CN110387361A - 一种醛酮还原酶及其应用 - Google Patents

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杜永静
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Abstract

本发明涉及一种醛酮还原酶，及其重组表达转化体作为生物催化剂在不对称还原2‑羰基‑4‑苯基丁酸乙酯合成(R)‑2‑羟基‑4‑苯基丁酸乙酯中的应用，属于生物工程技术领域。本发明所述醛酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述醛酮还原酶的编码基因对应所述SEQ ID NO.1氨基酸序列的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2所示。本发明提供了一种新的醛酮还原酶。本发明中所述的醛酮还原酶具有较高的催化性能。

Description

一种醛酮还原酶及其应用
技术领域
本发明涉及一种醛酮还原酶，及其重组表达转化体作为生物催化剂在不对称还原2-羰基-4-苯基丁酸乙酯合成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯中的应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯（分子式为C12H16O3，分子量为208.25，CAS号为90315-82-5）是合成多种血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）药物（如贝那普利，西拉普利等）的重要手性砌块。ACEI类药物主要用于治疗高血压、充血性心力衰竭等疾病。在抗高血压药物市场中，与非肽类血管紧张素II受体抑制剂，钙通道拮抗剂共居前三位置。因此，研究(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的手性合成具有广阔应用前景。(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的合成有化学法和生物法两种。与化学法相比，生物法具有条件温和、高转化率、高对映体选择性等多种优点。生物法又包括动力学拆分法和不对称合成法。其中，不对称合成法由于可达到100%的理论产率从而更受研究者的重视。
不对称合成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯可由醛酮还原酶或者含有醛酮还原酶的菌株催化2-氧代-4-苯基丁酸乙酯来生产。目前可以用于不对称合成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的野生型菌株有酿酒酵母、光滑假丝酵母等。Shi Yu-Gang以野生型酿酒酵母菌体作为生物催化剂不对称合成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯，反应液中R型产物占70.4%，无法满足医药行业对手性的要求（Yu-Gang Shi, Yun Fang, Yue-Ping Ren, Hong-Ping Wu andHui-Lei Guan. “Effect of ionic liquid [BMIM][PF6] on asymmetric reduction ofethyl 2-oxo-4-phenylbutyrate by Saccharomyces cerevisiae”. Journal ofIndustrial Microbiology & Biotechnology (2008) 35:1419–1424）。以野生型宿主作为催化主题的反应普遍存在产物浓度不高，反应时间较长，手性纯度较低的缺点。
利用基因重组菌株不对称合成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯是另一条可行的技术。Yun Hyungdon利用大肠杆菌属来源的2-酮酸还原酶和枯草芽孢杆菌属来源的葡萄糖脱氢酶构建了重组菌株，完全催化生成0.1 M (R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯需要24 h（e.e.值在97%-98%之间）（Hyungdon Yun, Hyeon-Lok Choi, Nitin W. Fadnavis, and Byung-GeeKim. “Effect of ionic liquid [BMIM][PF6] on asymmetric reductionof ethyl 2-oxo-4-phenyloli BL21 Overexpressing YiaEfrom Escherichia coli K12 and GlucoseDehydrogenase from Bacillus subtilis” Biotechnology Progress 2005, 21, 366−371）。ShenNai-dong 利用光滑假丝酵母来源的羰基还原酶（Genbank accession:CAG61069.1）在全水相体系中可催化合成1 M (R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯（Nai-DongShen, Yan Ni, Hong-Min Ma, Li-Juan Wang, Chun-Xiu Li, Gao-Wei Zheng, JieZhang, and Jian-He Xu. “Efficient Synthesis of a Chiral Precursor forAngiotensin-Converting Enzyme (ACE) Inhibitors in High Space-Time Yield by aNew Reductase without External Cofactors”. Organic Letter 2012, 14 (8):1982-1985），这是目前报道的最高水平。
然而，目前报道的具有不对称合成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯工业应用前景的羰基还原酶主要来自Candida glabrata，其GC含量为42.2%，并且含有大肠杆菌的稀有密码子。因此，利用基因工程菌株，例如大肠杆菌进行重组表达时，需要考虑其催化能力的高低。另外，利用基因工程菌株进行(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的不对称合成，目前最高的底物催化浓度为仅为1 M。
