CN110257349B

CN110257349B - 醛酮还原酶BmAKR2及其突变体和应用

Info

Publication number: CN110257349B
Application number: CN201910375420.0A
Authority: CN
Inventors: 游松; 秦斌; 张文鹤; 祝天慧; 张飞霆; 郭继阳; 张瑞; 李衡宇
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2019-05-07
Filing date: 2019-05-07
Publication date: 2022-11-18
Anticipated expiration: 2039-05-07
Also published as: CN110257349A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，涉及醛酮还原酶BmAKR2及其突变体和应用，所述突变体是由野生型巨大芽孢杆菌醛酮还原酶2(Bacillus megaterium aldo‑keto reductase 2,BmAKR2)出发经过突变得到的，本发明还涉及所述的醛酮还原酶BmAKR2及其突变体的制备方法。还涉及所述的醛酮还原酶BmAKR2及其突变体通过催化苯甲酰甲酸甲酯的还原，得到具有光学活性的S或R构型仲醇化合物的方法。本发明中的突变体相对于野生型，立体选择性及活性均得到了提高，催化上述底物可以获取光学纯的手性醇，在手性醇制备领域具有很好的应用价值。

Description

醛酮还原酶BmAKR2及其突变体和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及醛酮还原酶BmAKR2及其突变体和应用，所述突变体是由野生型巨大芽孢杆菌醛酮还原酶2(Bacillus megaterium aldo-keto reductase2,BmAKR2)出发经过突变得到的，本发明还涉及所述的醛酮还原酶BmAKR2及其突变体的制备方法。还涉及所述的醛酮还原酶BmAKR2及其突变体通过催化苯甲酰甲酸甲酯的还原，得到具有光学活性的S或R构型仲醇化合物的方法。

背景技术

苯甲酰甲酸甲酯属于α-酮酸酯类化合物，有两个羰基，其中α-羰基碳原子为前手性碳原子，故在手性合成方面有着重要的用途。由其不对称还原得到的具有光学活性的(R)-扁桃酸甲脂，是合成环扁桃酸酯、匹莫林等血管扩张剂、杀菌剂及镇痉剂的重要药物中间体。传统α-酮酸酯的还原路线中常常使用贵重金属，提高了生产成本，污染也较大，有的反应所得产物收率较低而且后处理复杂。与化学方法相比，生物法具有反应条件温和、转化率高、对映体选择性高等多种优点，尤其生物催化的羰基不对称还原反应在手性醇合成中的应用越来越受到重视，而属酮还原酶的醛酮还原酶在α-酮酸酯的还原中具有应用价值。

醛酮还原酶(Aldo keto reductases，AKRs)是一类依赖于NAD(P)⁺的氧化还原酶，包含了超过190个成员。其结构由(α/β)₈桶状结构及loop区构成，活性中心由loop 4、loop7及loop C组成，催化活性位点包括Tyr、Asp、Lys以及His。醛酮还原酶能够催化底物的类型包含多种，例如糖醛、类固醇、前列腺素、羰基化合物及酮酸酯类化合物等。来源于不同菌属中的醛酮还原酶可催化不同类型的底物得到相应的具有手性中心的氧化还原产物，而目前制约醛酮还原酶应用的主要问题就是天然的酶存在一定的缺陷，如活性低、选择性差、选择性与期望相反等，使其在生产实践中的应用受到一定限制，成功修饰和改造酮还原酶使其具有更加良好的性质是一个研究的热点。最近已有通过蛋白质工程将自然界存在的醛酮还原酶进行改造来提高醛酮还原酶的催化性能，例如可通过对醛酮还原酶的loop区进行改造来提高醛酮还原酶的催化性能，但成功例子仍较少。因此发掘并且改造醛酮还原酶以提高其催化性能的需求较为迫切。

本实验室通过基因挖掘获取的来源于巨大芽孢杆菌的醛酮还原酶BmAKR2，野生状态下对α-酮酸酯类化合物表现出较差的活性及立体选择性。通过理性设计及蛋白质定向进化提高该酶的立体选择性，实现具有光学活性的手性醇的生物催化制备，具有十分重要的应用价值。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种醛酮还原酶BmAKR2，还提供了通过对该醛酮还原酶进行突变得到的还原酶突变体，所述的醛酮还原酶BmAKR2和突变体可以提高其对α-酮酸酯类化合物的对映选择性及活性，使通过醛酮还原酶还原得到对应手性醇路线高效、可行。

