CN110218715B

CN110218715B - 碳酸酐酶XiCA及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN110218715B
Application number: CN201910515971.2A
Authority: CN
Inventors: 刘建国; 郗丽君; 葛保胜; 刘德健; 苏石晶; 谭雯斐; 王佳宇; 窦珂; 王明
Original assignee: China University of Petroleum East China
Current assignee: China University of Petroleum East China
Priority date: 2019-06-14
Filing date: 2019-06-14
Publication date: 2021-01-01
Anticipated expiration: 2039-06-14
Also published as: CN110218715A

Abstract

本发明公开了碳酸酐酶XiCA及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，来源于辛芳芳菌(Xinfangfangiasp.)，是一种碳酸酐酶，命名为XiCA蛋白，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明还保护XiCA蛋白作为碳酸酐酶的应用。本发明还保护一种碳捕获和储存技术中的应用，其活性成分为XiCA蛋白。本发明对于相关医疗领域、化工领域等，具有重大的应用前景。

Description

碳酸酐酶XiCA及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及碳酸酐酶XiCA及其编码基因和应用。

背景技术

随着现代工业的发展，二氧化碳浓度的增加造成了全球变暖等不良后果，因此，研究人员提出了多种方案，不仅用于降低CO₂的浓度，而且还用于在碳捕获使用和储存方案下回收CO₂以再利用。但是在各项方案中，CO₂的水合作用是过程中的关键和限速步骤。已报道的物理和化学技术，尽管受到了极大的关注，但因其反应过程有毒且繁琐，并且昂贵的无机催化剂和碱性介质进一步限制发展，而对于酶催化来说，则恰恰相反，酶催化不仅便宜，而且环保节能，因此，基于生物的捕获是具有前景的替代方案。

碳酸酐酶(Carbonic Anhydrase，CA，EC 4.2.1.1)是可以催化CO₂与水、碳酸及氢质子之间可逆反应的锌金属酶。该酶首先在牛红细胞中发现，随后人们陆续从动物，植物，古细菌和真细菌中鉴定出不同的碳酸酐酶，该酶存在五个不同的类型(α，β，γ，δ和ε)；其中α，β，γ三类酶存在于所有原核生物中，具有重要的生理功能，如CO₂和离子转运，以及生物合成反应所需的CO₂/碳酸氢盐平衡等。另外，碳酸酐酶在几种碳捕获和储存(CCS)技术中具有重要的作用，通过使用碳酸酐酶进行仿生CaCO₃矿化的生物技术不仅可行性强而且具有环境友好性，因此，不断的开发研究新来源的碳酸酐酶逐渐成为研究热点。

发明内容

本发明的目的是提供碳酸酐酶XiCA及其编码基因和应用。

本发明提供的蛋白质，来源于辛芳芳菌(Xinfangfangia sp.)，是一种碳酸酐酶，命名为XiCA蛋白，是如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)或(a6)或(a7)：

(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a3)含有(a1)的融合蛋白；

(a4)在(a1)的末端连接含有标签的短肽得到的融合蛋白；

(a5)在(a1)的末端连接标签得到的融合蛋白；

(a6)将(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加具有碳酸酐酶功能的由其衍生的蛋白质。

(a7)来源于辛芳芳菌，且与(a1)具有99％以上同源性，且具有碳酸酐酶功能的蛋白质。

标签具体如表1所示。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL
HA	9	YPYDVPDYA

XiCA蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述基因为如下1)至4)中任一所述的DNA分子：

1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

2)编码区如序列表中序列4中第1-996位核苷酸所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有碳酸酐酶功能蛋白的DNA分子；

4)来源于辛芳芳菌，且与1)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码具有碳酸酐酶功能蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

含有所述基因的重组表达载体、表达盒或重组微生物均属于本发明的保护范围。

本发明还保护XiCA蛋白作为碳酸酐酶的应用。应用XiCA蛋白作为碳酸酐酶时，采用的温度为20-80℃，采用的pH为3-11。应用XiCA蛋白作为碳酸酐酶时，采用的温度为50℃，采用的pH为5。

