CN117551641A - 一种耐高温的L-苏氨酸醛缩酶突变体及其在L-syn-对甲砜基苯丝氨酸合成中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种耐高温的L‑苏氨酸醛缩酶突变体、基因及制备L‑syn‑对甲砜基苯丝氨酸的方法。该L‑苏氨酸醛缩酶突变体由登录号为WP_016204489.1的野生型L‑苏氨酸醛缩酶突变所得。本发明提供的耐高温L‑苏氨酸醛缩酶突变体具有较高的热稳定性和催化活性，其最适温度可以提高到70℃，在60℃下孵育2h后仍保留98％的催化活性，并且在60℃,5％DMSO下反应1h转化率可达到89.4％，具有工业化推广意义。
Description
技术领域
本发明涉及酶工程技术领域，尤其涉及一种耐高温的L-苏氨酸醛缩酶突变体、基因及制备L-syn-对甲砜基苯丝氨酸的方法。
背景技术
L-syn-对甲砜基苯丝氨酸是一种重要的医药中间体，应用于多种广谱抗生素的合成，如甲砜霉素，氟苯尼考等，研究甲砜霉素和氟苯尼考的高效绿色合成新路线一直以来是有机合成研究的重点和难点。
目前，L-syn-对甲砜基苯丝氨酸主要有两种生产方法。
一种是化学合成法，使用硫酸铜为催化剂，利用金属离子的络合作用，对甲砜基苯甲醛和甘氨酸选择性反应生成两种顺式的产物：L-syn-对甲砜基苯丝氨酸铜和D-syn-对甲砜基苯丝氨酸铜，酸不能直接进行拆分，只能继续和乙醇进行酯化反应，生成消旋化的D,L-syn-对甲砜基苯丝氨酸乙酯。此工艺主要存在以下缺点：理论收率最高只有50％，无效对映体难套用，工艺比较复杂，同时需要使用等摩尔量手性拆分剂，单次拆分收率低，拆分试剂的回收和反应中的铜盐会产生大量的废水和废盐。
另一种是将化学法和生物法结合，主要过程是先利用对甲砜基苯丝氨酸和甘氨酸在硫酸铜的催化下生成消旋化的对甲砜基苯丝氨酸铜盐，主要产物是L-syn-对甲砜基苯丝氨酸铜和D-syn-对甲砜基苯丝氨酸铜。除去产品中的铜离子生成L-syn-对甲砜基苯丝氨酸和D-syn-对甲砜基苯丝氨酸混合物，再使用D-苏氨酸醛缩酶分解D-syn-对甲砜基苯丝氨酸达到拆分的目的，得到光学纯的L-syn-对甲砜基苯丝氨酸。此工艺存在以下缺点：生产工艺复杂，原子利用率不高，理论最高只有50％，同样还会产生铜盐对环境污染较大等问题。
相比之下，使用L-苏氨酸醛缩酶催化对甲砜基苯丝氨酸和甘氨酸直接生物法合成L-syn-对甲砜基苯丝氨酸，具有以下优点：1、生产工艺简单；2、L-苏氨酸醛缩酶的选择性高，产品光学纯度高；3、无需拆分，原子利用率高，理论可达100％；4、生产过程环保，污染较小，符合绿色化学理念；5、下游分离纯化工艺简单。
L-苏氨酸醛缩酶在高温下催化速率更快且转化率更高，然而目前报道的L-苏氨酸醛缩酶的热稳定性普遍不高。来自金黄色葡萄球菌(Aeromonas jandaei)DK-39和假单胞菌(Pseudomonas sp.)的LTA在50℃下孵育15分钟后仅残余15％和10％的活性；在60℃下热处理20分钟后，来自天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)的ScLTA仅保留了原有活性的10.6％。公开号为CN 113322248 A的中国专利申请文献报道了一种来源于Pelosinus sp.的耐高温的L-苏氨酸醛缩酶突变体在55℃下温育2h后保留90％的催化活性，然而，当温度超过55℃时，酶活损失严重，不能满足工业应用。因此，为了生物法制备L-syn-对甲砜基苯丝氨酸能够大规模应用，L-苏氨酸醛缩酶的热稳定性仍需进一步提高。
此前，公开号为CN 114134134 A的中国专利申请文献报道了一种来源于尼尔森芽孢杆菌(Bacillus nealsonii)的具有高选择性和活性的LTA突变体8H/31H/143R/305R/92V/123R，但是热稳定性还有提升空间。
发明内容
针对现有L-syn-对甲砜基苯丝氨酸合成工艺无法高温反应的缺陷，运用理性设计进行分子改造，提高热稳定性，提供了一种利用L-苏氨酸醛缩酶突变体高温高效制备L-syn-对甲砜基苯丝氨酸的方法，该方法催化效率高，原料利用率高，且可循环利用，成本低。产物易于分离提纯且转化率、收率高；与化学催化工艺相比，工艺简单，对环境污染小。
具体技术方案如下：
一种L-苏氨酸醛缩酶突变体，由登录号为WP_016204489.1的野生型L-苏氨酸醛缩酶突变所得，具体为以下突变中的一种：