本发明提供了醛酮还原酶BmAKR2，通过测序确定为野生型巨大芽孢杆菌醛酮还原酶2，其序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了由野生型巨大芽孢杆菌醛酮还原酶2(BmAKR2)基因(SEQ IDNO.1)通过突变得到具有改良性质的醛酮还原酶的突变体，该酶在大肠杆菌工程菌中表达，该醛酮还原酶及其突变体，能够将α-酮酸酯类化合物还原得到具有光学活性的S或R构型仲醇。

进一步地，将醛酮还原酶基因连接到表达质粒中，得重组醛酮还原酶。所述的表达质粒为：pET-28b-MBP。

所述的重组醛酮还原酶包括与SEQ ID NO.2至少75％同一性的氨基酸序列。

更进一步地，本发明提供了醛酮还原酶BmAKR2的突变体，所述的突变体是对重组醛酮还原酶(即SEQ ID NO.2)的24位或111位突变、或24位和111位同时突变获得。

本发明所述的醛酮还原酶BmAKR2的突变体对应于SEQ ID NO.2的24位残基为较小的氨基酸残基，111位残基为较大氨基酸残基，这些氨基酸对于改善醛酮还原酶的活性及对映体选择性至关重要。

本发明中涉及的较小的氨基酸为Ala、Ser、Thr、Val、Ile与Leu，优选为丝氨酸(Ser)；涉及的较大氨基酸残基为Pro、Phe、Try、Leu，优选为苯丙氨酸(Phe)。

本发明的一些实施方案中，含有突变的醛酮还原酶突变体针对α-酮酸酯类化合物及展现出更高的活性及立体选择性，这些突变体包含一个或两个突变，即24位或111位突变，或24位和111位同时突变，氨基酸序列24位突变为Ser；氨基酸序列111位突变为Phe。

本发明所述的醛酮还原酶突变体，其氨基酸序列优选如SEQ ID NO.4，6，8所示。

本发明的实施方式包括编码所述醛酮还原酶突变体的核酸，与编码本发明所述BmAKR2突变体的核酸序列具有至少75％的序列同一性。

所述的能够编码突变体的核酸，序列如SEQ ID NO.3，5，7所示。

本发明的相关实施方式还包括包含这些核酸的载体及包含该类载体的宿主细胞。

本发明还提供了所述的醛酮还原酶及其突变体在还原α-酮酸酯类化合物中的应用。本发明中所述的野生型BmAKR2与其突变体，或者是含有野生型或突变体酶的细胞可以作为催化剂催化不对称还原α-酮酸酯类化合物获取相应的光学纯手性产物。

所述的α-酮酸酯类化合物较佳的结构如(II)所示：

其中R₁为C1-C4烷基，苯基或者带有取代基的苯基；苯基的取代基C1-C4烷基；

R₂为C1-C4烷基；

优选地结构如1a所述：

本发明的一个实施方式提供了不对称还原α-酮酸酯类化合物的方法：

在pH 5-7的磷酸盐缓冲液溶液中，在葡萄糖脱氢酶，葡萄糖和NADP⁺存在下，在醛酮还原酶突变体的催化下，对α-酮酸酯类化合物进行还原，生成光学活性手性仲醇。

醛酮还原酶突变体用量为0.02-40g/L，葡萄糖脱氢酶用量为0.01-5g/L，葡萄糖用量为6-200g/L，NADP⁺用量为0.1-0.5mmol，α-酮酸酯类化合物的浓度为3-100g/L，所述缓冲液为pH5-7的磷酸盐缓冲液，反应温度是30-40℃。

该醛酮还原酶或其突变体可以多种可行的方式如细胞、粗酶粉、酶溶液、固定化酶等多种形式存在。

本发明的有益技术效果：通过对巨大芽孢杆菌醛酮还原酶2(BmAKR2)进行突变，所得到的醛酮还原酶突变体与天然存在的酮还原酶野生型相比，反转与提高了其对α-酮酸酯类化合物的活性与对映选择性。

