CN115261357A - 一种康氏副球菌（Paracoccus kondratievae）α/β水解酶F8A10_20830及其基因与应用 - Google Patents
一种康氏副球菌（Paracoccus kondratievae）α/β水解酶F8A10_20830及其基因与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种来源于康氏副球菌(Paracoccus kondratievae)的α/β水解酶F8A10_20830及其编码基因与应用，属于生物基因工程技术领域。本发明公开的P.kondratievae的α/β水解酶F8A10_20830的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，利用此序列信息，克隆该基因，构建携带所述基因的大肠杆菌表达载体，同时还公开了所述的α/β水解酶F8A10_20830在催化水解污染物邻苯二甲酸酯类中的应用。本发明提供了一种高效催化邻苯二甲酸酯类水解的酶，且对邻苯二甲酸酯类的水解具有重要意义，适于作为邻苯二甲酸酯类物质降解的催化剂加以开发利用。
Description
技术领域
本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种康氏副球菌(Paracoccuskondratievae)α/β水解酶F8A10_20830及其基因在催化水解污染物邻苯二甲酸酯类中的应用。
背景技术
自2012年白酒塑化剂事件之后，白酒品质安全问题获得广泛关注，一系列对白酒安全存在影响的化合物被检测出来，如重金属、杀虫剂、氨基甲酸乙酯等。其中，塑化剂对白酒品质的负面影响尤为恶劣。探究白酒中塑化剂的消除机制，对于提高产品的饮用安全性，确保产品品质具有重要意义。塑化剂以邻苯二甲酸酯(Phthalate esters，PAEs)为代表，是一类内分泌干扰物，具有生殖毒性，同时，还会造成脂质代谢异常，诱发肥胖病，干扰免疫和过敏反应等。由于PAEs的生理毒性，探索有效的降解处理方式是解决这一问题的科学途径。研究表明，微生物酶法水解PAEs效率高，降解相对彻底，反应条件温和，不产生二次污染等问题，并且不扰动微生物菌群，不会产生多余的代谢物，为白酒中PAEs污染问题的解决提供了可行的途径。目前研究发现，PAEs的毒性关键在于其酯键侧链，如果能够有效水解酯键侧链，可以显著降低毒性。因此，开发适于白酒的微生物酶法有效水解PAEs侧链酯键以尽量降低或消除其毒性是当前迫切需要解决的问题。
最近针对白酒原料包括高梁、大米和小麦，以及基酒和市售白酒样品检测发现，各样品中共性存在的PAEs包括5种，分别是邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP)和邻苯二甲酸双(2-乙基己)酯(DEHP)。因此，考虑到不论对白酒原料、发酵过程以及产品处理时，至少需要同时对5种PAEs进行酯键侧链的有效水解以降低其毒性，但是大多数酶在进行PAEs酯键水解时存在底物特异性，仅对特定链长或结构的侧链酯键具有高效水解能力，并不能够有效水解不同链长和结构的各类PAEs侧链酯键。因此，邻苯二甲酸二酯化合物侧链单酯键的酶的底物分子识别和单酯键水解规律解析，具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种康氏副球菌(P.kondratievae)α/β水解酶F8A10_20830及其基因在催化水解污染物邻苯二甲酸酯类物质中的应用。
本发明是通过以下技术方案来实现：
本发明公开了一种康氏副球菌(P.kondratievae)α/β水解酶F8A10_20830，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还公开了一种康氏副球菌(P.kondratievae)α/β水解酶F8A10_20830的编码基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还公开了一种含有上述康氏副球菌(P.kondratievae)α/β水解酶F8A10_20830基因的大肠杆菌表达载体，所述载体克隆区域核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还公开了一种含有上述康氏副球菌(P.kondratievae)α/β水解酶F8A10_20830，具有催化水解污染物邻苯二甲酸酯类物质的性能。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明利用生物基因工程技术，克隆获得康氏副球菌(P.kondratievae)α/β水解酶F8A10_20830基因，并构建含有该基因的大肠杆菌表达载体，将该重组质粒转入大肠杆菌中，经过IPTG诱导表达获得该酶，并经催化体系检测其水解DMP、DEP、DBP、DIBP和DEHP的能力，气相色谱的测试结果显示，底物含量明显下降，残余量分别为0.0mg/L，0.8mg/L，5.8mg/L，8.9mg/L和142.9mg/L。实验结果表明，α/β水解酶F8A10_20830可用于催化水解污染物邻苯二甲酸酯类物质。
