CN110616211B

CN110616211B - 一种α-淀粉酶、编码基因、载体、宿主及其应用

Info

Publication number: CN110616211B
Application number: CN201910965586.8A
Authority: CN
Inventors: 赵海; 易卓林; 陈兰钗; 方扬; 靳艳玲; 何开泽
Original assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Current assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Priority date: 2019-10-12
Filing date: 2019-10-12
Publication date: 2021-05-07
Anticipated expiration: 2039-10-12
Also published as: CN110616211A

Abstract

本发明提供了一种α‑淀粉酶编码基因，α‑淀粉酶，包含所述α‑淀粉酶编码基因的重组载体，包含所述α‑淀粉酶编码基因或所述重组载体的宿主，以及制备所述α‑淀粉酶的方法，并证实了所述α‑淀粉酶对多种淀粉底物具有水解活性，因而所述α‑淀粉酶及宿主可在水解淀粉中应用，具体可应用于洗涤行业、纺织行业及食品行业等，为可应用于洗涤、纺织及食品等行业的淀粉水解提供了新的选择。

Description

一种α-淀粉酶、编码基因、载体、宿主及其应用

技术领域

本发明属于生物工程和酶工程领域，涉及α-淀粉酶、编码基因、载体、宿主及其应用。

背景技术

α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1.)是工业应用酶中最重要的酶，占所有工业酶的25％。α-淀粉酶是内切淀粉水解酶，作用于淀粉底物的α-1，4-糖苷键而释放葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖等寡聚糖。作为糖苷水解酶13家族(GH13)的代表，根据序列相似度和催化功能可以分为GH13_1，5，6，7，15，24，27，28，32，36，37亚家族。其中，真菌来源淀粉酶归于GH13_1和5亚家族中。GH13_1仅包含来源于真菌和酵母的α-淀粉酶，且大部分α-淀粉酶为胞外酶；GH13_5亚家族包含来源于细菌的液化淀粉酶，真菌的胞内酶和一些古细菌的淀粉酶。目前报道较多的真菌淀粉酶多来源于GH13_1亚家族，以来源于Aspergillus oryzae的Taka-amylase为代表。而来源于GH13_5亚家族的真菌淀粉酶报道较少，对于该类淀粉酶的酶学特性分析相对于GH13_1家族来说少之甚少。

我国白酒的酿造过程，与国外的纯菌发酵产酒不同，它是完全开放性的多种微生物定向性参与的固态发酵。大曲，是固态白酒发酵的发酵剂，自古有“酒之骨”之说。大曲的微生物菌群多样性决定了其丰富的酶系网络。对于大曲中酶系的研究，报道最多的是提取其粗酶液测定液化力、糖化力以及酯化力等。对于大曲中酶资源的挖掘，主要是基于传统培养法筛选产特定功能酶的微生物，也有基于宏基因组法建库，进行随机筛选特定功能的克隆子而获得目的酶基因。而培养法不能有效挖掘不可培养微生物中的酶基因，宏基因组法无法如实反映功能酶基因在环境中的作用。

发明内容

本发明的目的是提供α-淀粉酶、编码基因、载体、宿主及其应用。

本发明提供的α-淀粉酶编码基因，来源于浓香型大曲未培养微生物，该编码基因编码具有如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白质，或者编码与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有90％以上同源性且具有α-淀粉酶活性的蛋白质。

进一步地，该编码基因编码具有如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白质，或者编码与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有95％以上、优选98％以上同源性且具有α-淀粉酶活性的蛋白质。

更进一步地，该编码基因具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，或者与SEQ IDNO.1所示核苷酸序列具有90％以上、优选95％以上、更优选98％以上同源性的核苷酸序列。与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％以上、优选95％以上、更优选98％以上同源性的核苷酸序列，可通过对SEQ ID NO.1所示核苷酸序列进行一个或者多个碱基取代或/和缺失或/和添加而生成的与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％以上、优选95％以上、更优选98％以上同源性的核苷酸序列。

本发明提供的α-淀粉酶，是具有如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白质，或者是与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有90％以上同源性且具有α-淀粉酶活性的蛋白质。

