CN116769757A

CN116769757A - 氨肽酶、突变体、编码基因及其在l-肌肽合成中的应用

Info

Publication number: CN116769757A
Application number: CN202310767899.9A
Authority: CN
Inventors: 张仙; 贺松; 钱小龙; 张傲南; 戴忆思; 张雄寅
Original assignee: Shanghai Baifu'an Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Baifu'an Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-06-27
Filing date: 2023-06-27
Publication date: 2023-09-19

Abstract

本发明涉及一种新型氨肽酶、其突变体、该氨肽酶或其突变体的编码基因，含有该编码基因的重组表达载体和重组表达转化体，该重组氨肽酶催化剂，以及该氨肽酶或其突变体或其重组氨肽酶催化剂在催化合成L‑肌肽中的应用。与现有合成L‑肌肽的其它方法相比，本发明的酶促反应具有底物浓度高、反应条件温和、环境友好、操作简单、产率高等优势，具有很好的工业应用前景。

Description

氨肽酶、突变体、编码基因及其在L-肌肽合成中的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种氨肽酶，其突变体，以及编码基因，含有该编码基因的重组表达载体和重组表达转化体，该重组氨肽酶催化剂的制备，以及该重组氨肽酶催化剂在催化合成L-肌肽中的应用。

背景技术

L-肌肽，又名β-丙氨酰-L-组氨酸，是一种由β-丙氨酸和L-组氨酸两种氨基酸缩合得到的二肽，为结晶状固体，是生物体内存在的一种天然抗氧化剂。L-肌肽由于具有较强的抗氧化能力、很低的副作用，在医药、保健、化妆品等领域都具有广泛的应用前景。

目前，L-肌肽的生产方法主要有两种：化学合成和生物合成。采用化学法合成，需要对底物L-组氨酸和β-丙氨酸的活性基团进行保护或活化，普遍存在反应条件剧烈，反应步骤繁琐，副产物较多等问题。相较于化学法，生物合成法具有合成路线短、反应条件温和、对环境友好、产物光学纯度高、无需对原料进行保护和去保护等优点，具有良好的工业应用前景，有望逐渐取代传统的化学合成方法。

2010年，Ueda课题组以人脑cDNA文库为模板，克隆获得肌肽水解酶hCN1，将其在酵母中进行表面展示表达，并在两相体系中使用酵母整细胞作为催化剂，催化β-丙氨酸和L-组氨酸的逆水解反应合成L-肌肽，反应体系中L-组氨酸浓度为100mM，β-丙氨酸浓度为500mM，产物L-肌肽的浓度仅为4.5mM(Applied Microbiology and Biotechnology,2010,86:1895-1902)。

2019年，许建和课题组通过广泛筛选，成功获得了来源于粘质沙雷氏菌的重组肌肽水解酶SmPepD，它可以催化β-丙氨酸与L-组氨酸的逆水解(缩合)反应，一步合成获得L-肌肽，产物浓度最高达到62.5mM。由于该酶的催化活性相对较低，反应液中还需要加入高浓度重金属锰离子，对酶进行激活，从而提高酶的催化活性(Catalysis Science&Technology,2019,9(21):5971-5978；CN 109468303 A)。

2021年，中国专利CN 113388602 A公开了一种固定化肌肽水解酶，其可以将500g/Lβ-丙氨酸、22g/L组氨酸催化合成L-肌肽，该固定化酶可以反复使用20次，但是最高的转化率仅能达到25％。

此外，中国专利CN 109593805 A报道了利用L-氨基酸连接酶催化β-丙氨酸和L-组氨酸合成L-肌肽，同时伴随着ATP去磷酸化形成ADP，聚磷酸盐激酶则催化聚磷酸盐转磷酸基团给ADP形成ATP，从而实现ATP的循环再生。利用上述双酶偶联体系，在合适的反应条件下反应6h可以得到31mM L-肌肽。

利用氨肽酶催化合成L-肌肽是目前研究最广泛的用于生产L-肌肽的绿色方法。中国专利CN 107217048 A和CN 115820610 A均报道了利用氨肽酶催化L-组氨酸与β-丙氨酸甲酯(盐酸盐)合成L-肌肽。最近，研究人员利用宏基因组技术获得了多个氨肽酶基因，并验证其可用于L-肌肽的合成(Microbial Cell Factories,2022,21:1-10)。然而，由于氨肽酶活性较低，最多只能获得32mM产物L-肌肽。

综上所述，目前报道的氨肽酶存在着品种较少，催化活性低，反应时间长，产物浓度低以及生产效率不高等问题。因此，还需要开发催化性能更好的酶催化剂，以满足工业化生产L-肌肽的技术需求。

发明内容

本发明所要解决的问题是针对现有技术中氨肽酶性能的缺陷，提供一种新型氨肽酶、其突变体、该氨肽酶或其突变体的编码基因，含有该编码基因的重组表达载体和重组表达转化体，该重组氨肽酶催化剂，以及该氨肽酶或其突变体或其重组氨肽酶催化剂在催化合成L-肌肽中的应用。