本发明还保护XiCA蛋白在制备碳酸酐酶中的应用。

本发明还保护一种碳捕获和储存技术中的应用，其活性成分为XiCA蛋白。

本发明提供的碳酸酐酶XiCA具有较高的酶活力，宽泛的底物，并且反应温度宽泛，反应pH宽泛，对于金属离子、金属离子螯合剂、还原剂、阴离子抑制剂和表面活性剂均具有高耐受性。

辛芳芳菌(Xinfangfangia sp.)DLY26已于2019年1月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国，武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC No：M 2019001。

本发明对于相关医疗领域、化工领域等，具有重大的应用前景。

附图说明

图1为菌株DLY26的照片。

图2为系统发生树。

图3为检测最适pH时的相对酶活结果。

图4为检测pH稳定性时的相对酶活结果。

图5为检测最适反应温度时的相对酶活结果。

图6为CaCO₃矿化扫描电镜照片。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、辛芳芳菌DLY26的分离、鉴定和保藏

一、分离

取约1ml活性污泥样品(取自石化炼油化污水处理系统)，用无菌蒸馏水依次稀释至10倍体积、20倍体积、50倍体积、100倍体积和1000倍体积。采用涂布平板法将100μl稀释后样本涂布于固体培养基表面，30℃培养，每天观察表面菌落的生长情况。挑取颜色不同、形态差异的菌落，通过三区划线法进行纯化和培养，直至在培养基表面生长出能够观察到形态、大小等特征都相同的单菌落为止。

二、鉴定

将纯化获得的菌株接种于TSA平板，30℃培养24h，然后使用透射电子显微镜观察细胞的形态、大小等特征(菌株DLY26的照片见图1)。从培养24h的TSA平板表面挑取单菌落，按照标准方法进行革兰氏染色处理，使用倒置荧光显微镜观察细菌的革兰氏染色情况。制备半固体培养基TSB，采用穿刺接种法观察细菌的运动性和好氧性情况。

以液体培养基TSB为基础：配制不同NaCl浓度的培养基体系(NaCl梯度为0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0及9.0g/100mL)，接种后置于30℃的摇床中振荡培养3-5d，使用UV-2450分光光度计在OD600处检测细菌的其生长情况，以确定最佳盐度生长范围；配制pH值不同的液体培养基(pH梯度设置为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0)，接种后置于30℃的摇床中振荡培养3-5d，以培养条件相同的不接菌培养基作为空白对照，以确定最佳生长pH范围；设置温度梯度为4℃、20℃、28℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃，以确定最佳生长温度范围。

以液体碳源培养基为基础，添加浓度的不同碳水化合物作为唯一的碳源，检测细菌的同化作用。

参照常见细菌系统鉴定手册中的方法，检测细菌的硝酸盐还原、亚硝酸盐还原能力，反硝化能力以及脂酶、接触酶的有无。使用海博革兰氏阴性细菌鉴定系统(青岛，中国)进行细菌的Voges-Proskauer测试(VP测试)，检测细菌的硫化氢(H₂S)产生、脲酶(URE)、明胶(GEL)水解情况。也可以用于评价其他生理生化特征的有无，例如通过对精氨酸(ADH)、山梨醇(SOR)、蔗糖(SAC)等的降解情况，以检验精氨酸酶、山梨醇脱氢酶、蔗糖酶的存在情况。

以X.soli ZQBW^T、R.megalophilus JA194^T和Fal.halotolerans JA744^T作为参考菌株。菌株DLY26和参考菌株的结果见表2和表3和表4。

表2

生化特征	DLY26	ZQBW<sup>T</sup>	JA194<sup>T</sup>	JA744<sup>T</sup>
					温度范围	4-45	26-35	4-45	4-40
最适温度	30	30	30	30
					pH范围	5-11	6-12	3-11	3-11
最适pH	7.0	7.0	7.0	7.0
					盐度范围(％)	0-5.0	0-5.0	0-5.0	0-5.0
最适盐度(％)	1.0	0	0	0
					细胞大小(μm)	1.2-2.0*,0.4-0.6	1.5-2.6*,0.7-0.9	1.2-1.0*,1.5-2.0	2.0-5.0*,1.0-1.2
鞭毛	-	-	-	+
					细胞外形	Rod	Rod	Oval Rod	Oval Rod
运动性	-	-	-	+
					GC含量(％)	63.9	67.0	66.67	74-76

