CN112899246A

CN112899246A - 醛酮还原酶KmAKR突变体及其催化合成手性醇的应用

Info

Publication number: CN112899246A
Application number: CN202110136118.7A
Authority: CN
Inventors: 王亚军; 程峰; 邱帅; 李树芳; 郑裕国
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2021-02-01
Filing date: 2021-02-01
Publication date: 2021-06-04
Anticipated expiration: 2041-02-01
Also published as: CN112899246B

Abstract

本发明公开了一种醛酮还原酶KmAKR突变体及其催化合成手性醇的应用，所述醛酮还原酶KmAKR突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第30位、第302位、第109位、第196位、第23位或第213位进行单位点或多位点突变获得的。本发明构建的醛酮还原酶突变体M7和M9的比酶活较出发菌株分别增加了1.1倍和0.63倍，T₅₀ ¹⁵分别提升6.3℃和4.9℃。对于突变体M9，底物6‑氰基‑(5R)‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯投料量可达到350g/L时，3.7h内可反应完成，底物转化率大于99％，产物de_p值始终保持在99.5％以上，时空产率达到1.82kg/L·d。

Description

醛酮还原酶KmAKR突变体及其催化合成手性醇的应用

(一)技术领域

本发明涉及一种源自马克斯克鲁维酵母的醛酮还原酶KmAKR突变体，及在阿托伐他汀侧链双手性二醇6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯手性生物催化合成方面的应用。

(二)背景技术

阿托伐他汀和瑞舒伐他汀、匹伐他汀等“超级他汀”是治疗心脑血管疾病的重大降脂药品种，具有高效的降脂功效、长期安全性和临床益处，显著降低心脑血管疾病的发病率和死亡率。迄今为止，阿托伐他汀钙的累计销售额已突破1000亿美元，是人类制药工业史上最成功的单一药物品种。

他汀药物大多含有6-取代-(3R,5R/S)-二羟基己酸叔丁酯结构，既是重要的药效基团又是关键合成前体。6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯是阿托伐他汀钙的关键手性二醇中间体。由于6-取代-(3R,5R/S)-二羟基己酸叔丁酯具有两个手性中心，因此，研究光学纯6-取代-(3R,5R/S)-二羟基己酸叔丁酯的手性合成方法学和合成技术具有重要意义。

经典的Paal-Knorr化学合成法合成阿托伐他汀双手性中间体以(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯为原料，通过LDA(二异丙基胺基锂)脱质子缩合，在-90℃的条件下经 NaBH₄催化选择性还原生成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯，工业上利用硼烷等化学催化剂催化还原工艺存在能耗高、转化率低、差向选择性低和生产成本高等缺陷。与化学催化剂相比，酶作为绿色天然生物催化剂，在催化化学反应中具有优越的化学选择性、立体选择性和区域选择性等优点，且反应条件温和、副产物少、环境友好。但许多酶分子在催化非天然底物时，往往存在活力较低、稳定性差、底物产物抑制等问题，需要对酶分子实施分子改造。

得益于蛋白质工程的科技进步，生物催化已广泛应用于工业化生产。在我们前期专利申请(CN 201710282633.X,CN201910072740.9,CN201910932502.0)的基础上，本发明通过建立高通量筛选模型，构建有效突变体文库，进一步筛选获得具有高活性、高稳定性、更广阔的非天然底物普适性的超级突变体。突变体 KmAKR-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/Q213A/T23V(M7)和KmAKR-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/A30P/T302S/N109K/S196C(M9)的热稳定性和对6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的催化性能增强，其中突变体 KmAKR-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/Q213A/T23V(M7)对不同种类的脂肪链酮酯类化合物和芳基酮的活性也得到提高。本发明分析了突变体催化性能提升的分子机理，优化反应工艺参数，构建了M7和M9催化合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯工艺。

(三)发明内容

本发明目的是针对现有醛酮还原酶KmAKR对6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯不对称还原活性不高、催化剂(菌体)用量大以及对非天然酮酯类底物的活力低等问题，提供一种立体选择性醛酮还原酶KmAKR突变体及利用该醛酮还原酶KmAKR突变体基因重组菌及其酶液作为生物催化剂，用于不对称还原羰基化合物制备手性醇，当底物为6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯时，其中突变菌株M7和突变菌株M9的比酶活较出发菌株KmAKR-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M分别提高了1.1倍和 0.63倍，底物投料量、催化剂用量(S/C)和时空产率均有显著提升。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种醛酮还原酶KmAKR突变体，所述醛酮还原酶KmAKR突变体是将SEQID NO.1所示氨基酸序列第30位、第302位、第109位、第196位、第23 位或第213位进行单位点或多位点定点突变或者定点饱和突变获得的。本发明所述源自马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)的醛酮还原酶KmAKR氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，编辑基因核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明所述的醛酮还原酶KmAKR突变体优选为将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列突变为下列之一：(1)第23位苏氨酸突变为缬氨酸；(2)第213位谷氨酰胺突变为丙氨酸；(3)第30位丙氨酸突变为脯氨酸；(4)第302位苏氨酸变为丝氨酸；(5) 第109位天冬氨酸突变为赖氨酸；(6)第196位丝氨酸突变为半胱氨酸；(7)第213 位谷氨酰胺突变为丙氨酸，且第23位苏氨酸突变为缬氨酸(Q213A/T23V，记为M7，氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示)；(8)第30位丙氨酸突变为脯氨酸，第302位苏氨酸变为丝氨酸，第109位天冬氨酸突变为赖氨酸，第196位丝氨酸突变为半胱氨酸(A30P/T302S/N109K/S196C，记为M9，氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示)。

本发明还涉及所述述醛酮还原酶KmAKR突变体编码基因，重组载体以及工程菌。

本发明还提供一种所述醛酮还原酶KmAKR突变体在不对称还原羰基化合物制备手性醇中的应用，所述应用的方法为：将含醛酮还原酶KmAKR突变体基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体和含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体混合，以混合菌体为催化剂，以羰基化合物为底物，以葡萄糖为辅底物，以pH 7.0、 100mM的磷酸缓冲液(PBS)为反应介质构成转化体系，在30～40℃、600～800rpm (优选35℃、600rpm)条件下进行反应，反应结束，反应液分离纯化，获得手性醇化合物。