使用该酶及其突变体催化L-组氨酸与β-丙氨酸甲酯盐酸盐催化合成L-肌肽，具有底物浓度高、条件温和、工艺简单和产品产率高等显著优点。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明第一方面，提供了一种可以催化L-组氨酸和β-丙氨酸甲酯进行缩合反应有效生成L-肌肽的氨肽酶。

本发明所述氨肽酶来源于中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium sp.)或芽胞八叠球菌属(Sporosarcina sp.)或申氏杆菌属(Shinella sp.)。申请人通过对自然界微生物以及实验室保存菌种的大量筛选，发现中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium sp.)、芽胞八叠球菌属(Sporosarcina sp.)或申氏杆菌属(Shinella sp.)经过培养，可以催化L-组氨酸和β-丙氨酸甲酯的缩合反应，生成目标产物L-肌肽。通过基因比对及挖掘方法获得了该三种菌属中相应的氨肽酶，并将其分别命名为MeBapA、SpBapA、ShBapA。所述氨肽酶MeBapA、SpBapA、ShBapA的氨基酸序列分别如SEQ ID No.2、SEQ ID No.4以及SEQ ID No.6所示。

制备本发明所述氨肽酶的方法包括但不限于：1)从中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium sp.)、芽胞八叠球菌属(Sporosarcina sp.)或申氏杆菌属(Shinellasp.)的细胞中直接提取分离获得；2)按照本领域常规技术通过所述氨肽酶编码基因的异源重组表达来获得。

本发明第二方面，提供了多种氨肽酶突变体，与母本相比，所述突变体均有活力提高，其中部分突变体的稳定性也有所提高。

本发明是以中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium sp.)来源的氨肽酶为母本，对其进行分子改造，得到所述氨肽酶的突变体。

本发明中的氨肽酶突变体的获得方法为随机突变。

本发明所述的氨肽酶突变体，是将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第20位苯丙氨酸、第34位谷氨酸、第62位丙氨酸、第102位甘氨酸、第119位丙氨酸、第128位精氨酸、第146位苏氨酸、第187位甲硫氨酸、第198位苏氨酸、第244位丝氨酸、第255位缬氨酸、第260位亮氨酸、第281位天冬酰胺、第317位异亮氨酸、第326位酪氨酸、第346位天冬氨酸、第359位丙氨酸或第369位甲硫氨酸中的一个或多个氨基酸替换为其他氨基酸所形成的新氨基酸序列的衍生蛋白质。

所述氨肽酶突变体具有如下序列中的一种：

(1)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第34位谷氨酸替换为苏氨酸，第62位丙氨酸替换为苏氨酸；

(2)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第34位谷氨酸替换为苏氨酸，第62位丙氨酸替换为苏氨酸，第128位精氨酸替换为赖氨酸；

(3)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第34位谷氨酸替换为苏氨酸，第62位丙氨酸替换为苏氨酸，第281位天冬酰胺替换为组氨酸；

(4)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第20位苯丙氨酸替换为酪氨酸，第317位异亮氨酸替换为缬氨酸；

(5)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第20位苯丙氨酸替换为酪氨酸，第317位异亮氨酸替换为缬氨酸，第346位天冬氨酸替换为丝氨酸；

(6)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第102位甘氨酸替换为苏氨酸，第119位丙氨酸替换为苏氨酸，第128位精氨酸替换为赖氨酸，第146位苏氨酸替换为天冬酰胺，第187位甲硫氨酸替换为亮氨酸，第198位苏氨酸替换为丝氨酸；

(7)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第119位丙氨酸替换为苏氨酸；

(8)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第119位丙氨酸替换为苏氨酸，第244位丝氨酸替换为丙氨酸；

(9)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第119位丙氨酸替换为苏氨酸，第244位丝氨酸替换为丙氨酸，第281位天冬酰胺替换为赖氨酸；

(10)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第62位丙氨酸替换为苏氨酸，第102位甘氨酸替换为苏氨酸，第128位精氨酸替换为赖氨酸，第317位异亮氨酸替换为缬氨酸；

(11)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第119位丙氨酸替换为苏氨酸，第146位苏氨酸替换为天冬酰胺，第198位苏氨酸替换为丝氨酸，第359位丙氨酸替换为脯氨酸；

(12)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第187位甲硫氨酸替换为亮氨酸，第198位苏氨酸替换为丝氨酸，第244位丝氨酸替换为组氨酸；

(13)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第187位甲硫氨酸替换为亮氨酸，第198位苏氨酸替换为丝氨酸，第281位天冬酰胺替换为异亮氨酸；

(14)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第244位丝氨酸替换为谷氨酸，第255位缬氨酸替换为异亮氨酸；