因此，本领域急需能够高效表达且具有高催化性能的新型醛酮还原酶，解决酶催化活性偏低、底物耐受性差、产物浓度较低的缺点，从而全面提升生物法不对称合成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的水平。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的醛酮还原酶、编码基因、重组载体以及基因工程菌，以及该基因工程菌株在不对称合成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯反应中的作用。该醛酮还原酶有效拓展了该酶基因的来源和应用。
本发明采用的技术方案是：
一种醛酮还原酶，所述醛酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
任何对SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中氨基酸进行缺失、插入或替换的处理获得的多肽片段或其变体，只要其与该氨基酸具有90%以上的同源性，均属于本发明的保护范围。
本发明还提供一种所述醛酮还原酶的编码基因，为实现醛酮还原酶在大肠杆菌等原核生物中的可溶性异源表达，首先对该醛酮还原酶的基因进行密码子优化，然后以全合成的方法获得了对应所述SEQ ID NO.1氨基酸序列的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2所示。
任何对SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入处理获得的核苷酸序列，只要其与SEQ ID NO.2所示核苷酸序列具有90%以上同源性，均属于本发明的保护范围。
本发明还涉及一种由所述的醛酮还原酶基因构建的重组载体，以及由所述重组载体转化获得的基因工程菌。
本发明还提供了所述醛酮还原酶编码基因在制备醛酮还原酶中的应用，所述应用为构建含有所述醛酮还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的基因工程菌进行诱导表达，将培养液分离获得含醛酮还原酶的菌体细胞。具体为：
第一步 将含有醛酮还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因的基因工程菌株接种至含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，在37℃、200 rpm条件下培养10 h，获得种子液；
第二步 将种子液以体积浓度1%接种量接种至新鲜的含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃、200 rpm条件下培养至菌体OD600为0.6-0.8；
第三步 向第二步培养液中加入终浓度为0.1 mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），于25℃诱导10 h，8000 rpm离心10 min，弃去上清液，利用磷酸盐缓冲液（PBS，pH6.8）洗涤两次之后收集湿菌体，即为含有醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶基因的基因工程菌。
第一步中，所述基因工程菌株的载体系统为pET-21a(+)载体，其宿主为大肠杆菌BL21(DE3)。
第二步中，所述LB培养基组成：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L，pH自然。
第三步中，所述磷酸盐缓冲液组成：二水磷酸氢二钠8.66 g/L，二水磷酸二氢钠7.70 g/L，氯化钠9.0 g/L，溶于1 L纯化水中，利用4 M氢氧化钠溶液调整pH至6.80。
本发明还提供了一种醛酮还原酶在催化2-氧代-4-苯基丁酸乙酯不对称合成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯中的应用。所述应用包括以下步骤：
第一步 以含有醛酮还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因的基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为生物催化剂，以2-氧代-4-苯基丁酸乙酯为底物，以NADPNa2作为辅酶，以葡萄糖作为NADPH的氢供体，以磷酸盐缓冲液（pH6.8）为反应介质构成反应体系；
第二步 控制体系温度在30-37℃范围，优选33℃，300 rpm条件下反应，待反应结束后将反应液分离纯化，得到(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯。
第一步所得反应体系中，底物初始浓度为0.3-1.2 M，优选1.0 M；湿菌体的用量为80-160 g/L，优选80 g/L；所述NADPNa2的摩尔浓度为0.1-0.5 mM，优选0.2 mM；葡萄糖摩尔浓度与底物摩尔浓度比为1.5:1。
有益效果：
本发明提供了一种新的醛酮还原酶。本发明中所述的醛酮还原酶具有较高的催化性能，在适宜条件下，1.2 M底物可在10 h内被完全催化为(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯，e.e.值大于99.0%，具备生物法不对称合成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的工业化应用潜力。
附图说明
图1为基因工程菌主导的催化过程；
图2为醛酮还原酶表达质粒构建过程；
图3为醛酮还原酶的SDS-PAGE图谱。
具体实施方式
本文所用的术语“多肽”或“本发明的多肽”或“来源于Kluyveromyces marxianusDMKU3-1042的醛酮还原酶”具有相同的意义，在本文中可以互换使用，均是指具有催化2-氧代-4-苯基丁酸乙酯为(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的蛋白。大肠杆菌中天然不存在此多肽，其属于外源性蛋白。
