JP2007020466A - 大麻CannabissativaL.の識別方法 - Google Patents

大麻CannabissativaL.の識別方法 Download PDF

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俊哉 村中
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Abstract

【課題】 ファイバータイプ大麻とドラッグタイプ大麻との迅速な識別法を提供すること。
【解決手段】 ドラッグタイプ大麻(Cannabis sativa L.)におけるtetrahydrocannabinolic acid(THCA)生合成酵素遺伝子又はファイバータイプ大麻(Cannabis sativa L.)におけるtetrahydrocannabinolic acid(THCA)生合成酵素様遺伝子中の連続する10〜100塩基からなる塩基配列又はそのアンチセンス配列からなるオリゴヌクレオチドであって、当該遺伝子の多型部位を少なくとも1個以上含むオリゴヌクレオチド。
【選択図】 なし

Description

本発明は、大麻Cannabis sativa L.の“ドラッグタイプ”と“ファイバータイプ”におけるtetrahydrocannabinolic acid(THCA)生合成酵素遺伝子のDNA多型、並びに上記多型の検出を用いた大麻Cannabis sativa L.のタイプの識別方法に関する。
大麻(アサ,Cannabis sativa L.)はアサ科の一年生草本で,繊維や油をとるために古くから栽培されている。しかしながら含有成分が麻酔性を有するため、その取り扱いは多くの国々で法律の規制を受けている。未熟花や葉からハシッシュやマリファナと呼ばれる幻覚物質が得られる。その麻酔性化学成分は数十種類にのぼるカンナビノイド類化合物である。特に麻酔性の高い成分がtetrahydrocannabinol(THC)である(THCは植物体中では通常酸化されたtetrahydrocannabinolic acid(THCA)の状態にあるため以後THCAと表記する)。大麻は世界中に分布しており、地域や系統によって同一種でありながらカンナビノイド化合物の含有量に大きな変異があることが知られている。繊維生産用に栽培される大麻は一般的に「ファイバータイプ(fiber-type)」と呼ばれ、THCA含有量が非常に低い。一方、麻薬を得るため違法に育てられる大麻はTHCA含有量が高く「ドラッグタイプ(drug-type)」と呼ばれる。
THCAは、ドラッグタイプ大麻において、カンナビゲロール酸(CBGA)を基質としてTHCA合成酵素による酵素反応によって生合成される(非特許文献1及び2)。長らくTHCA合成酵素遺伝子はクローニングされていなかったが、特許文献1及び非特許文献3において、ドラッグタイプ大麻からTHCA合成酵素のクローニングが報告された。しかしながら、これまでファイバータイプとドラッグタイプにおけるTHCA含有量の違いがなぜ引き起こされているのか明らかにはなっていなかった。
Taura et al.(1995) J Am Chem Soc 117: 9766-9767 Taura et al.(1996) J Biol Chem 271: 17411-17416 Sirikantaramas S et al. (2004) J Biol Chem 279: 39767-39774 特開2000−78979号公報
ファイバータイプ大麻とドラッグタイプ大麻とを、植物の外見から見分けることは非常に困難である。そのため、ファイバータイプ大麻にドラッグタイプ大麻の種が意図せずに混入した場合においても、ドラッグタイプ大麻を誤って栽培してしまい、事故・事件につながるおそれがある。従って、ファイバータイプ大麻とドラッグタイプ大麻とを迅速に識別することが重要であるが、これまでファイバータイプ大麻とドラッグタイプ大麻とを識別するには、各大麻から成分を抽出し、高速液体クロマトグラフィーなどの手法により、カンナビノイド化合物を作っているか否かを測定する必要があった。ところが、この手法は、元々成分含量が少ない幼植物には適用できないこと、測定に多くのサンプル量が必要であること、測定による結果の判定に時間と労力がかかることなど、多くの問題があることから、ファイバータイプ大麻とドラッグタイプ大麻との迅速な識別法の開発が求められていた。即ち、本発明は、ファイバータイプ大麻とドラッグタイプ大麻との迅速な識別法を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討し、多くの成分変異系統を用い,それらの試料におけるTHCA生合成酵素遺伝子の解析を行った。その結果、ファイバータイプ大麻においては、ドラッグタイプ大麻由来のTHCA合成酵素遺伝子とは異なるTHCA合成酵素様遺伝子が存在することを見出した。本発明は、この知見に基づいて完成したものである。、
即ち、本発明によれば、配列表の配列番号2、4、6、8、10、12又は14の何れかに記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子が提供される。
本発明の別の側面によれば、配列表の配列番号1、3、5、7、9、11又は13の何れかに記載の塩基配列からなる遺伝子が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、配列表の配列番号2、4、6、8、10、12又は14の何れかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、ドラッグタイプ大麻(Cannabis sativa L.)におけるtetrahydrocannabinolic acid(THCA)生合成酵素遺伝子である配列表の配列番号15、17、19、21、23又は25の何れかに記載の塩基配列、又はファイバータイプ大麻(Cannabis sativa L.)におけるtetrahydrocannabinolic acid(THCA)生合成酵素様遺伝子である配列表の配列番号1、3、5、7、9、11又は13の何れかに記載の塩基配列中の連続する10〜100塩基からなる塩基配列又はそのアンチセンス配列からなるオリゴヌクレオチドであって、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23又は25に記載の塩基配列中の塩基番号46、64、79、92、117、118、121、129、136、137、151、154、187、198、221、229、268、269、282、285、287、292、294、300、312、355、366、383、385、399、409、412、418、424、494、505、612、619、678、699、744、749、763、800、862、864、869、881、885、887、945、953、975、1035、1074、1079、1080、1172、1176、1179、1224、1232、1272、1342、1365、1398、1404、1407、1410、1481、1484、1560、1569、及び1574から選択される少なくとも1個以上の塩基を含み、ドラッグタイプ大麻(Cannabis sativa L.)におけるtetrahydrocannabinolic acid(THCA)生合成酵素遺伝子又はファイバータイプ大麻(Cannabis sativa L.)におけるtetrahydrocannabinolic acid(THCA)生合成酵素様遺伝子の何れか片方をPCRにおいて特異的に増幅することができるオリゴヌクレオチドが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、ドラッグタイプ大麻(Cannabis sativa L.)におけるtetrahydrocannabinolic acid(THCA)生合成酵素遺伝子である配列表の配列番号15、17、19、21、23又は25の何れかに記載の塩基配列、又はファイバータイプ大麻(Cannabis sativa L.)におけるtetrahydrocannabinolic acid(THCA)生合成酵素様遺伝子である配列表の配列番号1、3、5、7、9、11又は13の何れかに記載の塩基配列における塩基番号46、64、79、92、117、118、121、129、136、137、151、154、187、198、221、229、268、269、282、285、287、292、294、300、312、355、366、383、385、399、409、412、418、424、494、505、612、619、678、699、744、749、763、800、862、864、869、881、885、887、945、953、975、1035、1074、1079、1080、1172、1176、1179、1224、1232、1272、1342、1365、1398、1404、1407、1410、1481、1484、1560、1569、及び1574から選択される少なくとも1箇所以上の塩基の変異を検出することを含む、ドラッグタイプ大麻(Cannabis sativa L.)とファイバータイプ大麻(Cannabis sativa L.)とを識別する方法が提供される。