(15)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第255位缬氨酸替换为异亮氨酸；

(16)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第20位苯丙氨酸替换为酪氨酸，第34位谷氨酸替换为苏氨酸，第62位丙氨酸替换为苏氨酸，第102位甘氨酸替换为苏氨酸，第119位丙氨酸替换为苏氨酸，第128位精氨酸替换为赖氨酸，第146位苏氨酸替换为天冬酰胺，第187位甲硫氨酸替换为亮氨酸，第198位苏氨酸替换为丝氨酸，第244位丝氨酸替换为谷氨酸，第255位缬氨酸替换为异亮氨酸，第260位亮氨酸替换为缬氨酸，第281位天冬酰胺替换为丝氨酸，第317位异亮氨酸替换为缬氨酸，第326位酪氨酸替换为丝氨酸，第346位天冬氨酸替换为丝氨酸，第369位甲硫氨酸替换为丙氨酸；

(17)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第255位缬氨酸替换为异亮氨酸，第326位酪氨酸替换为苯丙氨酸；

(18)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第260位亮氨酸替换为缬氨酸、第281位天冬酰胺替换为丝氨酸；

(19)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第260位亮氨酸替换为缬氨酸，第281位天冬酰胺替换为丝氨酸，第346位天冬氨酸替换为丝氨酸。

本发明第三方面，提供了上述氨肽酶及其突变体的编码核酸。所述氨肽酶及其突变体的编码核酸的来源包括：通过基因克隆技术获得所述氨肽酶及其突变体的编码基因，或者通过人工全序列合成的方法获得所述氨肽酶及其突变体的编码基因。

本发明第四方面，提供了包含本发明所述氨肽酶或其突变体核酸序列的重组表达载体。所述的重组表达载体可通过本领域常规方法将本发明氨肽酶基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述的载体可以是本领域常规的各种质粒载体，优选质粒pET28a。较佳的，可通过下述方法制得本发明所述的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的氨肽酶或其突变体的基因序列DNA片段，用限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切，同时将空载质粒pET28a同样用限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切，回收上述酶切后的氨肽酶DNA片段和质粒，利用T4 DNA连接酶连接，构建获得含有本发明所述氨肽酶或其突变体基因的重组表达载体。

本发明第五方面，提供了包含本发明氨肽酶基因或其重组表达载体的重组表达转化体。所述重组表达转化体可通过本领域常规技术，将上述重组表达载体转化至相应宿主细胞中制得。所述宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，并且其所编码的氨肽酶基因能被有效表达即可。所述宿主细胞优选为大肠杆菌，更优选的为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。

本发明第六方面，提供了一种重组氨肽酶催化剂，所述重组氨肽酶催化剂的形式包括但不限于：

(1)培养本发明所述的重组表达转化体，分离含有所述氨肽酶的转化体细胞；

(2)培养本发明所述的重组表达转化体，分离含有所述氨肽酶的粗酶液；

(3)将所述氨肽酶的粗酶液干燥得到的粗酶粉。

其中所述重组表达转化体培养所用的培养基可选自本领域的常规培养基，前提是可使重组表达转化体生长并能生产本发明所述的重组氨肽酶。对于所述的宿主细胞，优选培养基为LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH6.5-7.0。优选的培养方法为：将如上所述构建的重组大肠杆菌，接种至含有卡那霉素的LB培养基中，37℃、180rpm振荡培养过夜。按1-2％(v/v)的接种量接入装有100mL的LB培养基(含卡那霉素)的500mL三角烧瓶中，置于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD₆₀₀达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.1-0.5mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂，16-25℃诱导16-24h后，将培养液离心，收集沉淀，然后用生理盐水洗涤两次，获得重组表达转化体细胞。将收获的重组细胞悬浮于5-10倍体积(v/w)的缓冲液中，超声破碎，离心收集上清液，即可获得所述重组氨肽酶的粗酶液。收集的粗酶液放置在-80℃下冷冻，然后使用真空冷冻干燥机低温干燥，即可得到冻干酶粉。将所获得的冻干酶粉保存在4℃冰箱内，可以方便地使用。

本发明中所述氨肽酶的活力测定方法：在含有0.6g L-组氨酸、0.68gβ-丙氨酸甲酯的10mL反应体系(100mmol/L磷酸钾缓冲液，pH 7.0)中，加入适量的氨肽酶，30℃保温反应15min后，取样进行液相色谱分析转化率。1个酶活力单位(U)定义为上述条件下每分钟催化生成1μmol产物所需的酶量。

本发明第七方面，还提供了利用上述氨肽酶或氨肽酶突变体或氨肽酶催化剂在L-肌肽制备中的应用方法。所述的应用是将本发明所述的氨肽酶加入到含有L-组氨酸和β-丙氨酸甲酯的溶液中，催化L-组氨酸和β-丙氨酸甲酯缩合生成L-肌肽。