基于现有技术的知识，本领域普通技术人员不难知晓，在多肽的某些区域，例如非重要区域改变少数氨基酸残基基本上不会改变其催化活性。因此，本领域普通技术人员能够实施这种替换并且确保所得分子仍具有所需生物活性。
本发明所用试剂和原料均可市售获得。
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1 基因工程菌的建立
利用蛋白质PDB数据库和NCBI数据库对醛酮还原酶基因序列进行筛选，获得了来自于Kluyveromyces marxianus DMKU3-1042的醛酮还原酶序列（Genbank：XP 022677552.1）。根据该醛酮还原酶的氨基酸序列，并结合大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化，人工合成该基因片段SEQ ID NO.2后将该基因整合至pET21a(+)载体中（片段两侧酶切位点为NdeI和XhoI）。利用PCR技术分别扩增pET28a(+)重组质粒中的葡萄糖脱氢酶BsGDH（本实验室保存）和pET21a(+)-KmAKR骨架，并利用ClonExpress II One Step Cloning Kit（诺唯赞）将以上两个片段整合，构建pET21a(+)-KmAKR-BsGDH重组质粒，将整合之后的重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中建立醛酮还原酶基因工程菌株。该重组大肠杆菌可完成NADPH的循环利用（图1）。
扩增葡萄糖脱氢酶BsGDH的正向扩增引物F：ttgtacacggccgcataatcGAAATTAATACGACTCACTATAG；反向扩增引物R：GCTCAGCGGTGGCAGCAGCCTTAGCCGCGACCGGCTTGGAAACTC。
扩增pET21a(+)-KmAKR骨架的正向引物扩增引物F：ggctgctgccaccgctgagcaataac；反向扩增引物R：gattatgcggccgtgtacaaTTATTTCTGAGCTTCAGAGTTGTATTTGG。
构建过程见附图2。
实施例2 重组大肠杆菌的培养
将实施例1中所得的重组大肠杆菌分别接种至20 mL含氨苄青霉素（100 μg/mL）LB培养基（蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，氯化钠10 g/L，pH 7.0）中，于37℃，200 rpm的摇床中振荡培养10 h。转接1%菌体培养液至装有100 mL LB培养基的摇瓶中，置于同样条件下振荡培养。当菌体OD600达到0.5-0.8时，加入终浓度为0.2 mM的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），将培养液25℃诱导表达10 h。培养完毕之后通过离心（8000 rpm，10 min，4℃）收集菌体，并用磷酸盐缓冲液（pH 6.8）洗涤两次，再次离心之后收集菌体（5000 rpm，10 min，4℃）备用。取少量菌体进行SDS-PAGE，观察醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的表达情况（见附图3）。
实施例3 不同菌体浓度对合成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的影响
在100 mL反应瓶中，加入40 mL终浓度为0.1 M的磷酸盐缓冲液（pH6.8），并依次加入NADPNa2（终浓度为0.2 mM），葡萄糖（终浓度为1.2 M）和2-氧代-4-苯基丁酸乙酯（终浓度为0.8 M），重组大肠杆菌（终浓度分别为80 g/L、120 g/L、160 g/L）。反应温度利用水浴锅维持在30-37 ℃，pH利用2 M碳酸钠溶液维持在6.5-6.8。反应持续进行8 h后终止反应。加入等体积乙酸乙酯进行萃取，离心（8000 rpm，10 min，4℃）之后收集有机相。将有机相旋蒸至体积恒定，加入一定量的无水硫酸钠干燥过夜即得最终产物(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯。结果见表1。
表1不同菌体浓度对合成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的影响
产物e.e.值的具体分析条件：使用高效液相色谱法，色谱柱为手性OD柱，流动相为正己烷/异丙醇=90:10（v/v），流速为1.0 mL/min，柱温为25℃，检测波长为210nm（紫外检测器）。
实施例4 不同底物浓度对合成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的影响
在100 mL反应瓶中，加入40 mL终浓度为0.1M的磷酸盐缓冲液（pH6.8），并依次加入NADPNa2（终浓度为0.2 mM），不同终浓度的葡萄糖和2-氧代-4-苯基丁酸乙酯（摩尔浓度比维持在1:1.5），重组大肠杆菌（终浓度为80 g/L）。反应温度利用水浴锅维持在30-37℃，pH利用2 M碳酸钠溶液维持在6.5-6.8。反应持续进行8 h后终止反应。加入等体积乙酸乙酯进行萃取，离心（8000 rpm，10 min，4℃）之后收集有机相。将有机相旋蒸至体积恒定，加入一定量的无水硫酸钠干燥过夜即得最终产物(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯。结果见表2。
表2不同底物浓度对合成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的影响
产物e.e.值的具体分析条件同实施例3。
实施例5 双相反应体系对合成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的影响
在100 mL反应瓶中，加入40 mL终浓度为0.1 M的磷酸盐缓冲液（pH6.8）和不同种类的有机相（终体积为10%），并依次加入NADPNa2（终浓度为0.2 mM），葡萄糖（终浓度为1.5 M）和2-氧代-4-苯基丁酸乙酯（终浓度1.0 M），重组大肠杆菌（终浓度为80 g/L）。反应温度利用水浴锅维持在30-37 ℃，pH利用2 M碳酸钠溶液维持在6.5-6.8。反应持续进行8 h后终止反应。加入等体积乙酸乙酯进行萃取，离心（8000 rpm，10 min，4℃）之后收集有机相。将有机相旋蒸至体积恒定，加入一定量的无水硫酸钠干燥过夜即得最终产物(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯。结果见表3。
