CN112852895A - 一种双酶级联催化合成(r)-3-氨基-1-丁醇的方法 - Google Patents

一种双酶级联催化合成(r)-3-氨基-1-丁醇的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种双酶级联催化合成(R)‑3‑氨基‑1‑丁醇的方法。该方法包括如下步骤：以1，3‑丁二醇为底物，经醇脱氢酶催化反应生成4‑羟基‑2‑丁酮；以4‑羟基‑2‑丁酮为底物，经胺脱氢酶或其突变体催化反应生成手性(R)‑3‑氨基‑1‑丁醇。本发明提供了一条全新的绿色生物合成路线，以廉价的1，3‑丁二醇为原料，通过双酶细胞共表达催化合成手性(R)‑3‑氨基‑1‑丁醇。同时本发明提供的方法存在辅因子自循环系统，具有很好的经济效益。本发明具有重要的应用价值。

Description

一种双酶级联催化合成(R)-3-氨基-1-丁醇的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种双酶级联催化合成(R)-3-氨基-1-丁醇的方法，尤其涉及一种利用醇脱氢酶和胺脱氢酶级联催化合成手性(R)-3-氨基-1-丁醇的方法。
背景技术
手性胺醇化合物是许多生物活性分子的结构单元，是重要的医药和精细化工中间体，其中(R)-3-氨基-1-丁醇是合成抗艾滋病整合酶抑制剂度鲁特韦(Dolutegravir)的重要前体，并且还可衍生为β-内酰胺，用于合成青霉烯类抗生素。
(R)-3-氨基-1-丁醇主要是通过化学法合成，酶法合成的报道较少。1995年Gertzmann等以手性(R)-丙氨酸为原料，经氨基保护后，以重氮甲烷增长碳链变为β-氨基酸酯，脱保护后还原得到目标产物。1977年Kinas等用巴豆酸酯与(R)-苯乙胺反应生成具有两个手性中心的一组差向异构体，通过硅胶柱层析分离后得到单一的异构体，然后经过酯还原、脱苄基得到(R)-3-氨基-1-丁醇；该方法步骤较少且原料易得，是一种有希望实现工业化生产的方法，但是存在以下问题，由于第一步反应选择性较差，得到几乎等量的两个対映异构体，造成分离纯化比较困难，常采用色谱柱法分离，洗脱剂用量大、损失大、效率低，同时由于使用了价格昂贵的LiAlH4作为还原剂，原材料成本也显著上升，该方法不宜规模化工业化生产。1998年，Tatsuya等报道了一种合成(R)-3-氨基-1-丁醇的方法，但该方法中原料的价格昂贵，反应条件苛刻。
目前，(R)-3-氨基-1-丁醇的合成方法中，化学法需要高温、高压和金属催化剂、反应条件苛刻、污染大、安全系数低，收率为60％～70％。生物法反应条件温和，但转化率低。因此，寻找新的绿色方法来合成(R)-3-氨基-1-丁醇，对促进现有化学工艺的绿色升级和加强对环境的保护具有重要的科学价值和社会意义。
1，3-丁二醇是一种重要的化工原料，具有易于获得、价格低等特点，用于(R)-3-氨基-1-丁醇的合成原料，具有很好的经济效益。
发明内容
本发明的目的是如何合成手性(R)-3-氨基-1-丁醇。
本发明首先保护合成手性(R)-3-氨基-1-丁醇的方法。
本发明所保护的合成手性(R)-3-氨基-1-丁醇的方法，具体可为方法一，可包括如下步骤：
(A)以1，3-丁二醇为底物，经酶A催化反应生成4-羟基-2-丁酮；
(B)以步骤(A)生成的4-羟基-2-丁酮为底物，经酶B催化反应生成手性(R)-3-氨基-1-丁醇；
所述酶A选自如下任一种：醇脱氢酶、醇脱氢酶突变体；
所述酶B选自如下任一种：胺脱氢酶、胺脱氢酶突变体。
本发明所保护的合成手性(R)-3-氨基-1-丁醇的方法，具体可为方法二，可包括如下步骤：以1，3-丁二醇为底物，经酶A和酶B催化反应，生成手性(R)-3-氨基-1-丁醇；
所述酶A选自如下任一种：醇脱氢酶、醇脱氢酶突变体；
所述酶B选自如下任一种：胺脱氢酶、胺脱氢酶突变体。
上述任一所述醇脱氢酶可为如下(a1)-(a42)中任一。
(a1)来源于短小乳杆菌(Lactobacillus brevis KB290)的醇脱氢酶ADH1，氨基酸序列的Accession Number为BAN05992.1。
(a2)来源于高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacter brockii)的醇脱氢酶ADH2，氨基酸序列的Accession Number为CAA46053.1。
(a3)来源于固氮弧菌属(Aromatoleum aromaticum EbN1)的醇脱氢酶ADH3，氨基酸序列的Accession Number为CAI07428.1。
(a4)来源于链霉菌(Streptomyces coelicolor)的醇脱氢酶ADH4，氨基酸序列的Accession Number为Q9KYM4。
(a5)来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的醇脱氢酶ADH5，氨基酸序列的Accession Number为WP_003234015.1。
(a6)来源于肺炎克雷白杆菌(Klebsiella pneumoniae)的醇脱氢酶ADH6，氨基酸序列的Accession Number为WP_015958558.1。
(a7)来源于葡萄糖杆菌(Gluconobacter oxydans)的醇脱氢酶ADH7，氨基酸序列的Accession Number为WP_011253549.1。
(a8)来源于赖氏菌属(Leifsonia sp.S749)的醇脱氢酶ADH8，氨基酸序列的Accession Number为BAD99642.1。
(a9)来源于赤红球菌(Rhodococcus ruber)的醇脱氢酶ADH9，氨基酸序列的Accession Number为Q8KLT9。
(a10)来源于高加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus kefiri DSM 20587)的醇脱氢酶ADH10，氨基酸序列的Accession Number为AAP94029.1。
(a11)来源于威吉利热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter wiegelii Rt8.B1)的醇脱氢酶ADH11，氨基酸序列的Accession Number为AEM77517.1。
(a12)来源于乳杆菌(Lactobacillus zymae DSM 19395)的醇脱氢酶ADH12，氨基酸序列的Accession Number为KRL08675.1。
(a13)来源于酒球菌(Oenococcus alcoholitolerans)的醇脱氢酶ADH13，氨基酸序列的Accession Number为KGO31568.1。
(a14)来源于愈伤热球菌(Thermococcus guaymasensis)的醇脱氢酶ADH14，氨基酸序列的Accession Number为ADV18977.1。
(a15)来源于肉毒梭菌(Clostridium botulinum)的醇脱氢酶ADH15，氨基酸序列的Accession Number为WP_003399463.1。
(a16)来源于致黑脱硫肠状菌(Desulfotomaculum nigrificans)的醇脱氢酶ADH16，氨基酸序列的Accession Number为WP_003542410.1。
(a17)来源于一氧化碳嗜热窦菌(Thermosinus carboxydivorans)的醇脱氢酶ADH17,氨基酸序列的Accession Number为WP_007290608.1。
(a18)来源于烷嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter mathranii)的醇脱氢酶ADH18，氨基酸序列的Accession Number为WP_013150923.1。
(a19)来源于梭菌属(Clostridium)的醇脱氢酶ADH19，氨基酸序列的AccessionNumber为WP_013239134.1。
(a20)来源于厚壁菌门细菌(Firmicutes bacterium CAG:137)的醇脱氢酶ADH20,氨基酸序列的Accession Number为CDB31037.1。
(a21)来源于拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)的醇脱氢酶ADH21，氨基酸序列的Accession Number为WP_026889046.1。
(a22)来源于梭菌属(Clostridium)的醇脱氢酶ADH22，氨基酸序列的AccessionNumber为WP_039771361.1。
(a23)来源于乙草甲烷菌(Methanosarcina acetivorans)的醇脱氢酶ADH23，氨基酸序列的Accession Number为WP_048065256.1。
(a24)来源于淡色甲烷菌(Methanosarcina lacustris)的醇脱氢酶ADH24，氨基酸序列的Accession Number为WP_048125376.1。
(a25)来源于甲烷八叠球菌(Methanosarcina thermophila)的醇脱氢酶ADH25，氨基酸序列的Accession Number为WP_048166386.1。
(a26)来源于西洋甲烷菌(Methanosarcina siciliae)的醇脱氢酶ADH26，氨基酸序列的Accession Number为WP_048172170.1。
(a27)来源于德氏葡萄球菌(Desnuesiella massiliensis)的醇脱氢酶ADH27，氨基酸序列的Accession Number为WP_055668884.1。
(a28)来源于卡尔德氏杆菌(Caldanaerobacter subterraneus)的醇脱氢酶ADH28，氨基酸序列的Accession Number为KUK09008.1。
(a29)来源于钟氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)的醇脱氢酶ADH29，氨基酸序列的Accession Number为WP_063556461.1。
(a30)来源于拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)的醇脱氢酶ADH30，氨基酸序列的Accession Number为WP_065417405.1。
(a31)来源于未培养梭菌(uncultured Clostridium sp.)的醇脱氢酶ADH31，氨基酸序列的Accession Number为SCI81347.1。
(a32)来源于丝状孢子梭菌(Clostridium taeniosporum)的醇脱氢酶ADH32，氨基酸序列的Accession Number为WP_069679756.1。
(a33)来源于脱硫弧菌(Desulfovibrio litoralis)的醇脱氢酶ADH33，氨基酸序列的Accession Number为WP_072695399.1。
(a34)来源于脱硫肠状菌(Desulfotomaculum putei)的醇脱氢酶ADH34，氨基酸序列的Accession Number为WP_073236284.1。
(a35)来源于拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)的醇脱氢酶ADH35，氨基酸序列的Accession Number为WP_077844196.1。
(a36)来源于梭状芽胞杆菌(Clostridium puniceum)的醇脱氢酶ADH36，氨基酸序列的Accession Number为WP_077846831.1。
(a37)来源于二醇梭菌(Clostridium diolis)的醇脱氢酶ADH37，氨基酸序列的Accession Number为WP_087701616.1。
(a38)来源于匙形梭菌(Clostridium cochlearium)的醇脱氢酶ADH38，氨基酸序列的Accession Number为WP_089865926.1。
(a39)来源于笃斯梭菌(Clostridium uliginosum)的醇脱氢酶ADH39，氨基酸序列的Accession Number为WP_090093236.1。
(a40)来源于梭菌属细菌(Clostridiales bacterium SK-Y3)的醇脱氢酶ADH40，氨基酸序列的Accession Number为WP_094550774.1。
