CN116732009A - 一种重组二肽酶突变体及其在l-肌肽生产中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种重组二肽酶突变体及其在L‑肌肽生产中的应用，属于酶工程技术领域。本发明以二肽酶为基础，选择其第148位和第168位进行的氨基酸进行定点突变，将第148位甘氨酸突变成天冬氨酸(G148D)，第168位苏氨酸突变成丝氨酸(T168S)，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，突变体酶活性比野生型高41.6％。本发明提供的二肽酶突变体催化β‑丙氨酸和L‑组氨酸合成L‑肌肽的效率更高，与野生型相比，产量提高了40.9％。本发明的重组二肽酶突变体能更好的满足工业生产需求，并解决现有技术中二肽酶活性低，表达量低，L‑肌肽的合成产量低等的问题。

Description

一种重组二肽酶突变体及其在L-肌肽生产中的应用
技术领域
本发明涉及一种重组二肽酶突变体及其在L-肌肽生产中的应用，属于酶技术领域。
背景技术
L-肌肽(L-Carnosine，简称L-Car)，又名β-丙氨酰-L-组氨酸，是一种天然活性二肽，最初是在骨骼肌中发现的，同时也存在于人类的大脑、心脏和胃肠道组织中。肌肽能参与和调节人体的生理活动，是一种非酶类自由基清除剂和天然抗氧化，具有抗炎和神经保护作用。此外，它的许多有益作用如pH缓冲活性、重金属螯合活性和抗糖化活性已被证实。肌肽可减少脂质过氧化，但也可抑制暴露于羟基自由基的蛋白质的氧化修饰，并且它还提高了抗氧化能力。目前工业上生产L-肌肽主要是使用化学法，但因其反应步骤繁琐、反应条件苛刻、能耗高等缺点。而报道的微生物法中，活性和产量较低，因此提高二肽酶的酶活力对于L-肌肽工业生产具有重要意义。
大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单。目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种二肽酶突变体及其在L-肌肽生产中的应用。
本发明提供了以粘质沙雷氏菌的二肽酶为亲本的二肽酶突变体、包含二肽酶突变体的重组菌、突变体酶学性质及应用，本发明的二肽酶突变体的酶活力及催化能力均有所提高，将其构建到大肠杆菌，全细胞催化效率较高，具有良好的工业前景。
本发明提供了一种二肽酶突变体，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的二肽酶的第148位甘氨酸突变为天冬氨酸，命名为smpepDG148D。
本发明提供了一种二肽酶突变体，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的二肽酶的第168位苏氨酸突变为丝氨酸，命名为smpepDT168S。
本发明提供了一种二肽酶突变体，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的二肽酶的第148位甘氨酸突变为天冬氨酸，同时将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的二肽酶的第168位苏氨酸突变为丝氨酸，命名为smpepDG148D/T168S；所述二肽酶突变体smpepDG148D/T168S氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码所述二肽酶突变体smpepDG148D/T168S的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，编码所述二肽酶亲本酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
本发明还提供了编码上述二肽酶突变体的基因。
本发明还提供了携带上述基因的重组载体。
在本发明的一种实施方式中，所述重组表达载体以pET28a作为表达载体。
本发明还提供了表达上述二肽酶突变体，或携带上述基因，或携带上述重组载体的重组细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞是以细菌或真菌为表达宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞是以大肠杆菌为表达宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞是以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主菌株。
本发明还提供了一种L-肌肽的制备方法，所述方法为，采用上述突变体或上述重组细胞或所述重组细胞表达的重组二肽酶为催化剂，以β-丙氨酸和L-组氨酸为底物，反应制备L-肌肽。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体或重组二肽酶的添加量为：10～20g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体或所述重组二肽酶的添加量为：20g/L。
在本发明的一种实施方式中，反应条件为：40～45℃下反应24～48h。
在本发明的一种实施方式中，反应条件为：45℃下反应48h。