在前述应用中，L-组氨酸浓度可为20～60g/L，β-丙氨酸甲酯浓度可为20～80g/L，所述重组氨肽酶的用量可选为1～10g/L，反应液水相pH为5.0～9.0。所述反应的温度为20～30℃，优选25℃。所述的反应的时间以反应转化率停止增长的时间为准，优选反应时间小于24h。反应转化率采用液相色谱法进行分析，分析条件：CROWNPAK(CR(+),)，以0.1M的高氯酸溶液为流动相，流速0.3mL/min，柱温25℃，检测波长220nm。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即可获得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均为市售可得。

与现有技术相比，本发明的改善进步效果在于：

本发明提供了一种新的氨肽酶及其突变体，可以高效催化L-组氨酸和β-丙氨酸甲酯缩合，制备L-肌肽。所述氨肽酶能够在底物L-组氨酸浓度高达60g/L时，实现80％以上的转化率，因此产物L-肌肽的浓度也大幅度提高。相对于其他的L-肌肽合成方法，本发明的酶促反应具有酶催化活性高，反应条件温和、底物上载量大，产率高等优势，具有很好的工业应用前景。

具体实施方式

本发明内容中所述的各反应或检测条件，可根据本领域常识进行组合或更改，并可通过实验得到验证。下面将结合具体实施例，对本发明中的技术方案和技术效果进行清楚、完整的描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例，凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

下列实施例中的材料来源为：

质粒载体pET28a购自Novagen公司。

E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)感受态细胞、2×Taq PCR MasterMix、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。

限制性内切酶EcoR I、Xho I、和T4 DNA连接酶均为New England Biolabs(NEB)公司的市售产品。

实施例1氨肽酶的基因克隆

本发明通过生物信息学分析方法预测可能具有明显的L-肌肽合成活性的氨肽酶基因，并将其分选出来进行克隆表达，验证其功能。采用这种方法，分别从中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium sp.)、芽胞八叠球菌属(Sporosarcina sp.)和申氏杆菌属(Shinellasp.)克隆得到三种新的氨肽酶基因，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQID No.5所示。示例的，以中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium sp.)的基因组DNA为模板，采用本领域常规技术方法(如聚合酶链式反应PCR)，获得编码所述氨肽酶的完整核酸分子。其中涉及的合成引物，优选的如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示：

上游引物SEQ ID No.7：CCG GAATTC ATGAAGAATTCCAG

下游引物SEQ ID No.8：CCG CTCGAG CTAGGAGTTCACCCG

其中上游引物下划线所示序列为EcoR I的酶切位点，下游引物下划线所示序列为Xho I的酶切位点。

以中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium sp.)的基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应PCR进行基因扩增。PCR体系(50μL)：2×Taq PCR MasterMix 25μl，基因组DNA(100ng/μL)1μL，上下游引物(10μM)各2.5μL，加灭菌蒸馏水补足至50μL。PCR反应程序：(1)95℃预变性5min；(2)94℃变性30s；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸2min；步骤(2)～(4)共进行30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存产物。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后切胶纯化，并用DNA回收试剂盒回收目的片段。利用同样的方法即可分别克隆出芽胞八叠球菌属(Sporosarcina sp.)和申氏杆菌属(Shinella sp.)中的氨肽酶基因。

实施例2氨肽酶酶重组表达载体和重组表达转化体的制备

将实施例1中PCR扩增获得的氨肽酶目的基因与空载质粒pET28a分别用限制性内切酶EcoR I和Xho I在37℃双酶切12h。双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后切胶纯化回收，用T4 DNA连接酶将得到的线性化pET28a质粒与纯化后的目的基因片段置于16℃连接过夜，将连接产物转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，并均匀涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上，置于37℃培养箱中静置培养约12h，对长出来的菌落进行菌落PCR验证，挑取菌落PCR为阳性的克隆进行测序验证。经测序验证正确后，提取相应的质粒，即得到氨肽酶的重组表达载体pET28a-MeBapA。利用同样的方法即可分别获得芽胞八叠球菌属(Sporosarcina sp.)和申氏杆菌属(Shinella sp.)中氨肽酶的重组表达载体：pET28a-SpBapA、pET28a-ShBapA。

将所得到的重组表达载体进一步转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，挑取阳性克隆，即获得氨肽酶的重组表达转化体E.coli BL21(DE3)/pET28a-MeBapA。利用同样的方法即可分别获得芽胞八叠球菌属(Sporosarcina sp.)和申氏杆菌属(Shinella sp.)中氨肽酶的重组表达转化体：E.coli BL21(DE3)/pET28a-SpBapA、E.coli BL21(DE3)/pET28a-ShBapA。

