CN111254153A

CN111254153A - 一种聚半乳糖醛酸酶编码基因及酶和制备与应用

Info

Publication number: CN111254153A
Application number: CN201811458954.1A
Authority: CN
Inventors: 尹恒; 杨国军
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2018-11-30
Filing date: 2018-11-30
Publication date: 2020-06-09

Abstract

本发明公开了一种来源于黑曲霉菌(Aspergillus parasiticus)的聚半乳糖醛酸酶基因及其酶的制备方法与应用，即利用基因工程的技术方法，将该聚半乳糖醛酸酶的基因克隆到毕赤酵母表达载体上，获得可异源高表达该酶的毕赤酵母重组菌株，该菌株能够直接高效降解富含果胶的水果皮，从而获得果胶寡糖；该菌株异源表达制备的聚半乳糖醛酸酶，能高效降解果胶多糖，能高效降解不同来源和酯化度的商业化果胶和聚半乳糖醛酸。本发明提供的聚半乳糖醛酸酶可广泛应用于农业、食品、饲料添加剂、医药及寡聚半乳糖醛酸和不同聚合度半乳糖醛酸标准品制备等领域。

Description

一种聚半乳糖醛酸酶编码基因及酶和制备与应用

技术领域

本发明涉及一种聚半乳糖醛酸酶的基因序列及其制备方法和应用。本发明提供了该聚半乳糖醛酸酶的重组质粒和重组基因工程菌株及其在多糖降解方面的应用。本发明提供的聚半乳糖醛酸酶可广泛应用于农业、食品、饲料添加、医药及果胶寡糖和不同聚合度半乳糖醛酸标准品制备等领域。

背景技术

果胶(Pectin)是植物细胞壁中结构和功能最为复杂的多糖，广泛存在于自然界中；果胶以果胶，果胶酸，原果胶三种形态分布在植物的软组织细胞壁，细胞间层，细胞与次生壁连接区等；果胶多糖是一种高分子化合物，平均分子量介于20000～400000之间。果胶多糖的结构十分复杂，主要包括同聚半乳糖醛酸(Homogalacturonan，HG)，约占果胶的65％；鼠李糖半乳糖醛酸聚糖I(Rhamnogalacturonan-I，RG-I)，约占果胶的20％～35％；鼠李糖半乳糖醛酸聚糖II(Rhamnogalacturonan-II，RG-II)三部分，约占果胶的10％。果胶的主要结构是半乳糖醛酸在α-1,4糖苷键的作用下线性聚合而成，是果胶的HG部分，也就是聚半乳糖醛酸(PGA)。根据果胶酯化度的大小将果胶分为低甲氧基果胶(LM)与高甲氧基果胶(HM)；低酯果胶根据是否酰胺化又可分为普通低酯果胶和酰胺化低酯果胶，根据果胶的凝结速率将高酯果胶分为快凝果胶，中凝果胶，慢凝果胶，三者之间的区别在于其酯化程度，分别为高于70％，介于65％～70％之间，低于65％。

果胶寡糖又称寡聚半乳糖醛酸，是由果胶多糖降解而成的一种酸性寡糖。寡聚半乳糖醛酸不仅具有普通寡糖的生物功效，如抑制病原菌、增强机体的免疫功能，改善脂类代谢，改善动物肠道与胃中的微生物区系，降低血清中胆固醇含量，改善动物生产性能，防止便秘、腹湾，降低血压等，还可激活植物的自卫系统，对植物起到抗病、防病和提高生长速度等功效。由果胶降解得到的寡聚半乳糖酸酸已经被证实在植物中有一系列的生物活性，如能够诱导植物抗病性防御反应，调节植物生长发育及细胞表面的快速反应。在大肠和结肠中，微生物降解果胶寡糖释放出对健康产生积极影响的短链脂肪酸(益生元效应)。

