CN110256535B - L-天门冬酰胺酶XiDL及其编码基因和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了L‑天门冬酰胺酶XiDL及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，来源于辛芳芳菌(Xinfangfangiasp.)，是一种L‑天门冬酰胺酶，命名为XiDL蛋白，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明还保护XiDL蛋白作为L‑天门冬酰胺酶的应用。本发明还保护XiDL蛋白在急性淋巴细胞白血病，淋巴系统恶性肿瘤和霍奇金淋巴瘤等治疗中的应用。本发明还保护一种用于防止油炸或烘焙食品中丙烯酰胺形成的制剂，其活性成分为XiDL蛋白。本发明对于相关医疗领域、食品工业领域等，具有重大的应用前景。

Description

L-天门冬酰胺酶XiDL及其编码基因和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及L-天门冬酰胺酶XiDL及其编码基因和应用。
背景技术
L-天门冬酰胺酶(L-天冬酰胺酰胺水解酶，E.C 3.5.1.1)催化L-天冬酰胺水解以产生L-天冬氨酸和氨，在医疗领域，微生物来源的L-天门冬酰胺酶用作抗肿瘤剂和抗白血病剂，例如治疗淋巴恶性肿瘤，急性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤，同样也是治疗急性淋巴细胞白血病的主要药物之一，但它们的治疗利用受到涉及超敏反应和其它一些毒副作用的不良并发症的阻碍。而在食品领域，2002年4月瑞典国家食品管理局和斯德哥尔摩大学研究人员率先在炸薯条等油炸和烧烤类的淀粉食品中检出丙烯酰胺，研究表明，丙烯酰胺是一种神经毒素，于2017年被世界卫生组织国际癌症研究机构列为致癌物，人体可通过消化道、皮肤黏膜等多种途径接触丙烯酰胺。据报道，可以通过添加L-天门冬酰胺酶去除天冬酰胺(丙烯酰胺的重要前体)而不改变最终食品的外观和味道的优点，因此L-天门冬酰胺酶在食品领域具有重要的应用前景。
但是目前，在食品工业中只有几种L-天门冬酰胺酶可以使用，如
Figure BDA0002094878430000011
和
Figure BDA0002094878430000012
两者都来自曲霉属(Aspergillus sp.)，随着对L-天门冬酰胺酶的研究应用的不断深入，寻求具有不同活性和性质的新颖的L-天门冬酰胺酶，这有利于扩展其在医学领域、食品工业领域的用途。在医学领域，要求L-天门冬酰胺酶在生理pH和温度下具有高活性，在食品领域，则需要L-天门冬酰胺酶在较宽pH和温度范围内具有足够的活性，并且具有高酶活性，据目前的报道，符合上述要求的L-天门冬酰胺酶相对较少，本发明提供了新颖来源的L-天门冬酰胺酶XiDL及其编码基因和应用。
发明内容
本发明的目的是提供L-天门冬酰胺酶XiDL及其编码基因和应用。
本发明提供的蛋白质，来源于辛芳芳菌(Xinfangfangia sp.)，是一种L-天门冬酰胺酶，命名为XiDL蛋白，是如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)或(a6)或(a7)：
(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(a2)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(a3)含有(a1)的融合蛋白；
(a4)在(a1)的末端连接含有标签的短肽得到的融合蛋白；
(a5)在(a1)的末端连接标签得到的融合蛋白；
(a6)将(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加具有L-天门冬酰胺酶功能的由其衍生的蛋白质。
(a7)来源于辛芳芳菌，且与(a1)具有99％以上同源性，且具有L-天门冬酰胺酶功能的蛋白质。
标签具体如表1所示。
表1标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
HA 9 YPYDVPDYA
XiDL蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
所述基因为如下1)至4)中任一所述的DNA分子：
1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；
2)编码区如序列表中序列4中第1-1173位核苷酸所示的DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有L-天门冬酰胺酶功能蛋白的DNA分子；