表3

碳源	DLY26	ZQBW<sup>T</sup>	JA194<sup>T</sup>	JA744<sup>T</sup>
					棉子糖	w	-	-	-
D-阿拉伯糖	-	-	-	+
					乳糖	w	-	w	-
赤藓糖	w	ND	-	-
					己二酸	+	ND	+	w
蔗糖	-	ND	-	-
					葡萄糖酸钾	w	-	-	-
肌糖	+	ND	-	w
					D-葡萄糖	+	-	-	-
D-甘露糖	+	-	-	-
					D-(+)-麦芽糖	+	-	-	w
D-果糖	+	-	-	w
					甘露糖醇	w	-	w	w
D-(+)-海藻糖	+	ND	w	w
					D-(+)-木糖	+	ND	-	w
D-(+)-半乳糖	+	ND	-	w

表4

注：ONPG：β-半乳糖苷酶；ADH：精氨酸；LDH：赖氨酸；ODC：鸟氨酸；CIT：柠檬酸盐；H₂S：产硫化氢试验；URE：脲酶；IND：吲哚；GEL：明胶；RHA：鼠李糖；MEL：蜜二糖；AMY：苦杏仁甙；OX：氧化酶。

利用细菌基因组DNA提取试剂盒，提取菌株DLY26的基因组DNA，并采用通用引物27F和1492R进行16S rDNA扩增。扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳法分析产物条带，获得目标条带并使用天根DNA纯化试剂盒DP209进行纯化。将纯化产物连接到载体pMD19-T中，利用pMD19-T克隆试剂盒，将目的载体转化至大肠杆菌DH5α。将重组菌送往青岛擎科生物技术有限公司进行测序，获得16S rRNA序列。利用GenBank数据库检索每个相关基因的16S rRNA的序列，使用MEGA版本7.0构建菌株的系统发育树。使用近邻连接法(NJ)进行细菌的系统发育分析。基于1000次重复，使用Bootstrap分析确定系统发生树的拓扑结构。见图2。

以上鉴定结果表明，菌株DLY26属于红细菌科(Rhodobacteraceae)，辛芳芳菌属(Xinfangfangia)。

三、保藏

实施例2、碳酸酐酶(XiCA蛋白)的制备

经过大量序列分析、比对和功能验证，从辛芳芳菌DLY26中发现一个新蛋白，将其命名为XiCA蛋白，如序列表的序列1所示。将辛芳芳菌DLY26中编码XiCA蛋白的基因命名为XiCA基因，其编码框如序列表的序列2所示。

一、构建重组质粒

1、以辛芳芳菌DLY26的基因组DNA为模板，采用DC-F和DC-R组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。

DC-F：5’-CACCTTTACCACTGGCCTTTAG-3’；

DC-R：5’-CGATAGGCGTGCATGGTCAA-3’。

2、取步骤1得到的PCR扩增产物，与pDE1载体连接，得到重组质粒pDE1-XiCA。

pDE1载体(pDE1 Vector)为pDE1 Directional Expression Kit的组件。pDE1Directional Expression Kit：北京擎科新业生物技术有限公司，产品目录号TSV-E1。

经测序，重组质粒pDE1-XiCA中具有序列表的序列4所示的DNA分子(其中第1-996位核苷酸为开放阅读框)，表达序列表的序列3所示的融合蛋白。序列表的序列3中，第2-7位氨基酸残基组成His₆标签，第40-287位氨基酸残基组成XiCA蛋白。

二、制备重组菌

将重组质粒pDE1-XiCA导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌甲。

将pDE1载体导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌乙。

三、表达蛋白

1、将重组菌接种至含50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基，37℃、150rpm振荡培养12小时，得到种子液。

2、将1体积份种子液接种至99体积份含50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，37℃、200rpm振荡培养至OD_600nm值约为0.6，此时加入IPTG诱导剂并使其在体系中的浓度为0.5mmol/L，然后25℃、200rpm振荡培养6h(诱导表达)，然后4℃、8000×g离心10min，收集菌体沉淀。

3、取步骤2得到的沉淀，用Tris-HCl缓冲液(0.05M，pH7.4)洗涤，然后悬浮于Tris-HCl缓冲液(0.05M，pH7.4)并进行超声破碎(超声破碎参数：功率200W，每超声4s停6s，总时间为40min)，然后4℃、10000×g离心20min，收集上清液。