(a41)来源于近平滑假丝酵母(Clostridium botulinum)的醇脱氢酶ADH41，氨基酸序列的Accession Number为WP_096043277.1。
(a42)在(a1)-(a41)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
上述任一所述胺脱氢酶可为如下(b1)-(b10)中任一。
(b1)来源于嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stereothermophilus)的胺脱氢酶AmDH1，氨基酸序列为SEQ ID No.1。
(b2)来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stereothermophilus)的胺脱氢酶AmDH2，氨基酸序列为SEQ ID No.2。
(b3)来源于嗜冷芽孢八叠球菌(Sporosarcina psychrophila)的胺脱氢酶AmDH3，氨基酸序列为SEQ ID No.3。
(b4)来源于球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)的胺脱氢酶AmDH4，氨基酸序列为SEQ ID No.4。
(b5)来源于西伯利亚微杆菌(Exiguobacterium sibiricum)的胺脱氢酶的胺脱氢酶AmDH5，氨基酸序列为SEQ ID No.5。
(b6)来源于普通高温放线菌(Thermoactinomyces intermedius)的胺脱氢酶AmDH6，氨基酸序列为SEQ ID No.6。
(b7)来源于温泉热碱芽孢杆菌(Caldalkalibacillus thermarum)的胺脱氢酶AmDH7，氨基酸序列为SEQ ID No.7。
(b8)来源于糖莱斯氏菌(Laceyella sacchari)的胺脱氢酶AmDH8，氨基酸序列为SEQ ID No.8。
(b9)来源于栗褐芽孢杆菌(Bacillus badius)的胺脱氢酶AmDH9，氨基酸序列为SEQ ID No.9。
(b10)在(b1)-(b9)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
上述任一所述胺脱氢酶的突变体可为(c1)或(c2)。
(c1)将SEQ ID No.3所示的胺脱氢酶AmDH3的第114位和第291位依次突变为缬氨酸残基和半胱氨酸残基。
(c2)将SEQ ID No.3所示的胺脱氢酶AmDH3的第111位、第114位、第294位依次突变为苯丙氨酸残基、缬氨酸残基和半胱氨酸残基。
上述任一所述的方法中，所述酶A和所述酶B均是以粗酶液、粗酶粉、纯酶或全细胞的形式发生催化作用的。
上述任一所述的方法中，所述经酶A和酶B催化反应可为经酶A和酶B共表达全细胞催化反应。
上述任一所述的方法中，所述粗酶液、粗酶粉和/或纯酶均按照包括如下步骤的方法制备得到：在宿主细胞中表达所述酶A和/或所述酶B，得到重组细胞；裂解所述重组细胞获得所述粗酶液、粗酶粉或纯酶。
上述任一所述的方法中，所述全细胞均按照包括如下步骤的方法制备得到：在宿主细胞中表达所述酶A和/或所述酶B，得到的重组细胞即为所述全细胞。
所述重组细胞是按照包括如下步骤的方法制备获得的：向所述宿主细胞到导入能够表达所述酶A和/或所述酶B的核酸分子，经诱导培养后获得表达所述酶A和/或所述酶B的所述重组细胞。
所述“能够表达所述酶A和/或所述酶B的核酸分子”是通过重组载体的形式导入到所述宿主细胞中的。
所述重组载体可为携带有所述酶A和/或所述酶B的编码基因的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒或逆转录病毒包装质粒。
所述宿主细胞可为原核细胞或低等真核细胞。
所述原核细胞可为细菌。所述低等真核细胞可为酵母细胞。
所述细菌可为大肠杆菌。
所述重组载体具体为将所述醇脱氢酶和/或所述胺脱氢酶或其突变体的编码基因替换pET28a载体的酶切位点NcoⅠ和XhoⅠ之间的小片段后得到的重组质粒。
上述任一所述的方法中，所述催化反应的温度可为25～40℃(具体如30℃)。所述催化反应的时间可为4～48h(具体如24h)。
上述任一所述的方法中，当所述酶A以全细胞、粗酶液、粗酶粉或纯酶的形式进行步骤(A)时，催化反应在如下(d1)所示缓冲液中进行。当所述酶B以全细胞、粗酶液、粗酶粉或纯酶的形式进行步骤(B)时，催化反应在如下(d2)所示缓冲液中进行。当酶A和酶B共表达全细胞催化反应时，催化反应在如下(d2)所示缓冲液中进行。
(d1)浓度为50～100mM，pH值为6.5～8.5的磷酸盐缓冲液。
(d2)浓度为50mM～4M，pH值为7.0～9.5的氯化铵/氨水缓冲液。
(d1)具体可为浓度为100mM，pH值为8.0的磷酸盐缓冲液。
(d2)具体可为浓度为1M，pH值为8.0的氯化铵/氨水缓冲液。
在本发明的一个实施例中，所述宿主细胞具体为大肠杆菌，更加具体的为E.coliBL21(DE3)。相应的，所述诱导培养为向培养体系中加IPTG至终浓度0.1-0.5mM(具体如0.1mM)，20-37℃(具体如20℃)诱导培养12-24h(具体如16h)。
在本发明中，所述酶A的辅酶具体可为氧化型辅酶I(即NAD+)或氧化型辅酶II(即NADP+)。所述酶B的辅酶具体为NADH或NADPH。
所述1，3-丁二醇在所述反应体系中浓度可为1-100mM(如20mM)。所述重组细胞在所述反应体系中的浓度可为50-500g/L(如100g/L)。所述粗酶液或粗酶粉在所述反应体系中的浓度可为10-50g/L(如20g/L)。所述纯酶在所述反应体系中的浓度可为0.1-2g/L(如0.5g/L)。所述NAD+在所述反应体系中的浓度可为0.1-2.0mM(如1.0mM)。
所述醇脱氢酶进行步骤(A)所述的催化反应体系组成如下：浓度为100mM磷酸盐缓冲液(pH值为8.0)，终浓度为1-10mM的1，3-丁二醇，终浓度为1mM的NAD+或NADP+，终浓度为2％的丙酮(v/v)，终浓度为10-40g/L的所述醇脱氢酶的粗酶液或粗酶粉。
所述胺脱氢酶或其突变体进行步骤(B)所述的催化反应体系组成如下：浓度为1M的氯化铵/氨水缓冲液(pH值为8.5)，终浓度为1-20mM的4-羟基-2-丁酮，终浓度为2g/L的GDH粗酶粉，终浓度为100mM的葡萄糖，终浓度为1mM的NAD+，终浓度为100g/L的所述胺脱氢酶或其突变体的全细胞。
当醇脱氢酶(或醇脱氢酶突变体)和胺脱氢酶(或胺脱氢酶突变体)全细胞催化反应的组成如下：浓度为1M的氯化铵/氨水缓冲液(pH值为8.0)、终浓度为20mM的1，3-丁二醇、终浓度为1mM的即NAD+、终浓度为1g/L的溶菌酶、终浓度为6U/mL的DNase I(脱氧核糖核酸酶)、终浓度为200g/L醇脱氢酶(或醇脱氢酶突变体)和胺脱氢酶(或胺脱氢酶突变体)共表达全细胞。
本发明还保护酶系统或其相关产品。
所述酶系统包括上述任一所述酶A和所述酶B。
所述相关产品可为能够表达所述酶系统中各酶的核酸分子，或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。
所述酶系统或其相关产品在合成手性(R)-3-氨基-1-丁醇中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明所提供的合成手性(R)-3-氨基-1-丁醇的方法中，存在辅因子自循环系统。所述辅因子再生系统为所述酶A催化1，3-丁二醇氧化成4-羟基-2-丁酮，NAD+被还原成NADH；所述酶B催化4-羟基-2-丁酮生成(R)-3-氨基-1-丁醇，NADH被氧化成NAD+，生成的NAD+重新参与到1，3-丁二醇生成4-羟基-2-丁酮的氧化。
本发明提供了一条全新的绿色生物合成路线，以廉价的1，3-丁二醇为原料，通过双酶共表达催化合成手性(R)-3-氨基-1-丁醇。本发明操作方便，具有产物光学纯度高等优点，在生物催化制备手性(R)-3-氨基-1-丁醇具有较好的工业应用前景。
附图说明
图1为醇脱氢酶偶联胺脱氢酶制备(R)-3-氨基-1-丁醇的反应示意图。
图2为醇脱氢酶的粗酶粉催化1，3-丁二醇生成4-羟基-2-丁酮反应的GC检测图谱。
图3为胺脱氢酶制备(R)-3-氨基-1-丁醇液相色谱HPLC检测结果。E：混旋3-氨基-1-丁醇标准品液相色谱结果；F：样品(R)-3-氨基-1-丁醇液相色谱结果。
图4为醇脱氢酶偶联胺脱氢酶制备(R)-3-氨基-1-丁醇液相色谱HPLC检测结果。G：混旋3-氨基-1-丁醇标准品液相色谱结果；H：样品(R)-3-氨基-1-丁醇液相色谱结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
下述实施例中，ADH1为来源于短小乳杆菌(Lactobacillus brevis KB290)的醇脱氢酶，氨基酸序列的Accession Number为BAN05992.1；ADH2为来源于高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacter brockii)的醇脱氢酶，氨基酸序列的Accession Number为CAA46053.1；ADH3为来源于固氮弧菌属(Aromatoleum aromaticum EbN1)的醇脱氢酶，氨基酸序列的Accession Number为CAI07428.1；ADH4为来源于链霉菌(Streptomycescoelicolor)的醇脱氢酶，氨基酸序列的Accession Number为Q9KYM4；ADH5为来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的醇脱氢酶，氨基酸序列的Accession Number为WP_003234015.1；ADH6为来源于肺炎克雷白杆菌(Klebsiella pneumoniae)的醇脱氢酶，氨基酸序列的Accession Number为WP_015958558.1；ADH7为来源于葡萄糖杆菌(Gluconobacteroxydans)的醇脱氢酶，氨基酸序列的Accession Number为WP_011253549.1；ADH8为来源于赖氏菌属(Leifsonia sp.S749)的醇脱氢酶，氨基酸序列的Accession Number为BAD99642.1；ADH9为来源于赤红球菌(Rhodococcus ruber)的醇脱氢酶，氨基酸序列的Accession Number为Q8KLT9；ADH10为来源于高加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus kefiriDSM20587)的醇脱氢酶，氨基酸序列的Accession Number为AAP94029.1；ADH11为来源于威吉利热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter wiegelii Rt8.B1)的醇脱氢酶，氨基酸序列的Accession Number为AEM77517.1；ADH12为来源于乳杆菌(Lactobacillus zymae DSM19395)的醇脱氢酶，氨基酸序列的Accession Number为KRL08675.1；ADH13为来源于酒球菌(Oenococcus alcoholitolerans)的醇脱氢酶，氨基酸序列的Accession Number为KGO31568.1；ADH14为来源于愈伤热球菌(Thermococcus guaymasensis)的醇脱氢酶，氨基酸序列的Accession Number为ADV18977.1；ADH15为来源于肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)的醇脱氢酶，氨基酸序列的Accession Number为WP_003399463.1；ADH16为来源于致黑脱硫肠状菌(Desulfotomaculum nigrificans)的醇脱氢酶，氨基酸序列的Accession Number为WP_003542410.1；ADH17为来源于一氧化碳嗜热窦菌(Thermosinuscarboxydivorans)的醇脱氢酶,氨基酸序列的Accession Number为WP_007290608.1；ADH18为来源于烷嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter mathranii)的醇脱氢酶，氨基酸序列的Accession Number为WP_013150923.1；ADH19为来源于梭菌属(Clostridium)的醇脱氢酶，氨基酸序列的Accession