CN114350639A

CN114350639A - 一种密码子优化的透明质酸水解酶基因及其表达

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Publication number: CN114350639A
Application number: CN202110245290.6A
Authority: CN
Inventors: 张天萌; 王浩; 徐荣荣; 张由恒; 杨贵红; 郝井坤; 王芬; 郭学平
Original assignee: Bloomage Biotech Co Ltd
Current assignee: Bloomage Biotech Co Ltd
Priority date: 2021-03-05
Filing date: 2021-03-05
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2041-03-05
Also published as: CN114350639B; WO2022183541A1

Abstract

本发明提供一种密码子优化的透明质酸水解酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明按照毕赤酵母密码子偏好性优化了山大齿猛蚁透明质酸酶基因，构建的重组毕赤酵母工程菌株表现出较高的透明质酸水解活力，为工业化生产和医疗应用山大齿猛蚁毒液透明质酸水解酶奠定了坚实的基础。

Description

一种密码子优化的透明质酸水解酶基因及其表达

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地，涉及一种密码子优化的透明质酸水解酶基因及其表达。

背景技术

透明质酸酶(Hyaluronidase,HAase)是广泛分布于自然界中的一类糖苷酶，能够作用于透明质酸糖链的β-1，3或β-1，4糖苷键来降解透明质酸。此外还在一定程度上能够降解硫酸软骨素和硫酸皮肤素。HAase首次发现于1929年，Duran Reynals等在哺乳动物睾丸及其他组织提取物中发现了一种可促进疫苗、染料、毒素等扩散的“扩散因子”，并于1940年被Chain等正式命名为透明质酸酶。

根据HAase的来源、催化机制和底物特异性差异，将其划分为三类。第一类为微生物来源的透明质酸裂解酶，这类HAase(EC 4.2.2.1)通过β消旋反应裂解透明质酸的β-1，4糖苷键，主要产物为不饱和的双糖分子2-acetamido-2-deoxy-3-O-(β-D-gluco-4-enepyranosyluronicacid)-D-glucose。这类透明质酸裂解酶主要来源于Clostridium,Micrococcus,Streptococcus,Bacillus及Streptomyces等菌属。第二类代表性的HAase(EC3.2.1.36)主要来源于水蛭唾液腺和十二指肠虫，属于内切-β-葡萄糖醛酸苷酶，能够水解透明质酸的β-1，3糖苷键，终产物以饱和的透明质酸四糖为主，含有少量的透明质酸六糖。这类HAase对底物的专一性强，对硫酸软骨素和硫酸皮肤素结构基本不具有水解和转糖苷活性。第三类透明质酸酶为内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.35)，主要来源于哺乳动物的睾丸及动物的毒液，能够水解透明质酸的β-1，4糖苷键，终产物主要为透明质酸四糖。这类酶的底物谱较宽，对硫酸软骨素和硫酸皮肤素结构也有一定的催化活性，且具有转糖苷活性。

透明质酸水解酶可以作为一种药理活性物质在临床上具有比较广泛的应用。例如在眼科手术中与局麻药合用，加快麻醉药的起效速度；促使眼局部积贮的药液、渗出液或血液的扩散，改善眼玻璃体浑浊、预防结膜化学烧伤后眼球粘连，并消除有关的炎症反应；透明质酸填充是整形美容的一个重要手段，但会发生透明质酸并发症的可能性，透明质酸水解酶作为可以用来水解透明质酸的最有效物质，可以有效治疗以上不良反应；透明质酸水解酶联合抗肿瘤药物辅助皮下给药，代替静脉穿刺，提高患者医疗体验，是目前市场应用热点，潜力巨大。另外，透明质酸水解酶作为工具酶能够高效制备低分子量透明质酸及透明质酸寡糖，产物更容易被机体吸收利用，在食品和化妆品领域也具有巨大的市场前景。

