CN113913418B - 一种抗胰蛋白酶的碱性果胶酶bpap-11及其应用 - Google Patents

一种抗胰蛋白酶的碱性果胶酶bpap-11及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113913418B
CN113913418B CN202111384724.7A CN202111384724A CN113913418B CN 113913418 B CN113913418 B CN 113913418B CN 202111384724 A CN202111384724 A CN 202111384724A CN 113913418 B CN113913418 B CN 113913418B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gly
val
bpap
asp
lys
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111384724.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113913418A (zh
Inventor
郭庆文
闫宜江
王克芬
王兴吉
张�杰
王金余
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Lonct Enzymes Co ltd
Original Assignee
Shandong Lonct Enzymes Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Lonct Enzymes Co ltd filed Critical Shandong Lonct Enzymes Co ltd
Priority to CN202111384724.7A priority Critical patent/CN113913418B/zh
Publication of CN113913418A publication Critical patent/CN113913418A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113913418B publication Critical patent/CN113913418B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38636—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing enzymes other than protease, amylase, lipase, cellulase, oxidase or reductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/02—Carbon-oxygen lyases (4.2) acting on polysaccharides (4.2.2)
    • C12Y402/02002—Pectate lyase (4.2.2.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种定点突变获得的抗胰蛋白酶的碱性果胶酶BPAP‑11及其基因和应用。所述果胶酶BPAP‑11具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。经过改造获得的BPAP‑11在保持原有高活性的基础上，抗胰蛋白酶的能力大幅度提高，可以作为饲料或洗涤剂的添加剂与胰蛋白酶混合使用而保持较高活性，尤其是洗涤行业，拓宽了酶的应用领域。

Description

一种抗胰蛋白酶的碱性果胶酶BPAP-11及其应用
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种通过定点突变获得的抗胰蛋白酶的碱性果胶酶BPAP-11及其基因和应用。
背景技术：
随着社会的进步和生物技术的发展，为了保护环境、节约资源，满足市场多样化产品的需求，在洗涤液中添加各种生物酶类洗涤助剂，帮助洗涤剂达到更好的洗涤效果的技术手段已经被广泛应用，常见的洗涤用酶有胰蛋白酶、脂肪酶、果胶酶等。
果胶是一类天然的高分子化合物，其成分由半乳糖酵酸与它的甲醋缩合而成。它是植物细胞间质的重要成分，在植物细胞姐织中起粘合作用。果胶质在高等植物中的含量相对偏低，只有不到1％。而在水果、蔬菜和大部分藻类植物中相对较多，最高可达30％，人们在享用美食的过程中经常会将这些含果胶的汁液沾染到衣服上。
果胶酶(pectinase)是指能够分解果胶质的一类酶。果胶酶按阳值来划分，可分为3类：碱性果胶酶、中性果胶酶和酸性果胶酶。碱性果胶酶是一种生物酶制剂，可用于洗涤剂添加助剂。耐碱，可在碱性环境下使用，对纤维胶质有较好的去处作用，减少污染、节约能源，应用较广。
