CN112489738B

CN112489738B - 高活性苯丙素类衍生物的定向设计及其生物合成方法

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Publication number: CN112489738B
Application number: CN202011372774.9A
Authority: CN
Inventors: 康前进; 胡晓婧; 欧一新; 白林泉
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2020-11-30
Filing date: 2020-11-30
Publication date: 2023-05-26
Anticipated expiration: 2040-11-30
Also published as: CN112489738A

Abstract

本发明公开了一种高活性苯丙素类衍生物的定向设计及其生物合成方法。该设计方法利用氨基肉桂酸作为苯丙素类化合物的合成前体，并利用计算机辅助设计对所获得衍生物与靶蛋白进行对接来评价其生物活性高低。本发明主要涉及三个高活性苯丙素类衍生物，氨基双去甲氧基姜黄素(C₁₉H₁₈N₂O₂)、氨基白藜芦醇(C₁₄H₁₃NO₂)及氨基柚皮素(C₁₅H₁₃NO₄)，结构分别为：

本发明构建了可生产该类衍生物的大肠杆菌工程菌，并进行发酵及分离纯化。本发明中所采用的设计策略为天然产物的定向设计及生物合成提供了借鉴。

Description

高活性苯丙素类衍生物的定向设计及其生物合成方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种高活性苯丙素类衍生物的定向设计及其生物合成方法；尤其涉及一种定向设计高活性苯丙素类衍生物的方法，和获得的高活性衍生物以及相关高产菌株的构建方法。

背景技术

苯丙素类化合物由于具有较好的抗炎、抗心脑血管疾病、抗肿瘤、抗氧化以及其他众多保健活性，而备受人们的关注。因此使用该类化合物的结构作为先导化合物，去合成活性更好的化合物吸引了众多研究者。在早期的研究中，科学家采用化学合成的方式对这一类化合物进行改造。一方面，某些化学反应条件比较苛刻，导致反应的难度高得率低；另一方面，对于某些结构比较复杂的分子，难以使用化学合成的手段进行再改造。

近些年，随着合成生物学的发展，越来越多的研究人员采用生物合成的方式去获得相关的衍生物。但大部分情况下，利用合成生物学的方法进行衍生物的合成并没有靶向性，即合成的大部分化合物可能并不具备比原始化合物更优良的活性，这会造成实验资源和人力的浪费。因此，将计算机辅助定向设计小分子药物与合成生物学的方法相结合，会为高活性天然产物衍生物的合成带来很大的导向性和便利性。

而发展苯丙素类化合物的初衷，实为获得活性更高的化合物。虽然在之前的各种研究中也有一些衍生物的合成及获得，但这些衍生物的生物活性并没有得到有效的检测。因此，通过将计算机辅助药物设计来指导合成生物学的方法，能够有效地指导人们更精准的获取更高活性的相关衍生物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高活性苯丙素类衍生物的定向设计及其生物合成方法。该方法为合成生物学在合成天然化合物衍生物的应用上提供了新思路。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

第一方面，本发明涉及一种高活性苯丙素类衍生物的定向设计方法，所述方法包括如下步骤：

(1)获得苯丙素类化合物合成前体的结构类似物；

(2)根据所述结构类似物构建苯丙素类衍生物的结构；

(3)利用计算机辅助，将构建的苯丙素类衍生物的结构与目标靶蛋白进行分子对接，预测其活性高低。

具体来说：1)挖掘出天然存在的非常见芳香类氨基酸。根据苯丙素类化合物合成前体的结构特征，以及挖掘出的相关非常见芳香类氨基酸的合成生物学进展，最终确定以对氨基苯丙氨酸为可能的合成砌块。该氨基酸的生物合成途径存在于委内瑞拉链霉菌及橙色束丝放线菌等一系列菌中。

2)对氨基苯丙氨酸可以作为苯丙氨酸裂解酶(PAL)的识别底物，形成对氨基肉桂酸(NCIN)。最终确定以对氨基肉桂酸为本发明的合成前体。

3)根据合成前体的结构特征，推测出可能合成的最终衍生物的结构。并利用计算机辅助药物设计技术，通过将苯丙素类化合物及其衍生物与相应靶蛋白进行分子对接，比较其生物活性的高低。

作为本发明的一个实施方案，步骤(2)中使用对氨基肉桂酸(NCIN)作为合成前体，构建氨基的苯丙素类衍生物。

作为本发明的一个实施方案，所述苯丙素类衍生物是姜黄素类化合物、芪类化合物或黄酮类化合物。

作为本发明的一个实施方案，所述姜黄素类化合物是氨基双去甲氧基姜黄素(NBMC)，分子式为C₁₉H₁₈N₂O₂，结构式为：

作为本发明的一个实施方案，所述芪类化合物是氨基白藜芦醇(NRES)，分子式为C₁₄H₁₃NO₂，结构式为：

作为本发明的一个实施方案，所述黄酮类化合物是氨基柚皮素(NNAR)，分子式为C₁₅H₁₃NO₄，结构式为：

第二方面，本发明涉及一种上述方法获得的高活性苯丙素类衍生物的生物合成方法，所述方法包括：

构建得到合成氨基白藜芦醇的大肠杆菌工程菌，发酵产生氨基白藜芦醇；

构建得到合成氨基柚皮素的大肠杆菌工程菌，发酵产生氨基柚皮素；

或，构建得到合成氨基双去甲氧基姜黄素的大肠杆菌工程菌，发酵产生氨基双去甲氧基姜黄素。

作为本发明的一个实施方案，合成氨基白藜芦醇的大肠杆菌工程菌的构建方法包括以下步骤：

(1)全合成拟南芥4-香豆酰辅酶A连接酶基因4cl和葡萄芪合成酶基因sts，核苷酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；

(2)以谷氨酸棒状杆菌基因组为模板，克隆乙酰辅酶A羧化酶基因accBC和dtsR1，核苷酸序列分别如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；

(3)利用NovagenλDE3溶原化试剂盒对大肠杆菌MG1655进行溶原化，得到MG1655(DE3)菌株；

(4)将序列4cl与表达载体pACYCDuet进行连接，得到重组表达质粒pJQK336；将序列sts与表达载体pRSFDuet进行连接，得到重组表达质粒pJQK337；将序列accBC、dtsR1与表达载体pCDFDuet进行连接，得到重组表达质粒pJQK342；