相比于水蛭透明质酸水解酶，来源于哺乳动物睾丸和动物毒液的透明质酸水解酶由于其生物安全性更高而更具医疗价值，但由于动物组织提取步骤繁琐，生产成本高，极大的限制了透明质酸水解酶在医疗上的应用。Halozyme公司生产的重组人睾丸来源的透明质酸水解酶PH20产品Hylenex于2005年获得FDA批准上市。其重组表达的细胞为CHO细胞，下游蛋白纯化工艺仍然复杂，收率低，导致市场价格居高不下。尽管也有利用毕赤酵母表达系统重组表达人睾丸及蝎子毒液来源透明质酸水解酶的报道，但都处于较低的表达水平。

2017年，Kohei Kazuma等首次基于转录组和多肽组学技术对山大齿猛蚁毒液组分进行了完全分析，鉴定了一段与意大利蜜蜂透明质酸水解酶同源性为52.8％的序列。目前，尚无对山大齿猛蚁来源透明质酸水解酶重组表达的相关报道。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种密码子优化的透明质酸水解酶基因。

具体来说，本发明涉及如下方面：

1、一种密码子优化的透明质酸水解酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2、根据项1所述的透明质酸水解酶基因编码的蛋白质，其序列如SEQ ID NO.2所示。

3、一种重组表达载体，其包含项1所述的核苷酸序列。

4、根据项3所述的重组表达载体，其中质粒骨架为毕赤酵母载体pPIC系列或pGAP系列或pAO815，优选pPIC9K。

5、一种毕赤酵母，其包含项3或4所述的表达载体。

6、一种生产透明质酸水解酶的方法，其包括如下步骤：

利用含有项1所述的透明质酸水解酶基因的重组毕赤酵母菌株或项5所述的毕赤酵母来生产透明质酸水解酶。

7、根据项6所述的方法，其中所述毕赤酵母为GS115、KM71或SMD1168。

8、根据项6所述的方法，其中所述方法包括使用BMMY培养基，甲醇诱导来发酵生产透明质酸水解酶。

9、根据项8所述的方法，其中所述发酵条件为：发酵温度为25℃-30℃，发酵过程中每隔24h补加0.5％-1％(v/v)甲醇，诱导表达96h。

10、项2所述的蛋白质在制备含有透明质酸的辅药、食品及化妆品中的应用。

本发明按照毕赤酵母密码子偏好性优化了山大齿猛蚁透明质酸水解酶基因，构建的重组毕赤酵母工程菌株表现出较高的透明质酸水解活力，为工业化生产和医疗应用山大齿猛蚁毒液透明质酸水解酶奠定了坚实的基础。

附图说明

图1为本发明优化的山大齿猛蚁透明质酸水解酶基因与野生型基因的核苷酸序列比对图。

图2为重组透明质酸水解酶发酵上清液SDS-PAGE蛋白电泳(A)及Western Blot结果(B)。其中，泳道M代表分子量为180kDa的标准蛋白；泳道1代表对照菌P.pastoris GS115/pPIC9K发酵上清液；泳道2代表重组菌P.pastoris GS115/pPIC9K-HYAL_OM^opt发酵上清液。

图3为透明质酸平板检测重组透明质酸水解酶活性结果图。其中，GS115代表不含任何重组基因的阴性对照菌发酵上清液；HYAL_OM^opt代表含有山大齿猛蚁源基因HYAL_OM^opt的重组菌发酵上清液；rTsHyal-1^opt代表含有巴西钳蝎毒液源基因rTsHyal-1^opt的重组菌发酵上清液；Hya-1^opt代表含有意大利蜜蜂毒液源基因Hya-1^opt的重组发酵上清液；HYA1^opt代表含有粗毒鲉毒液源基因HYA1^opt的重组发酵上清液；HYAL_LOXIN^opt代表含有棕色蜘蛛毒液源基因HYAL_LOXIN^opt的重组发酵上清液；GAAZ^opt代表含有响尾蛇毒液源基因的重组发酵上清液；HYAL2^opt代表含有蜥蜴毒液源基因HYAL2^opt的重组发酵上清液。

图4为DNS法测定的重组菌P.pastoris GS115/pPIC9K-HYAL_OM^opt发酵上清粗酶液的酶活。

图5Morgan–Elson反应鉴定寡糖还原端。其中空白对照为未经透明质酸酶水解的高分子量HA；水蛭Hase为经水蛭透明质酸水解的寡糖产物；HYAL_OM为经山大齿猛蚁源透明质酸酶水解的寡糖产物。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。