4)来源于辛芳芳菌，且与1)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码具有L-天门冬酰胺酶功能蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
含有所述基因的重组表达载体、表达盒或重组微生物均属于本发明的保护范围。
本发明还保护XiDL蛋白作为L-天门冬酰胺酶的应用。应用XiDL蛋白作为L-天门冬酰胺酶时，采用的温度为25-80℃，采用的pH为3-11。应用XiDL蛋白作为L-天门冬酰胺酶时，采用的温度为60℃，采用的pH为6。
本发明还保护XiDL蛋白在急性淋巴细胞白血病，淋巴系统恶性肿瘤和霍奇金淋巴瘤等治疗中的应用。应用XiDL蛋白治疗急性淋巴细胞白血病，淋巴系统恶性肿瘤和霍奇金淋巴瘤时，采用的温度为25-80℃，采用的pH为3-11。应用XiDL蛋白治疗急性淋巴细胞白血病，淋巴系统恶性肿瘤和霍奇金淋巴瘤时，采用的温度为60℃，采用的pH为6。
本发明还保护L-天门冬酰胺酶用于抑制炸薯条中的丙烯酰胺中的应用。所述的应用将原料浸泡在浓度为8U/mL的L-天门冬酰胺酶溶液中，其物料比为1:2-1:3，浸泡温度40℃，时间30min。
本发明提供的L-天门冬酰胺酶XiDL具有较高的酶活力，宽泛的底物，并且反应温度宽泛，反应pH宽泛，对于金属离子、还原剂、和表面活性剂均具有高耐受性。
辛芳芳菌(Xinfangfangia sp.)DLY26已于2019年1月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国，武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC No：M 2019001。
本发明对于相关医疗领域、食品工业领域等，具有重大的应用前景。
附图说明
图1为菌株DLY26的照片。
图2为系统发生树。
图3为XiDL蛋白溶液的电泳图。
图4为检测最适pH时的相对酶活结果。
图5为检测最适反应温度时的相对酶活结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、辛芳芳菌DLY26的分离、鉴定和保藏
一、分离
取约1ml活性污泥样品(取自石化炼油化污水处理系统)，用无菌蒸馏水依次稀释至10倍体积、20倍体积、50倍体积、100倍体积和1000倍体积。采用涂布平板法将100μl稀释后样本涂布于固体培养基表面，30℃培养，每天观察表面菌落的生长情况。挑取颜色不同、形态差异的菌落，通过三区划线法进行纯化和培养，直至在培养基表面生长出能够观察到形态、大小等特征都相同的单菌落为止。
二、鉴定
将纯化获得的菌株接种于TSA平板，30℃培养24h，然后使用透射电子显微镜观察细胞的形态、大小等特征(菌株DLY26的照片见图1)。从培养24h的TSA平板表面挑取单菌落，按照标准方法进行革兰氏染色处理，使用倒置荧光显微镜观察细菌的革兰氏染色情况。制备半固体培养基TSB，采用穿刺接种法观察细菌的运动性和好氧性情况。
以液体培养基TSB为基础：配制不同NaCl浓度的培养基体系(NaCl梯度为0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0及9.0g/100mL)，接种后置于30℃的摇床中振荡培养3-5d，使用UV-2450分光光度计在OD600处检测细菌的其生长情况，以确定最佳盐度生长范围；配制pH值不同的液体培养基(pH梯度设置为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0)，接种后置于30℃的摇床中振荡培养3-5d，以培养条件相同的不接菌培养基作为空白对照，以确定最佳生长pH范围；设置温度梯度为4℃、20℃、28℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃，以确定最佳生长温度范围。
以液体碳源培养基为基础，添加浓度的不同碳水化合物作为唯一的碳源，检测细菌的同化作用。
参照常见细菌系统鉴定手册中的方法，检测细菌的硝酸盐还原、亚硝酸盐还原能力，反硝化能力以及脂酶、接触酶的有无。使用海博革兰氏阴性细菌鉴定系统(青岛，中国)进行细菌的Voges-Proskauer测试(VP测试)，检测细菌的硫化氢(H2S)产生、脲酶(URE)、明胶(GEL)水解情况。也可以用于评价其他生理生化特征的有无，例如通过对精氨酸(ADH)、山梨醇(SOR)、蔗糖(SAC)等的降解情况，以检验精氨酸酶、山梨醇脱氢酶、蔗糖酶的存在情况。