果胶的基本组成单位是半乳糖醛酸，而果胶在自然界分布广泛，丰富的原料来源是酶解果胶生产寡聚半乳糖醛酸的最显著优势。目前制备寡聚半乳糖醛酸的方法大多是用果胶酶来水解果胶或果胶酸，得到不同聚合度的寡聚半乳糖醛酸的混合物。酶法制备寡聚半乳糖醛酸具有反应重复性好、条件温和、产物分离纯化过程简单、所得到的寡聚半乳糖醛酸品质优良等特点。同时利用酶解果胶多糖的方法获得，酶的反应效率高，方法简单、易控制，后期分离也容易，且酶作为一种生物制剂，不会带来化学试剂产生的不利因素。所以利用酶解果胶多糖的方法生产寡聚半乳糖醛酸是一条相对简单，容易研究的生产方法。

聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase)是果胶酶系中研究最为广泛的酶种，属于糖苷水解酶第28家族，特异催化水解多聚半乳糖醛酸链中α-1,4-糖苷键产生单个或寡聚的半乳糖醛酸，与其他糖苷水解酶一样，聚半乳糖醛酸酶有内切酶(endo-)和外切酶(exo-)之分，内切聚半乳糖醛酸酶的水解产物是寡聚半乳糖醛酸。

聚半乳糖醛酸酶参与果胶的降解，使细胞壁结构解体，聚半乳糖醛酸酶在果汁、果泥、果酒等果蔬的生产加工和生产果胶寡糖等方面具有较大的应用价值和前景。因此，寻找一种能够高效、稳定降解果胶多糖的聚半乳糖醛酸酶是获得果胶寡糖和不同聚合度半乳糖醛酸标准品和制剂的有效途径。而由于聚半乳糖醛酸酶在生物体内的含量非常少，借助基因水平进行高量表达和表征是提聚半乳糖醛酸酶产量的一种最有效措施。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种新型的来源于黑曲霉菌(Aspergillus niger)的聚半乳糖醛酸酶An EnPG及其编码基因。

本发明的第二个目的是提供一种制备新型聚半乳糖醛酸酶An EnPG的方法。

本发明的第三个目的是提供含有所述的聚半乳糖醛酸酶An EnPG基因重组表达质粒和重组基因工程菌株。

本发明的第四个目的是提供一种新型聚半乳糖醛酸酶An EnPG在商业化果胶多糖和聚半乳糖醛酸降解中的商业化应用。

本发明所提供的聚半乳糖醛酸酶An EnPG，来源于土壤中分离纯化的黑曲霉菌Aspergillus niger，从中扩增出的聚半乳糖醛酸酶An EnPG编码基因(命名为An EnPG)，具有下述核苷酸序列特征中的一种或二种以上：

1)具有序列表中SEQ ID NO.1的第1-1005位的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)具有序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；本发明的聚半乳糖醛酸酶An EnPG的基因序列是通过PCR技术从黑曲霉菌(Aspergillus niger)中克隆得到。该基因编码区长1026bp，包含多个结构域。其中，从第1-1005位为编码具有聚半乳糖醛酸酶AnEnPG活性的脱氧核糖核酸(DNA)序列，1006-1026位为酶切位点、His-Tag和终止密码子的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

3)编码序列表中SEQ ID NO.2的第1-335位氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

4)编码序列表中SEQ ID NO.2氨基酸序列的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

5)对序列表中SEQ ID NO.1的第1-1005位的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有聚半乳糖醛酸酶活性的核苷酸序列；

6)与序列表中SEQ ID NO.1限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码能降解果胶多糖和含聚半乳糖醛酸聚糖的蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

7)对序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或几个核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有聚半乳糖醛酸酶活性的核苷酸序列；

8)与序列表中SEQ ID NO.1的第1-1005位限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码降解果胶多糖的蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列。

本发明还提供了聚半乳糖醛酸酶An EnPG的氨基酸序列，具有如下特征中的一种或二种以上：

1)序列表中SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-335位氨基酸残基序列；

2)序列表中的SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-341位氨基酸残基序列；其中1-335位为具有聚半乳糖醛酸酶An EnPG活性的氨基酸序列，336-341位为酶切位点及His-Tag的氨基酸序列；