好ましくは、本発明の識別方法においては、上記した本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるPCRによって塩基の変異を検出することができる。
本発明により、ファイバータイプ大麻とドラッグタイプ大麻とを迅速に識別することが可能になった。また、本発明により明らかになったTHCA生合成酵素遺伝子の多型解析は、大麻の遺伝的な基礎研究の発展ならびに今後のDNA鑑定技術の開発に寄与するものである。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
(A)本発明の遺伝子及びタンパク質
本発明において、ドラッグタイプ大麻(Cannabis sativa L.)及びファイバータイプ大麻(Cannabis sativa L.)におけるtetrahydrocannabinolic acid(THCA)生合成酵素(様)遺伝子の塩基配列を調べた結果、ファイバータイプ大麻(Cannabis sativa L.)におけるtetrahydrocannabinolic acid(THCA)生合成酵素様遺伝子は、所定の位置に、ファイバータイプ大麻(Cannabis sativa L.)におけるtetrahydrocannabinolic acid(THCA)生合成酵素様遺伝子とは異なる塩基を共通して保持していることが判明した。ファイバータイプ大麻(Cannabis sativa L.)におけるtetrahydrocannabinolic acid(THCA)生合成酵素様遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列は、これまで報告がなく、新規な遺伝子である。
即ち、本発明の遺伝子は、配列表の配列番号2、4、6、8、10、12又は14の何れかに記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子、並びにその具体例である配列表の配列番号1、3、5、7、9、11又は13の何れかに記載の塩基配列からなる遺伝子である。また、配列表の配列番号2、4、6、8、10、12又は14の何れかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質も本発明の範囲内のものである。
なお、上記の遺伝子がコードするタンパク質は、tetrahydrocannabinolic acid(THCA)生合成酵素活性を有しないか、有したとしてもその活性は低いものである。
本発明の遺伝子は、ファイバータイプの大麻Cannabis sativa L.から取得することができる。本発明の遺伝子の取得方法は特に限定されない。本明細書中の配列表の配列番号1〜14に記載したアミノ酸配列及び塩基配列の情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いてファイバータイプの大麻Cannabis sativa L.由来のcDNAライブラリーをスクリーニングすることにより本発明の遺伝子を単離することができる。cDNAライブラリーは常法により作製することができる。
PCR法により本発明の遺伝子を取得することもできる。ファイバータイプの大麻Cannabis sativa L.由来の染色体DNAライブラリー又はcDNAライブラリーを鋳型として使用し、配列番号1、3、5、7、9、11又は13に記載した塩基配列を増幅できるように設計した1対のプライマーを用いてPCRを行う。PCRの反応条件は適宜設定することができ、例えば、94℃で15秒〜30秒(変性)、63℃で30秒〜1分間(アニーリング)、68℃で2〜3分間(伸長)からなる反応工程を1サイクルとして、例えば50サイクル行った後、72℃で10分間反応させる条件などを挙げることができる。次いで、増幅されたDNA断片を、大腸菌等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
上記したプローブ又はプライマーの調製、cDNAライブラリーの構築、cDNAライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989(以下、モレキュラークローニング第2版と略す)又は、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)(以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す)等に記載されている方法に準じて行うことができる。
本発明のタンパク質の取得方法は特に制限されず、化学合成により合成したタンパク質でもよいし、遺伝子組み換え技術により作製した組み換えタンパク質でもよい。組み換えタンパク質を作製する場合には、先ず、当該タンパク質をコードする遺伝子(DNA)を取得する。このDNAを適当な発現系に導入することにより、本発明のタンパク質を取得することができる。発現系での目的タンパク質の発現は当業者に公知であり、本発明の遺伝子を含む組み換え発現ベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製し、得られた形質転換体を好適な条件下で培養することにより目的タンパク質を発現させることができる。本発明の遺伝子が導入される宿主細胞は、本発明の遺伝子の発現が可能であれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。上記した組み換えタンパク質の作製は、例えば、モレキュラークローニング第2版、又はカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の方法に準じて行うことができる。
(B)本発明のオリゴヌクレオチド及び大麻Cannabis sativa L.の識別方法
本発明のオリゴヌクレオチドは、ドラッグタイプ大麻(Cannabis sativa L.)におけるtetrahydrocannabinolic acid(THCA)生合成酵素遺伝子である配列表の配列番号15、17、19、21、23又は25の何れかに記載の塩基配列、又はファイバータイプ大麻(Cannabis sativa L.)におけるtetrahydrocannabinolic acid(THCA)生合成酵素様遺伝子である配列表の配列番号1、3、5、7、9、11又は13の何れかに記載の塩基配列中の連続する10〜100塩基からなる塩基配列又はそのアンチセンス配列からなるオリゴヌクレオチドであって、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23又は25に記載の塩基配列中の塩基番号46、64、79、92、117、118、121、129、136、137、151、154、187、198、221、229、268、269、282、285、287、292、294、300、312、355、366、383、385、399、409、412、418、424、494、505、612、619、678、699、744、749、763、800、862、864、869、881、885、887、945、953、975、1035、1074、1079、1080、1172、1176、1179、1224、1232、1272、1342、1365、1398、1404、1407、1410、1481、1484、1560、1569、及び1574から選択される少なくとも1個以上の塩基を含み、ドラッグタイプ大麻(Cannabis sativa L.)におけるtetrahydrocannabinolic acid(THCA)生合成酵素遺伝子又はファイバータイプ大麻(Cannabis sativa L.)におけるtetrahydrocannabinolic acid(THCA)生合成酵素様遺伝子の何れか片方をPCRにおいて特異的に増幅することができるオリゴヌクレオチドである。