实施例3氨肽酶突变体库的构建及高通量筛选

本发明是以中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium sp.)来源的氨肽酶MeBapA为母本，采用易错PCR技术构建氨肽酶的随机突变体库：以pET28a-MeBapA为模板，以如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的基因序列为引物，用rTaq DNA聚合酶进行易错PCR，构建随机突变库。PCR体系(50μL)：rTaq DNA聚合酶0.5μL，10×PCR buffer(Mg²⁺Plus)5.0μL，dNTP Mixture(各2.0mM)4.0μL，终浓度为100μmol/L的MnCl₂，pET28a-MeBapA质粒0.5ng，上下游引物(10μM)各2μL，加灭菌蒸馏水补足至50μL。PCR反应程序：(1)95℃预变性5min；(2)94℃变性30s；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸2min；步骤(2)～(4)共进行30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存产物。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后切胶纯化回收，对回收后的目的基因与空载质粒pET28a分别用限制性内切酶EcoR I和Xho I在37℃双酶切12h。双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后切胶纯化回收，用T4DNA连接酶将得到的线性化pET28a质粒与纯化后的目的基因片段置于16℃连接过夜。将连接产物转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，并均匀涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上，置于37℃培养箱中静置培养约12h。

将转化平板上的转化子挑至加有300μL的LB培养基(含有50μg/mL卡那青霉素)的深孔板中，37℃振荡培养过夜，随后转接50μL至加有600μL的LB培养基(含有50μg/mL卡那青霉素)的二级深孔板，37℃振荡培养3h后加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG，16℃诱导24h。然后于4℃、3500×g离心10min，倒掉上层培养基，每个孔中加入200μL溶菌酶液(750mg溶菌酶和10mg DNA酶溶解于1L去离子水中)，振荡混匀，再于37℃摇床上处理2h。随后4℃、3500×g离心10min，取40μL适当稀释的细胞破碎上清液加入到160μL含有60g/L L-组氨酸和68g/Lβ-丙氨酸甲酯磷酸钾缓冲液(100mmol/L，pH 7.0)中，30℃震荡反应15min后，进行超高压液相色谱分析，根据转化率判断酶活性高低，如此筛选得到性能提高的突变体，并对相应的基因进行测序。

通过筛选，得到了活性显著提高的突变体，进而对这些突变体的热稳定性进行了表征，优选热稳定性增高的系列突变体，这些突变体的序列以及这些突变体的活性和稳定性列于表1中。在表1中，序列标号分别对应于表1后面的一系列序列。在活性列中，与母本MeBapA相比，一个加号“+”表示突变体蛋白的活性提高了1-10倍；两个加号“++”表示突变体蛋白的活性提高了11-20倍；三个加号“+++”表示突变体蛋白的活性提高了21-50倍。在热稳定性列中，一个加号“+”对应于50℃保温30min后，突变体蛋白的残余活性保留5.0-20.0％；两个加号“++”对应于50℃保温30min后，突变体蛋白的残余活性保留20.1-50.0％；三个加号“+++”对应于50℃保温30min后，突变体蛋白的残余活性保留50.1-80.0％。

表1：氨肽酶MeBapA突变体序列和相应的活性改进列表

对应序列标号的氨肽酶突变体的氨基酸序列分别如下：

实施例4氨肽酶的诱导表达及发酵活力测定

将实施例2和3中获得的重组表达转化体接种至含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃摇床振荡培养12h，之后按1％(v/v)的接种量接入装有100ml LB培养基(含50μg/ml卡那霉素)的500ml三角烧瓶中，置于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD₆₀₀达到0.6时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG作为诱导剂，16℃诱导24h。将培养液以8000×g离心10min，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得到静息细胞。将100ml培养液中获得的细胞悬浮于10ml的磷酸钾缓冲液(100mM,pH 7.0)中，冰水浴中进行如下超声破碎：400W功率，工作4s，间歇6s，进行99个循环，4℃下12000×g离心40分钟，收集上清粗酶液，按前文发明详述所述方法进行活力测定。经测定，本发明氨肽酶突变体MeBapA_M16的粗酶液的活力为800U/mL，冻干酶粉的活力为60U/mg。

实施例5～7重组氨肽酶催化L-肌肽的合成

在20mL夹套反应器中进行反应，10mL磷酸钾缓冲液(100mM,pH 7.0)中加有20g/LL-组氨酸，20g/Lβ-丙氨酸甲酯，10U/mL的重组氨肽酶MeBapA、SpBapA或者ShBapA的粗酶液。在30℃条件下磁力搅拌反应。通过自动电位滴定仪控制滴加NaOH溶液(3.0M)，维持反应液pH为7.0。间歇取样，按前文发明详述所述方法测定底物转化率，结果见表2。

表2重组氨肽酶催化L-肌肽合成的实验结果

实施例8重组MeBapA_M16酶催化的L-肌肽合成

在20mL夹套反应器中进行反应，10mL磷酸钾缓冲液(100mM,pH 7.0)中加有60g/LL-组氨酸，60g/Lβ-丙氨酸甲酯，50U/mL的重组氨肽酶MeBapA_M16的粗酶液。在30℃条件下磁力搅拌反应。通过自动电位滴定仪控制滴加NaOH溶液(3.0M)，维持反应液pH为7.0。反应24h，水相中肌肽浓度达到56g/L。