3)将序列表中的SEQ ID NO.2从氨基端开始的第1-335或1-341位氨基酸残基进行一个或两个以上氨基酸取代、缺失或添加而形成具有聚半乳糖醛酸酶活性不变的氨基酸序列。

本发明的聚半乳糖醛酸酶An EnPG的氨基酸序列及其核苷酸编码序列也可以根据预测的聚半乳糖醛酸酶An EnPG的氨基酸序列及其核苷酸编码序列人工合成获得。

与本文所公开的序列相似或同源(例如至少约70％序列同一性)的序列也是本发明的组成部分。在某些实施方案中，氨基酸水平上的序列同一性可以约为80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上。在核酸水平上，序列同一性可以约为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以上。

“基本相同(或“基本同源”)”，第一氨基酸或核苷酸序列与第二氨基酸或核苷酸序列含有足够数量的相同或等同(例如具有相似侧链，例如保守氨基酸取代)氨基酸残基或核苷酸，以使第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有相似活性；

制备重组酶An EnPG的方法，是将上文所述技术方案中的聚半乳糖醛酸酶基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的聚半乳糖醛酸酶。

所述的重组表达聚半乳糖醛酸酶An EnPG的表达载体可以是大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体等。具体的，在本发明实施例中使用的表达载体是真核表达载体pPICZαA。

用于重组表达聚半乳糖醛酸酶An EnPG的重组菌或转基因细胞系，可以是大肠杆菌宿主细胞(如Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM109、Escherichia coliDH5α等)、酵母菌宿主细胞(如Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、Kluyveromyces lactis等)、枯草杆菌宿主细胞(如Bacillus subtilis R25、Bacillussubtilis 9920等)、乳酸菌宿主细胞(如Lactic acid bacteria COCC101等)、放线菌宿主细胞(如Streptomyces spp.等)、丝状真菌宿主细胞(如Trichoderma viride、Trichodermareesei、Aspergillus niger、Aspergillus nidulans等)、昆虫细胞(如Bombyxmori、Antharaea eucalypti等)或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞CHO、幼小仓鼠肾脏细胞BHK、中国仓鼠肺细胞CHL等)。

本发明提供的聚半乳糖醛酸酶在降解果胶多糖，或在降解含有半乳糖醛酸聚糖连接的底物中的应用。

具体的，本发明提供的聚半乳糖醛酸酶在降解果胶多糖中可以应用，包括以下应用中的一种或二种：

1)在断裂果胶多糖的糖苷键，获得单糖或寡聚半乳糖醛酸中的应用；

2)在断裂果胶的糖苷键，获得单糖或寡聚半乳糖醛酸中的应用；

3)在断裂聚半乳糖醛酸的糖苷键，分离获得不同聚合度的寡聚半乳糖醛酸中的应用；

4)在与其他酶或金属离子协同断裂聚半乳糖醛酸糖苷键方面的应用；

5)重组酶An EnPG的毕赤酵母表达菌株对橘皮、苹果皮、橙子皮、柚子皮、葵花籽盘和菠萝等富含果胶的果皮进行直接降解来生产果胶寡糖。

上述步骤2)中所述的果胶是指实施例的商业化果胶，实施例中使用了阿拉丁果胶、柚皮果胶、菠萝低酯果胶、菠萝高酯果胶、苹果低酯果胶和葵花盘低酯果胶等，结果证明本发明提供的聚半乳糖醛酸酶，对上述商业化果胶均获得很好的降解效果，能够用于生产果胶寡糖。

本发明从毕赤酵母重组表达获得的聚半乳糖醛酸酶An EnPG，可以高效降解果胶多糖，以果胶多糖为底物时，在30℃、pH 5.0的条件下具有高活性，An EnPG的比活为5688(U/mg)。

上述步骤3)中所述的分离获得不同聚合度的寡聚半乳糖醛酸中的应用是指：本发明实施例9中，验证了重组酶An EnPG降解聚半乳糖醛酸(阿拉丁)用于不同聚合度的寡聚半乳糖醛酸的产物分离，证明了重组酶An EnPG对1％(w/v)的聚半乳糖醛酸酶活降解能力高，且产物中不同聚合度的寡聚半乳糖醛酸(DP1到DP8)的峰面积大小差异适宜，有利于对产物进行分离。因此，An EnPG可用于不同聚合度的半乳糖醛酸标准品的分离和制备。

