CN110628739A - 一种胺脱氢酶突变体及其在手性胺和氨基醇合成中的应用 - Google Patents

一种胺脱氢酶突变体及其在手性胺和氨基醇合成中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110628739A
CN110628739A CN201910747298.5A CN201910747298A CN110628739A CN 110628739 A CN110628739 A CN 110628739A CN 201910747298 A CN201910747298 A CN 201910747298A CN 110628739 A CN110628739 A CN 110628739A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amine
dehydrogenase mutant
chiral
amine dehydrogenase
mutant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910747298.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110628739B (zh
Inventor
郑高伟
柳磊
汪东浩
潘江
张志钧
许建和
钱小龙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou Baifu Enzyme Technology Co ltd
Original Assignee
Fuan Suzhou Hundred Zymotechnic Co Ltd
East China University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fuan Suzhou Hundred Zymotechnic Co Ltd, East China University of Science and Technology filed Critical Fuan Suzhou Hundred Zymotechnic Co Ltd
Priority to CN201910747298.5A priority Critical patent/CN110628739B/zh
Publication of CN110628739A publication Critical patent/CN110628739A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110628739B publication Critical patent/CN110628739B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
    • C12N9/0018—Phenylalanine dehydrogenase (1.4.1.20)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/001—Amines; Imines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y104/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12Y104/01—Oxidoreductases acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.4.1)
    • C12Y104/0102—Phenylalanine dehydrogenase (1.4.1.20)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种胺脱氢酶突变体及其在手性胺和氨基醇合成中的应用。具体而言，本发明公开了一种由嗜热地芽孢杆菌(Geobacillus kaustophilus)苯丙氨酸脱氢酶通过分子改造而成的苯丙胺脱氢酶突变体及其相应的氨基酸序列，以及所述苯丙胺脱氢酶突变体在不对称还原胺化潜手性羰基化合物合成手性胺及手性氨基醇中的用途。与其他手性胺及手性氨基醇的合成方法相比，本发明所使用的氨供体为廉价的氨水，所形成的副产物只有清洁的水，产物的光学纯度均>99％，因此代表了一条反应温和、立体选择性高、绿色环保的生物合成方法，在手性胺和手性氨基醇的实际生产中具有很好的应用前景。

