CN103773750A - 一种l-天冬酰胺酶及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种L-天冬酰胺酶及其编码基因与应用。本发明公开的一种蛋白，为如下（1）或（2）所示：（1）SEQ ID No.2所示的蛋白；（2）将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。本发明公开的L-天冬酰胺酶适合作为食品添加剂应用于焙烤食品中，以降低产品中致癌物丙烯酰胺的生成量，同时也适合作为药物应用于白血病的辅助治疗。

Description

一种L-天冬酰胺酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种L-天冬酰胺酶及其编码基因与应用。

背景技术

L-天冬酰胺酶（EC3.5.1.1，L-asparaginase）又称L-天冬酰胺酰胺基水解酶，能够特异性的水解天冬酰胺生成L-天冬氨酸和氨，可广泛应用于食品、医药等领域。在食品工业中，L-天冬酰胺酶可用作高效的食品添加剂，焙烤食品原料中含有的L-天冬酰胺与还原糖在高温烘焙过程中能够通过美拉德反应生成致癌物质丙烯酰胺，L-天冬酰胺酶添加到焙烤食品原料中后能够将其中的L-天冬酰胺水解，从而减少焙烤食品中丙烯酰胺的生成量，提高此类食品的安全性。在医药方面，L-天冬酰胺酶可用作治疗癌症的药物，L-天冬酰胺是细胞增殖所需的一类营养物质，正常细胞具有L-天冬酰胺合成能力，而癌症细胞由于缺乏L-天冬酰胺合成机制而不能自身合成，因此如果在癌细胞的增殖过程中引入L-天冬酰胺酶将其L-天冬酰胺水解掉，就能使其缺乏L-天冬酰胺的营养供给而停止增殖直至死亡。L-天冬酰胺酶因其在食品加工和医药等领域的广泛、成功应用，目前已成为人们研究和产品开发的热点之一。

L-天冬酰胺酶广泛存在于植物、动物和微生物体中。L-天冬酰胺酶最初受到研究者的重视是基于其医药疗效。1953年，Kidd首次发现豚鼠血清具有抗癌作用，Broom于1961年进一步证实了豚鼠血清中的抗肿瘤因子是L-天冬酰胺酶（Broome JD.1981.L-asparaginase:discovery and development as a tumor-inhibitory agent.CancerTreat Rep65:111–114）。之后关于L-天冬酰胺酶的研究逐步深入，研究者成功采用微生物大肠杆菌（Escherichia coli）和欧文菌（Erwinia carotovora）等制备得到了L-天冬酰胺酶，并将其应用于儿童ALL、霍金森病、淋巴肉瘤、黑素肉瘤和胰腺癌等疾病的治疗，取得较好的疗效（Duval M,Suciu S,Ferster A,Rialland X,NelkenB,Lutz P,Benoit Y,Robert A,Manel AM,Vilmer E,Otten J,Philippe N.2002.Comparison of Escherichia coli-asparaginase with Erwinia-asparaginase in thetreatment of childhood lymphoid malignancies:results of a randomized EuropeanOrganisation for Research and Treatment of Cancer-Children's Leukemia Groupphase3trial.Blood99:2734–2739）。然而目前已报道的L-天冬酰胺酶还存在一些缺陷，如大肠杆菌来源的L-天冬酰胺酶作为白血病治疗药物时往往存在稳定性差和致敏性强的缺点；L-天冬酰胺酶作为食品添加剂使用时则存在水解效率低和热稳定性差等缺点。迄今，国内L-天冬酰胺酶的相关研究相对较少，且主要集中于细菌L-天冬酰胺酶的制备，如大肠杆菌（专利号：CN101748094）和枯草芽孢杆菌（专利号：CN102864163，CN103243063）。关于真菌来源L-天冬酰胺酶的酶学性质及应用的研究报道更少，仅见一个专利公开了黑曲霉（Aspergillus niger）来源的L-天冬酰胺酶基因序列和制备方式（专利号：CN101663395和CN102869772），仍然缺乏特性优良的适合于食品工业和白血病治疗应用的L-天冬酰胺酶产品。