在洗涤剂中添加碱性果胶酶可以去除衣物上的水果蔬菜汁液污渍，但是由于洗涤液中不止添加一种酶，所以其中添加的蛋白水解酶可能会水解其他酶类，降低其他酶类助剂的作用，其中包括碱性果胶酶，针对在洗衣液中添加量较大的胰蛋白酶，本发明提供了一种具有较强抗胰蛋白酶水解能力的碱性果胶酶及其基因。
发明内容：
为了解决上述技术问题，本发明首先提供一种碱性果胶酶突变体BPAP-11，所述突变体具有序列表SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；
本发明还提供上述碱性果胶酶突变体的编码基因；
进一步地，所述编码基因具有序列表SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
本发明还提供包含上述编码基因的重组载体或重组菌株；
进一步地，所述重组载体所采用的表达载体为pUB110、pE194、pUCX05-bgaB、pWB980或pKS1质粒；
优选地，所述表达载体为pKS1质粒；
进一步地，所述重组菌株所采用的宿主细胞可以是芽孢杆菌ED-823、大肠杆菌WB600、大肠杆菌WB700；
优选地，所述宿主细胞为芽孢杆菌ED-823。
本发明还提供上述碱性果胶酶突变体的应用，特别是在洗涤剂领域的应用。
本发明还提供上述重组载体或重组菌株在制备果胶酶中的应用，重组菌株通过液体发酵培养，经过常规方法提取获得果胶酶粗酶；
所述果胶酶突变体BPAP-11具有如下酶学性质：
(1)最适反应温度为30-40℃，在70℃保存10h酶活性仍保持80％以上。
(2)最适反应pH 7.5-11.5。
(3)抗胰蛋白酶抗性增强150倍。
本发明涉及的芽孢杆菌(Bacillus sp.)ED-823，已于2021年8月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23193，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
有益效果：
利用本发明所展示的碱性果胶酶BPAP-11，增强了在胰蛋白酶存在条件下的稳定性，能够更好地应用于与胰蛋白酶混合使用的领域，尤其是洗涤行业，拓宽了酶的应用领域。
附图说明：
图1果胶酶SDS-PAGE蛋白电泳结果
其中，泳道1：原菌产果胶酶，泳道2：重组菌产果胶酶，泳道M：marker；
图2最适反应温度曲线；
图3最适反应pH曲线；
图4碱性果胶酶BP01与BPAP-11的热稳定变化曲线；
图5碱性果胶酶BP01与BPAP-11抗胰蛋白酶活性变化曲线。
具体实施方式：
以下通过具体实施案例对本发明做详细说明，具体实施案例仅为举例说明，不作为对本发明实施范围的限定。
本发明涉及的野生型果胶酶BP01，BP01碱性果胶酶基因含有1311个碱基，编码氨基酸436个，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列序列如SEQ ID NO.2所示。
经过单点位突变后核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其编码的氨基酸序列序列如SEQ ID NO.4所示。突变后亲水性的精氨酸替代亲脂性的异亮氨酸增加了与胰蛋白酶活性位点结合的难度。
经过定点突变后的碱性果胶酶基因可在芽孢杆菌(Bacillus sp.)ED-823中正常表达，与野生型碱性果胶酶BP01相比酶活性及稳定性没有降低，对胰蛋白酶的抗性增加150倍。
以下实施例涉及的培养基及培养条件如下：
(1)平板培养基：酵母浸粉5g/L，氯化钠0.5g/L，氯化钾0.12g/L，氯化钙0.15g/L，硫酸镁2.2g/L，葡萄糖3.6g/L，脱脂奶粉1.7g/L，磷酸二氢钾1.2g/L，磷酸氢二钠0.96g/L，琼脂粉10g/L，其余为水，pH7.0；
平板培养条件：37℃的培养箱中培养1-3天；
(2)液体培养基为上述培养基中不加琼脂粉；
液体培养条件：摇床中37℃，200rpm，培养1-2天，
(3)24深孔板培养基：麦芽糊精20g/L，蛋白胨14g/L，酵母粉3g/L，Na2HPO43g/L，KH2PO44.2g/L，其余为水，pH7.0；
深孔板培养条件：置于摇床中37℃，200rpm，培养1-2天。
实施例1:定点突变与融合质粒
1.碱性果胶酶BP01基因的获得
根据一株筛选获得的枯草芽孢杆菌碱性果胶酶BP01编码基因(SEQ ID NO.1)，进行全基因合成。
2.碱性果胶酶与胰蛋白酶结合位点分析预测
应用BLASTP程序对碱性果胶酶BP01的氨基酸序列进行分析，蛋白结构功能预测(http://smart.embl-heidelberg.de/)，用ClustalW(http：//ebi.ac.uk/ClustalW)进行对比，通过ExPASy的ProtScale进行疏水性分析，比较结果发现第71位氨基酸对碱性果胶酶BP01与胰蛋白酶和碱性蛋白酶的结合位点适应性较高，氨基酸为亲脂性的异亮氨酸，因此推测该氨基酸可能与蛋白酶水解碱性果胶酶BP01有关系。
3.预测结合位点的突变