除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。

如本文所使用的，术语“基因”或“编码序列”是指编码基因产物的体外或体内的核苷酸序列。在一些情况下，基因由或基本上由编码序列组成，即，编码基因产物的序列。在其它情况中，基因包括附加的非编码序列。例如，基因可以或可以不包括编码区之前和之后的区域，例如5’非翻译(5’UTR)或“前导”序列和3’UTR或“非转录尾区(trailer)”序列，以及各个编码区段(外显子)之间的插入序列(内含子)。

如本文所使用的，术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白，且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链。

如本文所使用的，术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。

如本文所使用的，术语“载体”用于描述可以被工程化以含有可以在宿主细胞中扩增的克隆的一种多核苷酸或多种多核苷酸的核酸分子。载体包括但不限于：单链，双链或部分双链的核酸分子；包含一个或多个游离末端，没有游离末端(例如环状)的核酸分子；包含DNA，RNA或两者的核酸分子；以及本领域已知的其他多核苷酸种类。一种类型的载体是“质粒”，其是指可以插入额外DNA片段的环状双链DNA环，例如通过标准分子克隆技术。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们可操作地连接的那些基因的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。重组表达载体可以包含适于在宿主细胞中表达核酸的形式的本发明的核酸，这意味着重组表达载体包括一种或多种调节元件，其可以基于用于表达的、可以与待表达的核酸序列可操作地连接的宿主细胞来选择。

如本文所使用的，密码子优化是指在维持天然氨基酸序列的同时，通过用目的宿主细胞的基因中更频繁或最频繁使用的密码子替换天然序列的至少一个密码子来修饰核酸序列以在该宿主细胞中增强表达的过程。多种物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特定的偏倚。密码子偏倚(生物体之间密码子选用的差异)通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而信使RNA(mRNA)的翻译效率继而被认为尤其取决于所翻译密码子的特性和特定转移RNA(tRNA)分子的可用性。所选择tRNA在细胞中的优势通常反映了肽合成中最频繁使用的密码子。因此，可基于密码子优化来定制基因以在给定生物体中进行最佳基因表达。

密码子优化可以例如通过将一种物种的核苷酸序列转化为不同物种的遗传序列来实现。优化的密码子有助于实现更快的翻译速度和更高的准确性。由于这些因素，预计在高表达基因中翻译选择会更强。然而，尽管本文考虑了使用优化的密码子来表达公开的蛋白质，但是本文考虑了用于编码任何公开的蛋白质的核酸的所有可能的密码子。本发明提供一种密码子优化的透明质酸水解酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。其中，SEQID NO.1为：

具体地，针对山大齿猛蚁透明质酸水解酶全长基因序列，根据毕赤酵母密码子偏好性对其进行了密码子优化。根据特定宿主密码子偏好性进行密码子优化主要能提高表达量，如果不进行优化很可能在毕赤酵母中不表达或表达量非常低。

其中，山大齿猛蚁透明质酸水解酶属于第三类透明质酸酶，为内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，能够水解透明质酸的β-1，4糖苷键，产生终产物的还原端为N-乙酰氨基葡萄糖。另外，这类酶相比于第二类的水蛭透明质酸水解酶底物谱酶较宽，对软骨素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素结构也有一定的催化活性。山大齿猛蚁透明质酸水解酶能够丰富透明质酸水解产物的种类，还可以具有除透明质酸酶催化以外的更广泛的应用范围。

毕赤酵母，是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。与其它酵母一样，在无性生长期主要以单倍体形式存在，当环境营养限制时，常诱导2个生理类型不同的接合型单倍体细胞交配，融合成双倍体。毕赤酵母的另一个生物学特点是，甲醇代谢所需的醇氧化酶被分选到过氧化物酶体中，形成区域化。以葡萄糖作碳源时，菌体中只有1个或很少几个小的过氧化物酶体，而以甲醇作碳源时，过氧化物酶体几乎占到整个细胞体积的80％，AOX增至细胞总蛋白的35％-40％。因此，当在AOX基因前利用同源重组方式插入外源蛋白基因时，可获得大量表达。同时，根据甲醇酵母这种可以形成过氧化物酶体的特性，既可利用该系统表达一些毒性蛋白和易被降解的酶类，也可用以研究细胞特异区域化的生物发生及其机制和功能，为高等动物类似的研究提供启示。