8H/31H/143R/305R/92V/123R/85A/207L；8H/31H/143R/305R/92V/123R/9A/21W/207L；8H/31H/143R/305R/92V/123R/12C/85A/207L；8H/31H/143R/305R/92V/123R/21W/85A/207L；8H/31H/143R/305R/92V/123R/9A/12C/21W/85A；8H/31H/143R/305R/92V/123R/12C/21W/85A/207L；8H/31H/143R/305R/92V/123R/9A/12C/21W/85A/207L。
野生型L-苏氨酸醛缩酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
SEQ ID NO.1：
atgtacagtttcaacaacgattacagtgaaggcgcacatccgcgtattctgcaggcactggtggaaagcaatctgcagcaggaaattggttatggtcaggatagttttaccaataaggccgccgaagttctgaaaaccaaaatgaatagcgatgaagttgatgtgcatctgctggttggcggtacccagaccaatctgattgcaattagtgcctttctgcgcccgcatgaagcagcaattgcagccagtaccggtcatatttttgttcatgaaaccggtgcaattgaagcaaccggtcataaagtgatta ccgttgatgccaaatatggtaaactgaccccgagtctggttcagagcgtgctggatgaacataccgatgaacatatggtg aaaccgaaactggtttatattagcaatagtaccgaaattggcaccatctatagtaaaagcgaactggaacagctgagtca gttttgccagattaataatctgattttctacatggacggcgcccgcctgggtagtgccctgtgtgcaaaagataatgatc tggttctgagtgattttccgaaactgctggatgccttttatattggcggcaccaaaaatggtgcactgatgggcgaagccctggttattaagaatgatagtctgaaaaccgatttccgttatcatattaagcagaaaggtgccatgctggcaaaaggccgcctgctgggtattcagttttatgaactgtttaaagacgacctgtttttcgaactggcagaatatgccaataagatggcagaacgtctgaatattgccctggccgaaaaagattatcgttttctgaccccgtcaagcaccaatcaggtgtttccgatttttagtaatgaaaaaatcaccatgctgcagaaaaattatcagtttaatatctgggagaagatcgataaagatcatagtgccattcgtctggtgaccagctgggcaaccaaagaagcagaagttgaagcctttattaatgaaatt
SEQ ID NO.2(单字母序列)：MYSFNNDYSEGAHPRILQALVESNLQQEIGYGQDSFTNKAAEVLKTKMNSDEVDVHLLVGGTQTNLIAISAFLRPHEAAIAASTGHIFVHETGAIEATGHKVITVDAKYGKLTPSLVQSVLDEHTDEHMVKPKLVYISNSTEIGTIYSKSELEQLSQFCQINNLIFYMDGARLGSALCAKDNDLVLSDFPKLLDAFYIGGTKNGALMGEALVIKNDSLKTDFRYHIKQKGAMLAKGRLLGIQFYELFKDDLFFELAEYANKMAERLNIALAEKDYRFLTPSSTNQVFPIFSNEKITMLQKNYQFNIWEKIDKDHSAIRLVTSWATKEAEVEAFINEI
本发明还提供了一种编码所述的L-苏氨酸醛缩酶突变体的基因。
本发明还提供了一种包含所述基因的表达载体。
进一步地，所述的表达载体，为插入有所述基因的pET28a质粒。
本发明还提供了一种包含所述基因的基因工程菌。
本发明还提供了所述的L-苏氨酸醛缩酶突变体、所述基因或所述的基因工程菌在合成L-syn-对甲砜基苯丝氨酸中的应用。