上述步骤4)中所述的协同断裂聚半乳糖醛酸糖苷键的酶为DTT，金属离子为Co²⁺。

本发明的聚半乳糖醛酸酶An EnPG可广泛应用于农业、食品、饲料添加、医药及半乳糖醛酸寡糖的制备等领域。

附图说明

图1：聚半乳糖醛酸酶基因An EnPG琼脂糖凝胶电泳检测。泳道1：核酸标准；泳道2-An EnPG扩增产物。

图2：聚半乳糖醛酸酶An EnPG诱导表达后的SDS-PAGE图(M:Maker；1-6为高抗性筛选的单菌落诱导表达后的蛋白电泳)。

图3：温度对聚半乳糖醛酸酶An EnPG活性影响曲线。

图4：pH对聚半乳糖醛酸酶An EnPG活性影响曲线。

图5：聚半乳糖醛酸酶An EnPG对果胶(阿拉丁)降解产物的HPAEC-PAD分析图谱。

图6：重组酶An EnPG对不同商业化果胶降解的酶活性变化。

图7：重组酶An EnPG对商业化果胶降解产物的HPAEC-PAD分析图谱。

图8：不同pH条件下，重组酶An EnPG对聚半乳糖醛酸(阿拉丁)降解产物的HPAEC-PAD分析图谱。

图9：2种商业化果胶酶与重组酶An EnPG对不同商业化果胶降解酶活性的比较分析。

图10：重组酶An EnPG的毕赤酵母重组菌株对新鲜橘皮降解效果图。

具体实施方式

下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

核苷酸SEQ ID No.1的信息：序列长度1026bp；链型：单链；

氨基酸SEQ ID No.2的信息：序列长度：341；链型：单链。

实施例1聚半乳糖醛酸酶An EnPG全长基因克隆

参照柱式真菌总RNA抽提纯化试剂盒(上海生工)操作步骤提取寄生曲霉总RNA并参照RevertAid Frist Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific)操作步骤合成第一链cDNA。对The National Center for Biotechnology Information(NCBI)数据库中聚半乳糖醛酸酶基因序列进行多序列比对分析后，设计简并引物：

An EnPG-F:5’-ATACTCGAGAAAAGAGGAAGCTGCACCTTC-3’；

An EnPG-R:5’-CTAGTCTAGACCGCAAGAAGCCACCGAAGGG-3’，

以寄生曲霉的第一链cDNA为模板，扩增编码聚半乳糖醛酸酶蛋白的基因序列(不包括信号肽基因)。PCR反应条件为：98℃3min，1个循环；98℃10s，55℃15s，72℃2min，35个循环；72℃5min，1个循环。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析后(见图1)，对目的基因进行切胶回收，经双酶切的方法连接到真核表达载体pPICZαA上，在大肠杆菌Top10中扩增后，提取质粒测序。

实施例2聚半乳糖醛酸酶基因序列分析

测序结果采用GenBank数据库中的Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)分析，DNAMAN软件进行多序列比对，Vector NTI分析序列信息。

获得的聚半乳糖醛酸酶基因(命名为An EnPG)编码区长1026bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。An EnPG编码341个氨基酸和一个终止密码子，其氨基酸序列如SEQ IDNO 2所示，蛋白质分子量为40kDa，等电点为5.58。An EnPG编码的氨基酸具有聚半乳糖醛酸酶中心结构域，此表明An EnPG为糖苷水解酶家族的一名成员。

实施例3聚半乳糖醛酸酶An EnPG在毕赤酵母中异源表达及纯化

聚半乳糖醛酸酶An EnPG按毕赤酵母表达手册方法进行诱导表达。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测聚半乳糖醛酸酶An EnPG的表达及纯化情况，结果如图2所示，聚半乳糖醛酸酶An EnPG在电泳胶上呈现单一条带，分子量约为40kDa左右。