本发明还提供了上述突变体，或上述基因，或上述重组载体，或上述重组细胞，或上述制备方法在制备食品、保健品及化妆品中的应用。
本发明还提供了上述二肽酶突变体在合成L-肌肽或含有L-肌肽的产品中的应用。
有益效果
(1)本发明通过将序列为SEQ ID NO.3中的第148位甘氨酸替换成天冬氨酸和第168位苏氨酸替换成丝氨酸，得到的突变体中，所述突变体smpepDG148D/T168S的酶活性由野生型的107.1±3.6U/mg提高至151.5±4.1U/mg，并且温度稳定性和pH稳定性也有所提高，克服了现有技术酶活较低的缺陷，更适合于工业生产。
(2)实验结果表明本发明的二肽酶突变体smpepDG148D/T168S比野生型酶活力有所上升，并且应用于合成L-肌肽，产量由55.7mM提高至78.7mM，突变体的产量比野生型提高40.9％，最终底物摩尔转化率达到49.3％，说明该突变增强了在大肠杆菌中合成L-肌肽的能力，更好的满足工业生产需求。
附图说明
图1：野生型酶与突变酶的比酶活。
图2：温度对酶活性的影响。
图3：pH对酶活性的影响。
图4：野生型和突变体SDS-PAGE图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
下述实施例中涉及的培养基如下：
LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L。
LB固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、琼脂20g/L。
TB培养基：A：酵母提取物24g、蛋白胨12g、甘油4g；B：KH2PO4 2.3g、K2HPO4 16.4g；将A溶于900mL超纯水，高压灭菌；将B溶于100mL超纯水，高压灭菌，将900mL A和100mL B混合以制备1L TB培养基。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
二肽酶酶活的检测
反应体系：1mL；控制体系pH为8.0，将含有2.0Mβ-Ala和0.1M L-His的Tris-HCl缓冲液于45℃下预热5min，然后加入100U纯酶液，在45℃下反应10min，最后迅速煮沸终止反应，离心。用10％三氯乙酸(TCA)稀释5倍，在4℃冰箱沉淀蛋白3h左右，然后用HPLC检测。
HPLC：取反应液用5％三氯乙酸(TCA)稀释5倍，在4℃冰箱沉淀蛋白3h左右离心，取上清液用0.22μ膜进行过滤处理。然后进样。色谱柱：Platisil NH2色谱柱(250×4.6mm，5ul，流动相：40mM K2HPO4—乙腈(56：44，v/v)，检测器：UV Detector，检测波长：210nm，柱温：35℃，进样量：10μL，流速：1.0mL/min。
定义酶活单位(U)为：一个酶活性单位被定义为在上述条件下每分钟生成1.0μmolL-肌肽的酶量，计算出酶活。
比酶活为1mg湿细胞的酶活，单位为U/mg。
不同温度和pH条件下的酶活力的检测：
缓冲液用于控制反应体系的pH，pH6为50mmol柠檬酸盐缓冲液，pH 7～9为50mmolTris-HCl缓冲液，pH 9为50mmol甘氨酸缓冲液。将温度控制在30℃、35℃、40℃、50℃、55℃、60℃时，测定野生型与突变体的酶活。
实施例1：野生二肽酶的构建及表达
具体步骤如下：
(1)化学合成核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的二肽酶基因smpepD。
(2)利用限制性内切酶HindIII/EcorI对表达质粒pET28a进行酶切处理以获得线性化载体，将基因smpepD和pET28a连接后获得重组质粒pET28a-smpepD；
(3)将重组质粒pET28a-smpepD用化学转化法转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于含卡那霉素抗性的LB平板，37℃下培养过夜，随机挑取克隆进行菌落PCR鉴定和测序验证，结果表明重组质粒pET28a-smpepD已成功转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，经测序验证突变成功的菌液提取重组质粒保存于-20℃冰箱。测序工作由苏州金唯智有限公司完成。
(4)将制备得到的重组菌株E.coli BL21/pET28a-smpepD接种至10mL LB培养基中，37℃、200r/min培养10h后，制备得到种子液；
将制备得到的种子液按1％(v/v)的接种量转接到50ml LB培养基中，并在37℃、200r/min培养2h，添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)使其终浓度为0.5mM，于16℃、200r/min进行二肽酶表达，继续培养时间为：12h后，收集菌液，使用PBS溶液洗涤细胞，离心后收集细胞，进行超声破碎：破1s停3s，15min，破碎后4℃，12000rpm离心20min，将破壁上清、破壁沉淀分离。上清液即为粗酶液。
(5)使用Ni-NTA亲和层析纯化粗酶，得到野生型二肽酶smpepD的纯酶液。
实施例2：二肽酶突变体的构建及表达
具体步骤如下：