发明内容

本发明的目的是提供一种L-天冬酰胺酶及其编码基因与应用。

本发明提供的一种蛋白，为如下（1）或（2）所示：

（1）SEQ ID No.2所示的蛋白；

（2）将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。

上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

上述编码基因中：所述编码基因为如下中至少一种：

1）SEQ ID No.1中自5’末端起第38位至第2086位核苷酸所示的DNA分子；

2）SEQ ID No.1所示的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

4）与1）或2）或3）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述蛋白质的DNA分子。

含有上述任一所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

一种制备L-天冬酰胺酶的方法也属于本发明的保护范围，该方法是将所述重组菌进行诱导表达得到。

所述重组菌的具体制备方法如下：将含有上述任一所述编码基因的重组表达载体导入E.coli BL21（DE3）中即得。

所述重组表达载体具体是将SEQ ID No.1中自5’末端起第38位至第2086位核苷酸所示的DNA分子插入pET-28a（+）的多克隆位点得到。

上述蛋白在制备清除食品中致癌物的产品中的应用或在降低食品中致癌物含量中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述致癌物为丙烯酰胺。

所述食品为面食，具体如面包、饼干。

上述蛋白在制备预防和/或治疗白血病和/或淋巴瘤的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

上述蛋白在制备抑制白血病细胞和/或淋巴瘤细胞的增殖的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

所述白血病细胞具体为人慢性髓系细胞性白血病细胞K562或人外周血白血病细胞Jurkat；

所述淋巴瘤细胞具体为人组织淋巴瘤细胞U937。

上述蛋白在制备具有L-天冬酰胺酶作用的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明通过RACE法从米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）中克隆得到一个L-天冬酰胺酶全长基因，并成功在大肠杆菌基因工程菌中进行了表达，该酶比活力高达约1980U/mg，具有严格的底物特异性，几乎没有L-谷氨酰胺酶活性。最适pH为7.0，在pH4.0-9.0范围内稳定；最适温度为45℃，且在45℃以内稳定，在45℃保温30min酶活几乎不变，表现出较好的热稳定性。本发明提供的L-天冬酰胺酶适合作为食品添加剂应用于焙烤食品中，以降低产品中致癌物丙烯酰胺的生成量，同时也适合作为药物应用于白血病的辅助治疗。

附图说明

图1为米黑根毛霉L-天冬酰胺酶（RmAsnase）基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为发酵粗酶液和Ni-IDA亲和柱纯化产物的SDS-PAGE图谱。

图3为RmAsnase蛋白作为L-天冬酰胺酶的最适作用pH。

图4为RmAsnase蛋白作为L-天冬酰胺酶的pH稳定性。

图5为RmAsnase蛋白作为L-天冬酰胺酶的最适作用温度。

图6为RmAsnase蛋白作为L-天冬酰胺酶的温度稳定性。

图7为RmAsnase蛋白作为L-天冬酰胺酶减少饼干中丙烯酰胺的含量图。

图8为RmAsnase蛋白作为L-天冬酰胺酶减少面包中丙烯酰胺的含量图。

图9为RmAsnase蛋白作为L-天冬酰胺酶抑制癌细胞体外增殖效果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中L-天冬酰胺酶酶活力的定义及测定方法如下：

L-天冬酰胺酶活力测定参照Wade等（Wade HE,Phillips BP.1971.Automateddetermination of bacterial asparaginase and glutaminase.Anal Biochem44:189-199）的方法：100μL0.04mol/L L-天冬酰胺溶液中分别加入50μL0.05M磷酸盐(pH7.0)缓冲液和100μL待测酶液，45℃反应10min后加50μL三氯乙酸溶液（1.5mol/L）终止反应，离心取上清加入0.7mL水和200μL Nessler试剂显色，最后在450nm测定吸光值A。