(5)将重组表达质粒pJQK336、pJQK337和pJQK342共同转入大肠杆菌MG1655(DE3)中，得到所述合成氨基白藜芦醇的大肠杆菌工程菌。

步骤(3)中，MG1655(DE3)菌株的获得方法参照文献Nielsen DR,Yoon SH,YuanCJ,Prather KL.Metabolic engineering of acetoin and meso-2,3-butanediolbiosynthesis in E.coli.Biotechnol J.2010Mar；5(3):274-84。

作为本发明的一个实施方案，合成氨基柚皮素的大肠杆菌工程菌的构建方法包括以下步骤：

(1)全合成矮牵牛查尔酮合成酶基因chs、查尔酮异构酶基因chi，核苷酸序列分别如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示；

(2)全合成拟南芥4-香豆酰辅酶A连接酶基因4cl，核苷酸序列分别如SEQ ID No.1所示；

(3)以谷氨酸棒状杆菌基因组为模板，克隆乙酰辅酶A羧化酶基因accBC和dtsR1，核苷酸序列分别如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；

(4)将序列4cl与表达载体pACYCDuet进行连接，得到重组表达质粒pJQK336；将序列chs、chi与表达载体pRSFDuet进行连接，得到重组表达质粒pJQK338；将序列accBC、dtsR1与表达载体pCDFDuet进行连接，得到重组表达质粒pJQK342；

(5)利用NovagenλDE3溶原化试剂盒对大肠杆菌MG1655进行溶原化，得到MG1655(DE3)菌株；

(6)将重组表达质粒pJQK336、pJQK338和pJQK342共同转入大肠杆菌MG1655(DE3)中，得到所述合成氨基柚皮素的大肠杆菌工程菌。

作为本发明的一个实施方案，合成氨基双去甲氧基姜黄素的大肠杆菌工程菌的构建方法包括以下步骤：

(1)全合成姜黄二聚酮合酶基因dcs、姜黄素合成酶基因curs3，核苷酸序列分别如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示；

(4)将序列4cl与表达载体pACYCDuet进行连接，得到重组表达质粒pJQK336；将序列dcs、curs3与表达载体pRSFDuet进行连接，得到重组表达质粒pJQK341；将序列accBC、dtsR1与表达载体pCDFDuet进行连接，得到重组表达质粒pJQK342；

(6)将重组表达质粒pJQK336、pJQK341和pJQK342共同转入大肠杆菌MG1655(DE3)中，得到所述合成氨基双去甲氧基姜黄素的大肠杆菌工程菌。

作为本发明的一个实施方案，所述方法还包括在发酵液中分离提纯的步骤。

作为本发明的一个实施方案，所述发酵是以对氨基肉桂酸为底物进行发酵。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明定向对天然苯丙素类化合物进行改造，不需要通过筛大量的小分子化合物库，通过计算机模拟分子对接，即可获得潜在的高活性衍生物；

(2)本发明通过喂养对氨基肉桂酸，利用大肠杆菌工程菌生物合成了高活性的氨基双去甲氧基姜黄素、氨基白藜芦醇和氨基柚皮素，为后续的进一步改造提供了可能的平台。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1：氨基双去甲氧基姜黄素(NBMC)、双去甲氧基姜黄素(BMC)与MD-2的docking结果；其中，A：通过分子动力学(MD)模拟获得的NBMC-MD2体系中均方根偏差(RMSD)随模拟时间的变化；B：NBMC-MD2体系中各残基的均方根涨落(RMSF)；C：通过MD模拟获得的BMC-MD2体系中RMSD随模拟时间的变化；D：BMC-MD2体系中各残基的RMSF；

图2：氨基白藜芦醇(NRES)、白藜芦醇(RES)与CYP19A1的docking结果；其中，A：NRES与CYP19A1蛋白的稳定对接结构；B：RES与CYP19A1蛋白的稳定对接结构；

图3：氨基柚皮素(NNAR)、柚皮素(NAR)与CYP19A1的docking结果；其中，A：NNAR与CYP19A1蛋白的稳定对接结构；B：NAR与CYP19A1蛋白的稳定对接结构；

图4：氨基苯丙素类衍生物的生物合成途径；

图5：重组质粒pJQK336、337、338、341及342示意图；

图6：重组质粒pJQK336、337、338、341及342的PCR验证琼脂糖凝胶电泳图；

图7：氨基双去甲氧基姜黄素的质谱检测图；

图8：氨基柚皮素的质谱检测图；

图9：氨基白藜芦醇的质谱检测图；

图10：氨基双去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素与MD-2的结合能力对比结果；其中，A：Biacore实验检测NBMC和MD-2的结合情况；B：Biacore实验检测BMC和MD-2的结合情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1、高活性苯丙素类衍生物的设计方法

目前天然产物衍生物的筛选主要依赖于高质量的化合物库，而其合成主要依赖于有机化学手段。为了更好地发挥合成生物学的理念，本发明通过对苯丙素类化合物合成底物类似物进行了挖掘，找到了天然存在的氨基苯丙氨酸生物合成途径，试图将其作为合成底物对苯丙素类化合物进行改造；并通过计算机辅助设计的方式对可能获得的目标衍生物进行了活性分析，进而达到定向高活性改造的目标。

首先，对于苯丙素类化合物合成底物类似物的挖掘。氨基苯丙氨酸存在于较多微生物的基因组中，参与了一些高活性天然产物的骨架合成。且该氨基酸的生物合成途径是平行于酪氨酸的生物合成途径，并且结构与酪氨酸较为接近，为衍生物改造提供了极大的可能性。最终，找到了对氨基丙氨酸这个目标氨基酸，该氨基酸的生物合成途径存在于委内瑞拉链霉菌及橙色束丝放线菌等菌中。

其次，对氨基丙氨酸可以被酪氨酸氨基裂解酶PAL识别，生成相应的氨基肉桂酸。而与之结构类似的肉桂酸以及香豆酸是合成苯丙素类一系列化合物的前体，因此，本发明中选择氨基肉桂酸作为相关衍生物的合成前体。根据氨基肉桂酸的结构，我们对可能获得的衍生物结构进行了预测。选取了芪类化合物、黄酮类化合物及姜黄素类化合物作为代表，结构分别为：

