CN106893748B - 一种l-茶氨酸的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物工程技术领域,尤其涉及一种L‑茶氨酸的合成方法,所述方法包括:以γ‑谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶为催化剂,以L‑谷氨酸钠和乙胺盐酸盐为底物合成L‑茶氨酸。本发明方法以价格相对低廉的L‑谷氨酸钠和乙胺盐酸盐为起始原料,以可大量生产的克隆表达蛋白为催化剂,具有反应条件温和、专一性强、反应转化率高、操作简便、对反应设备要求低、环境污染小等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域,尤其涉及一种L-茶氨酸的合成方法,具体涉及一种利用微生物酶催化,以L-谷氨酸钠和乙胺盐酸盐为底物偶合酶法ATP再生系统合成L-茶氨酸的方法。
背景技术
L-茶氨酸(C7H14O3N2,又称γ-谷氨酰乙胺)是茶叶中所含的一种特殊氨基酸,具有多种用途:在普通食品中用于改善食品风味、强化营养等;在保健食品中用于镇静放松、改善睡眠、抗疲劳、提高学习记忆能力等;在医药领域已用于降低血压、预防癌症、预防阿尔茨海默症、控制抑郁症等。因此L-茶氨酸在饮料、功能食品、功能药物等方面有着广泛的需求。
目前,L-茶氨酸的生产方法主要有提取法、化学法和生物法。提取法就是从茶叶组织中直接提取,由于茶氨酸在茶叶中含量很低,且原材料来源受限,导致生产成本过高,因而提取法并不适于大规模工业化生产。化学法合成L-茶氨酸均为谷氨酸衍生物与乙胺反应,涉及到谷氨酸的保护与脱保护,反应路线复杂,反应条件苛刻,副反应多,且容易产生消旋体,同时会有毒性物质残留,影响产品的品质。另外,会用到大量的有机溶剂,污染环境。
酶法是近年来合成L-茶氨酸的新趋势,主要包括微生物发酵法和酶催化法。LiJian的“LWT-Food Science and Technology”2008,41,883-889利用Xerocomus badius(mushroom)发酵制备L-茶氨酸。微生物发酵法专属性强、条件温和、环境污染少,但是其存在产物浓度和转化率低、发酵时间长、产物分离难度大、设备成本高等缺点。
酶催化是一种高选择性反应,不同种类的酶可作用于不同构型和不同种类的特定底物,从而达到定向转化的目的。目前,专利和文献所报道的生产L-茶氨酸的酶主要有CN102181501 A和CN 103409475 A公开了γ-谷氨酰转肽酶,CN 1688705 A和JP 2007185132A公开了谷氨酰胺酶,“Biosci.Biotechnol.Biochem.2007,71(2),545-552”公开了谷氨酰胺合成酶,“Biosci.Biotechnol.Biochem.2008,72(5),1206-1211”和CN 104212757 A公开了γ-谷氨酰甲胺合成酶,都具有生产L-茶氨酸的功能。与传统的化学方法相比,酶催化制备方法效率高、专一性强、反应条件温和,是一种理想的制备L-茶氨酸的方法。然而目前利用γ-谷氨酰转肽酶和谷氨酰胺酶合成L-茶氨酸时,通常反应pH为9.0-11.0,反应条件为碱性;所用底物为谷氨酰胺,价格相对昂贵。此外,两种酶均可使底物谷氨酰胺水解,反应转化率不高,因此,反应中需要添加过量的另一种底物乙胺(2.0-10.0eq)来抑制谷氨酰胺水解。谷氨酰胺合成酶和γ-谷氨酰甲胺合成酶虽可在中性条件(pH 6.5-7.5)转化价格低廉的谷氨酸钠和等当量的乙胺合成L-茶氨酸,但其为耗能反应,需要消耗当量的ATP。Yamamoto的“Biosci.Biotechnol.Biochem.”2005,69,784-789;Biosci.Biotechnol.Biochem.2008,72(5),1206-1211中报道,利用谷氨酰胺合成酶或γ-谷氨酰甲胺合成酶偶合酵母发酵能量循环,实现ATP再生来合成L-茶氨酸。然而此种ATP再生方法利用的是酵母内的糖酵解途径,需要多个步骤,因此效率相对较低;同时反应体系中还需要考虑细胞膜通透性的问题。另外,反应中影响活细胞代谢的因素较多,使反应体系变得复杂,不利于工业化生产。
因此,需要开发一种低成本且易于工业化放大的酶催化合成L-茶氨酸的新方法。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求,本发明提供一种L-茶氨酸的合成方法,所述方法催化合成茶氨酸的同时实现反应中ATP再生。
为达此目的,本发明采用以下技术方案:
一方面,本发明提供一种L-茶氨酸的合成方法,所述方法包括:以γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶为催化剂,以L-谷氨酸钠和乙胺盐酸盐为底物合成L-茶氨酸。
