CN107460176B - 一种过氧化物酶DyP35基因及其表达蛋白和应用 - Google Patents

一种过氧化物酶DyP35基因及其表达蛋白和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种过氧化物酶DyP35基因及其表达蛋白和应用；本发明所涉及的过氧化物酶DyP35，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；本发明还公开了表达上述染料脱色酶的基因，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示；本发明还公开了上述染料脱色酶的纯化方法及其在去除印染染料、造纸黑液脱色、木质素加工和果汁生产苯酚聚合中的应用；本发明的过氧化物酶DyP35对苯环类染料和木质素分解产物具有高效的脱色活性，具有巨大的应用前景。

Description

一种过氧化物酶DyP35基因及其表达蛋白和应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种过氧化物酶DyP35基因及其表达蛋白和应用。
背景技术
过氧化物酶是一种氧化还原酶，可以利用过氧化氢氧化各种有机物和无机物，在生物合成降解等过程中发挥重要作用。具有染料脱色功能的过氧化物酶最初大部分在真菌发现，例如1995年发现的含有亚铁血红素的过氧化物酶可以使18种不同类型的染料脱色，随后在细菌中也发现了具有染料脱色功能的过氧化物酶，例如YcdB是从大肠杆菌中分离出来的一种染料脱色功能的过氧化物酶。
现有的染料脱色方法主要是物理和化学方法，不仅工艺复杂而且成本高昂。而发现和公开的具有染料脱色功能的酶存在一些缺陷限制了实际应用，例如一些染料脱色酶对反应条件要求苛刻，需要在酸性条件下酶才具有较好的活性，而废水通常呈碱性，限制了应用，此外现有报道的一些染料脱色酶活性较低，造成脱色成本高等问题限制了进一步的应用。
食丝氨酸丛毛单胞菌（Comamonas serinivorans SP35，DSM 26136T）是从山东郓城某农场小麦秸秆堆肥中筛选到的一株能够降解木质素的丛毛单胞菌，它可利用木质素、对香豆酸、阿魏酸、芥子酸、香草醛和对羟基苯甲酸等物质作为唯一碳源生长，该菌已保藏并有文章发表。（Zhu D, Xie C, Huang Y, et al. Description of Comamonasserinivorans sp. nov., isolated from wheat straw compost [J]. Internationaljournal of systematic and evolutionary microbiology, 2014, 64(12): 4141-4146.）
深入研究食丝氨酸丛毛单胞菌中染料脱色过氧化物酶并探讨其脱色的酶学性质和机制，可以利用基因工程技术将染料脱色过氧化物酶转化或者转移到特定的载体进行高效表达，从而为获得大量染料脱色过氧化物酶并在工业上应用提供了技术可能性，并展现出巨大的应用潜力。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的问题，例如真菌来源的染料脱色过氧化物酶，真菌生长周期长，酶活低，不利于工业化生产以及传统的物理化学方法处理废水的效果差成本高的问题，以及一些细菌来源的染料脱色过氧化物酶最适pH为酸性环境，不适用于实际的废水处理环境偏碱性的情况；进而提供一种高活力的染料脱色过氧化物酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供一种编码上述染料脱色过氧化物酶的基因，其DNA序列如SEQ IDNO.1所示。
本发明还提供一种包含上述染料脱色过氧化物酶基因的重组表达载体，所述载体是将本发明所述的染料脱色过氧化物酶基因分别与质粒片段链接获得重组表达载体。所述表达载体是指大肠杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、枯草芽孢杆菌表达载体、酵母菌表达载体或丝状真菌表达载体等。
本发明还提供一种包含上述染料脱色过氧化物酶基因DyP35的重组细胞，所述重组细胞中宿主细胞为原核或真核细胞，原核细胞如细菌细胞，真核细胞包括酵母或丝状真菌，优选大肠杆菌（Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM109、Escherichia coli DH5a等）、乳酸菌（Lactococcus lactis NZ3900）、酵母菌(Pichia pastoris)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilits BS168)和丝状真菌(Aspergillus niger)。