本发明还提供了一种合成L-syn-对甲砜基苯丝氨酸的方法，包括：以甘氨酸和对甲砜基苯甲醛为底物，磷酸吡哆醛为辅酶，利用催化剂进行缩合反应，生成L-syn-对甲砜基苯丝氨酸；
所述催化剂为所述的L-苏氨酸醛缩酶突变体或其固定化酶，或者所述的基因工程菌。
进一步地，所述合成L-syn-对甲砜基苯丝氨酸的方法，反应在有机溶剂-水混合溶液或水溶液中进行。
更进一步地，有机溶剂为DMSO，有机溶剂的添加量为总体积的≤5％。
进一步地，所述缩合反应在20-70℃、pH 5.0-9.0条件下进行。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的耐高温L-苏氨酸醛缩酶突变体具有较高的热稳定性和催化活性，其最适温度可以提高到70℃，在60℃下孵育2h后仍保留98％的催化活性，并且在60℃,5％DMSO下反应1h转化率可达到89.4％，具有工业化推广意义。
附图说明
图1为生物法合成L-syn-对甲砜基苯丝氨酸的化学方程式示意图。
图2为底物对甲砜基苯甲醛标样高效液相检测图谱(非手性分析)，对甲砜基苯甲醛保留时间为2.620min。
图3为产物对甲砜基苯丝氨酸标样高效液相检测图谱(非手性分析)，对甲砜基苯丝氨酸保留时间为8.625min。
图4为实施例2突变体8H/31H/143R/305R/92V/123R/S9A/A12C/G85A/V21L/L25W/G85A/M207L在4℃下孵育1h后投入反应的反应液(反应10min)高效液相检测图谱(非手性分析)：其中，L-syn-对甲砜基苯丝氨酸为8.585min。
图5为实施例2突变体8H/31H/143R/305R/92V/123R/9A/12C/21W/85A/207L在65℃下孵育1h后投入反应的反应液(反应10min)高效液相检测图谱(非手性分析)：其中，L-syn-对甲砜基苯丝氨酸为8.652min。
图6为实施例4突变体8H/31H/143R/305R/92V/123R/9A/12C/21W/85A/207L的温度-活性曲线。
图7为实施例5突变体8H/31H/143R/305R/92V/123R/9A/12C/21W/85A/207L的残余酶活-温度曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。
本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参见J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。
上游基因工程操作所用试剂：本发明实施例中使用的限制性内切酶、Primer STARDNA聚合酶、DNA连接酶、重组酶均购自TaKaRa；基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA回收纯化试剂盒构自Axygen；E.coil BL21(DE3)、质粒等购自Novagen公司；DNA marker、低分子量标准蛋白、琼脂糖电泳试剂购自北京全式金生物技术有限公司；引物合成与基因测序工作有杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成。以上试剂使用方法参考商品说明书。
下游催化工艺所用试剂：甘氨酸、对甲砜基苯甲醛、L-syn-对甲砜基苯丝氨酸、磷酸吡哆醛均为市受分析纯。
对甲砜基苯甲醛结构式如式(1)所示；L-syn-对甲砜基苯丝氨酸的结构式如式(2)所示；具体如下：
本发明通过高效液相色谱(HPLC)分析反应液中底物、产物的浓度，监测反应进行。HPLC分析方法如下：色谱柱型号：QS-C18、5μm，4.6×250mm。流动相：KH2PO4(50mM):乙腈＝21:79，pH＝8.0，检测波长：225nm，流速：1.0mL/min，柱温：40℃。底物(标品)和产物(标品)出峰情况，见图2和图3。
实施例1
1、野生酶工程菌构建
在National Coalition Building Institute(NCBI)数据库中输入threoninealdolase等关键词检索并挑选编码L-苏氨酸醛缩酶的氨基酸序列WP_016204489.1(来源于Bacillus nealsonii(BnLTA))。依据大肠杆菌密码子偏好性将氨基酸序列转化为核苷酸序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。将核苷酸序列通过化学法全合成(安徽通用生物)，并且整合在表达载体pET-28a的多克隆位点BamH I和HindIII之间。最后将构建好的质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中构建野生型L-苏氨酸醛缩酶工程菌。