本发明中,所述L-茶氨酸的合成方法如下:
利用磷酸激酶催化、以廉价易得的多聚磷酸盐为底物进行ATP再生,降低反应中ATP的添加量,实现ATP的循化利用。
优选地,所述γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶的基因克隆在同一表达载体上。
优选地,所述γ-谷氨酰甲胺合成酶来源于Methylovorus mays。
优选地,所述磷酸激酶来源于Eschierichia coli、Rhodobacter sphaeroides或Chloroflexus aurantiacus中的任意一种。
优选地,所述克隆在同一表达载体上的γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶的核苷酸序列包含如SEQ ID NO.1所示的片段。
所述核苷酸序列如下:
SEQ ID NO.1:
ATGATGGCCGAAGATCGTGCTATGCCGGTTATGCCGCCGGCTGCTGAC GCTGCTGAAGCCGTCCCGGCCGCTCCGACCGCCCTGCCGGAAGAAGGTCCGGCAGGTCCGGAAGCACCGCTGCAAACCCTGCATGGTCCGCGTCACTTTCCGGCAGTTGATGCGAACGCCATTCGCCAGGCTTTCGAAGGCGGTCATTATCCGTACCCGCGTCGCCTGGGCCGTGTGGTTTATGAAGCGGAAAAAGCCCGCCTGCAGGCAGAACTGCTGAAGGTCCAGATTTGGGCGCAAGAAACCGGTCAGAAATTTGTGATCCTGATGGAAGGCCGTGATGCGGCCGGTAAAGGCGGTACGATCAAGCGCTTCATGGAACATCTGAACCCGCGTTATGCACGCGTCGTGGCTCTGACCAAACCGGGCGAACGTGAACGCGGTCAATGGTTTTTCCAGCGTTACATTGAACACCTGCCGACGGCCGGCGAAATCGTGTTTTTCGATCGCAGCTGGTATAATCGTGCAGGCGTGGAACGCGTTATGGGTTTTTGCACCCCGTCTGAATACCTGGAATTTATGCGTCAAGCGCCGGAACTGGAACGTATGCTGGTTCGCTCAGGTATTCGTCTGTATAAATACTGGTTTTCGGTCACCCGCGATGAACAGCGTGCACGCTTCCTGGCCCGTGAAACGGACCCGCTGAAACGCTGGAAGCTGAGTCCGATTGATAAAGCGTCCCTGGACAAGTGGGATGACTATACCGAAGCAAAAGAAGCTATGTTTTTCTACACCGATACGGCAGACGCTCCGTGGACGATCGTGAAGTCCAACGATAAAAAGCGTGCCCGCCTGAATTGTATGCGTCACTTTCTGAGCTCTCTGGATTATCCGGGCAAAGACCCGGAAGTTGTCGGTGTCCCGGACCCGCTGATTGTGGGTCGTGCAGCTCAGGTTATCGGTACCGCTGCCGACATTCTGGACTCCGCCACCCCGCCGGCCCTGCGTAAACCGCGTCAAGGTTGAGTCGACAAGCTTAAGGAGATATAATGAAGAGCCTGGAAGAAGCACAAAAGTTTCTGGAAGACCACCATGTCAAGTATGTCCTGGCACAGTTCGTCGATATTCACGGCGTTGCTAAAGTGAAGAGCGTTCCGGCGTCTCATCTGAATGATATTCTGACCACGGGTGCAGGTTTTGCAGGCGGTGCTATTTGG GGTACCGGTATCGCACCGAACGGTCCGGATTATATGGCAATTGGTGAACTGAGTACGCTGTCCCTGATCCCGTGGCAGCCGGGTTATGCACGTCTGGTCTGCGACGGCCACGTGAATGGTAAACCGTATGAATTTGATACCCGTGTGGTTCTGAAACAGCAAATTGCACGTCTGGCAGAAAAGGGTTGGACCCTGTATACGGGTCTGGAACCGGAATTTTCACTGCTGAAAAAGGATGAACATGGCGCGGTGCACCCGTTCGATGACTCGGACACGCTGCAAAAACCGTGTTATGATTACAAGGGTATTACCCGCCATAGCCCGTTTCTGGAAAAACTGACGGAATCTCTGGTTGAAGTCGGCCTGGACATTTATCAGATCGATCACGAAGACGCCAATGGTCAATTTGAAATCAACTATACCTACGCCGATTGCCTGAAAAGTGCAGATGACTACATTATGTTCAAGATGGCGGCCTCCGAAATCGCGAACGAACTGGGTATTATCTGTAGTTTTATGCCGAAACCGTTCTCCAATCGTCCGGGCAACGGTATGCACATGCACATGTCAATTGGCGACGGTAAAAAGTCGCTGTTTCAGGATGACTCAGATCCGTCGGGCCTGGGTCTGAGTAAACTGGCTTATCATTTCCTGGGCGGTATCCTGGCACACGCACCGGCACTGGCAGCTGTTTGCGCACCGACCGTCAATTCTTACAAACGTCTGGTCGTGGGTCGCAGCCTGTCTGGTGCTACCTGGGCTCCGGCGTATATTGCGTACGGCAACAATAACCGTAGCACGCTGGTTCGCATCCCGTATGGCCGTCTGGAACTGCGCCTGCCGGATGGTTCTTGTAACCCGTACCTGGCAACCGCAGCAGTGATTGCAGCTGGTCTGGACGGTGTTGCACGTGAACTGGATCCGGGCACGGGTCGCGATGACAATCTGTATGATTACAGCCTGGAACAGCTGGCCGAATTTGGCATTGGTATCCTGCCGCAAAACCTGGGTGAAGCACTGGATGCTCTGGAAGCGGACCAGGTCATCATGGATGCGATGGGCCCGGGTCTGTCCAAAGAATTTGTTGAACTGAAGCGCATGGAATGGGTGGACTATATGCGTCATGTGTCGGACTGGGAAATCAACCGCTATGTTCAATTCTAC TGA。
优选地,所述γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶加入的总酶量为1-25g/L,例如可以是1g/L、2g/L、3g/L、5g/L、6g/L、8g/L、10g/L、12g/L、13g/L、15g/L、16g/L、18g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L或25g/L,优选为2-20g/L,进一步优选为5-15g/L。
优选地,所述L-谷氨酸钠的加入量为50-400mM,例如可以是50mM、51mM、52mM、53mM、55mM、56mM、58mM、60mM、62mM、63mM、65mM、68mM、70mM、80mM、90mM、100mM、120mM、150mM、160mM、180mM、200mM、220mM、250mM、260mM、280mM、300mM、320mM、350mM、360mM、380mM或400mM。
优选地,所述乙胺盐酸盐的加入量为50-400mM,例如可以是50mM、51mM、52mM、53mM、55mM、56mM、58mM、60mM、62mM、63mM、65mM、68mM、70mM、80mM、90mM、100mM、120mM、150mM、160mM、180mM、200mM、220mM、250mM、260mM、280mM、300mM、320mM、350mM、360mM、380mM或400mM。
优选地,所述L-谷氨酸钠和乙胺盐酸盐的摩尔比为1:1-1:3,优选为1:1。
优选地,所述方法包括如下步骤:在反应器中加入L-谷氨酸钠、乙胺盐酸盐、多聚磷酸盐、ATP、Mg2+和缓冲液,调节pH,加入γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶,调节温度进行反应。
优选地,所述缓冲液为磷酸钾缓冲液、咪唑缓冲液或Tris-HCl缓冲液中的任意一种或至少两种的混合,优选为咪唑缓冲液。
优选地,所述缓冲液的浓度为20-150mM,例如可以是20mM、21mM、22mM、25mM、26mM、30mM、32mM、35mM、36mM、38mM、40mM、 50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、13.mM、140mM或150mM,优选为50-100mM,进一步优选为75mM。
优选地,所述缓冲液的pH为7-9,例如可以是7、7.2、7.5、7.8、8、8.2、8.5或9,优选为8。
优选地,所述多聚磷酸盐的加入量为5-200mM,例如可以是5mM、6mM、8mM、10mM、20mM、25mM、26mM、30mM、32mM、35mM、36mM、38mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、13.mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM或200mM。