附图说明

图1为野生型醛酮还原酶BmAKR2与其突变体酶的基因、含有上述基因的重组表达载体的构建。

图2为野生型醛酮还原酶BmAKR2与其突变体酶催化底物1a还原的HPLC检测结果；

Sub1：底物1a对照；Rac-1：产物消旋体对照；野生型(SEQ ID NO.2)HPLC检测结果；野生型Y24S突变体(SEQ ID NO.4)HPLC检测结果；野生型Y24S-W111F双位点突变体(SEQ IDNO.8)HPLC检测结果。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案，描述本发明的醛酮还原酶突变体，以及利用该酶还原α-酮酸酯类化合物及。除特别指明，本发明中所用的实验方案均为本领域技术人员所公知的方法。此外，实施例应理解为说明性的，而不是限制本发明。

某些术语的定义。

不对称还原是还原前手性化合物得到光学纯的相应的还原产物的一种方法，在本发明中指醛酮还原酶催化α-酮酸酯类化合物选择性地得到S或R构型的相应的醇。

对映体过量定义为对映体混合物中一个异构体A比另一个异构体B多出来的量占总量的百分数，缩写为ee，公式为(A-B)/(A+B)*100％，对映体过量值用于表示一种手性化合物的光学纯度。ee值越高，光学纯度也越高。

20种氨基酸缩写如下

Asp D 天冬氨酸 Ile I 异亮氨酸

Thr T 苏氨酸 Leu L 亮氨酸

Ser S 丝氨酸 Tyr Y 酪氨酸

Glu E 谷氨酸 Phe F 苯丙氨酸

Pro P 脯氨酸 His H 组氨酸

Gly G 甘氨酸 Lys K 赖氨酸

Ala A 丙氨酸 Arg R 精氨酸

Cys C 半胱氨酸 Trp W 色氨酸

Val V 缬氨酸 Gln Q 谷氨酰胺

Met M 甲硫氨酸 Asn N 天冬酰胺

氨基酸分类，根据氨基酸侧链基团的空间位阻分为较大及较小的氨基酸，本发明中涉及的本发明中涉及的较小的氨基酸为Ala、Ser、Thr、Val、Ile与Leu，较大氨基酸残基为Pro、Phe、Try、Leu。

实施例涉及的培养基配方。

a.LB培养基：0.5％酵母提取物、1％蛋白质胨与1％氯化钠(如配置固体培养基，在灭菌前加入1.5％琼脂)，115℃高压灭菌30min。

实施例1巨大芽孢杆菌基因组DNA的提取

巨大芽孢杆菌用LB液体培养过夜后，发酵液用1mL离心管3000r/min离心5min，弃上清收集菌体，可重复几次以得到足够量的细胞；b)按细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明提取巨大芽孢杆菌基因组。

实施例2野生型BmAKR2基因的克隆

以实施例1获得的巨大芽孢杆菌基因组DNA为模板进行PCR反应，反应体系如下：

扩增程序：94℃：10min，(94℃：30s，45℃：30s，72℃：30s)30个循环，72℃，10min。

引物1：BmAKR2-EcoR I-F：CCGGAATTCGATGAGTAAAGTAATTCCT；

引物2：BmAKR2-Xho I-R：CCGCTCGAGAAATTCTTCATAAGCAGA；

限制性内切酶酶切位点用下划线标出；

PCR扩增得到的DNA片段用胶回收试剂盒纯化。含有pET28b MBP质粒的E.coli DH5α用LB液体培养基37℃，220r/min培养过夜，质粒提取采用参照TIANprep Mini PlasmidKit。

目的片段与质粒pET28b MBP质粒限双酶切，酶切体系如下：

酶切产物用胶回收试剂盒回收片段，并通过T4连接酶连接。

实施例3E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞的制备及转化

a)从种子培养基中取0.4mL接种于20mL LB液体培养基中培养3h；b)3000r/min，5min分两次富集2mL菌体于1.5mL EP管中，弃上清；c)加入100μl冰冷TSS溶液，重新悬浮菌体，冰浴30min；d)加入20μL连接液轻轻旋转混匀，冰浴30min；e)42℃热休克60s，冰浴2min，加入600μL LB液体培养基。37℃培养，150r/min振荡培养1h；f)分别取150μL涂布于LB抗性平板。