进一步，羰基化合物为下列之一：6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、6-氯-(5S)- 羟基-3-羰基己酸叔丁酯、4-氯-3-羰基丁酸乙酯、3-羰基乙酸乙酯、4,4,4,-三氟-3-羰基丁酸乙酯、3-羰基丁酸叔丁酯、4-氧代戊酸乙酯、3-氧代己酸乙酯、4-甲基-3-氧代戊酸甲酯、4-氯-3-羰基丁酸甲酯、4-甲基-3-氧代戊酸乙酯、苯乙酮、4-乙基苯乙酮、4- 甲氧基苯乙酮、3,4-二甲氧基苯乙酮、4-苯基-2-丁酮、苯丁酮，优选6-氰基-(5R)-羟基 -3-羰基己酸叔丁酯。

进一步，所述转化体系中，底物加入终浓度30～450g/L(优选200～400g/L)，葡萄糖加入终浓度30～450g/L(优选200～400g/L)，催化剂用量以混合菌体总量干重计为0.1～20g DCW/L(DCW细胞干重，优选8g DCW/L)，所述混合菌体中含醛酮还原酶KmAKR突变体基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体与含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体以干重比1.0～5.0:1.0(w/w)，优选3:1混合。所述葡萄糖脱氢酶基因(GenBankNo.KM817194.1)来自一种西伯利亚微小杆菌 (Exiguobacterium sibirium DSM 17290)，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明所述羰基化合物为6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯时，所述醛酮还原酶突变体不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制备6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的方法为：将含醛酮还原酶KmAKR突变体基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体和含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体混合，以混合菌体为催化剂，以6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，以葡萄糖为辅底物，以pH 7.0、100mM的PBS缓冲液为反应介质构成转化体系，在30～40℃、600～800rpm (优选35℃、600rpm)条件下进行反应，反应结束，反应液分离纯化，获得6-氰基 -(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯。

进一步，所述湿菌体按如下方法制备：将含醛酮还原酶KmAKR突变体基因的工程菌接种到含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养10h，获得种子液；将种子液以体积浓度1.0％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养2h(OD₆₀₀＝0.6～0.8)，培养液中加入终浓度为0.15mM异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG)，28℃培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，获得含醛酮还原酶KmAKR突变体的湿菌体；所述含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体制备方法同含醛酮还原酶KmAKR突变体基因的湿菌体。

进一步，本发明所述催化剂为含醛酮还原酶KmAKR突变体基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体提取的纯酶，以羰基化合物为底物，以NADPH为辅酶，以pH 7.0、 100mM的磷酸缓冲液(PBS)为反应介质构成转化体系，在30～40℃、600～800rpm (优选35℃、600rpm)条件下进行反应，反应结束，反应液分离纯化，获得手性醇化合物。所述转化体系中底物加入终浓度为0.5～2.0mM(优选1mM)，辅酶加入终浓度为0.5～2.0mM(优选1mM)；所述催化剂加入量为50-150mg/L(优选100mg/L) 或者所述催化剂加入量为5925-37290U/L(11850U/L)。

本发明所述纯酶按如下方法制备：将含醛酮还原酶KmAKR基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体以50g/L的量重悬于pH 7.0、100mM PBS缓冲液中，在冰水混合物上超声破碎10min，超声破碎条件：功率为400W，破碎1s、暂停1s，取破碎混合液，获得粗酶液；粗酶液8000rpm，4℃下离心10min，收集上清液，通过0.45μm 膜微过滤后，采用镍亲和柱(1.6×10cm，Bio-Rad公司，美国)纯化突变体蛋白，具体操作如下：①用缓冲液A(含300mM NaCl、20mM咪唑的pH 7.0、20mM PBS)进行预平衡；②以1.0mL/min的流速上样，用缓冲液A以1.0mL/min的流速洗去未结合的杂质，直至电导率稳定；③然后用缓冲液B(含0.3M NaCl、500mM咪唑的pH 7.0、 20mM PBS)洗脱目的蛋白；将收集的洗脱液用20mM PBS(pH 7.0)透析过夜，取截留液，即为突变体的纯酶液。

本发明醛酮还原酶KmAKR及醛酮还原酶KmAKR突变体碱基序列全长均为933 bp，从第一个碱基起至第933个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。

本发明所述醛酮还原酶KmAKR突变体M7和M9采用定点突变技术、迭代饱和突变及分步进化技术获得，运用上述技术对 KmAKR-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M醛酮还原酶基因(SEQ ID NO.1)进行突变，将获得的突变质粒以热击方式转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，对获得菌株进行接种、转接、诱导、菌体回收，利用重悬菌液催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原，制备光学纯6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯，具体方法如下：第一步将对照菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-kmakr-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M 活化并提取质粒pET28a(+)-kmakr-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M，并保存于 -20℃。第二步通过同源建模，获得待改造醛酮还原酶的三维结构；利用分子对接，获得影响底物与醛酮还原酶结合的关键氨基酸位点Thr 23、Ala 30、Thr 302。第三步，基于结构指导的氨基酸共义性方法，选择位于活性位点(

)，根据溶剂可及性表面积(SAS≥30％)的非共义氨基酸突变成亲水共义氨基酸以及(SAS<30％)的非共义氨基酸突变成疏水共义氨基酸的突变原则，确定关键氨基酸位点Asn109、 Ser196、Gln213。以pET28a(+)-kmakr-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M为模板质粒，通过对Asn109、Ser196、Gln213、A30、T302、T23进行定点饱和突变与定点突变，获得突变质粒，并转化，利用底物6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯能与2,4-二硝基苯肼发生显色反应，生成2,4-二硝基苯腙，在碱性环境下呈暗红色，得到优势突变位点A30P、T302S、T23V、N109K、S196C、Q213A，经组合突变，利用高通量方法对醛酮还原酶进行优势突变菌株的筛选，获得醛酮还原酶突变体菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-KmAKR-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/Q213A/T23V(记为突变体菌株M7)和E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-KmAKR-Y296W/W297H/K29H/Y28A/T63M/A30P/T302S/N109K/S196C(记为突变体菌株M9)。相较于出发菌株M5，突变体菌株M7和突变体菌株M9的比活力分别提高了1.1倍和0.63倍，T₅₀ ¹⁵提升6.3℃和4.9℃。