上記の通り、本発明のオリゴヌクレオチドは、ドラッグタイプ大麻(Cannabis sativa L.)におけるtetrahydrocannabinolic acid(THCA)生合成酵素遺伝子又はファイバータイプ大麻(Cannabis sativa L.)におけるtetrahydrocannabinolic acid(THCA)生合成酵素様遺伝子中の連続する10〜100塩基からなる塩基配列又はそのアンチセンス配列からなるオリゴヌクレオチドであって、当該遺伝子の多型部位を少なくとも1個以上含むオリゴヌクレオチドである。
以下の実施例の表2に示す通り、ドラッグタイプ大麻(Cannabis sativa L.)におけるtetrahydrocannabinolic acid(THCA)生合成酵素遺伝子の塩基配列並びにファイバータイプ大麻(Cannabis sativa L.)におけるtetrahydrocannabinolic acid(THCA)生合成酵素様遺伝子においては、塩基配列中の塩基番号46、64、79、92、117、118、121、129、136、137、151、154、187、198、221、229、268、269、282、285、287、292、294、300、312、355、366、383、385、399、409、412、418、424、494、505、612、619、678、699、744、749、763、800、862、864、869、881、885、887、945、953、975、1035、1074、1079、1080、1172、1176、1179、1224、1232、1272、1342、1365、1398、1404、1407、1410、1481、1484、1560、1569、及び1574において、塩基が異なっている。従って、これらの塩基多型を特異的に検出できるオリゴヌクレオチドを設計することにより、当該オリゴヌクレオチドを用いてPCRを行うことにより、ドラッグタイプ大麻及びファイバータイプ大麻を識別することが可能になる。上記の塩基多型の中でも、塩基番号64、92、117、118、121、129、136、137、151、154、187、221、268、269、282、285、287、292、294、300、312、355、383、385、409、412、418、424、494、505、612、678、699、744、749、763、862、864、869、881、885、887、945、953、975、1035、1074、1079、1080、1172、1176、1179、1224、1232、1272、1342、1365、1404、1407、1481、1484、1569、及び1574の何れか1個以上の塩基多型を特異的に検出できるオリゴヌクレオチドを用いることが好ましい。
具体的には、ドラッグタイプ大麻におけるtetrahydrocannabinolic acid(THCA)生合成酵素遺伝子である配列表の配列番号15、17、19、21、23又は25の何れかに記載の塩基配列、又はファイバータイプ大麻におけるtetrahydrocannabinolic acid(THCA)生合成酵素様遺伝子である配列表の配列番号1、3、5、7、9、11又は13の何れかに記載の塩基配列中の連続する10〜100塩基からなる塩基配列又はそのアンチセンス配列からなるオリゴヌクレオチドであって、上記した塩基多型のうちの少なくとも1個以上を含むようなオリゴヌクレオチドを用いることにより、ドラッグタイプ大麻とファイバータイプ大麻を識別することができる。
本発明のオリゴヌクレオチドの具体例としては、配列番号33に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド(プライマーg)、及び配列番号34に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド(プライマーh)を挙げることができる。この2種のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用するPCRにより、ドラッグタイプの大麻のTHCA 生合成酵素遺伝子を特異的に増幅することができ、これによりドラッグタイプの大麻をファイバータイプの大麻から容易に識別することが可能になる。
CBGAを基質として、麻酔性を有さないカンナビジオール酸(CBDA)を合成するCBDA合成酵素遺伝子がクローニングされている(特開2001−29082号公報、配列番号35)。THCA合成酵素遺伝子の塩基配列は、CBDA合成酵素遺伝子配列と非常に相同性が高い(87.9%)。そのためドラッグタイプTHCA生合成酵素遺伝子特異的PCR断片検出するため、ファイバイータイプTHCA生合成酵素様遺伝子配列およびCBDA合成酵素遺伝子配列とを比較考慮してプライマーを設計した(図7)。上記したプライマーg(265-285 bp)およびプライマーh(1941-1472 bp)によるTHCA生合成酵素遺伝子特異的PCR断片検出以外に、下記のプライマーによってドラッグタイプ特異的PCR断片を得ることができる。すなわち、「プライマーIとプライマーq」、「プライマーIとプライマーp」、「プライマーIとプライマーo」、「プライマーIとプライマーn」、「プライマーIとプライマーm」、「プライマーIとプライマーh」、「プライマーgとプライマーq」、「プライマーgとプライマーp」、「プライマーgとプライマーo」、「プライマーgとプライマーn」、「プライマーgとプライマーm」、「プライマーjとプライマーq」、「プライマーjとプライマーp」、「プライマーjとプライマーo」、「プライマーjとプライマーn」、「プライマーjとプライマーm」、「プライマーjとプライマーh」、「プライマーkとプライマーo」、「プライマーkとプライマーn」、「プライマーkとプライマーm」、「プライマーkとプライマーh」、「プライマーlとプライマーh」の組み合わせである。
(フォワードプライマー)
I: 5'-GCT TCT CAA AAC ATA TTC CCA ACA ATG T-3' (110-137 bp)(配列番号36)
J: 5'-CCA AGC AAC TAT TTT ATG CTC T-3' (279-300 bp)(配列番号37)
k: 5'-GTA CTC ATG ACT CAC TTC ATA ACA AA-3' (862-887 bp)(配列番号38)
l: 5'-GGG TTC GAA GTG TTT ATA ATT TTA CG-3' (1382-1407 bp)(配列番号39)
(リバースプライマー)
m: 5'-GGG ACA CAT AAG GAG TCG TAA AAT TA-3' (1423-1398 bp)(配列番号40)
n: 5'-GGA GTC GTA AAA TTA TAA ACA CTT CGA ACC C-3' (1412-1382 bp)(配列番号41)
o: 5'-TGA CCA TTG CAG TTT CTG GAA TTG-3'(1195-1172 bp)(配列番号42)
p: 5'-CTT TGT TAT GAA GTG AGT CAT GAG TAC-3'(888-862 bp)(配列番号43)
q: 5'-AGA GCA TAA AAT AGT TGC TTG GAT ATG GGA GTT-3'(300-268 bp)(配列番号44)
本発明のオリゴヌクレオチドの塩基配列の長さは特に限定されるものではないが、好ましくは10塩基以上100塩基以下、より好ましくは15塩基以上50塩基以下、特に好ましくは15塩基以上30塩基以下である。