以X.soli ZQBWT、R.megalophilus JA194T和Fal.halotolerans JA744T作为参考菌株。菌株DLY26和参考菌株的结果见表2和表3和表4。
表2
生化特征 DLY26 ZQBW<sup>T</sup> JA194<sup>T</sup> JA744<sup>T</sup>
温度范围 4-45 26-35 4-45 4-40
最适温度 30 30 30 30
pH范围 5-11 6-12 3-11 3-11
最适pH 7.0 7.0 7.0 7.0
盐度范围(％) 0-5.0 0-5.0 0-5.0 0-5.0
最适盐度(％) 1.0 0 0 0
细胞大小(μm) 1.2-2.0*,0.4-0.6 1.5-2.6*,0.7-0.9 1.2-1.0*,1.5-2.0 2.0-5.0*,1.0-1.2
鞭毛 - - - +
细胞外形 Rod Rod Oval Rod Oval Rod
运动性 - - - +
GC含量(％) 63.9 67.0 66.67 74-76
表3
Figure BDA0002094878430000041
Figure BDA0002094878430000051
表4
ONPG ADH LDH ODC CIT H<sub>2</sub>S URE IND VP GEL RHA MEL AMY OX
DLY26 + + + + + W + - - - - - - +
DLY30 + + - - + W + - - + - - - +
JA194<sup>T</sup> - + + + + W + - - - - - - +
JA744<sup>T</sup> + + + + + W + - - - - - - +
注：ONPG：β-半乳糖苷酶；ADH：精氨酸；LDH：赖氨酸；ODC：鸟氨酸；CIT：柠檬酸盐；H2S：产硫化氢试验；URE：脲酶；IND：吲哚；GEL：明胶；RHA：鼠李糖；MEL：蜜二糖；AMY：苦杏仁甙；OX：氧化酶。
利用细菌基因组DNA提取试剂盒，提取菌株DLY26的基因组DNA，并采用通用引物27F和1492R进行16S rDNA扩增。扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳法分析产物条带，获得目标条带并使用天根DNA纯化试剂盒DP209进行纯化。将纯化产物连接到载体pMD19-T中，利用pMD19-T克隆试剂盒，将目的载体转化至大肠杆菌DH5α。将重组菌送往青岛擎科生物技术有限公司进行测序，获得16S rRNA序列。利用GenBank数据库检索每个相关基因的16S rRNA的序列，使用MEGA版本7.0构建菌株的系统发育树。使用近邻连接法(NJ)进行细菌的系统发育分析。基于1000次重复，使用Bootstrap分析确定系统发生树的拓扑结构。见图2。
以上鉴定结果表明，菌株DLY26属于红细菌科(Rhodobacteraceae)，辛芳芳菌属(Xinfangfangia)。
三、保藏
辛芳芳菌(Xinfangfangia sp.)DLY26已于2019年1月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国，武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC No：M 2019001。
实施例2、L-天门冬酰胺酶(XiDL蛋白)的制备
经过大量序列分析、比对和功能验证，从辛芳芳菌DLY26中发现一个新蛋白，将其命名为XiDL蛋白，如序列表的序列1所示。将辛芳芳菌DLY26中编码XiDL蛋白的基因命名为XiDL基因，其编码框如序列表的序列2所示。
一、构建重组质粒
1、以辛芳芳菌DLY26的基因组DNA为模板，采用DL-F和DL-R组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。
DL-F：5’-CACCGCAGAAAATCGCACATCT-3’；
DL-R：5’-CGCGTGAATGGGAACAGGCG-3’。
2、取步骤1得到的PCR扩增产物，与pDE1载体连接，得到重组质粒pDE1-XiDL。
pDE1载体(pDE1Vector)为pDE1Directional Expression Kit的组件。pDE1Directional Expression Kit：北京擎科新业生物技术有限公司，产品目录号TSV-E1。
经测序，重组质粒pDE1-XiDL中具有序列表的序列4所示的DNA分子(其中第1-1173位核苷酸为开放阅读框)，表达序列表的序列3所示的融合蛋白。序列表的序列3中，第2-7位氨基酸残基组成His6标签，第25-361位氨基酸残基组成XiDL蛋白。
二、制备重组菌