2、突变酶的构建
2.1工程菌的活化及质粒提取
所有工程菌(步骤1构建获得)均使用LB培养基进行活化与培养，配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L,用去离子水溶解后定容，115℃灭菌30min，待用。固体培养基为LB培养基加入2％的琼脂。
将保存的工程菌甘油管接入含有10mL LB培养基的试管中，30℃、200rpm培养12h。在获得培养菌体后，根据Axygen质粒提取试剂盒的操作说明书进行质粒提取，取得质粒可直接用于点突变也可置于-20℃长期保存。
2.2基因定点突变
基因突变采用全质粒PCR的方法，获得突变基因。
PCR扩增体系：
PCR扩增条件：
1)预变性：95℃3min
2)变性：95℃30s；退火：60℃30s；延伸：72℃90s；共循环25次；
3)后延伸：72℃5min；
4)4℃保存。
PCR扩增结束后，扩增产物用0.9％琼脂糖凝胶电泳来检测，结果显示扩增产物为单一条带，大小分别为7000bp左右。用DNA回收试剂盒对扩增产物进行纯化回收，具体步骤参照纯化试剂盒说明书。
L-苏氨酸醛缩酶BnLTA第12位丙氨酸突变为半胱氨酸所需引物：
上游引物：CATAGTGAAGGCTGCCATCCGCGTATTCTG；
下游引物：ATACGCGGGCATGCGCCTTCACTATGA；
其他突变点引物按照该原则设计。
2.3突变体工程菌的构建
将纯化后的基因片段使用DpnI消化去除模板然后用重组酶进行重组。将重组产物转化至E.coil BL21(DE3)感受态细胞中，涂平板、挑单菌落至LB液体培养，PCR法鉴定构建成功的阳性转化子，并通过测序验证突变位点的正确性。验证无误后，加入终浓度为25％的无菌甘油后，编号，置于-80℃保藏备用。
3、菌体的培养及粗酶液的制备
3.1菌体的培养
LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，用去离子水溶解后定容，115℃灭菌30min，待用。
将含有L-苏氨酸醛缩酶基因的工程菌在经培养皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/mL卡那霉素的5mL LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2％的接种量转接至50mL同样含50μg/mL卡那霉素的新鲜LB培养基中，37℃震荡培养至OD600达到0.6左右时，加入IPTG至其终浓度为0.5mM，18℃诱导培养16h。培养结束后，将培养液5000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，-80℃超低温冰箱中保存，待用。
3.2粗酶液的制备
将培养结束后收集的菌体，用50mM pH 8.0的磷酸缓冲液洗涤菌体两次。之后将菌体重悬于pH 8.0的磷酸缓冲液中，400W功率超声破碎30次，每次超声持续3s，间歇7s。将此细胞破碎液12000rpm 4℃离心3min，去除沉淀，获得的上清为含有重组L-苏氨酸醛缩酶的粗酶液。
3.3纯酶液的制备
使用Ni-NTA树脂纯化上述带有组氨酸标签的粗酶液。首先，将样品加载到预先平衡的Ni柱中，结合缓冲液为Tris-HCl缓冲液(100mM，pH8)，其中含有100mM NaCl和50mM咪唑。目标蛋白通过洗脱缓冲液【Tris-HCl缓冲液(100mM，pH8.0)，含有100mM NaCl和250mM咪唑)】进行洗脱。然后，通过超滤浓缩洗脱液，加入甘油至最终浓度为10％。最后，将纯化后的酶以等分的方式保存在-80℃，并使用BSA蛋白质测定法测定蛋白质浓度。
实施例2L-苏氨酸醛缩酶及其突变体在水溶液中制备L-syn-对甲砜基苯丝氨酸
按实施例1的方法培养能够表达L-苏氨酸醛缩酶的工程菌及其突变体，并获得粗酶液。
定量称取0.1M对甲砜基苯甲醛、1M甘氨酸到1L反应器中，用100mM pH 8.0NaOH-Gly缓冲液定容到1L，磷酸吡哆醛的终浓度为1μM，湿菌体浓度为5g/L。通过水浴控制反应温度为60℃，磁力搅拌，反应10min后，检测底物和产物的浓度，以确定酶活，测得数据见表1，之后间隔10min取样测得转化率直至转化率不再变化(酶失活或者达到反应平衡)，最终转化率数据见表1。