氨基白藜芦醇

氨基柚皮素

氨基双去甲氧基姜黄素

最后，利用计算机辅助药物设计对这些衍生物的活性进行评估，将衍生物和对应的天然产物分别与目标靶蛋白进行分子对接，从而对其活性高低进行比较。具体方法为：

(1)根据文献选取小分子的目标靶蛋白。其中，氨基双去甲氧基姜黄素选择的靶蛋白为人体MD-2蛋白(PDB ID：2E56)，氨基白藜芦醇和氨基柚皮素选取的靶蛋白为人体芳香化酶CYP19A1(PDB ID：5JKW)；

(2)绘制小分子结构并转化为三维立体结构，用PyMol软件对小分子进行构象优化、添加电荷以及能量最小化，将获得的文件保存为mol2格式；

(3)在PDB数据库中下载目的蛋白结构pdb文件，并用

软件对其进行去水加氢及能量最小化等处理后，保存文件；

(4)在

软件中进行对接计算，将打分最高的作为初选结构，进行后续的MD模拟。对复合物体系分别进行4次50ns MD模拟，筛选出较为稳定的结合构象进行比较分析。

其中，氨基双去甲氧基姜黄素与双去甲氧基姜黄素的对接结果如图1所示，氨基双去甲氧基姜黄素的体系能量更稳定，且小分子在体系中的贡献更大，表明氨基双去甲氧基姜黄素与MD-2蛋白的结合能力可能优于双去甲氧基姜黄素。氨基白藜芦醇与白藜芦醇、氨基柚皮素与柚皮素的对接比较结果分别见图2、图3。在氨基白藜芦醇和氨基柚皮素的体系中明显存在较多的氢键，表明这两个化合物与CYP19A1的结合能力分别高于白藜芦醇和柚皮素。

实施例2、生物合成途径基因选择

如图4所示，底物氨基肉桂酸(NCIN)在4CL的作用下生成氨基肉桂酰辅酶A。而氨基肉桂酰辅酶A可以在不同的聚酮合酶作用下，生成不同的苯丙素类化合物：在芪类合酶的作用下形成芪类化合物；在查尔酮合成酶及异构酶的作用下生成黄酮类化合物柚皮素；在姜黄素合成酶的作用下生成姜黄素类化合物。

考虑到拟南芥作为植物中的模式生物，其基因的相关性质研究的较为透彻，在大肠杆菌中进行异源表达也比较成功，因此本研究中选择了来自于拟南芥的4-香豆酰辅酶A连接酶基因4cl基因。同样地，矮牵牛作为另一种模式植物，其黄酮类途径也是研究的较为清楚，因此本发明选择了来自于矮牵牛的查尔酮合成酶基因chi和查尔酮异构酶基因chs构建合成黄酮类骨架化合物的通路。另一方面，由于葡萄中含有较为丰富的白藜芦醇，因此本研究选用了来自葡萄的芪合成酶基因sts来合成芪类化合物。

在草本植物姜黄中，姜黄素的生物合成途径包含两个蛋白，即二聚酮合酶基因DCS和姜黄素合成酶CURS。而姜黄中同时存在三条姜黄素合成酶基因(curs1、curs2和curs3)，经前人报道，CURS1和CURS2对阿魏酰辅酶A的底物特异性更高，而CURS3既可以利用香豆酰辅酶A也可以利用阿魏酰辅酶A作为底物。本发明选用了dcs和curs3的组合来构建氨基双去甲氧基姜黄素的合成途径。

在芪类、黄酮类以及姜黄素类化合物的合成中，除了使用肉桂酰辅酶A类作为底物，还需要利用另外一个共同的底物——丙二酰辅酶A。而在大肠杆菌细胞内，丙二酰辅酶A的含量并不高，因此会造成产物合成量提不上去的短板。因此，在本发明中引用了来自于谷氨酸棒状杆菌中的乙酰辅酶A羧化酶。该酶包含两个亚基，AccBC和DtsR1，可以将乙酰辅酶A转化为丙二酰辅酶A。通过该酶的引入，以期达到提高胞内前体分子含量的目的。

实施例3、生产高活性苯丙素类衍生物的工程菌株构建

将以上选择的所有基因进行大肠杆菌密码子优化后全合成。将4cl与经NdeI和XhoI酶切处理过的pCDFDuet载体连接，构成质粒pJQK336。将sts与经BamHI和HindIII酶切处理过的pRSFDuet载体连接，构成质粒pJQK337。将chs和chi连接到经BamHI和HindIII，NdeI和XhoI酶切处理过的pRSFDuet载体连接，构成质粒pJQK338。同样，将dcs和curs3连接到相同酶切处理过的pRSFDuet载体连接，构成质粒pJQK341。将accBC和dtsR1连接到相同酶切处理过的pACYCDuet载体连接，构成质粒pJQK342。所述质粒构建示意图如图5所示。将得到的重组质粒分别进行PCR验证，结果如图6所示，条带正确表明重组质粒构建成功。

为了构建芪类衍生物的合成菌株，将pJQK336、pJQK337和pJQK342用化学转化法共同转入MG1655(DE3)感受态中，并在含有50μg/mL壮观霉素、50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的LB固体平板上进行筛选。将长出的单克隆进行PCR验证，以确保阳性克隆的正确性。将最终筛选得到的重组菌株命名为HXJE101。

其中LB固体培养基配方为：10g/L tryptone，5g/L yeast extract，5g/L NaCl，15g/L agar。

为了构建黄酮类衍生物合成菌株，需要将pJQK336、pJQK338和pJQK342共同转化入MG1655(DE3)感受态中，筛选方法同上。将最终筛选得到的重组菌株命名为HXJE102。

同理，为了构建姜黄素类衍生物合成菌株，需要将pJQK336、pJQK341和pJQK342共同转化入MG1655(DE3)感受态中，筛选方法同上。将最终筛选得到的重组菌株命名为HXJE103。

实施例4、高活性苯丙素类衍生物的发酵及其制备纯化

以氨基双去甲氧基姜黄素的发酵和纯化为例：

将实施例3中获得的重组菌株HXJE103在LB液体培养基中37℃中培养过夜，以1:100的比例转接至5L新鲜的LB液体培养基，37℃、220rpm条件下培养至OD600约为0.6，加入终浓度为1mM的IPTG转至25℃培养5h。5000rpm离心15min后，弃上清，将得到的菌体重悬至1L含有0.5mM 4-氨基肉桂酸的新鲜M9培养基中，25℃继续培养48h。