(1)设计引物P1/P2，用于构建含有SmpepDG148D突变的重组质粒；引物P3/P4，用于构建含有SmpepDT168S突变的重组质粒；引物P5/P6，用于构建含有SmpepDL432F突变的重组质粒。
P1 ATGACCGAAGAAGCCGACATGGACGGCGCCTTC；
P2 GAAGGCGCCGTCCATGTCGGCTTCTTCGGTCAT；
P3 GACATCCTGATCAATTCCGATTCCGAAGAAGAA；
P4 TTCTTCTTCGGAATCGGAATTGATCAGGATGTC；
P5 GTGATCCACGCCGGCTTCGAATGCGGTCTGTTC；
P6 GAACAGACCGCATTCGAAGCCGGCGTGGATCAC。
(2)按照实施例1相同的方法构建重组质粒并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，即得到的重组菌株E.coli BL21/pET28a-smpepDG148D/T168S(命名为M12)、E.coli BL21/pET28a-smpepDG148D(命名为M1)、E.coli BL21/pET28a-smpepDT168S(命名为M2)、E.coli BL21/pET28a-smpepDL432F(命名为M3)、E.coli BL21/pET28a-smpepDG148D/L432F(命名为M13)、E.coli BL21/pET28a-smpepDT168S/L432F(命名为M23)。
(3)分别按照实施例1的方法，将上述重组菌株接种至10mL LB培养基中，37℃、200r/min培养10h后，制备得到种子液；
将制备得到的种子液按1％(v/v)的接种量转接到50ml LB培养基中，并在37℃、200r/min培养2h，添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)使其终浓度为0.5mM，于16℃、200r/min进行二肽酶表达，继续培养时间为：12h后，收集菌液，使用PBS溶液洗涤细胞，离心后收集细胞，进行超声破碎：破1s停3s，15min，破碎后4℃，12000rpm离心20min，将破壁上清、破壁沉淀分离；上清液即为粗酶液。
(5)使用Ni-NTA亲和层析纯化粗酶，分别制备得到smpepDG148D/T168S纯酶液、smpepDG148D纯酶液、smpepDT168S纯酶液、smpepDL432F纯酶液、smpepDG148D/L432F纯酶液、smpepDT168S/L432F纯酶液。
分别对上述纯酶液及实施例1制备得到的野生型的纯酶液进行SDS-PAGE验证，结果如图4所示，结果显示：野生型及突变体均已成功表达。
实施例3：野生酶和突变酶的酶活及酶学性质测定
具体步骤如下：
1、酶活数据
分别将实施例2所得纯化酶添加10％的甘油于4℃贮存备用；实验测定了二肽酶SmpepD野生型以及SmpepDG148D/T168S突变体、smpepDG148D突变体、smpepDT168S突变体、smpepDL432F突变体、smpepDG148D/L432F突变体、smpepDT168S/L432F突变体于45℃时，与β-丙氨酸和L-组氨酸反应时的酶活，结果如图1及表1所示；
表1：含有不同突变体及野生型二肽酶的重组菌株表达的重组酶的比酶活
菌株 比酶活(U/mg)
E.coli BL21/pET28a-smpepD 107.1±3.6
M1(smpepDG148D) 129.5±3.9
M2(smpepDT168S) 123.1±2.7
M3(smpepDL432F) 117.7±2.1
M12(smpepDG148D/T168S) 151.5±4.1
M13(smpepDG148D/L432F) 137.0±3.4
M23(smpepDT168S/L432F) 143.4±4.6
结果显示，SmpepDG148D/T168S突变体比野生型具有更高的催化活性，后续以SmpepDG148D/T168S突变体为例进行研究。
2、不同pH条件和不同温度条件下SmpepDG148D/T168S突变体的酶活力
(1)实验测定了在不同pH条件下的酶活力，缓冲液用于控制反应体系的pH，pH 6为50mmol柠檬酸盐缓冲液，pH 7～9为50mmol Tris-HCl缓冲液，pH 9为50mmol甘氨酸缓冲液。
(2)实验测定了在不同温度条件下的酶活力，将温度控制在25℃、30℃、35℃、40℃、50℃、55℃、60℃时，测定野生型与突变体的酶活。
结果如图2和图3显示，在pH 8(50mM Tris-HCl缓冲液)的环境下，野生型与突变体的最适温度均为45℃，并且在pH 8的条件下酶活最高。
结果显示，野生型在最适条件(45℃，pH 8)下的酶活为：107.1±3.6U/mg；
SmpepDG148D/T168S突变体在最适条件(45℃，pH 8)下的酶活为：151.5±4.1U/mg。
3、动力学研究
在最佳反应条件45℃和pH 8(50mM Tris-HCl缓冲液)下，野生型对β-Ala和L-His的动力学常数Km分别为26.8±3.87M、1.2M±0.35M，Kcat/Km分别为0.6±0.14M/min、6.8±2.12M/min。
SmpepDG148D/T168S突变体对β-Ala和L-His的动力学常数Km分别为12.3±2.55M、0.8M±0.18M，Kcat/Km分别为1.3±0.27M/min、10.2±1.66M/min。