Number为WP_013239134.1；ADH20为来源于厚壁菌门细菌(Firmicutes bacterium CAG:137)的醇脱氢酶,氨基酸序列的Accession Number为CDB31037.1；ADH21为来源于拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)的醇脱氢酶，氨基酸序列的Accession Number为WP_026889046.1；ADH22为来源于梭菌属(Clostridium)的醇脱氢酶，氨基酸序列的Accession Number为WP_039771361.1；ADH23为来源于乙草甲烷菌(Methanosarcina acetivorans)的醇脱氢酶，氨基酸序列的Accession Number为WP_048065256.1；ADH24为来源于淡色甲烷菌(Methanosarcina lacustris)的醇脱氢酶，氨基酸序列的Accession Number为WP_048125376.1；ADH25为来源于甲烷八叠球菌(Methanosarcina thermophila)的醇脱氢酶，氨基酸序列的Accession Number为WP_048166386.1；ADH26为来源于西洋甲烷菌(Methanosarcina siciliae)的醇脱氢酶，氨基酸序列的Accession Number为WP_048172170.1；ADH27为来源于德氏葡萄球菌(Desnuesiellamassiliensis)的醇脱氢酶，氨基酸序列的Accession Number为WP_055668884.1；ADH28为来源于卡尔德氏杆菌(Caldanaerobacter subterraneus)的醇脱氢酶，氨基酸序列的Accession Number为KUK09008.1；ADH29为来源于钟氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)的醇脱氢酶，氨基酸序列的Accession Number为WP_063556461.1；ADH30为来源于拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)的醇脱氢酶，氨基酸序列的Accession Number为WP_065417405.1；ADH31为来源于未培养梭菌(uncultured Clostridium sp.)的醇脱氢酶，氨基酸序列的Accession Number为SCI81347.1；ADH32为来源于丝状孢子梭菌(Clostridiumtaeniosporum)的醇脱氢酶，氨基酸序列的Accession Number为WP_069679756.1；ADH33为来源于脱硫弧菌(Desulfovibrio litoralis)的醇脱氢酶，氨基酸序列的AccessionNumber为WP_072695399.1；ADH34为来源于脱硫肠状菌(Desulfotomaculum putei)的醇脱氢酶，氨基酸序列的Accession Number为WP_073236284.1；ADH35为来源于拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)的醇脱氢酶，氨基酸序列的Accession Number为WP_077844196.1；ADH36为来源于梭状芽胞杆菌(Clostridium puniceum)的醇脱氢酶，氨基酸序列的Accession Number为WP_077846831.1；ADH37为来源于二醇梭菌(Clostridiumdiolis)的醇脱氢酶，氨基酸序列的Accession Number为WP_087701616.1；ADH38为来源于匙形梭菌(Clostridium cochlearium)的醇脱氢酶，氨基酸序列的Accession Number为WP_089865926.1；ADH39为来源于笃斯梭菌(Clostridium uliginosum)的醇脱氢酶，氨基酸序列的Accession Number为WP_090093236.1；ADH40为来源于梭菌属细菌(Clostridialesbacterium SK-Y3)的醇脱氢酶，氨基酸序列的Accession Number为WP_094550774.1；ADH41为来源于近平滑假丝酵母(Clostridium botulinum)的醇脱氢酶，氨基酸序列的AccessionNumber为WP_096043277.1；AmDH1为来源于嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstereothermophilus)的胺脱氢酶，氨基酸序列为SEQ ID No.1；AmDH2为来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stereothermophilus)的胺脱氢酶，氨基酸序列为SEQ ID No.2；AmDH3为来源于嗜冷芽孢八叠球菌(Sporosarcina psychrophila)的胺脱氢酶，氨基酸序列为SEQID No.3；AmDH4为来源于球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)的胺脱氢酶，氨基酸序列为SEQ ID No.4；AmDH5为来源于西伯利亚微杆菌(Exiguobacteriumsibiricum)的胺脱氢酶的胺脱氢酶，氨基酸序列为SEQ ID No.5；AmDH6为来源于普通高温放线菌(Thermoactinomyces intermedius)的胺脱氢酶，氨基酸序列为SEQ ID No.6；AmDH7为来源于温泉热碱芽孢杆菌(Caldalkalibacillus thermarum)的胺脱氢酶，氨基酸序列为SEQ ID No.7；AmDH8为来源于糖莱斯氏菌(Laceyella sacchari)的胺脱氢酶，氨基酸序列为SEQ ID No.8；AmDH9为来源于栗褐芽孢杆菌(Bacillus badius)的胺脱氢酶，氨基酸序列为SEQ ID No.9；AmDH3-M1为将SEQ ID No.3所示的胺脱氢酶AmDH3的第114位和第291位依次突变为缬氨酸残基和半胱氨酸残基，得到的胺脱氢酶突变体；AmDH3-M2为将SEQ ID No.3所示的胺脱氢酶AmDH3的第111位、第114位、第294位依次突变为苯丙氨酸残基、缬氨酸残基和半胱氨酸残基，得到的胺脱氢酶突变体。
2×High-fidelity Master Mix为擎科生物科技有限公司的产品，货号为TP001。
1，3-丁二醇和4-羟基-2-丁酮均为上海阿拉丁生化科技股份有限公司的产品，货号依次为B111018和H106330。
混旋3-氨基-1-丁醇为上海韶远试剂，货号为SY030187。
本发明的发明人经过大量实验，建立了醇脱氢酶和胺脱氢酶级联催化合成手性(R)-3-氨基-1-丁醇的方法。醇脱氢酶偶联胺脱氢酶制备(R)-3-氨基-1-丁醇的反应示意图见图1。
实施例1、表达醇脱氢酶的工程菌和表达胺脱氢酶的工程菌的制备
分别将醇脱氢酶和胺脱氢酶的编码基因送到金开瑞生物科技有限公司合成(根据需要以大肠杆菌为宿主进行密码子优化)，将合成的基因连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体。本发明所述载体具体为pET28a，将pET28a的酶切识别位点NcoⅠ和XhoⅠ之间的DNA小片段替换为全基因合成后的相关酶的编码基因，得到重组表达载体。
将上述重组表达载体转化至合适的微生物宿主中。所述宿主微生物为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足上述重组表达载体稳定的自行复制以及醇脱氢酶或胺脱氢酶基因可被有效表达即可。其中，较佳的所述宿主微生物为大肠杆菌(Escherichia coli)，优选大肠杆菌BL21(DE3)，将前述重组表达载体转入E.coli BL21(DE3)中，可得到本发明的基因工程菌株。
利用定点突变方法得到醇脱氢酶基因的突变体，然后按照上述步骤，获得表达醇脱氢酶突变体的相应的基因工程菌株。
利用定点突变方法得到胺脱氢酶基因的突变体，然后按照上述步骤，获得表达胺脱氢酶突变体的相应的基因工程菌株。
实施例2、醇脱氢酶和胺脱氢酶共表达的工程菌的制备
将醇脱氢酶(或醇脱氢酶突变体)和胺脱氢酶(或胺脱氢酶突变体)的编码基因分别进行全基因合成(根据需要以大肠杆菌为宿主进行密码子优化)，将合成的基因连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体。本发明所述载体具体为pET28a。首先将pET28a的酶切识别位点NcoⅠ和XhoⅠ之间的DNA小片段替换为全基因合成后的醇脱氢酶的编码基因，得到中间载体；然后采用重组克隆试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号C112-02)将全基因合成后胺脱氢酶的编码基因连接到醇脱氢酶的编码基因之后，得到重组表达质粒。
将上述重组表达质粒转化至合适的微生物宿主中。所述宿主微生物为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足上述重组表达质粒稳定的自行复制以及醇脱氢酶基因和胺脱氢酶基因可被有效表达即可。其中，较佳的所述宿主微生物为大肠杆菌(Escherichiacoli)，优选大肠杆菌BL21(DE3)，将前述重组表达质粒转入E.coli BL21(DE3)中，即可得到本发明的基因工程菌株。
实施例3、醇脱氢酶和胺脱氢酶的表达或共表达及全细胞、粗酶的制备
1、将实施例1构建的重组表达载体或实施例2构建的重组表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得重组细胞。
2、挑取转化子至含有50μg/mL卡那霉素的5mL LB液体培养基中，37℃、220rpm震荡过夜12h，再按照体积百分含量1％接种量接种到含有50μg/mL卡那霉素的TB液体培养基中，37℃培养至OD600nm为0.7时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，20℃、220rpm诱导表达12h后，4℃、4000rpm离心10min，收集沉淀菌体(即全细胞)，并将收集的菌体用磷酸盐缓冲液(50mmol/L，pH 7.4)重悬，得到菌体悬液；之后在冰浴条件下超声破碎菌体细胞，得到破碎后的样品(即为粗酶液)。
3、将粗酶液于4℃、8000rpm离心30min，收集上清，所得上清液置于-80℃冷冻后再用真空干燥仪冷冻干燥，获得粗酶粉。
实施例4、醇脱氢酶或醇脱氢酶突变体催化1，3-丁二醇生成4-羟基-2-丁酮
用实施例3制备的醇脱氢酶或醇脱氢酶突变体的粗酶粉催化1，3-丁二醇生成4-羟基-2-丁酮。
在反应体系中依次加入浓度为100mM磷酸盐缓冲液(pH值为8.0)、终浓度为5mM的1，3-丁二醇、终浓度为1mM的NAD+或NADP+、终浓度为2％的丙酮(v/v)和终浓度为10-40g/L的醇脱氢酶或醇脱氢酶突变体的粗酶粉。将该反应体系在30℃的条件下反应24h后，对产物进行气相色谱(GC)检测。
气相色谱(GC)的检测条件如下：色谱柱：Rtx-1(25×0.32mm ID)；升温程序：80℃，保留3分钟；5℃/min升温到120℃，保留4分钟；分流比：20:1；色谱柱流量：1mL/min；进样量：2μL；运行时间：15分钟。
醇脱氢酶的粗酶粉催化1，3-丁二醇生成4-羟基-2-丁酮反应的GC检测结果图谱见图2(A为混旋1，3-丁二醇标准品气相色谱结果，B为4-羟基-2-丁酮标准品气相色谱结果，C为混旋1，3-丁二醇和4-羟基-2-丁酮标准品气相色谱结果，D为样品底物1，3-丁二醇和中间产物4-羟基-2-丁酮的气相色谱结果)。
计算转化率，检测结果如表1所示。结果表明，醇脱氢酶和醇脱氢酶突变体均能够催化1,3-丁二醇生成4-羟基-2-丁酮，转化率为8-99％。
表1.醇脱氢酶和醇脱氢酶突变体催化1，3-丁二醇生成4-羟基-2-丁酮的转化率结果
名称 转化率(％) 名称 转化率(％)
ADH1 43 ADH22 46
ADH2 99 ADH23 9
ADH3 52 ADH24 12
ADH4 60 ADH25 87
ADH5 55 ADH26 13
ADH6 54 ADH27 60
ADH7 59 ADH28 11
ADH8 60 ADH29 54
ADH9 51 ADH30 15
ADH10 57 ADH31 12
ADH11 31 ADH32 20
ADH12 16 ADH33 25
