CN116287050A - 亚胺还原酶、突变体及其在四氢-β-咔啉类衍生物合成中的应用 - Google Patents

亚胺还原酶、突变体及其在四氢-β-咔啉类衍生物合成中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体为胺还原酶、突变体及其在四氢‑β‑咔啉类衍生物合成中的应用。本发明利用来源于Amycolatopsis thermoflava的亚胺还原酶及其酶活力、转化率显著提高的突变体的游离酶或重组表达转化体作为催化剂不对称还原二氢‑β‑咔啉类化合物生成相应的(S)‑四氢‑β‑咔啉类化合物，其可作为中间体进一步合成手性药物。所述突变体是将亚胺还原酶氨基酸序列中第118位甲硫氨酸、第120位脯氨酸及第174位苯丙氨酸中的一个或多个氨基酸残基替换为其它氨基酸残基所形成的新氨基酸序列的衍生蛋白质。该亚胺还原酶突变体的酶活性高于现有技术，可提高催化还原反应的产率，缩短反应时间。

Description

亚胺还原酶、突变体及其在四氢-β-咔啉类衍生物合成中的 应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及胺还原酶、突变体及其在四氢-β-咔啉类衍生物合成中的应用。
背景技术
四氢-β-咔啉类(THβCs)化合物是一类具有多种药理活性的氮杂环生物碱，在药物和具有生物活性的天然产物中广泛存在，例如利血平，阿马碱，他达拉非，四氢哈尔明碱，松香烃等均含有该骨架片段。其中，含有1-位取代基的片段因其显著的药用特性而尤为重要；例如，Tadalafil和AZD-9496分别用于治疗勃起功能障碍和抗乳腺癌的药物先导(I期临床试验)：
Figure BDA0004070478890000011
具有药学意义的THβCs类化合物
THβCs类化合物因其复杂的分子结构和与之相关的丰富生物活性引起了合成界的极大关注，已经报道了许多关于这些结构完全合成的开创性研究。其中，THβCs的不对称合成方法的发展仍然是一个重要的挑战，尽管前任已经开发了许多方法，包括手性辅助剂、过渡金属催化剂、有机催化剂等的使用，但同时也存在反应条件苛刻，贵金属的使用与残留等局限性。因此，开发一种绿色高效，反应条件温和的合成方法显得尤为重要。
生物法制备手性胺通常以酶为催化剂，拆分外消旋体或者直接催化手性胺的不对称合成。相较于传统的化学合成方法，生物酶法具有良好的对映选择性，可以在温和的环境中参与反应等优势，被看作金属催化剂的潜在绿色替代品。随着生物技术的发展和生物酶催化手性胺合成的研究的深入，越来越多催化手性胺生成的新酶被挖掘，目前催化手性胺不对称合成的生物酶主要包括转氨酶、亚胺还原酶、氨基酸脱氢酶和单胺氧化酶等。其中，亚胺还原酶(IRED)可催化亚胺不对称合成相应的手性胺，理论产率可达100％，且具有催化合成手性仲胺和叔胺的独特优势，也逐渐成为国内外研究的热点。
与许多其他N-杂环反应类似，迄今为止，通过IRED合成THβCs仅限于立体阻碍较小的1-烷基产物，1-位季碳取代的THβCs的生物合成方法尚无报道，而1-芳基-THβCs的生物催化方法仅在单胺氧化酶(MAO-N)与非选择性化学还原剂的化学酶解、酶法Pictet-Spengler反应中获得成功。然而，这些方法中的大多数存在酶活性不高，转化率低，e.e.值通常不太令人满意等问题；因此，开发更高效系统的方法，特别是那些能够催化生成(S)-1-位大位阻取代的产品的方法，具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的问题和不足，提供一种胺还原酶及其突变体，以及在四氢-β-咔啉类衍生物合成中的应用。
本发明包括：首先提供来源于Amycolatopsis thermoflava的亚胺还原酶；其次通过蛋白质工程技术对野生型亚胺还原酶进行分子改造，获得活性和立体选择性显著提高的亚胺还原酶突变体；然后以所述亚胺还原酶或其突变体的游离酶或重组表达转化体作为催化剂，不对称还原二氢-β-咔啉类(DHβCs)(简记为化合物1)生成(S)-四氢-β-咔啉类(THβCs)衍生物(简记为化合物2)；THβCs衍生物可作为中间体进一步用于合成手性药物。
本发明第一方面：提供一种野生型亚胺还原酶，记为IRED-At，其氨基酸序列如SEQID No.2所示。其对应编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1；该亚胺还原酶可以高选择性还原二氢-β-咔啉类(DHβCs)(化合物1)。