本发明参考了《一步法定点突变技术快速构建bsh基因突变启动子[J].冯莹颖,张强,周青春,罗勤,张晓莉,秦龙娟.生物技术.2009(05)》重组PCR进行定位诱变的单位点突变技术。采用Site-Directed Mutagenesis Kit(单/多)点突变试剂盒(购自上海翊圣生物科技有限公司)进行Ile71Arg定点突变。
引物
反应体系如下；
成分 体积
ddH2O 32.0μL
10×PCR Buffer 5.0μL
dNTP(2.5mmol/L) 5.0μL
正向突变引物(10mmol/L) 2.0μL
反向突变引物(10mmol/L) 2.0μL
BP01基因 2.0μL
Taq DNA聚合酶(5U/μL) 2.0μL
根据已知碱性果胶酶的保守序列以及分析得到的突变位点设计了正向突变引物Pel1和反向突变引物Pel2，以碱性果胶酶BP01的编码基因作为模板。采用的退火温度为55-65℃。以56℃为例，其反应程序如下。
将扩增得到的片段经核酸电泳验证后，用切胶回收试剂盒(购自上海生工生物)回收得到2条片段分别为P01和P02。根据两条片段测序结果设计引物Pel-03和Pel-04，再分别以两条互为模板，以Pel-03和Pel-04为引物，进行PCR扩增，具体反映体系如下：退火温度为67℃。
成分 体积
ddH2O 32.0μL
10×PCR Buffer 5.0μL
dNTP(2.5mmol/L) 5.0μL
Pel-03(10mmol/L) 2.0μL
Pel-04(10mmol/L) 2.0μL
片段P01 1.0μL
片段P02 1.0μL
Taq DNA聚合酶(5U/μL) 2.0μL
获得上下游产物后进行测序，得到全长基因序列SEQ ID NO.3。
实施例2碱性果胶酶基因的整合表达及氨基酸序列分析
突变后基因命名为bpap-11,通过已知常规基因工程手段经酶切后连接至质粒pKS1上，获得质粒pKS1-bpap-11。
将菌株芽孢杆菌(Bacillus sp.)ED-823制备成电转感受态细胞后，经电转化将整合表达质粒pKS1-bpap-11电转入菌株芽孢杆菌(Bacillus sp.)ED-823，然后取100μL涂布于红霉素(100μg/mL)抗性的LB平板上，置于30℃培养箱中，培养15h。挑取在抗性平板上长出的单菌落，接种到50mL无抗性的LB液体培养基中，置于37℃，200rpm的摇床中培养15h，取100μL涂布于红霉素(100μg/mL)抗性的LB平板上，置于37℃培养箱中，培养15h，长出单菌落转化子，提取质粒测序验证。
取转化成功菌株的冻存管，划线于LB平板，置于37℃培养箱中，培养2-3天，挑取单菌落接种至200mL液体培养基中，于37℃摇床中，200rpm培养至OD600至1.0左右，取2mL接种至摇瓶发酵培养基中，于37℃摇床中，300rpm培养4天，采用国标果胶酶活力测定方法(QB1502-1992)测定发酵液的平均酶活达到65873U/mL。经过蛋白电泳(图1)以及胶条蛋白质测序(上海生工)，获得氨基酸序列SEQ ID NO.4所示的碱性果胶酶BPAP-11。
摇瓶培养基配方为(g/L)：玉米淀粉4，鱼蛋白胨1，豆饼粉2，酵母粉0.4，玉米浆1.5，K2HPO4 4.0，KH2PO4 1.5，pH 7.0，其余为水。
以25℃条件下保藏的野生型碱性果胶酶BP01酶活作为100％参照，此条件下碱性果胶酶BPAP-11酶活为105％，经过不同温度条件下保温10h后检测酶活得到图4所示结果。所构建的重组菌株遗传稳定性高，重组蛋白的分泌表达水平正常，与原碱性果胶酶BP01相比酶活性及稳定性没有降低。
对碱性果胶酶BPAP-11进行最适反应温度和pH测定，结果如图2、3，显示该酶最适反应温度为30-40℃，最适反应pH 7.5-11.5。
实施例3碱性果胶酶抗胰蛋白酶验证
设置胰蛋白酶最适水解条件下，将碱性果胶酶作为底物，反应每30min检测一次碱性果胶酶活性，通过碱性果胶酶的残余活性作为蛋白酶抗性标准，残留酶活越高，胰蛋白酶抗性越强。结果显示胰蛋白酶处理碱性果胶酶3h后，BPAP-11的酶活残留仍然较高，相比于原始碱性果胶酶，BPAP-11对胰蛋白酶的抗性增加150倍，水解处理2h酶活仍然保持60％以上。
胰蛋白酶水解条件：1g碱性果胶酶粉，按酶用量0.5％添加5mg胰蛋白酶，固液比1:3，温度55℃，pH 7.5，水解4h，每30min检测果胶酶酶活。
胰蛋白酶处理完成后，检测残余碱性果胶酶活性，碱性果胶酶检测方法参照国标果胶酶活力测定方法(QB 1502-1992)。检测结果如图5，以25℃条件下保存的野生型碱性果胶酶BP01酶活作为100％参照。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东隆科特酶制剂有限公司
<120> 一种抗胰蛋白酶的碱性果胶酶BPAP-11及其应用
<130> 1
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1311
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 1