优选地,所述多聚磷酸盐为六偏磷酸钠。
优选地,所述ATP的加入量为0.5-10mM,例如可以是0.5mM、0.6mM、0.8mM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM或10mM,优选为0.8-6mM。
优选地,所述Mg2+的加入量为10-300mM,例如可以是10mM、20mM、25mM、26mM、30mM、32mM、35mM、36mM、38mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、13.mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM、200mM、210mM、230mM、250mM、260mM、280mM或300mM,优选为50-200mM。
优选地,所述调节pH为5.5-8.5,例如可以是5.5、6、6.5、7、7.5、8或8.5,优选为7.0-7.5。
优选地,所述调节温度为20-50℃,例如可以是20℃、21℃、23℃、25℃、26℃、28℃、30℃、32℃、35℃、36℃、38℃、40℃、41℃、42℃、43℃、45℃、46℃、48℃或50℃,优选为30-37℃。
优选地,所述反应的时间为6-24h,例如可以是6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、18h、20h、21h、22h、23h或24h。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
(1)本发明方法利用微生物酶催化并偶合酶法ATP再生系统,在温和条件下合成L-茶氨酸,利用磷酸激酶催化、以廉价易得的多聚磷酸盐为底物进行ATP再生,降低反应中ATP的添加量,实现ATP的循化利用;
(2)本发明方法产生L-茶氨酸的转化率可高达80%以上,ee值达到99%以上,且总的酶量和ATP的添加量都明显降低;
(3)本发明方法以价格相对低廉的L-谷氨酸钠和乙胺盐酸盐为起始原料,以可大量生产的克隆表达蛋白为催化剂,具有反应条件温和、专一性强、反应转化率高、操作简便、对反应设备要求低、环境污染小等优点;
(4)本发明方法与酵母发酵能量循环体系相比,酶法ATP再生只需一步反应且无透膜问题,反应体系简单、易控,有利于工业化放大,这些特点使整个L-茶氨酸的生产方法成本较低,有利于大批量的工业制备。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果,以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案,但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1酶法催化合成L-茶氨酸
在50mL反应瓶中依次加入终浓度为100mM谷氨酸钠、100mM乙胺盐酸盐、150mM六水合氯化镁、75mM六偏磷酸钠、5mM三磷酸腺苷二钠(ATP)和75mM咪唑缓冲液(pH 8.0),加水溶解使终体积为10mL,用5M氢氧化钠溶液调节反应pH为7.0,加入50mgγ-谷氨酰甲胺合成酶和40mg磷酸激酶。在37℃、200rpm下反应24h后,取样进行HPLC分析。
结果显示,L-茶氨酸的转化率为93%,ee值>99%。
实施例2酶法催化合成L-茶氨酸
在100mL反应瓶中依次加入终浓度为200mM谷氨酸钠、200mM乙胺盐酸盐、150mM六水合氯化镁、75mM六偏磷酸钠、5mM三磷酸腺苷二钠(ATP),加水溶解使终体积为50mL,用5M氢氧化钠溶液调节反应pH为7.0,加入250mgγ-谷氨酰甲胺合成酶和200mg磷酸激酶。在37℃、机械搅拌下反应,反应过程中用2M氢氧化钠溶液维持反应pH为7.0。反应7h后,取样进行HPLC分析检测方法同实施例1。
结果显示,转化率为90%,ee值>99%。
实施例3酶法催化合成L-茶氨酸
在100mL反应瓶中依次加入终浓度为400mM谷氨酸钠、400mM乙胺盐酸盐、300mM六水合氯化镁、150mM六偏磷酸钠、5mM三磷酸腺苷二钠(ATP),加水溶解使终体积为50mL,用5M氢氧化钠溶液调节反应pH为7.0,加入250mgγ-谷氨酰甲胺合成酶和200mg磷酸激酶。在37℃、机械搅拌下下反应,反应过程中用2M氢氧化钠溶液维持反应pH为7.0,反应1h后补加250mgγ-谷氨酰甲胺合成酶和200mg磷酸激酶。反应24h后,取样进行HPLC分析,检测方法同实施例1。