本发明所述染料脱色过氧化物酶DyP35的制备方法步骤包括：在有利于所述染料脱色过氧化物酶产生的条件下培养上述宿主细胞，从该细胞和/或培养基中回收所述染料脱色过氧化物酶。用于培养上述细胞的培养基可以是任何适于这种宿主细胞生长并能表达本发明的染料脱色过氧化物酶常规培养基。
本发明所述染料脱色过氧化物酶DyP35从培养基中收集可以通过常规方法进行，该方法包括：通过离心或者过滤从培养基中分离细胞；用盐，如硫酸铵沉淀上清液或者滤液中的蛋白质成分；然后用层析方法纯化，包括凝胶过滤、亲和离子交换等层析方法。
本发明还提供上述染料脱色过氧化物酶DyP35的用途，所述用途为对染料的脱色降解。具体的，所述用途包括但不限于：
（1）作为造纸过程添加物（包括促进制浆处理；提高纸浆的漂白率；造纸黑液的处理）；
（2）作为食品加工过程添加物（包括提高加工物的产量和过滤效率；处理果汁加快果汁中的酚类化合物的沉淀）；
（3）作为纺织品加工过程添加物（包括纺织品的酶解）；
（4）作为饲料添加物（包括提高饲料的可消化性和营养价值）；
（5）作为废水处理过程添加物（提高对废水中的芳香环类化合物的降解处理，减少环境污染）；
（6）作为木质素生产过程添加物（提高木质素的降解效率和促进获得目的产品）；
（7）作为木质纤维素生产过程添加物（提高木质纤维素的降解效率）。
与现有技术相比较，本发明的有益效果如下：
本发明根据食丝氨酸丛毛单胞菌（Comamonas serinivorans SP35，DSM 26136T）全基因组序列通过基因合成获得染料脱色过氧化物酶DyP35的全长序列，并且与pET-28a(+)表达载体相连接构建重组质粒后通过插入到Arctic Expression(DE3)感受态细菌中，从而获得工程菌株，通过镍柱纯化获得纯化的染料脱色过氧化物酶DyP35。与公开的脱色酶相比较，其优势在于酶活性高，在中性或弱碱性反应条件下酶活性均较高，对难降解的染料的脱色效率高，并且具有很大范围的底物专一性，由于其底物的多样性，染料脱色过氧化物酶DyP35具有潜在的多领域工业应用前景；其中包括造纸、果汁生产、纺织品的生产、废水的处理以及木质素的生产。
附图说明
图1为提取纯化的过氧化物酶DyP35的蛋白电泳结果图；图中A为纯化后的DyP35蛋白；B为未纯化的蛋白。
图2为染料脱色过氧化物酶DyP35对染料脱色率（%）的比较曲线图。
具体实施方式
本发明人经过大规模筛选和深入的研究，从食丝氨酸丛毛单胞菌中克隆到了一个染料脱色过氧化物酶基因，并成功在宿主细胞中得到了高效表达分泌，具有良好的应用于工业生产的潜能。
根据下述实施例可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所描述的发明。
实施例1：蛋白的纯化
（1）硫酸铵沉淀：将食丝氨酸丛毛单胞菌SP35于LB培养基（加入1g/L的木质素作为诱导剂）中培养24h，然后12000 rpm 离心收集菌体，用缓冲液（Tris-盐酸，pH 8.0）洗涤一次后重新离心，然后置于冰上超声破碎，15000 rpm高速离心20 min，提取上清液然后在磁力搅拌器上搅拌并分段加入硫酸铵然后离心获得不同阶段的蛋白质沉淀，然后检测活性，收集高活性的硫酸铵沉淀浓度阶段的蛋白质，然后透析除去硫酸铵。
（2）离子交换柱层析：将透析得到的蛋白溶液经过DEAE-Sepharose CL-6B 层析柱纯化，用五倍柱床体积的50 mmol/L Tris-HCl进行线性洗脱，流速1mL/min，收集样品经过SDS-PAGE确定富含蛋白的目的峰，然后超滤浓缩，获得纯化的酶（图1），然后冷冻保藏；所得酶浓度为2.66mg/mL。
实施例2：氨基酸序列测定
将实施例1获得的单一蛋白条带进行Edman降解法N末端测序（苏州泓讯生物科技股份有限公司），得到该脱色酶的氨基酸序列，如SEQ ID NO.2所示。将该序列在GENEBANK数据库中进行比对分析，确定该蛋白属于过氧化物酶类，命名为DyP35，同时获得该酶基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示。
实施例3：染料脱色过氧化物酶DyP35的工程菌的构建
（1）染料脱色过氧化物酶DyP35基因的合成
利用体外全基因合成方法合成染料脱色过氧化物酶DyP35的全长基因（苏州泓讯生物科技股份有限公司合成）。
（2）染料脱色过氧化物酶DyP35基因的处理与连接
将染料脱色过氧化物酶DyP35基因片段用T4DNA Polymerase处理后，与质粒pET-28a(+) （苏州泓讯生物科技股份有限公司）DNA室温链接 20 min。
（3）重组质粒在大肠杆菌BL21的转化
将连接产物加入到50 µL E.coli Arctic Expression(DE3) 感受态细胞中，冰浴30 min，然后热激60 s后继续冰浴2 min，然后加入250µL LB培养基，37℃下培养1 h。随后取100 µL培养液涂含有抗生素的LB平板，过夜培养，获得含有染料脱色过氧化物酶DyP35基因的工程菌。
（4）按照实施例1的方法提取纯化重组过氧化物酶DyP35。
实施例4：重组染料脱色过氧化物酶DyP35对各染料的脱色效果