atgagtctgc agaaaataaa agaagagatt actgagcggc agtttggaaa agggcattat 60
gatcgatctt ttgatgttac agcgtttggg gctgacggaa gcggaaaaaa ggatgcgacg 120
ggagcgatac aaaaggcgat tgatcaagcc cacaaagcag gcggtggaag agtagcagtt 180
cctgaaggcg tgtttctttc cggtgcactc atactgaaaa gcaatgtgga gcttcatctt 240
gcacaattca cggtgatcaa attcagtcag aacccggaag attatctccc cgttgtgctg 300
acgaggttcg aaggcgtcga gctttataat tattcaccgc tcatctatgc ttacgaagcc 360
gaaaatattg caataaccgg aaagggcacg cttgacggcc aaggtgatga cgaacattgg 420
tggccgtgga aaaggggaac gaacggccag tcttcacagg aaaaagaccg aaatgctttg 480
tttgaaatgg ctgagcgcgg tgtcccggtc ctaaagacgc tgaaggttcc ggtatttcct 540
ttgcggccga acttcattca gccgtatcgc tgcaaagata tattgattca aggtgtcccg 600
gttctgaatt cgccgatgtg gcaagttcat cccgtgcttt gcgagaatgt gacagtggac 660
ggaatctacg tcctgagaca cggtccgaat accgacggag tcaacccgga atcgtgcaaa 720
aacgtggtga tcaagggctg ccattttgat acgatcggaa gcgaaatttc cggcggcgtg 780
ggaaggaacg ccgacgcccg aaggatcaac atgccatcgg agaacattgt cattgaacat 840
aacgaaatga aagacgggca tggaggggtc agtggagatg actgcatcgc cgtcaaatcg 900
aagaatgtca tcgccgaggg aaacctcatg gacagcccga acttggacag agccctccgc 960
attaaaacga attcggtgcg cggcggtgtt cttgaaaaca tctactttca caaaaatacg 1020
gtcaaaagct tgaagcgcga agtgatcgcc atcgatatgg aatatgaaga aggggacgcc 1080
ggagatttca agcccgtcgt ccgcaacatt gatgttgagc agctgaaaag catgggcgga 1140
caatacggga tcagggtgct ggcgtacgat cattctccag tcaccggtct gaaagtgact 1200
gattccgaga tcgacggcgt cgatattccg atggaactga aacatgtgaa agaccctgtt 1260
ttttcgaatc tgtatattaa cggaaaacgc tatgactcac acaaagccta a 1311
<210> 2
<211> 436
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 2
Met Ser Leu Gln Lys Ile Lys Glu Glu Ile Thr Glu Arg Gln Phe Gly
1 5 10 15
Lys Gly His Tyr Asp Arg Ser Phe Asp Val Thr Ala Phe Gly Ala Asp
20 25 30
Gly Ser Gly Lys Lys Asp Ala Thr Gly Ala Ile Gln Lys Ala Ile Asp
35 40 45
Gln Ala His Lys Ala Gly Gly Gly Arg Val Ala Val Pro Glu Gly Val
50 55 60
Phe Leu Ser Gly Ala Leu Ile Leu Lys Ser Asn Val Glu Leu His Leu
65 70 75 80
Ala Gln Phe Thr Val Ile Lys Phe Ser Gln Asn Pro Glu Asp Tyr Leu
85 90 95
Pro Val Val Leu Thr Arg Phe Glu Gly Val Glu Leu Tyr Asn Tyr Ser
100 105 110