本发明利用生物信息学手段分析预测可能对化合物1具有明显还原活性的亚胺还原酶，并将其基因进行克隆表达，构建重组大肠杆菌。通过测定重组表达的亚胺还原酶对化合物1的活性及选择性，对一系列候选的亚胺还原酶进行筛选，最终获得催化性能较佳，选择性较高的亚胺还原酶，其来源于Amycolatopsis thermoflava。
本发明第二方面，提供上述多种亚胺还原酶突变体，也可称之为重组亚胺还原酶。本发明对所述亚胺还原酶IRED-At的氨基酸序列进行分子改造，提供多种亚胺还原酶突变体。所述亚胺还原酶突变体是在如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经过取代一个或几个氨基酸形成的稳定性提高的衍生蛋白质。
具体地，是将如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中第118位甲硫氨酸、第120位脯氨酸及第174位苯丙氨酸中的一个或多个氨基酸残基替换为其它氨基酸残基所形成的新氨基酸序列的衍生蛋白质。
进一步地，所述亚胺还原酶突变体具有如下序列中的一种：
(1)将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第118位甲硫氨酸替换为亮氨酸；
(2)将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第120位脯氨酸替换为甘氨酸；
(3)将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第118位甲硫氨酸替换为亮氨酸，第120位脯氨酸替换为丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、缬氨酸、谷氨酸或精氨酸；
(4)将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第118位甲硫氨酸替换为亮氨酸，第120位脯氨酸替换为丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、缬氨酸、谷氨酸或精氨酸，第174位苯丙氨酸替换为丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或亮氨酸。
本发明第三方面，还提供一种分离的核酸，所述核酸编码所述野生型亚胺还原酶或其突变体。并提供核酸的重组表达载体，具体通过本领域常规的方法将所述亚胺还原酶IRED-At或其突变体核酸克隆到各种表达载体上而得到重组表达载体。所述表达载体包括本领域常规的各种载体，如市售的质粒、噬菌体或是病毒载体等，优选载体为质粒pET28a。
本发明第四方面，还提供一种包含所述亚胺还原酶基因或所述亚胺还原酶突变体基因或其重组表达载体的重组表达转化体。所述重组表达转化体可通过将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，并且其所携带的亚胺还原酶IRED-At或其突变体的基因可被有效表达即可。所述宿主细胞优选为大肠杆菌，更优选的为：大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。将所述重组表达载体转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，即可获得本发明优选的重组表达转化体。例如，将重组表达载体pET28a-IRED-At转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-IRED-At。
本发明还涉及制备表达工程菌的静息细胞悬浊液，具体步骤为：将工程菌接种到含卡那霉素的培养基上，摇床活化后，扩大培养至OD600值达到0.8-1.2时，加入诱导剂，继续培养，离心收集细胞，用缓冲液重悬，获得静息细胞悬浊液。对所述静息细胞悬浊液进行超声破碎，离心，获得所述细胞上清液。其中，所述诱导剂为IPTG，诱导剂的浓度为0.05mM-0.8mM；加入诱导剂后的培养条件为：培养温度为15～25℃，培养时间为8-24h。所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液，浓度为30～300mM。