将重组质粒pDE1-XiDL导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌甲。
将pDE1载体导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌乙。
三、表达蛋白
1、将重组菌接种至含50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基，37℃、150rpm振荡培养12小时，得到种子液。
2、将1体积份种子液接种至99体积份含50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，37℃、200rpm振荡培养至OD600nm值约为0.6，此时加入IPTG诱导剂并使其在体系中的浓度为0.5mmol/L，然后25℃、200rpm振荡培养6h(诱导表达)，然后4℃、8000×g离心10min，收集菌体沉淀。
3、取步骤2得到的沉淀，用Tris-HCl缓冲液(0.05M，pH7.4)洗涤，然后悬浮于Tris-HCl缓冲液(0.05M，pH 7.2)并进行超声破碎(超声破碎参数：功率200W，每超声4s停6s，总时间为40min)，然后4℃、10000×g离心20min，收集上清液。
重组菌甲进行上述步骤得到的上清液，命名为粗酶液甲。
重组菌乙进行上述步骤得到的上清液，命名为粗酶液乙。
四、纯化蛋白
取步骤三得到的粗酶液甲，用孔径为0.22μm的微滤滤膜过滤，收集滤液。取滤液，采用SuperdexTM 200 10/60凝胶层析柱进行分离纯化。将SuperdexTM 200 10/60凝胶层析柱连接到快速蛋白液相系统，以1×PBS缓冲液(pH 8.0)作为流动相，流速为0.05ML/min。收集保留体积为18-20mL对应洗脱峰的过柱后溶液,即为XiDL蛋白溶液。XiDL蛋白溶液的电泳图见图3，仅一条蛋白带，且符合预估分子量(约35KD)。
实施例3、L-天门冬酰胺酶(XiDL蛋白)的酶学性质
Tris-HCl缓冲液(50mM,pH 7.4)：称取6.06gTris，溶于超纯水中，用HCl调节pH至7.4。
底物溶液(25mM天冬酰胺)：称取3.303gL-天冬酰胺，采用Tris-HCl缓冲液溶解，并定容至1L。
一、pH对L-天门冬酰胺酶活性的影响
1、最适pH
取实施例2制备的XiDL蛋白溶液，用缓冲液稀释至2倍体积，将稀释液作为供试液。
检测方法：加入供试液200μL、底物溶液700μL(采用pH缓冲液配制)，37℃反应15min后，加入15％TCA(三氯乙酸)100μL终止反应，于10000g离心10min,然后取上清液200μL，依次加入4.8mL无氨水、200μL纳氏试剂，于室温下静置10min,然后测定OD450nm值。
分别采用如下缓冲液：pH3.0的柠檬酸盐缓冲液、pH4.0的柠檬酸盐缓冲液、pH5.0的柠檬酸盐缓冲液、pH6.0的柠檬酸盐缓冲液、pH6.0的磷酸盐缓冲液、pH7.0的磷酸盐缓冲液、pH8.0的磷酸盐缓冲液、pH8.0的碳酸盐缓冲液、pH9.0的碳酸盐缓冲液、pH10.0的碳酸盐缓冲液、pH11.0的碳酸盐缓冲液。柠檬酸盐缓冲液的配方见表5。磷酸盐缓冲液的配方见表6。碳酸盐缓冲液的配方见表7。
表5
pH 0.05M柠檬酸水溶液(mL) 0.05M柠檬酸钠水溶液(mL)
3.0 37.2 2.8
4.0 26.2 13.8
5.0 16.4 23.6
6.0 7.6 32.4
表6
pH 0.2M磷酸氢二钠水溶液(mL) 0.2M磷酸二氢钠水溶液(mL)
6.0 61.5 438.5
7.0 305 195
8.0 473.5 26.5
表7
pH 0.05M碳酸钠水溶液(mL) 0.05M碳酸氢钠水溶液(mL)
8.0 50 450
9.0 150 350
10.0 300 200
11.0 450 50
XiDL蛋白的最适pH为6。将采用最适pH对应的缓冲液时的OD450nm值作为100％，计算采用各种缓冲液时的相对值，作为相对酶活。结果见图4。
二、温度对L-天门冬酰胺酶活性的影响
1、最适反应温度
取实施例2制备的XiDL蛋白溶液，用Tris-HCl缓冲液(100mM、pH7.4)稀释至2倍体积，然后作为供试液。
检测方法：加入供试液200μL、底物溶液700μL，于25℃、30℃、40℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃分别反应15min后，加入TCA(三氯乙酸)100μL终止反应，于10000g离心10min,然后取上清液200μL，依次加入4.8mL无氨水、200μL纳氏试剂，于室温静置10min,然后测定OD450nm值。