Pro Leu Ile Tyr Ala Tyr Glu Ala Glu Asn Ile Ala Ile Thr Gly Lys
115 120 125
Gly Thr Leu Asp Gly Gln Gly Asp Asp Glu His Trp Trp Pro Trp Lys
130 135 140
Arg Gly Thr Asn Gly Gln Ser Ser Gln Glu Lys Asp Arg Asn Ala Leu
145 150 155 160
Phe Glu Met Ala Glu Arg Gly Val Pro Val Leu Lys Thr Leu Lys Val
165 170 175
Pro Val Phe Pro Leu Arg Pro Asn Phe Ile Gln Pro Tyr Arg Cys Lys
180 185 190
Asp Ile Leu Ile Gln Gly Val Pro Val Leu Asn Ser Pro Met Trp Gln
195 200 205
Val His Pro Val Leu Cys Glu Asn Val Thr Val Asp Gly Ile Tyr Val
210 215 220
Leu Arg His Gly Pro Asn Thr Asp Gly Val Asn Pro Glu Ser Cys Lys
225 230 235 240
Asn Val Val Ile Lys Gly Cys His Phe Asp Thr Ile Gly Ser Glu Ile
245 250 255
Ser Gly Gly Val Gly Arg Asn Ala Asp Ala Arg Arg Ile Asn Met Pro
260 265 270
Ser Glu Asn Ile Val Ile Glu His Asn Glu Met Lys Asp Gly His Gly
275 280 285
Gly Val Ser Gly Asp Asp Cys Ile Ala Val Lys Ser Lys Asn Val Ile
290 295 300
Ala Glu Gly Asn Leu Met Asp Ser Pro Asn Leu Asp Arg Ala Leu Arg
305 310 315 320
Ile Lys Thr Asn Ser Val Arg Gly Gly Val Leu Glu Asn Ile Tyr Phe
325 330 335
His Lys Asn Thr Val Lys Ser Leu Lys Arg Glu Val Ile Ala Ile Asp
340 345 350
Met Glu Tyr Glu Glu Gly Asp Ala Gly Asp Phe Lys Pro Val Val Arg
355 360 365
Asn Ile Asp Val Glu Gln Leu Lys Ser Met Gly Gly Gln Tyr Gly Ile
370 375 380
Arg Val Leu Ala Tyr Asp His Ser Pro Val Thr Gly Leu Lys Val Thr
385 390 395 400
Asp Ser Glu Ile Asp Gly Val Asp Ile Pro Met Glu Leu Lys His Val
405 410 415
Lys Asp Pro Val Phe Ser Asn Leu Tyr Ile Asn Gly Lys Arg Tyr Asp
420 425 430
Ser His Lys Ala
435
<210> 3
<211> 1311
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgagtctgc agaaaataaa agaagagatt actgagcggc agtttggaaa agggcattat 60
gatcgatctt ttgatgttac agcgtttggg gctgacggaa gcggaaaaaa ggatgcgacg 120
ggagcgatac aaaaggcgat tgatcaagcc cacaaagcag gcggtggaag agtagcagtt 180
cctgaaggcg tgtttctttc cggtgcactc agactgaaaa gcaatgtgga gcttcatctt 240
gcacaattca cggtgatcaa attcagtcag aacccggaag attatctccc cgttgtgctg 300
acgaggttcg aaggcgtcga gctttataat tattcaccgc tcatctatgc ttacgaagcc 360
gaaaatattg caataaccgg aaagggcacg cttgacggcc aaggtgatga cgaacattgg 420
tggccgtgga aaaggggaac gaacggccag tcttcacagg aaaaagaccg aaatgctttg 480
