CN108588061A

CN108588061A - 一种比酶活及热稳定性提高的低温碱性果胶酶突变体

Info

Publication number: CN108588061A
Application number: CN201810396518.XA
Authority: CN
Inventors: 张桂敏; 唐雨蒙; 巫攀; 易犁; 马延和
Original assignee: Hubei University
Current assignee: Hubei University
Priority date: 2018-04-28
Filing date: 2018-04-28
Publication date: 2018-09-28
Anticipated expiration: 2038-04-28
Also published as: CN108588061B

Abstract

本发明公开了一种比酶活及热稳定性提高的低温碱性果胶裂解酶突变体。该突变体具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列基础上缺失、替换、插入或/和添加一个至几个氨基酸的保守性突变而获得的具有低温碱性果胶裂解酶活性的氨基酸序列。本发明提供的突变体的比酶活及热稳定性均有较大幅度的提高，更加适合纺织脱胶、洗涤等领域工业化生产的需要，满足社会生产的需求。

Description

一种比酶活及热稳定性提高的低温碱性果胶酶突变体

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种比酶活和热稳定性提高的低温碱性果胶裂解酶突变体。

背景技术

果胶酶是指能够催化果胶质分解的多种酶的总称。果胶酶最初是由MacDonnell从桔子里提取得到的。果胶质——果胶酶的作用底物广泛存在于高等植物中，是植物细胞间质和初生细胞壁的重要组分，在植物细胞组织中起着“黏合”作用。果胶质结构化学的研究表明，果胶质的化学结构比较复杂，能够催化其分解的果胶酶也是种类繁多。果胶酶根据分解糖苷键的反应性质或降解底物的性质可以分为3大类：果胶水解酶、果胶裂解酶和果胶酯酶。果胶酶按其作用最适pH分为酸性果胶酶和碱性果胶酶。碱性果胶酶是在碱性范围内具有较高活性的果胶酶，酸性果胶酶主要用于水果榨汁和果汁澄清，其酶作用最适pH在偏酸性范围。碱性果胶酶的研究可扩展果胶酶的应用范围。碱性果胶酶是非常重要的工业酶制剂之一，具有不可估量的潜在应用价值。

碱性果胶酶的作用最适pH在8.0-10.0，在植物药类提取、茶和咖啡发酵，榨油，纺织、造纸、洗涤剂、植物纤维加工、含果胶工业废水处理及生物技术等行业的应用成为人们研究的热点。微生物产生的碱性果胶酶在工业上有着很好的应用，作为棉织物染印煮练过程中至关重要的酶制剂，碱性果胶酶的研发以及其在织物染印煮练中的应用，使绿色、温和的生物煮练技术成为可能。在碱性条件下，作为棉纤维主体的纤维素有润胀的趋向，而果胶酶利用其专一性有效分解去除在棉纤维表面对棉蜡等疏水性共生物起黏结作用的果胶质，使疏水性物质从棉纤维表面脱落，从而达到精练效果，而纤维本身不受到损伤。因此，经生物精练的棉纤维能最大程度的保持纤维强度，失重小，织物手感柔软厚实，且富有弹性。并且可节约大量工艺用水、生产时间、能耗、原料及对废水的处理费用，减少对环境排放水中的盐含量及COD值等。因此，低温碱性果胶酶在工业应用中有更好的应用价值。

本发明人前期研究的碱性果胶酶基因来自专利201710497480.0，含有993bp的开放阅读框，编码331个氨基酸，将该基因pel1在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达所得低温碱性果胶裂解酶经纯化后进行酶学性质分析的研究表明，该酶的最适温度为30℃，最适pH为10.0，比酶活为275.023U/mg，可以有效地降解聚半乳糖醛酸，但是其热稳定性不好，在40℃处理5分钟酶活只有原来的23％，不利于工业应用，因此通过分子改造方法提高该低温碱性果胶裂解酶的热稳定性具有重要意义。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的目的是提供一种低温碱性果胶裂解酶突变体，尤其是一种与低温碱性果胶裂解酶的比酶活及热稳定性显著关联的突变位点，以及一种具有更高热稳定性的低温碱性果胶裂解酶突变体及其编码基因和制备方法。

