CN114438049B - 胺脱氢酶及其编码核酸与应用 - Google Patents

胺脱氢酶及其编码核酸与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种胺脱氢酶及其编码核酸与应用，本发明的胺脱氢酶为对如SEQ ID NO.2的氨基酸脱氢酶进行突变而获得，该突变包含SEQ ID NO：2第67、113、260、291位氨基酸中至少一个突变。本发明所述的胺脱氢酶具有较高的还原胺化活性，产率高且满足99％+立体选择性的要求，具有非常广阔的应用前景。

Description

胺脱氢酶及其编码核酸与应用
技术领域
本发明涉及蛋白修饰技术领域，特别涉及一种胺脱氢酶。同时，本发明还涉及该胺脱氢酶的编码核酸，以及该胺脱氢酶的应用。
背景技术
在众多的胺类中，手性伯胺是众多生物活性分子中非常重要的基序或构造块，在医药领域有着广泛的应用，其合成方法主要有化学法和生物法。前者依赖重金属而后者转化率有待提高，后者经胺脱氢酶(AmDH)能够以廉价的氨作为氨基供体，不对称还原胺化潜手性羟酮生成手性伯胺，理论转化率高，是理想的绿色合成途径。
光学纯(R)-α-苯乙胺是手性胺的一种，其是合成治疗阿尔茨海默病药物利凡斯的明(Rivastigmine)的手性砌块，也是一种有机酸类手性拆分试剂和性能优良的手性助剂，在工业上具有广阔的应用前景。
(R)-α-苯乙胺的工业化生产大多采用金属催化苯乙酮直接还原胺化、偶联α-苯乙胺的动力学拆分或烯胺的不对称氢化等化学方法。但化学法存在环境污染严重、副产物多、产物提纯复杂及催化剂回收困难等缺陷。与化学法合成(R)-α-苯乙胺不同，生物合成途径具有反应条件温和、原料易得及环境友好等优点。然而，脂肪酶和环己胺氧化酶催化的手性拆分需要以外消旋α-苯乙胺为原料，生产成本较高且步骤繁杂；转氨酶催化的转氨反应需要添加过量的有机胺或氨基酸作为氨基供体，且存在底物抑制和反应平衡的问题，工业应用难度大。
脱氢酶，是指一类能催化物质(如糖类、有机酸、氨基酸)进行氧化还原反应的酶，在酶学分类中属于氧化还原酶类。反应中被氧化的底物称为氢供体或电子供体，被还原的底物称为氢受体或电子受体。当受体是氧气时，催化该反应的酶称为氧化酶，其他情况下都称为脱氢酶。不同的脱氢酶几乎都根据其底物的名称命名，胺脱氢酶是脱氢酶中的一种，据报道称，胺脱氢酶可以采用生物学方法制备手性胺，但目前报道的AmDH种类极少且底物谱窄，严重限制了其工业应用。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种胺脱氢酶，以使其可以催化以潜手性酮和游离氨为底物的不对称还原反应而合成手性胺。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
本发明的第一方面，提供了一种胺脱氢酶，对如SEQ ID NO.2的氨基酸脱氢酶进行突变而获得，所述突变包含SEQ ID NO：2第67、113、260、291位氨基酸中至少一个突变。
进一步的，所述突变包含SEQ ID NO：2的下列突变中的至少一种：
A)：第67位由K突变为S、Q和M中的任一种；
B)：第260位由N突变为L、C、F和I中的任一种；
C)：第113位由E突变为V；
D)：第291位由V突变为A、C和G中的任一种。
也就是说，所述突变可为A)-D)中任一种，或任两种或任三种或四种的组合。
具体来说，所述突变包含SEQ ID NO：2的下列突变(a1)-(a15)中的至少一种：
(a1)SEQ ID NO：2第67位氨基酸残基由K突变为S；
(a2)SEQ ID NO：2第67位氨基酸残基由K突变为Q；
(a3)SEQ ID NO：2第67位氨基酸残基由K突变为M；
(a4)SEQ ID NO：2第260位氨基酸残基由N突变为L；
(a5)SEQ ID NO：2第260位氨基酸残基由N突变为C；
(a6)SEQ ID NO：2第260位氨基酸残基由N突变为F；
(a7)SEQ ID NO：2第260位氨基酸残基由N突变为I；
(a8)SEQ ID NO：2第67位氨基酸残基由K突变为S，且第260位氨基酸残基由N突变为L；
(a9)SEQ ID NO：2第67位氨基酸残基由K突变为S，且第260位氨基酸残基由N突变为C；
(a10)SEQ ID NO：2第67位氨基酸残基由K突变为S，且第260位氨基酸残基由N突变为F；
(a11)SEQ ID NO：2第67位氨基酸残基由K突变为S，且第260位氨基酸残基由N突变为I；
(a12)SEQ ID NO：2第67位氨基酸残基由K突变为S，第260位氨基酸残基由N突变为L，且第113位氨基酸残基由E突变为V；
(a13)SEQ ID NO：2第67位氨基酸残基由K突变为S，第260位氨基酸残基由N突变为L，第113位氨基酸残基由E突变为V，且第291位氨基酸残基由V突变为A；
(a14)SEQ ID NO：2第67位氨基酸残基由K突变为S，第260位氨基酸残基由N突变为L，第113位氨基酸残基由E突变为V，且第291位氨基酸残基由V突变为C；
(a15)SEQ ID NO：2第67位氨基酸残基由K突变为S，第260位氨基酸残基由N突变为L，第113位氨基酸残基由E突变为V，且第291位氨基酸残基由V突变为G。
本发明的胺脱氢酶，具有较高的还原胺化活性，其催化活性高，产率高且满足99％+立体选择性的要求，具有非常广阔的应用前景
本发明的胺脱氢酶，其可应用在催化羟基酮和潜手性酮类化合物发生转氨反应制备手性胺的过程中。