4、金属离子对于酶活性的影响
我们研究了在反应体系中加入1mM金属离子对酶活性的影响。结果如表2所示：
表2：不同金属离子对野生型和突变体的影响
菌株 相对活性(％)
不添加金属离子 100.0
Na+ 157.1
Mn2+ 208.3
Fe2+ 170.6
Zn2+ 117.7
结果显示，Mn2+对酶的激活作用较好(表2)，是不添加金属离子酶活的2.1倍。
实施例4：E.coli BL21/pET28a-SmpepDG148D/T168S工程菌制备L-肌肽。
将实施例2中的E.coli BL21/pET28a-SmpepDG148D/T168S突变型工程菌进行L-肌肽的转化，反应体系如下：
(1)E.coli BL21/pET28a-SmpepDG148D/T168S突变型工程菌催化剂的制备
1)种子活化：
将在-80℃甘油管保藏的实施例2构建的重组大肠杆菌M12划线至带有卡那霉素抗性的固体LB平板，37℃培养12-16h；从平板上挑取单菌落，接种于装有10mL LB培养基(含有终质量浓度为50μg/mL的卡那霉素)的锥形瓶中，置于37℃、220r/min的摇床中培养10-12h得到种子液。
2)摇瓶培养：
种子液以1％(v/v)的接种量转接于装液量为50mL的TB培养基中，37℃、220r/min条件下培养24h，得到细胞培养液；
3)细胞收集：
将步骤2)的细胞培养液于8000r/min、4℃离心10min弃去上清液，收集菌体，使用PBS清洗两次后，获得重组大肠杆菌M12全细胞催化剂。
同时，以含有野生型的重组菌株E.coli BL21/pET28a-smpepD为对照菌株，按照上述方法，制备得到全细胞催化剂。
(2)在5L发酵罐中添加1L浓度为50mM Tris-HCl的溶液作为缓冲体系，控制体系pH为8.0，向体系中添加步骤(1)制备得到的全细胞催化剂，添加的菌量OD600nm控制为20，并向体系中添加5.6Mβ-Ala、0.27M L-His和1mM MnCl2。在45℃下反应48h，制备得到发酵液，检测发酵液中的L-肌肽的含量。
结果显示，E.coli BL21/pET28a-SmpepDG148D/T168S重组菌株的L-肌肽的最终产量高达78.7mM，野生型重组菌株E.coli BL21/pET28a-smpepD的L-肌肽的产量为55.7mM，产量提高了约40.9％；采用含有突变体的菌株进行反应后，最终底物摩尔转化率达到49.3％。
结果表明该突变酶在以大肠杆菌为底盘细胞的催化效率明显提升，具有广阔的工业化应用前景。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种二肽酶突变体，其特征在于，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的二肽酶的第148位甘氨酸突变为天冬氨酸；
或，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的二肽酶的第168位苏氨酸突变为丝氨酸；
或，所述突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的二肽酶的第148位甘氨酸突变为天冬氨酸，同时将氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的二肽酶的第168位苏氨酸突变为丝氨酸。
2.编码权利要求1所述二肽酶突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的重组载体。
4.表达权利要求1所述的二肽酶突变体，或携带权利要求2所述基因，或携带权利要求3所述重组载体的重组细胞。
5.根据权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是以细菌或真菌为表达宿主。
6.根据权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是以大肠杆菌为表达宿主。
7.一种L-肌肽的制备方法，其特征在于，所述方法为，采用权利要求1所述的突变体或权利要求4～6任一所述的重组细胞或权利要求4～6任一所述的重组细胞表达的重组二肽酶为催化剂，以β-丙氨酸和L-组氨酸为底物，反应制备L-肌肽。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述突变体或重组二肽酶的添加量为：10～20g/L。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，反应条件为：40～45℃下反应24～48h。
10.权利要求1所述的突变体，或权利要求2所述的基因，或权利要求3所述的重组载体，或权利要求4～5任一所述的重组细胞，或权利要求7～9任一所述的制备方法在制备食品、保健品及化妆品中的应用。
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CN117486983A (zh) * 2023-11-07 2024-02-02 苏州华赛生物工程技术有限公司 L-肌肽制备方法即转运蛋白YjeM的新用途

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