tttgaaatgg ctgagcgcgg tgtcccggtc ctaaagacgc tgaaggttcc ggtatttcct 540
ttgcggccga acttcattca gccgtatcgc tgcaaagata tattgattca aggtgtcccg 600
gttctgaatt cgccgatgtg gcaagttcat cccgtgcttt gcgagaatgt gacagtggac 660
ggaatctacg tcctgagaca cggtccgaat accgacggag tcaacccgga atcgtgcaaa 720
aacgtggtga tcaagggctg ccattttgat acgatcggaa gcgaaatttc cggcggcgtg 780
ggaaggaacg ccgacgcccg aaggatcaac atgccatcgg agaacattgt cattgaacat 840
aacgaaatga aagacgggca tggaggggtc agtggagatg actgcatcgc cgtcaaatcg 900
aagaatgtca tcgccgaggg aaacctcatg gacagcccga acttggacag agccctccgc 960
attaaaacga attcggtgcg cggcggtgtt cttgaaaaca tctactttca caaaaatacg 1020
gtcaaaagct tgaagcgcga agtgatcgcc atcgatatgg aatatgaaga aggggacgcc 1080
ggagatttca agcccgtcgt ccgcaacatt gatgttgagc agctgaaaag catgggcgga 1140
caatacggga tcagggtgct ggcgtacgat cattctccag tcaccggtct gaaagtgact 1200
gattccgaga tcgacggcgt cgatattccg atggaactga aacatgtgaa agaccctgtt 1260
ttttcgaatc tgtatattaa cggaaaacgc tatgactcac acaaagccta a 1311
<210> 4
<211> 436
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Ser Leu Gln Lys Ile Lys Glu Glu Ile Thr Glu Arg Gln Phe Gly
1 5 10 15
Lys Gly His Tyr Asp Arg Ser Phe Asp Val Thr Ala Phe Gly Ala Asp
20 25 30
Gly Ser Gly Lys Lys Asp Ala Thr Gly Ala Ile Gln Lys Ala Ile Asp
35 40 45
Gln Ala His Lys Ala Gly Gly Gly Arg Val Ala Val Pro Glu Gly Val
50 55 60
Phe Leu Ser Gly Ala Leu Arg Leu Lys Ser Asn Val Glu Leu His Leu
65 70 75 80
Ala Gln Phe Thr Val Ile Lys Phe Ser Gln Asn Pro Glu Asp Tyr Leu
85 90 95
Pro Val Val Leu Thr Arg Phe Glu Gly Val Glu Leu Tyr Asn Tyr Ser
100 105 110
Pro Leu Ile Tyr Ala Tyr Glu Ala Glu Asn Ile Ala Ile Thr Gly Lys
115 120 125
Gly Thr Leu Asp Gly Gln Gly Asp Asp Glu His Trp Trp Pro Trp Lys
130 135 140
Arg Gly Thr Asn Gly Gln Ser Ser Gln Glu Lys Asp Arg Asn Ala Leu
145 150 155 160
Phe Glu Met Ala Glu Arg Gly Val Pro Val Leu Lys Thr Leu Lys Val
165 170 175
Pro Val Phe Pro Leu Arg Pro Asn Phe Ile Gln Pro Tyr Arg Cys Lys
180 185 190
Asp Ile Leu Ile Gln Gly Val Pro Val Leu Asn Ser Pro Met Trp Gln
195 200 205
Val His Pro Val Leu Cys Glu Asn Val Thr Val Asp Gly Ile Tyr Val
210 215 220
Leu Arg His Gly Pro Asn Thr Asp Gly Val Asn Pro Glu Ser Cys Lys
225 230 235 240