标准曲线的制作：以不同浓度的NH4Cl水溶液代替上述反应体系中的L-天冬酰胺溶液进行酶活测定，以铵离子浓度为横坐标，450nm处吸光值为纵坐标制作标准曲线，得到标准曲线公式。

酶活力单位（U）定义：在上述条件下每分钟催化L-天冬酰胺水解生成1μmol铵离子所需要的酶量。

将待测酶液的吸光值A带入标准曲线公式，得到铵离子的量，进而根据上述酶活力单位（U）定义计算得到该待测酶液的酶活。

米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）CAU432在文献“Katrolia,P.,Jia,H.,Yan,Q.,Song,S.,Jiang,Z.,Xu,H.,2012.Characterization of a protease-resistantalpha-galactosidase from the thermophilic fungus Rhizomucor miehei and itsapplication in removal of raffinose family oligosaccharides.Bioresour.Technol.110,578–586.”中公开过，公众可从中国农业大学获得。

SMART RACE cDNA Amplification Kit购自美国Clontech公司，产品目录号为634914。

琼脂糖Ni-IDA亲和柱购自美国GE公司，产品目录号为17-0575-01。

人慢性髓系细胞性白血病细胞系K562、人组织淋巴瘤细胞系U937和人外周血白血病细胞系Jurkat均购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。

实施例1、L-天冬酰胺酶基因的获得

一、L-天冬酰胺酶基因保守区片断的PCR扩增

（一）根据GenBank中已报道的L-天冬酰胺酶氨基酸序列，利用在线软件BlockMaker（http://blocks.fhcrc.org/blocks/blockmkr/make_blocks.html）搜索保守区，再利用在线引物设计软件CODEHOP（http://blocks.fhcrc.org/codehop.html）设计简并引物AsnDF（正向引物）：5'-TCGTCCTGCACGGACNGAYACNATG-3'，AsnDR（反向引物）：5'-CGTTGCCGGCGCCAAANGTYTC-3'。

（二）以米黑根毛霉CAU432基因组DNA为模板，以AsnDF和AsnDR为引物，使用Ex Taq DNA聚合酶扩增，得到PCR扩增产物。

PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，60℃-55℃（每个循环降低0.5℃）30s，72℃1min，共10个循环；94℃30s，55℃30s，72℃1min，共20个循环；72℃，10min。

PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示在622bp附近有特异条带，将该条带回收，并连接pMD18-T载体，得到重组质粒，将其热激转化E.coli DH5α和菌落PCR鉴定重组子后测序，测序结果经NCBI BLAST搜索比对，表明该基因与其它微生物来源的L-天冬酰胺酶基因有较高同源性。

二、L-天冬酰胺酶基因全长cDNA扩增

（一）根据克隆得到的DNA片段及阅读框分析，分别设计5'RACE和3'RACE引物。引物序列如表1所示。

表1引物序列

引物	引物序列（5'-3'）
		Asn5'GSP	AAGACTACCCCTTGCAAAGGAGGTG
Asn3'GSP	TGCAAGTGCGCTTAGCTTCATG
		Asn5'NGSP	AAGGAGGTGCGAGAAAAGCG
Asn3'NGSP	GCGCTTAGCTTCATGTTGGAGGA

（二）提取米黑根毛霉CAU432的mRNA并纯化，以其为模板，按照SMART RACE cDNAAmplification Kit方法反转录合成5'RACE-Ready cDNA、3'RACE-Ready cDNA。

（三）分别以5'RACE-Ready cDNA、3'RACE-Ready cDNA为模板，对应的GSP、NGSP基因特异性引物，分别进行两轮嵌套PCR反应。

5'RACE：

第一轮的模板为5'RACE-Ready cDNA，引物为Asn5'GSP和UPM（UPM为SMART RACEcDNA Amplification Kit试剂盒自带引物）；

第二轮的模板为第一轮PCR产物（稀释50倍），引物为Asn5'NGSP和NUP（NUP为SMARTRACE cDNA Amplification Kit试剂盒自带引物）；