重组菌甲进行上述步骤得到的上清液，命名为粗酶液甲。

重组菌乙进行上述步骤得到的上清液，命名为粗酶液乙。

四、纯化蛋白

取步骤三得到的粗酶液甲，用孔径为0.22μm的微滤滤膜过滤，收集滤液。取滤液，采用Superdex^TM 200 10/60凝胶层析柱进行分离纯化。将Superdex^TM 200 10/60凝胶层析柱连接到快速蛋白液相系统，以1×PBS缓冲液(pH 8.0)作为流动相，流速为0.1mL/min。收集保留体积为18-20mL对应洗脱峰的过柱后溶液,即为XiCA蛋白溶液。

实施例3、碳酸酐酶(XiCA蛋白)的酶学性质

乙酸对硝基苯酯(p-NPA)溶液(实验之前新鲜配制):称取0.04g乙酸对硝基苯酯溶于0.01L乙腈,再将其稀释10倍。

Tris-HCl缓冲液(50mM,pH 7.4)：称取6.06gTris，溶于超纯水中，用HCl调节pH至7.4。

一、pH对碳酸酐酶活性的影响

1、最适pH

取实施例2制备的XiCA蛋白溶液，用缓冲液稀释至2倍体积，将稀释液作为供试液。

检测方法：取石英比色皿，加入供试液0.2mL、乙酸对硝基苯酯(p-NPA)溶液1mL、缓冲液1.8mL，测量反应起始OD₄₀₀处吸光度值和反应3min后的吸光度值，整个过程在25℃下完成。

分别采用如下缓冲液：pH3.0的柠檬酸盐缓冲液、pH4.0的柠檬酸盐缓冲液、pH5.0的柠檬酸盐缓冲液、pH6.0的柠檬酸盐缓冲液、pH6.0的磷酸盐缓冲液、pH7.0的磷酸盐缓冲液、pH8.0的磷酸盐缓冲液、pH8.0的碳酸盐缓冲液、pH9.0的碳酸盐缓冲液、pH10.0的碳酸盐缓冲液、pH11.0的碳酸盐缓冲液。柠檬酸盐缓冲液的配方见表5。磷酸盐缓冲液的配方见表6。碳酸盐缓冲液的配方见表7。

表5

pH	0.1M柠檬酸水溶液(mL)	0.1M柠檬酸钠水溶液(mL)
			3.0	37.2	2.8
4.0	26.2	13.8
			5.0	16.4	23.6
6.0	7.6	32.4

表6

pH	0.2M磷酸氢二钠水溶液(mL)	0.2M磷酸二氢钠水溶液(mL)
			6.0	61.5	438.5
7.0	305	195
			8.0	473.5	26.5

表7

pH	0.1M碳酸钠水溶液(mL)	0.1M碳酸氢钠水溶液(mL)
			8.0	50	450
9.0	150	350
			10.0	300	200
11.0	450	50

XiCA蛋白的最适pH为5。将采用最适pH对应的缓冲液时的OD_400nm值作为100％，计算采用各种缓冲液时的相对值，作为相对酶活。结果见图3。

2、pH稳定性

取实施例2制备的XiCA蛋白溶液，用缓冲液稀释至2倍体积，然后4℃孵育12h。孵育0时刻作为供试液0，孵育12h后作为供试液12。

以供试液0的OD_400nm值作为100％，分别计算各个供试液12的相对值，作为相对酶活。结果见图4。XiCA蛋白在pH6时酶活力最稳定。

二、温度对碳酸酐酶活性的影响

1、最适反应温度

取实施例2制备的XiCA蛋白溶液，用缓冲液稀释至2倍体积，然后作为供试液。

检测方法：取石英比色皿，加入供试液0.2mL、乙酸对硝基苯酯(p-NPA)溶液1mL、缓冲液1.8mL，测量反应起始OD₄₀₀处吸光度值和反应3min后的吸光度值，分别在20℃、30℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、70℃、80℃下测定酶活。