最适反应温度为60℃。将采用最适反应温度时的OD450nm值作为100％，计算采用各种反应温度时的相对值，作为相对酶活。结果见图5。
三、金属离子及化学试剂对L-天门冬酰胺酶活性的影响
取实施例2制备的XiDL蛋白溶液，用Tris-HCl缓冲液(100mM、pH7.0)稀释至2倍体积，然后作为供试液。
检测方法：加入供试液200μL、底物溶液700μL，于25℃、30℃、40℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃分别反应15min后，加入TCA(三氯乙酸)100μL终止反应，于10000g离心10min,然后取上清液200μL，依次加入4.8mL无氨水、200μL纳氏试剂，于室温静置10min,然后测定OD450nm值。
以不加入化合物水溶液/化学试剂时相应的OD450nm值作为100％，分别计算加入各种化合物水溶液/化学试剂后的相对酶活。
部分化合物分别见表8。该部分化合物在5mL体系中的浓度分别为1mM或5mM。结果见表8。
部分化学试剂分别见表9。该部分化学试剂在5mL体系中的浓度为1mM或5mM。结果见表9。
表8
Figure BDA0002094878430000081
表9
Figure BDA0002094878430000091
四、L-天门冬酰胺酶的底物特异性
取实施例2制备的XiDL蛋白溶液，用Tris-HCl缓冲液(100mM、pH7.0)稀释至2倍体积，然后作为供试液。
检测方法：加入供试液200μL、底物溶液700μL，37℃反应15min后，加入TCA(三氯乙酸)100μL终止反应，于10000g离心10min,然后取上清液200μL，依次加入4.8mL无氨水、200μL纳氏试剂，于室温静置10min,然后测定OD450nm值。
以L-天冬酰胺作为底物时相应的OD450m值作为100％，分别计算对于各种底物的相对酶活。
底物分别见表11。底物在5mL体系中的浓度为10mM。结果见表11。
表11
底物 相对酶活
L-天冬酰胺 100(±2)％
D-天门冬酰胺 92(±4)％
L-谷氨酰胺 150(±3)％
D-谷氨酰胺 75(±2)％
五、酶活力的测定
酶活(1U)定义为：每分钟催化L-天冬酰胺释放1mmol氨所需的酶量。
检测方法：加入供试液200μL、底物溶液700μL，37℃反应15min后，加入TCA(三氯乙酸)100μL终止反应，于10000g离心10min,然后取上清液200μL，依次加入4.8mL无氨水、200μL纳氏试剂，于室温静置10min,然后测定OD450nm值。
采用实施例2制备的粗酶液甲作为供试液，酶活为26U/mL。
采用实施例2制备的粗酶液乙作为供试液，酶活为0U/mL。
采用实施例2制备的XiDL蛋白溶液作为供试液，检测单位体积供试液的酶活。检测实施例2制备的XiDL蛋白溶液中的蛋白浓度。将单位体积供试液的酶活除以单位体积供试液的蛋白含量，得到蛋白比活力，数值为50U/mg。
实施例4、L-天门冬酰胺酶(XiDL蛋白)用于治疗癌细胞
1、取实施例2制备的XiDL蛋白溶液，用Tris-HCl缓冲液(100mM、pH7.0)稀释至2倍体积，作为供试液；
2、将HELA癌细胞、MCF-7癌细胞在含有10％FBS的DMEM培养基中于37℃和5％CO2培养24h，然后用胰蛋白酶解离，离心后重悬于培养基中；
3、将1mL细胞悬浮液(2×104/mL)均匀地接种在96孔细胞培养板中，并通过标准MTT测定实现细胞生长的定量评估；
4、将各种浓度的供试液-L-天门冬酰胺酶(100ug/mL、250ug/mL和500ug/mL)加入孔中，过夜处理后，在每个孔中加入10μL MTT(5mg/mL)溶液，并将板在37℃下进一步温育4小时，直至形成甲蓝色晶体；
5、弃去每个孔中上清液，在37℃下加入100μL DMSO使甲蓝色晶体溶解，10分钟后测定OD570nm值。以未加L-天门冬酰胺酶测定的吸光度值作为对照组。
癌细胞分别见表12，结果见表12。
表12
Figure BDA0002094878430000101
实施例5、L-天门冬酰胺酶(XiDL蛋白)用于抑制炸薯条中的丙烯酰胺
1、实验过程
(1)取实施例2制备的XiDL蛋白溶液，用Tris-HCl缓冲液(100mM、pH7.0)稀释至8U/L，作为供试液；
(2)马铃薯洗涤去皮后使用切片机切片(厚度为2.0mm)，将马铃薯切片浸入蒸馏水中2分钟除去表面的淀粉；
(3)马铃薯切片于40℃浸入L-天门冬酰胺酶溶液中30min，烘干后样品在160℃下油炸10分钟后，冷却至环境温度；
(4)2g粉碎马铃薯样品采用5mL蒸馏水溶解，匀浆液在70℃温浴并搅拌30min后，于10000g离心15min，将上清以1:1的比例添加正己烷除油，彻底摇动混合物，弃上层，下层水层用于样品分析；