本発明のオリゴヌクレオチドは、デオキシリボ核酸(DNA)でもリボ核酸(RNA)でもよい。リボ核酸の場合はチミジン残基(T)をウリジン残基(U)と読み替えればよい。また合成の際に、任意の位置のTをUに変えて合成を行い、ウリジン残基を含むDNAであってもよい。同様に任意のUをTに変えたチミジン残基を含むRNAであってもよい。また、オリゴヌクレオチド中に修飾ヌクレオチドがあってもよい。
本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホアミダイト法等で合成することができる。合成にあっては、DNA/RNA合成機を利用すれば便利である。
本発明では、オリゴヌクレオチドの長さ、末端の塩基、グアニン及びシトシンの分布、増幅産物の大きさ等に関する選定基準に基づき好適なオリゴヌクレオチドを設計し、これを用いることができる。
本発明においては、上記オリゴヌクレオチドを用いたPCRによる増幅産物は、エチジウムブロマイドやサイバーグリーン等による染色で検出してもよいし、あるいはラジオアイソトープや蛍光プローブを使ったドットブロット法によって解析することも可能である。後者のような解析を行う場合、本発明のオリゴヌクレオチドは標識して使用することもできる。このような標識されたオリゴヌクレオチドは全て本発明の範囲内に属する。標識物としては放射性物質や酵素、蛍光物質、発光物質、抗原、ハプテン、酵素基質、不溶性担体、ビオチン・アビジン系標識などの公知の標識を用いることができる。標識の仕方は末端標識でも、配列の途中に標識してもよい。また、糖、リン酸基、塩基部分への標識であってもよい。
本発明のオリゴヌクレオチドを用いて、ファイバータイプ大麻とドラッグタイプ大麻とを識別する場合、(1)本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして検出する方法、(2)本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてDNAポリメラーゼ等により伸長反応を行うことにより検出する方法がある。上記(2)の中の好ましい態様によれば、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用してPCRを行うことにより、目的遺伝子を検出することができる。
上記(2)の場合、本発明のオリゴヌクレオチドをそのまま核酸プライマーとするか、または該オリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プライマーを試料と混合し、DNAポリメラーゼ等によりプライマーを伸長させ(好ましくは、PCRにより標的配列を増幅させる)、得られたプライマー伸長物(PCRの場合には、増幅産物)を直接測定するか、標識プローブを用いて測定する。
本発明の好ましい態様によれば、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCRを行うことにより、ドラッグタイプ大麻(Cannabis sativa L.)におけるtetrahydrocannabinolic acid(THCA)生合成酵素遺伝子、又はファイバータイプ大麻(Cannabis sativa L.)におけるtetrahydrocannabinolic acid(THCA)生合成酵素様遺伝子の何れかを特異的に増幅することができる。増幅反応に際しては反応時に放射性物質などの標識の結合したヌクレオチドを取り込ませる方法や、増幅産物を電気泳動により分画して特異なバンドを検出することにより、上記遺伝子を容易に検出することができる。
PCRの条件は適宜設定することができる。例えば、AmpliTaq Gold(PE biosystems)を用いたPCRの場合、95℃ 10分プレヒートを行った後、94℃で30秒(変性)、57℃で30秒(アニーリング),72℃で2分(伸長)から成るサイクルを30サイクル行った後、72℃で10分インキュベートすることができる。但し、ここに示した条件は一例に過ぎず、用いる酵素、反応温度、反応時間、サイクル数などは適宜変更することが可能である。PCRにより生成した目的遺伝子は電気泳動法、あるいは標識プローブを用いるドットブロットハイブリダイゼーション等により検出することができる。プローブとしては増幅領域内でプローブDNAを設計、作製することができる。
以下の実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
(A)材料および方法
(1)植物材料
国内外の機関より導入した13系統のC. sativa (#001,#005,#009,#010,#011,#013, #020,#045,#053,#054, #066,#068)1個体ずつを植物材料として用いた(表1)。それぞれの種子を25 ℃、24時間連続照明下の人工気象室で育成したものを実験材料とした。
またC. sativa以外の比較対照植物として、Humulus lupulus L. (ホップ,クワ科)およびArabidopsis thaliana L. (シロイヌナズナ,アブラナ科)、Oryza sativa L. (イネ,イネ科)、Nicotiana tabacum L. (タバコ,ナス科)、Solanum tuberosum L. (ジャガイモ,ナス科)、Foeniculum vulgare MILLER (ウイキョウ,セリ科)、Angelica acutiloba KITAGAWA (トウキ,セリ科)、Zingiber officinale ROSCOE (ショウガ,ショウガ科)、Curcuma longa (ウコン,ショウガ科)、Cinnamomum cassia BLUME (シナニッケイ,クスノキ科)、Glycyrrhiza uralensis FISHER (カンゾウ,マメ科)を用いた。
(2)カンナビノイドのHPLC分析
大麻カンナビノイド類のTHCA及びCBDAの定量分析を行った。出芽後40日目の植物体の葉を暗黒、50℃で12時間通風乾燥したものを分析試料とした。試料を粉砕後、エタノールを加え、室温で2時間溶出した。抽出液を遠心分離(7,000×g, 5 min)し、上澄を分析試料としHPLCによって分析を行った。分析システムはmodel LC-9A (Shimadzu)、SPD-6 AV spectrophotometric detector、C-R5A chromatopac、CTO-6A column oven、SCL-6B system controller、カラム: Waters Symmetry C18 (3.5μm, φ4.6 mm×100 mm, Waters)、カラム温度 : 30℃. Solvent system、MeOH − H2O (85:15, v/v, 0.6 ml/min flow rate)、検出: 210 nmとした。
(3)DNA抽出
植物体の生葉 150 mgをDNA抽出材料とした。CTAB(cetyltrimetylammonium bromide)法を一部改良し、抽出・精製を行った。得られたDNAを0.5 ng/μl になるよう希釈調製し試料とした。
(4)PCRおよびシークエンシング
