CN115261396B - 一种黑曲霉酯合成酶An605、编码基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黑曲霉酯合成酶An605基因及其应用。所述酯合成酶An605的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。具体公开了黑曲霉酯合成酶An605编码基因及携带所述基因的大肠杆菌表达载体的构建，同时还公开了所述酯合成酶An605在水相体系催化合成白酒风味物质癸酸乙酯中的应用。本发明首次提供了一种在水相体系高效催化合成癸酸乙酯的酶和编码基因。

Description

一种黑曲霉酯合成酶An605、编码基因及其应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种黑曲霉酯合成酶An605及其编码基因在水相体系中催化合成癸酸乙酯中的应用。

背景技术

浓香型白酒的主体物质是水和乙醇，以及少量风味物质如酯、酸、酮类化合物等，虽然其含量仅占酒体总量的1％-3％，却是白酒的灵魂所在，决定产品的风格。其中，酯类物质对浓香型白酒品质起着重要作用。实际生产中，将酒体中己酸乙酯等重要酯类含量的高低作为产品品质的重要衡量参数已成为业内共识。然而，由于酿造过程产酯生香慢，即己酸乙酯、癸酸乙酯和其他酯类的合成效率低，导致酿造生香周期长且优质酒出酒率低，而己酸乙酯、癸酸乙酯等重要酯类含量偏低历来是浓香型白酒品质差和优质酒出酒率低的关键原因之一。虽然通过勾调过程外加化学香精己酸乙酯等可以提高酯含量，但此类产品感官上往往呈现“浮香”，刺激性强，香味不协调且缺乏优质酒的“窖香”和“糟香”，失去“窖香浓郁、香味协调”的特点，严重影响产品品质。探究重要酯类的合成机制，对于从根本上保障浓香型白酒的产品品质和生产的稳定性，具有重要作用。研究表明，微生物所产酯合成酶对浓香型白酒癸酸乙酯的合成具有显著贡献。

中国传统浓香型白酒酿造过程具有复杂而独特的微生物区系，且不同种属的多种微生物均可以产生酯合成酶。然而到目前为止，尚无报道黑曲霉来源高效催化合成癸酸乙酯的酯合成酶。原因在于白酒酿造过程复杂的微生物区系，黑曲霉并未被聚焦研究。因此，挖掘黑曲霉来源具有催化合成癸酸乙酯能力的酯合成酶，对于保障白酒中关键风味酯类的稳定合成，具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黑曲霉酯合成酶An605及其基因在水相体系催化合成癸酸乙酯中的应用。

本发明是通过以下技术方案来实现：

本发明公开了一种黑曲霉酯合成酶An605，具有在白酒酿造的水相体系环境中催化合成癸酸乙酯的性能，所述酯合成酶An605的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还公开了一种含有上述黑曲霉酯合成酶An605编码基因的大肠杆菌表达载体，所述载体克隆区域核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还公开了一种黑曲霉酯合成酶An605在制备癸酸乙酯中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明利用生物基因工程技术，克隆并诱导表达获得黑曲霉酯合成酶An605及其编码基因，并构建含有酯合成酶An605编码基因的大肠杆菌表达质粒，将该质粒转入大肠杆菌中，经过诱导表达获得该酶，并经催化体系验证具有在水相体系催化合成癸酸乙酯的能力，纯化后催化合成癸酸乙酯的产量为268.5mg/L。本发明的酯合成酶An605，可用于在白酒酿造的水相体系催化合成重要风味酯癸酸乙酯。

本发明所述酯合成酶An605可通过大肠杆菌工程菌诱导表达获得，用于在水相体系中催化合成癸酸乙酯，为提升白酒品质的实际应用和大规模的工业化生产提供参考价值。

附图说明

图1为酯合成酶An605编码基因的PCR扩增结果

图2为酯合成酶An605编码基因的诱导表达结果

图3为酯合成酶An605编码基因诱导表达粗酶液的纯化结果

图4为酯合成酶An605催化合成癸酸乙酯气相色谱的原始图谱

图5为酯合成酶An605催化合成癸酸乙酯的定量计算结果(作为摘要附图)