进一步地，该α-淀粉酶是具有如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白质，或者是与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有90％以上、优选95％以上、更优选98％以上同源性且具有α-淀粉酶活性的蛋白质。与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有90％以上、优选95％以上、更优选98％以上同源性且具有α-淀粉酶活性的蛋白质，可通过对SEQ ID NO.2所示氨基酸序列进行一个或者几个氨基酸的取代或/和缺失或/和添加而衍生的与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有90％以上、优选95％以上、更优选98％以上同源性且具有α-淀粉酶活性的蛋白质。

本发明还提供了包含上述α-淀粉酶编码基因的重组载体，或包含上述α-淀粉酶的编码基因的重组载体。

本发明还提供了包含上述α-淀粉酶编码基因的宿主，或包含上述α-淀粉酶的编码基因宿主，或包含上述重组载体的宿主。

进一步地，所述的重组载体为将上述α-淀粉酶编码基因或上述α-淀粉酶的编码基因插入到载体中形成的，所述的载体是指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、动物细胞病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定保留，任何载体都可以采用，并无其他特定要求。作为示例，本发明选用了pDE2质粒。对宿主也无特定要求，宿主可以是原核细胞，如Escherichia coli、Bacillus等，也可以是真核细胞，如Pichia pastoris、Saccharomyces cerevisiae、Aspergillus niger等。

本发明还提供了一种制备上述α-淀粉酶的方法，该方法包括：在适合上述宿主产生α-淀粉酶的条件下培养该宿主；以及分离纯化所述宿主产生的α-淀粉酶。此处所述的宿主是指包含上述α-淀粉酶编码基因的宿主，或包含上述α-淀粉酶的编码基因宿主，或包含上述重组载体的宿主。

该制备方法对重组载体的构建方法、以及将所构建的重组载体转化、转染或转导至宿主中的方法无特定要求；该方法对宿主产生的α-淀粉酶的分离纯化方法，无特定要求，如Ni柱纯化法、离子交换柱法、分子筛法等都是可行的。

本发明提供的α-淀粉酶为中温真菌淀粉酶，本发明通过实验证实了该α-淀粉酶对多种淀粉底物具有水解活性。基于此，本发明还提供了上述α-淀粉酶及上述宿主在水解淀粉中的应用。此处的宿主是指包含上述α-淀粉酶编码基因的宿主，或包含上述α-淀粉酶的编码基因的宿主，或包含上述重组载体的宿主。

进一步地，应用上述α-淀粉酶或上述宿主水解淀粉时，使上述α-淀粉酶或上述宿主与含有待水解淀粉的反应体系接触，并在适宜α-淀粉酶进行水解反应的条件下进行水解反应。

更进一步地，控制所述反应体系的pH值为5.0～12.5、优选为5.0～8.5、进一步优选为5.5～6.0，控制进行水解反应的温度为30～65℃、优选为50～55℃、进一步优选为54℃。

本发明通过实验发现，本发明提供的α-淀粉酶在Ca²⁺存在的条件下，热稳定性增加，尤其是在Ca²⁺浓度为0.0625～2.5mM的条件下，α-淀粉酶的热稳定性更高。基于此，在根据实际应用时反应体系的具体情况，可以考虑在向反应体系中添加Ca²⁺的条件下进行水解反应。

本发明通过实验发现，本发明提供的α-淀粉酶对可溶性淀粉、支链淀粉、直链淀粉、小麦淀粉、土豆淀粉、玉米淀粉、糊精都具有良好的水解活性，尤其对支链淀粉、玉米淀粉和土豆淀粉的水解活性更高。基于此，本发明提供的α-淀粉酶可在上述这些淀粉水解中应用，该α-淀粉酶可应用于洗涤行业、纺织行业及食品行业等。

本发明的技术方案产生的有益技术效果：本发明提供了一种α-淀粉酶编码基因，以及该编码基因编码的α-淀粉酶，包含所述α-淀粉酶编码基因的重组载体，包含所述编码基因或重组载体的宿主，并证实了该α-淀粉酶对多种淀粉底物具有水解活性，可应用于洗涤行业、纺织行业及食品行业等，为可应用于洗涤、纺织及食品等行业的淀粉水解提供了新的选择。