(5)样品在Aminex HPX-87H(300mm×7.8mm)柱中分析，温度为30℃，流速为0.5mL/min，硫酸溶液(0.01M)作为流动相，进样为20μL，紫外检测保持在200nm。
2、L-天门冬酰胺酶(XiDL蛋白)用于抑制炸薯条中的丙烯酰胺
经L-天门冬酰胺酶处理后，油炸薯片中提取的丙烯酰胺的浓度，相较于处理前可降低95％，这些结果揭示了该酶在食品加工工业中的潜力。
序列表
<110> 中国石油大学（华东）
<120> 利血生XiDL及其编码基因和应用
<130> 20190611
<141> 2019-06-14
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 337
<212> PRT
<213> 辛芳芳菌(Xinfangfangia sp.)
<400> 1
Met Ala Arg Val Asp Ala Gly Ala Val Pro Val Ala Glu Leu Trp Arg
1 5 10 15
Gly Gly Val Leu Glu Ser Thr His Leu Gly His Ala Val Ile Cys Asp
20 25 30
Ala Lys Gly Ile Val Ala Gln Trp Gly Asn Pro Gln Ala Val Ile Phe
35 40 45
Pro Arg Ser Ser Cys Lys Met Ile Gln Ala Leu Pro Leu Ile Glu Thr
50 55 60
Gly Ala Ala Asp Ala Arg Gly Leu Ser Glu Ala His Leu Ala Leu Ala
65 70 75 80
Cys Ala Ser His Gln Gly Ala Asp Leu His Val Glu Met Ala Gly Arg
85 90 95
Trp Ile Ala Asp Leu Gly Leu Gly Glu Ser Asp Leu Arg Cys Gly Ala
100 105 110
His Glu Pro Ala Asp Ile Gln Glu Arg Asp Arg Leu Ile Lys Ala Asp
115 120 125
Lys Ser Pro Cys Gln Leu His Asn Asn Cys Ser Gly Lys His Ser Gly
130 135 140
Phe Leu Thr Val Thr Gln His Leu Arg Ala Gly Pro Glu Tyr Val Glu
145 150 155 160
Ile Asp His Pro Leu Gln Arg Ala Ile Arg Ala Ala Thr Glu Glu Val
165 170 175
Thr Gly Glu Thr Ile Ala Gly Trp Gly Val Asp Gly Cys Ser Ala Pro
180 185 190
Asn Phe Ala Met Ser Val Ala Gly Leu Ala Gly Ala Met Ala Lys Phe
195 200 205
Ala Thr Ala Arg Glu Gly Gln Gly Ala Arg Gln Asp Ala Met Ala Arg
210 215 220
Leu Ala Arg Ala Met Ala Ser Tyr Pro Glu Leu Val Ala Gly Glu Gly
225 230 235 240
Arg Ala Cys Thr Glu Leu Met Arg Ala Met Gly Gly Lys Val Ala Ile
245 250 255
Lys Thr Gly Ala Glu Ala Val Phe Val Ala Ile Leu Pro Glu Lys Gly
260 265 270
Leu Gly Ile Ala Leu Lys Val Leu Asp Gly Asn Ser Arg Ala Ser Glu
275 280 285
Ala Ala Ile Ala Ala Leu Leu Val Arg Leu Gly Val Leu Asp Pro Gly
290 295 300
His Pro Ala Thr Val Lys Arg Leu Asn Pro Val Gln Lys Asn Trp Arg
305 310 315 320
Gly Ile Glu Thr Gly Glu Val Arg Leu Ala Glu Gly Phe Gly Ala Gly
325 330 335
Leu
<210> 2
<211> 1014
<212> DNA
<213> 辛芳芳菌(Xinfangfangia sp.)