表3双相反应体系对合成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的影响
产物e.e.值的具体分析条件同实施例3。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津迪沙医药技术开发有限公司 迪沙药业集团有限公司
<120> 一种醛酮还原酶及其应用
<130> 20190808
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Thr Asn Gln Lys Phe Phe Thr Leu Ser Asn Gly Asn Lys Ile Pro
1 5 10 15
Ala Val Ala Val Val Gly Thr Gly Thr Lys Trp Tyr Lys Ala Glu Glu
20 25 30
Thr Asp Ala Thr Phe Ser Gln Glu Leu Thr Asp Ile Val Lys Leu Ser
35 40 45
Leu Asp Thr Val Pro Gly Ile Val His Ile Asp Ala Ala Glu Thr Tyr
50 55 60
Lys Thr Tyr Pro Glu Leu Gly Ala Ala Leu Lys Glu Thr Lys Lys Pro
65 70 75 80
Arg Glu Glu Ile Phe Ile Thr Asp Lys Phe Ser Ser Leu His Lys Ile
85 90 95
Ser Glu Asp Pro Lys Ser Ala Leu Glu Thr Ala Leu Lys Lys Leu Gly
100 105 110
Val Asp Tyr Val Asp Leu Tyr Leu Ile His Ser Pro Phe Phe Asp Lys
115 120 125
Asp Leu Asn Ile Asp Leu Glu Thr Ala Trp Lys Gln Leu Glu Glu Leu
130 135 140
Tyr Lys Ser Gly Lys Ala Lys Asn Ile Gly Val Ser Asn Phe Thr Val
145 150 155 160
Glu Asp Leu Lys Lys Val Leu Ala Ile Ala Glu Ile Lys Pro Gln Val
165 170 175
Asn Gln Ile Glu Phe Ser Pro Phe Leu Gln Asn Gln Thr Pro Gly Ile
180 185 190
Val Glu Phe Ser Gln Lys Asn Asp Ile Leu Leu Glu Ala Tyr Ser Pro
195 200 205
Leu Gly Pro Leu Gln Lys Lys Pro Thr Asp Ala Asp Gln Gln Pro Phe
210 215 220
Tyr Gln Tyr Leu Lys Glu Leu Ser Glu Lys Tyr Asn Lys Thr Glu Ala
225 230 235 240
Gln Val Leu Leu Leu Trp Val Tyr Lys Arg Gly Ile Leu Pro Val Thr
245 250 255
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gctgaaacct acaaaaccta cccggaactg ggtgctgctc tgaaagaaac caaaaaaccg 240
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序列表
<110> 天津迪沙医药技术开发有限公司 迪沙药业集团有限公司
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<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Tyr Gln Tyr Leu Lys Glu Leu Ser Glu Lys Tyr Asn Lys Thr Glu Ala
225 230 235 240
Gln Val Leu Leu Leu Trp Val Tyr Lys Arg Gly Ile Leu Pro Val Thr
245 250 255
Thr Ser Ala Lys Ile Glu Arg Ile Lys Gln Ala Gln Asp Ile Phe Ser
260 265 270
Phe Asp Leu Thr Glu Glu Glu Val Lys Lys Ile Thr Asp Leu Gly Leu
275 280 285
Gln His Glu Pro Val Arg Leu Tyr Trp Val Asp Phe Tyr Thr Lys Tyr
290 295 300
Asn Ser Glu Ala Gln Lys
305 310
<210> 4
<211> 933
<212> DNA
<213> 人工序列(Kluyveromyces marxianus)
<400> 4
atgaccaacc agaaattctt caccctgtct aacggtaaca aaatcccggc tgttgctgtt 60
gttggtaccg gtaccaaatg gtacaaagct gaagaaaccg acgctacctt ctctcaggaa 120
ctgaccgaca tcgttaaact gtctctggac accgttccgg gtatcgttca catcgacgct 180
gctgaaacct acaaaaccta cccggaactg ggtgctgctc tgaaagaaac caaaaaaccg 240
cgtgaagaaa tcttcatcac cgacaaattc tcttctctgc acaaaatctc tgaagacccg 300
aaatctgctc tggaaaccgc tctgaaaaaa ctgggtgttg actacgttga cctgtacctg 360