具体实施方式

下面结合具体的附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。下述实施例中未详细述及的操作步骤或条件，均按照本领域常规技术、条件实现。

实施例1 酯合成酶An605编码基因的克隆

1.1 黑曲霉的培养

在无菌操作条件下，将黑曲霉接种于含有100mL发酵培养基的250mL三角瓶中，在28±1℃条件下，250±10rpm振荡培养7d。所述的发酵培养基的组成为乳糖90g/L、黄豆饼粉10g/L、MgSO₄ 0.20g/L、(NH₄)₂SO₄ 20g/L、NaH₂PO₄ 1.0g/L，调节pH至4.5，115℃高压灭菌20min。

1.2 黑曲霉总RNA的提取

1.2 黑曲霉总RNA的提取

采用TRNzol Universal总RNA提取试剂盒对黑曲霉的总RNA进行提取。具体步骤如下：

(1)将真菌置于研钵中，加入液氮用研磨杵将其研磨成粉末，迅速转移100mg粉末至已加入1mL TRNzol Universal总RNA提取试剂离心管中。

(2)匀浆样品室温放置5min，4℃条件下，12000rpm离心10min，吸取上清液移至1.5mL离心管中。

(3)加入200μL氯仿，涡旋振荡15s，室温条件下放置3min，4℃条件下，12000rpm离心15min，样品分为三层，RNA主要在水相中，把水相(约500μL)转移至新的离心管中。

(4)加入等体积的异丙醇，混匀，室温条件下放置10min，4℃条件下，12000rpm离心10min，弃去上清液。

(5)加入1mL的75％乙醇(用RNase-Free ddH₂O配制)洗涤沉淀，4℃条件下，12000rpm离心5min，弃去上清液。

(6)4℃条件下，12000rpm离心1min，将残留在管壁的乙醇收集在管底，用枪头吸出，注意不能吸去沉淀。

(7)在室温条件下放置2-3min，晾干后加入30-100μL的RNase-Free ddH₂O于1.5mL收集管中，充分溶解RNA。提取获得的RNA可直接用于后续实验或者于-80℃条件下存放。

1.3 cDNA模板的制备

采用TIANGEN反转录试剂盒FastQuant RT Kit(with gDNase)制备cDNA模板，具体步骤如下：

50ng-2μg总RNA可建立20μL反应体系。

(1)将提取的RNA样品在冰上解冻；5×gDNA Buffer、FQ-RT Primer Mix、10×FastRT Buffer和RNase-Free ddH₂O在室温条件下(15-25℃)解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁上的液体。

以下操作步骤在冰上进行。为保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，预先配制成Mix，再分装到每个反应管中。