最适反应温度为50℃。将采用最适反应温度时的OD_400nm值作为100％，计算采用各种反应温度时的相对值，作为相对酶活。结果见图5。

三、金属离子及化学试剂对碳酸酐酶活性的影响

检测方法：取石英比色皿，分别加入供试液0.19mL或0.15mL(金属离子及化学试剂溶液分别加入10μL或50μL)、乙酸对硝基苯酯(p-NPA)溶液1mL、缓冲液1.8mL，测量反应起始OD₄₀₀处吸光度值和反应3min后的吸光度值，整个过程在25℃下完成。

以不加入化合物水溶液/阴离子及抑制剂时相应的OD_400nm值作为100％，分别计算加入各种化合物水溶液/阴离子及抑制剂后的相对酶活。

部分化合物分别见表8。该部分化合物在3mL体系中的浓度分别为1mM或5mM。结果见表8。

部分化合物分别见表9。该部分化合物在3mL体系中的浓度为1mM或5mM。结果见表9。

阴离子及抑制剂分别见表10。该部分化合物在3mL体系中的浓度为1mM。结果见表10。

表8

表9

表10

阴离子及抑制剂	相对酶活
		N<sub>3</sub><sup>-</sup>	76(±1.1)％
NO<sub>3</sub><sup>-</sup>	65(±3.8)％
		HCO<sub>3</sub><sup>-</sup>	74(±1.5)％
SCN<sup>-</sup>	72(±4.9)％
		Cl<sup>-</sup>	60(±4.6)％
I<sup>-</sup>	78(±1.0)％
		F<sup>-</sup>	80(±2.1)％
SO<sub>4</sub><sup>2-</sup>	75(±2.5)％
		磺胺	97(±1.4)％
CO<sub>3</sub><sup>2-</sup>	88(±2.8)％
		NO<sub>2</sub><sup>-</sup>	74(±3.7)％
ClO<sub>4</sub><sup>-</sup>	68(±4.5)％
		ClO<sub>3</sub><sup>-</sup>	74(±3.1)％

四、酶活力的测定

酶活(1U)定义为：在室温下，每分钟水解1μmol乙酸对硝基苯酯所需的酶量。

采用实施例2制备的粗酶液甲作为供试液，酶活为20.2U/mL。

采用实施例2制备的粗酶液乙作为供试液，酶活为0U/mL。

采用实施例2制备的XiCA蛋白溶液作为供试液，检测单位体积供试液的酶活。检测实施例2制备的XiCA蛋白溶液中的蛋白浓度。将单位体积供试液的酶活除以单位体积供试液的蛋白含量，得到蛋白比活力，数值为150U/mg。

实施例4、碳酸酐酶(XiCA蛋白)在碳捕获和储存技术中的应用

1、将含有碳酸酐酶的25mM CaCl₂溶液pH调节至6.5，将硅片置于烧杯底部，抛光表面朝上，将6个针孔(直径约2mm)均匀地铺展在封口膜表面后覆盖烧杯；

2、将盖好的烧杯放在干燥器中心位置，将各自含有(NH4)₂CO₃粉末(重量：0.5g)的三个小玻璃瓶均匀地放置在烧杯周围；

3、在CaCO₃生长结束时，将带有沉淀物的硅晶片用超纯水和乙醇冲洗并在氮气流下在环境温度下干燥；

4、通过扫描电子显微镜(SEM)在JEOL JSM-840显微镜上以15kV的加速电压用金溅射来表征CaCO₃沉淀物的尺寸和形态。

以未加入供试液碳酸酐酶的作为对照。结果见图6。

序列表

<110> 中国石油大学（华东）

<120> 碳酸酐酶XiCA及其编码基因和应用

<130> 20190610

<141> 2019-06-14

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 248

<212> PRT

<213> 辛芳芳菌(Xinfangfangia sp.)

