CN112852844A

CN112852844A - 羟甲基二氢蝶呤焦磷酸激酶基因folK的用途

Info

Publication number: CN112852844A
Application number: CN202110246861.8A
Authority: CN
Inventors: 柳陈坚; 孙世意; 李晓然
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2021-03-05
Filing date: 2021-03-05
Publication date: 2021-05-28

Abstract

本发明公开羟甲基二氢蝶呤焦磷酸激酶基因folK的新用途，即其在提高植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）叶酸生物合成中的应用，所述羟甲基二氢蝶呤焦磷酸激酶基因folK的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；本发明利用pMG36e质粒与folK基因构建过表达载体，并导入食源性植物乳杆菌感受态细胞中，获得过表达菌株H‑folK；采用LC‑MS法测定菌株产叶酸能力，发现与野生型菌株相比，H‑folK菌株产叶酸含量在培养24h时增加，folK基因在叶酸合成中起重要作用，本发明在叶酸生物合成研究及应用领域具有很大潜力。

Description

羟甲基二氢蝶呤焦磷酸激酶基因folK的用途

技术领域

本发明属于微生物基因应用领域，具体涉及羟甲基二氢蝶呤焦磷酸激酶基因folK在提高植物乳杆菌YM-4-3（Lactobacillus plantarum YM-4-3）叶酸生物合成中的应用。

背景技术

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的统称。它是食品发酵工业的重要微生物，它们在发酵过程中可以生成乳酸及其他有机酸，从而提高食品的保存性能，此外，它们还能产生多种次级代谢产物，赋予发酵食品具有独特的风味和营养价值。与植物性食物所含叶酸相比，由于乳酸菌发酵产生的叶酸储存于细胞内，因此可以更好地耐受胃部的酸性环境，从而提高肠道对叶酸的吸收率。

叶酸（Folic acid），化学名为蝶酰谷氨酸（pteroylglutamic acid），是维生素 B9的水溶性形态，由 H.K. Mitchell 等研究者首次从菠菜叶中分离纯化而来，并由此得名。叶酸（folate）通常是指一组化学结构和生物特征相类似的化合物，由蝶呤、对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid, pABA)和一个或多个谷氨酸结合而成，叶酸具有重要的生理功能，是人类饮食中必须的微量元素，涉及很多的代谢途径，主要在碳转移反应，比如嘌呤和嘧啶生物合成和氨基酸的相互转变中。由于哺乳动物细胞自身不能合成叶酸，只能通过摄取食物获得，因此一旦摄取量过少，即会引起机体发生相应的叶酸缺乏性疾病。另外生物体普遍需要叶酸，然而不同的生物体获得该营养物的途径各不相同。

许多研究表明乳酸菌具有合成叶酸的能力，其中植物乳杆菌产叶酸的量较高，被认为是较好的叶酸生产者。乳酸菌合成叶酸的主要途径由蝶呤分支和对氨基苯甲酸（pABA）分支组成。而当前研究中，仅对pABA代谢这一支路有比较深入的研究，而对蝶呤代谢支路的研究少之甚少，因此与此通路上相关的基因的作用及对于叶酸生物合成的调控乃至对整个菌株的代谢的影响仍缺乏系统的研究。

由于叶酸是人类必不可少的微量元素之一，而且随着经济和科技的快速发展，人类对健康的需求也在不断升高，因此生物合成叶酸显得尤为重要。乳酸菌合成的叶酸因其具有安全性及有效性，促使其在市场上更具有竞争力。但是通常情况下叶酸合成量普遍不高，且菌株稳定性较差，提取和纯化成本高等因素制约着乳酸菌叶酸在工业生产中大规模的应用，因此将愈加成熟的基因工程技术对相应菌株基因层面的改造结合最优的培养条件能有效提高叶酸合成量并降低成本，并使得乳酸菌来源的叶酸的工业化生产成为可能。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种羟甲基二氢蝶呤焦磷酸激酶基因folK的用途，即羟甲基二氢蝶呤焦磷酸激酶基因folK在提高植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）叶酸生物合成中的用途，所述基因folK的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，该基因序列长为513bp（碱基）。

本发明从植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）YM-4-3中克隆羟甲基二氢喋呤焦磷酸激酶基因folK，将folK基因与组成型表达质粒 pMG36e酶切连接后，获得重组表达载体，