<400> 2
atggccagag tcgatgcagg cgcggttccg gtggccgaac tgtggcgcgg gggtgtgctg 60
gaaagcaccc atctgggcca tgcggtgatc tgcgatgcca aggggatcgt ggcgcaatgg 120
ggcaacccgc aggcggtgat cttcccgcgg tcgtcctgca agatgatcca ggccctgccg 180
ctgatcgaga ccggcgcggc cgatgcgcgc ggcctttccg aggcgcatct ggcgctggcc 240
tgtgccagcc atcagggcgc cgatctgcat gtggaaatgg cggggcgctg gatcgccgat 300
ctgggcttgg gcgaaagcga cctgcgctgc ggggcgcatg aaccggccga tatccaagag 360
cgcgaccggc tgatcaaggc cgacaaatcg ccctgccagc tgcacaacaa ttgttccggc 420
aagcattccg gtttcctgac cgtgacccag catctgcgcg cggggccgga atatgtcgag 480
atcgaccatc cgctgcagcg cgcgatccgg gccgccaccg aagaggtgac gggcgagacg 540
attgccggct ggggcgtcga tggctgctcg gcgccgaatt ttgccatgtc ggtcgcgggc 600
ctggccggcg cgatggcgaa attcgccacg gcgcgcgaag gccagggcgc gcggcaggat 660
gcgatggcgc ggctggcgcg tgcgatggcc agctatcccg aactggtcgc gggcgaaggc 720
cgggcctgta ccgagctgat gcgggcgatg ggcggcaagg tggcgatcaa gaccggggcc 780
gaagcggttt tcgtggcgat cctgccggaa aagggcctgg gcatcgcgct gaaggtgctg 840
gacggcaatt cccgcgcctc ggaagcggcg atcgccgcgc ttctggtgcg gctgggcgtg 900
ctggatccgg gccatccggc cacggtaaag cggctgaacc cggtgcagaa aaactggcgc 960
ggcatcgaaa cgggcgaggt ccgtctggcc gagggcttcg gcgcgggtct gtaa 1014
<210> 3
<211> 361
<212> PRT
<213> 辛芳芳菌(Xinfangfangia sp.)
<400> 3
Met His His His His His His Arg Gly Ser Pro Phe Thr Ala Glu Asn
1 5 10 15
Arg Thr Ser Val Arg Gly Ala Arg Met Ala Arg Val Asp Ala Gly Ala
20 25 30
Val Pro Val Ala Glu Leu Trp Arg Gly Gly Val Leu Glu Ser Thr His
35 40 45
Leu Gly His Ala Val Ile Cys Asp Ala Lys Gly Ile Val Ala Gln Trp
50 55 60
Gly Asn Pro Gln Ala Val Ile Phe Pro Arg Ser Ser Cys Lys Met Ile
65 70 75 80
Gln Ala Leu Pro Leu Ile Glu Thr Gly Ala Ala Asp Ala Arg Gly Leu
85 90 95
Ser Glu Ala His Leu Ala Leu Ala Cys Ala Ser His Gln Gly Ala Asp
100 105 110
Leu His Val Glu Met Ala Gly Arg Trp Ile Ala Asp Leu Gly Leu Gly
115 120 125
Glu Ser Asp Leu Arg Cys Gly Ala His Glu Pro Ala Asp Ile Gln Glu
130 135 140
Arg Asp Arg Leu Ile Lys Ala Asp Lys Ser Pro Cys Gln Leu His Asn
145 150 155 160
Asn Cys Ser Gly Lys His Ser Gly Phe Leu Thr Val Thr Gln His Leu
165 170 175
Arg Ala Gly Pro Glu Tyr Val Glu Ile Asp His Pro Leu Gln Arg Ala
180 185 190
Ile Arg Ala Ala Thr Glu Glu Val Thr Gly Glu Thr Ile Ala Gly Trp
195 200 205
Gly Val Asp Gly Cys Ser Ala Pro Asn Phe Ala Met Ser Val Ala Gly
210 215 220
Leu Ala Gly Ala Met Ala Lys Phe Ala Thr Ala Arg Glu Gly Gln Gly
225 230 235 240
Ala Arg Gln Asp Ala Met Ala Arg Leu Ala Arg Ala Met Ala Ser Tyr