优选的，所述的手性胺包括但不限于(R)-苯乙胺、(R)-苯丙胺、(R)-苯丁胺、(R)-苯戊胺、(R)-苯己胺、(R)-苯庚胺、(R)-1-(邻甲苯基)乙胺、(R)-1-(3-甲基苯基)乙胺、(R)-1-(4-甲基苯基)乙胺、(R)-1-(邻氟苯基)乙胺、(R)-1-(3-氟苯基)乙胺、(R)-1-(4-氟苯基)乙胺、(R)-1-(邻氯苯基)乙胺、(R)-1-(3-氯苯基)乙胺或(R)-1-(4-氯苯基)乙胺。
优选的，所述的羟基酮和潜手性酮类化合物包括但不限于苯乙酮、苯丙酮、苯丁酮、苯戊酮、苯己酮、苯庚酮、2-甲基苯乙酮、3-甲基-苯乙酮、4-甲基-苯乙酮、2-氟-苯乙酮、3-氟-苯乙酮、4-氟-苯乙酮或3-氯-苯乙酮。
本发明的第二方面，一种酶制剂，所述的酶制剂包括如上所述的胺脱氢酶。
本发明的第三方面，提供了一种编码如上所述的胺脱氢酶的核酸。
进一步的，所述的核酸为对SEQ ID NO：1的核苷酸序列进行下列至少一种突变而获得：
A)：199位核苷酸由a突变为c；
B)：200-201位核苷酸由aa突变为gt或tg；
C)：338-339位核苷酸由aa突变为tg；
D)：779位核苷酸由a突变为t；
E)：778-779位核苷酸由aa突变为tt；
F)：778-780位核苷酸由aat突变为ctg或ggc；
G)：872位核苷酸由a突变为c；
H)：871-872位核苷酸由aa突变为tg。
I)871-873位核苷酸由aac突变为gcg。
也就是说，所述的核酸为对SEQ ID NO：1的核苷酸序列进行A)-D)中任一种突变获得，或任2-9种突变中任意多种突变的组合，如其可为任两种或任三种或四种突变的组合。
举例来讲，例如可为下述的突变：
(1)SEQ ID NO：1第200-201位核苷酸由aa突变为gt；
(2)SEQ ID NO：1第199位核苷酸由a突变为c；
(3)SEQ ID NO：1第200-201位核苷酸由aa突变为tg；
(4)SEQ ID NO：1第778-780位核苷酸由aat突变为ctg；
(5)SEQ ID NO：1第778-780位核苷酸由aat突变为ggc；
(6)SEQ ID NO：1第778-779位核苷酸由aa突变为tt；
(7)SEQ ID NO：1第779位核苷酸由a突变为t；
(8)SEQ ID NO：1第200-201位核苷酸由aa突变为gt，且第778-780位核苷酸由aat突变为ctg；
(9)SEQ ID NO：1第200-201位核苷酸由aa突变为gt，且第778-780位核苷酸由aat突变为ggc；
(10)SEQ ID NO：1第200-201位核苷酸由aa突变为gt，且第778-779位核苷酸由aa突变为tt；
(11)SEQ ID NO：1第200-201位核苷酸由aa突变为gt，且第779位核苷酸由a突变为t；
(12)SEQ ID NO：1第200-201位核苷酸由aa突变为gt，第778-780位核苷酸由aat突变为ctg，且第338-339位核苷酸由aa突变为tg；
(13)SEQ ID NO：1第200-201位核苷酸由aa突变为gt，第778-780位核苷酸由aat突变为ctg，第338-339位核苷酸由aa突变为tg，且871-873位核苷酸由aac突变为gcg；
(14)SEQ ID NO：1第200-201位核苷酸由aa突变为gt，第778-780位核苷酸由aat突变为ctg，第338-339位核苷酸由aa突变为tg，且871-872位核苷酸由“aa”突变为tg；
(15)SEQ ID NO：1第200-201位核苷酸由aa突变为gt，第778-780位核苷酸由aat突变为ctg，第338-339位核苷酸由aa突变为tg，且872位核苷酸由a突变为c。
本发明的第四方面，提供了一种包含如上所述的核酸的表达载体。
优选的，所述表达载体为pET28a。
本发明的第五方面，提供了一种包含如上所述的核酸或如上所述的表达载体的细胞。
优选的，所述的细胞可以为细菌(例如大肠杆菌)或真菌。
本发明的第六方面，提供了一种所述的胺脱氢酶的制备方法，所述的制备方法包括将如上所述的核酸导入细胞中，培养该细胞，获得所述胺脱氢酶。
优选的，所述细胞包括重组菌。
所述的制备方法还包括将上述核酸导入宿主菌中。
优选的，所述宿主菌包括大肠杆菌，具体可为大肠杆菌BL21(DE3)。
优选的，所述的核酸可通过上述的表达载体导入所述宿主菌。
所述的制备方法还包括如下步骤：
(d1)破碎所述重组菌菌体，得到菌体破碎液；
(d2)将步骤(d1)得到的菌体破碎液离心取上清，得到蛋白质。
步骤(d1)中，所述重组菌菌体的制备方法包括如下步骤：
种子液培养：将重组菌接种于10mL LB液体培养基中，所述培养基中含有终浓度50μg/mL卡那霉素，37℃、180rpm振荡培养16h。
扩大培养：将种子液接种到50mL的TB培养基中(接种量1％)，所述培养基中含有终浓度50μg/mL卡那霉素，37℃、180rpm振荡培养至菌液OD600nm0.6-0.8，加入终浓度0.5μM的IPTG，继续20℃、180rpm振荡培养20-24h，5000rcf离心15min收集菌体。
步骤(d1)中，破碎菌体的方法为：将所述重组菌菌体采用50mM 50mLD的PBS洗涤、重悬2次，重悬后利用匀浆机破碎，12000rpm离心15min，收集上清即为粗酶液。
本发明的胺脱氢酶的制备方法，通过蛋白质工程的手段可以将催化氨基酸底物的氨基酸脱氢酶改造为以酮、醛为底物的胺脱氢酶(AmDH)。采用AmDH催化以潜手性酮和游离氨为底物的不对称还原反应合成手性胺的路线，具有绿色高效、成本低及产物光学纯度高的优点，是手性胺合成最理想的反应之一。
本发明的第七方面，提供了所述胺脱氢酶的应用，其用于制备式I所示的化合物，所述化合物的制备方法包括以式II为底物在所述的胺脱氢酶催化下获得；
其中，
R1代表苯基、F基、Cl基、甲基中的任意一种；
R2代表烷基。
