CN110592049A - 一种黑曲霉酯水解酶AnCu3、编码基因及其在水解DEHP中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黑曲霉酯水解酶AnCu3，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；还公开了所述黑曲霉酯水解酶AnCu3在水相体系催化水解塑化剂邻苯二甲酸双(2‑乙基己)酯(DEHP)中的应用。本发明首次提供了一种黑曲霉来源的可以催化水解邻苯二甲酸双(2‑乙基己)酯的酶和编码基因，为水解邻苯二甲酸双(2‑乙基己)酯提供了一种新的途径。

Description

一种黑曲霉酯水解酶AnCu3、编码基因及其在水解DEHP中的 应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种黑曲霉酯水解酶AnCu3在水解邻苯二甲酸双(2-乙基己)酯(DEHP)中的应用。

技术背景

邻苯二甲酸酯(又称酞酸酯，phthalic acid esters，PAEs)，是邻苯二甲酸形成的酯的统称，俗称塑化剂、增塑剂。PAEs常被作为主要功能成分添加到聚氯乙烯(又名塑料，polyvinyl chloride，PVC)中，以增加PVC的柔韧性和耐久性。目前PAEs的用量超过800万吨/年，PAEs可用作油漆、粘合剂、化妆品和润滑剂的添加剂，并作为主要添加成分用于PVC材料的柔性改进，所生产改性PVC材料普遍用于建筑、汽车、医疗产品和电缆等行业。根据PAEs和PVC的相互作用，可将PAEs分为内增塑剂和外增塑剂。内增塑剂与PVC通过共价键相互作用，可被看作是PVC的固有部分；外增塑剂与PVC常通过氢键和范德华力等发生相互作用。因此，外增塑剂比内增塑剂更容易通过蒸发、迁移或萃取等途径进入环境。然而，内增塑剂对PVC材料的柔性改变相对更弱，所获得改性PVC材料的柔韧性和耐久性较差，难以满足实际的工业需求。与之相比，外增塑剂对PVC材料的改性效果更加显著，因而外增塑剂是目前主要的PVC改性添加材料。

常见PAEs包括邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DOP)、邻苯二甲酸双(2-乙基己)酯(DEHP)和邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)。其中邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)在PAEs的使用中占比较高，约37.1％，每年超过300万吨。研究表明，PAEs在人体内具有类似雌性激素的作用，会干扰内分泌，使男子精液量和精子数量减少，精子运动能力低下，精子形态异常。很多化妆品的芳香成分也含有这类物质，会通过女性的呼吸系统和皮肤进入体内，如果过多使用，会增加女性患乳腺癌的风险，并有一定几率危害到所孕男婴的生殖系统。2017年世界卫生组织国际癌症研究机构公布致癌物清单，邻苯二甲酸双(2-乙基己)酯属于2B类致癌物。目前上述6种PAEs均被美国环境保护署、欧盟(欧盟)和中国国家环境监测中心列为优先监测的污染物。

PAEs已经成为人们日常接触的最常见的化学物质之一，在塑料制品的生产、使用和处置过程中，PAEs会迁移到不同的生态系统中，比如土壤和水体。目前在各种生境甚至南极冰雪中都检测到PAEs。人们可以通过多种方式摄入PAEs，如饮食和皮肤接触等。由于PAEs对环境和人体健康的毒理学效应，研究PAEs的降解方法意义重大。目前已知的降解方法包括水解、光化学降解以及生物降解等。其中，生物降解法由于效率高、环境友好、二次污染小等优势，被认为是最重要的PAEs降解方法之一。挖掘降解PAEs的各种生物材料，比如各种微生物，以及更深入的层次，微生物所携带的有效降解PAEs的酶资源，具有重要的科学意义和实际应用价值。

发明内容

黑曲霉目前无文献报道具有邻苯二甲酸酯水解特性的羧酸酯水解酶，但本发明人在前期研究发现黑曲霉具有酯水解特性，推测可能是黑曲霉携带的羧酸酯水解酶在起作用。但羧酸酯水解酶为一个非常大的酶家族，包含95个亚家族，蛋白种类非常多，发明人通常研究最终筛选获得1个具有酯水解特性的酶。因此，本发明首次公开一个黑曲霉来源酯水解酶，具有水解邻苯二甲酸酯的能力，为邻苯二甲酸酯的生物降解提供优选的酶资源。。