将其转入野生型植物乳杆菌YM-4-3中，在野生型YM-4-3菌株体内实现folK基因的过表达，获得重组菌株，通过实验比较野生型菌株YM-4-3与过表达菌株H-folK叶酸产量，证明folK基因在叶酸合成中起关键作用，本发明在叶酸生物合成的研究及应用领域具有较大潜力。

与现有技术相比本发明具有以下优势：

1、本发明基因来自于食源性食物乳杆菌，具有安全性，可用于后期食品发酵领域；

2、本发明证明了folK基因在叶酸合成中的重要作用，为叶酸合成功能性食品的研发提供理论基础；本发明在叶酸生物合成研究及应用领域具有巨大潜力。

附图说明

图1为本发明过表达菌株H-folK的菌液PCR验证图，其中M为2000bp Marker，泳道1、2为对照；泳道3为重组过表达载体酶切验证；

图2为本发明野生型及过表达H-folK菌株里folK基因的表达量结果示意图；

图3为本发明野生型及过表达H-folK菌株的单个细胞内叶酸总含量结果示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法，下述实施例中的结果如无特别说明，均为三次重复的平均值。

实施例1：羟甲基二氢蝶呤焦磷酸激酶基因folK的克隆及重组表达载体的构建

1、将植物乳杆菌YM-4-3菌株解冻后，按4‰的比例接种至MRS肉汤培养基中，37℃静置培养16h，培养后的菌液使用CTAB/酶法提取基因组DNA；

2、 folK基因片段扩增与测序

以植物乳杆菌YM-4-3基因作为模板，利用K-BD-F和K-BD-R引物对folK基因进行PCR扩增；

K-YG-F：CAAGCCCTTAGCCGATTACG

K-YG-R：GCTTTCCCCACGGTTGAGTC；

PCR扩增体系（50 μL）如下：

；

PCR扩增程序：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min；12℃保存；将扩增出的PCR产物测序；测序结果显示，获得一段513bp长的序列，核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示；

3、过表达载体的构建及验证

（1）使用质粒小提试剂盒（天根）从以活化好含有 pMG36e 质粒的大肠杆菌中提取空 pMG36e 质粒，提取步骤参照试剂盒说明书；

（2）步骤2扩增获得的PCR产物纯化后和空pMG36e 质粒经HindⅢ、XmaⅠ两个限制性内切酶进行酶切，酶切体系如下：

；

37℃酶切4h后，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，参照胶回收试剂盒说明书进行酶切产物回收，-20℃保存。

（3）取出酶切产物，纯化后使用T4连接酶连接，16℃连接过夜，连接体系如下：

；

（4）连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株及验证

1) 从-80℃冰箱中拿出制备好的大肠杆菌DH5α感受态，冰上解冻后，加入全部连接反应好的连接产物，轻轻吹打混匀，冰上放置30min；

2) 42℃加热 45s 后，冰上放置2min；

3) 加入890μL SOC培养基，37℃摇床培养60min；

4) 将菌液在8000rpm/min条件下离心1min，取出900μL上清，剩余100μL菌悬液；

5) 将菌悬液涂布于含有500µg/mL红霉素的LB平板上，筛选转化子(28℃倒置培养)；

6）挑选单个菌落使用Pmg36e-F和pmg36e-R引物进行菌液PCR验证，挑选阳性克隆；送至测序公司测序；

Pmg36e-F：ATTCGGTCCTCGGGATATG

pmg36e-R：TTCATTCAGTCATCGGCTTTCA；

测序结果显示：测序获得的序列与理论值相同，重组表达载体构建成功；

（5）重组表达载体提取

挑选测序正确的含有重组表达载体的大肠杆菌在37℃、200rpm/min下过夜培养，使用 Genestar Starprep Plasmid Miniprep Kit 试剂盒进行质粒提取，操作步骤参考说明书；琼脂糖凝胶电泳验证质粒提取成功。