结果显示,转化率为80%,ee值>99%。
实施例4基因工程菌种的构建及酶的表达纯化
(1)pET21a(+)-ppk的构建
用质粒抽提试剂盒抽提质粒pET-21a(+),用NdeI/SalI双酶在37℃下酶切质 粒2h,酶切体系为:质粒50μL,10×buffer 10μL,NdeI 3μL,SalI 3μL,水34μL,电泳回收5.4kb的pET-21a(+)片段。
用NdeI/SalI双酶在37℃下酶切合成的含有磷酸激酶(US20050287627 A1,SEQ IDNO 125)编码基因ppk的质粒2h,酶切体系同上,电泳回收1kb的ppk片段。
将上述回收得到的5.4kb的pET-21a(+)片段与1kb的ppk片段在T4连接酶的作用下于22℃连接5h。连接产物用氯化钙法转化入感受态E.coli Top10,挑选转化子进行菌落PCR及双酶切鉴定,选择2-3个阳性转化子送测序进一步验证,测序结果显示构建成功。
(2)pET21a(+)-ppk+gmas的构建
将上述构建成功的pET21a(+)-ppk载体用HindIII在37℃水浴中酶切,酶切体系为:质粒50μL,10×buffer 10μL,HindIII 4μL,水36μL,1.5h后加入2μL碱性磷酸酶继续孵育0.5h,回收酶切产物。
使用下列引物从合成的含有γ-谷氨酰甲胺合成酶编码基因gmas(来源于Methylovorus mays NO.9,DDBJ登录号AB333782)的质粒PCR扩增gmas片段,PCR反应体系为:5×PCR buffer 10μL,dNTP 4μL,引物gmas-F和gmas-R(10μM)各2μL,模板0.5μL,HS DNA Polymerase 0.5μL,加水补足至50μL条件为:94℃5min;94℃45s,58℃30s,72℃90s,30个循环;72℃10min。电泳鉴定后直接纯化回收GMAS片段。
gmas-F:CCCAAGCTTAAGGAGATATAATGAAGAGCCTGGAAGAAGCAC
gmas-R:CCCAAGCTTTCAGTAGAATTGAACATAGCGGTTG
将扩增获得的gmas片段用HindIII单酶切,电泳回收后与上述HindIII单酶 切并去磷酸化的pET21a(+)-ppk载体在T4连接酶的作用下于22℃连接5h,连接产物用氯化钙法转化入感受态E.coli Top10,挑选转化子进行菌落PCR及双酶切鉴定,选择2-3个阳性转化子送测序进一步验证。测序结果显示构建成功。
(3)基因工程菌株的构建
将构建的重组质粒pET21a(+)-ppk+gmas用氯化钙法转化入宿主菌BL21(DE3),LB试管培养过夜,质粒抽提试剂盒抽提质粒,将正确的克隆子BL21(DE3)/pET21a(+)-ppk+gams保存。
(4)重组蛋白的表达
挑取重组菌BL21(DE3)/pET21a(+)-ppk+gams接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中,37℃振荡过夜培养。将培养物以1%的接种量转接于新鲜的含有氨苄青霉素的LB培养基中,37℃振荡培养至OD600=0.6-0.8,20℃IPTG诱导(终浓度0.1mM)过夜,离心收集细胞,20mM磷酸钠缓冲液(PH 8.0)重悬细胞,超声破碎,离心后将上清冷冻干燥得到的冻干粉粗酶制剂。
实施例5酶法催化合成L-茶氨酸
在50mL反应瓶中依次加入终浓度为100mM谷氨酸钠、100mM乙胺盐酸盐、150mM六水合氯化镁、75mM六偏磷酸钠、5mM三磷酸腺苷二钠(ATP)和75mM咪唑缓冲液(pH 8.0),加水溶解使终体积为10mL,用5M氢氧化钠溶液调节反应pH为7.0,加入50mg实施例4中制备得到的粗酶制剂,在37℃、200rpm下反应24h后,取样进行HPLC分析,检测条件同实施例1。
结果显示,转化率为88%,ee值>99%。
实施例6酶法催化合成L-茶氨酸
在100mL反应瓶中依次加入终浓度为200mM谷氨酸钠、200mM乙胺盐酸盐、150mM六水合氯化镁、75mM六偏磷酸钠、5mM三磷酸腺苷二钠(ATP), 加水溶解使终体积为50mL,用5M氢氧化钠溶液调节反应pH为7.0,加入250mg实施例4中制备得到的粗酶制剂,在37℃、机械搅拌下反应,反应过程中用2M氢氧化钠溶液维持反应pH为7.0。反应24h后,取样进行HPLC分析,检测方法同实施例1。
结果显示,转化率为87%,ee值>99%。