atccactctc cgttcttcga caaagacctg aacatcgacc tggaaaccgc ttggaaacag 420
ctggaagaac tgtacaaatc tggtaaagct aaaaacatcg gtgtttctaa cttcaccgtt 480
gaagacctga aaaaagttct ggctatcgct gaaatcaaac cgcaggttaa ccagatcgaa 540
ttctctccgt tcctgcagaa ccagaccccg ggtatcgttg aattctctca gaaaaacgac 600
atcctgctgg aagcttactc tccgctgggt ccgctgcaga aaaaaccgac cgacgctgac 660
cagcagccgt tctaccagta cctgaaagaa ctgtctgaaa aatacaacaa aaccgaagct 720
caggttctgc tgctgtgggt ttacaaacgt ggtatcctgc cggttaccac ctctgctaaa 780
atcgaacgta tcaaacaggc tcaggacatc ttctctttcg acctgaccga agaagaagtt 840
aaaaaaatca ccgacctggg tctgcagcac gaaccggttc gtctgtactg ggttgacttc 900
tacaccaaat acaactctga agctcagaaa taa 933

Claims (11)

1.一种醛酮还原酶，所述醛酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述醛酮还原酶，其编码基因对应所述SEQ ID NO.1氨基酸序列的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2所示。
3.权利要求1所述醛酮还原酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步 将含有醛酮还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因的基因工程菌株接种至含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，在37℃、200 rpm条件下培养10 h，获得种子液；
第二步 将种子液以体积浓度1%接种量接种至新鲜的含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃、200 rpm条件下培养至菌体OD600为0.6-0.8；
第三步 向第二步培养液中加入终浓度为0.1 mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），于25℃诱导10 h，8000 rpm离心10 min，弃去上清液，利用磷酸盐缓冲液（PBS，pH6.8）洗涤两次之后收集湿菌体，即为含有醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶基因的基因工程菌。
4.根据权利要求3中所述的醛酮还原酶的制备方法，其特征在于，第一步所述基因工程菌株的载体系统为pET-21a(+)载体，其宿主为大肠杆菌BL21(DE3)。
5.权利要求3所述醛酮还原酶的制备方法，其特征在于，第二步中，所述LB培养基组成：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L。
6.权利要求3所述醛酮还原酶的制备方法，其特征在于，第三步中，所述磷酸盐缓冲液组成：二水磷酸氢二钠8.66 g/L，二水磷酸二氢钠7.70 g/L，氯化钠9.0 g/L，溶于1 L纯化水中，利用4 M氢氧化钠溶液调整pH至6.80。
7.权利要求1所述醛酮还原酶在催化2-氧代-4-苯基丁酸乙酯不对称合成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯中的应用。
8.一种2-氧代-4-苯基丁酸乙酯不对称合成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步 以含有醛酮还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因的基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为生物催化剂，以2-氧代-4-苯基丁酸乙酯为底物，以NADPNa2作为辅酶，以葡萄糖作为NADPH的氢供体，以磷酸盐缓冲液（pH6.8）为反应介质构成反应体系；
第二步 控制体系温度在30-37℃范围，300 rpm条件下反应，待反应结束后将反应液分离纯化，得到(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯。
9.权利要求8所述2-氧代-4-苯基丁酸乙酯不对称合成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的制备方法，其特征在于，第一步所得反应体系中，底物初始浓度为0.3-1.2 M，湿菌体的用量为80-160 g/L，所述NADPNa2的摩尔浓度为0.1-0.5 mM，葡萄糖摩尔浓度与底物摩尔浓度比为1.5:1。
10.权利要求8所述2-氧代-4-苯基丁酸乙酯不对称合成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的制备方法，其特征在于，第一步所得反应体系中，底物初始浓度为1.0 M；湿菌体的用量为80 g/L；所述NADPNa2的摩尔浓度为0.2 mM；葡萄糖摩尔浓度与底物摩尔浓度比为1.5:1。
11.权利要求8所述2-氧代-4-苯基丁酸乙酯不对称合成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的制备方法，其特征在于，第二步中控制体系温度在33℃，300 rpm条件下反应，待反应结束后将反应液分离纯化，得到(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯。
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