CN107058248A - 一种重组醛酮还原酶突变体、基因、载体、工程菌及其应用 - Google Patents

一种重组醛酮还原酶突变体、基因、载体、工程菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组醛酮还原酶突变体、基因、载体、工程菌及其在制备6‑氰基‑(3R,5R)‑二羟基己酸叔丁酯中的应用，所述突变体是分别将SEQ ID No.1所示氨基酸序列第297位的色氨酸突变为组氨酸、或第296位的酪氨酸突变为色氨酸且第297位的色氨酸突变为组氨酸获得的。本发明醛酮还原酶突变体W297H和Y296W/W297H均对6‑氰基‑(3R,5R)‑二羟基己酸叔丁酯的立体选择性和活性显著提高，转化率达到99％，产物达到光学纯(d.e.值>99.5％)。

Description

一种重组醛酮还原酶突变体、基因、载体、工程菌及其应用
(一)技术领域
本发明涉及一种重组醛酮还原酶突变体、载体、工程菌株及其应用，还包含利用高效表达该醛酮还原酶突变体的重组大肠杆菌手性生物催化合成阿托伐他汀手性侧链6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的方法。
(二)背景技术
心脑血管疾病严重危害人类健康，其致死率居各类疾病之首。动脉粥样硬化及其并发症是心脑血管疾病的主要死因，其背后元凶是血脂异常，特别是血清总胆固醇异常升高。阿托伐他汀能竞争性抑制肝脏内胆固醇合成的关键限速酶—3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的活性，降低内源性胆固醇的合成，是治疗高胆固醇血症和混合型高脂血症的有效药物，具有起效快、降脂能力强、作用时间长和毒副作用小等优点，是全球首个年销售额超过百亿美元的重磅炸弹药。
6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯是阿托伐他汀合成的重要手性中间体，也是其药效基团。由于各国药监部门对药物手性纯度设置严苛的限制(e.e.值>99.5％，d.e.值>99％)，6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的合成技术成为阿托伐他汀合成的关键核心技术。传统的6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯化学法生产通常采用硼烷衍生物在-70℃不对称加氢还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯。这一技术方法存在诸多缺陷，首先，产物光学纯度低，仅能达到98％，其次，硼烷化合物易燃；再次，反应需要深冷条件，能耗较高。与化学合成法相比，生物催化的不对称合成具有选择性高，反应条件温和，环境友好等优势，代表了绿色合成技术的发展方向。开发生物不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯技术，具有巨大的经济效益和社会效益。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种重组醛酮还原酶突变体，以及在催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制备6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯合成中的应用。本发明获得的重组醛酮还原酶突变体具有较高的立体选择性和催化活力，催化过程对环境友好。
本发明采用的技术方案为：
本发明涉及到一种重组醛酮还原酶突变体，所述突变体是将SEQ ID NO.1所示原始型醛酮还原酶氨基酸序列第297位的色氨酸突变为组氨酸(KmAKR-W297H)的单位点突变体，或第296位的酪氨酸突变为色氨酸且第297位的色氨酸突变为组氨酸(KmAKR-Y296W/W297H)的双位点突变体。原始型醛酮还原酶氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；重组醛酮还原酶单位点突变体氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.4；重组醛酮还原酶双位点突变体氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.6。
由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在90％以上，均属于本发明保护范围之列。具体的所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。
由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有90％以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的变位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的肽蛋白的功能。
本发明还涉及所述醛酮还原酶突变体编码基因构建的重组表达载体。本发明所述重组表达载体可通过本领域常规技术得到，具体通过以下方法得到本发明的重组表达载体：以原始型醛酮还原酶基因的表达载体(pET28a(+)-kmakr)为模板，根据上游引物：5’-AGATTGTACNNKGTTGATTTCTACACCAAGTACAA-3’和下游引物：5’-GAAATCAACNNKGTACAATCTAACAGGTTCATGTT-3’，全质粒PCR扩增得到原始型醛酮还原酶氨基酸序列297位饱和突变的重组表达载体，用DpnI酶切后转化至E.coliJM109受体菌，进行涂布后随机挑取单菌落培养并提取质粒，经过测序获得本发明的单位点突变体表达载体(pET28a(+)-kmakr-W297H)；随后，以单位点突变体表达载体(pET28a(+)-kmakr-W297H)为模板，根据上游引物：5’-GTTAGATTGNNKCATGTTGATTTCTACACCAAGTA-3’和下游引物：5’-ATCAACATGNNKCAATCTAACAGGTTCATGTTGTA-3’，全质粒PCR扩增得到原始型醛酮还原酶氨基酸序列在297突变为组氨酸基础上的296位饱和突变的重组表达载体，用DpnI酶切后转化至E.coliJM109受体菌，进行涂布后随机挑取单菌落培养并提取质粒，经过测序获得本发明的双突变体表达载体(pET28a(+)-kmakr-Y296W/W297H)。