本发明中，酶催化反应需要用到葡萄糖脱氢酶来重生辅酶NADPH。具体在反应中加入葡萄糖脱氢酶(GDH)作为辅酶，上述细胞上清液与葡萄糖脱氢酶(GDH)细胞上清液的体积比为20:1-1:2。更优选两者体积比为10:1-8:1。
本发明第五方面，还提供亚胺还原酶催化剂，具体为以下形式中的任意一种：
(1)培养所述重组表达转化体，分离含有所述亚胺还原酶的突变体；
(2)对含有上述亚胺还原酶的转化体细胞进行破碎，获得含有所述亚胺还原酶的细胞破碎液；
(3)将含有所述亚胺还原酶的细胞破碎液冷冻干燥而得到的冻干酶粉；
(4)将含有所述亚胺还原酶的转化体细胞冷冻干燥而得到的冻干细胞。
本发明第六方面，提供所述亚胺还原酶突变体在催化二氢-β-咔啉类(DHβCs)(化合物1)不对称还原生成S-(THβCs)(化合物2)中的应用。
具体包括，以DHβCs化合物作为底物，辅酶NADPH存在下，使用亚胺还原酶突变体催化二氢-β-咔啉类(DHβCs)类衍生物不对称还原制备光学纯S构型产物，同时NADPH氧化生成NADP+。
在整个不对称还原反应过程中，一方面亚胺还原酶IRED-At或其优势突变体催化还原化合物1不对称合成化合物2；另一方面，葡萄糖脱氢酶(GDH)将葡萄糖氧化为葡萄糖内酯，同时消耗了氧化型辅酶因子NADP+，再生还原型辅酶因子NADPH，还原型辅酶因子NADPH将提供氢给底物，自身又被氧化成氧化型辅酶因子NADP+，形成一个辅酶因子消耗与再生的闭合回路，推动主反应的进行。
所述二氢-β-咔啉类(DHβCs)化合物的浓度为5～300mmol/L，所述羰基还原酶的用量为0.01g湿重/L-25g湿重/L，反应温度20～40℃，反应缓冲液pH为6.0-9.0。
不对称还原反应中，优选，反应温度为25-30℃，反应缓冲液pH为6.5-8.0。缓冲浓度为100-250mM。
不对称还原反应中，所述溶剂为Tris-HCl缓冲液与助溶剂的混合溶剂。其中，助溶剂选自：高介电常数溶剂(如二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺)，芳香族溶剂(如苯、甲苯、乙苯、氯苯、溴苯)，非极性溶剂(如正己烷、环己烷)，以及极性溶剂(如乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、甲醇、乙醇、异丙醇)中的一种或多种。优选溶剂为DMSO、Tris-HCl缓冲液的混合溶剂，体积比为10:90。
在整个反应过程中，待反应至GC检测底物完全耗尽后，用等体积的乙酸乙酯萃取3-4次，合并有机相，用饱和碳酸氢钠洗涤2次，水洗1次，饱和食盐水洗1次，无水硫酸钠干燥，真空减压除去有机溶剂，得到目标产物。
本发明中，所述二氢-β-咔啉类(DHβCs)(化合物1)的结构如下之一种：
Figure BDA0004070478890000051
与现有发明技术相比，本技术具有以下有益效果：
本发明构建含亚胺还原酶IRED-At及其突变体和含葡萄糖脱氢酶GDH的工程菌应用于催化还原化合物1，为化合物2的生产提供了一种新的生物制备途径。相对于其它制备方法，使用本发明方法制备所得的含亚胺还原酶IRED-At及其突变体和含葡萄糖脱氢酶GDH的工程菌具有对环境友好、操作简便、易于工业放大等优势，且能以底物普适性广、高立体选择性、高收率得到化合物2，具有很好的工业应用前景。
附图说明
图1显示经Ni-NTA柱纯化后的IRED-At及其突变体的SDS-PAGE。
图2显示亚胺还原酶不对称还原化合物1a生成(S)-2a的高效液相色谱图。
图3显示生成物(S)-2a的1H NMR。
具体实施方式
下面结合具体的实施例进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明的范围。
实施例1、基因工程菌的构建及诱导表达
挑取上例中在含卡那霉素的LB培养基平板上出现的阳性转化子，接种于3mL含100μg/mL卡那青霉素的LB液体培养基，37℃，200rpm过夜培养；以1％的接种量接入1L上述LB培养基中，37℃，200rpm继续培养4-5h，待培养物OD达到0.6-0.8左右时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，于16℃，100rpm过夜诱导培养。5 000rpm离心收集菌体，用10mL无菌水重悬菌体，超声破碎，15 000rpm离心收集上清液，即为粗酶液。