(2)按照表1的基因组DNA去除体系配制混合液，混匀。简短离心，置于42℃条件下孵育3min后移至冰上放置。

表1 gDNA去除反应体系

(3)反转录的反应体系，如表2所示。

表2 反转录的反应体系

(4)将反转录反应中的Mix，加入至gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀。

(5)42℃，孵育15min。

(6)95℃，孵育3min后置于冰上，获得的cDNA可用于后续实验或低温保存。

1.4 PCR扩增酯合成酶An605的编码基因

通过PCR扩增黑曲霉来源的酯合成酶An605的编码基因。引物序列如下：

正向引物P1F：5′-TAAGAAGGAGATATACCATGATGCATACTCCATATCTTC-3′

反向引物P1R：5′-GGTGGTGCTCGAGTGCGATGTAGCTCCGATCAATCCAG-3′

PCR反应体系见下表。

PCR反应体系如表3所示。

表3 An605扩增的PCR反应体系

PCR反应程序如表4所示。

表4 An605扩增的PCR反应程序

An605扩增的琼脂糖凝胶电泳的检测结果如图1所示。

实施例2 构建表达酯合成酶An605的大肠杆菌工程菌株

2.1 pET-28a(+)载体的线性化

设计引物通过PCR进行pET-28a(+)载体的线性化。引物序列如下：

正向引物P2F：5′-CTGAGATCCGGCTGCTAA-3′

反向引物P2R：5′-ACTTCCTCTTGGCACCAGGCCGCTGCT-3′

PCR反应体系如表5所示。

表5 线性化载体pET-28a(+)的PCR反应体系

PCR反应程序如表6所示。

表6 线性化载体pET-28a(+)的PCR反应程序

PCR产物纯化后，用于载体构建。

2.2 质粒构建

利用

One Step Cloning Kit进行载体构建。引物设计原则：通过在引物5′端引入线性化载体末端同源序列，使得插入片段扩增产物5′和3′末端分别带有和线性化载体两末端对应的完全一致的序列(15-20bp)。基于此原则设计基因扩增的引物进行重组反应，于冰水浴中配制如下反应体系。连接反应体系如表7所示。

表7 连接反应体系

体系配制完成后，用移液器轻柔吹吸混匀各组分。置于37±1℃条件下反应30min后，立即移至冰水浴中冷却5min。

2.3 大肠杆菌的转化

取20μL冷却连接液，加入到200μL大肠杆菌感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，冰上放置30min。42℃热激45-90s，冰浴孵育2min。加入600μL的LB液体培养基，在37±1℃条件下振荡培养60min使其充分复苏。取100μL菌液均匀涂布于含有适量硫酸卡那霉素的LB培养基平板上。将平板倒置，在37±1℃条件下过夜培养。所述的LB培养基配方：酵母粉5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L，调节pH为7.0(固体培养基需添加2％的琼脂粉)，121℃高压灭菌20min。

实施例3 酯合成酶An605粗酶液在水相体系中催化癸酸乙酯合成能力的检测

3.1 酯合成酶An605的诱导表达

挑取经验证正确的转化子，转接于含有适量硫酸卡那霉素的LB液体培养基试管，37±1℃过夜培养，然后以1％(v/v)的接种量接种含有100mL LB培养基的300mL三角瓶，在37±1℃条件下，200±10rpm振荡培养3h，加入终浓度为0.5mM的诱导剂乳糖，在20±1℃条件下，200±10rpm振荡培养20h。

3.2 酯合成酶An605粗酶液的制备

大肠杆菌诱导表达后10000rpm离心5min收集菌体，用0.05M Tris-HCl缓冲液(pH7.4)洗涤菌体2次，悬浮菌体。利用超声波细胞破碎仪破碎细胞，12000rpm离心10min，其上清液作为粗酶液，利用SDS-PAGE电泳以确定目标蛋白的表达(图2)，以备进行酯化酶An605催化酯合成能力的检测。

3.3 An605粗酶液催化酯合成能力的检测

10mL反应体系：粗酶液，1mL；柠檬酸缓冲液(pH 4.0)，9mL(加入乙醇至1M)；癸酸，终浓度均为10mM。在30±1℃条件下，150±10rpm振荡反应12h。利用3mL正己烷进行萃取，以备气相色谱定量检测酯的合成量。

3.4 An605粗酶液的纯化

在蛋白纯化仪中将粗酶液进行纯化，收集得到纯酶液，利用SDS-PAGE电泳以确定目标蛋白的表达(图3)，进行酯化酶An605催化酯合成能力的检测。

3.5 An605纯酶液催化酯合成能力的检测

1mL反应体系：纯酶液10μL；柠檬酸、Na₂HPO₄缓冲液(pH 4.0)，960μL(加入乙醇至1M)；CaCl₂溶液，终浓度为2mM；癸酸，终浓度为10mM。30±1℃水浴反应1h。利用600μL正己烷进行萃取，以备气相色谱定量检测酯的合成量。

3.6 气相色谱定量检测酯的合成量

色谱柱为Agilent 19091N-213I。检测条件为40℃，保持5min；以8℃/min的速度升至170℃，保持10min；以8℃/min的速度升至240℃，保持5min。进样量为1μL，不分流。载气为氮气，流速为1mL/min，检测器为FID。

结果证实，本发明构建的表达酯合成酶An605的大肠杆菌工程菌的纯酶液具有在水相体系中催化癸酸乙酯合成的能力(图4)，产量为268.5mg/L(图5)。

Claims (1)

1.一种来源于黑曲霉的酯合成酶An605在制备癸酸乙酯中的应用，所述酯合成酶An605编码基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

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