如图1所示，优化后的山大齿猛蚁透明质酸水解酶基因与野生型基因序列同源性为73.2％。

本发明还提供本发明的透明质酸水解酶基因编码的蛋白质，其序列如SEQ IDNO.2所示，这与野生型山大齿猛蚁透明质酸水解酶基因编码的氨基酸序列一致。其中，SEQID NO.2为：

Met Ile Pro Pro Ala Arg Asp Ser Leu Met Phe Val Phe Ala Thr Ala

Val Ile Ala Ser Phe Phe Gly Ser Ala Lys Thr Leu Arg Gly Ser Ser

Pro Gln Gln Phe Asp Val Tyr Trp Asn Val Pro Thr Phe Met Cys His

Lys His Gly Met Lys Phe Glu Glu Leu Lys Asp Phe Gly Ile His Gln

Asn Ala Met Asp Met Phe Arg Gly Glu Glu Ile Ala Ile Leu Tyr Asp

Pro Gly Met Phe Pro Ala Leu Leu Val Asp Lys Asp Gly Tyr Val Thr

Lys Arg Asn Gly Gly Val Pro Gln Glu Gly Asn Leu Lys Glu His Leu

Glu Thr Phe Arg Lys His Leu Thr Thr Gln Ile Pro Asp Glu Ser Phe

Ser Gly Ile Gly Ile Ile Asp Phe Glu Ser Trp Arg Pro Ile Phe Arg

Gln Asn Trp Ala Ser Leu Glu Pro Tyr Lys Thr Leu Ser Ile Lys Leu

Glu Arg Glu Lys His Pro Phe Trp Ser Glu Ala Ala Val Lys Lys Glu

Ala Lys Arg Arg Phe Glu Lys Ser Gly Arg Ile Phe Met Glu Glu Thr

Leu Lys Met Ala Lys Lys Leu Arg Pro Lys Ala Lys Trp Gly Tyr Tyr

Gly Tyr Pro His Cys Phe Asn Gln Thr Pro Gly Gln Gln Ser Val His

Cys Asn Arg Gln Thr Met Met Glu Asn Asp Gly Met Ser Trp Leu Phe

Thr Leu Glu Asp Val His Ala Pro Ser Val Tyr Leu Arg Leu Glu Ile

Lys Glu Asp Asp Arg Pro Ser Phe Val Lys Gly Arg Val Ser Glu Ala

Leu Arg Leu Ala Ala Lys Ser Ser Ser Lys Gln Arg Ile Leu Pro Tyr

Tyr Trp Phe Ile Tyr Gln Asp Lys Lys Asp Glu Phe Leu Thr Glu Lys

Asp Thr Gln Asn Thr Ile Asn Met Ile Ala Asn Leu Gly Ser Asn Gly

Phe Ile Ile Trp Gly Ser Ser Asp Asp Val Asn Thr Glu Arg Lys Cys

Lys Asp Leu Gln Gln Tyr Val Lys Glu Val Leu Gly Pro Ala Ile Lys

Lys Phe Thr Leu His

本发明还提供一种重组表达载体，其包含本发明的核苷酸序列。进一步地，所述重组表达载体的骨架为毕赤酵母载体pPIC系列或pGAP系列或pAO815，优选载体pPIC9K。其中，毕赤酵母载体pPIC系列包括pPIC9K、pPIC3.5K、pPICZαA,B,C、pPIC9K-His、pPICZA,B,C等，以醇氧化酶基因启动子P_AOX1为启动子。毕赤酵母载体pGAP系列包括pGAPZαA,B,C、pGAPZA,B,C等，以3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子P_GAP为启动子。载体pPIC9K是毕赤酵母蛋白表达载体，pPIC9K载体中存在卡那抗性基因，允许利用卡那抗性在酵母体内筛选多克隆拷贝，载体其余部分与pPIC9载体完全一样。pPIC9K载体能够使用的毕赤酵母宿主菌包括KM71、GS115或SMD1168。