本发明醛酮还原酶KmAKR突变体和葡萄糖脱氢酶基因工程菌的接种、转接、诱导、菌体回收，培养基可为本领域任何可使菌体生长并产生本发明的培养基，优选 LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，蒸馏水溶解，调节pH 7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，培养方法和条件可以根据宿主类型和培养方法等因素的进行优化。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明构建的醛酮还原酶KmAKR突变体M7和M9的比酶活较对照组醛酮还原酶KmAKR分别增加了1.1倍和0.63倍， T₅₀ ¹⁵分别提升6.3℃和4.9℃。其中突变体 KmAKR-Y296W/W297H/K29H/Y28A/T63M/A30P/T302/N109K/S196C，底物6-氰基 -(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯投料量可达到350g/L时，产物浓度随时间的推移而逐渐升高，3.7h内可反应完成，底物转化率大于99％，产物de_p值始终保持在99.5％以上，时空产率达到1.82kg/(L·d)。突变体 KmAKR-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/Q213A/T23V，底物6-氰基-(5R)-羟基-3- 羰基己酸叔丁酯投料量可达到450g/L，产物浓度随时间的推移而逐渐升高，8h内可反应完全，底物转化率大于99％，产物de_p值始终保持在99.5％以上。时空产率达到 1.08kg/L·d。

(四)附图说明

图1是醛酮还原酶KmAKR与葡萄糖脱氢酶EsGDH偶联催化6-氰基-(5R)-羟基-3- 羰基己酸叔丁酯不对称还原制备6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的反应示意图。

图2醛酮还原酶KmAKR突变体纯酶液的SDS-PAGE电泳图。泳道1：对照 KmAKR-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M纯酶液；泳道2： KmAKR-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/AQ213A/T23V纯酶液；泳道3： KmAKR-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63L/A30P/T302S/N109K/S196C纯酶液；M：标准蛋白分子。

图3是利用醛酮还原酶KmAKR突变体M7和醛酮还原酶KmAKR突变体M9分别偶联EsGDH不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制备6-氰基-(3R,5R)- 二羟基己酸叔丁酯时间进程图。

图4为实施例6中突变菌株M9不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的液相色谱图。

图5为HPLC信号值(mAu)与产物6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯相应浓度(g/L) 的标准曲线。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：醛酮还原酶突变体文库的构建及筛选

1、出发菌株：

以专利申请CN201910932502.0中工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-kmakr-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M为出发菌株，记为菌株M5，活化并提取质粒pET28a(+)-kmakr-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M，其中醛酮还原酶kmakr-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，编码基因序列为SEQ ID NO.2所示。

2、单突变：

(1)突变文库的构建

醛酮还原酶KmAKR突变体文库的制备通过定点突变和随机突变来实现，以菌株 M5中载体pET28a(+)-kmakr-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M为模板，采用表1引物，进行聚合酶链式反应(PCR)。将经Clean-up纯化试剂盒((Axygen Scientific,Int,货号AP-PCR-250)纯化所得的重组质粒转移到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，并将克隆子接种至10mL LB平板培养基中，在37℃培养12h。

(2)初筛

随机挑选平板上的阳性克隆子及出发菌株M5，接种于96孔板中，加入1000μL LB培养基(含50μg/mL的卡那霉素)，在37℃，180rpm条件下培养10h，获得种子液。各转接50μL种子液于另一块新的96孔板(加有1000μL含50μg/mL的卡那霉素的LB培养基)中，37℃，180rpm振荡培养4h后，加入IPTG(终浓度0.15mM)，转至28℃培养16h。所得的细胞通过96孔板离心机，4000rpm，4℃下离心10min，得到突变体的湿菌体。

将含湿菌体的96孔板每个孔中加入180μL磷酸钾缓冲溶液(100mM pH 7.0) 重悬细胞，再分别加入终浓度为4g/L的葡萄糖脱氢酶(总酶活20.6U，4g/L的葡萄糖和4g/L的6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，在35℃，180rpm条件下反应30 min。每个孔中各吸取反应液20μL于酶标板中，再分别加入20μL20mM 2,4-二硝基苯肼显色液(称取3.9628mg 2,4-二硝基苯腈溶解于1mL含体积浓度3％浓硫酸的乙醇中，其中浓硫酸质量浓度98％)用于显色；最后加入20μL(100mM pH 7.0)磷酸钾缓冲溶液进行颜色稀释。将酶标板置于37℃下，保温15min后分别加入150μL 6 M NaOH水溶液，通过酶标仪在480nm吸光值下测定反应液的OD₄₈₀的吸光度。相应地，突变体酶活越高，反应液颜色越浅，OD₄₈₀处的吸光值越小，从而筛选出突变文库内活力相对较高的突变体，用于进一步的复筛并进行测序验证。

(3)HPLC复筛

对步骤(2)获得的突变体进行优势突变体的筛选，筛选条件如下：将步骤(2) 初筛获得的突变体湿菌体和实施例2方法制备的葡萄糖脱氢酶湿菌体以干重比 3.5:1(w/w)混合，将混合菌体以干重25g/L的量加入pH 7.0的PBS(100mM)中重悬，再加入终浓度30g/L6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，30g/L的葡萄糖构成转化体系10mL，在35℃、600rpm条件下进行反应5min，移取100μL反应液，加入900μL无水乙醇(即反应液稀释10倍)，沉淀蛋白，12000rpm离心3min，取上清液，经过0.22μm微滤膜过滤后，所得滤液采用HPLC检测6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯、6-氰基-(3S,5R)-二羟基己酸叔丁酯的浓度及产物de_p值。以产物6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯浓度和de_p为指标，筛选获得优势菌株，结果如表2所示。

HPLC信号值(mAu)与产物6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯相应浓度(g/L)的标准曲线为y＝165.7x-14.1，R²＝0.9996，标准曲线为图5所示。

de_p＝(c[6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯]-c[6-氰基-(3S,5R)-二羟基己酸叔丁酯])/(c[6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯]+c[6-氰基-(3S,5R)-二羟基己酸叔丁酯])，即反应生成的6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的浓度与反应所生成的6-氰基-(3S,5R)- 二羟基己酸叔丁酯浓度的差值除以反应所生成的6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的浓度与反应所生成的6-氰基-(3S,5R)-二羟基己酸叔丁酯浓度之和。

将获得优势菌株送杭州擎科生物技术有限公司测序，并保存在-80℃冰箱。最终筛选得到优势突变体为KmAKR-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/Q213A(记为 M5-Q213A)、KmAKR-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/T23V(记为M5-T23V)、 KmAKR-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/A30P(记为M5-A30P)、 KmAKR-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/T302S(记为M5-T302S)、 KmAKR-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/N109K(记为M5-N109K)、 KmAKR-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/S196C(记为M5-S196C)。

将各优势突变体插入载体pET28a(+)的Nco I和Xho I两个酶切位点之间，并导入E.coli BL21(DE3)感受细胞中，构建相应的工程菌，例如将 KmAKR-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/Q213A转入载体pET28a(+)，并导入E. coli BL21(DE3)感受细胞中，构建工程菌E.coli BL21(DE3)- KmAKR-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/Q213A，记为菌株M5-Q213A。