（6）重组表达载体转化YM-4-3菌株感受态细胞

1）YM-4-3菌株感受态细胞的制备

YM-4-3菌株解冻后按4‰接种量接种至MRS肉汤培养基中，37℃培养12h，取1mL接种于含有2.5%甘氨酸的50mL MRS肉汤培养基中，培养至其OD ₆₀₀值达到0.6时停止培养，4℃、4000 rpm/min下离心10min 收集菌液；用25mL 冰冷的无菌水洗涤两次，再次离心，弃上清，将菌体重悬于0.05mol/L冰冷的EDTA溶液中，冰浴5min，再加入25mL冰冷的无菌水，于4℃、8000 rpm/min离心5min，再用25mL冰冷的无菌水洗涤，用25mL电击缓冲液（0.5 mol/L蔗糖，10%甘油），在4℃、8000 rpm/min下离心10min，重复一次；将菌体重悬于0.8mL电击缓冲液中，每个100μL分装于灭菌的离心管中，-80℃保存。

2）表达载体转化YM-4-3菌株感受态细胞

取出于无水乙醇中浸泡的电转杯，转移至75%的乙醇中浸泡3-4h，放在超净工作台中风干乙醇并紫外灭菌，取YM-4-3感受态细胞在冰上解冻后，加入10μL已构建好且序列正确的表达载体，将混合液转移至电转杯凹槽处，盖好盖子，放置电转仪中，2.5 kV处理2 s；电击完成后，立即加入890μL MRS 肉汤培养基，轻轻吹打混匀后，转移至干净的离心管中，28℃培养4h，培养好的菌液8000rpm/min离心2min，留100μL悬浮菌液涂布于含50μg/mL红霉素的MRS 固体培养基平板，37℃倒置培养；

3）PCR法筛选重组菌株

挑选单个菌落接种至含有50μg/mL红霉素的MRS液体培养基中，37℃静置培养过夜，使用用Pmg36e-F和pmg36e-R引物进行菌液 PCR，挑选阳性克隆，从而获得过表达folK基因的菌株H-folK，菌液PCR验证结果见图1，测序结果和序列比对结果与理论值相同，表明过表达载体构建成功。

实施例2：荧光定量 PCR (Real-time Qμantitative PCR) 测定folK基因表达量

（1）菌株总RNA提取

取出从-80℃冰箱保藏的野生型菌株YM-4-3及过表达H-folK菌株，以4‰（v/v）比例分别接种于2mL MRS液体培养基中，37℃中静置培养16h；使用液氮在已灭菌的研钵中将培养好的菌体研磨成粉末状，再参照上海生工生物公司UNIQ-10柱式Trizol总RNA 抽提试剂盒步骤进行提取；琼脂糖凝胶电泳验证RNA提取的完整性；选用完整性良好的总RNA，使用南京诺唯赞生物公司反转录试剂盒（HiScriptoR II Q RT SuperMix for qPCR）中步骤进行反转录实验；并将其反转录成可以使用的cDNA，-20℃保存。

（2）荧光定量 PCR 测定相对表达量

使用qPCR方法验证过表达菌株H-folK相比于野生型菌株YM-4-3在叶酸合成DHPPP途径中folK基因的表达差异

①引物扩增效率

取出-20℃保存的cDNA溶液，于冰上解冻后，使用无菌水，按10倍梯度稀释至10^-1、10^-2 、10^-3和10^-4 四个梯度，按照下表配制 qPCR 反应体系；

引物序列：

K-BD-F：ATACCCGGGCATGGCAAGTAGGGAAGAACG

K-BD-R：CCCAAGCTTTCAATCATCTAACTCACTCAC；

qPCR反应程序： 95℃预变性5 min；循环反应95℃10 s，55℃（退火温度）15s，循环40次；溶解曲线，95℃，15 s；60℃，60 s；95℃，15s；程序完毕，获得反应 Ct 值。

②目的基因qPCR

根据计算引物扩增效率得到不用模板浓度对应的Ct值选择合适的模板浓度，选择将得到的cDNA稀释100倍进行目的基因qPCR 实验。反应体系及程序与步骤①中相同，只是退火温度根据引物的不同发生改变。最后，得到反应C值，通过 2-△△CT方法计算不同菌株不同基因相对表达量。计算：利用 qPCR进行相对荧光定量，使用2-△△CT法计算表达差异量，其中△Ct1=Ct对照目的-Ct对照内参，△Ct2=Ct实验目的-Ct实验内参，△△Ct=△Ct1-△Ct2，当 2-△△CT≥2 时，认为基因是过量表达；结果如图2所示，通过比较 folK基因在过表达菌株H-folK和野生型菌株YM-4-3里的表达量可以发现，菌株H-folK中folK基因的表达量是野生型菌株的88倍，这充分证明表达载体成功导入敲除型菌株，且进行了基因的强烈表达。