实施例4聚半乳糖醛酸酶An EnPG的活性测定

以200μL 1％(w/v)的果胶(阿拉丁)为底物，加入10μL重组酶An EnPG，反应10min，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定其活性。酶活力单位定义为:每分钟释放1μmol还原糖(以半乳糖糖醛酸计)所需的酶量为一个酶活力单位(U)。蛋白浓度使用碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒进行测定。

在最适温度和最适pH条件下，按标准方法测得An EnPG的比活为5688(U/mg)。

实施例5聚半乳糖醛酸酶An EnPG酶学性质分析

(1)温度对聚半乳糖醛酸酶An EnPG活性的影响

在pH 5.0(HAc-NaAc)的条件下，以200μL 1％(w/v)的果胶(阿拉丁)为底物，加入10μL重组酶An EnPG，反应20min，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定其活性，分别在20-90℃，每隔10℃设置一个温度来测定聚半乳糖醛酸酶An EnPG的活力。以灭活的酶为对照，以反应最高酶活力为100％计算相对酶活，根据酶在不同温度下的相对活性绘制曲线。结果如图3所示，An EnPG的最适反应温度为30℃。

(2)pH对聚半乳糖醛酸酶An EnPG活性的影响

在30℃的条件下，以200μL，pH分别为2.0-12.0％(w/v)的果胶(阿拉丁)为底物，加入10μL重组酶An EnPG，反应20min，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定其活性。以灭活的酶为对照，以反应最高酶活力为100％计算相对酶活，根据酶在不同温度下的相对活性绘制曲线。结果如图4所示，An EnPG的最适反应pH为5.0。

(3)重组聚半乳糖醛酸酶An EnPG的底物特异性研究

选取海藻酸钠、聚甘露糖醛酸(PM)、聚古罗糖醛酸(PG)、杂合褐藻寡糖G 55％(80-120CP)、杂合褐藻寡糖G 55％(180-220CP)、杂合褐藻寡糖G 35％(80-120CP)、杂合褐藻寡糖G 36％(180-220CP)、聚半乳糖醛酸(阿拉丁)、果胶(阿拉丁)、高酯果胶(Sigma)、柑橘低酯果胶(Sigma)和亚麻耔胶12种底物考察重组酶聚半乳糖醛酸酶An EnPG的底物特异性。在最适温度和最适pH条件下，反应20min，按标准方法测得An EnPG的相对酶活力，结果如表1所示，重组酶An EnPG对果胶(阿拉丁)和聚半乳糖醛酸均具有很高的降解酶活性。

表1聚半乳糖醛酸酶的底物特异性

(4)金属离子和蛋白抑制剂对重组聚半乳糖醛酸酶An EnPG活性的影响

以200μL 1％(w/v)的果胶(阿拉丁)为底物，加入10μL重组酶An EnPG，向反应体系中添加不同的金属离子和蛋白抑制剂，混匀后反应20min，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定其活性。在最适温度和最适pH条件下测定其酶活力变化，对照组为不加任何金属离子时An EnPG的活性(设定为100％)，结果如表2所示，与对照组相比，PMSF对An EnPG的酶活性没有显著影响；Co²⁺和DTT能提高An EnPG的酶活性，而其它金属离子和蛋白抑制剂能显著抑制An EnPG的酶活性。