ADH13 40 ADH34 40
ADH14 99 ADH35 75
ADH15 12 ADH36 51
ADH16 92 ADH37 69
ADH17 14 ADH38 11
ADH18 99 ADH39 46
ADH19 8 ADH40 9
ADH20 15 ADH41 12
ADH21 15
注：转化率＝A1/A2×100％；A1：气相色谱分析获得的样品1，3-丁二醇或4-羟基-2-丁酮峰面积值；A2：液相色谱分析获得的标准品1，3-丁二醇或4-羟基-2-丁酮的峰面积值。
实施例5、胺脱氢酶或胺脱氢酶突变体全细胞催化4-羟基-2-丁酮生成(R)-3-氨基-1-丁醇
用实施例3制备的胺脱氢酶或胺脱氢酶突变体全细胞催化4-羟基-2-丁酮生成(R)-3-氨基-1-丁醇。
1、在反应体系中依次加入浓度为1M的氯化铵/氨水缓冲液(pH值为8.5)、终浓度为20mM的4-羟基-2-丁酮、终浓度为2g/L的GDH粗酶粉、终浓度为100mM的葡萄糖、终浓度为1mM的NAD+和终浓度为100g/L的胺脱氢酶或胺脱氢酶突变体的全细胞。将该反应体系在30℃的条件下反应24h，得到反应液。
2、将300μL 0.4mol/L硼酸缓冲液(pH 9.5)、150μL超纯水、200μL衍生剂和100μL反应液充分混匀并静置2分钟，然后12000rpm离心10分钟，收集上清并用滤膜过滤。
衍生剂：将0.343g邻苯二甲醛、5mL无水乙醇、0.147g N-乙酰-L半胱氨酸和适量0.4mol/L硼酸缓冲液(pH 9.5)混合，然后用0.4mol/L硼酸缓冲液(pH 9.5)定容至25mL，避光备用。
3、对滤液进行HPLC检测。
HPLC检测条件为：Agilent SB-Aq C18柱(4.6*250mm，5μm)；检测波长334nm；柱温：35℃，流速：1mL/min，上样量：10μL；梯度洗脱程序如表2所示。
表2.HPLC的梯度洗脱程序
时间(min) 流动相(甲醇)％ 流动相(0.05mol/L乙酸钠)％
0-6(不包括6) 30 70
6-7(包括6，不包括7) 30 70
7-15(包括7，不包括15) 45 55
15-15.5(包括15，不包括15.5) 45 55
15.5-20(包括15.5和20) 30 70
注：表中的％表示体积百分含量。
胺脱氢酶催化还原4-羟基-2-丁酮生成(R)-3-氨基-1-丁醇反应的HPLC检测结果图谱如图3所示(E为混旋3-氨基-1-丁醇标准品液相色谱结果，F为样品(R)-3-氨基-1-丁醇液相色谱结果)。
计算转化率，部分HPLC检测结果如表3所示。结果表明，胺脱氢酶或其突变体全细胞可以不对称还原催化4-羟基-2-丁酮生成(R)-3-氨基-1-丁醇，转化率为5-36％，立体选择性大于99％(R)。
表3.胺脱氢酶及其突变体全细胞催化4-羟基-2-丁酮生成(R)-3-氨基-1-丁醇的转化率结果
名称 转化率(％) ee(％)
AmDH1 36 >99(R)
AmDH2 20 >99(R)
AmDH3 23 >99(R)
AmDH3-M1 20 >99(R)
AmDH3-M2 29 >99(R)
AmDH4 26 >99(R)
AmDH5 23 >99(R)
AmDH6 ＜5 >99(R)
AmDH7 ＜5 >99(R)
AmDH8 ＜5 >99(R)
AmDH9 ＜5 >99(R)
注：转化率＝A1/A2×100％；A1：液相色谱分析获得的(R)-3-氨基-1-丁醇峰面积值；A2：液相色谱分析获得的标准品(R)-3-氨基-1-丁醇的峰面积值；ee(立体选择性)＝(AS-AR)/(AS+AR)×100％；AS：液相色谱分析获得的(S)-3-氨基-1-丁醇的峰面积值；AR：液相色谱分析获得的(R)-3-氨基-1-丁醇的峰面积值。
实施例6、醇脱氢酶(或醇脱氢酶突变体)和胺脱氢酶(或胺脱氢酶突变体)共表达全细胞催化1，3-丁二醇生成(R)-3-氨基-1-丁醇
用实施例3制备的醇脱氢酶(或醇脱氢酶突变体)和胺脱氢酶(或胺脱氢酶突变体)全细胞催化1，3-丁二醇生成(R)-3-氨基-1-丁醇。
1、在反应体系中依次加入浓度为1M的氯化铵/氨水缓冲液(pH值为8.0)、终浓度为20mM的1，3-丁二醇、终浓度为1mM的即NAD+、终浓度为1g/L的溶菌酶、终浓度为6U/mL的DNase I(脱氧核糖核酸酶)、终浓度为200g/L醇脱氢酶(或醇脱氢酶突变体)和胺脱氢酶(或胺脱氢酶突变体)共表达全细胞。将该反应体系在30℃的条件下反应24h，得到反应液。
2、将50μL反应液、50μL 1mol/L氯化铵/氨水缓冲液(pH 8.5)和500μL乙腈充分混匀，然后过滤。
3、将20μL步骤2得到的滤液、20μL Marfey’s试剂(浓度为14mmol/L，溶剂为乙腈)、36μL NaHCO3(浓度为1mol/L)和100μL DMSO混匀，40℃、1000rpm反应2h后，加入40μL HCl(浓度为1mol/L)终止反应，得到反应液。
4、将步骤3得到的反应液进行HPLC检测。
HPLC检测条件为：Zorbax SB-C18柱(4.6×150mm，5μm)；检测波长340nm；柱温：25℃；流速：1mL/min；上样量：10μL；流动相A：超纯水(0.1％三氟乙酸)，流动相B：甲醇(0.1％三氟乙酸)。洗脱程序：60％A/40％B；40％B保留6分钟；在9分钟内增加B到60％，保留3分钟；在2分钟内减少B到40％，保留5分钟。
醇脱氢酶(或醇脱氢酶突变体)和胺脱氢酶(或胺脱氢酶突变体)共表达全细胞催化1，3-丁二醇生成(R)-3-氨基-1-丁醇的HPLC检测结果图谱如图4所示。
计算转化率，部分HPLC检测结果如表4所示。结果表明，醇脱氢酶(或醇脱氢酶突变体)和胺脱氢酶(或胺脱氢酶突变体)可以共表达全细胞形式催化1，3-丁二醇生成(R)-3-氨基-1-丁醇，转化率为9-38％，立体选择性大于99％(R)。
表4.醇脱氢酶(或醇脱氢酶突变体)和胺脱氢酶(或胺脱氢酶突变体)共表达全细胞催化1，3-丁二醇生成(R)-3-氨基-1-丁醇的转化率结果
名称 转化率(％) ee(％)
ADH4-AmDH1 18 >99(R)
ADH4-AmDH2 9 >99(R)
ADH4-AmDH3 15 >99(R)
ADH4-AmDH4 20 >99(R)
ADH14-AmDH1 32 >99(R)
ADH14-AmDH2 16 >99(R)
ADH14-AmDH3 28 >99(R)
ADH14-AmDH4 35 >99(R)
ADH18-AmDH1 35 >99(R)
ADH18-AmDH2 18 >99(R)
ADH18-AmDH3 26 >99(R)
ADH18-AmDH4 38 >99(R)
注：转化率＝A1/A2×100％；A1：液相色谱分析获得的(R)-3-氨基-1-丁醇峰面积值；A2：液相色谱分析获得的标准品(R)-3-氨基-1-丁醇的峰面积值；ee(立体选择性)＝(AS-AR)/(AS+AR)×100％；AS：液相色谱分析获得的(S)-3-氨基-1-丁醇的峰面积值；AR：液相色谱分析获得的(R)-3-氨基-1-丁醇的峰面积值。
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 一种双酶级联催化合成(R)-3-氨基-1-丁醇的方法
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 429
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 1
Met Glu Leu Phe Lys Tyr Met Glu Thr Tyr Asp Tyr Glu Gln Val Leu
1 5 10 15
Phe Cys Gln Asp Lys Glu Ser Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Ile His
20 25 30
Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Thr Arg Met Trp Met Tyr
35 40 45
Asn Ser Glu Glu Glu Ala Leu Glu Asp Ala Leu Arg Leu Ala Arg Gly
50 55 60
Met Thr Tyr Ser Asn Ala Ala Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly Gly Lys
65 70 75 80
Thr Val Ile Ile Gly Asp Pro Arg Lys Asp Lys Asn Glu Ala Met Phe
85 90 95
Arg Ala Phe Gly Arg Phe Ile Gln Gly Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Thr
100 105 110
Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Val Ala Asp Met Asp Ile Ile Tyr Gln
115 120 125
Glu Thr Asp Tyr Val Thr Gly Ile Ser Pro Glu Phe Gly Ser Ser Gly
130 135 140
Asn Pro Ser Pro Ala Thr Ala Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met Lys Ala
145 150 155 160
Ala Ala Lys Glu Ala Phe Gly Ser Asp Ser Leu Glu Gly Lys Val Val
165 170 175
Ala Val Gln Gly Val Gly Asn Val Ala Tyr His Leu Cys Arg His Leu
180 185 190
His Glu Glu Gly Ala Lys Leu Ile Val Thr Asp Ile Asn Lys Glu Val
195 200 205
Val Ala Arg Ala Val Glu Glu Phe Gly Ala Lys Ala Val Asp Pro Asn
210 215 220
Asp Ile Tyr Gly Val Glu Cys Asp Ile Phe Ala Pro Cys Ala Leu Gly
225 230 235 240
Gly Ile Ile Asn Asp Gln Thr Ile Pro Gln Leu Lys Ala Lys Val Ile
245 250 255
Ala Gly Ser Ala Leu Asn Gln Leu Lys Glu Pro Arg His Gly Asp Ile
260 265 270
Ile His Glu Met Gly Ile Val Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Ile Asn Ala
275 280 285
Gly Gly Val Ile Asn Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Tyr Asn Arg Glu
290 295 300
Arg Ala Met Lys Lys Ile Glu Gln Ile Tyr Asp Asn Ile Glu Lys Val
305 310 315 320
Phe Ala Ile Ala Lys Arg Asp Asn Ile Pro Thr Tyr Val Ala Ala Asp
325 330 335
Arg Met Ala Glu Glu Arg Ile Glu Thr Met Arg Lys Ala Ala Ser Gln
340 345 350
Phe Leu Gln Asn Gly His His Ile Leu Ser Arg Arg Pro Arg Pro Leu
355 360 365
Thr Ala Ala Arg Ala Gly Leu Arg Arg Ala Asp Asp Gly Gly Thr Thr
370 375 380
Thr Met Gln Glu Gln Lys Phe Arg Ile Leu Thr Ile Asn Pro Gly Ser
385 390 395 400
Thr Ser Thr Lys Ile Gly Val Phe Glu Asn Glu Arg Ala Ile Ala Ser
405 410 415
Lys Lys Arg Ser Ala Thr Arg Ala Gly Ala Ser Ala Ile