综上所述,本发明的方法能够生产L-茶氨酸,转化率达到80%以上,ee值达到99%以上,满足L-茶氨酸生产需要,不仅能降低ATP的用量,而且还能降低酶的总添加量,节约成本,为今后充分利用低成本的谷氨酸钠工业化生产L-茶氨酸提供了方法。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法,但本发明并不局限于上述详细方法,即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (28)
1.一种L-茶氨酸的合成方法,其特征在于,所述方法包括:以γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶为催化剂,以L-谷氨酸钠和乙胺盐酸盐为底物合成L-茶氨酸;
所述方法具体包括如下步骤:在反应器中加入L-谷氨酸钠、乙胺盐酸盐、多聚磷酸盐、ATP、Mg2+和缓冲液,调节pH,加入γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶,调节温度进行反应;
所述γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶的基因克隆在同一表达载体上;
所述克隆在同一表达载体上的γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶的核苷酸序列包含如SEQ ID NO.1所示的片段。
2.根据权利要求1所述的合成方法,其特征在于,所述γ-谷氨酰甲胺合成酶来源于Methylovorus mays。
3.根据权利要求1所述的合成方法,其特征在于,所述磷酸激酶来源于Eschierichiacoli、Rhodobacter sphaeroides或Chloroflexus aurantiacus中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的合成方法,其特征在于,所述γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶加入的总酶量为1-25g/L。
5.根据权利要求4所述的合成方法,其特征在于,所述γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶加入的总酶量为2-20g/L。
6.根据权利要求5所述的合成方法,其特征在于,所述γ-谷氨酰甲胺合成酶和磷酸激酶加入的总酶量为5-15g/L。
7.根据权利要求1所述的L-茶氨酸的合成方法,其特征在于,所述L-谷氨酸钠的加入量为50-400mM。
8.根据权利要求1所述的L-茶氨酸的合成方法,其特征在于,所述乙胺盐酸盐的加入量为50-400mM。
9.根据权利要求1所述的L-茶氨酸的合成方法,其特征在于,所述L-谷氨酸钠和乙胺盐酸盐的摩尔比为1:1-1:3。
10.根据权利要求9所述的L-茶氨酸的合成方法,其特征在于,所述L-谷氨酸钠和乙胺盐酸盐的摩尔比为1:1。
11.根据权利要求1所述的合成方法,其特征在于,所述缓冲液为磷酸钾缓冲液、咪唑缓冲液或Tris-HCl缓冲液中的任意一种或至少两种的混合。
12.根据权利要求11所述的合成方法,其特征在于,所述缓冲液为咪唑缓冲液。
13.根据权利要求1所述的合成方法,其特征在于,所述缓冲液的浓度为20-150mM。
14.根据权利要求13所述的合成方法,其特征在于,所述缓冲液的浓度为50-100mM。
15.根据权利要求14所述的合成方法,其特征在于,所述缓冲液的浓度为75mM。
16.根据权利要求1所述的合成方法,其特征在于,所述缓冲液的pH为7-9。
17.根据权利要求16所述的合成方法,其特征在于,所述缓冲液的pH为8。
18.根据权利要求1所述的合成方法,其特征在于,所述多聚磷酸盐的加入量为5-200mM。
19.根据权利要求1所述的合成方法,其特征在于,所述多聚磷酸盐为六偏磷酸钠。
20.根据权利要求1所述的合成方法,其特征在于,所述ATP的加入量为0.5-10mM。
21.根据权利要求20所述的合成方法,其特征在于,所述ATP的加入量为0.8-6mM。
22.根据权利要求1所述的合成方法,其特征在于,所述Mg2+的加入量为10-300mM。
23.根据权利要求22所述的合成方法,其特征在于,所述Mg2+的加入量为50-200mM。
24.根据权利要求1所述的合成方法,其特征在于,所述调节pH为5.5-8.5。
25.根据权利要求24所述的合成方法,其特征在于,所述调节pH为7.0-7.5。
26.根据权利要求1所述的合成方法,其特征在于,所述调节温度为20-50℃。
27.根据权利要求26所述的合成方法,其特征在于,所述调节温度为30-37℃。
28.根据权利要求1所述的合成方法,其特征在于,所述反应的时间为6-24h。
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