实施例9重组MeBapA_M16催化的L-肌肽合成

在20mL夹套反应器中进行反应，10mL磷酸钾缓冲液(100mM,pH 7.0)中加有60g/LL-组氨酸，80g/Lβ-丙氨酸甲酯，1g/L的重组氨肽酶MeBapA_M16的冻干酶粉。在25℃条件下磁力搅拌反应。通过自动电位滴定仪控制滴加NaOH溶液(3.0M)，维持反应液pH为7.0。反应24h，水相中肌肽浓度达到65g/L。

实施例10 1-L规模重组MeBapA_M16催化的L-肌肽合成

在2L夹套反应器中进行反应，1L水中加有60g/L L-组氨酸，80g/Lβ-丙氨酸甲酯，以及10g/L的重组氨肽酶MeBapA_M16的冻干酶粉。在25℃条件下磁力搅拌反应。通过自动电位滴定仪控制滴加NaOH溶液(3.0M)，维持反应液pH为7.0。反应8h，水相中肌肽浓度达到74g/L。

实施例11 1-L规模重组MeBapA_M16催化的L-肌肽合成

在2L夹套反应器中进行反应，1L水中加有60g/L L-组氨酸，80g/Lβ-丙氨酸甲酯，5g/L的重组氨肽酶MeBapA_M16的冻干酶粉。在25℃条件下磁力搅拌反应。通过自动电位滴定仪控制滴加NaOH溶液(3.0M)，维持反应液pH为7.0。反应12h，水相中肌肽浓度达到69g/L。

其中，本发明涉及的序列如下所示：

SEQ ID No.1氨肽酶MeBapA的编码基因，来源于微生物Mesorhizobium sp.

ATGAAGAATTCCAGAAACTCACCGCCCAAACCGCGCGGTCGCGACCTTGGTTTGCCTTTCCGTGGGAAAACCGGCCCGCTCAACGCCATCACCGATGTCGAAGGCATCGCCGTCGGCTTCCGGACCATTTGGGAAGACACCCCGCGCCCCAGGCGCAAGCAGCCCACGCGGACGGGCGTCACGGCTATCGTCCCGCATGCCGGGTCCGAGACGCCTGTTCCCGTCTATGCCGGCGTCCACCGGTTCAACGGCAATGGCGAGATGACCGGCACGCACTGGATCGAGGATGGCGGCTTTTTCCTCGGGCCGGTCCTGATCACCAACACCCATGGCATTGGCATGGCGCACCATGGCGCGATCAAATGGATGCTGGAGCGCTACCGCACCACTTACGACACCGACGATTTCCTCTGGATCATGCCCGTCGTGGCCGAGACTTATGACGGCGCGCTCAACGACATCAACGGCATGCACATCGGCGAGGCCGATGTCAGGGCTGCCCTTGATGCCGCAGCGCCCGGCCCGGTCCAGGAAGGCAATTGCGGCGGTGGCACCGGCATGATCACCTATGGCTTCAAGGGCGGCACCGGCACCTCGTCGCGCGTCGTCGAGCTCGACGACAAGCGATACACGATCGGAACCCTCGTCCAGGCCAATCACGGCCAGCGCGACTGGCTGACCATCTGCGGCGTGCCGGTGGGCCAGCACATGCGCGACGGCACACCGCAAAGCCAGCTCAAGGAGCGTGGGTCGATCATCGTCGTCATCGCAACCGATTTGCCGCTCGCGCCGCACCAGCTGCAGCGGGTGGCACGCCGCGCCTCGATCGGCATAGGCCGCAACGGAACGCCCGGCGGCAACAATTCGGGCGACATCTTCCTCGCCTTCTCCACCGCCAACCCACGCCCCATGCTGCATCGCGCGCCGCCGCGCATGCAGATCGAGATAATCAACGATGAACTCTTGGACTCCGTCTACATGGCCGTGGTGGACAGCGTGGAGGAAGCCGTGGTCAACGCCATGCTCGCCGCTGAAGACATGGGCGGCACGCCCCACGACCGGCTGAAGGTCGAGGCCATCAAGCACGAGCCGCTTCTCGACGTCATGCGCCAATATGGGCGGGTGAACTCCTAG

SEQ ID No.2氨肽酶MeBapA的氨基酸序列，来源于微生物Mesorhizobiumsp.

MKNSRNSPPKPRGRDLGLPFRGKTGPLNAITDVEGIAVGFRTIWEDTPRPRRKQPTRTGVTAIVPHAGSETPVPVYAGVHRFNGNGEMTGTHWIEDGGFFLGPVLITNTHGIGMAHHGAIKWMLERYRTTYDTDDFLWIMPVVAETYDGALNDINGMHIGEADVRAALDAAAPGPVQEGNCGGGTGMITYGFKGGTGTSSRVVELDDKRYTIGTLVQANHGQRDWLTICGVPVGQHMRDGTPQSQLKERGSIIVVIATDLPLAPHQLQRVARRASIGIGRNGTPGGNNSGDIFLAFSTANPRPMLHRAPPRMQIEIINDELLDSVYMAVVDSVEEAVVNAMLAAEDMGGTPHDRLKVEAIKHEPLLDVMRQYGRVNS

SEQ ID No.3氨肽酶SpBapA的编码基因，来源于微生物Sporosarcina sp.