420 425
<210> 2
<211> 366
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 2
Met Thr Leu Glu Ile Phe Glu Tyr Leu Glu Lys Tyr Asp Tyr Glu Gln
1 5 10 15
Val Val Phe Cys Gln Asp Lys Glu Ser Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala
20 25 30
Ile His Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Thr Arg Met Trp
35 40 45
Thr Tyr Asp Ser Glu Glu Ala Ala Ile Glu Asp Ala Leu Arg Leu Ala
50 55 60
Lys Gly Met Thr Tyr Ser Asn Ala Ala Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly
65 70 75 80
Ala Lys Thr Val Ile Ile Gly Asp Pro Arg Lys Asp Lys Ser Glu Ala
85 90 95
Met Phe Arg Ala Leu Gly Arg Tyr Ile Gln Gly Leu Asn Gly Arg Tyr
100 105 110
Ile Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Val Asp Asp Met Asp Ile Ile
115 120 125
His Glu Glu Thr Asp Phe Val Thr Gly Ile Ser Pro Ser Phe Gly Ser
130 135 140
Ser Gly Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met
145 150 155 160
Lys Ala Ala Ala Lys Glu Ala Phe Gly Thr Asp Asn Leu Glu Gly Lys
165 170 175
Val Ile Ala Val Gln Gly Val Gly Asn Val Ala Tyr His Leu Cys Lys
180 185 190
His Leu His Ala Glu Gly Ala Lys Leu Ile Val Thr Asp Ile Asn Lys
195 200 205
Glu Ala Val Gln Arg Ala Val Glu Glu Phe Gly Ala Ser Ala Val Glu
210 215 220
Pro Asn Glu Ile Tyr Gly Val Glu Cys Asp Ile Tyr Ala Pro Cys Ala
225 230 235 240
Leu Gly Ala Thr Val Asn Asp Glu Thr Ile Pro Gln Leu Lys Ala Lys
245 250 255
Val Ile Ala Gly Ser Ala Leu Asn Gln Leu Lys Glu Asp Arg His Gly
260 265 270
Asp Ile Ile His Glu Met Gly Ile Val Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Ile
275 280 285
Asn Ala Gly Gly Val Ile Asn Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Tyr Asn
290 295 300
Arg Glu Arg Ala Leu Lys Arg Val Glu Ser Ile Tyr Asp Thr Ile Ala
305 310 315 320
Lys Val Ile Glu Ile Ser Lys Arg Asp Gly Ile Ala Thr Tyr Val Ala
325 330 335
Ala Asp Arg Leu Ala Glu Glu Arg Ile Ala Ser Leu Lys Asn Ser Arg
340 345 350
Ser Thr Tyr Leu Arg Asn Gly His Asp Ile Ile Ser Arg Arg
355 360 365
<210> 3
<211> 364
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 3
Met Glu Ile Phe Lys Tyr Met Glu His Gln Asp Tyr Glu Gln Leu Val
1 5 10 15
Ile Cys Gln Asp Lys Ala Ser Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Ile His
20 25 30
Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Thr Arg Met Trp Thr Tyr
35 40 45
Ala Ser Glu Glu Glu Ala Ile Glu Asp Ala Leu Arg Leu Ala Arg Gly
50 55 60
Met Thr Tyr Ser Asn Ala Ala Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly Gly Lys
65 70 75 80
Thr Val Ile Ile Gly Asn Pro Lys Thr Asp Lys Asn Asp Glu Met Phe
85 90 95
Arg Ala Phe Gly Arg Tyr Ile Glu Gly Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Thr
100 105 110
Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ala Asp Met Asp Leu Ile Asn Leu
115 120 125
Glu Thr Asp Tyr Val Thr Gly Thr Ser Ala Gly Ala Gly Ser Ser Gly
130 135 140
Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala Tyr Gly Ile Tyr Tyr Gly Met Lys Ala
145 150 155 160
Ala Ala Lys Glu Ala Phe Gly Asp Asp Ser Leu Ala Gly Lys Thr Val
165 170 175
Ala Val Gln Gly Val Gly Asn Val Ala Tyr Ala Leu Cys Glu Tyr Leu
180 185 190
His Glu Glu Gly Ala Lys Leu Ile Ile Thr Asp Ile Asn Glu Glu Ala
195 200 205
Val Gln Arg Ala Val Asp Ala Phe Gly Ala Thr Ala Val Gly Ile Asn
210 215 220
Glu Ile Tyr Ser Gln Glu Ala Asp Ile Phe Ala Pro Cys Ala Leu Gly
225 230 235 240
Ala Ile Ile Asn Asp Glu Thr Ile Pro Gln Leu Lys Ala Lys Val Ile
245 250 255
Ala Gly Ser Ala Leu Asn Gln Leu Lys Glu Thr Arg His Gly Asp Leu
260 265 270
Ile His Glu Met Gly Ile Val Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Ile Asn Ser
275 280 285
Gly Gly Val Ile Asn Val Ala Asp Glu Leu Asp Gly Tyr Asn Arg Glu
290 295 300
Arg Ala Leu Lys Arg Val Glu Gly Ile Tyr Asp Val Ile Gly Lys Ile
305 310 315 320
Phe Ala Ile Ser Lys Arg Asp Asn Ile Pro Thr Tyr Val Ala Ala Asp
325 330 335
Arg Met Ala Glu Glu Arg Ile Ala Arg Val Ala Asn Thr Arg Ser Thr
340 345 350
Phe Leu Gln Asn Glu Lys Ser Val Leu Ser Arg Arg
355 360
<210> 4
<211> 362
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 4
Met Glu Ile Phe Lys Tyr Met Glu Lys Tyr Asp Tyr Glu Gln Leu Val
1 5 10 15
Phe Cys Gln Asp Glu Ala Ser Gly Leu Lys Ala Val Ile Ala Ile His
20 25 30
Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Ala Arg Met Trp Thr Tyr
35 40 45
Ala Ser Glu Glu Asn Ala Val Glu Asp Ala Leu Arg Leu Ala Arg Gly
50 55 60
Met Thr Tyr Ser Asn Ala Ala Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly Gly Lys
65 70 75 80
Thr Val Ile Ile Gly Asp Pro Phe Lys Asp Lys Asn Glu Glu Met Phe
85 90 95
Arg Ala Leu Gly Arg Phe Ile Gln Gly Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Thr
100 105 110
Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Val Thr Asp Met Asp Leu Ile His Glu
115 120 125
Glu Thr Asp Tyr Val Thr Gly Ile Ser Pro Ala Phe Gly Ser Ser Gly
130 135 140
Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met Lys Ala
145 150 155 160
Ala Ala Lys Glu Ala Phe Gly Ser Glu Ser Leu Glu Gly Leu Lys Ile
165 170 175
Ser Val Gln Gly Leu Gly Asn Val Ala Tyr Lys Leu Cys Glu Tyr Leu
180 185 190
His Asn Glu Gly Ala Lys Leu Val Val Thr Asp Ile Asn Gln Ala Ala
195 200 205
Ile Asp Arg Val Val Asn Asp Phe Asp Ala Ile Ala Val Ala Pro Asp
210 215 220
Glu Ile Tyr Ala Gln Glu Val Asp Ile Phe Ser Pro Cys Ala Leu Gly
225 230 235 240
Ala Ile Leu Asn Asp Glu Thr Ile Pro Gln Leu Lys Ala Lys Val Ile
245 250 255
Ala Gly Ser Ala Leu Asn Gln Leu Lys Asp Ser Arg His Gly Asp Phe
260 265 270