オンラインデータベース配列情報をもとにTHCA 生合成酵素遺伝子特異的プライマー「primer a: 5'-TGA AGA AAA AAA ATG AAT TGC TCA GCA TTT TCC -3'(配列番号27)」と「primer b: 5'-TCT ATT TAA AGA TAA TTA ATG ATG ATG CGG TGG -3'(配列番号28)」を新たに設計した(図3)。5ngのDNA、1.25unitsのPfuTurboR DNA polymerase(STRATAGENE)、1/10容量のPfu Turbo添付Buffer、0.3μMのプライマー、各200μMのdNTPを滅菌水で25μlに調製した。反応条件は95℃ 2分プレヒートに引き続き、95℃ 30秒、50℃ 30秒、72℃ 2分を30サイクル後、72℃ 10分とした。反応時の低温におけるプライマーのミスアニーリングを防止するためAmpli-Wax(TAKARA)を用いた。次に反応液に0.5 unitsのTaq DNA polymerase(Roche)を加え72℃ 10分間3'末端アデニン付加反応を行った。得られた増幅産物を2%アガロースゲル(TAE buffer)電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し254nmでTHCA 生合成酵素遺伝子断片を検出した。PCR産物をQIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN)で精製後、 TOPO TA Cloning Kit(Invitrogen)によりクローニングした。BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(PE biosystems)に添付の方法に従ってシークエンス反応、精製を行った。ABI PRISM 310 およびABI PRISM 3100 automated DNA sequencing system(PE biosystems)によりフラグメントの配列を決定した。シークエンス反応には、プライマーa,bおよびc(5'-CAA ACT GGT TGC TGT CCC ATC-3') (配列番号29)、d(5'-AGC TGG GAA GAA GAC GGC TTT CTC A-3') (配列番号30)、e(5'-CGT CTT CTT CCC AGC TGA TCT-3') (配列番号31)、f(5'-CGC CAA CAG TAG GGC AAT ACC-3') (配列番号32)を用いた。1つのPCR産物に対してプラスミドクローニングおよびシークエンスは少なくとも3回行った。
(5)ドラッグタイプ特異的マーカーの検出
上記により決定した配列情報をもとにドラッグタイプのTHCA 生合成酵素遺伝子特異的プライマー「primer g: 5'-AAT AAC TCC CAT ATC CAA GCA-3' (配列番号33)」と「primer h: 5'-AGG ACT CGC ATG ATT AGT TT-3' (配列番号34)」を設計した(図3)。1ngのDNA、0.25unitsのAmpliTaq Gold(PE biosystems)、1/10容量のAmpliTaq Gold添付Buffer、0.2μMのプライマー、各200μMのdNTP、2.5mMのMgCl2を滅菌水で10μlの反応系に調製した。反応にはTakara PCR Thermal Cycler MP(TAKARA)を使用した.反応条件は95℃ 10分プレヒートに引き続き,94℃ 30秒,57℃ 30秒,72℃ 2分を30サイクル後,72℃ 10分とした。
(B)結果と考察
(1)カンナビノイドのHPLC分析
13の系統はTHCA含有量によって2群に分けられた(図2)。高含有量のTHCA(1.19〜7.51%dw)が#013および#020,#054,#001,#053,#010の6系統で検出された.これらの系統は「ドラッグタイプ」に分類された。一方、低含有量のTHCA(あるいは未検出,0〜0.12%)が#009および#045,#078,#011,#068,#066,#005の7系統で検出され、これらの系統は「ファイバータイプ」に分類された。Smallら(E. Small and A. Cronquist, A practical and natural taxonomy for Cannabis, Taxon 25 (1976) 405−435)はTHCAとCBDAの含有量に基づいてchemo-type I,II,IIIと分類することを提唱している.これに基づくと,本研究における「ファイバータイプ」7系統はchemo-typeIIIに分類された.「ドラッグタイプ」では#053と#010の2系統がchemo-typeIIにあたり,残りの4系統がchemo-typeIに分類された。
(2)THCA生合成酵素遺伝子の多型
「primer a」,「primer b」により13系統全てに1.6 kbの1個のフラグメントが得られた(図4−A)。配列決定した全てのフラグメントにおいてイントロン部位は存在せずエクソンのみで構成されていた(DDBJ/EMBL/GenBank databese)。これら13の配列はドラッグタイプの6系統(#013および#020,#054,#001,#053,#010)と、ファイバータイプの7系統(#009および#045,#078,#011,#068,#066,#005)の2群に分けられた。
上記13種の配列(塩基配列とアミノ酸配列)を以下に示す。
ファイバータイプ#009(配列番号1及び配列番号2)、#045(配列番号3及び配列番号4)、#078(配列番号5及び配列番号6)、#011(配列番号7及び配列番号8)、#068(配列番号9及び配列番号10)、#066(配列番号11及び配列番号12)、#005(配列番号13及び配列番号14)
ドラッグタイプ#013(配列番号15及び配列番号16)、#020(配列番号17及び配列番号18)、#054(配列番号19及び配列番号20)、#001(配列番号21及び配列番号22)、#010(配列番号23及び配列番号24)、#053(配列番号25及び配列番号26)
ドラッグタイプとファイバータイプの両群間には62の共通する塩基置換が認められた(表2)。2群のDNA配列は多くの塩基置換が認められるものの、どちらも545個の完全なアミノ酸をコードしていた(図5)。このドラッグタイプとファイバータイプ間には共通する37部位にアミノ酸置換が認められた。すなわちTHCA生合成酵素遺伝子にはドラッグタイプとファイバータイプにおいて異なる2つのタイプが存在することが示唆された。
一方、主要な塩基置換に加えて#001系統のゲノム上4箇所(187,366,399および1179 bp)で他のドラッグタイプとは異なる塩基置換が認められた。366,399および1179 bpの3箇所での塩基置換は全て同義的置換であり、アミノ酸配列には影響を及ぼさないと考えられた187 bpは非同義的置換であり、イソロイシンからロイシンへアミノ酸配列が変化していた。しかしながら両アミノ酸の化学的特徴は類似するものであった。ファイバータイプ群においても9つのマイナーな塩基置換が認められた(表2)。このうち#005系統の46 bp部位、#009系統の198 bp部位、#045系統の1398 bp部位、#078系統の1410 bp部位、および#011系統の1560 bp部位の塩基置換は同義的置換であった。
(3)ドラッグタイプ特異的マーカーの検出
ドラッグタイプ系統大麻を容易に検出するため、TaqポリメラーゼによるPCRマーカーを開発した。「primer g」,「primer h」により本実施例で用いたドラッグタイプ6系統全てに特異的なPCR断片が得られた(図4−B)。しかしながらファイバータイプ7系統にはこの断片が認められなかった。またC. sativa以外の11種の植物からもこの断片は認められなかった(図6)。
図1は、Cannabis sativaにおけるTHCAおよびCBDA生合成経路を示す。 図2は、13系統のCannabis sativaの葉中のTHCAおよびCBDA含有量を示す。(I)、(II)および(III)はケモタイプを示す。 図3は、THCA生合成酵素遺伝子図と使用したプライマー部位を示す。各プライマー(a、b、c、d、e、f、g、h)の向きを矢印で示した。ATGは開始コドン、TAAは終止コドンを示す。 図4は13系統のCannabis sativaからのTHCA生合成酵素遺伝子のPCR産物の検出を示す。(A)はプライマーa及びbによる全長断片を示し、(B)はプライマーg及びhによるドラッグタイプ特異的断片を示す。Mは分子量マーカーを示す。 図5は、13系統のCannabis sativaから得られたTHCA生合成酵素遺伝子のアミノ酸配列の比較を示す。 図6は、ドラッグタイプ特異的PCR断片の検出を示す。Mは分子量マーカーDNAを示す。NCはネガティブコントロール(鋳型DNAを含まない)を示す。 図7は、ドラッグタイプTHCA生合成酵素遺伝子(#013)およびファイバータイプTHCA生合成酵素遺伝子(#045)、CBDA生合成酵素遺伝子の塩基配列の比較を示す。本発明で設計したプライマーを矢印で示した。
SEQUENCE LISTING
<110> RIKEN
<120> A method for distinguishing Cannabis sativa L.