Description

一种胺脱氢酶突变体及其在手性胺和氨基醇合成中的应用
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种嗜热地芽孢杆菌(Geobacilluskaustophilus)来源的苯丙氨酸脱氢酶通过分子改造获得的具有胺脱氢酶活性的突变 体、含有所述突变体基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及所述突变体或重 组表达转化体作为催化剂在潜手性酮和羟基酮不对称胺化还原制备手性胺和手性 氨基醇中的应用，特别是在(R)-1-(4-甲氧苯基)-2丙胺和L-苯丙氨醇生物合成方面的 应用。
背景技术
手性胺广泛存在于天然活性分子中，也是许多手性药品和精细化学品合成的重要前体。目前，市场上约40％的化学药物都含有一个或多个手性氨基结构砌块， 这类药物涉及抗炎、抗阿尔茨海默病、抗抑郁、抗艾滋病等，在医药领域占据着重 要地位。由于手性胺在药物合成中的重要性和巨大价值，其合成技术的开发已成为 新药研究领域的热点(Chem.Rev.,2003,103:2985-3012)。
手性胺制备的传统化学方法主要包括：外消旋体的动力学拆分和潜手性化合物的不对称合成。然而，这两种方法在实际应用中仍存在一些问题，动力学拆分方法 的理论得率仅为50％，而不对称还原胺化、C＝N双键不对称加成和不对称氢胺化 等方法普遍存在反应条件苛刻、需要使用过渡金属催化剂、操作过程繁琐和立体选 择性不足等问题。
相比于化学合成法，生物催化合成法具有反应条件温和、立体选择性高和环境 友好等优点，目前已经广泛应用于医药中间体和精细化学品等产品的工业化生产 中。目前，多种生物催化剂，包括水解酶、转氨酶、胺氧化酶、亚胺还原酶、还原 胺化酶、氨裂解酶和胺脱氢酶等已成功应用于手性胺的合成。
2012年美国佐治亚理工学院的Bommarius课题组通过蛋白质工程手段，对亮 氨酸脱氢酶进行分子改造获得具有胺脱氢酶活性的突变体(以下简称为胺脱氢酶，Angew.Chem.Int.Ed.,2012,51(16):3969-3972)，通过分子改造获得的胺脱氢酶可用 于催化制备手性胺，其优点在于：使用廉价的氨水作为胺供体，副产物是水，并且 产物的光学纯度都>99％，该文章报道以后引起了企业界和学术界的广泛关注。 Bommarius和Li使用分子改造获得的苯丙胺脱氢酶用来催化芳基酮的不对称还原 胺化(Adv.Synth.Catal.,2013,355(9):1780-1786；ACS Catal.,2015,5(2): 1119-1122)。Schell课题组通过双相(铵盐缓冲液/乙酸异戊酯)反应体系，解决了高 浓度底物对酶的抑制问题，实现了高浓度苯氧基丙酮到(R)-1-苯氧基-2-丙胺的高效 转化，底物浓度达到400mM，转化率为96％，产物的ee值高于99％(ACS Catal., 2017,7(5):3204-3209)。但是目前所开发的胺脱氢酶种数还非常有限，酶活性仍然 比较低，而且其在手性氨基醇合成中的应用未见报道。因此，有必要开发高活性、 高稳定性的胺脱氢酶，以满足手性胺和手性氨基醇化合物合成的技术需要和市场需 求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中胺脱氢酶活性较低的问题，提 供催化性能明显改善的胺脱氢酶突变体，以及所述胺脱氢酶突变体在手性胺和氨基 醇合成中的应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明的技术方案之一，提供催化性能显著提升的胺脱氢酶。
通过基因挖掘的方法从嗜热地芽孢杆菌(Geobacillus kaustophilus)中克隆获得 一个苯丙氨酸脱氢酶，命名为GkPheDH，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。所 述嗜热地芽孢杆菌来自德国微生物菌种保藏中心(DSMZ-German Collection of Microorganismsand Cell cultures GmbH)，保藏编号为DSM 7263。在所述苯丙氨酸 脱氢酶GkPheDH中引入定点突变，将78位的赖氨酸突变为丝氨酸，将276位的 天冬酰胺突变为亮氨酸，突变后的蛋白质具有苯丙胺脱氢酶的活性，其氨基酸序列 如SEQ ID No.3所示，将其命名为GkAmDHK78S/N276L。
在GkPheDH的基础上，进行了78位氨基酸和276位氨基酸的单点饱和定点 突变，进而对这两个位点的突变进行组合，通过筛选，最终选取4个对羟基酮底物 具有高活性的苯丙胺脱氢酶突变体。
所述对羟基酮底物具有高活性的胺脱氢酶突变体是具有如下氨基酸序列的蛋 白质：
(1)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第78位赖氨酸替换为丝氨酸，第276 位天冬酰胺替换为亮氨酸，命名为GkAmDHK78S/N276L；
(2)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第78位赖氨酸突变为丝氨 酸，第276位的天冬酰胺突变为半胱氨酸，命名为GkAmDHK78S/N276C。
(3)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第78位赖氨酸突变为丝氨 酸，第276位的天冬酰胺突变为苏氨酸，命名为GkAmDHK78S/N276T。
(4)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第78位赖氨酸突变为苏氨 酸，第276位的天冬酰胺突变为半胱氨酸，命名为GkAmDHK78T/N276C。
(5)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第78位赖氨酸突变为苏氨 酸，第276位的天冬酰胺突变为亮氨酸，命名为GkAmDHK78T/N276L。
本发明的技术方案之二，提供了一种核酸，编码如本发明技术方案一所述的胺 脱氢酶突变体。
本发明的技术方案之三，提供了一种重组表达载体，包含如本发明技术方案二 所述的核酸。
所述重组表达载体可通过本领域常规方法将编码本发明所述胺脱氢酶突变体 基因的核酸连接于各种合适载体上构建而成。所述载体可以是本领域的各种常规载 体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，只要所述重组表达载体可以在相 应的表达宿主中正常复制，并表达所述的胺脱氢酶突变体即可。所述胺脱氢酶突变 体基因可以操作性连接于载体中合适的调控序列的下游，以实现所述胺脱氢酶突变 体的组成型或诱导型表达。所述载体优选质粒，更优选质粒pET28a。
本发明的技术方案之四，提供了一种重组表达转化体，包含如本发明技术方案 三所述的重组表达载体。
可通过将已经构建好的重组表达载体转化至宿主细胞来制备重组表达转化体。所述宿主细胞为本领域的各种常规宿主细胞，只要所述的重组表达载体能够稳定地 自行复制并能通过诱导剂诱导后有效表达目标蛋白质即可。本发明首选大肠杆菌作 为宿主细胞，更优选大肠杆菌E.coli BL21(DE3)用于高效表达本发明所述的胺脱 氢酶突变体。
本发明的技术方案之五，提供一种重组胺脱氢酶突变体催化剂。
所述重组胺脱氢酶突变体催化剂是以下形式中的任意一种：
(1)培养本发明所述的重组表达转化体，分离含有所述胺脱氢酶突变体的转化 体细胞；
(2)培养本发明所述的重组表达转化体，分离含有所述胺脱氢酶突变体的转化 体细胞，对含有所述胺脱氢酶突变体的转化体细胞进行破碎，获得的细胞破碎液；
(3)培养本发明所述的重组表达转化体，分离含有所述胺脱氢酶突变体的转化 体细胞，对含有所述胺脱氢酶突变体的转化体细胞进行破碎，获得的细胞破碎液， 将所述胺脱氢酶突变体的细胞破碎液经冷冻干燥而得到的冻干酶粉。