本发明还提供一种毕赤酵母，其包含上述的表达载体，即包含SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的表达载体。

本发明还提供一种表达本发明所述的透明质酸水解酶基因的方法，其包括如下步骤：

利用含有本发明的透明质酸水解酶基因的重组毕赤酵母菌株或本发明提供的毕赤酵母来生产透明质酸水解酶。

在一个具体的实施方式中，所述方法包括使用BMMY培养基，甲醇诱导来发酵生产透明质酸水解酶。

在一个优选的实施方式中，所述发酵条件为：发酵温度为25℃-30℃，发酵过程中每隔24h补加0.5％-1％(v/v)甲醇，诱导表达96h。

在一个更优选的实施方式中，以含有本发明的透明质酸水解酶基因的重组毕赤酵母P.pastoris/pPIC9K-HYAL_OM^opt为生产菌株，发酵生产透明质酸水解酶。具体的发酵条件为：将种子培养液按10％的接种量接种到40mL BMGY培养基中，温度为30℃、pH 6.0培养24h，离心、洗涤菌体并接种到诱导培养基BMMY中，每隔24h补加1％(v/v)甲醇，诱导表达96h。

发酵生产得到的透明质酸水解酶的酶活表征采用透明圈检测法，发酵液上清酶活采用3，5-二硝基水杨酸法(DNS)测定。

其中，透明质酸水解酶活力单位定义(U)为：在pH 5.5和38℃条件下，每小时从透明质酸糖链中释放出1μg葡萄糖还原当量的还原糖所需的酶量。

平板透明圈法表征透明质酸水解酶活性：在酸性pH条件下，牛血清蛋白BSA结合大分子透明质酸形成乳白色络合物，而与被水解的低分子量透明质酸则不会形成白色络合物，从而形成可视化的透明圈。利用这一原理可以快速简便的表征透明质酸水解酶活性。

DNS还原糖测定法：山大齿猛蚁透明质酸水解酶水解透明质酸的β-1,4糖苷键，产生带有还原端羟基的还原糖产物。通过DNS还原糖法测定水解透明质酸产生的相对于葡萄糖还原当量的还原糖产物的量，来计算透明质酸水解酶的催化活力。

本发明还提供如SEQ ID NO.2所示的蛋白质在制备含有透明质酸的辅药、食品及化妆品中的应用。

实施例

实施例1

(1)含透明质酸水解酶基因(HYAL_OM^opt)表达系统的构建

基于NCBI数据库公开的山大齿猛蚁透明质酸水解酶全长基因序列(Genbank:FX985505.1)，根据毕赤酵母密码子偏好性对其进行了密码子优化。如图1所示，优化后的基因序列如SEQ ID NO.1所示，与野生型基因序列同源性为73.2％。优化后的基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，与野生型基因编码的氨基酸序列一致。密码子优化的山大齿猛蚁透明质酸水解酶序列委托南京金斯瑞生物科技有限公司全基因合成，并克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K的EcoRI和NotI酶切位点之间，得到重组表达载体pPIC9K-HYAL_OM^opt。经DNA测序比对，重组序列正确。重组表达质粒pPIC9K-HYAL_OM^opt经SalI快切酶线性化后电转入P.pastoris GS115表达宿主细胞中，重组转化子经遗传霉素G418筛选获得高拷贝重组毕赤酵母P.pastoris GS115/pPIC9K-HYAL_OM^opt。

(2)重组毕赤酵母异源表达透明质酸水解酶

获得的重组工程菌P.pastoris GS115/pPIC9K-HYAL_OM^opt进行摇瓶发酵培养。挑取单克隆接种于40mL的YPD培养基(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L)，30℃、200rpm培养24h。按10％的接种量转接于40mL的初始表达培养基BMGY(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，K₂HPO₄ 3g/L，KH₂PO₄ 11.8g/L，YNB 3.4g/L，硫酸铵10g/L，生物素4×10^-4g/L，甘油10mL/L)中，30℃200rpm培养24h。离心收集菌体，用生理盐水洗涤菌体后更换至40mL诱导表达培养基BMMY(酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，K₂HPO₄ 3g/L，KH₂PO₄ 11.8g/L，YNB3.4g/L，硫酸铵10g/L，生物素4×10^-4g/L，甲醇10mL/L)，30℃200rpm培养，每隔24h向培养基中添加纯甲醇至终浓度为1.0％(v/v)进行诱导表达，诱导表达96h。