3'RACE：

第一轮的模板为3'RACE-Ready cDNA，引物为Asn3'GSP和UPM（UPM为SMART RACEcDNA Amplification Kit试剂盒自带引物）；

第二轮的模板为第一轮PCR产物（稀释50倍），引物为Asn3'NGSP和NUP（NUP为SMARTRACE cDNA Amplification Kit试剂盒自带引物）。

通过5'RACE最终获得1000bp的PCR扩增产物，3'RACE最终获得1600bp的PCR扩增产物，经序列拼接后获得2156bp的全长cDNA序列，该序列如SEQ ID No.1所示。

SEQ ID No.1中包含一个2049bp的完整开放阅读框（ORF），编码基因如SEQ ID No.1中自5’末端起第38位至第2086位所示，将其编码的蛋白命名为RmAsnase，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，该蛋白经SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析N端不包括信号肽序列。

实施例2、重组L-天冬酰胺酶的表达

一、构建重组菌株

（一）引物设计

上游引物RmAsnAF：5’-GGGTTTCATATGGATTCGAGAACGACTGCT-3’；

下划线所示的序列为Nde I酶切识别位点；

下游引物RmAsnAR：5’-ATTCCGCTCGAGTTCTTTTCCTAGAAGTTGTGC-3’；

下划线所示的序列为Xho I酶切识别位点。

（二）提取米黑根毛霉CAU432的mRNA并反转录为cDNA，以该cDNA为模板，以RmAsnAF和RmAsnAR为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物,该产物的琼脂糖凝胶电泳图如图1所示。图1中，M为DNA marker，1为PCR扩增产物。

PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环；72℃总延伸10min。

（三）Nde I和Xho I双酶切PCR扩增产物，得到基因片段；Nde I和Xho I双酶切pET-28a（+），得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒,将其命名为pET-Rm。将重组质粒pET-Rm转化E.coli BL21（DE3），在含卡那霉素（50μg/mL）的LB平板上筛选阳性转化子并测序验证。测序结果表明，PCR扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID No.1中自5’末端起第38位至第2086位所示，与预期一致。

二、重组L-天冬酰胺酶的诱导表达

将步骤一验证正确的阳性转化子于500mL含卡那霉素（50μg/mL）的TB培养基中扩大培养。37℃振荡培养至OD600达到0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度1mmol/L，30℃诱导培养过夜，离心收集细胞。重悬后超声破碎，离心收集上清液即为重组L-天冬酰胺酶粗酶液。

三、重组L-天冬酰胺酶的纯化

pET-Rm中含有编码His-Tag标签蛋白的序列，因此选择使用琼脂糖Ni-IDA亲和柱纯化重组L-天冬酰胺酶。

具体步骤为：用平衡缓冲液（含有20mmol/L Tris-HCl、500mmol/L NaCl和20mmol/L咪唑，pH为8.0）平衡Ni-IDA柱5-10个柱体积，将步骤二得到的粗酶液以0.5mL/min流速上样，分别用平衡缓冲液及含50mmol/L咪唑的Tris-HCl缓冲液以1mL/min流速洗涤至洗脱液OD280﹤0.05，最后以含有200mmol/L咪唑的Tris-HCl缓冲液洗涤并收集目的蛋白，得到纯化产物。

含50mmol/L咪唑的Tris-HCl缓冲液：该缓冲液为含有NaCl和咪唑的浓度为20mmol/L pH为8.0的Tris-HCl缓冲液；缓冲液中各成分的浓度如下：500mmol/L NaCl、50mmol/L咪唑；

含200mmol/L咪唑的Tris-HCl缓冲液：该缓冲液为含有NaCl和咪唑的浓度为20mmol/L pH为8.0的Tris-HCl缓冲液；缓冲液中各成分的浓度如下：500mmol/L NaCl和200mmol/L咪唑。

将上述纯化产物用SDS-PAGE法（Laemmli UK.1970.Cleavage of structuralproteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.Nature227:680-685）检测蛋白纯度，结果如图2所示。