因此，本发明首先提供一种黑曲霉酯水解酶AnCu3，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

进一步提供一种黑曲霉酯水解酶AnCu3编码基因，其编码上述的黑曲霉酯水解酶AnCu3。优选地，所述编码基因其的cDNA序列如SEQ ID No.2所示。

同时，本发明提供一种含有上述基因的表达载体，优选地所述表达载体是大肠杆菌表达载体，如pET-28a(+)表达载体。本发明还进一步提供含有上述表达载体的重组细胞系，优选为重组细菌，如大肠杆菌。

本发明进一步还提供一种水解邻苯二甲酸酯，优选为邻苯二甲酸双(2-乙基己)酯的方法，其特征在于，利用上述的黑曲霉酯水解酶AnCu3对邻苯二甲酸酯，优选为邻苯二甲酸双(2-乙基己)酯进行催化水解。

更具体的是，将所述黑曲霉酯水解酶AnCu3加入至邻苯二甲酸酯，优选为邻苯二甲酸双(2-乙基己)酯的溶液中，经水浴摇床进行反应。

优选地，所述黑曲霉酯水解酶AnCu3通过基因重组方法获得，更具体的是培养含有所述黑曲霉酯水解酶AnCu3基因的表达载体的大肠杆菌，经超声波细胞破碎仪破细胞，离心取清液作为酶液，优选还进一步纯化。

本发明的有益效果：本发明利用生物基因工程技术，克隆并诱导表达获得黑曲霉酯水解酶AnCu3及其编码基因。实验表明，通过构建含有酯水解酶AnCu3编码基因的大肠杆菌表达质粒，将该质粒转入大肠杆菌中，经过诱导表达获得该酶，并经催化体系验证具有在水相体系催化水解邻苯二甲酸双(2-乙基己)酯(DEHP)的能力，实验中采用粗酶液时，其水解率可高达41.20％。本发明首次获得黑曲霉来源的酯水解酶AnCu3，可以为邻苯二甲酸酯，尤其是DEHP的有效水解提供可选择的酶资源。

附图说明

图1酯水解酶AnCu3编码基因PCR扩增结果。

图2酯水解酶AnCu3编码基因诱导表达结果。

图3酯水解酶AnCu3催化水解DEHP结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。以下实施例中未详细述及的操作步骤或条件，均按照本领域常规技术、条件实现。

实施例1酯水解酶AnCu3编码基因的克隆

1、黑曲霉培养

在无菌操作条件下，将黑曲霉接种含有100mL发酵培养基的300mL三角瓶，摇床30±1℃，150±10r/min培养4-8d。所述发酵培养基，其组成为葡萄糖70g/L、黄豆饼粉10g/L、MgSO₄ 0.20g/L、NaNO₃ 2.0g/L、NaH₂PO₄ 1.0g/L，调节pH为4.5，115℃灭菌20min。

2、黑曲霉总RNA的提取

对上述培养6天的黑曲霉取样，采用BIOMIGA真菌RNA提取试剂盒提取总RNA。具体步骤如下：

(1)称取100mg真菌培养物到1.5mL或者2.0mL离心管中，液氮冷冻，用研磨小杵将真菌研磨成粉末(如果有条件，将组织置于研钵中，液氮研磨成粉末，迅速转移100mg研磨粉末到离心管中，效果更好)。样品的破碎程度将影响组织细胞裂解效果和RNA得率。

(2)加入10倍体积(1mL)Buffer RLY和1倍体积(100μl)Plantaid(使用前请摇匀)到离心管中，瞬时涡旋，充分打散研磨物。

确保β-巯基乙醇已加入到Buffer RLY中。

(3)转移上述裂解液到DNA清除柱中，13,000×g离心2分钟，弃掉DNA清除柱，保留下面收集管中的裂解液。

(4)向裂解液中加入0.5倍体积的无水乙醇(如500μl上清液应加入250μl无水乙醇)，颠倒混合均匀。

(5)转移以上混合液至一个带有收集管的吸附柱中(包括可能生成的任何沉淀)，室温下，13,000×g离心1分钟，弃废液，将吸附柱重新转移至收集管中。

(6)加入500μl Buffer RB，室温下，13,000×g离心30s，弃废液，将吸附柱放回到收集管中。

(7)加入500μl RNA Wash Buffer，室温下，13,000×g离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回到收集管中。