重组工程菌发酵上清液与对照菌发酵上清液进行SDS-PAGE蛋白电泳分析，电泳分析结果如图2A所示。在理论蛋白分子量39kDa附近，重组工程菌P.pastoris GS115/pPIC9K-HYAL_OM^opt(泳道2)多出一条淡淡的蛋白条带(箭头位置所示)，进一步通过Western Blot检测，检测结果如图2B所示，确定了该位置为重组工程菌表达的透明质酸水解酶。

(3)平板透明圈法表征重组透明质酸水解酶活性

配制pH 5.5的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液，加入1g/L透明质酸和2％的琼脂粉，121℃灭菌20min，待冷却到60℃下在无菌超净台中加入终浓度为10g/L过滤除菌的牛血清蛋白BSA。在透明质酸平板上用无菌移液枪头戳孔，在孔径内部滴入50μL发酵上清液，平板置于室温2d。在平板上覆盖适量的2mol/L的冰醋酸，约10min后，如图3所示，在加重组酶孔的周围出现一个明显的透明圈，表明构建的重组工程酵母表达的透明质酸水解酶具有透明质酸水解活力。

(4)重组菌株摇瓶发酵上清液酶活检测

采用DNS法测定水解透明质酸产生的还原糖当量，用分析纯葡萄糖做标准曲线，计算出透明质酸水解酶活力。反应体系为1mL：将200μL发酵上清液(空白用等体积煮沸灭活后的发酵上清液)加入到800μL 2mg/mL透明质酸底物溶液中，置于38℃孵育15min，反应结束后立即置于沸水浴中2min，使酶失活以终止反应。将处理后的1mL反应液加入到2mL DNS(四水合酒石酸钾钠248g/L，3,5-二硝基水杨酸6.3g/L，2M NaOH 250mL/L，苯酚5.136g/L，亚硫酸钠5g/L)溶液中，震荡混匀，与葡萄糖标曲样品一起沸水浴10min；冰水浴降至室温后加入7mL去离子水，振荡混匀，540nm下测定吸光度，换算为反应产生的还原糖量，根据葡萄糖标准曲线计算出重组工程菌发酵上清液的粗酶活。酶活结果如图4所示，本发明中的重组菌株P.pastoris GS115/pPIC9K-HYAL_OM^opt的发酵上清液酶活为3547.88U/mL(此结果为三个平行实验的平均值，方差为684.93)。

(5)重组透明质酸水解酶水解产物还原端单糖类型分析

Morgan–Elson反应用于鉴定本发明山大齿猛蚁透明质酸水解酶水解透明质酸产物的还原端是否为N-乙酰氨基葡萄糖，同时将水蛭透明质酸酶水解产物作为阴性对照，没有透明质酸酶产物的样品作为空白对照。具体操作步骤如下：分别将山大齿猛蚁透明质酸水解酶和水蛭透明质酸酶水解产物400μL加入到110μL的碱性硼酸盐溶液(1.73g H₃BO₃和0.78g KOH充分溶解在10mL去离子水中，在使用前加入1/10体积0.8g/mL的K₂CO₃溶液)中，充分混匀后，沸水浴加热4min；随后加入1.5mL的对二甲基氨基苯甲醛溶液(2g的对二甲基氨基苯甲醛溶解在2.5mL的浓盐酸和7.5mL的冰乙酸中，使用前用冰乙酸稀释4倍)，充分混匀后置于37℃水浴孵育20min。测定结果如图5所示，其中山大齿猛蚁透明质酸水解酶的水解产物在一定条件下与对二甲基氨基苯甲醛反应形成了红色缩合物，而水蛭透明质酸酶水解产物不发生颜色的变化这证实了本发明山大齿猛蚁透明质酸水解酶能够水解透明质酸的β-1，4糖苷键，产物的还原端为N-乙酰氨基葡萄糖，属于第三类透明质酸酶。