其中所述重组表达转化体的培养为本领域常规的方法和培养条件，具体可以选用如下的步骤：对于重组大肠杆菌，优选培养基为TB培养基：蛋白胨12g/L，酵 母膏24g/L，KH2PO4 2.3g/L，K2HPO4 12.5g/L，pH 6.5-7.0。优选的培养方法为： 将如上所述构建的重组大肠杆菌，接种至含有卡那霉素的培养基中，于37℃、180 rpm振荡培养过夜。按1～2％(v/v)的接种量接种至装有100mL TB培养基(含卡那 霉素)的500mL三角烧瓶中，于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD600达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.1-0.5mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG) 作为诱导剂，16-25℃诱导16-24h后，将培养液离心，收集沉淀，然后用生理盐 水洗涤两次，获得重组表达转化体细胞。将收获的重组细胞进行冷冻干燥，即可获 得含有所述胺脱氢酶突变体的冻干细胞。将收获的重组细胞悬浮于5-10倍体积(v/w) 的缓冲液中，超声破碎后离心收集上清液，即可获得所述重组胺脱氢酶突变体的细 胞破碎液。收集的细胞破碎液于-80℃下预冷，然后通过真空冷冻干燥制备相应的 冻干酶粉，获得的冻干酶粉在4℃储存备用。
本发明所述胺脱氢酶突变体的活力测定方法如下：将含10mmol/L对氟苯丙 酮和0.1mmol/L辅酶NADH的1mL反应液(5M氨水/氯化铵缓冲液，pH 9.0)预热 至30℃，然后加入适量的胺脱氢酶突变体，通过分光光度计检测NADH在340nm 处的吸光度变化。1个酶活力单位(U)定义为上述条件下每分钟催化氧化1μmol NADH所需的酶量。
本发明的技术方案之六，提供如技术方案一所述胺脱氢酶突变体或如技术方案五所述重组胺脱氢酶突变体催化剂在催化潜手性羰基化合物和邻位羟基酮类化合 物不对称还原制备(R)-手性胺或手性氨基醇中的应用。
即提供了利用所述胺脱氢酶突变体或所述重组胺脱氢酶突变体催化剂催化不 对称还原潜手性酮类化合物，制备不同手性胺的方法，其制备途径可参照图1进行。
所述潜手性羰基化合物的结构如下1-12所示，所述邻位羟基酮类化合物的结 构如下13-16所示：
所述胺脱氢酶突变体催化剂可以催化上述潜手性羰基化合物和邻位羟基酮类 化合物不对称还原制备(R)-手性胺或手性氨基醇。
所述胺脱氢酶突变体或所述重组胺脱氢酶突变体催化剂催化潜手性羰基化合 物和邻位羟基酮类化合物不对称还原反应的氨基供体为氨水。
所述胺脱氢酶突变体或所述重组胺脱氢酶突变体催化剂催化潜手性羰基化合 物和邻位羟基酮类化合物不对称还原反应需要辅酶NADH的参与，反应过程中辅 酶NADH被氧化为NAD+。
进一步地，可以通过与葡萄糖脱氢酶催化的葡萄糖氧化反应进行反应耦联，以 葡萄糖作为辅底物，实现辅酶NADH的原位再生；
或者，可以通过与甲酸脱氢酶催化的甲酸氧化反应进行反应耦联，以甲酸作为 辅底物，实现辅酶NADH的原位再生。
在所述应用中，潜手性羰基化合物的浓度可为10～500mmol/L，所述的胺脱氢 酶的用量可选用为0.5～50U/mmol潜手性羰基化合物。反应液中NADH或NAD+的用量为0.1～0.5mmol/L。反应过程中可利用葡萄糖或甲酸盐作为辅底物，通过葡 萄糖脱氢酶或甲酸脱氢酶催化的葡萄糖或甲酸根离子的氧化反应实现反应体系中 NADH的辅酶循环再生，所述葡萄糖脱氢酶或甲酸脱氢酶的用量可为1～200 U/mmol潜手性羰基化合物，所述葡萄糖或甲酸盐的摩尔量可为潜手性羰基化合物 的1～50倍。不对称还原过程中所需的氨水/甲酸铵缓冲液(但不限于氨水/甲酸铵 缓冲液)为本领域常规缓冲液，其浓度较佳为5mol/L。所述的不对称还原反应是 在振荡或搅拌条件下进行。所述的不对称还原反应的温度为20～40℃。所述的反应 时间以底物完全转化或反应自行终止的时间为准，优选反应时间小于24h。
还原反应结束后，采用常规方法对反应液中的还原产物胺进行分离提取。采用 水不溶性有机溶剂二氯甲烷进行萃取，优选有机溶剂为二氯甲烷，对萃取液进行浓 缩去除溶剂，获得目标产品。
与现有技术相比，本发明的创新和改进效果在于：
本发明提供了一种催化性能更好的胺脱氢酶突变体，能够高效催化芳香酮和 脂肪酮的不对称还原，制备光学纯的手性胺和手性氨基醇类化合物如：(R)-对氟苯 丙胺、(R)-对甲氧基苯丙胺、(R)-苄基丙胺，L-苯丙氨醇等。所述的胺类化合物可 作为许多药物的合成中间体，在市场上具有广泛的应用价值。所述的胺脱氢酶能够 催化浓度高达200mM的对甲氧基苯丙酮底物转化，转化率和产物(R)-对甲氧基苯 丙胺的光学纯度均高于99％，时空产率达到130.9g L-1d-1。另外，本发明首次利用 胺脱氢酶实现了手性氨基醇的合成，为手性氨基醇的合成提供了一种新方法。综上 所述，本发明所述的胺脱氢酶突变体具有活性高，耐受高浓度底物，产物光学纯度 高，时空产率高等优势，具有很好的工业应用前景。
附图说明
图1：胺脱氢酶催化潜手性羰基化合物转化制备手性氨基化合物示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
如非另有说明，下列实施例中的具体实验过程按照本领域常规方法和条件 进行，或遵照商品说明书。
本发明实施例中的材料来源如下：
嗜热地芽孢杆菌(Geobacillus kaustophilus)，来自德国微生物菌种保藏中心(DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell cultures GmbH)，保藏编号为DSM 7263；
E.coli BL21(DE3)感受态细胞、2×Taq PCR MasterMix、琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒购于北京天根生化科技有限公司；限制性内切酶BamH I和Hind III 购于Takara公司。
实施例1苯丙氨酸脱氢酶GkPheDH的基因克隆
根据苯丙氨酸脱氢酶GkPheDH的开放阅读框，设计上、下游引物：
上游引物如SEQ ID No.4所示，包含限制性内切酶BamH I的酶切位点；
下游引物如SEQ ID No.5所示，包含限制性内切酶Hind III的酶切位点。
以嗜热地芽孢杆菌(Geobacillus kaustophilus)的基因组DNA为模板，进行 PCR扩增。PCR体系为：2×Taq PCR MasterMix 25μl，上游引物和下游引物(10 ng/μl)各1.5μl，基因组DNA(100ng/μl)1μl和ddH2O 21μl。PCR扩增程序为： 95℃预变性5min，然后进行32次如下循环：94℃变性30s，50℃退火30s， 72℃延伸60s；最后72℃再延伸10min。PCR扩增产物进行凝胶电泳纯化后， 用DNA回收试剂盒回收目的片段。经过DNA测序，该序列中编码的开放阅读 框全长1143bp，其碱基序列如SEQ ID No.1所示。
实施例2苯丙氨酸脱氢酶重组表达质粒和重组表达转化体的制备
将实施例1中PCR扩增所得的苯丙氨酸脱氢酶目的基因片段以及pET 28a 质粒同时用限制性内切酶BamH I和Hind III进行双酶酶切过夜，然后经琼脂糖 凝胶电泳纯化和DNA试剂盒回收。将回收的目的基因和质粒的酶切片段质粒 在T4DNA连接酶的作用下，于16℃下连接24h，得到苯丙氨酸脱氢酶的重 组表达质粒pET28a-GkpheDH，然后将该重组表达质粒转化至E.coli BL21(DE3) 进行培养，挑取阳性克隆，即获得重组表达转化体E.coliBL21 (DE3)/pET28a-GkpheDH。