图2中，M为低分子量标准蛋白质；1为粗酶液；2为纯化产物。

图2表明，琼脂糖Ni-IDA亲和柱纯化后得到明显的单一条带，分子量大小为72kDa，此蛋白即为RmAsnase。

以pET-28a（+）按照上述方法转化E.coli BL21（DE3），并进行步骤二和步骤三没有目的条带产生。

四、测定步骤三得到的琼脂糖Ni-IDA亲和柱纯化产物（RmAsnase）以及相对应的粗酶液的总蛋白量、L-天冬酰胺酶的总酶活力以及比酶活力；以粗酶液的量为100%，计算RmAsnase的回收率；以粗酶液的纯化倍数为1，计算RmAsnase的纯化倍数，结果如表2所示。

其中总蛋白量的测定参照Lowry等（Lowry OH,Rosebrough NJ,Farr AL,RandallRJ.1951.Protein measurement with the folin phenol reagent.J Biol Chem193:265-275）的方法，以牛血清白蛋白作为标准蛋白。

表2琼脂糖Ni-IDA亲和柱纯化结果分析

实施例3、重组L-天冬酰胺酶（RmAsnase）的性质

一、RmAsnase的最适反应pH及pH稳定性

最适反应pH的测定：将实施例2制备的RmAsnase作为待测酶液，测定其L-天冬酰胺酶的酶活。

差别仅在于分别采用以下几种不同的缓冲液（浓度均为50mmol/L）：柠檬酸缓冲液（pH3.0-6.0），MES（2-(N-吗啉)乙磺酸）缓冲液（pH5.5-6.5），磷酸盐缓冲液（pH6.0-8.0），Tris-HCl（三羟甲基氨基甲烷-盐酸）缓冲液(pH7.5-9.0)，CHES（2-环己胺基乙磺酸）缓冲液（pH8.0-10.0）。将相同量的RmAsnase溶于相同体积不同pH值的5种缓冲液体系中。然后在45℃条件下测定其L-天冬酰胺酶的酶活力，以酶活力最高点作为100%，计算得到各体系下的相对酶活，结果如图3所示。

重组L-天冬酰胺酶pH稳定性的测定：用上述相同体积不同pH值的缓冲液分别稀释相同量的RmAsnase酶液，将稀释好的酶液置于30℃水浴锅中分别处理30min，再将其迅速置于冰水中冷却30min，然后测定残余L-天冬酰胺酶活力，以未经处理的相同量的RmAsnase酶液作为对照，测定其酶活力，作为对照酶活力，最后计算残余L-天冬酰胺酶活力占对照酶活力的百分比，得到相对酶活，结果如图4所示。

图3和图4中，带有“◇”的曲线为RmAsnase在柠檬酸缓冲液中的相对酶活；带有“■”的曲线为RmAsnase在MES缓冲液中的相对酶活；带有“▲”的曲线为RmAsnase在磷酸盐缓冲液中的相对酶活；带有“×”的曲线为RmAsnase在Tris-HCl缓冲液中的相对酶活；带有“○”的曲线为RmAsnase在CHES缓冲液中的相对酶活。

图3表明，重组L-天冬酰胺酶RmAsnase的最适反应pH为7.0。

图4表明，重组L-天冬酰胺酶RmAsnase在pH4.0-9.0的范围内仍保持80%以上的酶活力，在酸性pH范围内具有较高的稳定性。

二、RmAsnase的最适反应温度及温度稳定性

重组L-天冬酰胺酶RmAsnase的最适反应温度的测定：将重组L-天冬酰胺酶RmAsnase适当稀释于50mmol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液中，然后分别在20-80℃范围内不同温度下按照标准方法测定重组L-天冬酰胺酶RmAsnase的酶活力，以酶活力最高点为100%，计算得到各处理条件下的相对酶活，结果如图5所示。