<130> A51545A
<160> 44
<210> 1
<211> 1638
<212> DNA
<213> Cannabis sativa
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1635)
<223>
<400> 1
atg aat tgc tca gca ttt tcc ttt tgg ttt gtt tgc aaa ata ata ttt 48
Met Asn Cys Ser Ala Phe Ser Phe Trp Phe Val Cys Lys Ile Ile Phe
1 5 10 15
ttc ttt ctc tca ttc aat atc caa att tca ata gct aat cct caa gaa 96
Phe Phe Leu Ser Phe Asn Ile Gln Ile Ser Ile Ala Asn Pro Gln Glu
20 25 30
aac ttc ctt aaa tgc ttc tcg gaa tat att cct aac aat cca gca aat 144
Asn Phe Leu Lys Cys Phe Ser Glu Tyr Ile Pro Asn Asn Pro Ala Asn
35 40 45
cca aaa ttc ata tac act caa cac gac caa ttg tat atg tct gtc ctg 192
Pro Lys Phe Ile Tyr Thr Gln His Asp Gln Leu Tyr Met Ser Val Leu
50 55 60
aat tca aca ata caa aat ctt aga ttc acc tct gat aca acc cca aaa 240
Asn Ser Thr Ile Gln Asn Leu Arg Phe Thr Ser Asp Thr Thr Pro Lys
65 70 75 80
cca ctc gtt att gtc act cct tca aat gtc tcc cat atc cag gcc agt 288
Pro Leu Val Ile Val Thr Pro Ser Asn Val Ser His Ile Gln Ala Ser
85 90 95
att ctc tgc tcc aag aaa gtt ggt ttg cag att cga act cga agc ggt 336
Ile Leu Cys Ser Lys Lys Val Gly Leu Gln Ile Arg Thr Arg Ser Gly
100 105 110
ggc cat gat gct gag ggt ttg tcc tac ata tct caa gtc cca ttt gct 384
Gly His Asp Ala Glu Gly Leu Ser Tyr Ile Ser Gln Val Pro Phe Ala
115 120 125
ata gta gac ttg aga aac atg cat acg gtc aaa gta gat att cat agc 432
Ile Val Asp Leu Arg Asn Met His Thr Val Lys Val Asp Ile His Ser
130 135 140
caa act gcg tgg gtt gaa gcc gga gct acc ctt gga gaa gtt tat tat 480
Gln Thr Ala Trp Val Glu Ala Gly Ala Thr Leu Gly Glu Val Tyr Tyr
145 150 155 160
tgg atc aat gag atg aat gag aat ttt agt ttt cct ggt ggg tat tgc 528
Trp Ile Asn Glu Met Asn Glu Asn Phe Ser Phe Pro Gly Gly Tyr Cys
165 170 175
cct act gtt ggc gta ggt gga cac ttt agt gga gga ggc tat gga gca 576
Pro Thr Val Gly Val Gly Gly His Phe Ser Gly Gly Gly Tyr Gly Ala
180 185 190
ttg atg cga aat tat ggc ctt gcg gct gat aat atc att gat gca cac 624
Leu Met Arg Asn Tyr Gly Leu Ala Ala Asp Asn Ile Ile Asp Ala His
195 200 205
tta gtc aat gtt gat gga aaa gtt cta gat cga aaa tcc atg gga gaa 672
Leu Val Asn Val Asp Gly Lys Val Leu Asp Arg Lys Ser Met Gly Glu
210 215 220
gat cta ttt tgg gct ata cgt ggt gga gga gga gaa aac ttt gga atc 720
Asp Leu Phe Trp Ala Ile Arg Gly Gly Gly Gly Glu Asn Phe Gly Ile
225 230 235 240
att gca gca tgg aaa atc aaa ctt gtt gtt gtc cca tca aag gct act 768
Ile Ala Ala Trp Lys Ile Lys Leu Val Val Val Pro Ser Lys Ala Thr
245 250 255
ata ttc agt gtt aaa aag aac atg gag ata cat ggg ctt gtc aag tta 816
Ile Phe Ser Val Lys Lys Asn Met Glu Ile His Gly Leu Val Lys Leu
260 265 270
ttt aac aaa tgg caa aat att gct tac aag tat gac aaa gat tta atg 864
Phe Asn Lys Trp Gln Asn Ile Ala Tyr Lys Tyr Asp Lys Asp Leu Met
275 280 285
ctc acg act cac ttc aga act agg aat att aca gat aat cat ggg aag 912
Leu Thr Thr His Phe Arg Thr Arg Asn Ile Thr Asp Asn His Gly Lys
290 295 300
aat aag act aca gta cat ggt tac ttc tct tcc att ttt ctt ggt gga 960
Asn Lys Thr Thr Val His Gly Tyr Phe Ser Ser Ile Phe Leu Gly Gly
305 310 315 320
gtg gat agt cta gtt gac ttg atg aac aag agc ttt cct gag ttg ggt 1008
Val Asp Ser Leu Val Asp Leu Met Asn Lys Ser Phe Pro Glu Leu Gly
325 330 335
att aaa aaa act gat tgc aaa gaa ttg agc tgg att gat aca acc atc 1056
Ile Lys Lys Thr Asp Cys Lys Glu Leu Ser Trp Ile Asp Thr Thr Ile
340 345 350
ttc tac agt ggt gtt gta aat tac aac act gct aat ttt aaa aag gaa 1104
Phe Tyr Ser Gly Val Val Asn Tyr Asn Thr Ala Asn Phe Lys Lys Glu
355 360 365
att ttg ctt gat aga tca gct ggg aag aag acg gct ttc tca att aag 1152
Ile Leu Leu Asp Arg Ser Ala Gly Lys Lys Thr Ala Phe Ser Ile Lys
370 375 380
tta gac tat gtt aag aaa cta ata cct gaa act gca atg gtc aaa att 1200
Leu Asp Tyr Val Lys Lys Leu Ile Pro Glu Thr Ala Met Val Lys Ile
385 390 395 400
ttg gaa aaa tta tat gaa gaa gag gta gga gtt ggg atg tat gtg ttg 1248
Leu Glu Lys Leu Tyr Glu Glu Glu Val Gly Val Gly Met Tyr Val Leu
405 410 415
tac cct tac ggt ggt ata atg gat gag att tca gaa tca gca att cca 1296
Tyr Pro Tyr Gly Gly Ile Met Asp Glu Ile Ser Glu Ser Ala Ile Pro
420 425 430
ttc cct cat cga gct gga ata atg tat gaa ctt tgg tac act gct acc 1344
Phe Pro His Arg Ala Gly Ile Met Tyr Glu Leu Trp Tyr Thr Ala Thr
435 440 445