表2不同金属离子和蛋白抑制剂对重组聚半乳糖醛酸酶An EnPG活性的影响

实施例6重组酶An EnPG降解果胶(阿拉丁)、商业化果胶(葵花盘低酯果胶)和聚半乳糖醛酸(阿拉丁)的产物聚合度分析

将1％(w/v)果胶(阿拉丁)与重组酶An EnPG(4.5mg/mL)按50:1(体积比)的比例混合后，在30℃条件下反应6h，通过Sevage法除蛋白后，对其产物进行HPAEC-PAD分析，如图5A所示，An EnPG对果胶(阿拉丁)的降解可以生成低聚合度的果胶寡糖混合物(DP＝1-12)。将0.5％(w/v)商业化果胶(葵花盘低酯果胶)与重组酶An EnPG(2mg/mL)按20:1(体积比)的比例混合后，在30℃条件下反应6h，通过Sevage法除蛋白后，对其产物进行HPAEC-PAD分析，如图5B所示，An EnPG对商业化果胶(葵花盘低酯果胶)的降解产物主要为DP＝1-10。将1％(w/v)聚半乳糖醛酸(阿拉丁)与重组酶An EnPG(0.01mg/mL)按25:1(体积比)的比例混合后，在30℃条件下反应22h，通过Sevage法除蛋白后，对其产物进行HPAEC-PAD分析，如图5C所示，An EnPG对聚半乳糖醛酸(阿拉丁)的降解产物主要为DP＝1-12。由图5可知重组酶An EnPG可以高效降解果胶(阿拉丁)、商业化果胶(葵花盘低酯果胶)和聚半乳糖醛酸(阿拉丁)生成DP1-DP12的寡聚半乳糖醛酸混合物。

实施例7重组酶An EnPG对不同来源和酯化度的商业化果胶降解的酶活性测定

在pH 5.0(HAc-NaAc)的条件下，以200μL 0.5％(w/v)的商业化果胶(1：葵花盘低酯果胶；2：苹果低酯果胶；3：橘子中酯果胶；4：菠萝低酯果胶；5：菠萝高酯果胶；6：柚皮果胶；7：对照组-果胶(阿拉丁))为底物，加入10μL重组酶An EnPG(2mg/mL)，混匀后反应30min，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定其活性。以对照组果胶(阿拉丁)来计算相对酶活为100％，重组酶An EnPG对其它不同来源和酯化度的商业化果胶降解的相对酶活力如图6所示，与对照组相比，重组酶An EnPG对不同的商业化果胶均具较高的酶活力，酶活力提高了2-5倍，说明重组酶An EnPG对商业化果胶具有高降解酶活性。

实施例8重组酶An EnPG对不同来源和酯化度的商业化果胶降解的产物分析

将1％(w/v)商业化果胶(阿拉丁果胶-作为实验对照、柚皮果胶、菠萝低酯果胶、菠萝高酯果胶、苹果低酯果胶和葵花盘低酯果胶)与重组酶An EnPG按50:1(体积比)的比例混合后，在最适温度和最适pH条件下反应22h，通过Sevage法除蛋白后，对其产物进行HPAEC-PAD分析。如图7所示，与对照组的阿拉丁果胶相比，重组酶An EnPG对这些商业化果胶均有很好的降解效果，降解产物主要为DP1-DP8的寡聚半乳糖醛酸混合物，商业化果胶不同聚合度的峰面积均显著高于对照组，说明商业化果胶不同聚合度的分解产物均有大量产生，所以重组酶An EnPG可以以商业化果胶为底物生产果胶寡糖。

实施例9重组酶An EnPG降解聚半乳糖醛酸(阿拉丁)用于不同聚合度的寡聚半乳糖醛酸的产物分离。

用氨水和冰乙酸配制不同pH的1％(w/v)的聚半乳糖醛酸(阿拉丁)底物(pH值分别为3、4、5、6和8)，分别将1％(w/v)聚半乳糖醛酸(阿拉丁)与重组酶An EnPG(0.01mg/mL)按50:1(体积比)的比例混合后，在30℃条件下反应22h，通过Sevage法除蛋白后，对其产物进行HPAEC-PAD分析，如图8所示，在pH＝5的条件下，重组酶An EnPG对1％(w/v)的聚半乳糖醛酸酶活降解能力高，且DP1到DP8的峰面积大小差异适宜，有利于对不同聚合度的寡聚半乳糖醛酸产物进行分离。因此，An EnPG可用于不同聚合度的半乳糖醛酸标准品的分离和制备(DP1、DP2、DP3、DP4、DP5、DP6、DP7和DP8标准品)。