粗酶液用Ni-NTA柱纯化：用Binding buffer(20mM Tris-HCL，500mM NaCl，20mM咪唑，pH 7.0)冲洗5倍柱体积平衡层析柱后，上样，以10倍柱体积Binding buffer洗去层析柱中未结合的蛋白，以Elution buffer(20mM Tris-HCL，500mM NaCl，500mM咪唑，pH 7.0)洗脱目的蛋白。洗脱液用30kDa超滤管(Amicon Ultra 15，Millipore)进行脱盐和浓缩，最终得到纯度90％以上的重组亚胺还原酶，SDS-PAGE如图1所示。
实施例2、亚胺还原酶酶活测定及酶催化产物HPLC分析
Figure BDA0004070478890000061
其中，酶活力的定义：在上述反应体系中，1min内催化氧化1μmol还原型辅酶NADPH的酶活力定义为一个酶活力单位，用U表示。
酶活力计算公式如下：
Figure BDA0004070478890000071
A2:反应1min时，在410nm处的吸光度值；A1:反应初始时，在410nm处的吸光度值；V:反应液的总体积，mL；ε：摩尔吸光系数，L/mol/cm；L:光程距离，cm。
该酶活测定是在410nm下通过测定底物1的消耗计算而得；其中，ε是通过吸光系数曲线计算而得。
HPLC分析：
于50mL反应体系，(Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 7.5)中加入10mL亚胺还原酶或其突变体粗酶液，2mL葡萄糖脱氢酶(GDH),10mM底物1，20mM葡萄糖溶液，1mM NADP+，10％(v/v)DMSO。30℃，500rpm下反应12h。反应结束后，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥后过滤旋干，采用正向液相色谱仪测定转化率以及对映选择性。其中反应式如下：
Figure BDA0004070478890000072
亚胺还原酶IRED-At不对称还原底物1
检测条件：色谱柱为
Figure BDA0004070478890000073
OD-H(250×4.6mm)，正己烷：异丙醇：二乙胺＝90:10:0.1,流速为1.0mL/min,265nm UV。
实施例3、亚胺还原酶IRED-At突变体的构建
采用半理性设计的方法构建亚胺还原酶IRED-At的突变库：以IRED-At蛋白序列为探针进行同源建模，优取同源性在40％以上的蛋白结构模型。通过Autodock对接，在底物附近
Figure BDA0004070478890000074
范围内挑选出一系列的非保守残基进行单点突变，通过设计相应的突变引物，以质粒pET28a-IRED-At作为模板，用高保真聚合酶TransStart FastPfu Fly DNA polymerase进行PCR扩增。PCR反应条件如下：总体积为50μL的PCR反应体系中，加入10μL FastPfu DNApolymerase buffer(5×)，4μL 2.5mM dNTPs，1μL(100ng)模板DNA(pET28a-His-6-tag-IRED-At)，10μM引物(正反向各2μL)，1μL FastPfu DNA polymerase，加无菌ddH2O至50μL。PCR反应程序：(1)98℃预变性3min，(2)98℃变性20s，(3)60-68℃退火30s，(3)72℃延伸30s，步骤(1)～(3)共进行30个循环，72℃终延伸10min，4℃保存PCR产物。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后切胶回收，进行第二步全质粒PCR。PCR反应条件如下：总体积为50μL的PCR反应体系中，加入10μL FastPfu DNA polymerase buffer(5×)，4μL 2.5mM dNTPs，0.5μL(100ng)模板DNA(pET28a-His-6-tag-IRED-At)，2μL 50mM MgSO4，15μl上步所得短片段，1μL FastPfu DNA polymerase，10μL PCR Stimulant，加无菌ddH2O至50μL。PCR反应程序：(1)98℃预变性3min,(2)98℃变性20s，(3)60-68℃退火30s.(3)72℃延伸8min，步骤(1)～(3)共进行20个循环，72℃终延伸10min，4℃保存PCR产物。加入限制性内切酶Dpn I在37℃消化2h。将消化产物转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，并涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基，平板中，置于37℃培养箱中静置培养约12h。将所得到的单克隆菌落挑至含有50μg/mL卡那霉素的LB试管中，37℃振荡培养12h，提取质粒进行DNA测序验证，确认正确的突变菌株进行进一步的发酵培养。