<400> 1

Met Cys Asn Asp Cys Ser Gly Glu Asp Arg Val Glu Ser Arg Arg Gly

1 5 10 15

Phe Leu Arg Leu Gly Leu Met Gly Thr Gly Ala Ala Ala Val Ser Ala

20 25 30

Leu Gly Leu Pro Ala Phe Ala Asp Glu Cys Leu Ala Phe Gly Pro Asp

35 40 45

Asp Gln Ser Ala Ile Thr Pro Ala Gln Ala Val Ala Lys Leu Met Glu

50 55 60

Gly Asn Ala Arg Phe Thr Ala Gly Gln Ser Leu His Cys Asp Leu Leu

65 70 75 80

Ala Gln Ala Arg Ala Thr Ala Glu Lys Gln Thr Pro Phe Ala Cys Val

85 90 95

Leu Gly Cys Met Asp Ser Arg Ala Ala Pro Glu Leu Ile Phe Asp Gln

100 105 110

Gln Ile Gly Asp Ile Phe Val Ser Arg Val Ala Gly Asn Leu Ala Thr

115 120 125

Pro Glu Val Ile Gly Ser Phe Glu Tyr Gly Thr Lys Val Ala Gly Ala

130 135 140

Lys Ala Ile Val Val Leu Gly His Ser His Cys Gly Ala Val Lys Gly

145 150 155 160

Ala Ile Asp Lys Ala Asp Val Gly Ala Asn Leu Thr Ala Leu Leu Ala

165 170 175

Glu Ile Glu Pro Val Val Ala Ala Val His His Glu Gly Glu Arg Ser

180 185 190

Ser Lys Asn His Glu Leu Val Glu Ala Val Ala Glu Ala Asn Ala Arg

195 200 205

Asp Ala Ala Ala Lys Leu Val Ala Ala Ser Pro Val Leu Ala Glu Arg

210 215 220

Val Ala Ala Gly Glu Leu Met Val Val Ala Ala Ile Tyr Asp Val Asp

225 230 235 240

Thr Gly Ala Val Arg Leu Leu Ala

245

<210> 2

<211> 747

<212> DNA

<213> 辛芳芳菌(Xinfangfangia sp.)

<400> 2

atgtgcaatg actgttcggg tgaagacagg gtggaaagcc ggcggggctt tctgcggctg 60

gggctgatgg gaacgggtgc ggccgcggtc tcggccctgg gcctgccggc ctttgccgat 120

gaatgcctgg ccttcggccc cgatgatcaa agcgcgatca cgccggccca ggcggtggca 180

aagctgatgg agggcaatgc ccgcttcacc gccgggcaaa gcctgcattg cgatctgctc 240

gcccaggcca gggcgacggc ggaaaagcag acgccctttg cctgtgtgct gggctgcatg 300

gattcgcgcg ccgcgcccga gctgatcttt gatcagcaga tcggcgatat cttcgtgtcg 360

cgcgtggcgg gcaatctggc gacgcccgaa gtgatcggca gtttcgaata tggaaccaag 420

gtggccgggg ccaaggcgat cgtggtgctg ggccattccc attgcggcgc ggtcaagggc 480

gccatcgaca aggccgatgt cggcgcgaac ctgaccgccc ttctggccga gatcgagccc 540

gtggtggcgg ccgtgcatca cgagggcgag cggtcttcga agaaccacga actggtcgag 600

gcggtggccg aagccaatgc ccgcgacgcc gcggcaaagc tggtggcggc aagcccggtt 660

ctggccgaac gggtcgcggc gggcgaattg atggtggtgg cagcgatcta cgacgtcgac 720

accggcgctg tgcggcttct ggcctag 747

<210> 3

<211> 287

<212> PRT

<213> 辛芳芳菌(Xinfangfangia sp.)