进一步的，所述烷基包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基中的任意一种。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为(R)-苯乙胺的不对称合成路线；
图2为(R)-1-(邻甲基苯基)乙胺的不对称合成路线；
图3为(R)-1-(3-甲基苯基)乙胺的不对称合成路线；
图4为(R)-1-(4-甲基苯基)乙胺的不对称合成路线；
图5为(R)-1-(邻氟苯基)乙胺的不对称合成路线；
图6为(R)-1-(3-氟苯基)乙胺的不对称合成路线；
图7为(R)-1-(4-氟苯基)乙胺的不对称合成路线；
图8为(R)-1-(3-氯苯基)乙胺的不对称合成路线；
图9为(R)-苯戊胺的不对称合成路线。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
本发明涉及一种胺脱氢酶，其是对如SEQ ID NO.2的氨基酸脱氢酶进行突变而获得，所述突变包含SEQ ID NO：2第67、113、260、291位氨基酸中至少一个突变。
为了制备如上的胺脱氢酶，本发明选用的制备原料如下：
pET28a载体：来自Novagen公司，产品目录编号：69864-3。
大肠杆菌BL21(DE3)：来自北京全式金生物技术有限公司，货号：CD601-02。
LB培养基：每升10g胰蛋白冻(Tryptone)，5g酵母提取物(Yeast extract)，5gNaCl，1ml 1mol/L NaOH调pH至7.4用去离子水定容至1L.高压下蒸汽灭菌20min。
TB培养基：每升12g胰蛋白冻(Tryptone)，24g酵母提取物(Yeast extract)，87％甘油4mL，磷酸缓冲溶液(pH 6.5)100mL，用去离子水定容至1L.高压下蒸汽灭菌20min。
实施例1、突变位点的筛选确定
对来源于Jeotgalicoccus aerolatus的天然氨基酸脱氢酶蛋白(如SEQ ID NO：2所示，其编码基因(AmDH基因)如SEQ ID NO：1所示)进行序列分析、突变和功能验证，特定选择了12个氨基酸位点，通过进一步研究分析从12个氨基酸位点中筛选出了4个重要的氨基酸位点。将这4个氨基酸位点进行不同形式突变，得到突变体蛋白。
4个氨基酸位点及其突变形式如表1所示。
表1：15种突变形式
突变体序号 突变形式
a1 K67S
a2 K67Q
a3 K67M
a4 N260L
a5 N260C
a6 N260F
a7 N260I
a8 K67S\N260L
a9 K67S\N260C
a10 K67S\N260F
a11 K67S\N260I
a12 K67S\N260L\E113V
a13 K67S\N260L\E113V\V291A
a14 K67S\N260L\E113V\V291C
a15 K67S\N260L\E113V\V291G
编码表1所示突变体的核苷酸序列如表2所示。
表2突变体对应的核苷酸序列
SEQ ID NO：1：(NABI中参考序列号是：WP_092594608.1)
ATGATTTTTACCGAAATGGAACAAGGCGATTATGAACAGCTGGTGTTTTGCCAAGATAAAGCGAGCGGCCTGAAAGCGATTATTTGCATTCATGATACCACCCTGGGCCCGGCGCTGGGCGGCATTCGCTTTTGGAACTATGAACGCGAAGAAGATGCGATTACCGATGTGCTGCGCCTGGCGAAAGGCATGACCTATAAAAACGCGGCCGCGGGCCTGAATCTGGGCGGTGGCAAAGCGGTGGTGATTGGCGATGCGAGCAAAGATAAAAGCGAAGCGTTTTTTCGCAGCCTGGGCCGCTATATTAACAATTTAGGCGGTCGCTATATCGCGGCGGAAGATGTGGGCACCACCGTGGAAGATATGGATTTTATTTATCAAGAAACCGATTATGTGTGCGGCGTGAGCGAAGCGTATGGCAGCAGCGGCAACCCGAGCCCGTTTACCGCGCTGGGCCTGTATGTGGCGATGAAACGCACCGCGAAAGAAGCGTTTGGCAGCGATGATCTGAGCAACAAAACCGTGGCGGTGCAAGGCGTGGGCAACGTGGCGTATAGCCTGTGCAAACATCTGCATGAAGCGGGCGCGAAACTGATTGTGACCGATATTAACGAAAAAGCGGTGCAGCGCGCGGTGGATGATTTTGGCGCGGAAAGCGTGGGCCTGGATGATATTTATAGCGTGGATGCGGATATTTTTGCGCCGTGCGCGTTAGGCGGCATCTTAAACGATAAAACCATTCCGGAACTGAAAGTGAAAGCGATTTGCGGCAGCGCGAACAATCAGCTGCTGGATATTGAAACCCATGGCAAAGCGCTGGAAGATCGCGGCATTGTGTATGCGCCGGATTATGTGGTGAACAGCGGCGGCGTGATTAACGTGGCGGATGAACTGGAAGGCTATAACAAAGAACGCGCGACCGCGAAAGTGAACGATGTGTATAATCAGATTGATAAAATTTTTACCATTGCGAAAGAAGAAAACATTAGCCCGCAGCTGGCGGCGGATCATCTGGCGGAAAGCCGCATTAAAGCGATTCAGAACGTGAAAAGCGTGTATAGTCAGAGCGATAAAAACATTCTGAGCGGCCGCAAATAA
SEQ ID NO：2：