实施例4、重组亚胺还原酶IRED-At及其突变体的诱导表达及纯化
将实施例3中所得的重组表达转化体E.coli BL21(DE3)/pET28a-IRED-At接种至含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃摇床振荡培养12h，之后按1％(v/v)的接种量接种至装有100mL LB培养基(含50μg/mL卡那霉素)的500mL锥形瓶中，37℃、200rpm振荡培养，当培养液的OD600达到0.6时，加入终浓度0.1mmoL/L的IPTG进行诱导，16℃诱导18小时后，将培养液以8500rpm转速离心，收集细胞沉淀，并用生理盐水洗涤，得到静息细胞，将其冷冻干燥，制得冻干细胞，其比活力为2-250mU/mg DCW。
将所得的静息细胞悬浮于100mL的Tris-HCl缓冲液(l00 mM,pH 7.5)中，冰水浴中进行超声破碎，离心收集上清液，即为重组亚胺还原酶IRED-At及其突变体的粗酶液。所得粗酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，重组亚胺还原酶IRED-At和其突变体以可溶的形式存在。
镍柱纯化具体步骤：
①镍柱平衡：Lysis Buffer平衡镍柱约5个柱体积(如果镍柱保存在NiCl2中应先用超纯水冲洗5个
柱体积，再用Lysis Buffer平衡)；
②蛋白上样：将20mL粗酶液(即菌体破碎液上清)加入到镍柱中；
③去除杂蛋白：加入Washing Buffer洗脱柱子中的杂蛋白，冲洗3～4个柱体积；
④洗脱目的蛋白：加入20mL Elution Buffer将目的蛋白洗脱并收集；
⑤目的蛋白除盐：将上步收集液浓缩至体积为2.5mL，再加入3.5mL StorageBuffer除去蛋白混有的无机盐离子；
⑥目的蛋白超滤：利用15kDa超滤管(根据目的蛋白大小选择超滤管大小)；
在4℃,4500rpm下离心30min对收集的目的蛋白进行超滤，并用不含有咪唑和盐离子的去离子水超滤两次目标蛋白，除去杂离子，测定蛋白的浓度(蛋白浓缩至10～50mg/mL)并将纯化浓缩的蛋白分装，经液氮速冻后放置-80℃中备用；
⑦镍柱后处理：用Elution Buffer冲洗镍柱5个柱体积；再用ddH2O冲洗3个柱体积；再用Washing Buffer清洗镍柱2个柱体积；再次用ddH2O冲洗镍柱5个柱体积至pH为中性；最后，加入0.1mol/L的NiCl2对镍柱进行重新挂镍后用Lysis Buffer充满镍柱，镍柱后处理完成。
实施例5、IRED-At-M118′L催化还原5mM的底物1a
Figure BDA0004070478890000091
在含有5mM底物1a(0.92g/L)和10mM葡萄糖(1.81g/L)的50mL的Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 7.5)中，加入实施例3中1.0g/L的IRED-At-M118′L湿菌体，50mg/L GDH湿菌体的破碎液及1.0mmol/L的NADP+。磁力搅拌下于30℃进行反应，反应过程中通过0.5mol/L的NaOH溶液使pH控制在7.5。反应结束后，加入等量乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥，过滤旋干。用高效液相分析测得：底物转化率为99％，ee值≥99％(HPLC见图2)(
Figure BDA0004070478890000092
OD-H,正己烷：异丙醇：二乙胺为流动相)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.06(s,1H),7.50(d,J＝7.6Hz,1H),7.31(d,J＝7.8Hz,1H),7.18-7.09(m,2H),4.21-4.15(m,1H),3.37(ddd,J＝12.9,5.2,3.7Hz,1H),3.06(ddd,J＝13.3,8.7,5.3Hz,1H),2.79-2.71(m,2H),1.45(d,J＝6.8Hz,3H).(核磁见图3)。