本发明涉及一种由所述重组表达载体转化得到的重组基因工程菌，通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足表达载体可稳定的自行复制，且所携带的醛酮还原酶突变体能被有效表达即可。本发明优选E.coli BL21(DE3)。将本发明重组表达载体pET28a(+)-kmakr-W297H和pET28a(+)-kmakr-Y296W/W297H通过常规转化方法，转化至E.coli BL21(DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株，即E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-kmakr-W297H和E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-kmakr-Y296W/W297H。
本发明涉及一种所述重组醛酮还原酶突变体在制备6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯中的应用，具体所述的应用如下：将含有重组醛酮还原酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养后的发酵液离心，以湿菌体为催化剂，以6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯底物，以葡萄糖为共底物，以采用常规方法构建的含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为辅酶再生酶，以pH值为5.0～9.0(优选7.0)的100mM磷酸钠缓冲液为介质构成反应体系，(先将催化剂与辅酶再生酶用反应介质重悬，超声破碎，再加入底物6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯底物和共底物葡萄糖)，在25～55℃(优选35℃)转化反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯。
进一步，上述反应体系：底物6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯初始浓度为10～100g/L(优选75g/L)，共底物葡萄糖15～150g/L(优选113g/L)，催化剂湿菌体用量10～100g/L(优选75g/L)，辅酶再生酶用量10～100g/L(优选25g/L)。
本发明所述催化剂按如下方法制备：
(1)斜面培养：将含有重组编码醛酮还原酶突变体基因的重组基因工程菌接种至斜面培养基，在28～37℃培养12～24h，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，20g/L琼脂，溶剂为水，pH值为7.0；
(2)种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至含终浓度50μg/mL卡那霉素(Kan)的Lysogeny-Broth(LB)液体培养基中，37℃培养10～12h，获得种子液；LB液体培养基终浓度组成：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，溶剂为水，pH值7.0；
(3)发酵培养：以体积浓度2％的接种量将种子液接种至含有终浓度50μg/mLKan的LB液体培养基进行发酵培养，37℃，180rpm培养至培养液的OD600为0.6～0.8之间，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.1mM，28℃，180rpm诱导培养12h，4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集湿菌体。
本发明还可以以湿菌体超声破碎提取的纯酶为催化剂，具体分离纯化：将收集的湿菌体在pH7.0，100mM磷酸钠缓冲液(100g/L，w/v)中重悬，进行超声波破碎(400W，30min)，取破碎后的上清液经nickel-NTA柱纯化，上柱之前先用缓冲液(终浓度500mMNaCl，溶剂为pH 8.0、20mM NaH2PO4)进行平衡；接着用洗脱缓冲液(终浓度500mMNaCl、终浓度5mMimidazole，溶剂为pH 8.0、20mM NaH2PO4)洗脱不具有吸附性的蛋白；最后，用蛋白洗脱液(终浓度500MmNaCl和终浓度500mM imidazole，溶剂为20mM NaH2PO4(pH 8.0)解吸目的蛋白，收集蛋白洗脱液洗脱产生的流出液，获得所述的酶。
本发明所述的含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体的制备方法：接种含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌(优选E coliBL21(DE3)/pET28b-esgdh，GenBankNO.KM817194.1)于50mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、180rpm培养10h得到种子液。以接种量4％(v/v)转接到100mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、180rpm培养至OD600为0.8，加入终浓度9g/L的乳糖，在28℃、180rpm诱导9h。4℃、8000rpm离心10min，收集湿菌体细胞。
