquete 65 informático Zeiss LSM.

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una molécula de ácido nucleico aislada o purificada que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 77 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, o una secuencia de nucleótidos degenerada de codón de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, en la que la molécula de ácido nucleico codifica un 5 polipéptido que tiene actividad de hexanoil-CoA sintetasa.
2. 2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3.

   10
3. 3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que la secuencia de nucleótidos es como se expone en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, o una secuencia de nucleótidos degenerada de codón de la misma.
4. 4. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que la secuencia de nucleótidos es como se expone en SEQ ID NO: 1. 15
5. 5. Un polipéptido aislado o purificado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, o una secuencia de aminoácidos sustituida conservativamente de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, en el que el polipéptido tiene actividad de hexanoil-CoA sintetasa. 20
6. 6. Un vector, una construcción o un sistema de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
7. 7. Una célula hospedadora transformada con una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las 25 reivindicaciones 1 a 4.
8. 8. Un proceso de modificación de los niveles de compuestos cannabinoides en un organismo, una célula o un tejido que comprende:

   30

   i) usar la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2, o una parte de la misma, para silenciar, en el organismo, la célula o el tejido, un gen que codifica una enzima que cataliza la síntesis de una hexanoil-CoA, en comparación con un organismo, una célula o un tejido cultivado en condiciones similares, pero sin el uso de la molécula de ácido nucleico para el silenciamiento;

   ii) mutar genes del organismo, la célula o el tejido, y usar la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las 35 reivindicaciones 1 a 4 para seleccionar organismos, células o tejidos que contienen mutantes o variantes de un gen que codifique una enzima que catalice la síntesis de una hexanoil-CoA;

   en el que el organismo, la célula o el tejido de i) e ii) es un organismo de planta de cannabis, una célula de planta de cannabis o un tejido de planta de cannabis;

   iii) expresar o sobreexpresar una molécula de ácido nucleico exógena de una cualquiera de las reivindicaciones 40 1 a 4 en el organismo, la célula o el tejido en comparación con un organismo, una célula o un tejido desarrollado en condiciones similares, pero sin la expresión o sobreexpresión de la molécula de ácido nucleico exógena; o

   iv) expresar o sobreexpresar una molécula de ácido nucleico exógena que codifica el polipéptido de la reivindicación 5 en el organismo, la célula o el tejido en comparación con un organismo, una célula o un tejido desarrollado en condiciones similares, pero sin la expresión o sobreexpresión de la molécula de ácido nucleico 45 exógena;

   en el que el organismo de iii) e iv) es una planta o un microorganismo, en el que la célula de iii) e iv) es de una planta o un microorganismo, y en el que el tejido de iii) e iv) es de una planta.
9. 9. Un proceso de síntesis de una hexanoil-CoA en una reacción libre de células in vitro, comprendiendo dicho 50 proceso hacer reaccionar ácido carboxílico con CoA en presencia del polipéptido de la reivindicación 5, preferentemente en el que el ácido carboxílico tiene de 2 a 10 átomos de carbono.
10. 10. El proceso de la reivindicación 8, comprendiendo dicho proceso:

    55

    iii) expresar o sobreexpresar una molécula de ácido nucleico exógena de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el organismo, la célula o el tejido en comparación con un organismo, una célula o un tejido desarrollado en condiciones similares, pero sin la expresión o sobreexpresión de la molécula de ácido nucleico exógena; o

    iv) expresar o sobreexpresar una molécula de ácido nucleico exógena que codifica el polipéptido de la reivindicación 5 en el organismo, la célula o el tejido en comparación con un organismo, una célula o un tejido 60 desarrollado en condiciones similares, pero sin la expresión o sobreexpresión de la molécula de ácido nucleico exógena; y

    en el que se aumenta el nivel del compuesto cannabinoide.

    65
11. 11. El proceso de la reivindicación 8, comprendiendo dicho proceso:

    i) usar la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2, o una parte de la misma, para silenciar, en el organismo, la célula o el tejido, un gen que codifica una enzima que cataliza la síntesis de una alcanoil-CoA, en comparación con un organismo, una célula o un tejido cultivado en condiciones similares, pero sin el uso de la molécula de ácido nucleico para el silenciamiento; o

    ii) mutar genes en el organismo, la célula o el tejido y usar la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las 5 reivindicaciones 1 a 4 para seleccionar organismos, células o tejidos que contengan mutantes o variantes de un gen que codifique una enzima que catalice la síntesis de una alcanoil-CoA; y

    en el que se reduce el nivel del compuesto cannabinoide.

    10
12. 12. Un proceso de síntesis de un compuesto cannabinoide de origen natural o un análogo no natural de un compuesto cannabinoide en un organismo, una célula o un tejido que comprende introducir y expresar la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el organismo, la célula o el tejido en presencia de un ácido carboxílico y CoA, en el que el organismo es una planta o un microorganismo, en el que la célula es de una planta o de un microorganismo, y en el que el tejido es de una planta. 15
13. 13. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 8, 10 u 11, en el que el organismo es un microorganismo, preferentemente en el que el microorganismo es levadura Saccharomyces cerevisiae o E. coli.
14. 14. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 8, 10, 12 o 13, comprendiendo dicho proceso: 20

    iii) expresar o sobreexpresar una molécula de ácido nucleico exógena de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el organismo, la célula o el tejido en comparación con un organismo, una célula o un tejido desarrollado en condiciones similares, pero sin la expresión o sobreexpresión de la molécula de ácido nucleico exógena; o

    iv) expresar o sobreexpresar una molécula de ácido nucleico exógena que codifica el polipéptido de la 25 reivindicación 5 en el organismo, la célula o el tejido en comparación con un organismo, una célula o un tejido desarrollado en condiciones similares, pero sin la expresión o sobreexpresión de la molécula de ácido nucleico exógena; y

    en el que la molécula de ácido nucleico se expresa o sobreexprese en combinación con la expresión o 30 sobreexpresión de ácidos nucleicos que codifican enzimas en una vía biosintética de cannabinoides.
15. 15. El proceso de la reivindicación 14, en el que las enzimas de la vía biosintética de cannabinoides son una ácido olivetólico sintasa, una policétido sintasa de tipo III, una policétido ciclasa y una oxidocilasa formadora de cannabinoides, opcionalmente, en la que las enzimas de la vía biosintética de cannabinoides son olivetol sintasa, 35 una policétido ciclasa, una geranilpirofosfato:olivetolato geraniltransferasa, una ácido Δ9-tetrahidrocannabinólico sintasa, una ácido cannabidiólico sintasa o una ácido cannabicroménico sintasa.
16. 16. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 8 o 10 a 15, en el que el compuesto cannabinoide es uno o más de ácido cannabigerólico, ácido Δ9-tetrahidrocannabinólico, ácido cannabidiólico, ácido cannabicroménico, Δ9-40 tetrahidrocannabinol, cannabidiol o cannabicromeno, o un análogo de compuesto cannabinoide del mismo que comprende una cadena lateral de 1 a 9 átomos de carbono de longitud.