Asn Val Val Ile Lys Gly Cys His Phe Asp Thr Ile Gly Ser Glu Ile
245 250 255
Ser Gly Gly Val Gly Arg Asn Ala Asp Ala Arg Arg Ile Asn Met Pro
260 265 270
Ser Glu Asn Ile Val Ile Glu His Asn Glu Met Lys Asp Gly His Gly
275 280 285
Gly Val Ser Gly Asp Asp Cys Ile Ala Val Lys Ser Lys Asn Val Ile
290 295 300
Ala Glu Gly Asn Leu Met Asp Ser Pro Asn Leu Asp Arg Ala Leu Arg
305 310 315 320
Ile Lys Thr Asn Ser Val Arg Gly Gly Val Leu Glu Asn Ile Tyr Phe
325 330 335
His Lys Asn Thr Val Lys Ser Leu Lys Arg Glu Val Ile Ala Ile Asp
340 345 350
Met Glu Tyr Glu Glu Gly Asp Ala Gly Asp Phe Lys Pro Val Val Arg
355 360 365
Asn Ile Asp Val Glu Gln Leu Lys Ser Met Gly Gly Gln Tyr Gly Ile
370 375 380
Arg Val Leu Ala Tyr Asp His Ser Pro Val Thr Gly Leu Lys Val Thr
385 390 395 400
Asp Ser Glu Ile Asp Gly Val Asp Ile Pro Met Glu Leu Lys His Val
405 410 415
Lys Asp Pro Val Phe Ser Asn Leu Tyr Ile Asn Gly Lys Arg Tyr Asp
420 425 430
Ser His Lys Ala
435

Claims (9)

1.一种碱性果胶酶BPAP-11，其特征在于，所述果胶酶BPAP-11的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示。
2.权利要求1所述果胶酶BPAP-11的编码基因。
3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.包含权利要求2所述编码基因的重组载体或重组菌株。
5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体所采用的表达载体为pKS1质粒。
6.如权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株采用的宿主细胞为芽孢杆菌ED-823。
7.如权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株是在芽孢杆菌ED-823中通过质粒pKS1表达SEQ ID NO.3所示的编码基因所得。
8.权利要求4所述重组载体或重组菌株在生产权利要求1所述果胶酶BPAP-11中的应用。
9.权利要求1所述果胶酶BPAP-11在水解果胶中的应用。
CN202111384724.7A 2021-11-22 2021-11-22 一种抗胰蛋白酶的碱性果胶酶bpap-11及其应用 Active CN113913418B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111384724.7A CN113913418B (zh) 2021-11-22 2021-11-22 一种抗胰蛋白酶的碱性果胶酶bpap-11及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111384724.7A CN113913418B (zh) 2021-11-22 2021-11-22 一种抗胰蛋白酶的碱性果胶酶bpap-11及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113913418A CN113913418A (zh) 2022-01-11
CN113913418B true CN113913418B (zh) 2023-10-13

Family

ID=79247947

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111384724.7A Active CN113913418B (zh) 2021-11-22 2021-11-22 一种抗胰蛋白酶的碱性果胶酶bpap-11及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113913418B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102021157A (zh) * 2009-09-23 2011-04-20 中国科学院微生物研究所 一种果胶酶及其编码基因