<400> 3

Met His His His His His His Arg Gly Ser Pro Phe Thr Phe Thr Thr

1 5 10 15

Gly Leu Leu Pro Leu Cys Ala Arg Arg His Gly Arg Ala Gln Pro Leu

20 25 30

Ala Ala Asp Gly Arg Arg Gly Met Cys Asn Asp Cys Ser Gly Glu Asp

35 40 45

Arg Val Glu Ser Arg Arg Gly Phe Leu Arg Leu Gly Leu Met Gly Thr

50 55 60

Gly Ala Ala Ala Val Ser Ala Leu Gly Leu Pro Ala Phe Ala Asp Glu

65 70 75 80

Cys Leu Ala Phe Gly Pro Asp Asp Gln Ser Ala Ile Thr Pro Ala Gln

85 90 95

Ala Val Ala Lys Leu Met Glu Gly Asn Ala Arg Phe Thr Ala Gly Gln

100 105 110

Ser Leu His Cys Asp Leu Leu Ala Gln Ala Arg Ala Thr Ala Glu Lys

115 120 125

Gln Thr Pro Phe Ala Cys Val Leu Gly Cys Met Asp Ser Arg Ala Ala

130 135 140

Pro Glu Leu Ile Phe Asp Gln Gln Ile Gly Asp Ile Phe Val Ser Arg

145 150 155 160

Val Ala Gly Asn Leu Ala Thr Pro Glu Val Ile Gly Ser Phe Glu Tyr

165 170 175

Gly Thr Lys Val Ala Gly Ala Lys Ala Ile Val Val Leu Gly His Ser

180 185 190

His Cys Gly Ala Val Lys Gly Ala Ile Asp Lys Ala Asp Val Gly Ala

195 200 205

Asn Leu Thr Ala Leu Leu Ala Glu Ile Glu Pro Val Val Ala Ala Val

210 215 220

His His Glu Gly Glu Arg Ser Ser Lys Asn His Glu Leu Val Glu Ala

225 230 235 240

Val Ala Glu Ala Asn Ala Arg Asp Ala Ala Ala Lys Leu Val Ala Ala

245 250 255

Ser Pro Val Leu Ala Glu Arg Val Ala Ala Gly Glu Leu Met Val Val

260 265 270

Ala Ala Ile Tyr Asp Val Asp Thr Gly Ala Val Arg Leu Leu Ala

275 280 285

<210> 4

<211> 996

<212> DNA

<213> 辛芳芳菌(Xinfangfangia sp.)

<400> 4

atgcatcatc atcatcatca ccgcggatcg cccttcacct ttaccactgg cctttagctt 60

ccgctctgcg cccgccgcca tggcagggcc caaccccttg ctgctgacgg gagacgcggg 120

atgtgcaatg actgttcggg tgaagacagg gtggaaagcc ggcggggctt tctgcggctg 180

gggctgatgg gaacgggtgc ggccgcggtc tcggccctgg gcctgccggc ctttgccgat 240

gaatgcctgg ccttcggccc cgatgatcaa agcgcgatca cgccggccca ggcggtggca 300

aagctgatgg agggcaatgc ccgcttcacc gccgggcaaa gcctgcattg cgatctgctc 360

gcccaggcca gggcgacggc ggaaaagcag acgccctttg cctgtgtgct gggctgcatg 420

gattcgcgcg ccgcgcccga gctgatcttt gatcagcaga tcggcgatat cttcgtgtcg 480

cgcgtggcgg gcaatctggc gacgcccgaa gtgatcggca gtttcgaata tggaaccaag 540

gtggccgggg ccaaggcgat cgtggtgctg ggccattccc attgcggcgc ggtcaagggc 600

gccatcgaca aggccgatgt cggcgcgaac ctgaccgccc ttctggccga gatcgagccc 660

gtggtggcgg ccgtgcatca cgagggcgag cggtcttcga agaaccacga actggtcgag 720

gcggtggccg aagccaatgc ccgcgacgcc gcggcaaagc tggtggcggc aagcccggtt 780

ctggccgaac gggtcgcggc gggcgaattg atggtggtgg cagcgatcta cgacgtcgac 840

accggcgctg tgcggcttct ggcctagggg cggggccggc gccggcgggc gtgccggcct 900

ttccctgcgc ggggttgact tcgcggtcct ctggcgttct atcgccacga tccgaatgac 960

cccgctgtac agggattgac catgcacgcc tatcgc 996

Claims

1.一种蛋白质，是如下(a1)或(a2)或(a5)：

(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a5)在(a1)的末端连接标签得到的融合蛋白。

2.权利要求1所述蛋白质的编码基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下1)或2)中任一所述的DNA分子：

1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

2)编码区如序列表中序列4中第121-867位核苷酸所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒或重组微生物。

5.权利要求1所述蛋白质作为碳酸酐酶的应用。

6.权利要求1所述蛋白质在碳捕获和储存技术中的应用。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于：应用权利要求1所述蛋白质时，采用的温度为20-80℃，采用的pH为3-11。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：应用权利要求1所述蛋白质时，采用的温度为50℃，采用的pH为5。

9.权利要求1所述蛋白质在制备碳酸酐酶中的应用。