实施例10 2种商业化果胶酶与重组酶An EnPG对不同来源和酯化度的商业化果胶降解酶活性比较分析。

在pH 5.0的条件下，以200μL 1％(w/v)的商业化果胶(1：葵花盘低酯果胶；2：苹果低酯果胶；3：橘子中酯果胶；4：菠萝低酯果胶；5：菠萝高酯果胶；6：柚皮果胶；7：聚半乳糖醛酸(阿拉丁))为底物，分别加入10μL果胶酶1、果胶酶2和重组酶An EnPG，3种酶的蛋白浓度均为0.085mg/mL，混匀后反应30min，采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定其活性。商业化果胶酶1(源叶生物CAS 9032-75-1)、商业化果胶酶2(氏璧生物技术有限公司)和重组酶AnEnPG对不同来源和酯化度的商业化果胶和聚半乳糖醛酸降解的酶活力如图9所示，两种商业化果胶酶的活力相似，差异不显著，而重组酶An EnPG对7种底物降解的酶活力均显著高于2种商业化果胶酶的活力，说明重组酶An EnPG具有商业化应用和开发的广大前景。

实施例11重组酶An EnPG的毕赤酵母重组菌株对新鲜橘皮降解效果评价

把重组酶An EnPG的毕赤酵母重组表达菌株接种到三角锥形瓶内的100mL自来水中，并加入无水甲醇0.5mL，把用紫外灭菌30min的新鲜橘皮40g放入上述锥形瓶中，在28℃，260rpm的条件下震荡培养，每隔24h加入无水甲醇0.5mL。在震荡培养的过程中观察橘皮的降解效果。如图10所示，经过48h震荡培养，发现重组酶An EnPG的毕赤酵母重组表达菌株对橘皮有显著的降解效果，新鲜的橘皮被液化降解成粘稠的黄色果胶寡糖液体。因此，可以利用重组酶An EnPG的毕赤酵母重组表达菌株对橘皮、苹果皮、橙子皮、柚子皮、葵花籽盘和菠萝等富含果胶的果皮进行直接降解来生产果胶寡糖。