245 250 255
Pro Glu Leu Val Ala Gly Glu Gly Arg Ala Cys Thr Glu Leu Met Arg
260 265 270
Ala Met Gly Gly Lys Val Ala Ile Lys Thr Gly Ala Glu Ala Val Phe
275 280 285
Val Ala Ile Leu Pro Glu Lys Gly Leu Gly Ile Ala Leu Lys Val Leu
290 295 300
Asp Gly Asn Ser Arg Ala Ser Glu Ala Ala Ile Ala Ala Leu Leu Val
305 310 315 320
Arg Leu Gly Val Leu Asp Pro Gly His Pro Ala Thr Val Lys Arg Leu
325 330 335
Asn Pro Val Gln Lys Asn Trp Arg Gly Ile Glu Thr Gly Glu Val Arg
340 345 350
Leu Ala Glu Gly Phe Gly Ala Gly Leu
355 360
<210> 4
<211> 1173
<212> DNA
<213> 辛芳芳菌(Xinfangfangia sp.)
<400> 4
atgcatcatc atcatcatca ccgcggatcg cccttcaccg cagaaaatcg cacatctgtg 60
aggggggcac gcatggccag agtcgatgca ggcgcggttc cggtggccga actgtggcgc 120
gggggtgtgc tggaaagcac ccatctgggc catgcggtga tctgcgatgc caaggggatc 180
gtggcgcaat ggggcaaccc gcaggcggtg atcttcccgc ggtcgtcctg caagatgatc 240
caggccctgc cgctgatcga gaccggcgcg gccgatgcgc gcggcctttc cgaggcgcat 300
ctggcgctgg cctgtgccag ccatcagggc gccgatctgc atgtggaaat ggcggggcgc 360
tggatcgccg atctgggctt gggcgaaagc gacctgcgct gcggggcgca tgaaccggcc 420
gatatccaag agcgcgaccg gctgatcaag gccgacaaat cgccctgcca gctgcacaac 480
aattgttccg gcaagcattc cggtttcctg accgtgaccc agcatctgcg cgcggggccg 540
gaatatgtcg agatcgacca tccgctgcag cgcgcgatcc gggccgccac cgaagaggtg 600
acgggcgaga cgattgccgg ctggggcgtc gatggctgct cggcgccgaa ttttgccatg 660
tcggtcgcgg gcctggccgg cgcgatggcg aaattcgcca cggcgcgcga aggccagggc 720
gcgcggcagg atgcgatggc gcggctggcg cgtgcgatgg ccagctatcc cgaactggtc 780
gcgggcgaag gccgggcctg taccgagctg atgcgggcga tgggcggcaa ggtggcgatc 840
aagaccgggg ccgaagcggt tttcgtggcg atcctgccgg aaaagggcct gggcatcgcg 900
ctgaaggtgc tggacggcaa ttcccgcgcc tcggaagcgg cgatcgccgc gcttctggtg 960
cggctgggcg tgctggatcc gggccatccg gccacggtaa agcggctgaa cccggtgcag 1020
aaaaactggc gcggcatcga aacgggcgag gtccgtctgg ccgagggctt cggcgcgggt 1080
ctgtaacggc gctgttacgc cgcgcttgat ttgccgggcg ttccgcggca cgattcaggc 1140
atgaatatgg aagcgcctgt tcccattcac gcg 1173

Claims (5)

1.一种蛋白质，是如下(a1)或(a2)或(a5)：
(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(a2)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(a5)在(a1)的末端连接标签得到的融合蛋白。
2.权利要求1所述蛋白质的编码基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下1)或2)中任一所述的DNA分子：
1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；
2)编码区如序列表中序列4中第73-1086位核苷酸所示的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒或重组微生物。
5.权利要求1所述蛋白质在制备L-天门冬酰胺酶中的应用。
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