MIFTEMEQGDYEQLVFCQDKASGLKAIICIHDTTLGPALGGIRFWNYEREEDAITDVLRLAKGMTYKNAAAGLNLGGGKAVVIGDASKDKSEAFFRSLGRYINNLGGRYIAAEDVGTTVEDMDFIYQETDYVCGVSEAYGSSGNPSPFTALGLYVAMKRTAKEAFGSDDLSNKTVAVQGVGNVAYSLCKHLHEAGAKLIVTDINEKAVQRAVDDFGAESVGLDDIYSVDADIFAPCALGGILNDKTIPELKVKAICGSANNQLLDIETHGKALEDRGIVYAPDYVVNSGGVINVADELEGYNKERATAKVNDVYNQIDKIFTIAKEENISPQLAADHLAESRIKAIQNVKSVYSQSDKNILSGRK
实施例2、重组菌的制备
一、野生型重组表达载体的构建
将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列插入至pET28a载体的EcoRI和XhoI酶切位点之间，得到重组表达载体pET28a-AmDH，测序验证正确。
二、突变体重组表达载体的构建
将编码突变体a1-a15的核苷酸序列(见表2)分别插入至pET28a载体的EcoRI和XhoI酶切位点之间，得到重组表达载体pET28a-1-15，测序验证正确。
三、重组菌的制备
1、将步骤一得到的重组表达载体pET28a-AmDH转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到野生型重组菌。
2、将步骤二中制备的重组表达载体pET28a-1-15分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)，得到突变体重组菌，依次编号为突变体重组菌1-15。
实施例3、氨基酸脱氢酶突变体蛋白的酶活力测定
培养实施例2得到的野生型重组菌和突变体重组菌1-15，提取蛋白，并检测酶活。
1、将重组菌接种于10mL LB液体培养基中，所述培养基中含有终浓度50μg/mL卡那霉素，37℃、180rpm振荡培养16h，获得种子液。再将种子液接种到50mL的TB培养基中(接种量1％)，所述培养基中含有终浓度50μg/mL卡那霉素，37℃、180rpm振荡培养至菌液OD600nm0.6-0.8，加入终浓度0.5μM的IPTG，继续20℃、180rpm振荡培养20-24h，5000rcf离心15min收集菌体。
将所述重组菌菌体采用50mM 50mL的PBS缓冲液洗涤重悬2次，重悬后利用匀浆机破碎，12000rpm离心15min，收集上清即为粗酶液。
2、野生型重组菌进行上述步骤得到的蛋白溶液命名为野生型蛋白溶液。突变体重组菌1-15进行上述步骤得到的蛋白溶液依次命名为突变体1-突变体15蛋白溶液。Bradford法测蛋白质浓度。
3、配制酶活检测反应体系：反应缓冲溶液2M NH4Cl/NH3·H2O 850μL，底物终浓度10mM，待测蛋白溶液100μL(蛋白含量约为0.1mg)，NADH终浓度1mM。30℃反应3min。340nm处测定反应前后吸光值的变化。
4、根据吸光值变化计算酶活：
酶活计算公式：
其中，EW：340nm处1min吸光值的变化量；V：反应体系的总体积，单位为mL；6220：摩尔消光系数，单位为L/mol/cm；l：比色皿的光程距离
比酶活计算公式：
其中，U：酶活；mg：蛋白含量
结果见表3。
表3酶活统计结果
活性U/g 比活(％)
野生型 <0.1 <0.1
突变体1 98.4 5.71
突变体2 77.6 4.50
突变体3 35.7 2.07
突变体4 <0.1 <0.1
突变体5 <0.1 <0.1
突变体6 <0.1 <0.1
突变体7 <0.1 <0.1
突变体8 435 25.23
突变体9 332 19.26
突变体10 236 13.69
突变体11 278 16.13
突变体12 776 45.01
突变体13 1484 86.08
突变体14 893 51.80
突变体15 1724 100
实施例4：(R)-苯乙胺的不对称合成
合成路线见图1，将苯乙酮(0.5mmol)、NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、0.005mmol)、2M NH4Cl/NH4OH溶液5mL、胺脱氢酶突变体15(Ja-AmDH-M15)(0.22μmol)、GDH(谷氨酸脱氢酶、0.22μmol)、葡萄糖(0.5mmol)、DMSO(二甲基亚砜)50μL加入10mL玻璃管中。在30℃下搅拌反应混合物48h，反应完成后，用乙酸乙酯(3×5mL)萃取混合物。有机层用Na2SO4干燥，硅胶柱层析分离(乙酸乙酯：甲醇＝99：1-90：10)。1mL萃取液，加入100μL乙酸酐，漩涡震荡10s。
利用气相色谱测定不对称还原反应产物的产率、构型及其ee值，色谱条件：Agilent J&W CP-Chiralsil-DEXCB色谱柱(25m×0.32mm×0.25μm)，柱温程序：起始温度100℃，5℃/min速率升温至200℃，200℃保留5min。得到(R)-苯乙胺，收率97％，ee值为99％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.42–7.34(m,4H),7.29–7.23(m,1H),4.16(q,J＝6.6Hz,1H),1.65(s,2H),1.43(d,J＝6.6Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ147.85(s),128.55(s),126.87(s),125.76(s),51.40(s),25.74(s)。
实施例5：(R)-1-(邻甲苯基)乙胺的不对称合成
合成路线见图2，将2-甲基苯乙酮(0.5mmol)、NAD+(0.005mmol)、2M NH4Cl/NH4OH溶液5mL、胺脱氢酶突变体15(Ja-AmDH-M15)(0.22μmol)、GDH(0.22μmol)、葡萄糖(0.5mmol)、DMSO 50μL加入10mL玻璃管中。在30℃下搅拌反应混合物48h，反应完成后，用乙酸乙酯(3×5mL)萃取混合物。有机层用Na2SO4干燥，硅胶柱层析分离(乙酸乙酯：甲醇＝99：1-90：10)。1mL萃取液，加入100μL乙酸酐，漩涡震荡10s。
利用气相色谱测定不对称还原反应产物的产率、构型及其ee值，色谱条件：Agilent J&W CP-Chiralsil-DEXCB色谱柱(25m×0.32mm×0.25μm)，柱温程序：起始温度100℃，5℃/min速率升温至200℃，200℃保留5min。得到(R)-1-(邻甲苯基)乙胺，收率87％，ee值为99％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.51(d,J＝7.7Hz,1H),7.26(dd,J＝8.3,4.7Hz,1H),7.22–7.14(m,2H),4.41(q,J＝6.6Hz,1H),2.41(d,J＝7.2Hz,3H),1.75(s,2H),1.40(d,J＝6.6Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ145.69(s),134.50(s),130.44(s),126.50(d,J＝6.4Hz),124.25(s),46.90(s),24.59(s),19.12(s)。
实施例6：(R)-1-(3-甲基苯基)乙胺的不对称合成
合成路线见图3，将3-甲基-苯乙酮(0.5mmol)、NAD+(0.005mmol)、2M NH4Cl/NH4OH溶液5mL、胺脱氢酶突变体15(Ja-AmDH-M15)(0.22μmol)、GDH(0.22μmol)、葡萄糖(0.5mmol)、DMSO 50μL加入10mL玻璃管中。在30℃下搅拌反应混合物48h，反应完成后，用乙酸乙酯(3×5mL)萃取混合物。有机层用Na2SO4干燥，硅胶柱层析分离(乙酸乙酯：甲醇＝99：1-90：10)。1mL萃取液，加入100μL乙酸酐，漩涡震荡10s。
利用气相色谱测定不对称还原反应产物的产率、构型及其ee值，色谱条件：Agilent J&W CP-Chiralsil-DEXCB色谱柱(25m×0.32mm×0.25μm)，柱温程序：起始温度100℃，5℃/min速率升温至200℃，200℃保留5min。得到(R)-1-(3-甲基苯基)乙胺，收率83％，ee值为99％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.26(t,J＝7.5Hz,1H),7.17(d,J＝7.8Hz,2H),7.09(d,J＝7.4Hz,1H),4.12(q,J＝6.8Hz,1H),2.39(s,3H),1.79(s,2H),1.45–1.39(m,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ147.68(s),138.17(s),128.47(s),127.64(s),126.50(s),122.78(s),51.36(s),25.61(s),21.53(s)。
实施例7：(R)-1-(4-甲基苯基)乙胺的不对称合成
合成路线见图4，将4-甲基-苯乙酮(0.5mmol)、NAD+(0.005mmol)、2M NH4Cl/NH4OH溶液5mL、胺脱氢酶突变体15(Ja-AmDH-M15)(0.22μmol)、GDH(0.22μmol)、葡萄糖(0.5mmol)、DMSO 50μL加入10mL玻璃管中。在30℃下搅拌反应混合物48h，反应完成后，用乙酸乙酯(3×5mL)萃取混合物。有机层用Na2SO4干燥，硅胶柱层析分离(乙酸乙酯：甲醇＝99：1-90：10)。1mL萃取液，加入100μL乙酸酐，漩涡震荡10s。
利用气相色谱测定不对称还原反应产物的产率、构型及其ee值，色谱条件：Agilent J&W CP-Chiralsil-DEXCB色谱柱(25m×0.32mm×0.25μm)，柱温程序：起始温度100℃，5℃/min速率升温至200℃，200℃保留5min。得到(R)-1-(4-甲基苯基)乙胺，收率78％，ee值为99％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.28(d,J＝8.0Hz,2H),7.18(d,J＝7.7Hz,2H),4.13(q,J＝6.7Hz,1H),2.37(s,3H),1.79(s,2H),1.42(d,J＝6.6Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ144.84(s),136.44(s),129.16(d,J＝13.4Hz),125.66(s),51.10(s),25.70(s),21.09(s)。
实施例8：(R)-1-(邻氟苯基)乙胺的不对称合成
合成路线见图5，将2-氟-苯乙酮(3.75mmol)、NAD+(0.005mmol)、2M NH4Cl/NH4OH溶液5mL、胺脱氢酶突变体15(Ja-AmDH-M15)(0.22μmol)、GDH(0.22μmol)、葡萄糖(3.75mmol)、DMSO 50μL加入10mL玻璃管中。在30℃下搅拌反应混合物48h，反应完成后，用乙酸乙酯(3×5mL)萃取混合物。有机层用Na2SO4干燥，硅胶柱层析分离(乙酸乙酯：甲醇＝99：1-90：10)。1mL萃取液，加入100μL乙酸酐，漩涡震荡10s。
利用气相色谱测定不对称还原反应产物的产率、构型及其ee值，色谱条件：Agilent J&W CP-Chiralsil-DEXCB色谱柱(25m×0.32mm×0.25μm)，柱温程序：起始温度100℃，5℃/min速率升温至200℃，200℃保留5min。得到(R)-1-(邻氟苯基)乙胺，收率92％，ee值为99％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.44(td,J＝7.7,1.9Hz,1H),7.27–7.20(m,1H),7.15(td,J＝7.5,1.3Hz,1H),7.04(ddd,J＝9.5,8.5,1.4Hz,1H),4.42(q,J＝6.7Hz,1H),1.68(s,2H),1.45(d,J＝6.7Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ159.23(s),128.16(d,J＝8.4Hz),126.76(d,J＝5.0Hz),124.28(d,J＝3.6Hz),115.62(s),115.48(d,J＝22.3Hz),45.45(d,J＝3.0Hz),24.10(s)。
实施例9：(R)-1-(3-氟苯基)乙胺的不对称合成
合成路线见图6，将3-氟-苯乙酮(0.5mmol)、NAD+(0.005mmol)、2M NH4Cl/NH4OH溶液5mL、胺脱氢酶突变体15(Ja-AmDH-M15)(0.22μmol)、GDH(0.22μmol)、葡萄糖(0.5mmol)、DMSO 50μL加入10mL玻璃管中。在30℃下搅拌反应混合物48h，反应完成后，用乙酸乙酯(3×5mL)萃取混合物。有机层用Na2SO4干燥，硅胶柱层析分离(乙酸乙酯：甲醇＝99：1-90：10)。1mL萃取液，加入100μL乙酸酐，漩涡震荡10s。
利用气相色谱测定不对称还原反应产物的产率、构型及其ee值，色谱条件：Agilent J&W CP-Chiralsil-DEXCB色谱柱(25m×0.32mm×0.25μm)，柱温程序：起始温度100℃，5℃/min速率升温至200℃，200℃保留5min。得到(R)-1-(3-氟苯基)乙胺，收率99％，ee值为99％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.37–7.30(m,1H),7.19–7.08(m,2H),6.96(dd,J＝13.3,5.5Hz,1H),4.16(q,J＝6.7Hz,1H),1.67(s,2H),1.45–1.38(m,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ161.88(s),150.57(d,J＝6.4Hz),129.96(d,J＝8.2Hz),121.42(d,J＝2.8Hz),113.78(s),113.63(d,J＝21.2Hz),112.80(s),112.66(d,J＝21.5Hz),51.01(s),25.69(s)。
实施例10：(R)-1-(4-氟苯基)乙胺的不对称合成
合成路线见图7，将4-氟-苯乙酮(0.5mmol)、NAD+(0.005mmol)、2M NH4Cl/NH4OH溶液5mL、胺脱氢酶突变体15(Ja-AmDH-M15)(0.22μmol)、GDH(0.22μmol)、葡萄糖(0.5mmol)、DMSO 50μL加入10mL玻璃管中。在30℃下搅拌反应混合物48h，反应完成后，用乙酸乙酯(3×5mL)萃取混合物。有机层用Na2SO4干燥，硅胶柱层析分离(乙酸乙酯：甲醇＝99：1-90：10)。1mL萃取液，加入100μL乙酸酐，漩涡震荡10s。
利用气相色谱测定不对称还原反应产物的产率、构型及其ee值，色谱条件：Agilent J&W CP-Chiralsil-DEXCB色谱柱(25m×0.32mm×0.25μm)，柱温程序：起始温度100℃，5℃/min速率升温至200℃，200℃保留5min。得到(R)-1-(4-氟苯基)乙胺，收率96％，ee值为99％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.39(d,J＝2.4Hz,1H),7.26(ddd,J＝11.0,9.6,4.7Hz,3H),4.14(q,J＝6.7Hz,1H),1.65(s,2H),1.44–1.39(m,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ162.99(s),160.56(s),143.31(d,J＝3.1Hz),127.29(d,J＝7.9Hz),115.33(s),115.12(s),50.72(s),25.84(s)。
实施例11：(R)-1-(3-氯苯基)乙胺的不对称合成
合成路线见图8，将3-氯-苯乙酮(0.5mmol)、NAD+(0.005mmol)、2M NH4Cl/NH4OH溶液5mL、胺脱氢酶突变体15(Ja-AmDH-M15)(0.22μmol)、GDH(0.22μmol)、葡萄糖(0.5mmol)、DMSO 50μL加入10mL玻璃管中。在30℃下搅拌反应混合物48h，反应完成后，用乙酸乙酯(3×5mL)萃取混合物。有机层用Na2SO4干燥，硅胶柱层析分离(乙酸乙酯：甲醇＝99：1-90：10)。1mL萃取液，加入100μL乙酸酐，漩涡震荡10s。
利用气相色谱测定不对称还原反应产物的产率、构型及其ee值，色谱条件：Agilent J&W CP-Chiralsil-DEXCB色谱柱(25m×0.32mm×0.25μm)，柱温程序：起始温度100℃，5℃/min速率升温至200℃，200℃保留5min。得到(R)-1-(3-氯苯基)乙胺，收率76％，ee值为99％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.34(dd,J＝8.4,5.4Hz,2H),7.04(t,J＝8.5Hz,2H),4.15(q,J＝6.7Hz,1H),1.71(s,2H),1.40(d,J＝6.5Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ149.86(s),134.37(s),129.83(s),127.00(s),126.08(s),124.06(s),51.04(s),25.69(s)。
实施例12：(R)-苯戊胺的不对称合成
合成路线见图9，将苯戊酮(0.5mmol)、NAD+(0.005mmol)、2M NH4Cl/NH4OH溶液5mL、胺脱氢酶突变体15(Ja-AmDH-M15)(0.22μmol)、GDH(0.22μmol)、葡萄糖(0.5mmol)、DMSO 50μL加入10mL玻璃管中。在30℃下搅拌反应混合物48h，反应完成后，用乙酸乙酯(3×5mL)萃取混合物。有机层用Na2SO4干燥，硅胶柱层析分离(乙酸乙酯：甲醇＝99：1-90：10)。1mL萃取液，加入100μL乙酸酐，漩涡震荡10s。
利用气相色谱测定不对称还原反应产物的产率、构型及其ee值，色谱条件：Agilent J&W CP-Chiralsil-DEXCB色谱柱(25m×0.32mm×0.25μm)，柱温程序：起始温度100℃，5℃/min速率升温至200℃，200℃保留5min。得到(R)苯戊胺，收率89％，ee值为99％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.39–7.26(m,5H),3.90(t,J＝6.9Hz,1H),1.70(d,J＝6.3Hz,2H),1.62(s,2H),1.40–1.20(m,4H),0.91(t,J＝6.9Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ146.87(s),128.46(s),126.87(s),126.36(s),77.41(s),77.09(s),76.77(s),56.35(s),39.44(s),28.83(s),22.73(s),14.06(s)。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北工业大学
<120> 胺脱氢酶及其编码核酸与应用
<130> 2010
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1098
<212> DNA
<213> WP_092594608.1
<400> 1
atgattttta ccgaaatgga acaaggcgat tatgaacagc tggtgttttg ccaagataaa 60
gcgagcggcc tgaaagcgat tatttgcatt catgatacca ccctgggccc ggcgctgggc 120
ggcattcgct tttggaacta tgaacgcgaa gaagatgcga ttaccgatgt gctgcgcctg 180
gcgaaaggca tgacctataa aaacgcggcc gcgggcctga atctgggcgg tggcaaagcg 240
gtggtgattg gcgatgcgag caaagataaa agcgaagcgt tttttcgcag cctgggccgc 300
tatattaaca atttaggcgg tcgctatatc gcggcggaag atgtgggcac caccgtggaa 360
gatatggatt ttatttatca agaaaccgat tatgtgtgcg gcgtgagcga agcgtatggc 420
agcagcggca acccgagccc gtttaccgcg ctgggcctgt atgtggcgat gaaacgcacc 480
gcgaaagaag cgtttggcag cgatgatctg agcaacaaaa ccgtggcggt gcaaggcgtg 540
ggcaacgtgg cgtatagcct gtgcaaacat ctgcatgaag cgggcgcgaa actgattgtg 600
accgatatta acgaaaaagc ggtgcagcgc gcggtggatg attttggcgc ggaaagcgtg 660
ggcctggatg atatttatag cgtggatgcg gatatttttg cgccgtgcgc gttaggcggc 720
atcttaaacg ataaaaccat tccggaactg aaagtgaaag cgatttgcgg cagcgcgaac 780
aatcagctgc tggatattga aacccatggc aaagcgctgg aagatcgcgg cattgtgtat 840
gcgccggatt atgtggtgaa cagcggcggc gtgattaacg tggcggatga actggaaggc 900
tataacaaag aacgcgcgac cgcgaaagtg aacgatgtgt ataatcagat tgataaaatt 960
tttaccattg cgaaagaaga aaacattagc ccgcagctgg cggcggatca tctggcggaa 1020
agccgcatta aagcgattca gaacgtgaaa agcgtgtata gtcagagcga taaaaacatt 1080
ctgagcggcc gcaaataa 1098
<210> 2
<211> 365
<212> PRT
<213> Jeotgalicoccus aerolatus
<400> 2
Met Ile Phe Thr Glu Met Glu Gln Gly Asp Tyr Glu Gln Leu Val Phe
1 5 10 15
Cys Gln Asp Lys Ala Ser Gly Leu Lys Ala Ile Ile Cys Ile His Asp
20 25 30
Thr Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Ile Arg Phe Trp Asn Tyr Glu
35 40 45
Arg Glu Glu Asp Ala Ile Thr Asp Val Leu Arg Leu Ala Lys Gly Met
50 55 60
Thr Tyr Lys Asn Ala Ala Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly Gly Lys Ala
65 70 75 80
Val Val Ile Gly Asp Ala Ser Lys Asp Lys Ser Glu Ala Phe Phe Arg
85 90 95
Ser Leu Gly Arg Tyr Ile Asn Asn Leu Gly Gly Arg Tyr Ile Ala Ala
100 105 110
Glu Asp Val Gly Thr Thr Val Glu Asp Met Asp Phe Ile Tyr Gln Glu
115 120 125
Thr Asp Tyr Val Cys Gly Val Ser Glu Ala Tyr Gly Ser Ser Gly Asn
130 135 140
Pro Ser Pro Phe Thr Ala Leu Gly Leu Tyr Val Ala Met Lys Arg Thr
145 150 155 160
Ala Lys Glu Ala Phe Gly Ser Asp Asp Leu Ser Asn Lys Thr Val Ala
165 170 175
Val Gln Gly Val Gly Asn Val Ala Tyr Ser Leu Cys Lys His Leu His
180 185 190
Glu Ala Gly Ala Lys Leu Ile Val Thr Asp Ile Asn Glu Lys Ala Val
195 200 205
Gln Arg Ala Val Asp Asp Phe Gly Ala Glu Ser Val Gly Leu Asp Asp
210 215 220
Ile Tyr Ser Val Asp Ala Asp Ile Phe Ala Pro Cys Ala Leu Gly Gly
225 230 235 240
Ile Leu Asn Asp Lys Thr Ile Pro Glu Leu Lys Val Lys Ala Ile Cys
245 250 255
Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Leu Asp Ile Glu Thr His Gly Lys Ala
260 265 270
Leu Glu Asp Arg Gly Ile Val Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Val Asn Ser
275 280 285
Gly Gly Val Ile Asn Val Ala Asp Glu Leu Glu Gly Tyr Asn Lys Glu
290 295 300
Arg Ala Thr Ala Lys Val Asn Asp Val Tyr Asn Gln Ile Asp Lys Ile
305 310 315 320
Phe Thr Ile Ala Lys Glu Glu Asn Ile Ser Pro Gln Leu Ala Ala Asp
325 330 335
His Leu Ala Glu Ser Arg Ile Lys Ala Ile Gln Asn Val Lys Ser Val
340 345 350
Tyr Ser Gln Ser Asp Lys Asn Ile Leu Ser Gly Arg Lys
355 360 365

Claims (8)

1.一种胺脱氢酶，其特征在于：对如SEQ ID NO .2的氨基酸脱氢酶进行突变而获得，所述突变为同时突变K67S和N260L和E113V和V291G位点。
2.一种酶制剂，其特征在于，所述的酶制剂包括权利要求1所述的胺脱氢酶。
3.编码权利要求1所述的胺脱氢酶的核酸。
4.一种包含权利要求3所述的核酸的表达载体。
5.一种包含权利要求3所述的核酸或权利要求4所述的表达载体的细胞。
6.一种权利要求1所述的胺脱氢酶的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括将权利要求3所述的核酸导入细胞中，培养该细胞，获得所述胺脱氢酶。
7.一种权利要求1所述的胺脱氢酶的应用，其特征在于，用于制备式I所示的化合物，所述化合物的制备方法包括以式II为底物在所述的胺脱氢酶催化下获得；
式I；
式II；
其中，
R1代表F基、Cl基、甲基中的任意一种；
R2代表烷基。
8.根据权利要求7所述的胺脱氢酶的应用，其特征在于，所述烷基包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基中的任意一种。
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