本发明所述野生型醛酮还原酶的重组表达载体由来自Kluyveromycesmarxianus醛酮还原酶基因(GenBank NO.BAP73216.1)插入到pET28a(+)构建而成，并将其转入到E.coli BL21(DE3)获得E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-kmakr。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明公开的一条来自Kluyveromycesmarxianus醛酮还原酶及其突变体，首次用于催化合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯。其中，野生型K.marxianus醛酮还原酶对6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的立体选择性中等(d.e.值仅仅80.5％)、活性一般。醛酮还原酶突变体W297H和Y296W/W297H均对6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的立体选择性和活性显著提高，转化率达到99％，产物达到光学纯(d.e.值>99.5％)。
(四)附图说明
图1野生型K.marxianus醛酮还原酶基因kmakr琼脂糖凝胶电泳图
图2野生型醛酮还原酶KmAKR基因重组载体物理图谱，其中A为pGEM-T-Easy-kmakr物理图谱；B为pET28a(+)-kmakr物理图谱。
图3野生型KmAKR及其突变体琼脂糖凝胶电泳图，其中，泳道1为pET28a(+)-kmakr，泳道2为pET28a(+)-kmakr-W297H，泳道3为pET28a(+)-kmakr-Y296W/W297H。
图4重组醛酮还原酶突变体的SDS-PAGE图，M：标准蛋白质分子；1：未诱导醛酮还原酶突变体工程菌细胞破碎液；2：IPTG诱导醛酮还原酶突变体工程菌细胞破碎液上清；3：纯化后重组醛酮还原酶突变体；4：纯化后的原始型醛酮还原酶。
图5野生型醛酮还原酶及其突变体与葡萄糖脱氢酶偶联不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯生成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1:野生型醛酮还原酶KmAKR基因克隆及其重组表达载体的构建
(1)目的基因的克隆
以Kluyveromycesmarxianus(CICC32920)基因组DNA为模板，通过上游引物：5’-CCATGGCCATGACAAACCAAAAGTTCTTTACTT-3’，下游引物：5’-GCGGCCGCTCACTTCTGGGATTCAGAAT-3’进行PCR扩增，获得扩增产物。取10μL PCR扩增产物用0.9％琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶电泳图见图1所示，在1000bp左右出现条带；
PCR反应体系组成(总体积100μL)：10倍Pfu DNA聚合酶缓冲液(含Mg2+)10μL，10mMdNTP混合物(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mM)0.5μL，浓度为50μM的克隆上游引物、下游引物各0.5μL，基因组DNA 1μL，Pfu DNA聚合酶1μL，无核酸水86.5μL。采用Biorad PCR仪，PCR反应条件为：预变性94℃4min，然后进入温度循环94℃30s，55℃30s，72℃1.5min，共35个循环，最后72℃延伸10min，终止温度为4℃。
(2)重组表达载体pET28a(+)-kmakr的构建
将步骤(1)获得PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用AxyPrep DNA GelExtraction Kit试剂盒回收，纯化后的基因片段记为kmakr(核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示)，与pGEM-T easy vector连接，得到重组克隆载体pGEM-T Easy-kmakr，如图2中A。将重组克隆载体转化至宿主E.coli JM109中，利用含氨苄青霉素(Amp，终浓度为50μg/mL)的LB平板筛选。分别用限制性内切酶Nco I和Xho I对制备的重组克隆载体pGEM-TEasy-kmakr进行双酶切，然后分别与经相同限制性内切酶双酶切反应形成的互补的粘性末端的表达载体pET28a(+)用T4DNA连接酶连接，构建表达载体pET28a(+)-kmakr，如图2中B。将构建的表达载体pET28a(+)-kmakr转化至E.coli BL21(DE3)中，涂布含终浓度50μg/mL卡那霉素(Kan)的LB抗性平板上筛选，获得E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-kmakr。
实施例2醛酮还原酶突变体KmAKR-W297H重组表达载体的构建