其中，LB液体培养基配方为：10g/L tryptone，5g/L yeast extract，5g/L NaCl。

M9培养基配方为：6.78g/L Na₂HPO₄，3g/L KH₂PO₄，0.5g/L NaCl，1g/L NH₄Cl，0.493g/L MgSO₄·7H₂O，0.011g/L CaCl₂，4g/L glucose。

将发酵液用乙酸乙酯萃取3次，取有机相进行旋转蒸发后溶于少量甲醇。将粗产物上样至MCI分离柱，依次使用10％、30％、50％、70％以及100％甲醇水溶液洗脱。并利用HPLC检测分析各梯度的洗脱产物，将含有目标峰的组分进行旋转蒸发。再利用高效制备液相进行分离纯化。使用250mm×10mm的BDS HYPERSIL C18反向半制备柱，以甲醇：0.1％甲酸水溶液＝70:30为流动相进行洗脱，流速为2mL/min，检测波长为450nm，进样量为50μL。通过确定目标峰的馏分时间，对特定馏分进行接样后蒸干,得到目标化合物氨基双去甲氧基姜黄素。

本发明中氨基双去甲氧基姜黄素是首次被报道并分离的，通过核磁共振分析及质谱检测(图7)确定其结构的正确性。核磁数据如下：

NBMC：¹H NMR(DMSO-d₆,400MHz)δ7.43(2H,d,J＝15.6Hz),7.38(4H,d,J＝8.3Hz),6.57(4H,d,J＝8.3Hz),6.50(1H,d,J＝15.6Hz),5.88(1H,s),5.82(4H,s)；¹³C NMR(DMSO-d₆,100MHz)δ182.9,151.5,140.8,130.3,122.1,117.8,113.7,100.4.

同理，我们分别使用菌株HXJE101和HXJE102对氨基白藜芦醇和氨基柚皮素进行发酵。分离纯化方法参照上述，最后半制备分离时，需将紫外吸收波长调为303nm。通过核磁共振分析及质谱检测(图8、图9)确定其结构的正确性。相应的核磁数据分别如下所示：

NRES：¹H NMR(DMSO-d₆,600MHz)δ9.16(2H,s),7.23(2H,d,J＝8.4Hz),6.83(1H,d,J＝16.3Hz),6.68(1H,d,J＝16.3Hz),6.53(2H,d,J＝8.4Hz),6.33(2H,d,J＝1.8Hz),6.06(1H,t,J＝1.8Hz),5.26(2H,s)；¹³C NMR(DMSO-d₆,150MHz)δ158.5,148.7,139.7,128.5,127.6,124.7,123.3,113.9,104.0,101.3.

NNAR：¹H NMR(DMSO-d₆,600MHz)δ12.16(1H,s),10.77(1H,br.s),7.13(2H,d,J＝8.4Hz),6.56(2H,d,J＝8.4Hz),5.85(1H,d,J＝2.1Hz),5.84(1H,d,J＝2.1Hz),5.32(1H,dd,J＝12.9,2.9Hz),5.21(2H,s),3.25(1H,dd,J＝17.1,12.9Hz),2.61(1H,dd,J＝17.1,2.9Hz)；¹³C NMR(DMSO-d₆,150MHz)δ196.7,166.7,163.5,163.1,149.3,128.1,125.1,113.4,101.7,95.7,94.9,78.9,41.8.

实施例5、氨基双去甲氧基姜黄素与双去甲氧基姜黄素的抗炎活性比较

氨基双去甲氧基姜黄素与双去甲氧基姜黄素的体外抗炎活性实验中，我们将小鼠单核巨噬细胞RAW264.7用LPS脂多糖诱导一氧化氮合成酶的生成，同时加入待测化合物处理，吸取培养基通过Griess法在570nm波长测吸光值来检测亚硝酸盐(NO^2-)。该方法的原理为当免疫细胞遭受微生物内毒素、炎症介质等刺激时，会生成大量的诱导型一氧化氮合成酶(induced NO synthase，iNOS)，产生一氧化氮(nitric oxide,NO)进行免疫应答。因此抑制NO生成是化合物抗炎活性的直接指标。

首先将RAW264.7细胞接种至96孔板，用1μg/mL LPS进行诱导刺激，同时加入待测化合物(终浓度从50μM开始2倍稀释)处理，设置不含药物组和L-NMMA阳性药物组做对照。细胞过夜培养后取培养基检测NO生成，在570nm处测定吸光值。在剩余培养基中加入MTS进行细胞存活率检测，排除化合物对细胞的毒性影响。

NO生成抑制率(％)＝(非药物处理组OD_570nm-样品组OD_570nm)/非药物处理组OD_570nm×100％

IC50(50％concentration of inhibition)按Reed&Muench法计算。

上述体外抗炎活性测定均进行3组平行实验。

其中氨基双去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素的抗炎活性数据如表1所示：

表1

样品名称	IC50(μM)
		L-NMMA	48.56±1.28
氨基双去甲氧基姜黄素	5.45±0.12
		双去甲氧基姜黄素	7.42±0.16

为了更进一步验证氨基双去甲氧基姜黄素的活性，以及前期利用计算机辅助设计的准确性，本发明中又利用了表面等离子共振(SPR)技术将氨基双去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素与MD-2蛋白的结合能力进行了体外实验验证。将人体MD-2蛋白(购于美国R&DSystems)偶联在CM5芯片(Biacore 8K)上，使用含有5％DMSO的PBS缓冲液作为工作缓冲液，氨基双去甲氧基姜黄素浓度范围为1.56-50μM，双去甲氧基姜黄素浓度范围为3.125-50μM。结合时间60s，流速为30μL/min，解离时间120s。溶剂校正方法采用厂家推荐的方法。数据用Biacore insight evaluation software按照1:1结合模式进行分析拟合。最终得到，氨基双去甲氧基姜黄素与MD-2的解离常数为KD＝0.00000332M，而双去甲氧基姜黄素KD＝0.0000588M，表明氨基双去甲氧基姜黄素与MD-2的结合能力更强(图10)。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

序列表

<110>上海交通大学

<120> 高活性苯丙素类衍生物的定向设计及其生物合成方法

<130> KAG45535

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1686

<212> DNA

<213>拟南芥 (Arabidopisis thaliana)