实施例3胺脱氢酶突变体GkAmDHK78S/N276L的创制和重组蛋白的表达
以实施例2所构建的重组表达质粒pET28a-GkpheDH作为DNA模板，使 用78位氨基酸突变引物，通过全质粒PCR，将氨基酸序列的第78位赖氨酸突 变为丝氨酸。获得的PCR产物通过限制性内切酶Dpn I降解去除DNA模板，纯 化后作为276位氨基酸突变的模板，使用276位氨基酸突变的引物，通过全质 粒PCR，将氨基酸序列的第276位天冬酰胺突变为亮氨酸，再通过Dpn I酶降解 去除DNA模板，将突变质粒转化至E.coli BL21(DE3)，即可获得第78位赖氨 酸突变为丝氨酸，第276位天冬酰胺突变为亮氨酸的胺脱氢酶，命名为GkAmDHK78S/N276L。
78位氨基酸突变上游引物：AAGGGATGACGTATAGCTGCTTGGCCGCTGA， 如SEQ ID No.6所示；
78位氨基酸突变下游引物：TCAGCGGCCAAGCAGCTATACGTCATCCCTT， 如SEQ ID No.7所示；
276位氨基酸突变上游引物： TCGTCGGTTCGGCGCTGAATCAGCTGGCTGA，如SEQ IDNo.8所示；
276位氨基酸突变上游引物： TCAGCCAGCTGATTCAGCGCCGAACCGACGA，如SEQ IDNo.9所示；
将GkAmDHK78S/N276L的重组表达质粒转化至E.coli BL21(DE3)，然后接种 至含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L) 中，于37℃摇床中振荡培养12h后，以1％(v/v)的接种量接种至装有100mL TB培养基的500mL三角瓶中，放入37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液 的OD600达到0.8左右时，加入IPTG至终浓度0.2mmol/L进行诱导，16℃下 继续培养24h，离心收集细胞，并用生理盐水洗涤，得到静息细胞。将收集的 细胞重新悬浮于10mL的Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 8.0)中，冰水浴中进行 超声破碎，离心收集上清液，冷冻干燥制备冻干细胞粗提物。
实施例4-7催化羟基酮底物的胺脱氢酶GkAmDH突变体活力筛选
根据实施例3中的PCR过程，以质粒pET28a-GkpheDH作为DNA模板，对 第78位赖氨酸和第276位的天冬酰胺；使用NDT兼并引物，构建双点组合的饱 和突变库。构建的克隆子转化至E.coli BL21(DE3)，在96孔板中进行诱导表达。 表达后的蛋白，分别针对实施例4-7中的四个羟基酮底物进行活力测定。具体活 力测定如下：在氨水/甲酸铵缓冲液中(2M,pH9.0)中，反应体系包括0.2mM NADH和10mM底物，在40℃下，测定单位时间内340nm处吸光度的变化 值，计算酶活力。经过活力比较、筛选，针对每一个化合物都获得了一个最优 的胺脱氢酶GkAmDH的突变体，其针对相应底物的活力如表1所示。
针对实施例4的底物，最优突变体为如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序 列的第78位赖氨酸突变为丝氨酸，第276位的天冬酰胺突变为半胱氨酸所得到的 蛋白质，命名为GkAmDHK78S/N276C。
针对实施例5中底物，最优突变体为如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序 列的第78位赖氨酸突变为丝氨酸，第276位的天冬酰胺突变为苏氨酸所得到的蛋 白质，命名为GkAmDHK78S/N276T。
针对实施例6中底物，最优突变体为如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序 列的第78位赖氨酸突变为苏氨酸，第276位的天冬酰胺突变为半胱氨酸所得到的 蛋白质，命名为GkAmDHK78T/N276L。
针对实施例7中底物，最优突变体为如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序 列的第78位赖氨酸突变为苏氨酸，第276位的天冬酰胺突变为亮氨酸所得到的蛋 白质，命名为GkAmDHK78T/N276C。
表1.针对不同羟基酮底物的GkAmDH最优突变体
实施例8-19胺脱氢酶GkAmDHK78S/N276L催化的不对称氨化反应
图1示出了胺脱氢酶催化潜手性羰基化合物转化制备手性氨基化合物示意图。
在500μL的氨水/氯化铵缓冲液(5M,pH 9.0)中，加入0.18U-3.7U胺脱氢 酶GkAmDHK78S/N276L冻干粗提物，1U的甲酸脱氢酶FDH的冻干粗提物，5umol 的底物，1mM NAD+，于40℃，1000rpm下振摇反应24h。反应结束后用等 体积的二氯甲烷萃取，萃取液加入无水硫酸钠干燥8h，250μL萃取液用于气 相色谱分析底物转化率。另外250μL萃取液加入50μL乙酸酐和10μL吡啶， 然后在室温下反应2h，生理盐水洗涤干燥后，通过气相色谱分析产物光学纯 度(ee值)。
表2.GkAmDHK78S/N276L催化还原胺化反应的结果
实施例20 GkAmDHK78S/N276L催化合成(R)-1-(4-甲氧苯基)-2丙胺
将包含92mL氨水/甲酸铵缓冲液(5M,pH 9.0)，2g胺脱氢酶 GkAmDHK78S/N276L冻干粗提物(40U)，100mg FDH冻干细胞粗提物(74U)，100 μmol NAD+，3.3g 4-甲氧基苯丙酮和5mL二甲亚砜的反应物，于40℃下，200rpm 搅拌反应。6h后底物转化率达到99％，结束反应。反应液加入10M氢氧化 钠将pH调节至12，然后使用等体积二氯甲烷萃取三次，合并萃取液，加入无 水硫酸钠干燥过夜，减压蒸馏去除溶剂，得到1.30g产品(R)-1-(4-甲氧苯基)-2 丙胺，产品收率41％，产物的ee值高于99％，时空得率为130.9g L-1d-1。
实施例21 GkAmDHK78S/N276C催化合成(S)-2-氨基-1-苯基丙烷-1-醇
将1g胺脱氢酶GkAmDHK78S/N276C冻干粗提物(80U)，100mg FDH冻干细 胞粗提物(74U)，100μmol NAD+，5.25g 1-羟基-1-苯丙酮和5mL二甲亚砜加入到 95mL氨水/甲酸铵缓冲液(5M,pH 9.0)中，于40℃下，200rpm搅拌反应24h。 反应液加入10M氢氧化钠将pH调节至12，然后使用等体积二氯甲烷萃取三 次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜，减压蒸馏去除溶剂，得到2.15g 产品(S)-2-氨基-1-苯基丙烷-1-醇，产品收率41％，产物的ee值高于99％。
实施例22 GkAmDHK78S/N276T催化合成(S)-2-氨基-3-苯基丙烷-1-醇
将2g胺脱氢酶GkAmDHK78S/N276T冻干粗提物(90U)，100mg FDH冻干细 胞粗提物(74U)，100μmol NAD+，5.25g 1-羟基-3-苯基丙酮和5mL二甲亚砜加入 到95mL氨水/甲酸铵缓冲液(5M,pH 9.0)中，于40℃下，200rpm搅拌反应24 h。反应液加入10M氢氧化钠将pH调节至12，然后使用等体积二氯甲烷萃取 三次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜，减压蒸馏去除溶剂，得到2.36 g产品(S)-2-氨基-3-苯基丙烷-1-醇，产品收率45％，产物的ee值高于99％。
实施例23 GkAmDHK78T/N276L催化合成(S)-2-氨基-1-丁醇
将5g胺脱氢酶GkAmDHK78T/N276L冻干粗提物(85U)，100mg FDH冻干细 胞粗提物(74U)，100μmol NAD+，1.60g 1-羟基-2-丁酮和5mL二甲亚砜加入到 95mL氨水/甲酸铵缓冲液(5M,pH 9.0)中，于40℃下，200rpm搅拌反应24h。 反应液加入10M氢氧化钠将pH调节至12，然后使用等体积二氯甲烷萃取三 次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜，减压蒸馏去除溶剂，得到0.62g 产品(S)-2-氨基-1-丁醇，产品收率39％，产物的ee值高于99％。
实施例24 GkAmDHK78T/N276C催化合成(S)-2-氨基-2-丁醇
将10g胺脱氢酶GkAmDHK78T/N276C冻干粗提物(50U)，100mg FDH冻干细 胞粗提物(74U)，100μmol NAD+，1.60g 3-羟基-2-丁酮和5mL二甲亚砜加入到 95mL氨水/甲酸铵缓冲液(5M,pH 9.0)中，于40℃下，200rpm搅拌反应24h。 反应液加入10M氢氧化钠将pH调节至12，然后使用等体积二氯甲烷萃取三 次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜，减压蒸馏去除溶剂，得到0.77g 产品(S)-2-氨基-2-丁醇，产品收率48％，产物的ee值高于99％。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此 说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限 于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改 进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华东理工大学、苏州百福安酶技术有限公司
<120> 一种胺脱氢酶突变体及其在手性胺和氨基醇合成中的应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1143
<212> DNA
<213> 好热地芽孢杆菌(Geobacillus kaustophilus)
<400> 1
atgaatgtca tgctatcgcc aaacatgtca caaagattgg atttgttttt ccaaatgcgt 60
gaacatgaac aggtggtgtt ttgtctcgat gaagcgaccg gcctaagggc gatcatcgcc 120
attcatagca cggctcttgg gccggcgctc ggcggctgtc ggatgcatcc gtatgccacg 180
acggaagagg cgctcgccga tgcgcttcgg ctgtcgaaag ggatgacgta taaatgcttg 240
gctgccgatg tcgattttgg cggcggcaag gcggtgatca tcggcgatcc gcgcaaagac 300
aaatcgccgg aattgtttcg cgctttcggc cagttcgtgg agtcattagg cggccggttt 360
tacacgggca cggatatggg gacgacgccg gacgattttg tgcacgcgct gaaagagacg 420
aattgcatcg tcggcgttcc ggaagcgtat ggcggaagcg gcgactcatc cgtgccgacc 480
gccgagggcg ttgtttacgg cattcaggcg acgaacgatg ttgtgtttgg cagcaagcat 540
ttgcatggca aaacgtatgc ggtgcaaggg ctcggaaaag tcggaaaaaa agtggcgctt 600
cgtttgcttg aagaaggggc ggatctgtat gtgtgcgatt tgaacgaagc ggcagtcaaa 660
gaggtcgtgg cgtacggcaa gcaaatcggg gcgtccgtca agccggtgaa cggaacggat 720
atttatcgcg tcgaagccga tgtgttcgtc ccgtgcgcat ttggcggcgt catcaacgat 780
gaaacgatcg ccgagctgcg agtgaaagcg gtcgtcggtt cggcgaacaa tcagctggct 840
gacaaacgcc acgcccgtat gttgaaagaa aagggcatca tgtatgcccc cgattatatc 900
gtcaacgccg gcggcctcat tcaagtggcc gatgaactgt acggagcgaa caaagagcgg 960
gtgctggcga aaacgaaagc gatttatgat acgctgctcg ccatttatgc gcgggctgaa 1020
tcggaaggaa taacgacgat cgaggcagcc gatcaatttt gcgaagagcg gatcgagaaa 1080
cgcaaacgcc gcaatcattt tttcacgcac caaaagcggc cgaagtggga tattcgacgt 1140
taa 1143
<210> 2
<211> 380
<212> PRT
<213> 好热地芽孢杆菌(Geobacillus kaustophilus)
<400> 2
Met Asn Val Met Leu Ser Pro Asn Met Ser Gln Arg Leu Asp Leu Phe
1 5 10 15
Phe Gln Met Arg Glu His Glu Gln Val Val Phe Cys Leu Asp Glu Ala
20 25 30
Thr Gly Leu Arg Ala Ile Ile Ala Ile His Ser Thr Ala Leu Gly Pro
35 40 45
Ala Leu Gly Gly Cys Arg Met His Pro Tyr Ala Thr Thr Glu Glu Ala
50 55 60
Leu Ala Asp Ala Leu Arg Leu Ser Lys Gly Met Thr Tyr Lys Cys Leu
65 70 75 80
Ala Ala Asp Val Asp Phe Gly Gly Gly Lys Ala Val Ile Ile Gly Asp
85 90 95
Pro Arg Lys Asp Lys Ser Pro Glu Leu Phe Arg Ala Phe Gly Gln Phe
100 105 110
Val Glu Ser Leu Gly Gly Arg Phe Tyr Thr Gly Thr Asp Met Gly Thr
115 120 125
Thr Pro Asp Asp Phe Val His Ala Leu Lys Glu Thr Asn Cys Ile Val
130 135 140
Gly Val Pro Glu Ala Tyr Gly Gly Ser Gly Asp Ser Ser Val Pro Thr
145 150 155 160
Ala Glu Gly Val Val Tyr Gly Ile Gln Ala Thr Asn Asp Val Val Phe
165 170 175
Gly Ser Lys His Leu His Gly Lys Thr Tyr Ala Val Gln Gly Leu Gly
180 185 190
Lys Val Gly Lys Lys Val Ala Leu Arg Leu Leu Glu Glu Gly Ala Asp
195 200 205
Leu Tyr Val Cys Asp Leu Asn Glu Ala Ala Val Lys Glu Val Val Ala
210 215 220
Tyr Gly Lys Gln Ile Gly Ala Ser Val Lys Pro Val Asn Gly Thr Asp
225 230 235 240
Ile Tyr Arg Val Glu Ala Asp Val Phe Val Pro Cys Ala Phe Gly Gly
245 250 255
Val Ile Asn Asp Glu Thr Ile Ala Glu Leu Arg Val Lys Ala Val Val
260 265 270
Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Ala Asp Lys Arg His Ala Arg Met Leu
275 280 285
Lys Glu Lys Gly Ile Met Tyr Ala Pro Asp Tyr Ile Val Asn Ala Gly
290 295 300
Gly Leu Ile Gln Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Ala Asn Lys Glu Arg
305 310 315 320
Val Leu Ala Lys Thr Lys Ala Ile Tyr Asp Thr Leu Leu Ala Ile Tyr
325 330 335
Ala Arg Ala Glu Ser Glu Gly Ile Thr Thr Ile Glu Ala Ala Asp Gln
340 345 350
Phe Cys Glu Glu Arg Ile Glu Lys Arg Lys Arg Arg Asn His Phe Phe
355 360 365
Thr His Gln Lys Arg Pro Lys Trp Asp Ile Arg Arg
370 375 380
<210> 3
<211> 380
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
Met Asn Val Met Leu Ser Pro Asn Met Ser Gln Arg Leu Asp Leu Phe
1 5 10 15
Phe Gln Met Arg Glu His Glu Gln Val Val Phe Cys Leu Asp Glu Ala
20 25 30
Thr Gly Leu Arg Ala Ile Ile Ala Ile His Ser Thr Ala Leu Gly Pro
35 40 45
Ala Leu Gly Gly Cys Arg Met His Pro Tyr Ala Thr Thr Glu Glu Ala
50 55 60
Leu Ala Asp Ala Leu Arg Leu Ser Lys Gly Met Thr Tyr Ser Cys Leu
65 70 75 80
Ala Ala Asp Val Asp Phe Gly Gly Gly Lys Ala Val Ile Ile Gly Asp
85 90 95
Pro Arg Lys Asp Lys Ser Pro Glu Leu Phe Arg Ala Phe Gly Gln Phe
100 105 110
Val Glu Ser Leu Gly Gly Arg Phe Tyr Thr Gly Thr Asp Met Gly Thr
115 120 125
Thr Pro Asp Asp Phe Val His Ala Leu Lys Glu Thr Asn Cys Ile Val
130 135 140
Gly Val Pro Glu Ala Tyr Gly Gly Ser Gly Asp Ser Ser Val Pro Thr
145 150 155 160
Ala Glu Gly Val Val Tyr Gly Ile Gln Ala Thr Asn Asp Val Val Phe
165 170 175
Gly Ser Lys His Leu His Gly Lys Thr Tyr Ala Val Gln Gly Leu Gly
180 185 190
Lys Val Gly Lys Lys Val Ala Leu Arg Leu Leu Glu Glu Gly Ala Asp
195 200 205
Leu Tyr Val Cys Asp Leu Asn Glu Ala Ala Val Lys Glu Val Val Ala
210 215 220
Tyr Gly Lys Gln Ile Gly Ala Ser Val Lys Pro Val Asn Gly Thr Asp
225 230 235 240
Ile Tyr Arg Val Glu Ala Asp Val Phe Val Pro Cys Ala Phe Gly Gly
245 250 255
Val Ile Asn Asp Glu Thr Ile Ala Glu Leu Arg Val Lys Ala Val Val
260 265 270
Gly Ser Ala Leu Asn Gln Leu Ala Asp Lys Arg His Ala Arg Met Leu
275 280 285
Lys Glu Lys Gly Ile Met Tyr Ala Pro Asp Tyr Ile Val Asn Ala Gly
290 295 300
Gly Leu Ile Gln Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Ala Asn Lys Glu Arg
305 310 315 320
Val Leu Ala Lys Thr Lys Ala Ile Tyr Asp Thr Leu Leu Ala Ile Tyr
325 330 335
Ala Arg Ala Glu Ser Glu Gly Ile Thr Thr Ile Glu Ala Ala Asp Gln
340 345 350
Phe Cys Glu Glu Arg Ile Glu Lys Arg Lys Arg Arg Asn His Phe Phe
355 360 365
Thr His Gln Lys Arg Pro Lys Trp Asp Ile Arg Arg
370 375 380
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
cgggatccat gaatgtcatg ctatcgccaa aca 33
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
cccaagcttt taacgtcgaa tatcccactt cggc 34
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
aagggatgac gtatagctgc ttggccgctg a 31
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
tcagcggcca agcagctata cgtcatccct t 31
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
tcgtcggttc ggcgctgaat cagctggctg a 31
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
tcagccagct gattcagcgc cgaaccgacg a 31

Claims (10)

1.一种胺脱氢酶突变体，其特征在于，其是由下述任一氨基酸序列组成的蛋白质：
(1)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第78位赖氨酸替换为丝氨酸，第276位天冬酰胺替换为亮氨酸；
(2)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第78位赖氨酸替换为丝氨酸，第276位的天冬酰胺替换为半胱氨酸；
(3)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第78位赖氨酸替换为丝氨酸，第276位的天冬酰胺替换为苏氨酸；
(4)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第78位赖氨酸替换为苏氨酸，第276位的天冬酰胺替换为半胱氨酸；
(5)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第78位赖氨酸替换为苏氨酸，第276位的天冬酰胺替换为亮氨酸。
2.一种核酸，其特征在于，编码如权利要求1所述的胺脱氢酶突变体。
3.一种重组表达载体，其特征在于，包含如权利要求2所述的核酸。
4.一种重组表达转化体，其特征在于，包含如权利要求3所述的重组表达载体。
5.一种重组胺脱氢酶突变体催化剂，其特征在于，是以下形式中的任意一种：
(1)培养所述的重组表达转化体，分离含有所述胺脱氢酶突变体的转化体细胞；
(2)培养所述的重组表达转化体，分离含有所述胺脱氢酶突变体的转化体细胞，对含有所述胺脱氢酶突变体的转化体细胞进行破碎，获得的细胞破碎液；
(3)培养所述的重组表达转化体，分离含有所述胺脱氢酶突变体的转化体细胞，对含有所述胺脱氢酶突变体的转化体细胞进行破碎，获得的细胞破碎液，将所述胺脱氢酶突变体的细胞破碎液经冷冻干燥而得到的冻干酶粉。
6.一种如权利要求1所述胺脱氢酶突变体或如权利要求5所述重组胺脱氢酶突变体催化剂在催化潜手性羰基化合物和邻位羟基酮类化合物不对称还原制备(R)-手性胺或手性氨基醇中的应用。
7.如权利要求6所述应用，其特征在于，所述潜手性羰基化合物的结构如下1-12所示，所述邻位羟基酮类化合物的结构如下13-16所示：
8.如权利要求6所述应用，其特征在于，所述胺脱氢酶突变体或所述重组胺脱氢酶突变体催化剂催化潜手性羰基化合物和邻位羟基酮类化合物不对称还原反应的氨基供体为氨水。
9.如权利要求6所述应用，其特征在于，所述胺脱氢酶突变体或所述重组胺脱氢酶突变体催化剂催化潜手性羰基化合物和邻位羟基酮类化合物不对称还原反应需要辅酶NADH的参与，反应过程中辅酶NADH被氧化为NAD+。
10.如权利要求9所述应用，其特征在于，通过与葡萄糖脱氢酶催化的葡萄糖氧化反应进行反应耦联，以葡萄糖作为辅底物，实现辅酶NADH的原位再生；
或者，通过与甲酸脱氢酶催化的甲酸氧化反应进行反应耦联，以甲酸作为辅底物，实现辅酶NADH的原位再生。
CN201910747298.5A 2019-08-14 2019-08-14 一种胺脱氢酶突变体及其在手性胺和氨基醇合成中的应用 Active CN110628739B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910747298.5A CN110628739B (zh) 2019-08-14 2019-08-14 一种胺脱氢酶突变体及其在手性胺和氨基醇合成中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910747298.5A CN110628739B (zh) 2019-08-14 2019-08-14 一种胺脱氢酶突变体及其在手性胺和氨基醇合成中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110628739A true CN110628739A (zh) 2019-12-31
CN110628739B CN110628739B (zh) 2021-04-09

Family

ID=68970340

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910747298.5A Active CN110628739B (zh) 2019-08-14 2019-08-14 一种胺脱氢酶突变体及其在手性胺和氨基醇合成中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110628739B (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112852894A (zh) * 2020-06-04 2021-05-28 中国科学院天津工业生物技术研究所 胺脱氢酶突变体及其在手性胺醇化合物合成中的应用
CN112852771A (zh) * 2020-04-17 2021-05-28 中国科学院天津工业生物技术研究所 酶催化合成手性氨基醇化合物
CN113846069A (zh) * 2021-10-28 2021-12-28 华东理工大学 一种苯丙胺脱氢酶突变体及在手性胺合成中的应用
CN114438049A (zh) * 2022-03-07 2022-05-06 河北工业大学 胺脱氢酶及其编码核酸与应用
CN114686451A (zh) * 2022-02-28 2022-07-01 华东理工大学 胺脱氢酶突变体及其在制备(s)-5-甲基-2-吡咯烷酮中的应用
CN114934082A (zh) * 2022-04-29 2022-08-23 华东理工大学 一种连续流生物催化合成(s)-5-甲基-2-吡咯烷酮的方法
CN115975968A (zh) * 2022-10-14 2023-04-18 中国科学院天津工业生物技术研究所 胺脱氢酶突变体及其在手性胺合成中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103555683A (zh) * 2013-11-19 2014-02-05 南京博优康远生物医药科技有限公司 一种沙格列汀手性中间体的合成方法
CN106574281A (zh) * 2014-07-03 2017-04-19 巴斯夫欧洲公司 醇类的氧化还原自足性生物催化胺化
CN107267474A (zh) * 2017-08-02 2017-10-20 中国农业大学 一种二氢硫辛酰胺脱氢酶突变体蛋白及其制备方法和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103555683A (zh) * 2013-11-19 2014-02-05 南京博优康远生物医药科技有限公司 一种沙格列汀手性中间体的合成方法
CN106574281A (zh) * 2014-07-03 2017-04-19 巴斯夫欧洲公司 醇类的氧化还原自足性生物催化胺化
CN107267474A (zh) * 2017-08-02 2017-10-20 中国农业大学 一种二氢硫辛酰胺脱氢酶突变体蛋白及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FEI-FEI CHEN等: "Reshaping the Active Pocket of Amine Dehydrogenases for Asymmetric Synthesis of Bulky Aliphatic Amines", 《ACS CATAL.》 *
LEI LIU等: "Development of an engineered thermostable amine dehydrogenase for the synthesis of structurally diverse chiral amines", 《CATAL. SCI. TECHNOL.》 *
MAHIMA SHARMA等: "NAD(P)H-Dependent Dehydrogenases for the Asymmetric Reductive Amination of Ketones: Structure,Mechanism,Evolution and Application", 《ADV. SYNTH. CATAL. 》 *
NCBI: "GenBank登录号：CP038860.1", 《NCBI GENBANK》 *
NCBI: "GenBank登录号：QCK83188.1", 《NCBI GENBANK》 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114381441B (zh) * 2020-04-17 2023-09-08 中国科学院天津工业生物技术研究所 酶催化合成手性氨基醇化合物
CN112852771A (zh) * 2020-04-17 2021-05-28 中国科学院天津工业生物技术研究所 酶催化合成手性氨基醇化合物
CN114381441A (zh) * 2020-04-17 2022-04-22 中国科学院天津工业生物技术研究所 酶催化合成手性氨基醇化合物
CN112852894B (zh) * 2020-06-04 2021-11-09 中国科学院天津工业生物技术研究所 胺脱氢酶突变体及其在手性胺醇化合物合成中的应用
CN112852894A (zh) * 2020-06-04 2021-05-28 中国科学院天津工业生物技术研究所 胺脱氢酶突变体及其在手性胺醇化合物合成中的应用
CN113846069A (zh) * 2021-10-28 2021-12-28 华东理工大学 一种苯丙胺脱氢酶突变体及在手性胺合成中的应用
CN114686451A (zh) * 2022-02-28 2022-07-01 华东理工大学 胺脱氢酶突变体及其在制备(s)-5-甲基-2-吡咯烷酮中的应用
CN114686451B (zh) * 2022-02-28 2024-03-08 华东理工大学 胺脱氢酶突变体及其在制备(s)-5-甲基-2-吡咯烷酮中的应用
CN114438049A (zh) * 2022-03-07 2022-05-06 河北工业大学 胺脱氢酶及其编码核酸与应用
CN114438049B (zh) * 2022-03-07 2023-09-15 河北工业大学 胺脱氢酶及其编码核酸与应用
CN114934082A (zh) * 2022-04-29 2022-08-23 华东理工大学 一种连续流生物催化合成(s)-5-甲基-2-吡咯烷酮的方法
CN114934082B (zh) * 2022-04-29 2024-03-26 华东理工大学 一种连续流生物催化合成(s)-5-甲基-2-吡咯烷酮的方法
CN115975968A (zh) * 2022-10-14 2023-04-18 中国科学院天津工业生物技术研究所 胺脱氢酶突变体及其在手性胺合成中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN110628739B (zh) 2021-04-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110628739B (zh) 一种胺脱氢酶突变体及其在手性胺和氨基醇合成中的应用
CN111051503B (zh) 醇脱氢酶突变体及其在双芳基手性醇合成中的应用
CN113846069B (zh) 一种苯丙胺脱氢酶突变体及在手性胺合成中的应用
CN111094557B (zh) 醇脱氢酶突变体及其在双芳基手性醇合成中的应用
CN108546690B (zh) 一种短链脱氢酶及其突变体与基因的制备及应用
CN113621600B (zh) 一种高活性腈水合酶突变体及其应用
CN109468291B (zh) 一种羰基还原酶EbSDR8突变体及其构建方法和应用
CN112359036B (zh) 一种催化活力和反应专一性提高的腈水解酶突变体及应用
CN111073912A (zh) (s)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的生物制备方法
WO2016138641A1 (zh) 假丝酵母及其羰基还原酶的产生及应用
CN111778229B (zh) 环己烯甲酸酯水解酶及其突变体、编码基因、表达载体、重组菌与应用
CN109777788B (zh) 一种亮氨酸脱氢酶突变体及其应用
CN108410831B (zh) 酮酸还原酶、基因、工程菌及在合成手性芳香2-羟酸中的应用
CN110055230B (zh) 单加氧酶突变体及其应用
CN113322291A (zh) 一种手性氨基醇类化合物的合成方法
CN116287050A (zh) 亚胺还原酶、突变体及其在四氢-β-咔啉类衍生物合成中的应用
CN114507650B (zh) 亮氨酸脱氢酶突变体及其在合成(s)-邻氯苯甘氨酸中的应用
CN115838697A (zh) 亚胺还原酶突变体及其在拉罗替尼手性中间体合成中的应用
CN115433721A (zh) 一种羰基还原酶突变体及其应用
CN101903528A (zh) 使用烯醇还原酶酶促还原α-和β-脱氢氨基酸的方法
CN110129382B (zh) 一种羰基还原酶催化合成手性邻位卤代-α-苯乙醇的方法
CN113215120A (zh) 重组大肠杆菌转化生产反式-4-羟基-l-脯氨酸的方法
CN109182286B (zh) 一种改进的氰基还原酶及其在合成3-氯吡嗪-2甲胺中的应用
CN113583992B (zh) 一种还原胺化酶及其在仲胺合成中的应用
CN114196659B (zh) 酰胺酶突变体、编码基因、工程菌及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20240424

Address after: Room 207, No. 8, Sihai Road Research Institute Road, Changshu Economic and Technological Development Zone, Suzhou City, Jiangsu Province

Patentee after: SUZHOU BAIFU ENZYME TECHNOLOGY CO.,LTD.

Country or region after: China

Address before: 200237 No. 130, Meilong Road, Shanghai, Xuhui District

Patentee before: EAST CHINA University OF SCIENCE AND TECHNOLOGY

Country or region before: China

Patentee before: SUZHOU BAIFU ENZYME TECHNOLOGY CO.,LTD.

TR01 Transfer of patent right