实施例3L-苏氨酸醛缩酶及其突变体在水-DMSO溶液中制备L-syn-对甲砜基苯丝氨酸
按实施例1的方法培养能够表达L-苏氨酸醛缩酶的工程菌及其突变体，并获得粗酶液。
定量称取0.1M对甲砜基苯甲醛、1M甘氨酸到1L反应器中，反应体系中DMSO的体积分数为5％，用100mM pH 8.0NaOH-Gly缓冲液定容到1L，磷酸吡哆醛的终浓度为1μM，湿菌体浓度为5g/L。通过水浴控制反应温度为60℃，磁力搅拌，反应10min后，检测底物和产物的浓度以确定酶活，测得数据见表1，之后间隔10min取样测得转化率直至转化率不再变化(酶失活或者达到反应平衡)，最终转化率数据见表1。
实施例4L-苏氨酸醛缩酶及其突变体的最适反应温度的测定
按实施例1的方法培养能够表达L-苏氨酸醛缩酶的工程菌及其突变体，并获得粗酶液。突变体为8H/31H/143R/305R/92V/123R/9A/12C/21W/85A/207L。
定量称取0.1M对甲砜基苯甲醛、1M甘氨酸到1L反应器中，用100mM pH 8.0NaOH-Gly缓冲溶液定容到1L，磷酸吡哆醛的终浓度为1μM，湿菌体浓度为5g/L。通过水浴控制反应温度为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，磁力搅拌，反应10min后，检测底物和产物的浓度以确定酶活。数据如见表1。
实施例5L-苏氨酸醛缩酶及其突变体的动力学热稳定性
按实施例1的方法培养能够表达L-苏氨酸醛缩酶的工程菌及其突变体，并获得粗酶液。突变体为8H/31H/143R/305R/92V/123R/9A/12C/21W/85A/207L。
将粗酶液在20-70℃水浴锅温浴2h，然后放至冰上冷却。定量称取0.1M对甲砜基苯甲醛、1M甘氨酸到1L反应器中，用100mM pH 8.0NaOH-Gly缓冲溶液定容到1L，磷酸吡哆醛的终浓度为1μM，湿菌体浓度为5g/L。通过水浴控制反应温度为30℃，磁力搅拌，反应10min后检测底物和产物的浓度以测定残余酶活。
表1L-苏氨酸醛缩酶及其突变体的酶活，热稳定性
Claims (10)
1.一种L-苏氨酸醛缩酶突变体，其特征在于，由登录号为WP_016204489.1的野生型L-苏氨酸醛缩酶突变所得，具体为以下突变中的一种：
8H/31H/143R/305R/92V/123R/85A/207L；8H/31H/143R/305R/92V/123R/9A/21W/207L；8H/31H/143R/305R/92V/123R/12C/85A/207L；8H/31H/143R/305R/92V/123R/21W/85A/207L；8H/31H/143R/305R/92V/123R/9A/12C/21W/85A；8H/31H/143R/305R/92V/123R/12C/21W/85A/207L；8H/31H/143R/305R/92V/123R/9A/12C/21W/85A/207L。
2.一种编码如权利要求1所述的L-苏氨酸醛缩酶突变体的基因。
3.一种包含如权利要求2所述基因的表达载体。
4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，为插入有如利要求2所述基因的pET28a质粒。
5.一种包含如权利要求2所述基因的基因工程菌。
6.如权利要求1所述的L-苏氨酸醛缩酶突变体、如权利要求2所述基因或权利要求5所述的基因工程菌在合成L-syn-对甲砜基苯丝氨酸中的应用。
7.一种合成L-syn-对甲砜基苯丝氨酸的方法，其特征在于，包括：以甘氨酸和对甲砜基苯甲醛为底物，磷酸吡哆醛为辅酶，利用催化剂进行缩合反应，生成L-syn-对甲砜基苯丝氨酸；
所述催化剂为如权利要求1所述的L-苏氨酸醛缩酶突变体或其固定化酶，或者如权利要求5所述的基因工程菌。
8.如权利要求7所述的合成L-syn-对甲砜基苯丝氨酸的方法，其特征在于，反应在有机溶剂-水混合溶液或水溶液中进行。
9.如权利要求7所述的合成L-syn-对甲砜基苯丝氨酸的方法，其特征在于，有机溶剂为DMSO，有机溶剂的添加量为总体积的≤5％。
10.如权利要求7所述的合成L-syn-对甲砜基苯丝氨酸的方法，其特征在于，所述缩合反应在20-70℃、pH 5.0-9.0条件下进行。
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