在进行上述山大齿猛蚁来源的透明质酸水解酶基因HYAL_OM(GenBank:FX985505.1)的表达的同时，本发明的发明人还通过NCBI数据库筛选确定了其他六种不同动物毒液来源的透明质酸水解酶基因，它们分别为巴西钳蝎毒液来源的透明质酸水解酶基因rTsHyal-1(Genebank：KF623285.1)、意大利蜜蜂毒液来源的透明质酸水解酶基因Hya-1(GenBank:L10710.1)、粗毒鲉毒液来源的透明质酸水解酶基因HYA1(GenBank:AY232496.1)、棕色蜘蛛毒液来源的透明质酸水解酶基因HYAL_LOXIN(UniProtKB/Swiss-Prot:R4J7Z9.1)、响尾蛇毒液来源的透明质酸水解酶基因(GenBank:GAAZ01003049.1)、蜥蜴毒液来源的透明质酸水解酶基因HYAL2(NCBI Reference Sequence:XP_028574505.1)，上述六种基因序列根据毕赤酵母密码子偏好性进行密码子优化后委托南京金斯瑞生物科技有限公司全基因合成，并克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K上，克隆方法详见实施例(1)，构建成功的六种重组质粒经SalI快切酶线性化后电转入P.pastoris GS115表达宿主细胞中，重组转化子分别经遗传霉素G418筛选获得高拷贝重组毕赤酵母。

六株重组毕赤酵母按照实施例(2)的方法进行摇瓶发酵，发酵上清液经实施例(3)的平板透明圈法表征酶活，结果如图3所示，根据有无透明圈得出结论，只有含山大齿猛蚁来源的透明质酸水解酶基因HYAL_OM^opt的重组菌发酵上清液有水解活性，其余六种来源的透明质酸水解酶基因的重组菌发酵上清液没有水解活性。