实施例3：叶酸含量及OD600值测定

1、叶酸含量测定

1）菌株培养

将储存于-80℃的YM-4-3及H-folK菌株按体积分数4‰的量接种于新鲜的MRS肉汤培养基中，37℃静置培养18h进行活化后，再次按体积分数为 4‰的量接种于新鲜的FACM液体培养基中，37℃培养18h；接种于FACM 液体培养基中的菌液在FACM培养基中连续传代3次后进行菌落计数，之后按10⁷CFU/mL的浓度接种于30mL FACM液体培养基中，37℃静置培养；每株菌分别接种3瓶，每隔24h取出一瓶作为此时间点下叶酸的产量；在H-folK菌株培养转接过程中，培养基均含5μg/mL的红霉素以防质粒丢失；

2）将上述培养的菌液取600µL稀释5倍后测OD600，剩余菌液避光超声破碎处理20min，12000rpm/min离心10min 后，取1mL上清冷冻干燥，将样品加入1mL 1%氨水溶解，超声 5min，12000 rpm/min离心 10 min，取上清用于LC-MS分析叶酸含量；

标准品制备：精密称取1mg叶酸标准品溶于1mL 1%氨水溶液中，配成浓度为1mg/mL的母液，逐级稀释为200ng/mL、40ng/mL、8ng/mL、2ng/mL、0.4ng/mL、0.2ng/mL的标准品；

a、色谱条件：色谱柱，Waters ACQUITY UPLC BEH Amide 柱(2.1mm×100mm，1.7µm)。流动相为甲醇(含5mmol/L甲酸铵)和水(含5mmol/L甲酸铵)。梯度洗脱：0-5min，98%-95%甲醇；5-10min，95%-55%甲醇；10-12min，55%甲醇；12-14min，55%-98%甲醇；14-20min，98%甲醇；流速为0.2 mL/min，柱温为35℃，进样量为5µL；

b、质谱条件：4500QTrap 质谱参数设置如下：气帘气(CUR)25，碰撞气(CAD)中等，离子源气 1 (GS1) 45，离子源气 2 (GS2) 50，电喷雾电压 5500 V，加热器温度350℃，选用正离子模式进行检测，离子源为 ESI 电离源；

结果如图3所示，在前12h（对数生长期）过表达菌株H-FolK产叶酸的能力显著高于野生型菌株；证明folK基因在植物乳杆菌叶酸合成中发挥关键作用；因此，后续可通过过量表达羟甲基二氢蝶呤焦磷酸激酶的方式提高叶酸产量，以达到扩大生产的目的，为植物乳杆菌YM-4-3菌株及其代谢产物在工业上的应用提供理论基础。

序列表

<110> 昆明理工大学

<120> 羟甲基二氢蝶呤焦磷酸激酶基因folK的用途

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 513

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌YM-4-3(Lactobacillus plantarum YM-4-3)

<400> 1

atggcaagta gggaagaacg ggtttatttg agtgttggtt ccaatattca tccgcgcgtc 60

caaaatattc agcaagccct tagccgatta cgagccgtca atggggtaaa cgtgattgac 120

gaatctcatt ggtatgagac tcaaccgtgg ggaaagcgtg atcaggccaa tttttacaat 180

gtttcggtat ccttaacgac taatttgaca ccagaagaac tattggatga attacataca 240

attgagcagg cgggccaccg ccaacgcttg gttcactggg gaccacgtac gattgatttg 300

gacattattt tttggggcga ccggcaaatc aacacagcga cgctgacgat tccgcatgcg 360

caggcagcta agcgcaactt tgtgctactg ccaactgctg aaatcgccaa aactgatgtg 420

ttagttggac cacaagtggc ccaattgatt gcggctaatc aggatcagag ttggattaaa 480

aaagtaagaa atgtgagtga gttagatgat tga 513

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

caagccctta gccgattacg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

gctttcccca cggttgagtc 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

attcggtcct cgggatatg 19

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

ttcattcagt catcggcttt ca 22

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 6

atacccgggc atggcaagta gggaagaacg 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 7

cccaagcttt caatcatcta actcactcac 30

Claims

1.羟甲基二氢蝶呤焦磷酸激酶基因folK在提高植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）叶酸生物合成中的应用，所述羟甲基二氢蝶呤焦磷酸激酶基因folK的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。