实施例4突变体的构建

突变库的构建是利用突变引物和侧翼引物，重叠延伸PCR进行的。(设计的突变引物如下：)

PCR扩增条件：94℃：10Min，(94℃：30s，45℃：30s，72℃：30s)35个循环，72℃：10min。所得基因片段经过纯化，按如下PCR扩增

按实施例2中所述PCR获得目的片段并连接到pET28b MBP载体上，按实施例3所述转化到E.coli Rosetta(DE3)中。分别得到了野生型醛酮还原酶BmAKR2与其突变体。

实施例5突变体表达

a)取单菌落接种于4ml卡那霉素抗性LB液体培养基中，37℃，200rpm培养6h后得到种子液；

b)取20μl种子液接种于20ml卡那霉素抗性LB液体培养基中，37℃，200rpm培养至培养液OD600达到0.8-1.0时加入终浓度0.5mM IPTG，并将温度降至20℃诱导表达20h；c)4000rpm×15min离心培养液收集菌体，生理盐水洗涤两次后用0.1M pH6.0磷酸钠缓冲液重选菌体，加入终浓度1mg/ml溶菌酶，30℃，200rpm破碎1h后，4℃下，10000rpm离心收集上清进行筛选。

实施例6葡萄糖脱氢酶表达

将含有pET22b-GDH质粒的E.coli Rosetta(DE3)按照实施例5所述表达获得葡萄糖脱氢酶。

实施例7粗酶液催化还原

本实施例中涉及的典型底物如下所示：

反应体系：如实施例5、6中所述的上清各450μl混匀，终浓度0.3mM NADP⁺，8mg葡萄糖，4mg底物(100μl甲醇助溶)，30℃反应6h；用等体积乙酸乙酯萃取三次。

实施例8高效液相分析底物和产物

检测底物1a及产物的条件为：色谱柱：OD-H，流动相：正己烷：异丙醇＝90:10，流速：0.8ml/min，波长：254nm，柱温：25℃，检测器：UV检测器。

实施例9野生型(SEQ ID NO.2)及Y24S突变体(SEQ ID NO.4)对底物1a的选择性测定结果

a)转化率[％]；b)还原产物醇对映体过量值(ee％)；c)还原产物醇的绝对构型

SEQ ID NO.4催化底物1a液相图见图2。

实施例10野生型(SEQ ID NO.2)及Y24S-W111F双位点突变体(SEQ ID NO.8)对底物1a的选择性测定结果

SEQ ID NO.8催化底物1a液相图见图2。

序列表

<110> 沈阳药科大学

<120> 醛酮还原酶BmAKR2及其突变体和应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 840

<212> DNA

<213> Bacillus megaterium

<400> 1

atgagtaaag taattcctga aataaccctt aatgacgggg taatcttgcc tgctataggc 60

tttggtacat acaaacttaa cggaaatgaa ggagtcaacg ctataacgag tgcgattgat 120

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cgataccata cgtatgacaa agcaattcct accatccaag aatctttgta tcgcgcgaat 300

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gaattgaacc gcgaggatgg aagacttaat aatcaagacc ccgctgctta tgaagaattt 840

<210> 2

<211> 280

<212> PRT

<213> Bacillus megaterium

<400> 2

Met Ser Lys Val Ile Pro Glu Ile Thr Leu Asn Asp Gly Val Ile Leu

1 5 10 15

Pro Ala Ile Gly Phe Gly Thr Tyr Lys Leu Asn Gly Asn Glu Gly Val

20 25 30

Asn Ala Ile Thr Ser Ala Ile Asp Val Gly Tyr Arg Leu Ile Asp Thr

35 40 45

Ala Tyr Asn Tyr Glu Asn Glu Gly Thr Val Gly Gln Ala Leu Arg Arg

50 55 60

Thr Pro Val Ser Arg Gln Glu Leu Phe Val Thr Ser Lys Leu Pro Gly

65 70 75 80

Arg Tyr His Thr Tyr Asp Lys Ala Ile Pro Thr Ile Gln Glu Ser Leu

85 90 95

Tyr Arg Ala Asn Leu Asp Tyr Tyr Asp Leu Tyr Leu Ile His Trp Pro

100 105 110

Asn Pro Lys Gln Asp His Tyr Val Glu Ala Trp Gln Ala Leu Ile Asp

115 120 125

Ala Lys Arg Trp Gly Leu Ile Arg Ser Ile Gly Val Cys Asn Phe Leu

130 135 140

Pro Glu His Val Glu Arg Leu Glu Lys Glu Thr Gly Ile Leu Pro Ser

145 150 155 160

Ile Asn Gln Ile Glu Leu His Pro Phe Phe Asn Gln His Gln Tyr Arg

165 170 175

Asn Trp Tyr Gln Glu Lys Asn Ile Gln Ile Glu Ser Trp Ser Pro Leu

180 185 190

Gly Arg Ala Ser Ala Val Leu Glu Asn Glu Ala Ile Lys Gln Ile Ala

195 200 205

Asp Arg His Asn Lys Thr Val Ser Gln Val Ile Leu Arg Trp His Tyr

210 215 220

Gln Leu Gly Ala Ile Ser Ile Pro Lys Ser Ser Ser Arg Lys Arg Gln

225 230 235 240

Leu Glu Asn Ile Ser Ile Phe Ser Phe Ser Leu Asp Glu Thr Glu Met

245 250 255

Asn Met Ile Ser Glu Leu Asn Arg Glu Asp Gly Arg Leu Asn Asn Gln

260 265 270

Asp Pro Ala Ala Tyr Glu Glu Phe

275 280

<210> 3

<211> 840

<212> DNA

<213> Bacillus megaterium

<400> 3

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<210> 4

<211> 280

<212> PRT

<213> Bacillus megaterium

<400> 4

Met Ser Lys Val Ile Pro Glu Ile Thr Leu Asn Asp Gly Val Ile Leu

1 5 10 15

Pro Ala Ile Gly Phe Gly Thr Ser Lys Leu Asn Gly Asn Glu Gly Val

20 25 30

Asn Ala Ile Thr Ser Ala Ile Asp Val Gly Tyr Arg Leu Ile Asp Thr

35 40 45

Ala Tyr Asn Tyr Glu Asn Glu Gly Thr Val Gly Gln Ala Leu Arg Arg

50 55 60

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Gly Arg Ala Ser Ala Val Leu Glu Asn Glu Ala Ile Lys Gln Ile Ala

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Leu Glu Asn Ile Ser Ile Phe Ser Phe Ser Leu Asp Glu Thr Glu Met

245 250 255

Asn Met Ile Ser Glu Leu Asn Arg Glu Asp Gly Arg Leu Asn Asn Gln

260 265 270

Asp Pro Ala Ala Tyr Glu Glu Phe

275 280

<210> 5

<211> 840

<212> DNA

<213> Bacillus megaterium

<400> 5

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<211> 280

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<213> Bacillus megaterium

<400> 6

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1 5 10 15

Pro Ala Ile Gly Phe Gly Thr Tyr Lys Leu Asn Gly Asn Glu Gly Val

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Leu Glu Asn Ile Ser Ile Phe Ser Phe Ser Leu Asp Glu Thr Glu Met

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<211> 840

<212> DNA

<213> Bacillus megaterium

<400> 7

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cgataccata cgtatgacaa agcaattcct accatccaag aatctttgta tcgcgcgaat 300