ATGCGAGCACGAGATTTAGGGTTGAAATTTGAAGGAGAAACGGGATTACATAACGCAATTACTGACGTTCCAGGGGTTACCGTTGGGTATTCAACAATCATTGAAGGGGAAGGTCCATTAGAGGTGGGAAAGGGTCCAATTCGCACCGGAGTAACTGCCATATTGCCACGTGGTAAACAAAATGAAATGAAGCCGATCTGGGCTGGAGCATTTTCGTTTAATGGCAATGGTGAAATGACAGGTACACATTGGATAAACGACGGCGGATACTTTTTAAGCCCGATATGTATTACAAATACGCATTCAGTTGGTACTGTCCACCAGGCGGTAGTCAAATGGATGATAGATAATTATCAAGATCAATTCTTAAATGAACATTTATGGGCTATGCCTGTCGTTGCTGAAACATATGACGGTGTTTTAAATGATATTAATGGGCTTCATGTTAAAGAAGAGCATGTTTTGGCTGCAATACAATCTGCCCAATCAGGCGAATTGAAGGAGGGCAATGTTGGCGGAGGAACTGGGATGATTTGTTACGGGTTTAAAGGGGGAACGGGTACTTCTTCTCGTAAACTAGATATCGATGGAGAGGAATACCACATCGGAGTACTTGTGCAAGCAAACTACGGTAAAAGGGAATGGCTAAAAGTTTCAGGTGTCCCAGTTGGAGAACACTTGACTGAGAATATAGTACACACAAAGGAAATGGGCTCAATCATTGTAATTATCGGGACTGATATTCCAATGTTACCTCATCAACTAAAAAGACTTGCGAAACGTGCATCCATTGGGATTGGACGGAGTGGTAGTCCGGGGGGAAATGATTCCGGTGATATATTTCTTGCATTTTCAACCGCAAATGAAATGTCTATTCATCAAAAGGAAGACCCAATCCTAACTATGAAAGTCACAAATGATCAACAGTTTGACCCGATTTATGAGCAAGCTTGTCATGCGATTGATGAGGCGATTATTAACGCTATGATTGCAGCGGAAAGTATGTCCGCTCTTAAACCAAGCGGGAAAGTAGTTGAAGCTATTGATCATGAACGACTGATGGAAGTGATGAAGAAGTATAATCGTTAA

SEQ ID No.4氨肽酶SpBapA的氨基酸序列，来源于微生物Sporosarcina sp.

MRARDLGLKFEGETGLHNAITDVPGVTVGYSTIIEGEGPLEVGKGPIRTGVTAILPRGKQNEMKPIWAGAFSFNGNGEMTGTHWINDGGYFLSPICITNTHSVGTVHQAVVKWMIDNYQDQFLNEHLWAMPVVAETYDGVLNDINGLHVKEEHVLAAIQSAQSGELKEGNVGGGTGMICYGFKGGTGTSSRKLDIDGEEYHIGVLVQANYGKREWLKVSGVPVGEHLTENIVHTKEMGSIIVIIGTDIPMLPHQLKRLAKRASIGIGRSGSPGGNDSGDIFLAFSTANEMSIHQKEDPILTMKVTNDQQFDPIYEQACHAIDEAIINAMIAAESMSALKPSGKVVEAIDHERLMEVMKKYNR

SEQ ID No.5氨肽酶ShBapA的编码基因，来源于微生物Shinella sp.