3、双突变

以菌株M5-Q213A中载体pET28a(+)-kmakr-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/

Q213A为模板，所使用到的引物为表1中T23V、A30P、T302S、N109K、S196C。将其他五个突变体位点分别组合叠加到M5-Q213A上，即

pET28a(+)-kmakr-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/Q213A/T23V、

pET28a(+)-kmakr-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/Q213A/A30P、

pET28a(+)-kmakr-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/Q213A/T302S、

pET28a(+)-kmakr-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/Q213A/N109K、

pET28a(+)-kmakr-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/Q213A/S196C。结果发现只有M5-Q213A/T23V为活力较M5-Q213A提高的正突变体，其他均为负突变。结果如表2所示。最终获得醛酮还原酶突变体菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-KmAKR-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/Q213A/T23V(记为突变菌株M7)，对应的醛酮还原酶突变体为 KmAKR-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/Q213A/T23V。

4、多突变

以菌株M5-A30P中载体pET28a(+)-kmakr-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/

A30P为模板，将除Q213A和T23V的其他剩余的三个单突变体分别与M5-A30P 进行组合突变。所使用的引物为表1中的T302S、N109K、S196C。通过对不同突变体进行两两组合已经多突变组合，结果如表2所示。即

pET28a(+)-kmakr-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/A30P/T302S、

pET28a(+)-kmakr-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/A30P/N109K、

pET28a(+)-kmakr-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/A30P/S196C、

pET28a(+)-kmakr-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/A30P/T302S/N109K、

pET28a(+)-kmakr-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/A30P/T302S/S196C、

pET28a(+)-kmakr-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/A30P/N109K/S196C、

pET28a(+)-kmakr-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/A30P/T302S/N109K/S196C。

最终获得醛酮还原酶突变体菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-KmAKR-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/A30P/T302S/N109 K/S196C(记为突变菌株M9)，对应的醛酮还原酶突变体为 KmAKR-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/A30P/T302S/N109K/S196C。

PCR反应体系(25μL)：1μL正向引物(100μM)，1μL反向引物(100μM)，12.5 μL 2×Phanta缓冲液，0.5μL dNTP混合物(各10mM)，1μL质粒模板，0.5μL DNA 聚合酶和8.5μL超纯水。

根据Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶手册设置的PCR程序如下：95℃预变性5min，然后30个循环(95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸7s)，72℃终延伸10min，16℃保温。

液相检测条件：色谱柱

C18(4.6×250mm，Acchrom,China)柱，流动相乙腈:水体积比为1:3(v/v)，流速1.0mL/min，检测波长210nm，进样量10μL，柱温40℃。6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯保留时间分别为：13.9min，9.8min。

表1醛酮还原酶定点饱和突变引物设计

表2醛酮还原酶及其突变体的相对酶活

实施例2：出发菌株和突变体菌株醛酮还原酶及葡萄糖脱氢酶的诱导表达

1、葡萄糖脱氢酶基因工程菌：将来自西伯利亚微小杆菌(Exiguobacteriumsibirium DSM 17290)葡萄糖脱氢酶基因esgdh(GenBank No.KM817194.1，核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示)插入到pET28b(+)的Nco I和Xho I两个酶切位点之间，构建重组表达载体；并将此表达载体转入E.coli BL21(DE3)，挑取单菌落接种至LB培养基，37℃培养12h，测序确定葡萄糖脱氢酶构建成功，制得E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-esgdh。

2、诱导表达：将实施例1出发菌株M5和突变菌株M7、突变菌株M9以及E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-esgdh分别接种到含有终浓度50μg/mL卡那霉素的10mL LB 液体培养基中，37℃，180rpm条件下培养10h，获得种子液。将种子液以体积浓度 1.0％(v/v)的接种量接种到新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的100mL LB液体培养基摇瓶中，37℃、180rpm培养至OD₆₀₀为0.6～0.8之间，再向培养液中加入终浓度为0.15mM IPTG，28℃培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，获得相应的湿菌体细胞。

以上获得的细胞产有相应的蛋白，可用于蛋白纯酶液的制备，也可用于粗酶液催化不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制备6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯。

3、催化活性

将步骤2诱导表达的突变菌株M7、突变菌株M9的湿菌体及葡萄糖脱氢酶湿菌体以干重比3.0:1(w/w)混合，加入pH 7.0、100mM PBS缓冲液重悬，分别获得混合菌液。同样条件下，用出发菌株M5湿菌体替换突变菌株湿菌体制备对照株混合菌液。

分别将突变株混合菌液和对照株混合菌液作为催化剂，以6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，以葡萄糖为辅助底物，不添加外源性NADPH或NADP⁺，运用菌体内源型NADPH，建立起辅酶循环系统。反应体系选择为10mL，催化剂用量以混合菌体总干重计20g/L，底物终浓度30g/L，葡萄糖终浓度30g/L，pH 7.0、100 mM PBS缓冲液为反应介质构建转化体系，35℃、600rpm下反应5min，移取100μL 反应液，加入900μL无水乙醇，沉淀蛋白，12000rpm离心3min，取上清液，经过 0.22μm微滤膜过滤，滤液制备HPLC样品，采用实施例1所述HPLC检测6-氰基-(5R)- 羟基-3-羰基己酸叔丁酯、6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯、6-氰基-(3S,5R)-二羟基己酸叔丁酯的生成量及de_p值。以产物6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯和de_p为指标，实验结果示于表3。

液相检测条件：色谱柱

C18(4.6×250mm，Acchrom,China)柱，流动相乙腈:水体积比为1:3，流速1.0mL/min，检测波长210nm，进样量10μL，柱温40℃。 6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯保留时间分别为：13.9min，9.8min。

表3 M5及其突变体的催化性能和立体选择性

实施例3：醛酮还原酶出发菌株及其突变体菌株中醛酮还原酶的纯化

将出发菌株M5、实施例2获得的醛酮还原酶突变株M7、突变株M9湿菌体，用 0.9g/mL生理盐水洗涤两次。按照湿菌体总量100g/L的量加入pH 7.0、100mM PBS 缓冲液中重悬，在冰水混合物上超声破碎6min，超声破碎条件：功率为400W，破碎1s、暂停1s，获得突变株粗酶液。通过在8000rpm，4℃下离心10min，收集上清液20mL，通过0.45μm膜微过滤后，滤液采用Ni亲和柱纯化突变体蛋白。