本发明通过大肠杆菌工程菌诱导表达α/β水解酶F8A10_20830以开展对其催化水解污染物邻苯二甲酸酯类物质的功能研究，为微生物降解污染物的应用和发展奠定基础。
附图说明
图1为α/β水解酶F8A10_20830编码基因的PCR扩增结果
图2为α/β水解酶F8A10_20830编码基因的诱导表达结果
图3为α/β水解酶F8A10_20830催化水解DMP、DEP、DBP、DIBP和DEHP的气相色谱原始图谱
图4为α/β水解酶F8A10_20830催化水解DMP、DEP、DBP、DIBP和DEHP的定量计算结果(作为摘要附图)
具体实施方式
下面结合具体的附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。下述实施例中未详细述及的操作步骤或条件，均按照本领域常规技术、条件实现。
实施例1 α/β水解酶F8A10_20830编码基因的克隆
1.1康氏副球菌(P.kondratievae)的培养
在无菌操作条件下，将康氏副球菌(P.kondratievae)接种于含有50mL LB液体培养基的300mL三角瓶中，在37±1℃，200±10rpm条件下培养12h。所述的LB液体培养基，其组成为酵母粉5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L，调节pH为7.0，121℃高压灭菌20min。
1.2康氏副球菌(P.kondratievae)基因组DNA的提取
对上述培养12h的康氏副球菌(P.kondratievae)取样，采用E.Z.N.A.细菌DNA试剂盒(Omega Bio-tek，GA，USA)提取基因组DNA。具体步骤如下：
(1)吸取2mL菌液到2.0mL离心管中，室温下，10000rpm离心1min，弃上清液。
(2)加入100μL TE Buffer，充分悬浮菌体。
(3)加入10μL Lysozyme，37℃孵育10min。
(4)加入100μL BTL Buffer和10μL Proteinase K Solution，涡旋振荡混匀，55℃水浴孵育20min。
(5)加入5μL RNase A，颠倒混合均匀，室温孵育5min，10000rpm离心2min，将上清液转移至新的1.5mL离心管中。
(6)加入220μL BDL Buffer，涡旋振荡混匀，65℃孵育10min。
(7)加入220μL 无水乙醇，涡旋振荡混匀。
(8)将上述混合液转移至一个带有收集管的吸附柱中(包括可能生成的任何沉淀)，13000rpm室温离心1min，弃废液，更换收集管。
(9)加入500μL HBC Buffer，13000rpm室温离心1min，弃废液，将吸附柱重新放回到收集管中。
(10)加入700μL DNA Wash Buffer(确保无水乙醇已加入到DNA Wash Buffer中)，13000rpm室温离心1min，弃废液，将吸附柱放回到收集管中。
(11)再次加入700μL DNA Wash Buffer，13000rpm室温离心1min，弃废液，将吸附柱重新放回到收集管中。
(12)13000rpm室温离心2min，去除残留的乙醇。
(13)将吸附柱放入一个1.5mL离心管中，加入50-100μL Elution Buffer(ElutionBuffer孵育至65℃后使用)于吸附柱中心，室温放置3-5min，10000rpm离心1min洗脱DNA。提取的DNA可直接用于后续实验或者-20℃存放。
1.3α/β水解酶F8A10_20830的编码基因的克隆
通过PCR扩增康氏副球菌(P.kondratievae)来源的α/β水解酶F8A10_20830的编码基因。引物序列如下：
正向引物P1F：5′-TAAGAAGGAGATATACCATGGTCGTAAACCGCGTCTCT-3′
反向引物P1R：5′-GGTGGTGCTCGAGTGCGATGTCGTAAACCGCGTCTCT-3′
PCR反应体系如表1所示。
表1 α/β水解酶F8A10_20830编码基因扩增的PCR反应体系
PCR反应程序如表2所示。
表2 α/β水解酶F8A10_20830编码基因扩增的PCR反应程序
实施例2构建表达α/β水解酶F8A10_20830的大肠杆菌工程菌株
2.1 pET-28a(+)载体的线性化