TCAGGGCATGGCCGGCGCATCCGCGTGCCGGCCATATCGCTTCATCACCGCCACCAGTTCGTCGTGCCGGATGGCGTCGACGCGCAGACGGTCATGCGGCGTGCCGCCGCTGTCCTTCGCCGCCAGCATGGCATTGACGACGGCCTCCTCCACGCTTTCCACCGCCGCCAGATAGACCGGATCGAGCTGTTCGTCGTTGACCATGTCGAGGGCGAGCAGCGCCGGTGCGCGATGGGCCATCGGCTGCGGATTGGCGGTGGAGAAGGCGAGGAAGATGTCGCCGGAATTGTTGCCGCCGGGCGTGCCGTTGCGGCCGATGCCGATGGCGGCGCGGCGGGCGAGGCGCTTTAGCTGGTGCGGGGCCATCGGCAGGTCCGTGGCGATGACGACGATGATCGAGCCGCGCTCCTTGAGCTGGCTTTGCGGCGTGTTGTCCTGGAGATGTTTTCCGACCGGCACACCGCAGATCGTCAGCCAGTCGCGCTGGCCGTGGTTGGCCTGCACCAGCGTGCCGATCGTATAGTCCTTGTCTCCGACCGTGACGACACGGGAGGCGGTGCCGGTGCCGCCCTTGAAACCATAGGCGATCATGCCCGTGCCGCCGCCGCAATTGCCTTCCGCGACGGGGCCGGAGGAGAGGTTTTTCAGAGCTGCCCGGGCATCCGCCTCCGTCACCGGCATGGCATTGATGTCGCTGAGCACGCCGTCATAGGTCTCGGCGATGACAGGCATCAGCCAGAGGAAATCGCCCACCTCGTAGGTCGAGGCATAGCGCTCCAGCATCCAGCGGATCGTTGCATGATGGGTGATGCCGACGCCGTGGGTGTTGGTGATCATGACAGGCCCCAGGAACGTGCCGCCGTCCTCGATCCAGTGGGTGCCGGTCATCTCGCCATTGCCGTTGAAGCGGTGCACGCCGGCATAGACGGGGACGGGCGTCGGGCTCTCGCTATGGGGCAGGATGGCGGTGACGCCGGTGCGCACCGGGAGTTTGCGGCCGGGGCGTGGGGTTTCCTCGACAATGGTGCGGAAGCCGACGGTGATGCCTTCCACATCGGTGATGGCGTTGAACGGGCCGGTGCGGCCGGTGAAGGGCAGGCCGAGGGTGCGGGCGCGGGGTTTTGCTGTCTGGGTCATGGTCAT

SEQ ID No.6氨肽酶ShBapA的氨基酸序列，来源于微生物Shinella sp.

MTMTQTAKPRARTLGLPFTGRTGPFNAITDVEGITVGFRTIVEETPRPGRKLPVRTGVTAILPHSESPTPVPVYAGVHRFNGNGEMTGTHWIEDGGTFLGPVMITNTHGVGITHHATIRWMLERYASTYEVGDFLWLMPVIAETYDGVLSDINAMPVTEADARAALKNLSSGPVAEGNCGGGTGMIAYGFKGGTGTASRVVTVGDKDYTIGTLVQANHGQRDWLTICGVPVGKHLQDNTPQSQLKERGSIIVVIATDLPMAPHQLKRLARRAAIGIGRNGTPGGNNSGDIFLAFSTANPQPMAHRAPALLALDMVNDEQLDPVYLAAVESVEEAVVNAMLAAKDSGGTPHDRLRVDAIRHDELVAVMKRYGRHADAPAMP

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种氨肽酶，其特征在于，为SEQ ID No.2、SEQ ID No.4或SEQ ID No.6所示氨基酸序列组成的蛋白质。

2.一种氨肽酶突变体，其特征在于，其是如下的蛋白质：

由SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第20位苯丙氨酸、第34位谷氨酸、第62位丙氨酸、第102位甘氨酸、第119位丙氨酸、第128位精氨酸、第146位苏氨酸、第187位甲硫氨酸、第198位苏氨酸、第244位丝氨酸、第255位缬氨酸、第260位亮氨酸、第281位天冬酰胺、第317位异亮氨酸、第326位酪氨酸、第346位天冬氨酸、第359位丙氨酸或第369位甲硫氨酸中的一个或多个氨基酸替换为其他氨基酸所形成的新氨基酸序列的衍生蛋白质。

3.根据权利要求2所述氨肽酶突变体，其特征在于，所述氨肽酶突变体的氨基酸序列如下：

4.一种分离的核酸，其特征在于，所述的核酸是编码如权利要求1所述氨肽酶或权利要求2或3所述氨肽酶突变体的核酸分子。

5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如权利要求4所述的核酸。

6.一种重组表达转化体，其特征在于，所述重组表达转化体包含如权利要求5所述的重组表达载体。

7.一种氨肽酶催化剂，其特征在于，所述氨肽酶催化剂为以下中的一种：

(1)培养如权利要求6所述的重组表达转化体，分离含有所述氨肽酶的转化体细胞；

(2)培养如权利要求6所述的重组表达转化体，分离含有所述氨肽酶的粗酶液；

(3)将所述氨肽酶的粗酶液干燥得到的粗酶粉。

8.权利要求1所述氨肽酶、权利要求2或3所述氨肽酶突变体、权利要求8所述氨肽酶催化剂的应用，其特征在于，权利要求1所述氨肽酶、权利要求2或3所述氨肽酶突变体或权利要求8所述氨肽酶催化剂中的一种催化L-组氨酸和β-丙氨酸甲酯缩合生成L-肌肽。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将权利要求1所述氨肽酶、权利要求2或3所述氨肽酶突变体或权利要求8所述氨肽酶催化剂中的一种加入到含有L-组氨酸和β-丙氨酸甲酯的溶液中，催化L-组氨酸和β-丙氨酸甲酯缩合生成L-肌肽。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述L-组氨酸浓度为20～60g/L，β-丙氨酸甲酯浓度为20～80g/L，重组氨肽酶催化剂的用量为1～10g/L，反应液水相pH为5.0～9.0，反应温度为20～30℃。