为了实现本发明的技术目的，发明人通过大量试验摸索和研究，最终以野生型低温碱性果胶裂解酶的基因为模板，采用定点突变技术获得编码突变体的基因，随后将编码突变体的基因位点进行重组表达，获得了一种比酶活和热稳定性提高的低温碱性果胶裂解酶突变体。具体地，本发明的技术方案概况如下：

一种与低温碱性果胶裂解酶的比酶活及热稳定性显著关联的突变位点，该突变位点位于野生型低温碱性果胶裂解酶的184和185氨基酸处，该位点是将184位点的谷氨酸突变为天冬氨酸，185位点的赖氨酸突变为丝氨酸，突变后低温碱性果胶裂解酶的比酶活及热稳定性显著提高。

由于按上述突变位点突变后得到的低温碱性果胶裂解酶的比酶活及热稳定性显著提高，因此本发明还保护上述的突变位点在提高低温碱性果胶裂解酶的比酶活及热稳定性中的应用。

一种比酶活及热稳定性提高的低温碱性果胶裂解酶突变体，所述突变体具有SEQID NO.1所示的氨基酸序列；或在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列基础上缺失、替换、插入或/和添加一个至几个氨基酸的保守性突变而获得的具有低温碱性果胶裂解酶活性的氨基酸序列。

需要说明的是，本发明所提供的低温碱性果胶裂解酶突变体属于果胶酶超家族中的一员。SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列由328个氨基酸残基组成，主要是将来源于M.eurypsychrophila的野生低温碱性果胶裂解酶的第184位的谷氨酸Glu突变成天冬氨酸Asp,第185位的赖氨酸Lys突变成丝氨酸Ser。所得突变体命名为E184D/K185S。

一种低温碱性果胶裂解酶突变体的编码基因，该基因编码：(a)具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的蛋白质；或(b)具有衍生自缺失、置换、插入或添加一个至几个氨基酸的SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列并具低温碱性果胶裂解酶活性的蛋白质。

进一步优选地，如上所述的低温碱性果胶裂解酶突变体的编码基因，其特征在于，所述基因为(i)、(ii)或(iii)的DNA分子：

(i)具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的DNA分子；

(ii)在严格条件下与(i)所述的核苷酸序列杂交且编码具有低温碱性果胶裂解酶活性的蛋白质的DNA分子；

(iii)与(i)或(ii)所述DNA分子的核苷酸序列具有90％以上同源性的核苷酸序列的DNA分子。

本发明还提供一种重组载体，该重组载体携带上述的低温碱性果胶裂解酶突变体的编码基因。所述重组载体为将上述编码基因插入出发载体(例如：pET26b)的多克隆位点得到的重组表达载体。可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

本发明还提供一种重组菌，该重组菌包含上述的重组载体。例如，将上述任一所述编码基因插入出发载体(例如：pET26b载体)的多克隆位点得到的重组表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌。

本发明还提供一种制备低温碱性果胶裂解酶突变体的方法，该方法包括培养上述的重组菌并由培养产物中收集低温碱性果胶裂解酶突变体。

进一步优选地，如上所述制备低温碱性果胶裂解酶突变体的方法，其以TB液体培养基为发酵培养基，所述重组菌在37℃培养至OD₆₀₀＝2-2.5，加入IPTG后在18℃进行诱导表达25-35h，将所得菌液离心后收集发酵上淸，即为低温碱性果胶裂解酶粗酶液，该低温碱性果胶裂解酶粗酶液中含有低温碱性果胶裂解酶突变体。

进一步优选地，如上所述制备低温碱性果胶裂解酶突变体的方法，其中的发酵上清经过GE HiTrap SP FF阳离子交换柱纯化以及GE-desalting柱脱盐，得到纯化后的低温碱性果胶裂解酶突变体。

与现有技术相比，本发明通过定点突变的方法改造低温碱性果胶裂解酶基因，使所编码的低温碱性果胶裂解酶突变体PEL1活性大幅度提高，比酶活显著增强，热稳定性明显提高，具体试验数据显示，突变后的低温碱性果胶裂解酶突变体比酶活为559.584U/mg，相比野生低温碱性果胶裂解酶的比酶活提高了1倍多，热稳定性提高了数十倍。因此，本发明提供的PEL1的比酶活及热稳定性均有较大幅度的提高，更加适合纺织脱胶领域工业化生产的需要，满足社会生产的需求。