Leu His Glu Leu Gly Ile Val Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Ile Asn Ala
275 280 285
Gly Gly Val Ile Asn Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Tyr Asn Arg Glu
290 295 300
Arg Ala Leu Lys Arg Val Asp Gly Ile Tyr Asp Ser Ile Glu Lys Ile
305 310 315 320
Phe Ala Ile Ser Lys Arg Asp Gly Ile Pro Thr Tyr Val Ala Ala Asn
325 330 335
Arg Leu Ala Glu Glu Arg Ile Ala Arg Val Ala Lys Ser Arg Ser Gln
340 345 350
Phe Leu Lys Asn Glu Lys Asn Ile Leu His
355 360
<210> 5
<211> 374
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 5
Met Val Glu Thr Asn Val Glu Ala Arg Phe Ser Ile Phe Glu Thr Met
1 5 10 15
Ala Met Glu Asp Tyr Glu Gln Val Val Phe Cys His Asp Lys Val Ser
20 25 30
Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Ile His Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala
35 40 45
Leu Gly Gly Leu Arg Met Trp Asn Tyr Ala Ser Asp Glu Glu Ala Leu
50 55 60
Ile Asp Ala Leu Arg Leu Ala Lys Gly Met Thr Tyr Ser Asn Ala Ala
65 70 75 80
Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly Gly Lys Ala Val Ile Ile Gly Asp Ala
85 90 95
Lys Thr Gln Lys Ser Glu Ala Leu Phe Arg Ala Phe Gly Arg Tyr Val
100 105 110
Gln Ser Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Thr Ala Glu Asp Val Asn Thr Thr
115 120 125
Val Ala Asp Met Asp Tyr Ile His Met Glu Thr Asp Phe Val Thr Gly
130 135 140
Val Ser Pro Ala Phe Gly Ser Ser Gly Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala
145 150 155 160
Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met Lys Ala Ala Ala Lys Glu Val Tyr Gly
165 170 175
Thr Asp Ser Leu Gly Gly Lys Thr Val Ala Ile Gln Gly Val Gly Asn
180 185 190
Val Ala Phe Asn Leu Cys Arg His Leu His Glu Glu Gly Ala Lys Leu
195 200 205
Ile Val Thr Asp Ile Asn Gln Asp Ala Leu Arg Arg Ala Glu Glu Ala
210 215 220
Phe Gly Ala Leu Val Val Gly Pro Asp Glu Ile Tyr Ser Val Asp Ala
225 230 235 240
Asp Ile Phe Ala Pro Cys Ala Leu Gly Ala Thr Leu Asn Asp Glu Thr
245 250 255
Ile Pro Gln Leu Lys Val Lys Ile Ile Ala Gly Ala Ala Leu Asn Gln
260 265 270
Leu Lys Glu Asp Arg His Gly Asp Met Leu Gln Glu Arg Gly Ile Leu
275 280 285
Tyr Thr Pro Asp Phe Val Ile Asn Ala Gly Gly Val Ile Asn Val Ala
290 295 300
Asp Glu Leu Asp Gly Tyr Asn Arg Glu Arg Ala Met Lys Lys Val Glu
305 310 315 320
Leu Val Tyr Asp Ala Val Ala Lys Val Ile Glu Ile Ala Lys Arg Asp
325 330 335
His Leu Pro Thr Tyr Arg Ala Ala Glu Lys Met Ala Glu Glu Arg Ile
340 345 350
Ala Thr Met Gly Ser Ala Arg Ser Gln Phe Leu Arg Arg Asp Lys Asn
355 360 365
Ile Leu Gly Ser Arg Gly
　　370
<210> 6
<211> 366
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 6
Met Lys Ile Phe Asp Tyr Met Glu Lys Tyr Asp Tyr Glu Gln Leu Val
1 5 10 15
Met Cys Gln Asp Lys Glu Ser Gly Leu Lys Ala Ile Ile Cys Ile His
20 25 30
Val Thr Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Met Arg Met Trp Thr Tyr
35 40 45
Ala Ser Glu Glu Glu Ala Ile Glu Asp Ala Leu Arg Leu Gly Arg Gly
50 55 60
Met Thr Tyr Ser Asn Ala Ala Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly Gly Lys
65 70 75 80
Thr Val Ile Ile Gly Asp Pro Arg Lys Asp Lys Asn Glu Ala Met Phe
85 90 95
Arg Ala Leu Gly Arg Phe Ile Gln Gly Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Thr
100 105 110
Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Val Glu Asp Met Asp Ile Ile His Glu
115 120 125
Glu Thr Arg Tyr Val Thr Gly Val Ser Pro Ala Phe Gly Ser Ser Gly
130 135 140
Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met Lys Ala
145 150 155 160
Ala Ala Lys Glu Ala Phe Gly Asp Asp Ser Leu Glu Gly Lys Val Val
165 170 175
Ala Val Gln Gly Val Gly His Val Ala Tyr Glu Leu Cys Lys His Leu
180 185 190
His Asn Glu Gly Ala Lys Leu Ile Val Thr Asp Ile Asn Lys Glu Asn
195 200 205
Ala Asp Arg Ala Val Gln Glu Phe Gly Ala Glu Phe Val His Pro Asp
210 215 220
Lys Ile Tyr Asp Val Glu Cys Asp Ile Phe Ala Pro Cys Ala Leu Gly
225 230 235 240
Ala Ile Ile Asn Asp Glu Thr Ile Glu Arg Leu Lys Cys Lys Val Val
245 250 255
Ala Gly Ser Ala Leu Asn Gln Leu Lys Glu Glu Arg His Gly Lys Met
260 265 270
Leu Glu Glu Lys Gly Ile Val Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Ile Asn Ala
275 280 285
Gly Gly Val Ile Asn Val Ala Asp Glu Leu Leu Gly Tyr Asn Arg Glu
290 295 300
Arg Ala Met Lys Lys Val Glu Gly Ile Tyr Asp Lys Ile Leu Lys Val
305 310 315 320
Phe Glu Ile Ala Lys Arg Asp Gly Ile Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Asp
325 330 335
Arg Met Ala Glu Glu Arg Ile Glu Met Met Arg Lys Thr Arg Ser Thr
340 345 350
Phe Leu Gln Asp Gln Arg Asn Leu Ile Asn Phe Asn Asn Lys
355 360 365
<210> 7
<211> 370
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 7
Met Ser Thr Val Thr Phe Asp Gln Ile Ser Glu His Glu Gln Val Met
1 5 10 15
Phe Cys Asn Asp Pro His Thr Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Ile His
20 25 30
Asn Thr Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Cys Arg Met Leu Pro Tyr
35 40 45
Lys Ser Glu Glu Glu Ala Leu Thr Asp Val Leu Arg Leu Ser Lys Gly
50 55 60
Met Thr Tyr Ser Cys Val Ala Ala Asp Val Asp Phe Gly Gly Gly Lys
65 70 75 80
Ala Val Ile Ile Gly Asp Pro Arg Lys Asp Lys Thr Pro Glu Leu Phe
85 90 95
Arg Ala Phe Gly Gln Phe Val Gln Ser Leu Asn Gly Arg Phe Tyr Thr
100 105 110
Gly Thr Asp Met Gly Thr Thr Pro Glu Asp Phe Val Gln Ala Tyr Lys
115 120 125
Glu Thr Ser Phe Ile Val Gly Leu Pro Glu Glu Tyr Gly Gly Asn Gly
130 135 140
Asp Ser Ser Val Thr Thr Ala Phe Gly Val Met Gln Gly Leu Arg Ala
145 150 155 160
Val Ser Gln Phe Leu Trp Gly Thr Asp Val Leu Thr Glu Arg Val Phe
165 170 175
Ala Val Gln Gly Leu Gly Lys Val Gly Phe Lys Val Ala Glu Gly Leu