确保无水乙醇已加入到RNA Wash Buffer中。

(8)再次加入500μl RNA Wash Buffer到吸附柱中，室温下，13,000×g离心30s，弃废液和收集管，将吸附柱转移至一个新的收集管中。

(9)室温下，13,000×g离心2分钟(可选操作，开盖离心将更有助于乙醇的去除)，去除残留的乙醇。

注意：乙醇的残留将会降低洗脱效果和影响下游实验，开盖离心或者适当延长离心时间，将有助于乙醇的去除。

(10)将吸附柱放入一个RNase-Free的1.5mL收集管中，加入50–100μl的DEPC-treated ddH₂O，室温放置2分钟，13,000×g离心1分钟洗脱RNA。提取到的RNA可直接用于后续实验或者-20℃存放。

3、cDNA模板的制备

采用TIANGEN反转录试剂盒FastQuant RT Kit(with gDNase)制备cDNA模板，具体步骤如下：

50ng–2μg总RNA可建立20μl反应体系。

(1)将提取的RNA样品在冰上解冻；5×gDNA Buffer、FQ-RT Primer Mix、10×FastRT Buffer、RNase-Free ddH₂O在室温(15-25℃)解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。

以下操作步骤请在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先配制成Mix，然后再分装到每个反应管中。

(2)按照表1的基因组DNA的去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心，并置于42℃，孵育3min。然后置于冰上放置。

表1gDNA去除反应体系

组成成分	使用量(μl)
		5*gDNA Buffer	2
Total RNA	-
		RNase-Free ddH<sub>2</sub>O	补足到10

(3)按照表2的反转录反应体系配制混合液。

表2反转录反应体系

组成成分	使用量(μl)
		10*Fast RT Buffer	2
RT Enzyme Mix	1
		FQ-RT Primer Mix	2
RNase-Free ddH<sub>2</sub>O	补足到10

(4)将反转录反应中的Mix，加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀。

(5)42℃，孵育15min。

(6)95℃，孵育3min之后放于冰上，得到的cDNA可用于后续实验，或低温保存。

4、PCR扩增酯水解酶编码基因

依据已经在NCBI公布的黑曲霉基因组信息和注释结果，设计了多对引物克隆黑曲霉的羧酸酯水解酶编码基因。

第一对引物：

AnCu1.f:GCCTGGTGCCAAGAGGAAGTACCGACGCCGAAAACCTC；AnCu1.r:TGTTAGCAGCCGGATCTCAGTTAGAGACCTCCAAAAAAAG。其克隆的基因称为AnCu1。

第二对引物：

AnCu2f:GCCTGGTGCCAAGAGGAAGTGAACGTCAACTTTCCGATG；AnCu2r:TGTTAGCAGCCGGATCTCAGTTAGAAAAGTGATGCCAG，其克隆到的基因称为AnCu2；

第三对引物：

AnCu3.f:GCCTGGTGCCAAGAGGAAGTATGTCCAGCAGTGGTAGCGGC；

AnCu3.r:TGTTAGCAGCCGGATCTCAGCTAAGAAGAAGAAACCC，其克隆的基因称为AnCu3。

依据实施例2和3的操作步骤构建工程菌株诱导表达后获得粗酶液，以其测定DEHP的水解效率，结果表明仅AnCu3基因具有DEHP降解特性的酶(见图3)，后续以仅描述AnCu3基因的克隆和表达的具体操作如下(其中AnCu1和AnCu2基因的验证过程方法相同，因此没有重复描述)。

通过PCR扩增黑曲霉来源的酯水解酶AnCu3的编码基因。

PCR反应体系见下表。

表3PCR反应体系扩增AnCu3的编码基因

试剂组成	使用量(μl)
		ddH<sub>2</sub>O	21.0
dNTP Mixture(2.5mM each)	3.0
		10×Ex Taq Buffer	3.0
正向引物(10μM)	0.6
		反向引物(10μM)	0.6
模板cDNA	0.8
		Ex Taq(5U/μl)	1.0
Total	30.0