附图说明

图1低温碱性果胶裂解酶SDS-PAGE电泳图；

图2低温碱性果胶裂解酶热稳定性曲线图。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、低温碱性果胶裂解酶突变体E184D/K185S的获得

根据野生型低温碱性果胶裂解酶基因pel1的核苷酸序列设计点突变引物对如下：

E184D/K185S-F：5'CAGCGATAGCGACACCCTCAAT 3'

E184D/K185S-R：5'GTGTCGCTATCGCTGTAACCATTGA 3'

以质粒pET26a-pel 1为模板，用设计的引物对进行PCR扩增。

PCR反应体系：

PCR反应条件：98℃预变性30s，然后98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸30s，25个循环，最后72℃延伸30s。

PCR产物用0.7％琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用DNA纯化试剂盒纯化。将纯化后的PCR产物用DpnI进行去甲基化，转化到大肠杆菌XL-Gold克隆感受态细胞(购自Stratagene)中，挑选两个转化子进行测序得到正确点突变的重组载体pET28a-pel E184D/K185S，该重组载体上携带有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码SEQ ID NO.1所示的突变体。

实施例2、低温碱性果胶裂解酶的表达纯化

将质粒pET26b-pel1、pET26b-pelE184D/K185S分别转入BL21(DE3)中，获得重组菌BL21(DE3)/pET26b-pel1、BL21(DE3)/pET26b-pelE184D/K185S。

将两种重组菌BL21(DE3)/pET26b-pel1、BL21(DE3)/pET26b-pelE184D/K185S分别培养于含有50μg/ml卡那霉素的TB培养基中，37℃培养3h；OD₆₀₀＝2.0-2.5时，加入IPTG至其在LB培养基中的终浓度0.5mM，转至18℃继续培养25-30h。

5000rpm、10min离心收集发酵上淸，将上清液用脱盐柱GE HiTrap Desalting进行脱盐处理，用溶液C(50mM Tris-HCl，pH 7.0)进行洗脱，得到的洗脱液再过阴离子交换柱GEHiTrap SP FF，先用溶液D(20mM Tris-HCl，pH7.5)洗脱杂蛋白，再用溶液E(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，pH7.5)和溶液D梯度混合洗脱目的蛋白，最后再用脱盐柱GE HiTrapDesalting进行脱盐处理，用溶液F(50mM glycine-NaOH，pH 10.0)进行洗脱,分别得到Pel1与E184D/K185S纯酶液。

SDS-PAGE电泳显示纯化的PEL1、E184D/K185S，蛋白的分子量均约为35kDa，列于图1,图中1为野生型低温碱性果胶裂解酶PEL1，2为突变体E184D/K185S。

实施例3、低温碱性果胶裂解酶Pel1与E184D/K185S的比酶活比较

一、果胶酶酶活的测定方法

将PGA溶液于30℃预热5min；取20μl酶稀释液，加入2ml含0.2％PGA的缓冲液启动酶促反应；反应条件为30℃，15min，再用3ml 0.03mol/L的磷酸终止反应，在235nm处测定其吸光度值。

空白对照：无活性的酶液反应(即：先取3ml磷酸与待测酶液混匀，如上述反应条件反应，再加入底物终止反应)。

酶活计算：

式中：4600(L^.mol^-1cm^-1)—不饱和PGA在235nm处的摩尔吸光系数；

t(min)—酶促反应时间(在酶反应的线性范围内)；

b(cm)—石英比色杯厚度；

简化得：酶活(U/ml)＝3.6232x稀释倍数xOD₂₃₅。

二、蛋白浓度测定方法

根据BI0-RAD Quick Start^TM Bradford Protein Assay Kit(购自BI0-RAD公司，货号No.:5000201)使用说明，取纯的BSA小牛血清蛋白，根据其纯度同0.05mol/L Gly-NaOHpH10.0缓冲液配制成0.5mg/ml蛋白溶液。吸取标准蛋白溶液0、1、2、4、8、12、16和20μl，用Gly-NaOH缓冲液定容至20μl；样品蛋白与Gly-NaOH pH10.0缓冲液以一定比例混合，总体积为20μl。取5μl蛋白溶液与200μl1x dye reagent反应5min,在595nm处测定吸光度OD值，绘制蛋白浓度与OD595的标准曲线。