图5表明，RmAsnase的最适反应温度为45℃。

重组L-天冬酰胺酶RmAsnase的温度稳定性测定：将重组L-天冬酰胺酶RmAsnase酶液分别在不同的温度下处理30min，缓冲液为50mmol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液，然后置于冰水浴中冷却30min，最后按标准方法测定残余酶活力，以未经处理的相同量的RmAsnase酶液的酶活力作为对照，最后计算残余酶活力占对照酶活力的百分比，得到相对酶活，结果如表6所示。

图6表明，RmAsnase在45℃下比较稳定，相对酶活力能够保持80%以上，具有较强的低温适应性。

三、RmAsnase的底物特异性

分别用L-天冬酰胺、D-天冬酰胺和L-谷氨酰胺为反应底物测定重组L-天冬酰胺酶RmAsnase的底物特异性。

按照L-天冬酰胺酶活力测定方法，将底物设置成以上三种反应底物之一，得到重组L-天冬酰胺酶RmAsnase在三种条件下的酶活，并以L-天冬酰胺为底物时的酶活力为100%，计算得到其他底物条件下的相对酶活，结果如表3所示。

表3重组L-天冬酰胺酶RmAsnase的底物特异性

底物	比活(U/mg)	相对活力(%)
			L-天冬酰胺	1980	100
D-天冬酰胺	22	1.1
			L-谷氨酰胺	36	1.8

表3表明重组L-天冬酰胺酶RmAsnase具有严格的底物特异性，几乎没有D-天冬酰胺酶活性和L-谷氨酰胺酶活性。

实施例4、利用RmAsnase降低饼干和面包中的丙烯酰胺的含量

一、饼干和面包的制备

（一）饼干的制作方法：将50g低筋面粉、20g蔗糖、1g小苏打和20ml水混匀。将含有不同酶活单位的RmAsnase的水加入到面粉中和面，面团4℃保温30min，擀平至厚度为1cm，模型压制后放置45℃恒温箱保温30min，最后250℃烘烤20min。

（二）面包的制作方法：在500g面粉中（以面粉质量为100%计）加入占面粉质量1.2%的酵母、5%的糖、1.5%食盐混匀，然后加入占面粉质量60%的水和不同酶活单位的RmAsnase，中速和面2min，高速2.5min，加入15g起酥油中速2min，最后高速2.5min，静置4min，分割(80g/个)成型后38℃，80%相对湿度条件下发酵100min，最后焙烤15min（面火160℃，底火210℃）。

同时制作未添加RmAsnase的饼干或面包作为对照。

二、饼干或面包中丙烯酰胺的提取和含量测定

（一）样品中丙烯酰胺的提取：将添加RmAsnase和未添加RmAsnase的饼干或面包于研钵中捣碎后称取1g于50mL试管中，加5ml正己烷，振荡提取1min，然后5000r/min离心10min，移去上层液体正己烷层，再加入5ml正己烷按照上述方法提取，重复2次。吸去残留的正己烷后加入10ml超纯水振荡1min，再加入10mL乙腈、4g硫酸镁和1g氯化钠，振荡1min。10000r/min冷冻离心10min，取乙腈层6mL，35℃旋转蒸发烘干，加1mL超纯水复容，用0.45μm滤膜过滤得提取物，待测。

（二）将步骤（一）得到的提取物进行高效液相色谱-质谱联用分析

色谱条件：色谱柱为AtlantisTM d C18(5μm，150mm×2.1mm)；

流动相由如下A溶液和B溶液组成：

A溶液：体积百分含量0.1%的甲酸的水溶液；

B溶液：100%甲醇；

流动相中A溶液与B溶液的体积比为90∶10，流速为0.2mL/min，柱温30℃，检测波长205nm，提取物的进样量为10μL。

质谱条件：ESI+模式，毛细管电压4kV；锥孔电压35V，源温110℃，脱溶剂温度为450℃；MRM方式定量，丙烯酰胺定性离子（72/55），碰撞能量6eV。

分别以未添加RmAsnase的饼干或面包的丙烯酰胺清除率为100%，计算对应的添加RmAsnase的饼干中的丙烯酰胺清除率或添加RmAsnase的面包中的丙烯酰胺清除率。