以实施例1中构建的pET28a(+)-kmakr为基础，为提高原始型醛酮还原酶的立体选择性和对底物6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的活性，对其进行两轮点饱和突变。第一轮突变，以pET28a(+)-kmakr的基因序列为模板，W297-F和W297-R为上下游引物(表1)进行PCR扩增(PCR反应参数为：95℃4min；95℃15s，55℃15s，72℃7min，重复30个循环；72℃继续延伸10min)。将扩增后回收的PCR产物用DpnI酶切3h，应用纯化试剂盒将酶切产物纯化后转化至至E.coliJM109受体菌，涂布于含终浓度50μg/mLKan的LB固体平板上，37℃培养过夜后，平板上长出许多白色菌落。随机挑取白色克隆提取质粒进行测序。测序后对突变后的阳性菌落进行纯培养，提取质粒后转入E.coliBL21(DE3)中表达，获得含有单突变基因(该核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示)重组表达载体的E.coliBL21(DE3)，即E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-kmakr-W297H。
第二轮突变，以pET28a(+)-kmakr-W297H为模板，Y296/W297H-F和Y296/W297H-R为上下游引物(如表1)，按照第一轮相同的操作方法，获得含有双位点突变基因(该核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示)重组表达载体的E.coliBL21(DE3)，即E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-kmakr-Y296W/W297H。
表1醛酮还原酶的突变引物
实施例3野生型醛酮还原酶KmAKR和重组醛酮还原酶突变体KmAKR-W297H、KmAKR-Y296W/W297H纯化
依据在实施例1和2的方法，得到含有原始基因表达载体的E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-kmakr和单位点突变体基因表达载体的E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-kmakr-W297H、双位点突变基因表达载体的E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-kmakr-Y296W/W297H，对其进行培养。
(1)诱导培养：将E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-kmakr、E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-kmakr-W297H和E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-kmakr-Y296W/W297H，分别接种至含终浓度50μg/mL Kan的Lysogeny-Broth(LB)液体培养基中，37℃，180rpm培养10-12h，随即以体积浓度2％的接种量接种至含有终浓度50μg/mL Kan的LB液体培养基进行扩大培养，37℃，180rpm培养至培养液的OD600为0.6～0.8之间，加入终浓度为0.1mMIPTG，28℃，180rpm诱导培养12h，4℃、8000rpm离心10min，分别收集经过诱导后的湿菌体。
(2)Ni柱分离纯化：将收集的湿菌体在pH 7.0，100mM磷酸钠缓冲液(100g/L(w/v))中重悬，进行超声波破碎(400W，30min)，4℃、8000rpm离心10min，取10mL的上清液作为粗酶液，进行镍-NTA柱纯化，上柱之前先用缓冲液(终浓度500mM NaCl，溶剂为pH 8.0、20mMNaH2PO4)进行平衡；接着用洗脱缓冲液(终浓度500mM NaCl、终浓度5mM咪唑，溶剂为20mMNaH2PO4(pH 8.0)洗脱不具有吸附性的蛋白；最后，用蛋白洗脱液(终浓度500mM NaCl和终浓度500mM咪唑，溶剂为20mM pH 8.0、NaH2PO4洗脱目标蛋白，收集蛋白洗脱液洗脱产生的流出液，分别获得野生型醛酮还原酶KmAKR纯酶液、重组醛酮还原酶单位点突变体KmAKR-W297H纯酶液和重组醛酮还原酶双位点突变体KmAKR-Y296W/W297H的纯酶液，4℃下在pH 7.0，NaH2PO4缓冲液中透析过夜，用SDS-PAGE凝胶电泳对其表达进行验证(见图2)。
实施例4野生型醛酮还原酶KmAKR和重组醛酮还原酶突变体的比酶活和立体选择性测定
利用酶标仪测定纯酶液的活力，方法如下：总反应体系为200μL，分别加入终浓度0.25mM NAPDH，终浓度5mM6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，以pH7.0、100mM磷酸钠缓冲液为反应介质，35℃保温5min，加入100μL实施例3中透析后纯酶液，检测340nm处吸光值的变化。酶活力定义为：在35℃条件下，每分钟消耗1μmolNADPH所需的酶量为一个活力单位(1U)。活力测定均进行3次平行试验，取其平均值为最后结果。测定结果示于表2。
分别将实施例3中获得的纯酶液为催化剂，以6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，进行转化反应制备6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯。转化体系(在1.5mL EP管中进行)组成及转化操作如下：终浓度44mM6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、终浓度44mM NADPH和5U的纯酶液，后用pH 7.0，100mM磷酸钠缓冲液补加到1.0mL。35℃水浴摇床150rpm条件下反应2h，加入10μL 6M HCl终止反应，12000rpm、离心10min，收集上清液检测6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的浓度及其d.e.值。
采用液相色谱检测生成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的d.e.值。检测条件：ODS-2C18柱(4.6×250mm，5μm)，流动相乙腈：水＝1:3(v/v)，柱温40℃，流速1mL/min，紫外检测波长210nm，进样量20μL。6-氰基-(3S,5R)-二羟基己酸叔丁酯、6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯、6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯保留时间分别为7.4min、8.1min、12.5min。d.e.值测定均进行3次平行试验，取其平均值为最后结果。测定结果示于表2。
相比于野生型KmAKR，最优单位点突变体KmAKR-W297H比酶活提高了2.8倍，产物6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯d.e.值从80.5％提高到了99.5％以上，立体选择性显著提升。最优双位点突变体KmAKR-Y296W/W297H比酶活则提高了11.1倍，产物光学纯。
表2：野生型醛酮还原酶及其突变体酶活及立体选择性比较
实施例5野生型醛酮还原酶KmAKR及其突变体的动力学参数测定
将实施例3制备的野生型醛酮还原酶KmAKR纯酶液及重组醛酮还原酶突变体KmAKR-W297H和KmAKR-Y296W/W297H纯酶液在35℃温浴5min，获得预处理的酶液。总反应体系为200μL，固定6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯终浓度3.0mM、4.0mM、5.0mM、7.5mM、10.0mM时，分别加入终浓度0.125mM、0.25mM、0.375mM、0.5mM、0.6mM的NAPDH，以pH7.0、100.0mmol/L磷酸钠缓冲盐为反应介质，加入100μL纯酶液，检测340nm处吸光值的变化，从而得到酶催化反应的初始速度。
野生型醛酮还原酶纯酶及重组醛酮还原酶突变体纯酶的动力学参数Vmax和Km通过公式计算得到，其中[A]是NADPH的浓度，[B]是6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的浓度，Km A和Km B分别为NADPH和6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的米氏常数。通过Origin8.0软件进行双倒数曲线计算出原始型醛酮还原酶纯酶及重组醛酮还原酶突变体动力学常数Vmax、Km A和Km B，如表3所示。分析结果表明，突变体相比野生型的催化效率kcat有大幅度提高，底物亲和常数Km B则有少量降低，说明酶活提高与前两者都相关。
表3：原始型醛酮还原酶及其突变体的动力学参数
实施例6野生型醛酮还原酶KmAKR及其突变体不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的应用
葡萄糖脱氢酶湿菌体的制备：所述E.coli BL21(DE3)/pET28b-esgdh由来自Exiguobacterium sibirium DSM 17290葡萄糖脱氢酶基因(GenBank NO.KM817194.1)插入到pET28b构建重组表达载体，并将此表达载体转入E.coliBL21(DE3)制得。接种E coliBL21(DE3)/pET28b-esgdh于50mL含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、180rpm培养10h得到种子液。以4％体积分数转接到100mL含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、180rpm培养至OD600为0.8，加入终浓度9g/L的乳糖，在28℃、180rpm诱导9h。4℃、8000rpm离心10min，收集湿菌体细胞。
分别将实施例3中收集到的野生型KmAKR湿菌体2.25g、单位点突变体KmAKR-W297H湿菌体2.25g和双位点突变体KmAKR-Y296W/W297H湿菌体2.25g与葡萄糖脱氢酶湿菌体0.75g混合，用体积为30mL的pH 7.0，100mM磷酸缓冲液重悬，并按实施例4超声破碎，用得到的破碎液催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯。反应体系(30mL)由30mL上述破碎液，不同终浓度(10g/L、50g/L、75g/L)的6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯和相应1.5倍质量浓度葡萄糖组成，在温度35℃，磁力搅拌转速300rpm下进行，并用1M Na2CO3流加保持反应体系pH为7.0。按照实施例4的方法进行液相检测，底物转化率与产物d.e.值示于表4示。相比于野生型KmAKR，双位点突变体KmAKR-Y296W/W297H能完全转化的底物浓度极大的提高，达到75g/L，产物的d.e.大于99.5％。
表4野生KmAKR及其突变体不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江工业大学
<120> 一种重组醛酮还原酶突变体、基因、载体、工程菌及其应用
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 310
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 1
Met Thr Asn Gln Lys Phe Phe Thr Leu Ser Asn Gly Asn Lys Ile Pro
1 5 10 15
Ala Val Ala Val Val Gly Thr Gly Thr Lys Trp Tyr Lys Ala Glu Glu
20 25 30
Thr Asp Ala Thr Phe Ser Gln Glu Leu Thr Asp Ile Val Lys Leu Ser
35 40 45
Leu Asp Thr Val Pro Gly Ile Val His Ile Asp Ala Ala Glu Thr Tyr
50 55 60
Lys Thr Tyr Pro Glu Leu Gly Ala Ala Leu Lys Glu Thr Lys Lys Pro
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Val Asp Tyr Val Asp Leu Tyr Leu Ile His Ser Pro Phe Phe Asp Lys
115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
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Val Glu Phe Ser Gln Lys Asn Asp Ile Leu Leu Glu Ala Tyr Ser Pro
195 200 205
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Tyr Gln Tyr Leu Lys Glu Leu Ser Glu Lys Tyr Asn Lys Thr Glu Ala
225 230 235 240
Gln Val Leu Leu Leu Trp Val Tyr Lys Arg Gly Ile Leu Pro Val Thr
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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<220>
<223> 人工序列
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ttttctccat tcttgcaaaa ccagacccca ggtatcgtgg agtttagcca aaagaacgat 600
attttactag aagcctattc tccattaggt cctctccaaa agaagccagc tgatgctgac 660
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caagttttgt tgttgtgggt gtacaagcgc ggtatcttgc cagttaccac ttctgccaag 780
atcgagagaa tcaagcaagc ccaagacatc ttcagctttg atcttactga agaagaggta 840
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Claims (8)

1.一种重组醛酮还原酶突变体，其特征在于所述突变体是分别将SEQ ID No.1所示氨基酸序列第297位的色氨酸突变为组氨酸、或第296位的酪氨酸突变为色氨酸且第297位的色氨酸突变为组氨酸获得的。
2.一种编码权利要求1所述重组醛酮还原酶突变体的编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6所示。
3.一种由权利要求2所述编码基因构建的重组表达载体。
4.一种由权利要求3所述重组表达载体转化得到的重组基因工程菌。
5.一种权利要求1所述醛酮还原酶突变体在催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的应用为：将含有重组醛酮还原酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为辅酶再生酶，以6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯底物，以葡萄糖为共底物，以pH值5.0～9.0的100mM磷酸钠缓冲液为反应介质构成反应体系，超声破碎，在25～55℃转化反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述反应体系中，底物初始浓度为10～100g/L，共底物终浓度15～150g/L，催化剂湿菌体用量10～100g/L，辅酶再生酶用量10～100g/L。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：
(1)斜面培养：将含有重组编码醛酮还原酶突变体基因的重组基因工程菌接种至斜面培养基，在28～37℃培养12～24h，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，20g/L琼脂，溶剂为水，pH值为7.0；
(2)种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养10～12h，获得种子液；LB液体培养基终浓度组成：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，溶剂为水，pH值为7.0；
(3)发酵培养：以体积浓度2％的接种量将种子液接种至含有终浓度50μg/mLKan的LB液体培养基进行发酵培养，37℃，180rpm培养至培养液的OD600为0.6～0.8之间，加入IPTG至终浓度0.1mM，28℃，180rpm诱导培养12h，4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集湿菌体。
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