PCR扩增循环

基因扩增结果通过凝胶电泳检测，结果如图1所示。

实施例2构建表达酯水解酶AnCu3的大肠杆菌工程菌株

1、pET-28a(+)载体的线性化

设计引物通过PCR进行pET-28a(+)载体的线性化。引物设计如下：

正向引物：5'-CTGAGATCCGGCTGCTAA-3'，

反向引物：5'-ACTTCCTCTTGGCACCAGGCCGCTGCT-3'

PCR反应体系见表4。

表4线性化载体pET-28a(+)的PCR反应体系

试剂	体积(μl)
		ddH<sub>2</sub>O	21.0
dNTPs(2.5mM each)	3.0
		10×Ex Taq Buffer	3.0
正向引物(10μM)	0.6
		反向引物(10μM)	0.6
pET-28a(+)载体	0.8
		Q5DNA Polymerase(5U/μl)	1.0
Total	30.0

PCR扩增循环

扩增DNA条带通过DNA纯化后，用于质粒的构建。

2、pET-AnCu3质粒构建

通过II进行质粒构建。引物设计总的原则是：通过在引物5’端引入线性化克隆载体末端同源序列，使得插入片段扩增产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列(15–20bp)。基于此原则设计基因扩增的引物进行重组反应，于冰水浴中配制如下反应体系。反应体系组成见表5。

表5质粒连接反应体系

组成成分	使用量
		5*CE II Buffer	4μl
线性化克隆载体	50–200ng
		基因扩增产物	20–200ng
Exnase II	2μl
		ddH<sub>2</sub>O	补足到10μl

体系配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分。置于37±1℃反应30min。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。

3、质粒的转化

取20μl冷却反应液，加入到200μl感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。42℃热激45–90秒，冰水浴孵育2min。加入600μl的LB培养基，37±1℃摇菌60min充分复苏。取100μl菌液均匀涂布在含有适当硫酸卡那霉素抗生素的LB培养基平板上。将平板倒置，于37±1℃过夜培养。所述LB培养基配方：酵母粉5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L，固体添加2％的琼脂粉，调节pH为7.0，121℃灭菌20min。

实施例3酯水解酶AnCu3粗酶液水相体系催化水解DEHP

1、酯水解酶AnCu3的诱导表达

挑取经验证正确的转化子，转接含有适当硫酸卡那霉素抗生素的LB液体试管，37±1℃过夜培养，然后以1％(v/v)的接种量接种含有100mL LB培养基的300mL三角瓶，摇床37±1℃、200±10rpm培养3h，然后加入终浓度0.5mM的诱导剂IPTG，20±1℃、200±10rpm培养20h。

2、酯水解酶AnCu3粗酶液的制备

大肠杆菌诱导表达后13,000rpm离心5min收集菌体，用pH 7.5的0.05M Tris-HCl缓冲液悬浮洗涤菌体2次，然后悬浮菌体。超声波细胞破碎仪破细胞，13,000×g离心5min，上清液作为粗酶液，首先进行SDS-PAGE电泳，确定目标蛋白表达(图2)，然后进行水解酶AnCu3的酯合成特性检测。

3、AnCu3粗酶液的DEHP催化水解

10mL反应体系如下：

粗酶液，1mL；Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液，9mL；DMSO溶解的DEHP母液(10g/L)20μL，终浓度为200mg/L。30±1℃，150±10rpm水浴摇床反应12h。3mL正己烷萃取，通过气相色谱标准曲线法定量检测DEHP的水解量。

以不含有酯水解酶AnCu3编码基因的pET-28a(+)载体作为对照。

4、气相色谱定量检测

色谱柱：Agilent 19091N-213I

检测条件：80℃，保持5min；以20℃/min的速度升至240℃，保持23.5min。进样量1μl，不分流。载气为氮气，流速为1mL/min，FID检测器。

结果证实，表达酯水解酶AnCu3的大肠杆菌工程菌的粗酶液具有在水相体系催化水解DEHP的能力，12h可以水解82.4mg/L的DEHP，水解率为41.20％，而pET-28a(+)载体、以及AnCu1(对应载体为pET-AnCu1)和AnCu2(对应载体为pET-AnCu2)没有显示有水解能力(见图3)。