tgg gag aag caa gaa gat aac gaa aag cat ata aac tgg gtt cga agt 1392
Trp Glu Lys Gln Glu Asp Asn Glu Lys His Ile Asn Trp Val Arg Ser
450 455 460
gtt tat aat ttc aca act cct tat gtg tcc caa aat cca aga ttg gcg 1440
Val Tyr Asn Phe Thr Thr Pro Tyr Val Ser Gln Asn Pro Arg Leu Ala
465 470 475 480
tat ctc aat tat agg gac ctt gat tta gga aaa act aat cct gag agt 1488
Tyr Leu Asn Tyr Arg Asp Leu Asp Leu Gly Lys Thr Asn Pro Glu Ser
485 490 495
cct aat aat tac aca caa gca cgt att tgg ggt gaa aag tat ttt ggt 1536
Pro Asn Asn Tyr Thr Gln Ala Arg Ile Trp Gly Glu Lys Tyr Phe Gly
500 505 510
aaa aat ttt aac agg tta gtt aag gtg aaa acc aaa gct gat ccc aat 1584
Lys Asn Phe Asn Arg Leu Val Lys Val Lys Thr Lys Ala Asp Pro Asn
515 520 525
aat ttt ttt aga aac gaa caa agt atc cca cct ctt cca ccg cat cat 1632
Asn Phe Phe Arg Asn Glu Gln Ser Ile Pro Pro Leu Pro Pro His His
530 535 540
cat taa 1638
His
545
<210> 2
<211> 545
<212> PRT
<213> Cannabis sativa
<400> 2
Met Asn Cys Ser Ala Phe Ser Phe Trp Phe Val Cys Lys Ile Ile Phe
1 5 10 15
Phe Phe Leu Ser Phe Asn Ile Gln Ile Ser Ile Ala Asn Pro Gln Glu
20 25 30
Asn Phe Leu Lys Cys Phe Ser Glu Tyr Ile Pro Asn Asn Pro Ala Asn
35 40 45
Pro Lys Phe Ile Tyr Thr Gln His Asp Gln Leu Tyr Met Ser Val Leu
50 55 60
Asn Ser Thr Ile Gln Asn Leu Arg Phe Thr Ser Asp Thr Thr Pro Lys
65 70 75 80
Pro Leu Val Ile Val Thr Pro Ser Asn Val Ser His Ile Gln Ala Ser
85 90 95
Ile Leu Cys Ser Lys Lys Val Gly Leu Gln Ile Arg Thr Arg Ser Gly
100 105 110
Gly His Asp Ala Glu Gly Leu Ser Tyr Ile Ser Gln Val Pro Phe Ala
115 120 125
Ile Val Asp Leu Arg Asn Met His Thr Val Lys Val Asp Ile His Ser
130 135 140
Gln Thr Ala Trp Val Glu Ala Gly Ala Thr Leu Gly Glu Val Tyr Tyr
145 150 155 160
Trp Ile Asn Glu Met Asn Glu Asn Phe Ser Phe Pro Gly Gly Tyr Cys
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Pro Thr Val Gly Val Gly Gly His Phe Ser Gly Gly Gly Tyr Gly Ala
180 185 190
Leu Met Arg Asn Tyr Gly Leu Ala Ala Asp Asn Ile Ile Asp Ala His
195 200 205
Leu Val Asn Val Asp Gly Lys Val Leu Asp Arg Lys Ser Met Gly Glu
210 215 220
Asp Leu Phe Trp Ala Ile Arg Gly Gly Gly Gly Glu Asn Phe Gly Ile
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Ile Ala Ala Trp Lys Ile Lys Leu Val Val Val Pro Ser Lys Ala Thr
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Phe Asn Lys Trp Gln Asn Ile Ala Tyr Lys Tyr Asp Lys Asp Leu Met
275 280 285
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<213> Cannabis sativa
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<222> (1)..(1635)
<223>
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Met Asn Cys Ser Ala Phe Ser Phe Trp Phe Val Cys Lys Ile Ile Phe
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ttc ttt ctc tca ttc aat atc caa att tca tta gct aat cct caa gaa 96
Phe Phe Leu Ser Phe Asn Ile Gln Ile Ser Leu Ala Asn Pro Gln Glu
20 25 30
aac ttc ctt aaa tgc ttc tcg gaa tat att cct aac aat cca gca aat 144
Asn Phe Leu Lys Cys Phe Ser Glu Tyr Ile Pro Asn Asn Pro Ala Asn
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cca aaa ttc ata tac act caa cac gac caa ttg tat atg tct gtc ctg 192
Pro Lys Phe Ile Tyr Thr Gln His Asp Gln Leu Tyr Met Ser Val Leu
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Phe Asn Lys Trp Gln Asn Ile Ala Tyr Lys Tyr Asp Lys Asp Leu Val
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Leu Met Thr His Phe Ile Thr Lys Asn Ile Thr Asp Asn His Gly Lys
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Asn Lys Thr Thr Val His Gly Tyr Phe Ser Ser Ile Phe His Gly Gly
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<400> 34
aggactcgca tgattagttt 20
<210> 35
<211> 1635
<212> DNA
<213> Cannabis sativa
<400> 35
atgaagtgct caacattctc cttttggttt gtttgcaaga taatattttt ctttttctca 60
ttcaatatcc aaacttccat tgctaatcct cgagaaaact tcctgaaatg cttctcgcaa 120
tatattccca ataatgcaac aaatctaaaa ctcgtataca ctcaaaacaa cccattgtat 180
atgtctgtcc taaattcgac aatacacaat cttagattca cctctgacac aaccccaaaa 240
ccacttgtta tcgtcactcc ttcacatgtc tctcatatcc aaggcactat tctatgctcc 300
aagaaagttg gcttgcagat tcgaactcga agtggtggtc atgattctga gggcatgtcc 360
tacatatctc aagtcccatt tgttatagta gacttgagaa acatgcgttc aatcaaaata 420
gatgttcata gccaaactgc atgggttgaa gccggagcta cccttggaga agtttattat 480