使用镍亲和柱(1.6×10cm，Bio-Rad公司，美国)纯化突变体蛋白，具体操作如下：①用缓冲液A(含300mM NaCl、20mM咪唑的pH 7.0、20mM PBS)进行预平衡。②以1.0mL/min的流速上样，用缓冲液A以1.0mL/min的流速洗去未结合的杂质，直至电导率稳定。③然后用缓冲液B(含0.3M NaCl、500mM咪唑的pH 7.0、20 mM PBS)洗脱目的蛋白。将收集的洗脱液用20mM PBS(pH 7.0)透析过夜，取截留液，即为突变体纯酶，分别获得KmAKR-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M纯酶20 mL，蛋白浓度为5.3g/L；KmAKR-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/Q213A/T23V 纯酶20mL，蛋白浓度为5.7g/L；

KmAKR-Y296W/W297H/K29H/Y28A/T63M/A30P/T302S/N109K/S196C纯酶20 mL，蛋白浓度为5.4g/L。所有纯化步骤均在4℃下进行。蛋白浓度用二喹啉甲酸蛋白测定试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司，南京)测定。

用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定蛋白质大小，电泳结果示于图2，突变菌株的目标酶表达量较出发菌株酶的表达量没有显著变化，因此，突变菌株的酶活提高不是酶的表达量增加引起的，与酶自身比活力增加有关。

实施例4：母本醛酮还原酶及其突变体M7和M9纯酶比酶活及半失活温度的测定

酶活单位(U)定义为：在35℃、pH 7.0条件下，每分钟每生成1μmol 6-氰基 -(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯所需的酶量定义为一个酶活单位U。比酶活定义为每mg 酶蛋白所具有的活力单位数，U/mg。

酶活检测标准条件：10mM 6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，1mM NADPH，实施例3方法制备的40mg/L酶液，并用pH 7.0的100mM PBS缓冲液补齐至500 μL，35℃、pH7.0，600rpm条件下反应3min，采用实施例2方法进行HPLC检测分析，结果见表4所示。

T₅₀ ¹⁵(半失活温度)测定方法：将实施例3中突变体纯酶稀释至同一浓度(1 mg/mL)，并将稀释后的纯酶放置一定温度梯度下(42、44、46、48、50、52、54、 56、58、60、62℃)保温孵育15min，并立即放置冰上冷却，使用酶活检测条件进行检测，测量各个温度下的残余酶活，从而得到T₅₀ ¹⁵。

表4醛酮还原酶及其两株突变体的比活力、相对酶活、半失活温度T₅₀ ¹⁵值

实施例5：出发菌株M5不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯

将实施例2方法制备的出发菌株M5湿菌体和葡萄糖脱氢酶EsGDH湿菌体建立双酶偶联体系，催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯生成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯。

将实施例2方法制备的出发菌株M5湿菌体和葡萄糖脱氢酶EsGDH湿菌体以干重比3.5:1(w/w)混合成混合菌体，在50mL反应体系中，先将混合菌体用pH 7.0、 100mM的PBS缓冲液重悬，转化体系中混合菌体加入干重量为20g DCW/L，底物 6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的投料量为450g/L，葡萄糖浓度为450g/L，以 pH 7.0、100mM的PBS缓冲液为反应介质构成转化体系，在35℃、600rpm条件下反应，采用实施例2方法检测，7.0h能完全转化成产物6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯，底物转化率大于99％，产物de_p值始终保持在99.5％以上。产物的浓度为881.1 mM，时空产率达到1224.3g/L d。

实施例6：突变菌株M9不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯

在50mL反应体系中，将实施例2方法制备的突变菌株M9湿菌体和葡萄糖脱氢酶EsGDH湿菌体以干重比3.5:1(w/w)混合成混合菌体，混合菌体先用pH 7.0、100 mM PBS缓冲液重悬，反应体系中混合菌体的投加总干重量为7g DCW/L，将底物6- 氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的初始投料量设定为350g/L，葡萄糖的浓度为350 g/L，pH 7.0、100mM PBS缓冲液为反应介质构建转化体系，35℃、600rpm反应。采用实施例2方法检测，反应进程曲线如图3所示，产物的HPLC如图4所示，产物浓度随时间的推移而逐渐升高，5.5h反应完成，可完全转化成1222.7mM的产物，产物de_p值>99.5％，时空产率可达1827.2g/L d。

实施例7：突变菌株M7不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯

在50mL反应体系中，将实施例2的方法制备的突变菌株M7湿菌体和葡萄糖脱氢酶EsGDH湿菌体以干重比3.5:1(w/w)混合成混合菌体，混合菌体先用pH 7.0、 100mM PBS缓冲液重悬，反应体系中混合菌体的投加总干重量为3.75g DCW/L，将底物6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的初始投料量设定为450g/L，葡萄糖的浓度为450g/L，pH 7.0、100mMPBS缓冲液为反应介质构建转化体系，35℃、600rpm 反应。反应进程曲线如图3所示，产物浓度随时间的推移而逐渐升高，产物经HPLC 检测在10.775min处出现物质峰，出峰时间与图4中10.775min处产物峰相一致，经确定为产物为6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯，8h内反应完成，产物de_p值>99.5％，时空产率可达1080.5g/L d。

实施例8：突变菌株M9和突变菌株M7不对称还原系列羰基化合物

将实施例3方法制备的出发菌株M5的纯酶 KmAKR-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M、突变菌株M7的纯酶KmAKR-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/Q213A/T23V和突变菌株M9的纯酶KmAKR-W297H/Y296W/K29H/Y28A/T63M/A30P/T302S/N109K/S196C作为催化剂，用分光光度法检测340nm下NADPH吸光度的变化来测定了M5、M7和M9纯酶对各种酮或酮酸酯的比活力。200μL反应体系中，加入终浓度1mM底物，1mM NADPH 和100mg/L突变菌株的纯酶(实施例3方法制备)，并用pH 7.0 100mM的PBS缓冲液补齐至200μL，在35℃、600rpm的条件下反应1min后，通过分光光度计检测 340nm波长下的吸光值变化。酶的活性计算公式为U＝(EW×V×1000)/(6220M^-1cm^-1×1)，其中EW为吸光值的变化值，V为反应总体积，1为光程距离(cm)。比酶活为单位酶量所具有的活力，计算公式，比酶活(U/mg)＝总活力/纯酶质量。表4可以看出突变体M7对脂肪链酮酯类化合物和芳香族酮酯类化合物都具有较高的活性，拓宽了对不同酮酯类化合物的底物谱，对合成多种手性醇类化合物具有潜在的应用价值。 M9相较于M5，对多种脂肪链酮酯类化合物的活性均有提高。结果如表5所示。