设计引物通过PCR进行pET-28a(+)载体的线性化。引物序列如下：
正向引物P2F：5′-CTGAGATCCGGCTGCTAA-3′
反向引物P2R：5′-ACTTCCTCTTGGCACCAGGCCGCTGCT-3′
PCR反应体系如表3所示。
表3线性化载体pET-28a(+)的PCR反应体系
PCR反应程序如表4所示。
表4线性化载体pET-28a(+)的PCR反应程序
PCR产物纯化后，用于载体构建。
2.2载体构建
利用
One Step Cloning Kit进行载体构建。引物设计原则：通过在引物5′端引入线性化载体末端同源序列，使得插入片段扩增产物5′和3′末端分别带有和线性化载体两末端对应的完全一致的序列(15-20bp)。基于此原则设计基因扩增的引物进行重组反应，于冰水浴中配制如下反应体系。连接反应体系如表5所示。
表5连接反应体系
体系配制完成后，用移液器轻柔吹吸混匀各组分。置于37±1℃条件下反应30min后，立即移至冰水浴中冷却5min。
2.3大肠杆菌的遗传转化
取5μL冷却反应液，加入至50μL大肠杆菌感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，冰上放置30min。42℃热激45-90秒，冰水浴孵育2min。加入600μL的LB液体培养基，37±1℃振荡培养60min使菌株充分复苏。取100μL菌液均匀涂布在含有适量卡那霉素的LB培养基平板上。将平板倒置，于37±1℃过夜培养。所述LB培养基配方：酵母粉5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L，调节pH为7.0，固体培养基需添加2％的琼脂粉，121℃高压灭菌20min。
实施例3 α/β水解酶F8A10_20830粗酶液催化水解DMP、DEP、DBP、DIBP和DEHP
3.1 α/β水解酶F8A10_20830的诱导表达
挑取经验证正确的转化子，转接至含有适量卡那霉素的LB液体培养基中，37±1℃过夜培养，以1％(v/v)的接种量接种于含有50mL LB培养基的300mL三角瓶中，37±1℃，200±10rpm培养3h，加入诱导剂IPTG(终浓度为0.5mM)，25±1℃，200±10rpm培养20h。
3.2 α/β水解酶F8A10_20830的粗酶液制备
大肠杆菌诱导表达后13000rpm离心5min收集菌体，用pH 7.5的0.05M Tris-HCl缓冲液悬浮洗涤菌体2次，然后悬浮菌体。超声波细胞破碎仪破细胞，13000rpm离心5min，上清液作为粗酶液，首先通过SDS-PAGE检测目标蛋白的表达水平(图2)，然后进行α/β水解酶F8A10_20830的PAEs水解特性检测。
3.3 F8A10_20830的粗酶液催化水解PAEs性能的检测
10mL的反应体系如下：
粗酶液，2mL；Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)，8mL；DMP、DEP、DBP、DIBP和DEHP，终浓度均为200mg/L。37±1℃条件下，150±10rpm水浴振荡22h。用3mL正己烷进行萃取，通过气相色谱定量检测PAEs的水解量。
色谱柱为Agilent 19091N-213I。检测条件为80℃保持3min，以20℃/min升至250℃保持17.5min。进样量为1μL，不分流。载气为氮气，流速为1mL/min，检测器为FID。
结果证实，本发明构建的表达α/β水解酶F8A10_20830的大肠杆菌工程菌产生的粗酶液具有催化水解DMP、DEP、DBP、DIBP和DEHP的能力(图3)，残余量分别为0.0mg/L，0.8mg/L，5.8mg/L，8.9mg/L和142.9mg/L(图4)。
Claims (4)
1.一种来源于康氏副球菌(Paracoccus kondratievae)的α/β水解酶F8A10_20830，其特征在于，该α/β水解酶F8A10_20830的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
2.由权利要求1所述的α/β水解酶F8A10_20830基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
3.含有权利要求2所述基因的表达载体，其特征在于，该载体克隆区域核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
4.如权利要求1所述的康氏副球菌(P.kondratievae)α/β水解酶F8A10_20830在水解邻苯二甲酸酯类中的应用。
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