tgggttaatg agaaaaatga gaatcttagt ttggcggctg ggtattgccc tactgtttgc 540
gcaggtggac actttggtgg aggaggctat ggaccattga tgagaaacta tggcctcgcg 600
gctgataata tcattgatgc acacttagtc aacgttcatg gaaaagtgct agatcgaaaa 660
tctatggggg aagatctctt ttgggcttta cgtggtggtg gagcagaaag cttcggaatc 720
attgtagcat ggaaaattag actggttgct gtcccaaagt ctactatgtt tagtgttaaa 780
aagatcatgg agatacatga gcttgtcaag ttagttaaca aatggcaaaa tattgcttac 840
aagtatgaca aagatttatt actcatgact cacttcataa ctaggaacat tacagataat 900
caagggaaga ataagacagc aatacacact tacttctctt cagttttcct tggtggagtg 960
gatagtctag tcgacttgat gaacaagagt tttcctgagt tgggtattaa aaaaacggat 1020
tgcagacaat tgagctggat tgatactatc atcttctata gtggtgttgt aaattacgac 1080
actgataatt ttaacaagga aattttgctt gatagatccg ctgggcagaa cggtgctttc 1140
aagattaagt tagactacgt taagaaacca attccagaat ctgtatttgt ccaaattttg 1200
gaaaaattat atgaagaaga tataggagct gggatgtatg cgttgtaccc ttacggtggt 1260
ataatggatg agatttcaga atcagcaatt ccattccctc atcgagctgg aatcttgtat 1320
gagttatggt acatatgtag ttgggagaag caagaagata acgaaaagca tctaaactgg 1380
attagaaata tttataactt catgactcct tatgtgtcca aaaatccaag attggcatat 1440
ctcaattata gagaccttga tataggaata aatgatccca agaatccaaa taattacaca 1500
caagcacgta tttggggtga gaagtatttt ggtaaaaatt ttgacaggct agtaaaagtg 1560
aaaaccctgg ttgatcccaa taactttttt agaaacgaac aaagcatccc acctcttcca 1620
cggcatcgtc attaa 1635
<210> 36
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 36
gcttctcaaa acatattccc aacaatgt 28
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 37
ccaagcaact attttatgct ct 22
<210> 38
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 38
gtactcatga ctcacttcat aacaaa 26
<210> 39
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 39
gggttcgaag tgtttataat tttacg 26
<210> 40
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 40
gggacacata aggagtcgta aaatta 26
<210> 41
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 41
ggagtcgtaa aattataaac acttcgaacc c 31
<210> 42
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 42
tgaccattgc agtttctgga attg 24
<210> 43
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 43
ctttgttatg aagtgagtca tgagtac 27
<210> 44
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA
<400> 44
agagcataaa atagttgctt ggatatggga gtt 33



Claims (6)

  1. 配列表の配列番号2、4、6、8、10、12又は14の何れかに記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子。
  2. 配列表の配列番号1、3、5、7、9、11又は13の何れかに記載の塩基配列からなる遺伝子。
  3. 配列表の配列番号2、4、6、8、10、12又は14の何れかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
  4. ドラッグタイプ大麻(Cannabis sativa L.)におけるtetrahydrocannabinolic acid(THCA)生合成酵素遺伝子である配列表の配列番号15、17、19、21、23又は25の何れかに記載の塩基配列、又はファイバータイプ大麻(Cannabis sativa L.)におけるtetrahydrocannabinolic acid(THCA)生合成酵素様遺伝子である配列表の配列番号1、3、5、7、9、11又は13の何れかに記載の塩基配列中の連続する10〜100塩基からなる塩基配列又はそのアンチセンス配列からなるオリゴヌクレオチドであって、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23又は25に記載の塩基配列中の塩基番号46、64、79、92、117、118、121、129、136、137、151、154、187、198、221、229、268、269、282、285、287、292、294、300、312、355、366、383、385、399、409、412、418、424、494、505、612、619、678、699、744、749、763、800、862、864、869、881、885、887、945、953、975、1035、1074、1079、1080、1172、1176、1179、1224、1232、1272、1342、1365、1398、1404、1407、1410、1481、1484、1560、1569、及び1574から選択される少なくとも1個以上の塩基を含み、ドラッグタイプ大麻(Cannabis sativa L.)におけるtetrahydrocannabinolic acid(THCA)生合成酵素遺伝子又はファイバータイプ大麻(Cannabis sativa L.)におけるtetrahydrocannabinolic acid(THCA)生合成酵素様遺伝子の何れか片方をPCRにおいて特異的に増幅することができるオリゴヌクレオチド。
  5. ドラッグタイプ大麻(Cannabis sativa L.)におけるtetrahydrocannabinolic acid(THCA)生合成酵素遺伝子である配列表の配列番号15、17、19、21、23又は25の何れかに記載の塩基配列、又はファイバータイプ大麻(Cannabis sativa L.)におけるtetrahydrocannabinolic acid(THCA)生合成酵素様遺伝子である配列表の配列番号1、3、5、7、9、11又は13の何れかに記載の塩基配列における塩基番号46、64、79、92、117、118、121、129、136、137、151、154、187、198、221、229、268、269、282、285、287、292、294、300、312、355、366、383、385、399、409、412、418、424、494、505、612、619、678、699、744、749、763、800、862、864、869、881、885、887、945、953、975、1035、1074、1079、1080、1172、1176、1179、1224、1232、1272、1342、1365、1398、1404、1407、1410、1481、1484、1560、1569、及び1574から選択される少なくとも1箇所以上の塩基の変異を検出することを含む、ドラッグタイプ大麻(Cannabis sativa L.)とファイバータイプ大麻(Cannabis sativa L.)とを識別する方法。
  6. 請求項5に記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるPCRによって塩基の変異を検出する、請求項5に記載の方法。
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