序列表

<110> 北京工商大学

<120>一种黑曲霉酯水解酶AnCu3、编码基因及其在水解DEHP中的应用

<160> 6

<170> Patent-In 3.3

<210> 1

<211> 189

<212> PRT

<213>黑曲霉酯水解酶AnCu3

<220>

<223>

<400> 1

MSSSGSGSST ENGVTQHSGS CKKLTFIFAR GTTEIGNMGT VVGPEVASEL ATLTGNQVTV 60

QGVNYPADWE GNVSLGSSGG PTMASYVKEA LQQCPNTKVV LGGYSQGSMV VHYAANQLSA 120

DQLSGAALFG DPLKMEGVGK LSSGKVKEFC ASGDPVCENG MNVMAHLTYG SDAKEAAQFL 180

VQAAGVSSS 189

<210> 2

<211> 570

<212> DNA

<213>黑曲霉酯水解酶AnCu3 编码基因

<220>

<223>

<400> 2

atgtccagca gtggtagcgg ctcatcaacc gaaaacggcg tgacccaaca cagcggcagc 60

tgcaagaaac tgacctttat tttcgcccgc ggtaccaccg agatcggcaa catgggaacc 120

gtcgtcggac ccgaggtggc tagcgagctg gctacattga cgggcaacca ggtgaccgtg 180

cagggagtga actatcctgc tgattgggag ggcaacgtat ccctcggctc ttccggcggc 240

ccgaccatgg cctcgtacgt gaaggaagcg ctccagcaat gccctaacac caaggtcgtg 300

ctgggcggat actcgcaggg ttcgatggtg gtgcactacg ccgcgaacca gctgagcgcg 360

gaccagttgt cgggtgctgc gttgttcggt gacccgttga agatggaggg cgtgggtaag 420

ttgtctagcg gcaaggtgaa ggagttctgt gctagtgggg atcccgtctg tgagaatggt 480

atgaatgtta tggcgcattt gacttatggc agtgatgcca aggaggcggc gcagtttttg 540

gtccaggctg cgggggtttc ttcttcttag 570

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：酯水解酶AnCu3 编码基因扩增引物

<400>3

gcctggtgcc aagaggaagt atgtccagca gtggtagcgg c 41

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：酯水解酶AnCu3 编码基因扩增引物

<400>4

tgttagcagc cggatctcag ctaagaagaa gaaaccc 37

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：pET-28a(+)载体的线性化扩增引物

<400>5

ctgagatccg gctgctaa 18

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：pET-28a(+)载体的线性化扩增引物

<400>6

acttcctctt ggcaccaggc cgctgct 27

Claims (9)

1.一种黑曲霉酯水解酶AnCu3，其特征在于：所述黑曲霉酯水解酶AnCu3的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种黑曲霉酯水解酶AnCu3编码基因，其编码如权利要求1所述的黑曲霉酯水解酶AnCu3，优选地，所述编码基因的cDNA序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种含有权利要求2所述基因的表达载体，优选地所述表达载体是大肠杆菌表达载体，如pET-28a(+)表达载体。

4.一种含有如权利要求3所述的表达载体的重组细胞系，优选为重组细菌，如大肠杆菌。

5.如权利要求1所述一种黑曲霉酯水解酶AnCu3在水解邻苯二甲酸双(2-乙基己)酯中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，是在水相体系中进行催化水解。

7.一种水解邻苯二甲酸双(2-乙基己)酯的方法，其特征在于，利用如权利要求1所述的黑曲霉酯水解酶AnCu3对水解邻苯二甲酸双(2-乙基己)酯进行催化水解。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，将所述黑曲霉酯水解酶AnCu3加入至邻苯二甲酸双(2-乙基己)酯的溶液中，经水浴摇床进行催化水解反应。

9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述黑曲霉酯水解酶AnCu3通过基因重组方法获得，更具体的是培养含有所述黑曲霉酯水解酶AnCu3基因的表达载体的大肠杆菌，经超声波细胞破碎仪破细胞，离心取上清液作为酶液，优选可进一步纯化。