<400> 1

atggctcctc aggaacaggc tgtgagccag gttatggaaa aacagagcaa taataataac 60

agcgatgtta ttttccgcag taaactgccg gatatctata ttccgaatca tctgagcctg 120

catgattata tttttcagaa tatcagcgag ttcgccacca aaccgtgcct gattaatggc 180

ccgaccggtc atgtgtatac ctatagcgat gttcatgtta ttagccgtca gattgcagca 240

aattttcata aactgggtgt gaatcagaat gatgttgtga tgctgctgct gccgaattgc 300

ccggaatttg ttctgagctt tctggcagcc agttttcgtg gtgcaaccgc aaccgcagcc 360

aatcctttct ttaccccggc agaaattgcc aaacaggcaa aagcaagtaa taccaaactg 420

attattaccg aagcacgcta tgtggataaa attaagccgc tgcagaatga tgatggtgtt 480

gttattgttt gtatcgatga taatgagagc gtgccgattc cggaaggttg tctgcgtttt 540

accgaactga cccagagcac caccgaagca agcgaagtga ttgatagtgt ggaaattagt 600

ccggatgatg tggttgcact gccgtatagt agcggtacca ccggtctgcc taaaggcgtt 660

atgctgaccc ataaaggtct ggtgaccagc gttgcccagc aggttgatgg tgaaaatccg 720

aatctgtatt ttcatagtga tgatgttctg ctgtgtgttc tgccgatgtt tcatatctat 780

gccctgaata gcattatgct gtgcggtctg cgtgttggcg ccgcaatctt aattatgccg 840

aaatttgaaa tcaacctgct gctggaactg attcagcgct gcaaagtgac cgtggcaccg 900

atggttccgc ctattgtgct ggcaattgcc aaaagcagcg aaaccgaaaa atatgatctg 960

agcagtattc gtgtggtgaa aagtggtgca gccccgttag gcaaagaact ggaagatgca 1020

gtgaatgcca aatttccgaa tgccaaactg ggtcagggct atggtatgac cgaagccggt 1080

cctgttctgg ctatgagcct gggttttgcc aaagaaccgt ttccggtgaa aagtggcgcc 1140

tgtggtaccg ttgttcgtaa tgcagaaatg aaaattgttg atccggatac cggtgacagt 1200

ctgagtcgca aacagccggg tgaaatttgc attcgtggtc atcagattat gaaaggctat 1260

ctgaataatc cggccgccac cgcagaaacc attgataaag atggctggct gcataccggc 1320

gatattggct taattgatga tgatgatgaa ctgtttatcg ttgatcgtct gaaagaactg 1380

gttaaatata aaggtttcca ggtggcaccg gccgaactgg aagcattact gattggtcat 1440

ccggatatta ccgatgtggc cgttgttgca atgaaagaag aagcagcagg tgaagtgccg 1500

gttgcctttg tggtgaaatc aaaagatagt gaactgagcg aagatgatgt taaacagttt 1560

gtgagtaaac aggttgtttt ctataagcgc attaataagg ttttcttcac cgaaagtatc 1620

ccgaaagccc cgagcggtaa aattctgcgt aaagatctgc gcgcaaaact ggccaatggt 1680

ctgtaa 1686

<210> 2

<211> 1179

<212> DNA

<213> 葡萄(Vitis vinifera)

<400> 2

atggcaagcg ttgaagaatt tcgcaatgca cagcgtgcca aaggtccggc aaccattctg 60

gcaattggta ccgcaacccc ggatcattgt gtttatcaga gtgattatgc cgatttttat 120

ttccgtgtga ccaaaagcga acacatgacc gcactgaaaa agaaattcaa tcgcatttgt 180

gataagagta tgattaagaa acgctatatc catctgaccg aagaaatgct ggaagaacat 240

ccgaatattg gcgcctatat ggccccgagc ctgaatattc gccaggaaat tattaccgcc 300

gaagttccga aactgggtaa agaagccgcc ctgaaagccc tgaaagaatg gggtcagccg 360

aaaagcaaaa ttacccatct ggtgttttgt accaccagcg gtgttgaaat gccgggcgca 420

gattataaac tggcaaatct gctgggcctg gaaccgagtg ttcgtagagt tatgctgtat 480

catcagggtt gttatgccgg tggtaccgtt ctgcgtaccg ctaaagatct ggccgaaaat 540

aatgccggcg cacgtgttct ggtggtgtgt agtgaaatta ccgtggtgac ctttcgcggc 600

ccgtcagaag atgctctgga ttcactggtt ggtcaggcac tgtttggcga tggtagcgca 660

gcagtgattg ttggcagtga tccggatatt agcattgaac gcccgctgtt tcagctggtg 720

agtgctgcac agacctttat tccgaatagt gcaggtgcaa ttgccggtaa tctgcgcgaa 780

gttggcctga catttcatct gtggccgaat gttccgaccc tgattagtga aaatattgaa 840

aaatgcctga cccaggcatt tgatccgctg ggtattagtg attggaatag tctgttttgg 900

attgcacatc cgggcggccc tgcaattctg gatgcagttg aagcaaaact gaatctggat 960

aaaaagaaac tggaagcaac ccgccatgtg ctgagtgaat atggcaatat gagcagcgcc 1020

tgcgttctgt ttattctgga tgaaatgcgc aaaaaatctc tgaaaggcga acgtgcaacc 1080

accggtgaag gcttagattg gggcgttctg tttggctttg gcccgggttt aaccattgaa 1140

accgttgtgc tgcatagtat tccgatggtg accaattaa 1179

<210> 3

<211> 1170

<212> DNA

<213>矮牵牛(Petunia hybrida)