饼干中的丙烯酰胺清除率检测结果如图7所示。

面包中的丙烯酰胺清除率检测结果如图8所示。

图7表明，制作饼干时，在面粉中添加RmAsnase能够有效减少饼干中丙烯酰胺的产生，当RmAsnase的添加量为10U/g面粉时，与未添加酶的对照组相比减少了80%以上。

图8表明，制作面包时，添加RmAsnase同样也能有效减少面包中的丙烯酰胺的含量，当RmAsnase的添加量仅为2U/g面粉时，与未添加酶的对照组相比减少了80%以上。

实施例5、利用RmAsnase抑制癌细胞的体外增殖

采用MTT法测定细胞体外增殖抑制率，具体步骤如下：

一、将人慢性髓系细胞性白血病细胞系K562、人组织淋巴瘤细胞系U937和人外周血白血病细胞系Jurkat以一定的密度（约2×10⁵个/mL）分别接种于50ml的培养瓶中，置于37℃、5％湿化的CO2培养箱中培养2-3d。

二、取对数生长期的各肿瘤细胞，用1640完全培养液分别制成浓度为1×10⁵个/mL的单细胞悬液，按照每孔200μL的量加入到96孔培养板中。将培养板置于37℃、5％湿化的CO2培养箱中培养24h。

三、在96孔培养板每个孔中加入等体积的用浓度为10mmol/L,pH7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）稀释的RmAsnase（终浓度为1、2、5、10、40mU/mL,mU为U/1000），每个浓度设3个重复，作为实验组；在孔中加入等体积的PBS，作为对照组，对照组设3个重复。将96孔板继续培养48h。

四、取出96孔板后离心弃掉上清液，每孔加入200μL浓度为0.5mg/mL的MTT，在37℃恒温箱中避光孵育4h。离心弃上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜（DMSO），在微量振荡器上振荡10min使结晶物完全溶解。用酶标仪在492nm处检测培养板上各孔吸光值（OD），OD值与活细胞数量呈正比。根据公式计算肿瘤细胞生长抑制率。

计算公式如下：

肿瘤细胞增殖抑制率（％）＝（1－实验组OD_492nm/对照组OD_492nm）×100％

各肿瘤细胞系U937、K562和Jurkat分别经1、2、5、10、40mU/mL的RmAsnase处理48h，MTT法检测肿瘤细胞增殖抑制率后，以RmAsnase的终浓度为横坐标，增殖抑制率为纵坐标，作RmAsnase对U937、K562和Jurkat细胞的量效曲线，结果如图9所示。

图9中，带有“◆”的曲线为K562细胞系的增殖抑制率曲线，带有“■”的曲线为U937细胞系的增殖抑制率曲线，带有“▲”的曲线为Jurkat细胞系的增殖抑制率曲线。

图9表明，RmAsnase对细胞系Jurkat的体外增殖影响最为明显，在给药终浓度为40mU/mL时，抑制率为60%左右。

Claims (10)

1.一种蛋白，为如下（1）或（2）所示：

（1）SEQ ID No.2所示的蛋白；

（2）将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因为如下中至少一种：

1）SEQ ID No.1中自5’末端起第38位至第2086位核苷酸所示的DNA分子；

2）SEQ ID No.1所示的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；

4）与1）或2）或3）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.一种制备L-天冬酰胺酶的方法，该方法是将权利要求4所述的重组菌进行诱导表达得到。

6.权利要求1所述的蛋白在制备清除食品中致癌物的产品中的应用或在降低食品中致癌物含量中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述致癌物为丙烯酰胺。

8.权利要求1所述的蛋白在制备预防和/或治疗白血病和/或淋巴瘤的产品中的应用。

9.权利要求1所述的蛋白在制备抑制白血病细胞和/或淋巴瘤细胞的增殖的产品中的应用。

10.权利要求1所述的蛋白在制备具有L-天冬酰胺酶作用的产品中的应用。

Images