对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。

序列表

<110> 中国科学院大连化学物理研究所

<120> 一种聚半乳糖醛酸酶编码基因及酶和制备与应用

<130> 2013

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1026

<212> DNA

<213> 核苷酸序列

<400> 1

ggaagctgca ccttcaaaac ggctgctgct gccaaagcgg gcaaggcagg gtgctctacc 60

atcacccttg acaacatcga agtccccgct ggaaccaccc tcgacctgac cggtctcacc 120

agcggtacga aggtcatctt cgagggcacc acgaccttcg attatgaaga atgggcaggc 180

cccttgatct ccatgagtgg caaagatatc accgtcactg gtgcctcagg ccatctcatc 240

aactgcgacg gtgcgcggtg gtgggacggc aaagggacta gcggaaagaa gaagcccaag 300

ttcttctacg ctcatggcct tgactcctcg tccattactg gattgaatat caagaacacc 360

ccccttatgg cgttcagtgt tcaggcagat gacatcactc tgactgacat taccatcaac 420

aacgcggacg gtgataccca gggtggacac aacactgatg cgtttgatgt tggtaactcc 480

gtcggtgtga atatcatcaa accgtgggtc cataaccagg atgactgtct tgcggtcaac 540

tctggcgaga acatctggtt caccggcggc acctgcattg gcggccacgg tctctccatc 600

ggttctgtcg gcggccgctc caacaacgtt gtcaagaacg tcactatcga gcactccacc 660

gtgagcaatt ccgagaacgc cgtccgaatt aagaccgtct ctggtgccac tggttccgtg 720

tctgagatca cgtactccaa cattgttatg tccggtatct ccgattacgg cgtcgttatc 780

cagcaggatt acgaggatgg caagcctacg ggtaagccca cgaacggtgt cactattacg 840

gatgtcaagc tggagagcgt gactggtact gtggatagta aggctactga tatctatctt 900

ctttgcggat ctggtagctg ctcggactgg acttgggacg atgtgaaggt tactggggga 960

aagaaatcta ctgcttgcaa aaactaccct tcggtggctt cttgccatca tcatcatcat 1020

cattga 1026

<210> 2

<211> 341

<212> protein

<213> 氨基酸序列

<400> 2

GSCTFKTAAA AKAGKAGCST ITLDNIEVPA GTTLDLTGLT SGTKVIFEGT TTFDYEEWAG 60

PLISMSGKDI TVTGASGHLI NCDGARWWDG KGTSGKKKPK FFYAHGLDSS SITGLNIKNT 120

PLMAFSVQAD DITLTDITIN NADGDTQGGH NTDAFDVGNS VGVNIIKPWV HNQDDCLAVN 180

SGENIWFTGG TCIGGHGLSI GSVGGRSNNV VKNVTIEHST VSNSENAVRI KTVSGATGSV 240

SEITYSNIVM SGISDYGVVI QQDYEDGKPT GKPTNGVTIT DVKLESVTGT VDSKATDIYL 300

LCGSGSCSDW TWDDVKVTGG KKSTACKNYP SVASCHHHHH H 341

Claims

1.一种聚半乳糖醛酸酶基因，其核苷酸序列具有如下特征中的一种或二种以上：

2)具有序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

6)对序列表中SEQ ID NO.1的脱氧核糖核酸(DNA)序列进行一个或两个以上核苷酸取代、缺失或添加而得到的编码具有聚半乳糖醛酸酶活性的核苷酸序列；

7)与序列表中SEQ ID NO.1的第1-1005位限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码降解果胶多糖的蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列；

8)与序列表中SEQ ID NO.1限定的脱氧核糖核酸(DNA)序列的同源性达到80％及以上，且能编码降解果胶多糖的蛋白质的脱氧核糖核酸(DNA)序列。

2.一种权利要求1所述的聚半乳糖醛酸酶基因编码的聚半乳糖醛酸酶，其特征在于：其氨基酸序列具有如下特征中的一种或二种：

2)序列表中SEQ ID NO.2氨基酸残基序列；

3)对序列表中SEQ ID NO.2所示的第1-335位氨基酸序列进行一个或两个以上氨基酸取代、缺失或添加而形成的具有聚半乳糖醛酸酶活性的氨基酸序列；

4)对序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列进行一个或两个以上氨基酸取代、缺失或添加而形成的具有聚半乳糖醛酸酶活性的氨基酸序列。

3.一种权利要求2所述的聚半乳糖醛酸酶的制备方法，其特征在于：将如权利要求1所述的聚半乳糖醛酸酶酶基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的聚半乳糖醛酸酶。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述的重组表达载体选自：大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体或哺乳动物细胞表达载体。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述宿主细胞，即用于重组表达聚半乳糖醛酸酶的重组菌或转基因细胞系，是指大肠杆菌宿主细胞、酵母菌宿主细胞、枯草杆菌宿主细胞、乳酸菌宿主细胞、放线菌宿主细胞、丝状真菌宿主细胞、昆虫细胞，哺乳动物细胞中的一种。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述宿主细胞选自，Escherichia coliBL21、Escherichia coli JM109、Escherichia coli DH5α、Saccharomyces cerevisiae、Pichiapastoris、Kluyveromyces lactis、Bacillus subtilis R25、Bacillus subtilis9920、Lactic acid bacteria COCC101、Streptomyces spp.、Trichoderma viride、Trichodermareesei、Aspergillus niger、Aspergillus nidulans、Bombyxmori、Antharaea eucalypti、中国仓鼠卵巢细胞CHO、幼小仓鼠肾脏细胞BHK或中国仓鼠肺细胞CHL。

7.如权利要求2所述的聚半乳糖醛酸酶在降解果胶多糖，或在降解含有半乳糖醛酸聚糖连接的底物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：包括以下应用中的一种或二种：

5)重组酶AnEnPG的毕赤酵母表达菌株对富含果胶的果皮进行直接降解来生产果胶寡糖的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述协同断裂聚半乳糖醛酸糖苷键的酶为DTT，金属离子为Co²⁺。