CN102559638A (zh) * 2010-12-17 2012-07-11 武汉新华扬生物股份有限公司 一种碱性果胶酶pla及其基因和应用
CN108588061A (zh) * 2018-04-28 2018-09-28 湖北大学 一种比酶活及热稳定性提高的低温碱性果胶酶突变体

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102021157A (zh) * 2009-09-23 2011-04-20 中国科学院微生物研究所 一种果胶酶及其编码基因
CN102559638A (zh) * 2010-12-17 2012-07-11 武汉新华扬生物股份有限公司 一种碱性果胶酶pla及其基因和应用
CN108588061A (zh) * 2018-04-28 2018-09-28 湖北大学 一种比酶活及热稳定性提高的低温碱性果胶酶突变体

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
枯草芽孢杆菌产碱性果胶酶发酵条件的优化;王克芬等;江苏调味副食品(第1期);第20-24页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113913418A (zh) 2022-01-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108285900B (zh) 一种重组褐藻胶裂解酶及其构建方法及应用
CN110656099B (zh) 一种40℃下高比活木聚糖酶突变体及其构建方法与应用
US11248246B2 (en) Beta-glucosidase for producing glucose and laminarioligosaccharide from sea weed
CN106591271A (zh) 一株酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体及其应用
CN111269907B (zh) 一种基于loop区域改造的褐藻胶裂解酶突变体及其应用
CN106635846B (zh) 一种高产果胶甲酯酶的黑曲霉菌株
CN112725319B (zh) polyG底物特异性的褐藻胶裂解酶FaAly7及其应用
CN112111472B (zh) 一种新型β-木糖苷酶及其制备
CN111690629B (zh) 一种内切葡聚糖苷酶突变体、基因、工程菌及其应用
CN105802943B (zh) 一种性能改善的普鲁兰酶嵌合体及高产该嵌合体的巴斯德毕赤酵母突变株
CN113862241A (zh) 一种壳聚糖酶Csncv及其突变体CsnB和应用
CN111826363A (zh) 一种右旋糖酐蔗糖酶突变体及其制备方法与应用
KR101062978B1 (ko) 신균주 페니실륨 피노필럼 ｋｍｊ601 유래 엔도글루카네이즈의 생산 최적화 및 유전자 클로닝
CN112553183B (zh) 一种糖苷水解酶CmChi3及其在降解水解胶体几丁质上的应用
CN107164346B (zh) 一种碱性耐盐普鲁兰酶PulA及其基因和应用
CN113913418B (zh) 一种抗胰蛋白酶的碱性果胶酶bpap-11及其应用
CN105316300A (zh) 一种高温活性和热稳定性提高的α-淀粉酶突变体ApkA-m及其制备方法和应用
CN110184258B (zh) 一种普鲁兰酶突变体
Champreda et al. Purification, biochemical characterization, and gene cloning of a new extracellular thermotolerant and glucose tolerant maltooligosaccharide-forming α-amylase from an endophytic ascomycete Fusicoccum sp. BCC4124
CN113755473B (zh) 分泌表达量提高的葡萄糖淀粉酶突变体m5及其基因和应用
CN110616211B (zh) 一种α-淀粉酶、编码基因、载体、宿主及其应用
CN108102934A (zh) 一种高产果胶裂解酶的黑曲霉菌株
CN109628429B (zh) 一种极端嗜盐、耐表面活性剂的非钙离子依赖型α-淀粉酶及其基因和应用
CN107236772A (zh) 一种制备褐藻寡糖的方法
CN108060149B (zh) 一种魔芋甘露寡糖的制备方法及其专用β-甘露聚糖酶突变体

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant