CN117867002A - 一种多酶共展示重组假单胞菌的构建方法和应用 - Google Patents
一种多酶共展示重组假单胞菌的构建方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种多酶共展示重组假单胞菌的构建方法和应用，以假单胞菌Pseudomonas sp.JY‑Q作为底盘细胞，使用假单胞菌JY‑Q的内源外膜蛋白OmpA(外膜蛋白A)及其变体作为锚定基序，将带有信号肽、靶蛋白、锚定肽的基因序列的重组表达质粒导入上述底盘细胞后得到工程菌株。该工程菌可以使fastpetase和mhetase基因在假单胞菌Pseudomonas sp.JY‑Q中表达，并将这两个酶展示于细胞表面，表面展示的FASTPETase以及MHETase能有效地与底物接触，可作为全细胞催化剂应用于PET塑料降解中。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种多酶共展示重组假单胞菌的构建方法和应用。
背景技术
聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)是最常用的聚酯塑料之一，性质稳定不易降解，在PET被广泛应用的同时，环境中积累的大量PET废料已经对生态系统造成了严重危害。
细胞表面展示技术是指通过重组DNA技术，使外源功能蛋白表达并定位于特定细菌细胞的表面，以达到研究与应用目标的一项蛋白质应用技术。细胞表面展示体系由锚定蛋白、靶蛋白和受体菌三部分组成。细胞表面展示是通过将肽或蛋白质适当地融合到表面锚定基序上从而在微生物表面上显示肽或蛋白质。PET水解酶的表面展示系统和全细胞生物催化剂是酶表达和功能测定的新策略。通过DNA重组，将PET水解酶基因克隆到细胞表面展示表达载体中，使PET水解酶通过锚定蛋白固定在微生物细胞表面，被展示的酶可保持较高的生物活性。通过构建PET水解酶基因工程菌将PET水解酶表达到细胞表面，不需要进行细胞破碎和酶的提取纯化，解决酶与底物不能直接充分接触以及在提取过程中活性损失等问题，增加了可重复利用性和稳定性。由于PET这种聚合物很难进入细胞，微生物细胞表面展示技术为PET的微生物降解提供了一种新对策。
假单胞菌Pseudomonas sp.JY-Q从废次烟叶水提液(Tobacco waste extraction，TWE)中分离而来，能够降解尼古丁，对尼古丁具有高度的耐受性，且能够耐受高渗透压的环境。目前对假单胞菌Pseudomonas sp.JY-Q的基因组信息以及遗传操作比较清楚，在本研究中将其选定为细胞表面展示体系的受体菌。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种多酶共展示重组假单胞菌的构建方法和应用。
具体采用如下技术方案：
本发明提供了一种表面展示FASTPETase以及MHETase的假单胞菌，其以假单胞菌Pseudomonas sp.JY-Q作为底盘细胞，将带有信号肽、靶蛋白、锚定蛋白的基因序列的重组表达质粒导入所述底盘细胞后得到，所述FASTPETase为改造后的聚对苯二甲酸乙二醇酯水解酶PETase，FASTPETase与MHETase均已进行密码子优化，锚定蛋白为假单胞菌JY-Q的外膜蛋白OmpA截断改造后的cOmpA蛋白，信号肽为Pseudomonas aeruginosa的外膜蛋白OprF(外膜蛋白F，outer membrane protein A)的信号肽Signal(OprF)，将截断后的cOmpA的信号肽替换为OprF的信号肽，将其命名为Signal(OprF)-cOmpA，作为表面展示的锚定蛋白。
作为一种优选的实施方式，所述重组表达质粒中表达FASTPETase以及MHETase的质粒为组成型质粒p519n。
本发明提供了一种重组假单胞菌的构建方法，包括如下步骤：
1)以野生型假单胞菌Pseudomonas sp.JY-Q的全基因组为模板，PCR扩增得到锚定蛋白compa片段，其基因序列如SEQ ID NO.3所示；
2)以化学合成的，来自铜绿假单胞菌的锚定蛋白OprF的信号肽为模板，PCR扩增得到信号肽signal(oprf)片段，其基因序列如SEQ ID NO.4所示；
3)以p519n质粒为模板，PCR扩增得到锚定蛋白gfp片段；
4)选择XbaI和EcoRI，作为酶切位点，将p519n质粒双酶切，按照Takara DNA片段纯化试剂盒步骤对终止反应液进行纯化回收获得双酶切后的质粒；
5)将步骤1)获得的锚定蛋白compa、步骤2)获得的signal(oprf)信号肽以及步骤3)获得的gfp片段和步骤4)的酶切p519n质粒一步克隆，获得信号肽替换后的锚定蛋白signal(oprf)-compa，PCR扩增得到signal(oprf)-compa片段；
6)编码FASTPETase以及MHETase基因序列密码子优化后化学合成，PCR扩增得到目的蛋白基因片段，FASTPETase的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，MHETase的基因序列如SEQID NO.2所示；
7)将步骤5)和步骤6)中获得的片段和酶切后的质粒进行酶连，通过热激转化到大肠杆菌DH5α中，在含有卡那霉素的固体平板中筛选阳性转化子，即可获得重组表达质粒；
8)以步骤7)中获得的重组表达质粒经电转化导入到野生型假单胞菌Pseudomonassp.JY-Q的感受态细胞中，在含有卡那霉素的固体平板中筛选，获得重组假单胞菌。
本发明提供了上述重组假单胞菌在降解PET塑料污染物中的应用，将所述重组假单胞菌全细胞破碎后的粗酶液以及纯化后的蛋白用于降解聚酯型塑料，作为一种优选的实施方式，将所述重组假单胞菌进行扩培后，收集菌体并进行超声破碎，获得全细胞破碎后的粗酶液。
作为一种优选的实施方式，所述扩大培养的培养基为LB液体培养基。
作为一种优选的实施方式，在降解体系中，使用PBS作为降解培养基，以PET作为唯一碳源时添加量为4g；以BHET为唯一碳源时降解体系中底物浓度为200mg/L。
本发明的有益效果在于：
1)本发明获得了FASTPETase以及MHETase在细胞表面展示表达的假单胞菌Pseudomonas sp.JY-Q，且镍柱纯化后获得的融合酶蛋白具有酯键水解酶活性；
2)本发明以假单胞菌Pseudomonas sp.JY-Q作为底盘细胞，构建能够降解PET的重组假单胞菌，为进一步土壤塑料污染的生物修复奠定基础。
附图说明
图1为原始质粒图谱；
图2为p519n-signal(oprf)-compa-gfp热转至E.coli DH5ɑ的菌落和菌液PCR验证图；
图3为JY-Q/p519n-signal(oprf)-compa-gfp的三种显微镜观察结果；
图4为重组质粒构建示意图；
图5为重组质粒导入JY-Q的菌落和菌液PCR验证图；
图6为重组菌株破碎后的粗酶液、沉淀以及纯化液的SDS-PAGE图；
图7为重组菌株破碎后的粗酶液、沉淀以及纯化液的BHET降解HPLC检测图；
图8为重组菌株PET粉末降解的HPLC检测图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明做进一步地说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例使用的假单胞菌Pseudomonas sp.JY-Q为能够耐受高渗透压的环境的菌株，可作为基因工程改造的底盘菌株。
LB液体培养基配方为：氯化钠10g/L，酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，溶剂为水，pH为7.0。PBS培养基配为：氯化钠16g/L，氯化钾0.4g/L，十二水合磷酸氢二钠7.26g/L，磷酸二氢钾0.48g/L，溶剂为水，pH为7.3。降解阶段温度为37℃。
实施例1
signal(oprf)-compa片段的获得以及表面展示效果验证
(1)以野生型假单胞菌Pseudomonas.sp.JY-Q的全基因组为模板，以表1中的compaF/compaR序列为引物，PCR扩增得到compa片段，其基因序列如SEQ ID NO.3所示；
(2)以化学合成的oprf片段为模板，以表1中的signal(oprf)F/signal(oprf)R序列为引物，经过PCR反应扩增得到信号肽signal(oprf)片段，其基因序列如SEQ ID NO.4所示。
(3)gfp基因来自p519ngfp质粒，以表1中gfp F/gfp R序列为引物，经过PCR反应扩增得到荧光蛋白编码基因gfp片段。
(4)p519n质粒双酶切，p519n的原始图谱如图1所示，酶切位点选择XbaI和EcoRI，双酶切体系为：XbaI 1μL、EcoRI 1μL、10x K 2μL、质粒1000ng/C(ng/μL)，ddH2Oto25μL，37℃水浴反应50min后，65℃水5min终止反应，按照Takara纯化试剂盒说明书对酶切反应液进行纯化回收得到酶切质粒。
(5)p519n-signal(oprf)-compa-gfp重组质粒连接，将纯化得到的compa基因片段、signal(oprf)基因片段以及gfp片段与纯化后线性化的p519n质粒载体使用一步克隆试剂进行连接，体外重组反应体系如表2。
(6)将重组产物热转至E.coli DH5ɑ化学感受态细胞，菌落PCR筛选阳性转化子。将验证正确的菌株进行扩培，培养过夜。进行菌液PCR二次验证，为避免假阳性的出现，PCR验证结果如图2a，验证通过后，再次扩大培养并提取重组质粒进行测序验证和后续备用，目标菌株用甘油保藏法保存于-80℃冰箱。
(7)将步骤(6)获得的重组质粒，选取质粒和浓度较好的重组质粒电转导入JY-Q中，孵育后涂布抗性LB平板，倒置培养过夜，次日挑取单菌落进行菌落PCR，PCR验证结果如图2b，验证正确的菌株扩培后提取质粒送测。
(8)将步骤(7)获得的重组菌株在倒置显微镜和共聚焦显微镜下观测荧光情况，结果如图3所示，说明使用假单胞菌JY-Q的内源外膜蛋白OmpA及其变体作为锚定基序具备细胞表面展示的能力。
表1引物序列汇总表
表2体外重组反应体系汇总表
表3高保真酶PCR反应体系
| 添加物 | 添加量 |
| ddH2O | to 50μL |
| 2×PhantaMaxMasterMix | 25μL |
| 模板DNA | 50-400ng |
| 引物F(10μM) | 2μL |
| 引物R(10μM) | 2μL |
实施例2
构建串联双酶共展示重组假单胞菌Pseudomonas.sp.JY-Q，重组质粒构建示意如图4所示。
实验所用PET水解酶和MHET水解酶均来源于Ideonella sakaiensis 201-F6，编码FASTPETase以及MHETase的基因密码子优化后化学合成，分别以表1中的fastpetase F/fastpetase R和mhetase-6his F/mhetase-6his R序列为引物，PCR反应扩增得到fastpetase以及mhetase-6his片段，高保真酶PCR扩增片段，片段按照试剂盒进行纯化和凝胶回收。以实施例1构建的p519n-signal(oprf)-compa-gfp为模版，表1so F/so R序列为引物经过PCR反应扩增得到signal(oprf)-compa片段，高保真酶PCR扩增体系如表3所示，片段按照试剂盒进行纯化和凝胶回收。将signal(oprf)-compa片段、纯化后的FASTPETase以及MHETase片段与双酶切后的p519n线性质粒使用一步克隆试剂进行连接。按照上述体外重组反应体系。连接得到重组质粒p519n-signal(oprf)-compa-fastfastpetase-mhetase-6his(简称p519n-SOFM)，在含有卡那霉素的固体LB平板中筛选阳性转化子如图5，即得到带有FASTPETase以及MHETase的重组表达质粒。
将野生型假单胞菌Pseudomonas sp.JY-Q制备成感受态细胞，接种野生型假单胞菌Pseudomonas sp.JY-Q于100mL培养基中扩培，控制OD600在0.60-0.80之间；移液枪吸取10mL菌液于预冷的无菌离心管中，4℃条件下，6000rpm离心3min；倒掉上清，加入5ml预冷的无菌水洗涤菌体2次；倒掉上清，加入5mL预冷的含有10％甘油的溶液吹打悬浮细胞，冰上静置5min，6000rpm离心3min，重复操作2次；倒掉上清，加入300μL预冷的10％甘油溶液，轻轻吹打混匀，每100μL分装至无菌1.5mL离心管中，保藏于-80℃冰箱或直接用于后续实验。将上述质粒p519n-SOFM以及电转感受态细胞置于冰上解冻，取大约1500ng重组质粒加入100μL解冻好的电转感受态细胞中，冰上静置10min。将电极杯预冷处理，然后加入混合液，冰上静置10min。选择1.50kv的电压，在电转仪中进行电转，记录电击时间在5ms左右为宜。电击结束后，立刻加入1mL灭过菌的LB培养基，吸打混匀后转移至无菌1.5mL的离心管内，30℃温度下复苏4h。菌液复苏后，离心3min，移液枪吸出800μL的LB培养基，剩余涂布于LB抗性固体平板上，倒置培养过夜。挑取单菌反复转接后进行验证，即得到重组假单胞菌，验证结果如图5，菌液的PCR验证都有正确条带并且与质粒构建验证条带一致，说明质粒电转成功。
实施例3
重组假单胞菌Pseudomonas sp.JY-Q表达FASTPETase以及MHETase在PET塑料污染物中的降解应用。
将构建的重组假单胞菌Pseudomonas sp.JY-Q接种于100mL添加了卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃过夜培养。
离心收集菌体，磷酸缓冲液(PBS)洗涤三次，超声破碎得到粗酶液，对细胞破碎液进行镍柱纯化，使用不同浓度咪唑的洗脱液洗脱目的蛋白，获得的粗酶液和纯酶液通过蛋白凝胶电泳检测表达情况如图6。粗酶液、纯化液1及纯化液2进行酶溶液的BHET降解反应，HPLC检测结果如图7，液相结果显示粗酶液、纯化液1及纯化液2对BHET都有降解效果，说明蛋白表达且有功能。
将构建的重组假单胞菌Pseudomonas sp.JY-Q接种于100mL添加了卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃过夜培养。
将离心收集的菌体洗涤三次后接入100ml PBS培养基中，加入4g PET粉末。37℃，180rpm摇床培养，培养七天，取样HPLC检测，检测结果如图8，检测到酶的降解底物生成，证明酶均已展示于细胞表面，并具备催化效果，能够降解PET。
Claims (4)
1.一种多酶共展示重组假单胞菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)以野生型假单胞菌Pseudomonas sp.JY-Q的全基因组为模板，PCR扩增得到锚定蛋白compa片段，其基因序列如SEQ ID NO.3所示；
2)以化学合成的，来自铜绿假单胞菌的锚定蛋白OprF的信号肽为模板，PCR扩增得到信号肽signal(oprf)片段，其基因序列如SEQ ID NO.4所示；
3)以p519n质粒为模板，PCR扩增得到锚定蛋白gfp片段；
4)选择XbaI和EcoRI，作为酶切位点，将p519n质粒双酶切，按照Takara DNA片段纯化试剂盒步骤对终止反应液进行纯化回收获得双酶切后的质粒；
5)将步骤1)获得的锚定蛋白compa、步骤2)获得的signal(oprf)信号肽以及步骤3)获得的gfp片段和步骤4)的酶切p519n质粒一步克隆，获得信号肽替换后的锚定蛋白signal(oprf)-compa，PCR扩增得到signal(oprf)-compa片段；
6)编码FASTPETase以及MHETase基因序列密码子优化后化学合成，PCR扩增得到目的蛋白基因片段，FASTPETase的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，MHETase的基因序列如SEQ IDNO.2所示；
7)将步骤5)和步骤6)中获得的片段和酶切后的质粒进行酶连，通过热激转化到大肠杆菌DH5α中，在含有卡那霉素的固体平板中筛选阳性转化子，即可获得重组表达质粒；
8)以步骤7)中获得的重组表达质粒经电转化导入到野生型假单胞菌Pseudomonassp.JY-Q的感受态细胞中，在含有卡那霉素的固体平板中筛选，获得重组假单胞菌。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤8)中的感受态细胞的制备过程为：接种野生型假单胞菌Pseudomonas sp.JY-Q于培养基中扩培，控制OD600在0.60-0.80之间；移液枪吸取10mL菌液于预冷的无菌离心管中，4℃条件下，6000rpm离心3min；倒掉上清，加入5ml预冷的无菌水洗涤菌体2次；倒掉上清，加入5mL预冷的含有10％甘油的溶液吹打悬浮细胞，冰上静置5min，6000rpm离心3min，重复操作2次；倒掉上清，加入300μL预冷的10％甘油溶液，轻轻吹打混匀，每100μL分装至无菌1.5mL离心管中，保藏于-80℃冰箱或直接用于后续实验。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤7)的具体操作过程为：将重组表达质粒以及电转感受态细胞置于冰上解冻，取大1500ng重组质粒加入100μL解冻好的电转感受态细胞中，冰上静置10min，将电极杯预冷处理，然后加入混合液，冰上静置10min，选择1.50kv的电压，在电转仪中进行电转，电击结束后，加入1mL灭过菌的LB培养基，吸打混匀后转移至无菌1.5mL的离心管内，30℃温度下复苏4h，菌液复苏后，离心3min，移液枪吸出800μL的LB培养基，剩余涂布于LB抗性固体平板上，倒置培养过夜，挑取单菌反复转接后进行验证，即得到重组假单胞菌。
4.一种采用如权利要求3所述的构建方法制备得到的重组假单胞菌在降解PET塑料污染物中的应用，其特征在于，包括如下步骤：将构建的重组假单胞菌接种于卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃过夜培养，磷酸缓冲液洗涤三次，超声破碎得到粗酶液，对细胞破碎液进行镍柱纯化，使用不同浓度咪唑的洗脱液洗脱目的蛋白，获得的粗酶液和纯酶液，并进行BHET降解实验，同样将构建好的的重组假单胞菌接入LB扩培，离心收集菌体，洗涤三次后接入PBS培养基中，加入PET粉末，37℃，180rpm摇床培养，培养七天，取样HPLC检测。
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