<400> 3

atggttaccg ttgaagaata tcgtaaagcc cagcgtgccg aaggcccggc aaccgttatg 60

gcaattggta ccgcaacccc gaccaattgc gttgatcaga gcacctatcc ggattattat 120

tttcgtatta ccaacagcga acataaaacc gatctgaaag aaaaattcaa gcgcatgtgc 180

gaaaaaagta tgattaagaa acgttacatg cacctgaccg aagaaattct gaaagaaaat 240

ccgagcatgt gtgaatatat ggcaccgagc ctggatgcac gccaggatat tgtggttgtg 300

gaagttccga aactgggcaa agaagcagcc cagaaagcaa ttaaggaatg gggtcagccg 360

aaaagtaaaa ttacccatct ggtgttttgc accaccagtg gcgttgatat gccgggctgc 420

gattatcagc tgaccaaact gctgggtctg cgtccgagtg ttaaacgtct gatgatgtat 480

cagcagggct gttttgcagg cggcaccgtt ctgcgtctgg ccaaagatct ggccgaaaat 540

aataagggcg cacgtgtgct ggttgtgtgc agtgaaatta ccgcagttac ctttcgtggt 600

ccgaatgata cccatctgga tagcctggtg ggtcaggccc tgtttggtga cggtgccggt 660

gccattatta ttggtagcga tccgattccg ggcgttgaac gcccgctgtt tgaactggtg 720

agtgcagccc agaccctgct gccggatagt catggtgcaa ttgatggcca tctgcgtgaa 780

gttggtctga cctttcatct gctgaaagat gttccgggcc tgattagtaa aaatattgaa 840

aaaagcctgg aggaagcctt tcgcccgctg agtattagcg attggaatag cctgttttgg 900

attgcacatc cgggtggccc ggccattctg gatcaggtgg aaattaagct gggcctgaaa 960

ccggaaaaac tgaaagcaac ccgcaatgtt ctgagcaatt atggcaatat gagtagcgca 1020

tgcgttctgt ttattctgga tgaaatgcgt aaagcaagtg caaaagaagg tctgggtacc 1080

accggtgaag gcctggaatg gggtgttctg tttggttttg gtccgggcct gaccgtggaa 1140

accgtggttc tgcatagcgt ggcaacctaa 1170

<210> 4

<211> 726

<212> DNA

<213>矮牵牛(Petunia hybrida)

<400> 4

atgtctcctc cagtgtccgt tactaaaatg caggttgaga attacgcttt cgcaccgacc 60

gtgaaccctg ctggttccac caataccttg ttccttgctg gtgctgggca tagaggtctg 120

gagatagaag ggaagtttgt taagtttacg gcgataggtg tgtatctaga agagagtgct 180

attccttttc tggccgaaaa atggaaaggc aaaacccccc aggagttgac tgactcggtc 240

gagttcttta gggatgttgt tacaggtcca tttgagaaat ttactagagt tactatgatc 300

ttgcccttga cgggcaagca gtactcggag aaggtggcgg agaattgtgt tgcgcattgg 360

aaggggatag gaacgtatac tgatgatgag ggtcgtgcca ttgagaagtt tctagatgtt 420

ttccggagtg aaacttttcc acctggtgct tccatcatgt ttactcaatc acccctaggg 480

ttgttgacga ttagcttcgc taaagatgat tcagtaactg gcactgcgaa tgctgttata 540

gagaacaagc agttgtctga agcagtgctg gaatcaataa ttgggaagca tggagtttct 600

cctgcggcaa agtgtagtgt cgctgaaaga gtagcggaac tgctcaaaaa gagctatgct 660

gaagaggcat ctgtttttgg aaaaccggag accgagaaat ctactattcc agtgattgga 720

gtctag 726

<210> 5

<211> 1170

<212> DNA

<213>姜黄(Curcuma longa)

<400> 5

atggaagcta acggttaccg tatcacccac tctgctgacg gtccagctac catcctggct 60

atcggtaccg ctaacccgac caacgttgtt gaccagaacg cttacccgga cttctacttc 120

cgtgttacca actctgaata cctgcaggaa ctgaaagcta aattccgtcg tatctgcgaa 180

aaagctgcta tccgtaaacg tcacctgtac ctgaccgaag aaatcctgcg tgaaaacccg 240

tctctgctgg ctccgatggc tccgtctttc gacgctcgtc aggctatcgt tgttgaagct 300

gttccgaaac tggctaaaga agctgctgaa aaagctatca aagaatgggg tcgtccgaaa 360

tctgacatca cccacctggt tttctgctct gcttctggta tcgacatgcc gggttctgac 420

ctgcagctgc tgaaactgct gggtctgccg ccgtctgtta accgtgttat gctgtacaac 480

gttggttgcc acgctggtgg taccgctctg cgtgttgcta aagacctggc tgaaaacaac 540

cgtggtgctc gtgttctggc tgtttgctct gaagttaccg ttctgtctta ccgtggtccg 600

cacccggctc acatcgaatc tctgttcgtt caggctctgt tcggtgacgg tgctgctgct 660

ctggttgttg gttctgaccc ggttgacggt gttgaacgtc cgatcttcga aatcgcttct 720

gcttctcagg ttatgctgcc ggaatctgct gaagctgttg gtggtcacct gcgtgaaatc 780

ggtctgacct tccacctgaa atctcagctg ccgtctatca tcgcttctaa catcgaacag 840

tctctgacca ccgcttgctc tccgctgggt ctgtctgact ggaaccagct gttctgggct 900

gttcacccgg gtggtcgtgc tatcctggac caggttgaag ctcgtctggg tctggaaaaa 960

gaccgtctgg ctgctacccg tcacgttctg tctgaatacg gtaacatgca gtctgctacc 1020

gttctgttca tcctggacga aatgcgtaac cgttctgctg ctgaaggtca cgctaccacc 1080

ggcgaaggtc tggactgggg tgttctgctg ggtttcggtc caggtctgtc tatcgaaacc 1140

gttgttctgc actcttgccg tctgaactaa 1170

<210> 6

<211> 1173

<212> DNA

<213>姜黄(Curcuma longa)