三、比酶活比较

利用测得酶活除以蛋白浓度得到比酶活，实验结果列于表1，将野生酶与突变酶相比，可以发现突变酶的比酶活和野生酶相比有大幅度的提高，突变后的低温碱性果胶裂解酶突变体比酶活提高至559.584U/mg，是野生型的2.03倍。

表1野生酶与低温碱性果胶裂解酶突变体的比酶活比较

实施例4、低温碱性果胶裂解酶的热稳定性比较

用pH10.0的50mM glycine-NaOH缓冲液稀释实施例2中的PEL1与突变体E184D/K185S纯酶液，用稀释后的酶液以聚半乳糖醛酸为底物进行酶活测定。将稀释后的酶液记作稀释酶液。

将稀释酶液在40℃水浴放置10分钟，每隔5min取样测定酶的残余活性。结果显示，低温碱性果胶裂解酶PEL1在40℃处理5分钟丧失75％活性，10分钟后几乎完全丧失了活性。而突变体E184D/K185S在40℃处理5分钟保持稳定，10分钟后还能保持90％以上的活性。实验结果列于图2，将野生酶与突变酶相比，可以发现突变酶的热稳定性和野生酶相比有大幅度的提高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖北大学

<120> 一种比酶活及热稳定性提高的低温碱性果胶酶突变体

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 328

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Pro Val Gly Tyr Gly Ala Ala Thr Thr Gly Gly Gly Asn Lys Ala

1 5 10 15

Ala Val Asn Val Ser Ser Leu Ala Asp Met Ala Ala Lys Ile Lys Ala

20 25 30

Tyr Ser Gly Ser Gly Gly Leu Val Leu Asn Tyr Thr Gly Lys Phe Asp

35 40 45

Phe Ala Ser Ile Lys Asp Val Cys Ala Gln Trp Lys Lys Pro Ala Gln

50 55 60

Thr Leu Glu Ile Lys Gly Lys Asn Asp Ile Thr Ile Arg Gly Ala Ala

65 70 75 80

Asp Ser Ser Ala Asn Phe Gly Ile Arg Ile Val Gly Asp Ser Ser Asn

85 90 95

Val Ile Val Gln Asn Met Thr Ile Gly Leu Leu Gln Gly Gly Glu Asp

100 105 110

Ala Asp Ser Ile Ser Ile Glu Gly Thr Ser Ser Gly Lys Pro Ser Lys

115 120 125

Val Trp Ile Asp His Asn Thr Ile Phe Ala Ser Ile Lys Ser Cys Pro

130 135 140

Gly Ala Gly Asp Ala Ser Phe Asp Gly Gly Ile Asp Met Lys Lys Gly

145 150 155 160

Ala Asn His Ile Thr Val Ser Tyr Asn Tyr Val Tyr Asn Tyr Gln Lys

165 170 175

Val Ala Leu Asn Gly Tyr Ser Asp Ser Asp Thr Leu Asn Ala Gly Ser

180 185 190

Leu Thr Thr Tyr His Asn Asn Arg Phe Glu Asn Val Lys Ser Arg Leu

195 200 205

Pro Leu Leu Arg Tyr Gly Lys Ala His Ile Phe Asn Asn Tyr Phe Gly

210 215 220

Asn Val Asp Thr Ser Gly Ile Asn Val Arg Met Gly Ala Met Ala Leu

225 230 235 240

Val Glu Ser Asn Tyr Phe Glu Asn Val Arg Asn Pro Val Thr Ser Arg

245 250 255

Asp Ser Ala Lys Leu Gly Tyr Trp Asp Leu Arg Ser Asn Phe Val Gly

260 265 270

Ser Gly Ile Thr Trp Gly Ala Pro Glu Asp Gly Ile Tyr Ala Asn Ala

275 280 285

Thr Asp Trp Lys Thr Thr Lys Ala Tyr Gly Pro Thr Gly Tyr Asn Tyr

290 295 300

Thr Ala Ser Ala Ala Ala Gly Val Lys Ala Lys Ala Ile Ala Thr Ala

305 310 315 320

Gly Ala Arg Thr Asn Leu Ala Gln

325

<210> 2

<211> 984

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gggccggtgg gctacggcgc cgccaccacg ggcggtggca acaaggccgc cgtgaacgta 60