180 185 190
Leu Lys Glu Gly Ala Asn Val Tyr Val Thr Asp Val Asp Pro Glu Thr
195 200 205
Ile Ala Lys Leu Glu Glu Lys Ala Tyr Gln Tyr Pro Gly His Val Gln
210 215 220
Ala Val Thr Ala Asp Asp Ile Tyr Gly Val Gly Ala Asp Val Phe Val
225 230 235 240
Pro Cys Ala Ile Gly Gly Ile Ile Asn Asp Glu Thr Ile Glu Arg Leu
245 250 255
Lys Val Lys Ala Val Cys Gly Ala Ala Leu Asn Gln Leu Leu Glu Asp
260 265 270
Arg His Gly Lys Val Leu Gln Ala Lys Asn Ile Leu Tyr Ala Pro Asp
275 280 285
Tyr Ile Val Asn Ala Gly Gly Leu Ile Gln Val Ser Asp Glu Leu Tyr
290 295 300
Gly Pro Asn Lys Ala Arg Val Leu Lys Lys Thr Arg Ala Leu Tyr Asp
305 310 315 320
Thr Leu Phe Glu Ile Phe Gln Ser Ala Glu Lys Lys Ala Val Ser Thr
325 330 335
Val Glu Ala Ala Asn Gln Phe Val Glu Glu Arg Leu Gln Lys Arg Ala
340 345 350
Arg Leu Asn Ser Phe Phe Ser Pro Asp Asn Pro Pro Lys Trp Arg Val
355 360 365
Arg Arg
370
<210> 8
<211> 366
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 8
Met Lys Ile Phe Glu Tyr Met Gly Lys Tyr Asp Tyr Glu Gln Leu Val
1 5 10 15
Leu Cys His Asp Glu Gln Ser Gly Leu Lys Ala Ile Ile Cys Ile His
20 25 30
Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Thr Arg Met Trp Thr Tyr
35 40 45
Asp Ser Glu Asp Ala Ala Ile Glu Asp Ala Leu Arg Leu Ala Arg Gly
50 55 60
Met Thr Tyr Ser Asn Ala Ala Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly Gly Lys
65 70 75 80
Thr Val Val Ile Gly Asp Pro Lys Lys Asp Lys Ser Glu Ala Leu Phe
85 90 95
Arg Ala Leu Gly Arg Tyr Ile Gln Gly Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Thr
100 105 110
Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Val Glu Asp Met Asp Ile Ile Arg Glu
115 120 125
Glu Thr Lys Tyr Val Thr Gly Val Ser Pro Ala Phe Gly Ser Ser Gly
130 135 140
Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala Tyr Gly Val Tyr Lys Gly Met Lys Ala
145 150 155 160
Ala Ser Lys Val Ala Phe Gly Glu Asp Ser Leu Lys Gly Lys Val Val
165 170 175
Ala Val Gln Gly Val Gly His Val Ala Tyr Asn Leu Cys Lys His Leu
180 185 190
His Ala Glu Gly Ala Lys Leu Ile Val Thr Asp Ile Asn Gln Ala Asn
195 200 205
Gly Asp Arg Ala Val Gln Glu Phe Gly Ala Glu Ala Val Ser Pro Asp
210 215 220
Lys Ile Tyr Asp Val Asp Cys Asp Ile Phe Ser Pro Cys Ala Leu Gly
225 230 235 240
Ala Ile Ile Asn Asp Glu Thr Ile Glu Arg Leu Thr Cys Lys Val Val
245 250 255
Ala Gly Ala Ala Leu Asn Gln Leu Lys Glu Glu Lys His Gly Glu Met
260 265 270
Leu Glu Gln Lys Gly Ile Ile Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Ile Asn Ala
275 280 285
Gly Gly Val Ile Asn Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Tyr Asn Arg Asp
290 295 300
Arg Ala Met Lys Arg Val Glu Thr Ile Tyr Asp Asn Met Leu Lys Val
305 310 315 320
Phe Glu Ile Ala Lys Arg Asp Gly Ile Pro Ser Tyr Lys Ala Ala Asp
325 330 335
Arg Met Ala Glu Glu Arg Ile Ala Ala Met Arg Lys Thr Arg Ser Thr
340 345 350
Phe Leu Val Asn Gly Gln Ser Ile Leu Ser His Arg Leu Glu
355 360 365
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<211> 380
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 9
Met Ser Leu Val Glu Lys Thr Ser Ile Ile Lys Asp Phe Thr Leu Phe
1 5 10 15
Glu Lys Met Ser Glu His Glu Gln Val Val Phe Cys Asn Asp Pro Ala
20 25 30
Thr Gly Leu Arg Ala Ile Ile Ala Ile His Asp Thr Thr Leu Gly Pro
35 40 45
Ala Leu Gly Gly Cys Arg Met Gln Pro Tyr Asn Ser Val Glu Glu Ala
50 55 60
Leu Glu Asp Ala Leu Arg Leu Ser Lys Gly Met Thr Tyr Ser Cys Ala
65 70 75 80
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85 90 95
Pro Gln Lys Asp Lys Ser Pro Glu Leu Phe Arg Ala Phe Gly Gln Phe
100 105 110
Val Asp Ser Leu Gly Gly Arg Phe Tyr Thr Gly Thr Asp Met Gly Thr
115 120 125
Asn Met Glu Asp Phe Ile His Ala Met Lys Glu Thr Asn Cys Ile Val
130 135 140
Gly Val Pro Glu Ala Tyr Gly Gly Gly Gly Asp Ser Ser Ile Pro Thr
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Lys Ala Lys Thr Thr Ser Gly Ser Val Thr Val Val Ala Ser Asp Glu
225 230 235 240
Ile Tyr Ser Gln Glu Ala Asp Val Phe Val Pro Cys Ala Phe Gly Gly
245 250 255
Val Val Asn Asp Glu Thr Met Lys Gln Phe Lys Val Lys Ala Ile Ala
260 265 270
Gly Ser Ala Leu Asn Gln Leu Leu Thr Glu Asp His Gly Arg His Leu
275 280 285
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290 295 300
Gly Leu Ile Gln Val Ala Asp Glu Leu Tyr Glu Val Asn Lys Glu Arg
305 310 315 320
Val Leu Ala Lys Thr Lys His Ile Tyr Asp Ala Ile Leu Glu Val Tyr
325 330 335
Gln Gln Ala Glu Leu Asp Gln Ile Thr Thr Met Glu Ala Ala Asn Arg
340 345 350
Met Cys Glu Gln Arg Met Ala Ala Arg Gly Arg Arg Asn Ser Phe Phe
355 360 365
Thr Ser Ser Val Lys Pro Lys Trp Asp Ile Arg Asn
370 375 380

Claims (10)

1.一种合成手性(R)-3-氨基-1-丁醇的方法，包括如下步骤：
(A)以1，3-丁二醇为底物，经酶A催化反应生成4-羟基-2-丁酮；
(B)以步骤(A)生成的4-羟基-2-丁酮为底物，经酶B催化反应生成手性(R)-3-氨基-1-丁醇；
所述酶A选自如下任一种：醇脱氢酶、醇脱氢酶突变体；
所述酶B选自如下任一种：胺脱氢酶、胺脱氢酶突变体。
2.一种合成手性(R)-3-氨基-1-丁醇的方法，包括如下步骤：以1，3-丁二醇为底物，
经酶A和酶B催化反应，生成手性(R)-3-氨基-1-丁醇；
所述酶A选自如下任一种：醇脱氢酶、醇脱氢酶突变体；
所述酶B选自如下任一种：胺脱氢酶、胺脱氢酶突变体。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述醇脱氢酶为如下(a1)-(a42)中任一：
(a1)来源于短小乳杆菌(Lactobacillus brevis KB290)的醇脱氢酶ADH1，氨基酸序列的Accession Number为BAN05992.1；
(a2)来源于高温厌氧杆菌(Thermoanaerobacter brockii)的醇脱氢酶ADH2，氨基酸序列的Accession Number为CAA46053.1；
(a3)来源于固氮弧菌属(Aromatoleum aromaticum EbN1)的醇脱氢酶ADH3，氨基酸序列的Accession Number为CAI07428.1；
(a4)来源于链霉菌(Streptomyces coelicolor)的醇脱氢酶ADH4，氨基酸序列的Accession Number为Q9KYM4；
(a5)来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的醇脱氢酶ADH5，氨基酸序列的Accession Number为WP_003234015.1；
(a6)来源于肺炎克雷白杆菌(Klebsiella pneumoniae)的醇脱氢酶ADH6，氨基酸序列的Accession Number为WP_015958558.1；