表5醛酮还原酶KmAKR突变体催化系列羰基化合物不对称还原反应的结果

N.D.:表示对该底物无活性。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 醛酮还原酶KmAKR突变体及其催化合成手性醇的应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 312

<212> PRT

<213> 马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)

<400> 1

Met Thr Asn Gln Lys Phe Phe Thr Leu Ser Asn Gly Asn Lys Ile Pro

1 5 10 15

Ala Val Ala Val Val Gly Thr Gly Thr Lys Trp Ala His Ala Glu Glu

20 25 30

Thr Asp Ala Thr Phe Ser Gln Glu Leu Thr Asp Ile Val Lys Leu Ser

35 40 45

Leu Asp Thr Val Pro Gly Ile Val His Ile Asp Ala Ala Glu Met Tyr

50 55 60

Lys Thr Tyr Pro Glu Leu Gly Ala Ala Leu Lys Glu Thr Lys Lys Pro

65 70 75 80

Arg Glu Glu Ile Phe Ile Thr Asp Lys Phe Ser Ser Leu His Lys Ile

85 90 95

Ser Glu Asp Pro Lys Ser Ala Leu Glu Thr Ala Leu Asn Lys Leu Gly

100 105 110

Val Asp Tyr Val Asp Leu Tyr Leu Ile His Ser Pro Phe Phe Asp Lys

115 120 125

Asp Leu Asn Ile Asp Leu Glu Thr Ala Trp Lys Gln Leu Glu Glu Leu

130 135 140

Tyr Lys Ser Gly Lys Ala Lys Asn Ile Gly Val Ser Asn Phe Thr Val

145 150 155 160

Glu Asp Leu Lys Lys Val Leu Ala Ile Ala Glu Ile Lys Pro Gln Val

165 170 175

Asn Gln Ile Glu Phe Ser Pro Phe Leu Gln Asn Gln Thr Pro Gly Ile

180 185 190

Val Glu Phe Ser Gln Lys Asn Asp Ile Leu Leu Glu Ala Tyr Ser Pro

195 200 205

Leu Gly Pro Leu Gln Lys Lys Pro Ala Asp Ala Asp Gln Gln Pro Phe

210 215 220

Tyr Gln Tyr Leu Lys Glu Leu Ser Glu Lys Tyr Asn Lys Thr Glu Ala

225 230 235 240

Gln Val Leu Leu Leu Trp Val Tyr Lys Arg Gly Ile Leu Pro Val Thr

245 250 255

Thr Ser Ala Lys Ile Glu Arg Ile Lys Gln Ala Gln Asp Ile Phe Ser

260 265 270

Phe Asp Leu Thr Glu Glu Glu Val Lys Lys Ile Thr Asp Leu Gly Leu

275 280 285

Gln His Glu Pro Val Arg Leu Trp His Val Asp Phe Tyr Thr Lys Tyr

290 295 300

Asn Ser Glu Ala Gln Lys Leu Glu

305 310

<210> 2

<211> 936

<212> DNA

<213> 马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)

<400> 2

atgacaaacc aaaagttctt tactttatcc aatgggaaca agattccagc tgttgctgtt 60

gttggtacag gtaccaagtg ggcccacgct gaagaaaccg atgctacttt ctctcaagaa 120

ttgactgata tcgtaaagct atctttagac actgttccag gaattgttca cattgatgca 180

gccgagatgt acaagactta tccagagttg ggtgctgctt tgaaggaaac aaagaagccc 240

agggaagaga ttttcattac agacaagttt tcttccttgc acaagatttc ggaagatcct 300

aagtctgctt tagaaaccgc tttgaacaag ctaggagttg attatgttga cttatacttg 360

attcattctc catttttcga caaggacttg aatattgatc tagagaccgc ttggaagcaa 420

ttggaagaac tatataaatc cggaaaggca aagaacattg gtgtctcaaa ctttactgtt 480

gaggatttga aaaaagtttt ggccattgct gaaattaaac ctcaagtgaa tcaaatcgag 540

ttttctccat tcttgcaaaa ccagacccca ggtatcgtgg agtttagcca aaagaacgat 600

attttactag aagcctattc tccattaggt cctctccaaa agaagccagc tgatgctgac 660

caacaaccat tctatcaata tctgaaggaa ctttctgaaa agtataacaa aactgaagct 720

caagttttgt tgttgtgggt gtacaagcgc ggtatcttgc cagttaccac ttctgccaag 780

atcgagagaa tcaagcaagc ccaagacatc ttcagctttg atcttactga agaagaggta 840

aagaaaatta ccgatttggg tttacaacat gaacctgtta gattgtggca tgttgatttc 900

tacaccaagt acaactccga agcccaaaaa ctcgag 936

<210> 3

<211> 312

<212> PRT

<213> 马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)

<400> 3

Met Thr Asn Gln Lys Phe Phe Thr Leu Ser Asn Gly Asn Lys Ile Pro

1 5 10 15

Ala Val Ala Val Val Gly Val Gly Thr Lys Trp Ala His Ala Glu Glu

20 25 30

Thr Asp Ala Thr Phe Ser Gln Glu Leu Thr Asp Ile Val Lys Leu Ser

35 40 45

Leu Asp Thr Val Pro Gly Ile Val His Ile Asp Ala Ala Glu Met Tyr

50 55 60

Lys Thr Tyr Pro Glu Leu Gly Ala Ala Leu Lys Glu Thr Lys Lys Pro

65 70 75 80

Arg Glu Glu Ile Phe Ile Thr Asp Lys Phe Ser Ser Leu His Lys Ile

85 90 95

Ser Glu Asp Pro Lys Ser Ala Leu Glu Thr Ala Leu Asn Lys Leu Gly

100 105 110

Val Asp Tyr Val Asp Leu Tyr Leu Ile His Ser Pro Phe Phe Asp Lys

115 120 125

Asp Leu Asn Ile Asp Leu Glu Thr Ala Trp Lys Gln Leu Glu Glu Leu

130 135 140

Tyr Lys Ser Gly Lys Ala Lys Asn Ile Gly Val Ser Asn Phe Thr Val

145 150 155 160

Glu Asp Leu Lys Lys Val Leu Ala Ile Ala Glu Ile Lys Pro Gln Val

165 170 175

Asn Gln Ile Glu Phe Ser Pro Phe Leu Gln Asn Gln Thr Pro Gly Ile

180 185 190

Val Glu Phe Ser Gln Lys Asn Asp Ile Leu Leu Glu Ala Tyr Ser Pro

195 200 205

Leu Gly Pro Leu Ala Lys Lys Pro Ala Asp Ala Asp Gln Gln Pro Phe

210 215 220

Tyr Gln Tyr Leu Lys Glu Leu Ser Glu Lys Tyr Asn Lys Thr Glu Ala

225 230 235 240

Gln Val Leu Leu Leu Trp Val Tyr Lys Arg Gly Ile Leu Pro Val Thr

245 250 255

Thr Ser Ala Lys Ile Glu Arg Ile Lys Gln Ala Gln Asp Ile Phe Ser

260 265 270

Phe Asp Leu Thr Glu Glu Glu Val Lys Lys Ile Thr Asp Leu Gly Leu

275 280 285

Gln His Glu Pro Val Arg Leu Trp His Val Asp Phe Tyr Thr Lys Tyr

290 295 300

Asn Ser Glu Ala Gln Lys Leu Glu

305 310

<210> 4

<211> 936

<212> DNA

<213> 马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)