tcttcgctgg ccgacatggc cgccaagatc aaggcgtatt cgggtagcgg cggcctggta 120

ctgaactaca ccggcaagtt cgacttcgcc agcatcaagg atgtctgcgc acagtggaag 180

aagccggccc agaccctgga aatcaagggc aagaacgaca tcacgatccg cggcgcggcc 240

gattcgtccg ccaacttcgg catccgtatc gtgggcgatt cgagcaacgt gatcgtgcag 300

aacatgacca tcggcctgct gcagggtggc gaagacgccg actcgatctc gatcgaaggc 360

acgtcgagcg gcaagccaag caaggtctgg atcgaccaca acaccatttt cgcttcgatc 420

aagtcgtgcc ctggcgcggg cgatgcctcg ttcgacggcg gcatcgacat gaagaagggc 480

gccaaccaca tcaccgtgtc gtacaactac gtgtacaact accagaaggt ggcgctcaat 540

ggttacagcg atagcgacac cctcaatgcc ggatcgctga ccacctacca caacaaccgc 600

ttcgagaacg tcaagtcgcg cctgccgctg ctgcgttacg gtaaagccca catcttcaac 660

aactacttcg gcaacgtgga cacctcgggc atcaatgtgc gcatgggcgc gatggcgctg 720

gtcgaatcga actacttcga gaacgtcagg aacccggtca cctcgcgcga cagcgccaaa 780

ctcgggtact gggacctgcg cagcaacttc gtcggcagcg gcattacctg gggcgcgccg 840

gaagacggca tttacgccaa tgccaccgac tggaagacca ccaaggccta cggcccgacc 900

ggctacaact acaccgccag cgcggctgcg ggcgtgaaag cgaaagccat cgccaccgcc 960

ggtgcgcgca ccaacctggc ccag 984

Claims

1.一种与低温碱性果胶裂解酶的比酶活及热稳定性显著关联的突变位点，其特征在于，该突变位点位于野生型低温碱性果胶裂解酶的184和185氨基酸处，该位点是将184位点的谷氨酸突变为天冬氨酸，185位点的赖氨酸突变为丝氨酸，突变后低温碱性果胶裂解酶的比酶活及热稳定性显著提高。

2.权利要求1所述的突变位点在提高低温碱性果胶裂解酶的比酶活及热稳定性中的应用。

3.一种比酶活及热稳定性提高的低温碱性果胶裂解酶突变体，其特征在于，所述突变体具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列基础上缺失、替换、插入或/和添加一个至几个氨基酸的保守性突变而获得的具有低温碱性果胶裂解酶活性的氨基酸序列。

4.一种低温碱性果胶裂解酶突变体的编码基因，其特征在于，该基因编码：(a)具有SEQID NO.1所示的氨基酸序列的蛋白质；或(b)具有衍生自缺失、置换、插入或添加一个至几个氨基酸的SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列并具低温碱性果胶裂解酶活性的蛋白质。

5.根据权利要求4所述的低温碱性果胶裂解酶突变体的编码基因，其特征在于，所述基因为(i)、(ii)或(iii)的DNA分子：

(i)具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的DNA分子；

6.一种重组载体，其特征在于，该重组载体携带权利要求4或5所述的低温碱性果胶裂解酶突变体的编码基因。

7.一种重组菌，其特征在于，包括权利要求6所述的重组载体。

8.一种制备低温碱性果胶裂解酶突变体的方法，其特征在于，该方法包括培养权利要求7所述的重组菌并由培养产物中收集低温碱性果胶裂解酶突变体。

9.根据权利要求8所述制备低温碱性果胶裂解酶突变体的方法，其特征在于，该方法以TB液体培养基为发酵培养基，所述重组菌在37℃培养至OD₆₀₀＝2-2.5，加入IPTG后在18℃进行诱导表达25-35h，将所得菌液离心后收集发酵上淸，即为低温碱性果胶裂解酶粗酶液，该低温碱性果胶裂解酶粗酶液中含有低温碱性果胶裂解酶突变体。

10.根据权利要求9所述制备低温碱性果胶裂解酶突变体的方法，其特征在于，所述的发酵上清经过GE HiTrap SP FF阳离子交换柱纯化以及GE-desalting柱脱盐，得到纯化后的低温碱性果胶裂解酶突变体。