附图说明

图1是纯α-淀粉酶NFAmy13B的SDS-PAGE凝胶电泳图。

图2是α-淀粉酶NFAmy13B对普鲁兰多糖和直链淀粉的水解图。

图3是不同pH对α-淀粉酶NFAmy13B的酶活影响曲线。

图4是不同反应温度对α-淀粉酶NFAmy13B的酶活影响曲线。

图5是α-淀粉酶NFAmy13B的pH稳定性曲线。

图6是α-淀粉酶NFAmy13B的热稳定性曲线。

图7是不同浓度CaCl₂对α-淀粉酶NFAmy13B的热稳定性影响条状图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明提供的α-淀粉酶、编码基因、载体、宿主及其应用作进一步说明。下述各实施例中所使用的试验方法，如无特殊说明，均为本技术领域的常规方法。下述各实施例中所采用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得，所述浓香型大曲采集自中国四川省宜宾市。

实施例1：α-淀粉酶编码基因的获取

在浓香型大曲高温阶段(62℃)取样，提取总RNA。具体方法如下，在预冷的研钵中将1g浓香型大曲样品磨成细粉。将样品与4mL pH＝9.0的硼酸盐缓冲液(200mM硼酸钠，30mM乙二醇四乙酸(EGTA)，1％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)，4％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，0.5％(v/v)Nonidet-40(NP-40)，10mMβ-巯基乙醇和0.03％(v/v)RNase抑制剂)以及280μL蛋白酶K(20mg/mL)混合并在室温保持2分钟。然后将所得粗裂解物的RNA离心，用70％乙醇沉淀，并根据RNeasy Midi Kit(Qiagen，Valencia，CA)说明书进行洗涤。此外，根据说明书对RNA混合物进行DNase I(Fermentas，USA)处理。使用3μL总RNA(约1μg)作为用MMLV逆转录酶进行第一链合成的模板，之后使用

cDNA库构建试剂盒(Clontech，MountainView，CA)通过20个长距离PCR(LD-PCR)循环扩增cDNA。cDNA文库构建后，对其进行宏转录组分析，编号为22984的开放阅读框被预测为编码一种含DUF1939未知功能区域的α-淀粉酶编码基因。由于该α-淀粉酶编码基因来源于浓香型大曲，且为糖苷水解酶13家族成员，故命名为NFAmy13B基因。其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其开放阅读框为从5’端的第1位到1605位碱基。

实施例2：α-淀粉酶生物信息学分析

实施例1所获得的NFAmy13B基因所表达的蛋白质，命名为α-淀粉酶NFAmy13B，含534个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，预测的蛋白大小为61.2KD。根据SignalP-5.0Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对NFAmy13B基因的核苷酸序列进行预测，表明其没有信号肽。根据基因库序列比对表明，与α-淀粉酶NFAmy13B的氨基酸序列相似度最高的酶为来源于Byssochlamys spectabilis的假定α-淀粉酶(GenBank编号：XP_028489551.1)，其相似度为77.6％，该淀粉酶来源于基因组信息分析，未进行酶学性质分析。其次是来源于Aspergillus niger的胞内真菌淀粉酶AmyD(GenBank编号：XP_001389762.2)，相似度为64.4％。根据进化树分析表明，α-淀粉酶NFAmy13B属于糖苷水解酶13家族的5亚家族(GH13_5)。因此，α-淀粉酶NFAmy13B是一种从浓香型大曲中挖掘到的属于GH13_5亚家族的未被研究的真菌α-淀粉酶。

实施例3：α-淀粉酶基因的表达

以浓香型大曲cDNA文库中含22984开放阅读框的cDNA为模板，通过正向引物NFABf(5’-CACCATGAAGTCCCTCCTCTGCTG-3’)和反向引物NFABr(5’-CTAGTGCTTGTAGATATCCGAGTC-3’)扩增获得NFAmy13B基因。具体PCR反应体系为：47μL Mix(green)(TsingKe，北京)，10μM的正反向引物各1μL，DNA模板1μL。PCR扩增条件为：98℃预变性2min，98℃变性10s，50℃退火15s，72℃延伸25s，跳到第2步循环30次，72℃保温5min。琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物约1.6kb，与预期NFAmy13B基因含有1605个碱基相符。将扩增产物50～100ng与pDE2质粒(TsingKe，北京)在22～30℃连接反应1～5min，构建成重组表达载体。