酶液的制备：采用实施例3所获得纯化后的DyP35酶，对照酶选用来自红球菌的RHA1,制备方法同DyP35，红球菌来源的RHA1是最早发现的用于脱色的细菌来源的脱色酶，也是脱色领域中典型的过氧化物酶，故选用该酶作为对照；并将本发明所述的DyP35酶进行灭活，对染料脱色实验，作为对比。
2 mL脱色体系中，包含各染料的最终浓度为50 mg/L、磷酸盐缓冲液、给酶量0.5IU/mL、HBT（1-羟基-苯并-三氮唑）的终浓度为0或者0.1g/L，脱色体系的pH 为7.5，温度35℃，分别在时间为1、2、3、4、12 h时，测定各反应液在相应染料最大吸收波长处的吸光值（A1），同时以对照酶液和灭火酶液作为对照，同样方法测得其吸光值A0，脱色率为R=A0-A1/A0X100%。
本实施例中采用的染料有雷玛唑亮蓝、活性艳蓝X-GR、刚果红、考马斯亮蓝、孔雀石绿、溴酚蓝几种染料来考察过氧化物酶DyP35的脱色降解效果。
结果如图2所示，重组染料脱色过氧化物酶DyP35对各染料均具有较好的脱色效果，在1-12 h以内随着时间延长，脱色程度增加，前六个小时脱色速率最快，12 h对染料的脱色基本完成，与对照酶相比，降解率非常高，而灭活酶（活性艳蓝X灭活）的降解效率为0，证实数据的可靠性。由此可见，本发明的染料脱色过氧化物酶活性高，能够在中性或者弱碱性条件下仍然具有较强的活性，并且具有很大范围的底物专一性，由于其底物的多样性，能同时对多种染料进行脱色处理，并达到很好的效果。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏大学
<120> 一种过氧化物酶DyP35基因及其表达蛋白和应用
<130> 一种过氧化物酶DyP35基因及其表达蛋白和应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 960
<212> DNA
<213> 食丝氨酸丛毛单胞菌（Comamonas serinivorans SP35）
<400> 1
atggcggccg catccgacat tgaacccaca cccaccatga gtttccacac ccaagccacc 60
acgcacgaac ccaaccacaa cgcgatgttc atggtctggg tgctcaaagc cggcgtggac 120
gccaagccgg cgtttcgggc gctgtgcgcc ctggtcgaga acctgaacaa ctcggccgcc 180
gcgcggtttc cgggcacaca ggccagctgt gtgctgggca tcggccatcg cgcctggcag 240
gccctggccc tgccgcagcc gcagccgcgc gagctggtcg agttcacccc catcgccggc 300
gaccggcaca cggccgtggc cacgcccggt gacctgcacc tgcacctgcg gggcgccgat 360
ttcagcctgt gtgtggacat ggcgatgcag atccgccagc ggctgcaggc ggtggccgac 420
tgcgtggtgc aggtgtcggg ctttcgctac tgggatggcc gctccatcct cgggtttgtc 480
gacggcaccg aaaacccgca gggggatgag cgcgatttct tcgcccaggt ggggcccgag 540
gacgccgcct atgaaggcgg cagctacctg ttcgtgcaga agtacatcca cgacatgacc 600
gcctggcgag ccctgcccgt ggccgagcag gaaaacgtca tcggccgcag caaggccgac 660
gacatcgaga tggacgacga caccaagccc agcaactcgc acagcgcgct gtccaacgtg 720
ggcgacgacc ggaagatcgt gcgcgacaac ctgccattcg tcgacgatgc cacgcaagag 780
atcggcacct atttcatcgg ctacgccagc accttcggca ccgtgcgcga catgctcgag 840
gccatgttca tcggcaagcc ggccggcaac tcggaccgca tcctggactt cagccgcgcc 900
gtgaccggca gcctgttctt tgtgcccacg ctggatatgc tgggggagtt tgccgagtga 960
<210> 2
<211> 318
<212> PRT
<213> 食丝氨酸丛毛单胞菌（Comamonas serinivorans SP35）
<400> 2
Met Ala Ala Ala Ser Asp Ile Glu Pro Thr Pro Thr Met Ser Phe His
1 5 10 15
Thr Gln Ala Thr Thr His Glu Pro Asn His Asn Ala Met Phe Met Val
20 25 30
Trp Val Leu Lys Ala Gly Val Asp Ala Lys Pro Ala Phe Arg Ala Leu
35 40 45
Cys Ala Leu Val Glu Asn Leu Asn Asn Ser Ala Ala Ala Arg Phe Pro
50 55 60
Gly Thr Gln Ala Ser Cys Val Leu Gly Ile Gly His Arg Ala Trp Gln
65 70 75 80
Ala Leu Ala Leu Pro Gln Pro Gln Pro Arg Glu Leu Val Glu Phe Thr
85 90 95
Pro Ile Ala Gly Asp Arg His Thr Ala Val Ala Thr Pro Gly Asp Leu
100 105 110
His Leu His Leu Arg Gly Ala Asp Phe Ser Leu Cys Val Asp Met Ala
115 120 125
Met Gln Ile Arg Gln Arg Leu Gln Ala Val Ala Asp Cys Val Val Gln
130 135 140
Val Ser Gly Phe Arg Tyr Trp Asp Gly Arg Ser Ile Leu Gly Phe Val
145 150 155 160
Asp Gly Thr Glu Asn Pro Gln Gly Asp Glu Arg Asp Phe Phe Ala Gln
165 170 175
Val Gly Pro Glu Asp Ala Ala Tyr Glu Gly Gly Ser Tyr Leu Phe Val
180 185 190
Gln Lys Tyr Ile His Asp Met Thr Ala Trp Arg Ala Leu Pro Val Ala
195 200 205
Glu Gln Glu Asn Val Ile Gly Arg Ser Lys Ala Asp Asp Ile Glu Met
210 215 220
Asp Asp Asp Thr Lys Pro Ser Asn Ser His Ser Ala Leu Ser Asn Val
225 230 235 240
Gly Asp Asp Arg Lys Ile Val Arg Asp Asn Leu Pro Phe Val Asp Asp
245 250 255
Ala Thr Gln Glu Ile Gly Thr Tyr Phe Ile Gly Tyr Ala Ser Thr Phe
260 265 270
Gly Thr Val Arg Asp Met Leu Glu Ala Met Phe Ile Gly Lys Pro Ala
275 280 285
Gly Asn Ser Asp Arg Ile Leu Asp Phe Ser Arg Ala Val Thr Gly Ser
290 295 300
Leu Phe Phe Val Pro Thr Leu Asp Met Leu Gly Glu Phe Ala
305 310 315

Claims (3)

1.过氧化物酶DyP35在染料脱色降解中的应用,所述过氧化物酶DyP35的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述过氧化物酶DyP35降解染料时脱色体系的pH 为7.5。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为作为造纸过程添加物、食品加工过程添加物、纺织品加工过程添加物、饲料添加物、废水处理过程添加物或木质素生产过程添加物，对涉及的染料进行脱色降解。
3.根据权利要求1-2任一项所述的应用，其特征在于，所述染料为雷玛唑亮蓝、活性艳蓝X-GR、刚果红、考马斯亮蓝、孔雀石绿、溴酚蓝。
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GenBank登录号：ARU05295.1;Zhu, D;《GenBank数据库》;20170530;参见序列及相关信息 *
GenBank登录号：WP_087281313.1;匿名;《GenBank数据库》;20170601;参见序列及相关信息 *
黄孢原毛平革菌合成的木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶及其菌球在染料脱色过程中的作用.;章燕芳等;《过程工程学报》;20020630;第2卷(第3期);参见摘要 *

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