实施例6、IRED-At-M118′L催化还原300mM的底物1b
Figure BDA0004070478890000093
在含有300mM底物1b(67.8g/L)和600mM葡萄糖(108.6g/L)的50mL的Tris-HCl缓冲液(100mM,pH7.5)中，加入实施例3中3.0g/L的IRED-At-M118′L冻干酶粉，70mg/L GDH湿菌体的破碎液及1.0mmol/L的NADP+。磁力搅拌下于30℃进行反应，反应过程中通过0.5mol/L的NaOH溶液使pH控制在7.5。反应结束后，加入等量乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥，过滤旋干。用高效液相分析测得：底物转化率为99％，ee值≥99％(
Figure BDA0004070478890000101
OD-H,正己烷：异丙醇：二乙胺为流动相)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.95(s,1H),7.54(d,J＝7.6Hz,1H),7.35(d,J＝7.9Hz,1H),7.21–7.12(m,2H),3.89(s,1H),3.41(dt,J＝12.2,4.0Hz,1H),2.93(dt,J＝12.6,7.0Hz,1H),2.78–2.75(m,2H),1.14(s,9H)。
实施例7、IRED-At-M118′L/P120′G催化还原10mM的底物1c
Figure BDA0004070478890000102
在含有10mM底物1c(2.12g/L)和20mM葡萄糖(3.62g/L)的50mL的Tris-HCl缓冲液(100mM,pH7.5)中，加入实施例3中1.0g/L的IRED-At-M118′L/P120′G湿菌体，50mg/L GDH湿菌体的破碎液及1.0mmol/L的NADP+。磁力搅拌下于30℃进行反应，反应过程中通过0.5mol/L的NaOH溶液使pH控制在7.5。反应结束后，加入等量乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥，过滤旋干。用高效液相分析测得：底物转化率为99％，ee值≥99％(
Figure BDA0004070478890000103
OD-H,环己烷/异丙醇/二乙胺为流动相)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.79(s,1H),7.50(d,J＝7.7Hz,1H),7.32(d,J＝7.9Hz,1H),7.13(dt,J＝21.8,7.2Hz,2H),4.04–4.02(m,1H),3.44–3.39(m,1H),3.03–2.97(m,1H),2.81–2.70(m,1H),2.24–2.16(m,1H),2.14(s,3H),1.16(d,J＝6.9Hz,3H),0.90(d,J＝6.9Hz,3H)。
实施例8、IRED-At-P120′G催化还原15mM的底物1d
Figure BDA0004070478890000104
在含有15mM底物1d(3.18g/L)和30mM葡萄糖(5.43g/L)的50mL的Tris-HCl缓冲液(100mM,pH7.5)中，加入实施例3中1.5g/L的IRED-At-P120′G冻干粉，50mg/L GDH湿菌体的破碎液及1.0mmol/L的NADP+。磁力搅拌下于30℃进行反应，反应过程中通过0.5mol/L的NaOH溶液使pH控制在7.5。反应结束后，加入等量乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥，过滤旋干。用高效液相分析测得：底物转化率为99％，ee值≥99％(
Figure BDA0004070478890000111
IC,环己烷/异丙醇/二乙胺为流动相)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.44(d,J＝7.9Hz,1H),7.33(d,J＝8.1Hz,1H),7.12(t,J＝7.6Hz,1H),7.02(t,J＝7.5Hz,1H),4.66(dd,J＝9.1,4.1Hz,1H),3.72–3.67(m,1H),3.44–3.37(m,1H),3.12–2.98(m,2H),2.26–2.17(m,1H),1.95–1.85(m,1H),1.66–1.52(m,2H),1.06(t,J＝7.3Hz,3H).