(a7)来源于葡萄糖杆菌(Gluconobacter oxydans)的醇脱氢酶ADH7，氨基酸序列的Accession Number为WP_011253549.1；
(a8)来源于赖氏菌属(Leifsonia sp.S749)的醇脱氢酶ADH8，氨基酸序列的AccessionNumber为BAD99642.1；
(a9)来源于赤红球菌(Rhodococcus ruber)的醇脱氢酶ADH9，氨基酸序列的AccessionNumber为Q8KLT9；
(a10)来源于高加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus kefiri DSM 20587)的醇脱氢酶ADH10，氨基酸序列的Accession Number为AAP94029.1；
(a11)来源于威吉利热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter wiegelii Rt8.B1)的醇脱氢酶ADH11，氨基酸序列的Accession Number为AEM77517.1；
(a12)来源于乳杆菌(Lactobacillus zymae DSM 19395)的醇脱氢酶ADH12，氨基酸序列的Accession Number为KRL08675.1；
(a13)来源于酒球菌(Oenococcus alcoholitolerans)的醇脱氢酶ADH13，氨基酸序列的Accession Number为KGO31568.1；
(a14)来源于愈伤热球菌(Thermococcus guaymasensis)的醇脱氢酶ADH14，氨基酸序列的Accession Number为ADV18977.1；
(a15)来源于肉毒梭菌(Clostridium botulinum)的醇脱氢酶ADH15，氨基酸序列的Accession Number为WP_003399463.1；
(a16)来源于致黑脱硫肠状菌(Desulfotomaculum nigrificans)的醇脱氢酶ADH16，氨基酸序列的Accession Number为WP_003542410.1；
(a17)来源于一氧化碳嗜热窦菌(Thermosinus carboxydivorans)的醇脱氢酶ADH17,氨基酸序列的Accession Number为WP_007290608.1；
(a18)来源于烷嗜热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter mathranii)的醇脱氢酶ADH18，氨基酸序列的Accession Number为WP_013150923.1；
(a19)来源于梭菌属(Clostridium)的醇脱氢酶ADH19，氨基酸序列的AccessionNumber为WP_013239134.1；
(a20)来源于厚壁菌门细菌(Firmicutes bacterium CAG:137)的醇脱氢酶ADH20,氨基酸序列的Accession Number为CDB31037.1；
(a21)来源于拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)的醇脱氢酶ADH21，氨基酸序列的Accession Number为WP_026889046.1；
(a22)来源于梭菌属(Clostridium)的醇脱氢酶ADH22，氨基酸序列的AccessionNumber为WP_039771361.1；
(a23)来源于乙草甲烷菌(Methanosarcina acetivorans)的醇脱氢酶ADH23，氨基酸序列的Accession Number为WP_048065256.1；
(a24)来源于淡色甲烷菌(Methanosarcina lacustris)的醇脱氢酶ADH24，氨基酸序列的Accession Number为WP_048125376.1；
(a25)来源于甲烷八叠球菌(Methanosarcina thermophila)的醇脱氢酶ADH25，氨基酸序列的Accession Number为WP_048166386.1；
(a26)来源于西洋甲烷菌(Methanosarcina siciliae)的醇脱氢酶ADH26，氨基酸序列的Accession Number为WP_048172170.1；
(a27)来源于德氏葡萄球菌(Desnuesiella massiliensis)的醇脱氢酶ADH27，氨基酸序列的Accession Number为WP_055668884.1；
(a28)来源于卡尔德氏杆菌(Caldanaerobacter subterraneus)的醇脱氢酶ADH28，氨基酸序列的Accession Number为KUK09008.1；
(a29)来源于钟氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)的醇脱氢酶ADH29，氨基酸序列的Accession Number为WP_063556461.1；
(a30)来源于拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)的醇脱氢酶ADH30，氨基酸序列的Accession Number为WP_065417405.1；
(a31)来源于未培养梭菌(uncultured Clostridium sp.)的醇脱氢酶ADH31，氨基酸序列的Accession Number为SCI81347.1；
(a32)来源于丝状孢子梭菌(Clostridium taeniosporum)的醇脱氢酶ADH32，氨基酸序列的Accession Number为WP_069679756.1；
(a33)来源于脱硫弧菌(Desulfovibrio litoralis)的醇脱氢酶ADH33，氨基酸序列的Accession Number为WP_072695399.1；
(a34)来源于脱硫肠状菌(Desulfotomaculum putei)的醇脱氢酶ADH34，氨基酸序列的Accession Number为WP_073236284.1；
(a35)来源于拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)的醇脱氢酶ADH35，氨基酸序列的Accession Number为WP_077844196.1；
(a36)来源于梭状芽胞杆菌(Clostridium puniceum)的醇脱氢酶ADH36，氨基酸序列的Accession Number为WP_077846831.1；
(a37)来源于二醇梭菌(Clostridium diolis)的醇脱氢酶ADH37，氨基酸序列的Accession Number为WP_087701616.1；
(a38)来源于匙形梭菌(Clostridium cochlearium)的醇脱氢酶ADH38，氨基酸序列的Accession Number为WP_089865926.1；
(a39)来源于笃斯梭菌(Clostridium uliginosum)的醇脱氢酶ADH39，氨基酸序列的Accession Number为WP_090093236.1；
(a40)来源于梭菌属细菌(Clostridiales bacterium SK-Y3)的醇脱氢酶ADH40，氨基酸序列的Accession Number为WP_094550774.1；
(a41)来源于近平滑假丝酵母(Clostridium botulinum)的醇脱氢酶ADH41，氨基酸序列的Accession Number为WP_096043277.1；
(a42)在(a1)-(a41)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；
所述胺脱氢酶为如下(b1)-(b10)中任一：
(b1)来源于嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stereothermophilus)的胺脱氢酶AmDH1，氨基酸序列为SEQ ID No.1；
(b2)来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stereothermophilus)的胺脱氢酶AmDH2，氨基酸序列为SEQ ID No.2；
(b3)来源于嗜冷芽孢八叠球菌(Sporosarcina psychrophila)的胺脱氢酶AmDH3，氨基酸序列为SEQ ID No.3；
(b4)来源于球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)的胺脱氢酶AmDH4，氨基酸序列为SEQ ID No.4；
(b5)来源于西伯利亚微杆菌(Exiguobacterium sibiricum)的胺脱氢酶的胺脱氢酶AmDH5，氨基酸序列为SEQ ID No.5；
(b6)来源于普通高温放线菌(Thermoactinomyces intermedius)的胺脱氢酶AmDH6，氨基酸序列为SEQ ID No.6；
(b7)来源于温泉热碱芽孢杆菌(Caldalkalibacillus thermarum)的胺脱氢酶AmDH7，氨基酸序列为SEQ ID No.7；
(b8)来源于糖莱斯氏菌(Laceyella sacchari)的胺脱氢酶AmDH8，氨基酸序列为SEQID No.8；
(b9)来源于栗褐芽孢杆菌(Bacillus badius)的胺脱氢酶AmDH9，氨基酸序列为SEQ IDNo.9；
(b10)在(b1)-(b9)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；
所述胺脱氢酶的突变体为(c1)或(c2)：
(c1)将SEQ ID No.3所示的胺脱氢酶AmDH3的第114位和第291位依次突变为缬氨酸残基和半胱氨酸残基；
(c2)将SEQ ID No.3所示的胺脱氢酶AmDH3的第111位、第114位、第294位依次突变为苯丙氨酸残基、缬氨酸残基和半胱氨酸残基。
4.如权利要求1至3任一所述的方法，其特征在于：所述酶A和所述酶B均是以粗酶液、粗酶粉、纯酶或全细胞的形式发生催化作用的。
5.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述经酶A和酶B催化反应为经酶A和酶B共表达全细胞催化反应。
6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于：
所述粗酶液、粗酶粉和纯酶均按照包括如下步骤的方法制备得到：在宿主细胞中表达所述酶A和/或所述酶B，得到重组细胞；裂解所述重组细胞获得所述粗酶液、粗酶粉或纯酶；
进一步，所述全细胞均按照包括如下步骤的方法制备得到：在宿主细胞中表达所述酶A和/或所述酶B，得到的重组细胞即为所述全细胞；
再进一步，所述重组细胞是按照包括如下步骤的方法制备获得的：向所述宿主细胞到导入能够表达所述酶A和/或所述酶B的核酸分子，经诱导培养后获得表达所述酶A和/或所述酶B的所述重组细胞；
更进一步，所述“能够表达所述酶A和/或所述酶B的核酸分子”是通过重组载体的形式导入到所述宿主细胞中的；所述重组载体为携带有所述酶A和/或所述酶B的编码基因的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒或逆转录病毒包装质粒；
和/或所述宿主细胞为原核细胞或低等真核细胞；
具体的，所述原核细胞为细菌；所述低等真核细胞为酵母细胞；
更加具体的，所述细菌为大肠杆菌。
7.如权利要求1至6任一所述的方法，其特征在于：
所述催化反应的温度为25～40℃；
所述催化反应的时间为4～48h。
8.如权利要求1至7任一所述的方法，其特征在于：
当所述酶A以全细胞、粗酶液、粗酶粉或纯酶的形式进行步骤(A)时，催化反应在如下(d1)所示缓冲液中进行；
当所述酶B以全细胞、粗酶液、粗酶粉或纯酶的形式进行步骤(B)时，催化反应在如下(d2)所示缓冲液中进行；
当酶A和酶B共表达全细胞催化反应时，催化反应在如下(d2)所示缓冲液中进行；
(d1)浓度为50～100mM，pH值为6.5～8.5的磷酸盐缓冲液；
(d2)浓度为50mM～4M，pH值为7.0～9.5的氯化铵/氨水缓冲液。
9.酶系统或其相关产品，其特征在于：所述酶系统包括权利要求1至8中任一所述酶A和所述酶B；
所述相关产品为能够表达所述酶系统中各酶的核酸分子，或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。
10.权利要求9所述的酶系统或其相关产品在合成手性(R)-3-氨基-1-丁醇中的应用。
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