<400> 4

atgacaaacc aaaagttctt tactttatcc aatgggaaca agattccagc tgttgctgtt 60

gttggtgtgg gtaccaagtg ggcccacgct gaagaaaccg atgctacttt ctctcaagaa 120

ttgactgata tcgtaaagct atctttagac actgttccag gaattgttca cattgatgca 180

gccgagatgt acaagactta tccagagttg ggtgctgctt tgaaggaaac aaagaagccc 240

agggaagaga ttttcattac agacaagttt tcttccttgc acaagatttc ggaagatcct 300

aagtctgctt tagaaaccgc tttgaacaag ctaggagttg attatgttga cttatacttg 360

attcattctc catttttcga caaggacttg aatattgatc tagagaccgc ttggaagcaa 420

ttggaagaac tatataaatc cggaaaggca aagaacattg gtgtctcaaa ctttactgtt 480

gaggatttga aaaaagtttt ggccattgct gaaattaaac ctcaagtgaa tcaaatcgag 540

ttttctccat tcttgcaaaa ccagacccca ggtatcgtgg agtttagcca aaagaacgat 600

attttactag aagcctattc tccattaggt cctctcgcga agaagccagc tgatgctgac 660

caacaaccat tctatcaata tctgaaggaa ctttctgaaa agtataacaa aactgaagct 720

caagttttgt tgttgtgggt gtacaagcgc ggtatcttgc cagttaccac ttctgccaag 780

atcgagagaa tcaagcaagc ccaagacatc ttcagctttg atcttactga agaagaggta 840

aagaaaatta ccgatttggg tttacaacat gaacctgtta gattgtggca tgttgatttc 900

tacaccaagt acaactccga agcccaaaaa ctcgag 936

<210> 5

<211> 312

<212> PRT

<213> 马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)

<400> 5

Met Thr Asn Gln Lys Phe Phe Thr Leu Ser Asn Gly Asn Lys Ile Pro

1 5 10 15

Ala Val Ala Val Val Gly Thr Gly Thr Lys Trp Ala His Pro Glu Glu

20 25 30

Thr Asp Ala Thr Phe Ser Gln Glu Leu Thr Asp Ile Val Lys Leu Ser

35 40 45

Leu Asp Thr Val Pro Gly Ile Val His Ile Asp Ala Ala Glu Met Tyr

50 55 60

Lys Thr Tyr Pro Glu Leu Gly Ala Ala Leu Lys Glu Thr Lys Lys Pro

65 70 75 80

Arg Glu Glu Ile Phe Ile Thr Asp Lys Phe Ser Ser Leu His Lys Ile

85 90 95

Ser Glu Asp Pro Lys Ser Ala Leu Glu Thr Ala Leu Lys Lys Leu Gly

100 105 110

Val Asp Tyr Val Asp Leu Tyr Leu Ile His Ser Pro Phe Phe Asp Lys

115 120 125

Asp Leu Asn Ile Asp Leu Glu Thr Ala Trp Lys Gln Leu Glu Glu Leu

130 135 140

Tyr Lys Ser Gly Lys Ala Lys Asn Ile Gly Val Ser Asn Phe Thr Val

145 150 155 160

Glu Asp Leu Lys Lys Val Leu Ala Ile Ala Glu Ile Lys Pro Gln Val

165 170 175

Asn Gln Ile Glu Phe Ser Pro Phe Leu Gln Asn Gln Thr Pro Gly Ile

180 185 190

Val Glu Phe Cys Gln Lys Asn Asp Ile Leu Leu Glu Ala Tyr Ser Pro

195 200 205

Leu Gly Pro Leu Gln Lys Lys Pro Ala Asp Ala Asp Gln Gln Pro Phe

210 215 220

Tyr Gln Tyr Leu Lys Glu Leu Ser Glu Lys Tyr Asn Lys Thr Glu Ala

225 230 235 240

Gln Val Leu Leu Leu Trp Val Tyr Lys Arg Gly Ile Leu Pro Val Thr

245 250 255

Thr Ser Ala Lys Ile Glu Arg Ile Lys Gln Ala Gln Asp Ile Phe Ser

260 265 270

Phe Asp Leu Thr Glu Glu Glu Val Lys Lys Ile Thr Asp Leu Gly Leu

275 280 285

Gln His Glu Pro Val Arg Leu Trp His Val Asp Phe Tyr Ser Lys Tyr

290 295 300

Asn Ser Glu Ala Gln Lys Leu Glu

305 310

<210> 6

<211> 936

<212> DNA

<213> 马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)

<400> 6

atgacaaacc aaaagttctt tactttatcc aatgggaaca agattccagc tgttgctgtt 60

gttggtacag gtaccaagtg ggcccacccc gaagaaaccg atgctacttt ctctcaagaa 120

ttgactgata tcgtaaagct atctttagac actgttccag gaattgttca cattgatgca 180

gccgagatgt acaagactta tccagagttg ggtgctgctt tgaaggaaac aaagaagccc 240

agggaagaga ttttcattac agacaagttt tcttccttgc acaagatttc ggaagatcct 300

aagtctgctt tagaaaccgc tttgaaaaag ctaggagttg attatgttga cttatacttg 360

attcattctc catttttcga caaggacttg aatattgatc tagagaccgc ttggaagcaa 420

ttggaagaac tatataaatc cggaaaggca aagaacattg gtgtctcaaa ctttactgtt 480

gaggatttga aaaaagtttt ggccattgct gaaattaaac ctcaagtgaa tcaaatcgag 540

ttttctccat tcttgcaaaa ccagacccca ggtatcgtgg agttttgtca aaagaacgat 600

attttactag aagcctattc tccattaggt cctctccaaa agaagccagc tgatgctgac 660

caacaaccat tctatcaata tctgaaggaa ctttctgaaa agtataacaa aactgaagct 720

caagttttgt tgttgtgggt gtacaagcgc ggtatcttgc cagttaccac ttctgccaag 780

atcgagagaa tcaagcaagc ccaagacatc ttcagctttg atcttactga agaagaggta 840

aagaaaatta ccgatttggg tttacaacat gaacctgtta gattgtggca tgttgatttc 900

tacagtaagt acaactccga agcccaaaaa ctcgag 936

<210> 7

<211> 789

<212> DNA

<213> 西伯利亚微小杆菌(Exiguobacterium sibirium)