<400> 6

atgggcagtc tccaagccat gcgtcgtgcg caacgtgcgc aaggcccagc gaccatcatg 60

gcggttggca cgagcaatcc accaaatctg tacgagcaga ccagctaccc ggatttctac 120

ttccgcgtta cgaacagcga ccataagcat gagctgaaaa ataaattccg tgttatctgt 180

gaaaagacga aggtgaaacg ccgctatctg catctgaccg aagagatcct caaacagcgc 240

ccgaaactgt gcagctacat ggagccgagt ttcgacgacc gtcaagatat cgtggtggag 300

gagattccga aactggcgaa agaagcggcc gaaaaagcga ttaaggagtg gggtcgccca 360

aaaagcgaga tcacccacct cgtgttctgc agcatcagcg gtatcgacat gccgggcgcc 420

gattatcgtc tggccacgct gctcggtctg ccactgagcg ttaaccgtct gatgctgtac 480

agccaagcgt gccacatggg tgcccaaatg ctgcgcatcg ccaaggatct ggccgaaaat 540

aatcgcggtg cccgcgttct ggccgttagc tgcgaaatca ccgttctgag cttccgtggc 600

ccagatgccg gcgattttga agcgctggcg tgccaagcgg gttttggtga cggtgcggcg 660

gcggttgttg ttggtgccga cccactgccg ggtgtggaac gtccaatcta tgagattgcc 720

gccgcgatgc aagaaaccgt tccggagagt gaacgcgccg ttggcggcca tctccgtgag 780

atcggctgga ccttccactt cttcaatcag ctgccgaaac tgatcgcgga gaacatcgaa 840

ggcagtctgg cccgtgcgtt caagccactg ggtatcagtg agtggaacga cgtgttctgg 900

gttgcccacc cgggtaattg gggcatcatg gatgcgatcg agacgaaact gggtctggaa 960

caaggcaaac tggcgacggc gcgtcacgtt ttcagcgagt acggcaatat gcagagcgcc 1020

accgtgtact tcgtgatgga tgaggtgcgt aagcgcagtg ccgccgaagg tcgtgcgacg 1080

acgggtgaag gtctcgaatg gggcgtgctg tttggttttg gtccgggcct caccatcgaa 1140

accgttgtgc tgcgcagtgt gccactgccg taa 1173

<210> 7

<211> 1776

<212> DNA

<213>谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400> 7

gtgtcagtcg agactaggaa gatcaccaag gttcttgtcg ctaaccgtgg tgagattgca 60

atccgcgtgt tccgtgcagc tcgagatgaa ggcatcggat ctgtcgccgt ctacgcagag 120

ccagatgcag atgcaccatt cgtgtcatat gcagacgagg cttttgccct cggtggccaa 180

acatccgctg agtcctacct tgtcattgac aagatcatcg atgcggcccg caagtccggc 240

gccgacgcca tccaccccgg ctacggcttc ctcgcagaaa acgctgactt cgcagaagca 300

gtcatcaacg aaggcctgat ctggattgga ccttcacctg agtccatccg ctccctcggc 360

gacaaggtca ccgctcgcca catcgcagat accgccaagg ctccaatggc tcctggcacc 420

aaggaaccag taaaagacgc agcagaagtt gtggctttcg ctgaagaatt cggtctccca 480

atcgccatca aggcagcttt cggtggcggc ggacgtggca tgaaggttgc ctacaagatg 540

gaagaagtcg ctgacctctt cgagtccgca acccgtgaag caaccgcagc gttcggccgc 600

ggcgagtgct tcgtggagcg ctacctggac aaggcacgcc acgttgaggc tcaggtcatc 660

gccgataagc acggcaacgt tgttgtcgcc ggaacccgtg actgctccct gcagcgccgt 720

ttccagaagc tcgtcgaaga agcaccagca ccattcctca ccgatgacca gcgcgagcgt 780

ctccactcct ccgcgaaggc tatctgtaag gaagctggct actacggtgc aggcaccgtt 840

gagtacctcg ttggctccga cggcctgatc tccttcctcg aggtcaacac ccgcctccag 900

gtggaacacc cagtcaccga agagaccacc ggcatcgacc tggtccgcga aatgttccgc 960

atcgcagaag gccacgagct ctccatcaag gaagatccag ctccacgcgg ccacgcattc 1020

gagttccgca tcaacggcga agacgctggc tccaacttca tgcctgcacc aggcaagatc 1080

accagctacc gcgagccaca gggcccaggc gtccgcatgg actccggtgt cgttgaaggt 1140

tccgaaatct ccggacagtt cgactccatg ctggcaaagc tgatcgtttg gggcgacacc 1200

cgcgagcagg ctctccagcg ctcccgccgt gcacttgcag agtacgttgt cgagggcatg 1260

ccaaccgtta tcccattcca ccagcacatc gtggaaaacc cagcattcgt gggcaacgac 1320

gaaggcttcg agatctacac caagtggatc gaagaggttt gggataaccc aatcgcacct 1380

tacgttgacg cttccgagct cgacgaagat gaggacaaga ccccagcaca gaaggttgtt 1440

gtggagatca acggccgtcg cgttgaggtt gcactcccag gcgatctggc actcggtggc 1500

accgctggtc ctaagaagaa ggccaagaag cgtcgcgcag gtggtgcaaa ggctggcgta 1560

tccggcgatg cagtggcagc tccaatgcag ggcactgtca tcaaggtcaa cgtcgaagaa 1620

ggcgctgaag tcaacgaagg cgacaccgtt gttgtcctcg aggctatgaa gatggaaaac 1680

cctgtgaagg ctcataagtc cggaaccgta accggcctta ctgtcgctgc aggcgagggt 1740

gtcaacaagg gcgttgttct cctcgagatc aagtaa 1776

<210> 8

<211> 1635

<212> DNA

<213>谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<400> 8

atgatgacca tttcctcacc tttgattgac gtcgccaacc ttccagacat caacaccact 60

gccggcaaga tcgccgacct taaggctcgc cgcgcggaag cccatttccc catgggtgaa 120