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atcaatcaaa tagaactgca tccttttttt aatcaacatc aatatcgaaa ttggtatcag 540

gagaaaaaca ttcaaattga atcttggagt ccactagggc gagcaagtgc tgttttagaa 600

aatgaagcaa ttaaacaaat tgccgaccgt cataataaga cagtttcaca agtgattttg 660

cgatggcatt atcagctagg ggcgatttca attccaaaat cgtcatctcg caagcggcag 720

cttgaaaaca tatctatttt ttcattttct ttagatgaaa ctgagatgaa tatgatttca 780

gaattgaacc gcgaggatgg aagacttaat aatcaagacc ccgctgctta tgaagaattt 840

<210> 8

<211> 280

<212> PRT

<213> Bacillus megaterium

<400> 8

Met Ser Lys Val Ile Pro Glu Ile Thr Leu Asn Asp Gly Val Ile Leu

1 5 10 15

Pro Ala Ile Gly Phe Gly Thr Ser Lys Leu Asn Gly Asn Glu Gly Val

20 25 30

Asn Ala Ile Thr Ser Ala Ile Asp Val Gly Tyr Arg Leu Ile Asp Thr

35 40 45

Ala Tyr Asn Tyr Glu Asn Glu Gly Thr Val Gly Gln Ala Leu Arg Arg

50 55 60

Thr Pro Val Ser Arg Gln Glu Leu Phe Val Thr Ser Lys Leu Pro Gly

65 70 75 80

Arg Tyr His Thr Tyr Asp Lys Ala Ile Pro Thr Ile Gln Glu Ser Leu

85 90 95

Tyr Arg Ala Asn Leu Asp Tyr Tyr Asp Leu Tyr Leu Ile His Phe Pro

100 105 110

Asn Pro Lys Gln Asp His Tyr Val Glu Ala Trp Gln Ala Leu Ile Asp

115 120 125

Ala Lys Arg Trp Gly Leu Ile Arg Ser Ile Gly Val Cys Asn Phe Leu

130 135 140

Pro Glu His Val Glu Arg Leu Glu Lys Glu Thr Gly Ile Leu Pro Ser

145 150 155 160

Ile Asn Gln Ile Glu Leu His Pro Phe Phe Asn Gln His Gln Tyr Arg

165 170 175

Asn Trp Tyr Gln Glu Lys Asn Ile Gln Ile Glu Ser Trp Ser Pro Leu

180 185 190

Gly Arg Ala Ser Ala Val Leu Glu Asn Glu Ala Ile Lys Gln Ile Ala

195 200 205

Asp Arg His Asn Lys Thr Val Ser Gln Val Ile Leu Arg Trp His Tyr

210 215 220

Gln Leu Gly Ala Ile Ser Ile Pro Lys Ser Ser Ser Arg Lys Arg Gln

225 230 235 240

Leu Glu Asn Ile Ser Ile Phe Ser Phe Ser Leu Asp Glu Thr Glu Met

245 250 255

Asn Met Ile Ser Glu Leu Asn Arg Glu Asp Gly Arg Leu Asn Asn Gln

260 265 270

Asp Pro Ala Ala Tyr Glu Glu Phe

275 280

Claims

1.醛酮还原酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 4或8所示。

2.一种核酸，其能够编码权利要求1所述的醛酮还原酶突变体。

3.如权利要求2 所述的核酸，其核酸序列如SEQ ID NO. 3或7所示。

4.一种表达载体，该载体含有权利要求2 或3 所述的核酸且能在宿主细胞中进行表达。

5.一种宿主细胞，其含有权利要求2 或3 所述的核酸或权利要求4 所述的表达载体。

6.如权利要求5所述的宿主细胞，所述的宿主细胞为大肠杆菌。

7.权利要求1所述的醛酮还原酶突变体在还原α-酮酸酯类化合物中的应用，所述的α-酮酸酯类化合物如式（I）所示:

其中，R₁为苯基；R₂为甲基。

8.如权利要求7 所述的应用，其特征在于，所述的还原方法为：在pH 5-7 的磷酸盐缓冲液溶液中，在葡萄糖脱氢酶，葡萄糖和NADP⁺存在下，在权利要求1所述的醛酮还原酶突变体的催化下，对α-酮酸酯类化合物进行还原，生成光学活性手性仲醇。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，醛酮还原酶突变体用量为0.02-40g/L，葡萄糖脱氢酶用量为0.01-5g/L，葡萄糖用量为6-200g/L，NADP⁺用量为0.1-0.5mmol，底物浓度为3-100g/L，所述缓冲液为pH5-7的磷酸盐缓冲液，反应温度是30-40℃。