序列表

<110> 华熙生物科技股份有限公司

<120> 一种密码子优化的透明质酸水解酶基因及其表达

<130> TPE01352

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1074

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial

<400> 1

atgatcccac ccgcacgtga ctcgcttatg tttgtctttg cgactgcggt aatcgctagt 60

tttttcggta gcgcaaagac actacgcggc tcttccccac agcaattcga cgtatactgg 120

aatgtgccaa ctttcatgtg tcacaagcac ggtatgaaat ttgaagagct gaaagatttc 180

ggtatacacc agaacgcaat ggatatgttt cgcggcgaag aaattgcgat tctttatgac 240

cctggcatgt ttcccgccct tctagtagat aaagatggat acgtcactaa acggaacggt 300

ggggtgccgc aagaggggaa cctcaaggaa catttagaaa cctttagaaa gcatctgacg 360

acacaaattc cggacgagag ctttagcggg ataggaatca tagactttga gagttggaga 420

ccgattttca ggcagaactg ggcgtcactc gagccctata aaactttgtc cataaagttg 480

gagagggaaa aacacccatt ttggtcggag gcagctgtga agaaggaggc caaacgtcga 540

ttcgagaaat ccgggcgaat atttatggag gaaaccctca aaatggccaa aaaactaaga 600

ccgaaagcaa agtggggcta ttatgggtat ccccactgtt tcaatcaaac ccctggacag 660

cagtcggttc actgcaatcg gcaaacgatg atggaaaatg acggtatgag ttggctgttt 720

acactcgaag acgttcatgc tcccagcgtt tacctacgat tggaaatcaa ggaggatgac 780

cggccttcat tcgtgaaagg ccgggtttcc gaggccttaa ggttagccgc taaatcgtct 840

tcaaaacaac gtatcctacc ttactactgg ttcatttatc aggataagaa ggatgagttc 900

ttaacggaaa aggatacaca aaacactata aatatgatcg ctaatctggg atctaatggt 960

ttcataattt ggggatctag tgacgatgtc aacacggaac gcaaatgcaa ggatttacag 1020

caatacgtaa aggaagtctt gggcccagcg attaagaagt tcacccttca ttga 1074

<210> 2

<211> 357

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial

<400> 2

Met Ile Pro Pro Ala Arg Asp Ser Leu Met Phe Val Phe Ala Thr Ala

1 5 10 15

Val Ile Ala Ser Phe Phe Gly Ser Ala Lys Thr Leu Arg Gly Ser Ser

20 25 30

Pro Gln Gln Phe Asp Val Tyr Trp Asn Val Pro Thr Phe Met Cys His

35 40 45

Lys His Gly Met Lys Phe Glu Glu Leu Lys Asp Phe Gly Ile His Gln

50 55 60

Asn Ala Met Asp Met Phe Arg Gly Glu Glu Ile Ala Ile Leu Tyr Asp

65 70 75 80

Pro Gly Met Phe Pro Ala Leu Leu Val Asp Lys Asp Gly Tyr Val Thr

85 90 95

Lys Arg Asn Gly Gly Val Pro Gln Glu Gly Asn Leu Lys Glu His Leu

100 105 110

Glu Thr Phe Arg Lys His Leu Thr Thr Gln Ile Pro Asp Glu Ser Phe

115 120 125

Ser Gly Ile Gly Ile Ile Asp Phe Glu Ser Trp Arg Pro Ile Phe Arg

130 135 140

Gln Asn Trp Ala Ser Leu Glu Pro Tyr Lys Thr Leu Ser Ile Lys Leu

145 150 155 160

Glu Arg Glu Lys His Pro Phe Trp Ser Glu Ala Ala Val Lys Lys Glu

165 170 175

Ala Lys Arg Arg Phe Glu Lys Ser Gly Arg Ile Phe Met Glu Glu Thr

180 185 190

Leu Lys Met Ala Lys Lys Leu Arg Pro Lys Ala Lys Trp Gly Tyr Tyr

195 200 205

Gly Tyr Pro His Cys Phe Asn Gln Thr Pro Gly Gln Gln Ser Val His

210 215 220

Cys Asn Arg Gln Thr Met Met Glu Asn Asp Gly Met Ser Trp Leu Phe

225 230 235 240

Thr Leu Glu Asp Val His Ala Pro Ser Val Tyr Leu Arg Leu Glu Ile

245 250 255

Lys Glu Asp Asp Arg Pro Ser Phe Val Lys Gly Arg Val Ser Glu Ala

260 265 270

Leu Arg Leu Ala Ala Lys Ser Ser Ser Lys Gln Arg Ile Leu Pro Tyr

275 280 285

Tyr Trp Phe Ile Tyr Gln Asp Lys Lys Asp Glu Phe Leu Thr Glu Lys

290 295 300

Asp Thr Gln Asn Thr Ile Asn Met Ile Ala Asn Leu Gly Ser Asn Gly

305 310 315 320

Phe Ile Ile Trp Gly Ser Ser Asp Asp Val Asn Thr Glu Arg Lys Cys

325 330 335

Lys Asp Leu Gln Gln Tyr Val Lys Glu Val Leu Gly Pro Ala Ile Lys

340 345 350

Lys Phe Thr Leu His

355

Claims

1.一种密码子优化的透明质酸水解酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的透明质酸水解酶基因编码的蛋白质，其序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组表达载体，其包含权利要求1所述的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其中质粒骨架为毕赤酵母载体pPIC系列或pGAP系列或pAO815，优选pPIC9K。

5.一种毕赤酵母，其包含权利要求3或4所述的表达载体。

6.一种生产透明质酸水解酶的方法，其包括如下步骤：

利用含有权利要求1所述的透明质酸水解酶基因的重组毕赤酵母菌株或权利要求5所述的毕赤酵母来生产透明质酸水解酶。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述毕赤酵母为GS115、KM71或SMD1168。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述方法包括使用BMMY培养基，甲醇诱导来发酵生产透明质酸水解酶。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述发酵条件为：发酵温度为25℃-30℃，发酵过程中每隔24h补加0.5％-1％(v/v)甲醇，诱导表达96h。

10.权利要求2所述的蛋白质在制备含有透明质酸的辅药、食品及化妆品中的应用。