aaggcagtag agaaggtcca cgctgctgga cgcctcactg cccgtgagcg cttggattac 180

ttactcgatg agggctcctt catcgagacc gatcagctgg ctcgccaccg caccaccgct 240

ttcggcctgg gcgctaagcg tcctgcaacc gacggcatcg tgaccggctg gggcaccatt 300

gatggacgcg aagtctgcat cttctcgcag gacggcaccg tattcggtgg cgcgcttggt 360

gaggtgtacg gcgaaaagat gatcaagatc atggagctgg caatcgacac cggccgccca 420

ttgatcggtc tttacgaagg cgctggcgct cgtattcagg acggcgctgt ctccctggac 480

ttcatttccc agaccttcta ccaaaacatt caggcttctg gcgttatccc acagatctcc 540

gtcatcatgg gcgcatgtgc aggtggcaac gcttacggcc cagctctgac cgacttcgtg 600

gtcatggtgg acaagacctc caagatgttc gttaccggcc cagacgtgat caagaccgtc 660

accggcgagg aaatcaccca ggaagagctt ggcggagcaa ccacccacat ggtgaccgct 720

ggtaactccc actacaccgc tgcgaccgat gaggaagcac tggattgggt acaggacctg 780

gtgtccttcc tcccatccaa caatcgctcc tacgcaccga tggaagactt cgacgaggaa 840

gaaggcggcg ttgaagaaaa catcaccgct gacgatctga agctcgacga gatcatccca 900

gattccgcga ccgttcctta cgacgtccgc gatgtcatcg aatgcctcac cgacgatggc 960

gaatacctgg aaatccaggc agaccgcgca gaaaacgttg ttattgcatt cggccgcatc 1020

gaaggccagt ccgttggctt tgttgccaac cagccaaccc agttcgctgg ctgcctggac 1080

atcgactcct ctgagaaggc agctcgcttc gtccgcacct gcgacgcgtt caacatccca 1140

atcgtcatgc ttgtcgacgt ccccggcttc ctcccaggcg caggccagga gtacggtggc 1200

attctgcgtc gtggcgcaaa gctgctctac gcatacggcg aagcaaccgt tccaaagatc 1260

accgtcacca tgcgtaaggc ttacggcgga gcgtactgcg tgatgggttc caagggcttg 1320

ggctctgaca tcaaccttgc atggccaacc gcacagatcg ccgtcatggg cgctgctggc 1380

gcagttggat tcatctaccg caaggagctc atggcagctg atgccaaggg cctcgatacc 1440

gtagctctgg ctaagtcctt cgagcgcgag tatgaagacc acatgctcaa cccgtaccac 1500

gctgcagaac gtggcctgat cgacgccgtg atcctgccaa gcgaaacccg cggacagatt 1560

tcccgcaacc ttcgcctgct caagcacaag aacgtcactc gccctgctcg caagcacggc 1620

aacatgccac tgtaa 1635

Claims

1.一种高活性苯丙素类衍生物的定向设计方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）获得苯丙素类化合物合成前体的结构类似物；

（2）根据所述结构类似物构建苯丙素类衍生物的结构；

（3）利用计算机辅助，将构建的苯丙素类衍生物的结构与目标靶蛋白进行分子对接，预测其活性高低；

步骤（2）中使用对氨基肉桂酸作为合成前体，构建氨基的苯丙素类衍生物；

所述苯丙素类衍生物是姜黄素类化合物、芪类化合物或黄酮类化合物；

所述姜黄素类化合物是氨基双去甲氧基姜黄素，分子式为C₁₉H₁₈N₂O₂，结构式为：

；

所述芪类化合物是氨基白藜芦醇，分子式为C₁₄H₁₃NO₂，结构式为：

；

所述黄酮类化合物是氨基柚皮素，分子式为C₁₅H₁₃NO₄，结构式为：

；

所述高活性苯丙素类衍生物的生物合成方法包括：

或，构建得到合成氨基双去甲氧基姜黄素的大肠杆菌工程菌，发酵产生氨基双去甲氧基姜黄素；

合成氨基白藜芦醇的大肠杆菌工程菌的构建方法包括以下步骤：

（1）全合成拟南芥4-香豆酰辅酶A连接酶基因4cl和葡萄芪合成酶基因sts，核苷酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；

（2）以谷氨酸棒状杆菌基因组为模板，克隆乙酰辅酶A羧化酶基因accBC和dtsR1，核苷酸序列分别如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；

（3）利用Novagen λDE3溶原化试剂盒对大肠杆菌MG1655进行溶原化，得到MG1655(DE3)菌株；

（4）将序列4cl与表达载体pACYCDuet进行连接，得到重组表达质粒pJQK336；将序列sts与表达载体pRSFDuet进行连接，得到重组表达质粒pJQK337；将序列accBC、dtsR1与表达载体pCDFDuet进行连接，得到重组表达质粒pJQK342；

（5）将重组表达质粒pJQK336、pJQK337和pJQK342共同转入大肠杆菌MG1655 (DE3)中，得到所述合成氨基白藜芦醇的大肠杆菌工程菌。

2.根据权利要求1所述的高活性苯丙素类衍生物的定向设计方法，其特征在于，合成氨基柚皮素的大肠杆菌工程菌的构建方法包括以下步骤：

（1）全合成矮牵牛查尔酮合成酶基因chs、查尔酮异构酶基因chi，核苷酸序列分别如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示；

（2）全合成拟南芥4-香豆酰辅酶A连接酶基因4cl，核苷酸序列分别如SEQ ID No.1所示；

（3）以谷氨酸棒状杆菌基因组为模板，克隆乙酰辅酶A羧化酶基因accBC和dtsR1，核苷酸序列分别如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；

（4）将序列4cl与表达载体pACYCDuet进行连接，得到重组表达质粒pJQK336；将序列chs、chi与表达载体pRSFDuet进行连接，得到重组表达质粒pJQK338；将序列accBC、dtsR1与表达载体pCDFDuet进行连接，得到重组表达质粒pJQK342；

（5）利用Novagen λDE3溶原化试剂盒对大肠杆菌MG1655进行溶原化，得到MG1655(DE3)菌株；

（6）将重组表达质粒pJQK336、pJQK338和pJQK342共同转入大肠杆菌MG1655 (DE3)中，得到所述合成氨基柚皮素的大肠杆菌工程菌。

3.根据权利要求1所述的高活性苯丙素类衍生物的定向设计方法，其特征在于，合成氨基双去甲氧基姜黄素的大肠杆菌工程菌的构建方法包括以下步骤：

（1）全合成姜黄二聚酮合酶基因dcs、姜黄素合成酶基因curs3，核苷酸序列分别如SEQID No.5、SEQ ID No.6所示；

（4）将序列4cl与表达载体pACYCDuet进行连接，得到重组表达质粒pJQK336；将序列dcs、curs3与表达载体pRSFDuet进行连接，得到重组表达质粒pJQK341；将序列accBC、dtsR1与表达载体pCDFDuet进行连接，得到重组表达质粒pJQK342；

（6）将重组表达质粒pJQK336、pJQK341和pJQK342共同转入大肠杆菌MG1655 (DE3)中，得到所述合成氨基双去甲氧基姜黄素的大肠杆菌工程菌。

4.根据权利要求1所述的高活性苯丙素类衍生物的定向设计方法，其特征在于，所述方法还包括在发酵液中分离提纯的步骤。

5.根据权利要求1所述的高活性苯丙素类衍生物的定向设计方法，其特征在于，所述发酵是以对氨基肉桂酸为底物进行发酵。