<400> 7

atgggttata attctctgaa aggcaaagtc gcgattgtta ctggtggtag catgggcatt 60

ggcgaagcga tcatccgtcg ctatgcagaa gaaggcatgc gcgttgttat caactatcgt 120

agccatccgg aggaagccaa aaagatcgcc gaagatatta aacaggcagg tggtgaagcc 180

ctgaccgtcc agggtgacgt ttctaaagag gaagacatga tcaacctggt gaaacagact 240

gttgatcact tcggtcagct ggacgtcttt gtgaacaacg ctggcgttga gatgccttct 300

ccgtcccacg aaatgtccct ggaagactgg cagaaagtga tcgatgttaa tctgacgggt 360

gcgttcctgg gcgctcgtga agctctgaaa tacttcgttg aacataacgt gaaaggcaac 420

attatcaata tgtctagcgt ccacgaaatc atcccgtggc ctactttcgt acattacgct 480

gcttctaagg gtggcgttaa actgatgacc cagactctgg ctatggaata tgcaccgaaa 540

ggtatccgca ttaacgctat cggtccaggc gcgatcaaca ctccaattaa tgcagaaaaa 600

ttcgaggatc cgaaacagcg tgcagacgtg gaaagcatga tcccgatggg caacatcggc 660

aagccagagg agatttccgc tgtcgcggca tggctggctt ctgacgaagc gtcttacgtt 720

accggcatca ccctgttcgc agatggtggc atgaccctgt acccgagctt tcaggctggc 780

cgtggttga 789

Claims

1.一种醛酮还原酶KmAKR突变体，其特征在于所述醛酮还原酶KmAKR突变体是将SEQ IDNO.1所示氨基酸序列第30位、第302位、第109位、第196位、第23位或第213位进行单位点或多位点突变获得的。

2.如权利要求1所述醛酮还原酶KmAKR突变体，其特征在于所述的醛酮还原酶KmAKR突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列突变为下列之一：(1)第23位苏氨酸突变为缬氨酸；(2)第213位谷氨酰胺突变为丙氨酸；(3)第30位丙氨酸突变为脯氨酸；(4)第302位苏氨酸变为丝氨酸；(5)第109位天冬氨酸突变为赖氨酸；(6)第196位丝氨酸突变为半胱氨酸；(7)第213位谷氨酰胺突变为丙氨酸，且第23位苏氨酸突变为缬氨酸；(8)第30位丙氨酸突变为脯氨酸，第302位苏氨酸变为丝氨酸，第109位天冬氨酸突变为赖氨酸，第196位丝氨酸突变为半胱氨酸。

3.一种权利要求1所述醛酮还原酶KmAKR突变体编码基因构建的重组基因工程菌。

4.一种权利要求1所述醛酮还原酶KmAKR突变体在不对称还原羰基化合物制备手性醇中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：将含醛酮还原酶KmAKR突变体基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体和含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体混合，以混合菌体为催化剂，以羰基化合物为底物，以葡萄糖为辅底物，以pH7.0、100mM的磷酸缓冲液为反应介质构成转化体系，在30～40℃、600～800rpm条件下进行反应，反应结束，反应液经分离纯化获得手性醇化合物。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述羰基化合物为下列之一：6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、6-氯-(5S)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、4-氯-3-羰基丁酸乙酯、3-羰基乙酸乙酯、4,4,4,-三氟-3-羰基丁酸乙酯、3-羰基丁酸叔丁酯、4-氧代戊酸乙酯、3-氧代己酸乙酯、4-甲基-3-氧代戊酸甲酯、4-氯-3-羰基丁酸甲酯、4-甲基-3-氧代戊酸乙酯、苯乙酮、4-乙基苯乙酮、4-甲氧基苯乙酮、3,4-二甲氧基苯乙酮、4-苯基-2-丁酮、苯丁酮。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述转化体系中，底物加入终浓度30～450g/L，葡萄糖加入终浓度30～450g/L，催化剂用量以混合菌体总量干重计为0.1～20g DCW/L，所述混合菌体中含醛酮还原酶KmAKR突变体基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体与含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体以干重比1.0～5.0:1.0混合。

8.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备：将含醛酮还原酶KmAKR突变体基因的工程菌接种到含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养10h，获得种子液；将种子液以体积浓度1.0％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8，培养液中加入终浓度为0.15mM异丙基硫代半乳糖苷，28℃培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，获得含醛酮还原酶突变体的湿菌体；所述含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体制备方法同含醛酮还原酶突变体基因的湿菌体。

9.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述催化剂为含醛酮还原酶KmAKR突变体基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体提取的纯酶，以羰基化合物为底物，以NADPH为辅酶，以pH 7.0、100mM的磷酸缓冲液为反应介质构成转化体系，在30～40℃、600～800rpm条件下进行反应，反应结束，反应液分离纯化，获得手性醇化合物；所述转化体系中底物加入终浓度为0.5～2.0mM，辅酶加入终浓度为0.5～2.0mM，所述催化剂加入量为5925-37290U/L。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述纯酶按如下方法制备：将含醛酮还原酶KmAKR突变体基因的工程菌经发酵培养的湿菌体以50g/L的量重悬于pH 7.0、100mMPBS缓冲液中，在冰水混合物上超声破碎10min，超声破碎条件：功率为400W，破碎1s、暂停1s，取破碎混合液，获得粗酶液；粗酶液8000rpm，4℃下离心10min，收集上清液，通过0.45μm膜微过滤后，采用镍亲和柱纯化突变体蛋白，纯化操作如下：①用含300mM NaCl、20mM咪唑的pH 7.0、20mM PBS进行预平衡；②以1.0mL/min的流速上样，用含300mM NaCl、20mM咪唑的pH 7.0、20mM PBS以1.0mL/min的流速洗去未结合的杂质，直至电导率稳定；③然后用含0.3M NaCl、500mM咪唑的pH 7.0、20mM PBS洗脱目的蛋白；将收集的洗脱液用20mM pH 7.0PBS透析过夜，取截留液，即为突变体的纯酶。