将重组表达载体与E.coli DH5α感受态细胞轻轻混匀，冰上静置25min。然后将混合液于42℃热激30～45s，迅速转移至冰浴中，静置2min。加入500μL无菌LB于37℃、200rpm条件下培养1h后在含50μg/mL卡那霉素的LB平板中进行抗性筛选。挑取克隆子进行PCR菌液验证，将验证呈阳性的克隆子送公司测序。将测序正确的克隆子进行菌液培养提取质粒，将质粒转入E.coli BL21(DE3)中进行异源表达。具体表达方法如下：

先挑取单克隆进行种子液培养，培养条件为：培养基为含50μg/mL卡那霉素的LB，温度37℃，转速200rpm。种子液在摇床中过夜培养后，取1mL接种于同样含50μg/mL卡那霉素的1升LB中在上述条件下培养。待菌体的OD_600nm值达0.5～0.8后，加入0.1mM IPTG进行诱导表达，此时温度降低至16℃，其它培养条件不变。24h后，将培养液在8000rpm、4℃下离心3min，弃培养基，保留菌体。

实施例4：α-淀粉酶的纯化

将实施例3中收集的菌体重悬于结合缓冲液(50mM Tris-HCl，300mM NaCl，pH7.5)中，用超声破碎仪对菌悬液进行破碎。充分破碎后，对破碎液进行离心，条件为8000rpm、4℃下离心10min，保留上清液备用。将上清液与Ni柱结合，先用结合缓冲液冲洗未与Ni柱结合的杂蛋白，再用不同浓度的咪唑(20mM，50mM和250mM)梯度洗脱与Ni柱结合的蛋白。分别收集流出液，进行SDS-PAGE凝胶电泳(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析，根据跑胶结果收集目的蛋白。收集的目的蛋白用

Ultra-15离心过滤管浓缩，并且用存储缓冲液(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 7.5)代替结合缓冲液。最后获得的纯蛋白跑SDS-PAGE胶验证，如图1所示。

实施例5：α-淀粉酶的底物谱分析

基于平板法测定α-淀粉酶NFAmy13B对不同底物的水解酶活。制备含有不同底物(AZCL-葡聚糖，-阿拉伯木聚糖，-HE-纤维素，-普鲁兰多糖，-直链淀粉)的固体平板，在每个平板上打孔。在孔中加入约20μg的α-淀粉酶NFAmy13B，在54℃过夜孵化，即可观察α-淀粉酶NFAmy13B对不同底物的酶解作用。结果表明，在上述实验底物中，该α-淀粉酶NFAmy13B只对普鲁兰多糖和直链淀粉有水解作用，如图2所示。

进一步将40nMα-淀粉酶NFAmy13B与5mg/mL不同底物混合，在pH 6.0磷酸盐缓冲液(50mM NaH₂PO₄，150mM NaCl)中于54℃下孵育30min后，采用对羟基苯甲酸酰肼法(pHBAH法)测定总还原糖，结果如表1所示，由表1可知，α-淀粉酶NFAmy13B对多种淀粉底物有水解作用，对支链淀粉的水解能力最高。

表1 NFAmy13B对不同底物的水解酶活

底物	葡萄糖当量(mM)(平均值±SD)
		可溶性淀粉	1.2±0.1
支链淀粉	11.6±0.3
		直链淀粉	5.7±1.2
小麦淀粉	6.1±1.1
		土豆淀粉	5.4±0.7
玉米淀粉	7.1±0.7
		木聚糖	0
昆布多糖	0
		糊精	6.8±0.8
糖原	0.2±0.0
		普鲁兰多糖	0.1±0.1
阿拉伯木聚糖	0
		纤维素	0

实施例6：α-淀粉酶的最适反应条件分析

在pH 3.0～9.5的缓冲液(pH 3.0～6.0：50mM C₆H₅Na₃O₇·2H₂O，150mM NaCl；pH6.0～8.0：50mM NaH₂PO₄，150mM NaCl；pH 8.0～9.5：50mM tris-HCl，150mM NaCl)中，测定α-淀粉酶NFAmy13B的最适反应pH值。具体反应条件为，反应体系中α-淀粉酶NFAmy13B浓度30nM，玉米淀粉浓度2mg/mL，反应温度45℃，反应时间30min。反应结束后采用pHBAH法测定总还原糖浓度。结果如图3所示，由图3可知，α-淀粉酶NFAmy13B在pH 5.0～8.5都能保持在较高的活性(>50％)，且最适反应pH值为5.5～6.0。

在30～78℃测定α-淀粉酶NFAmy13B的最适反应温度。具体反应条件为，反应体系中α-淀粉酶NFAmy13B浓度30nM，玉米淀粉浓度2mg/mL，在pH 6.0磷酸盐缓冲液(50mMNaH₂PO₄，150mM NaCl)中45℃下反应30min。反应结束后采用pHBAH法测定总还原糖浓度。结果如图4所示，由图4可知，α-淀粉酶NFAmy13B在30～65℃都能保持在较高的活性(>50％)，且最适反应温度为54℃。

实施例7：α-淀粉酶的稳定性分析

α-淀粉酶NFAmy13B的pH稳定性于pH 3.0～13.0(pH 3.0～6.0：50mM C₆H₅Na₃O₇·2H₂O，150mM NaCl；pH 6.0～8.0：50mM NaH₂PO₄，150mM NaCl；pH 8.0～9.5：50mM tris-HCl，150mM NaCl；pH 9.5～11.0：25mM Na₂CO₃-NaOH，pH 11.0～12.0：25mM Na₂HPO₄-NaOH；pH12.0～13.0：50mM KCl-NaOH)的缓冲液中进行测试。将600nMα-淀粉酶NFAmy13B在pH3.0～13.0的环境中于20℃处理1h后，测定剩余酶活。测定剩余酶活的反应条件为，反应体系中α-淀粉酶NFAmy13B浓度40nM、玉米淀粉2mg/mL，在54℃和各pH条件下反应30min后，采用pHBAH法测定总还原糖浓度。将反应酶活最高的实验组定义为相对酶活100％。结果如图5所示，由图5可知，α-淀粉酶NFAmy13B在pH 5.0～12.5的条件下极其稳定，可见α-淀粉酶NFAmy13B可在较宽的pH范围内使用，尤其在极碱性条件下仍保持较高的酶活。

α-淀粉酶NFAmy13B的热稳定性分析于40～64℃进行。将150nM纯的α-淀粉酶NFAmy13B在上述温度、pH 6.0条件下热处理30min。热处理后的酶立即进行冰浴，待冷却后测定剩余酶活。具体反应条件为，反应体系中α-淀粉酶NFAmy13B浓度30nM、玉米淀粉2mg/mL，在54℃和pH 6.0条件下反应30min后，采用pHBAH法测定总还原糖浓度。将未进行热处理的α-淀粉酶NFAmy13B在相同条件下反应的酶活定义为相对酶活100％。结果如图6所示，由图6可知，α-淀粉酶NFAmy13B的热稳定性不佳，酶活随温度升高而降低。

实施例8：Ca²⁺对α-淀粉酶热稳定性影响

测定不同CaCl₂浓度对α-淀粉酶NFAmy13B热稳定性的影响。将75nM纯的α-淀粉酶NFAmy13B与含不同CaCl₂浓度(0～25mM)的pH 6.0的缓冲液(50mM NaH₂PO₄，150mM NaCl)混合，在55℃下热处理30min。热处理后的酶立即进行冰浴，待冷却后测定剩余酶活。具体反应条件为，反应体系中α-淀粉酶NFAmy13B浓度30nM、土豆淀粉5mg/mL，在54℃和pH 6.0的条件下反应30min后，采用pHBAH法测定总还原糖浓度。将未进行热处理的酶在相同条件下反应的酶活定义为相对酶活100％。结果如图7所示，由图7可知，α-淀粉酶NFAmy13B在CaCl₂浓度0.0025～6.25mM的条件下的热稳定性较未加CaCl₂提高，尤其在含有0.0625～2.5mMCaCl₂的条件下，α-淀粉酶NFAmy13B的剩余酶活显著提高。

序列表

<110> 中国科学院成都生物研究所

<120> 一种α-淀粉酶、编码基因、载体、宿主及其应用

<130> 2019.09.17

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1605

<212> DNA

<213> 未知()

<400> 1

atgaagtccc tcctctgctg ctttggccgg gaaaaacaga aatggcggga aatcgaagcc 60

gaggctgagc atcttgatca gttgccaaca tgggacgctc cggacaacgc tcttatgatg 120

caggcgtttg aatggcacgt cccggacgac cagaggcact ggcagcgcct taagagcgta 180

ttaccgagcc tgaaggaaat cggcgttgac agcatgtgga tccctccggg atgtaaagcc 240

atgagtccgt cgggaaatgg ctacgacatc tacgatctat atgacttggg cgaattcgat 300

cagaaggggt ccagagcgac gaaatgggga accaaggagg agctcctaga actcacacgg 360

accgctcaaa atctcggtat tggcgtcatc tgggatgcgg ttctcaatca caaggcagct 420

gcggattaca ctgaaaggtt tctggccgtc aaagtagacc cgaaagatcg gaatgtcgaa 480

gtctctagtc cagaggaaat cgaggcatgg gtaggctacg acttccctgg acgtggaaaa 540

aagtatagct ccatgaagta ccactggcat cattttagcg gcattgatta caatgccatt 600

gacaacaaga atgcaattta caaggtcgtt gggccaaaca agggctgggc gaccgatgtc 660

agcaaagaaa acggcaacta cgactatctg atgttcggtg acttggacta ctcgaacccg 720

gaagtcaggc aagatgttat gaactggggt gaatggattg ggaaagagct ccctctgagc 780

ggcatgcgcc tggatgccgt caaacactac tcattatcct tccagaagca gttcgttgac 840

catttaagac aaacgttcgg gccccattgg ttcgtcgttg cagagtattg gaggggagtt 900

ccaggagaac tccttgacta cctacaaaag atggaccaca aggtggccct atttgatgtg 960

cctcttgtct atcgattctc caacttctct cgaacggaag gagcggacct caggaaaatc 1020

ttcgatgaca ctctggtgaa atataagcct caacatgcag tgacgtttgt agcaaaccac 1080

gatactcaac cgggtcaatc tctggaggcc ccgattgcgt catatttcaa gccactcgcg 1140

tatgctttaa tcctcctgcg cagtgaaggc catccttgca tcttctacgg tgatctctac 1200

ggaattagag aaggtgtcaa gaaacctctg acaccatcct gcggcggaaa gctacctcat 1260

ctggctcttg cgcggaagct ttatgcctac ggagtgcaga gggactattt cgacaagaga 1320

aattgcatcg gcttcgtccg ctacggcaac aagcggcatc cttccggtct tgcgtgcgtt 1380

ctcagcaaca gctccgcgtc caagaaacgc atgttcgttg gcaggaaaca cgccggagag 1440

cactggacgg acattctggg gtggagcaaa gagaccgttg tgatcgacgg ccgagggtac 1500

ggtgtctttc ccgtatcagc aaggagtgtg agcgtctggg tggatgctgc agcagaggga 1560

agagatcggt ttggtgactt tgactcggat atctacaagc actag 1605

<210> 2

<211> 534

<212> PRT

<213> 未知()

<400> 2

Met Lys Ser Leu Leu Cys Cys Phe Gly Arg Glu Lys Gln Lys Trp Arg

1 5 10 15

Glu Ile Glu Ala Glu Ala Glu His Leu Asp Gln Leu Pro Thr Trp Asp

20 25 30

Ala Pro Asp Asn Ala Leu Met Met Gln Ala Phe Glu Trp His Val Pro

35 40 45

Asp Asp Gln Arg His Trp Gln Arg Leu Lys Ser Val Leu Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Glu Ile Gly Val Asp Ser Met Trp Ile Pro Pro Gly Cys Lys Ala

65 70 75 80

Met Ser Pro Ser Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu

85 90 95

Gly Glu Phe Asp Gln Lys Gly Ser Arg Ala Thr Lys Trp Gly Thr Lys

100 105 110

Glu Glu Leu Leu Glu Leu Thr Arg Thr Ala Gln Asn Leu Gly Ile Gly

115 120 125

Val Ile Trp Asp Ala Val Leu Asn His Lys Ala Ala Ala Asp Tyr Thr

130 135 140

Glu Arg Phe Leu Ala Val Lys Val Asp Pro Lys Asp Arg Asn Val Glu

145 150 155 160

Val Ser Ser Pro Glu Glu Ile Glu Ala Trp Val Gly Tyr Asp Phe Pro

165 170 175

Gly Arg Gly Lys Lys Tyr Ser Ser Met Lys Tyr His Trp His His Phe

180 185 190

Ser Gly Ile Asp Tyr Asn Ala Ile Asp Asn Lys Asn Ala Ile Tyr Lys

195 200 205

Val Val Gly Pro Asn Lys Gly Trp Ala Thr Asp Val Ser Lys Glu Asn

210 215 220

Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Phe Gly Asp Leu Asp Tyr Ser Asn Pro

225 230 235 240

Glu Val Arg Gln Asp Val Met Asn Trp Gly Glu Trp Ile Gly Lys Glu

245 250 255

Leu Pro Leu Ser Gly Met Arg Leu Asp Ala Val Lys His Tyr Ser Leu

260 265 270

Ser Phe Gln Lys Gln Phe Val Asp His Leu Arg Gln Thr Phe Gly Pro

275 280 285

His Trp Phe Val Val Ala Glu Tyr Trp Arg Gly Val Pro Gly Glu Leu

290 295 300

Leu Asp Tyr Leu Gln Lys Met Asp His Lys Val Ala Leu Phe Asp Val

305 310 315 320

Pro Leu Val Tyr Arg Phe Ser Asn Phe Ser Arg Thr Glu Gly Ala Asp

325 330 335

Leu Arg Lys Ile Phe Asp Asp Thr Leu Val Lys Tyr Lys Pro Gln His

340 345 350

Ala Val Thr Phe Val Ala Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu

355 360 365

Glu Ala Pro Ile Ala Ser Tyr Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Leu Ile

370 375 380

Leu Leu Arg Ser Glu Gly His Pro Cys Ile Phe Tyr Gly Asp Leu Tyr

385 390 395 400

Gly Ile Arg Glu Gly Val Lys Lys Pro Leu Thr Pro Ser Cys Gly Gly

405 410 415

Lys Leu Pro His Leu Ala Leu Ala Arg Lys Leu Tyr Ala Tyr Gly Val

420 425 430

Gln Arg Asp Tyr Phe Asp Lys Arg Asn Cys Ile Gly Phe Val Arg Tyr

435 440 445

Gly Asn Lys Arg His Pro Ser Gly Leu Ala Cys Val Leu Ser Asn Ser

450 455 460

Ser Ala Ser Lys Lys Arg Met Phe Val Gly Arg Lys His Ala Gly Glu

465 470 475 480

His Trp Thr Asp Ile Leu Gly Trp Ser Lys Glu Thr Val Val Ile Asp

485 490 495

Gly Arg Gly Tyr Gly Val Phe Pro Val Ser Ala Arg Ser Val Ser Val

500 505 510

Trp Val Asp Ala Ala Ala Glu Gly Arg Asp Arg Phe Gly Asp Phe Asp

515 520 525

Ser Asp Ile Tyr Lys His

530

Claims

1.一种α-淀粉酶编码基因，其特征在于，该编码基因编码氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示的蛋白质。

2.根据权利要求1所述α-淀粉酶编码基因，其特征在于，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。

3.一种α-淀粉酶，其特征在于，该α-淀粉酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。

4.包含权利要求1或2所述α-淀粉酶编码基因的重组载体。

5.包含权利要求1或2所述α-淀粉酶编码基因的宿主。

6.一种制备权利要求3所述α-淀粉酶的方法，其特征在于，该方法包括：在适合权利要求5所述宿主产生α-淀粉酶的条件下培养该宿主；以及分离纯化所述宿主产生的α-淀粉酶。

7.权利要求3所述α-淀粉酶及权利要求5所述宿主在水解淀粉中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，应用权利要求3所述α-淀粉酶或权利要求5所述宿主水解淀粉时，使权利要求3所述α-淀粉酶或权利要求5所述宿主与含有待水解淀粉的反应体系接触，并在适宜α-淀粉酶进行水解反应的条件下进行水解反应。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，控制所述反应体系的pH值为5.0~12.5、控制进行水解反应的温度为30~65 ℃。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，在向反应体系中添加Ca²⁺的条件下进行水解反应。