实施例9、IRED-At-M118′L催化还原150mM的底物1f
Figure BDA0004070478890000112
在含有150mM底物1f(35.72g/L)和300mM葡萄糖(54.3g/L)的50mL的Tris-HCl缓冲液(100mM,pH7.5)中，加入实施例3中3.0g/L的IRED-At-P120′G菌体冻干粉，70mg/L GDH湿菌体的破碎液及1.0mmol/L的NADP+。磁力搅拌下于30℃进行反应，反应过程中通过0.5mol/L的NaOH溶液使pH控制在7.5。反应结束后，加入等量乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥，过滤旋干。用高效液相分析测得：底物转化率为99％，ee值≥99％(
Figure BDA0004070478890000113
IC,环己烷/异丙醇/二乙胺为流动相)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.45(d,J＝7.9Hz,1H),7.36(d,J＝8.1Hz,1H),7.12(t,J＝7.6Hz,1H),7.03(t,J＝7.5Hz,1H),4.61(d,J＝7.2Hz,1H),3.69(dt,J＝12.7,5.4Hz,1H),3.47–3.40(m,1H),3.13–
3.00(m,2H),2.56(ddd,J＝16.8,9.4,7.3Hz,1H),2.07–2.00(m,1H),1.92–1.85(m,1H),1.80–1.60(m,5H),1.48–1.38(m,1H)。
实施例10、IRED-At-P120′G催化还原100mM的底物1g
Figure BDA0004070478890000114
在含有100mM底物1g(25.22g/L)和200mM葡萄糖(36.2g/L)的50mL的Tris-HCl缓冲液(100mM,pH7.5)中，加入实施例3中2.0g/L的IRED-At-P120′G湿菌体破碎液，60mg/LGDH湿菌体的破碎液及1.0mmol/L的NADP+。磁力搅拌下于30℃进行反应，反应过程中通过0.5mol/L的NaOH溶液使pH控制在7.5。反应结束后，加入等量乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥，过滤旋干。用高效液相分析测得：底物转化率为99％，ee值≥99％(
Figure BDA0004070478890000121
IC,环己烷/异丙醇/二乙胺为流动相)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.47(d,J＝7.8Hz,1H),7.39(d,J＝8.1Hz,1H),7.16(t,J＝7.6Hz,1H),7.06(t,J＝7.5Hz,1H),4.62–4.61(m,1H),3.73(ddd,J＝12.5,5.5,3.4Hz,1H),3.42(ddd,J＝12.2,9.8,5.5Hz,1H),3.16–2.99(m,2H),2.33–2.26(m,1H),1.92(d,J＝6.3Hz,2H),1.79(t,J＝15.3Hz,2H),1.53–
1.34(m,4H),1.30–1.17(m,2H)。
实施例11、IRED-At-P120′G催化还原5mM的底物1h
Figure BDA0004070478890000122
在含有5mM底物1h(1.23g/L)和10mM葡萄糖(1.81g/L)的50mL的Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 7.5)中，加入实施例3中1.5g/L的IRED-At-P120′G湿菌体破碎液，50mg/L GDH湿菌体的破碎液及1.0mmol/L的NADP+。磁力搅拌下于30℃进行反应，反应过程中通过0.5mol/L的NaOH溶液使pH控制在7.5。反应结束后，加入等量乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥，过滤旋干。用高效液相分析测得：底物转化率为99％，ee值≥99％(
Figure BDA0004070478890000123
OD-H,环己烷/异丙醇/二乙胺为流动相)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.68(s,1H),7.58–7.53(m,1H),7.37–7.33(m,3H),7.32–7.29(m,2H),7.21–7.18(m,1H),7.16–7.10(m,2H),5.15(t,J＝2.0Hz,1H),3.36(ddd,J＝12.6,5.3,3.8Hz,1H),3.13(ddd,J＝12.5,8.8,4.8Hz,1H),2.97–2.89(m,1H),2.86–2.79(m,1H),2.15(s,1H)。
实施例12、IRED-At-M118′L催化还原20mM的底物1i
Figure BDA0004070478890000124
在含有20mM底物1i(4.52g/L)和40mM葡萄糖(7.24g/L)的50mL的Tris-HCl缓冲液(100mM,pH
7.5)中，加入实施例3中1.0g/L的IRED-At-M118′L湿菌体破碎液，50mg/L GDH湿菌体的破碎液及1.0mmol/L的NADP+。磁力搅拌下于30℃进行反应，反应过程中通过0.5mol/L的NaOH溶液使pH控制在7.5。反应结束后，加入等量乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥，过滤旋干。用高效液相分析测得：底物转化率为99％，ee值≥99％(
Figure BDA0004070478890000131
IC,环己烷/异丙醇/二乙胺为流动相)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.95(s,1H),7.49(d,J＝7.6Hz,1H),7.30(d,J＝7.8Hz,1H),7.17–7.09(m,2H),4.14–4.10(m,1H),3.35(dt,J＝12.8,4.7Hz,1H),3.03(ddd,J＝13.0,7.7,5.7Hz,1H),2.81–2.70(m,2H),2.05–1.92(m,1H),1.70–1.57(m,2H),1.02(dd,J＝11.4,6.6Hz,6H)。
上述对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种野生亚胺还原酶IRED-At在催化合成(S)-四氢-β-咔啉类化合物中的应用，其特征在于，所述亚胺还原酶IRED-At的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.一种亚胺还原酶突变体，其特征在于，所述突变体是将其如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中第118位甲硫氨酸、第120位脯氨酸及第174位苯丙氨酸中的一个或多个氨基酸残基替换为其它氨基酸残基所形成的新氨基酸序列的衍生蛋白质。
3.根据权利要求2所述亚胺还原酶突变体，其特征在于，所述亚胺还原酶突变体具有如下序列中的一种：
(1)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第118位甲硫氨酸替换为亮氨酸；
(2)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第120位脯氨酸替换为甘氨酸；
(3)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第118位甲硫氨酸替换为亮氨酸，第120位脯氨酸替换为丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、缬氨酸、谷氨酸或精氨酸；
(4)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第118位甲硫氨酸替换为亮氨酸，第120位脯氨酸替换为丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、缬氨酸、谷氨酸或精氨酸，第174位苯丙氨酸替换为丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或亮氨酸。
4.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的亚胺还原酶IRED-At，以及如权利要求2或3中所述亚胺还原酶突变体之一种。
5.一种包含如权利要求4所述核酸的重组表达载体。
6.一种包含如权利要求5所述重组表达载体的重组表达转化体。
7.一种亚胺还原酶催化剂，其特征在于，是以下形式中的任意一种：
(1)培养如权利要求6所述重组表达转化体，分离含有如权利要求1-3中所述亚胺还原酶突变体；
(2)对含有如权利要求1-3所述亚胺还原酶的转化体细胞进行破碎，获得含有如权利要求1-3所述亚胺还原酶的细胞破碎液；
(3)将含有如权利要求1-3所述亚胺还原酶的细胞破碎液冷冻干燥而得到的冻干酶粉；
(4)将含有如权利要求1-3所述亚胺还原酶的转化体细胞冷冻干燥而得到的冻干细胞。
8.如权利要求1-3中任选一项所述亚胺还原酶或其突变体在催化二氢-β-咔啉类(DHβCs)化合物不对称还原生成S-(THβCs)中的应用。
9.如权利要求9所述的应用，其特征在于：以DHβCs化合物作为底物，辅酶NADPH存在下，使用亚胺还原酶突变体催化二氢-β-咔啉类(DHβCs)类衍生物不对称还原制备光学纯S构型产物，同时NADPH氧化生成NADP+；在不对称还原反应过程中，一方面亚胺还原酶IRED-At或其突变体催化还原DHβCs不对称合成S-(THβCs)；另一方面，葡萄糖脱氢酶(GDH)将葡萄糖氧化为葡萄糖内酯，同时消耗氧化型辅酶因子NADP+，再生还原型辅酶因子NADPH，还原型辅酶因子NADPH将提供氢给底物，自身又被氧化成氧化型辅酶因子NADP+，形成一个辅酶因子消耗与再生的闭合回路，推动主反应的进行。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述二氢-β-咔啉类(DHβCs)化合物为如下结构式之一种：
Figure FDA0004070478880000021
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